与1-脱氧野尻霉素合成相关的多肽及其应用的制作方法

xiaoxiao2020-6-24  5

【专利下载】Tel:18215660330

专利名称:与1-脱氧野尻霉素合成相关的多肽及其应用的制作方法
技术领域
本发明涉及与1-脱氧野尻霉素合成相关的多肽及其应用,更具体地,本发明涉及与1-脱氧野尻霉素(其是α-葡萄糖苷酶抑制剂)一一生物合成相关的多肽,编码该多肽的多核苷酸,含有该多核苷酸的载体,含有该载体的转化体,以及使用该转化体生产与1-脱氧野尻霉素合成相关的多肽或1-脱氧野尻霉素的方法。
背景技术
随着生活环境和饮食习惯的西化以及老龄人口的增加,与饮食生活相关的成人疾病的代表一糖尿病的发病,已在韩国越来越普遍。糖尿病(diabetes mellitus),或简称糖尿病(diabetes)是一种代谢性疾病,由于胰腺不能产生足够的胰岛素,或由于各器官的细胞对胰岛素的响应效率非常低,使患者出现高血糖。糖尿病如果不进行适当的治疗,可导致许多严重的并发症,包括肾功能衰竭、白内障和视网膜病变,从而引起个人和社会的关注。已经基于各种机制对糖尿病的降血糖药进行研究和开发。其中一个典型的实例是对α-葡萄糖苷酶的抑制机制,该酶催化糖原降解为葡萄糖。在研发此类降血糖药的背景下,已知通常分离自桑叶的1-脱氧野尻霉素(DNJ)具有有效的α -葡萄糖苷酶抑制活性(Asano, N.等人,碳水化合物研究(Carbohydr.Res.)第 293 卷,195-382 页,1996; Asano, N.等人,植物化学(Phytochemistry),第 53 卷,397-382 页,2000; Asano, N.等人,农业与食品化学杂志,(J.Agric.Food Chem.),第 49 卷,4208-4213 页,2001)。1-脱氧野尻霉素,是一种多羟基生物碱,其具有糖基团上的氧原子被氮原子取代的特征性结构。1-脱氧野尻霉素的功能是抑制参与将二糖,如麦芽糖、蔗糖、果糖等分解成为单糖葡萄糖的α -葡萄 糖苷酶和甘露糖脱氢酶,从而抑制血糖。1-脱氧野尻霉素的许多种来源是已知的。例如,1-脱氧野尻霉素可分离自桑树(Morus alba L.)或蚕(Bombyx mori L.) (Asano, N.等人,J.农业与食品化学杂志,(J.Agric.Food Chem.),第 49 卷,4208-4213 页,2001),从植物中提取(Evans, S.V.等,植物化学(Phytochemistry),第 24 卷,1953-1955 页,1985;Murao, S.和 Miyata, S.,农业与生物化学(Agric.Biol.Chem.),第 44 卷,219-221 页,1980; Yamada, H., Oya, 1.和 Nagai, T., Shoyakugaku Zasshi,第 47 期,47-55 页,1993),或从微生物,如链霉菌和芽孢杆菌中制备(Ezure, Y.等人,农业与生物化学(Agric.Biol.Chem.),第49卷,1119-1125 页,1985; Hardick, D.J.和 Hutchinson, D.W.,生物化学(Biochemistry),第 49 卷,6707-6716 页,1993; Shibano, M.等人,植物化学(Phytochemistry),第 65卷,2661-2665页,2004)。然而,从植物中提取获得1_脱氧野尻霉素的缺点在于,各种具有相似结构的成分使纯化困难,并降低了产率。另一方面,与植物提取相比,从微生物中制备1-脱氧野尻霉素,可以在相对短的时间内完成而不破坏环境,并保证了高产率。然而,与1-脱氧野尻霉素生物合成相关的多肽并不是已知的,迄今也未分离出编码该多肽的基因。出于这些原因,尽管有这些优点,人们并没有尝试从微生物中提高产率,或开发新的α-葡萄糖苷酶。
许多构成病毒外膜的蛋白由糖蛋白组成。为了在动物细胞内复制,病毒利用作为合成工具的内质网或高尔基体合成糖蛋白。在动物细胞中,糖蛋白的合成需要添加N-连接或O-连接的糖链。作为参与糖蛋白合成的α-葡萄糖苷酶I和II以及甘露糖脱氢酶的抑制剂,1-脱氧野尻霉素阻断病毒外膜蛋白的合成,并形成不完整的外膜,从而干扰病毒颗粒的产生。因此,已报道1-脱氧野尻霉素对病毒疾病具有预防效果(Hardick,D.J.等人,四面体(Tetrahedron),第48卷,6285-6296页,1992),抗癌活性和对癌症转移的预防作用(Olden, K.等人,药理与治疗(Pharmacol.Ther.),第 50 卷,285-290 页,1991; Tayer, Ο-ι.等人,艾滋病(AIDS),第5卷,693-698页,1991)。如上所述,人们预期将1-脱氧野尻霉素是用于治疗各种疾病的潜在药物,因此,需要开发一种有效地生产1-脱氧野尻霉素的方法。本发明的发明人努力开发出一种用于生产1-脱氧野尻霉素的方法,并确定了与1-脱氧野尻霉素生物合成相关的多肽,其可用于生产1-脱氧野尻霉素。发明概述本发明的目的是提供一种与1-脱氧野尻霉素生物合成相关的多肽。本发明的另一目的是提供编码该多肽的多核苷酸。本发明的再一目的是提供含有该多核苷酸的重组载体以及用该载体转化的转化体。本发明的再一目的是提供一种通过培养所述转化体生产1-脱氧野尻霉素相关多肽,或1-脱氧野尻霉素的方法。

为了实现前述目的,本发明提供具有SEQ ID N0:16的氨基酸序列的多肽,其包括gabTl、yktcl和gutBl基因的编码区;具有SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的多肽,其包括gabTl、yktcl、gutBl和ybaR基因的编码区;以及具有SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的多肽,其包括 glcPl、gabTl、yktcl、gutBl、ybaR、ybaS 和 ybbA 基因的编码区。为了实现前述的另一目的,本发明提供具有SEQ ID NO: 19的核苷酸序列的多核苷酸,具有SEQ ID NO: 20的核苷酸序列的多核苷酸;以及具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的多核苷酸,所述多核苷酸分别编码相应的多肽。为了实现前述的再一目的,本发明提供含有其中一条所述多核苷酸序列的重组载体,以及用该载体转化的转化体。为了实现前述的再一目的,本发明提供一种利用所述转化体生产与1-脱氧野尻霉素合成相关的多肽或1-脱氧野尻霉素的方法。本发明所述的编码与1-脱氧野尻霉素生物合成相关的多肽的多核苷酸可用于1-脱氧野尻霉素的大量生产。此外,所述多核苷酸可结合重组技术来寻找新的1-脱氧野尻霉素衍生物,该衍生物有效地用于开发糖尿病患者的降血糖药以及对抗致病性病毒的抑制剂。


图1为实施例1提取的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtil is) MORI 3K-85的基因组经BamH I和Hind III处理的琼脂糖凝胶电泳图(泳道I,Ikb DNA梯状条带(DNA ladder),泳道2,基因组DNA ;泳道3,BamH I酶切;泳道4,Hind III酶切)。
图2为本发明的CopyControl pCClBAC 载体的酶切图谱示意图。图3为根据实施例1,从筛选的克隆的培养物中提取的生物碱的薄层色谱法色谱图分析结果(泳道1:参照1-脱氧野尻霉素,泳道2:C5-26,泳道3:C26-40,泳道4:C36_4,泳道 5:C88-29,泳道 6:C91-31)。图4A为本发明筛选的C36-4克隆子培养提取物的HPLC色谱图分析结果。图4B为用作本发明制备的化合物的参照物的1-脱氧野尻霉素的HPLC色谱图分析结果。图5为用作参照物的1-脱氧野尻霉素(A),以及本发明中筛选的C36-4克隆子的培养提取物的LC-MS/MS图。图6为从筛选的C36-4克隆子中提取的质粒的琼脂糖凝胶电泳图(泳道1:DNA梯状条带;泳道2:质粒)。图7为本发明从筛选的C36-4克隆子中提取的质粒经限制酶消化后的琼脂糖凝胶电泳图(泳道1:宽量程DNA梯状条带,泳道2:空载体,泳道3:未消化的C36-4衍生质粒,泳道4 =BamH I消化,泳道5 =EcoR I消化,泳道6:Hind III消化,泳道7:BamH I/EcoR I消化,泳道8:BamH I/Hind III消化,泳道9:空载体,泳道10:lkb DNA梯状条带)。图8为本发明筛选的C36-4克隆子的基因插入的限制酶酶切图谱示意图。图9为本发明筛选的C36-4克隆子的基因插入与枯草芽孢杆菌168的基因组之间的核苷酸序列比较示意图。图10为本发明筛选的C36-4克隆子的基因插入与解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)FZB42的基因组之间的核苷酸序列比较示意图。图11为本发明筛选的C36-4克隆子的基因插入与枯草芽孢杆菌168和解淀粉芽孢杆菌FZB42的基因组之间的核苷酸序列比较示意图。图12为本发明从筛选的C36-4克隆子中提取的质粒经限制酶消化后的琼脂糖凝胶电泳图(A.泳道l:lkb DNA梯状条带,泳道2:Hind III消化,B.泳道1:1kb DNA梯状条带,泳道 2:Hind III/Nru I 消化)。图13为显示筛选的C36-4克隆子的质粒上的Hind III限制酶位点的位置,以及用Hind III消化该质粒后的DNA片段大小示意图。图14为显示筛选的C36-4克隆子的质粒上的Hind III和Nru I限制酶位点的位置,以及用Hind III和Nru I消化该质粒后的DNA片段大小示意图。发明详述除非另有说明,本发明中使用的所有技术和科学术语具有与本领域的普通技术人员所通常理解的相同的含义。通常,本发明中使用的术语是本领域公知的和常用的。除非另有说明,适用如下定义。本发明中使用的术语“核酸分子”,指广义地包括DNA CgDNA和cDNA)和RNA分子。在本发明中,形成核酸分子构建单元的核苷酸包括糖或碱基修饰的类似物以及天然核苷酸。

本领域技术人员从本发明下面的描述中应当理解,本发明的核酸分子并不仅限于编码上述特定氨基酸序列的核酸分子,也解释为包括那些编码与所述特定氨基酸序列大体相同的氨基酸序列或具有相应功能多肽的核酸分子。在本文中,术语“大体相同”是指当采用本领域中典型的算法程序进行最佳比对时,本发明的氨基酸序列及任何序列具有至少60%,更优选至少80%,并且最优选至少90%的序列同源性。术语“具有相应功能的多肽”是指具有与参照多肽相同的氨基酸序列,但至少在氨基酸序列的一个氨基酸残基上发生修饰,如缺失、取代、插入和/或添加,同时保持了与参照多肽相同功能的多肽。本发明的与1-脱氧野尻霉素合成相关的多肽,具有相应功能的多肽优选含有较少的修饰,如缺失、取代、插入和/或添加。此外,任何与上述特定的氨基酸序列具有约60%,优选更高序列同源性的多肽,均落入本发明的与1-脱氧野尻霉素合成相关的多肽的范围内。本发明中使用的术语“互补的”或“互补”是指多核苷酸通过嘌呤和嘧啶核苷酸残基之间的氢键彼此之间形成碱基对,从而形成双链核酸分子的能力,也指部分互补。与互补有关的碱基对如下:鸟嘌呤对胞嘧啶,腺嘌呤对胸腺嘧啶,腺嘌呤对尿嘧啶。以下将详细描述本发明。根据本发明的一个方面,提供一种涉及1-脱氧野尻霉素合成的多肽。本发明的多肽来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)M0RI3K-85,由负责1_脱氧野尻霉素合成的基因群组(gene group)所编码。在本发明的一个实施方案中,提供具有SEQ ID NO: 16的氨基酸序列的多肽,其包括gabTl、yktcl和gutBl基因的编码区。在本发明的另一个实施方案中,提供具有SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的多肽,其包括gabTl、yktcl、gutBl和ybaR基因的编码区。在本发明再一个实施方案中,提供具有SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的多肽,其包括 glcPl、gabTl、yktcl、 gutBl、ybaR、ybaS 和 ybbA 基因的编码区。本发明多肽的氨基酸序列选自下组:1) SEQ ID NO: 16的氨基酸序列;2) SEQ IDNO: 17的氨基酸序列,由SEQ ID NO: 16的氨基酸序列加上ybaR基因编码区构成;以及3)SEQ ID NO: 18的氨基酸序列,由SEQ ID NO: 17的氨基酸序列加上glcPl、ybaS和ybbA基因的编码区构成。具体地,在所述多肽中,glcPl基因编码SEQ ID NO: 9的氨基酸序列,gabTl基因编码SEQ ID NO: 10的氨基酸序列,yktcl基因编码SEQ ID NO: 11的氨基酸序列,gutBl基因编码SEQ ID NO: 12的氨基酸序列,ybaR基因编码SEQ ID NO: 13的氨基酸序列,ybaS基因编码SEQID NO: 14的氨基酸序列,ybbA基因编码SEQ ID NO: 15的氨基酸序列。根据本发明的另一个方面,提供具有编码所述多肽的核苷酸序列或具有与该序列互补的核苷酸序列的多核苷酸。在本发明的一个实施方案中,提供具有SEQ ID NO: 19的核苷酸序列的多核苷酸,其编码具有SEQ ID NO: 16的氨基酸序列的多肽,或与该序列互补的核苷酸序列。在本发明的另一个实施方案中,提供具有SEQ ID N0:20的核苷酸序列的多核苷酸,其编码具有SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的多肽,或与该序列互补的核苷酸序列。在本发明又一个的实施方案中,提供具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的多核苷酸,其编码具有SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的多肽,或与该序列互补的核苷酸序列。本发明多核苷酸的核苷酸序列选自下组:1) SEQ ID NO: 19的核苷酸序列;2) SEQID NO: 20的核苷酸序列,由SEQ ID NO: 19的核苷酸序列加上ybaR基因的核苷酸序列构成;以及3) SEQ ID NO:1的核苷酸序列,由SEQ ID NO:20的核苷酸序列加上glcPl、ybaS和ybbA基因的核苷酸序列构成。具体地,在所述多核苷酸中,glcPl基因具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列,gabTl基因具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列,yktcl基因具有SEQ ID NO:4的核苷酸序列,gutBl基因具有SEQ ID NO: 5的核苷酸序列,ybaR基因具有SEQ ID N0:6的核苷酸序列,ybaS基因具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列,ybbA基因具有SEQ ID NO:8的核苷酸序列。更具体地,glcPl基因对应于SEQ ID NO:8的3071-1881核苷酸,gabTl基因对应于SEQ ID NO:1的3343-4611核苷酸,yktcl基因对应于SEQ ID NO:1的4608-5558核苷酸,gutBl基因对应于SEQ ID NO:1的5533-6579核苷酸,ybaR基因对应于SEQ ID NO:1的6820-8256核苷酸,ybaS基因对应于SEQ ID NO:1的8470-9322核苷酸,以及ybbA基因对应于SEQ ID N0:1的9902-9333 核苷酸。由上述七个基因编码的多肽的功能推测如下。glcPl具有跨膜转运的功能。gabTl同时具有4-氨基丁酸转氨酶活性和磷酸吡哆醛结合活性。yktcl具有肌醇或磷脂酰肌醇磷酸酶活性,gutBl同时具有氧化还原酶活性和锌离子结合活性。ybaR具有继发性主动(secondary active)跨膜转运硫酸盐的活性,ybaS具有胆汁酸:钠协同转运活性。ybbA尚未知晓其功能(表3和表7)。根据本发明的一个实施方案,所述多肽优选分离自菌株,更优选地,分离自枯草芽孢杆菌 MORI3K-85。根据本发明的另一个方面,提供含有所述多核苷酸的重组载体,以及用该重组载体转化的宿主细胞。编码与1-脱氧野尻霉素生物合成相关的多肽的基因群组(group)可被克隆至适当的载体,如BAC、质粒、福斯质粒(fosmid)、粘粒等,然后可将载体导入到合适的宿主细胞中。优选的宿主细胞的实例为酵母、芽孢杆菌(Bacillus sp.)和大肠杆菌(E.coli)。可采用各种典型的技术,包括热休克、电穿孔等将所述重组载体导入到宿主细胞中。本领域技术人员显而易见的是根据表达目的,可应用于除前述宿主细胞外的各种宿主细胞。
`
根据本发明的另一个方面,提供一种生产与1-脱氧野尻霉素合成相关的多肽的方法,包括(I)培养用含有本发明所述多核苷酸的重组载体转化的转化体;以及(2)从所述培养物中分离与1-脱氧野尻霉素合成相关的多肽。此外,本发明提供一种生产1-脱氧野尻霉素的方法,包括(I)培养用含有本发明所述的多核苷酸的重组载体转化的转化体;以及(2)从所述培养物中分离1-脱氧野尻霉素。
具体实施例方式以下将更详细地描述本发明。以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。以下提供的实施例用于说明本发明的优选实施方案,但不用来限制本发明的范围。实施例1利用产1-脱氧野尻霉素的枯草芽孢杆菌M0RI3K-85的基因组构建文库<1~1>菌株培养
从韩国传统食品中分离并鉴定的枯草芽孢杆菌MORI (保藏号KCCM-10450),经Y射线照射,获得具有提高的α -葡萄糖苷酶抑制活性的改良枯草芽孢杆菌M0RI3K-85菌株。具体地,将 MORI 菌株培养于 Difco YM[Becton Dickinson and Company (BD),美国 BD 公司]液体培养基中,37°C下180rpm振荡培养一天,然后用3kGy或5kGy剂量的、射线(SoyaGreenTec,韩国)照射。将经Y射线照射的培养液涂布于YM琼脂板上,并在37°C培养18小时。然后,将形成的菌落转移到新鲜YM琼脂板上进行孵育。再次地,将该平板上生长的菌落接种到YM液体培养基中,37°C 180rpm振荡培养5天。分析细胞对α -葡萄糖苷酶的抑制活性,从而获得改良的细胞亚株枯草芽孢杆菌M0RI3K-85。孵育一天后,将枯草芽孢杆菌M0RI3K-85按1%体积的量接种于各含500mL YM液体培养基的四个培养基中,37°C 180rpm振荡培养。培养物在8,OOOrpm下离心10分钟,移去上清。将所形成的细胞团重悬于20mL的IX磷酸盐缓冲盐水(PBS)中,_20°C贮存至基因提取时用。〈1-2>某闵纟目提取用基因组提取试剂盒(美国Promega公司)从枯草芽孢杆菌M0RI3K-85中提取基因组DNA。取ImL贮存于-20°C的枯草芽孢杆菌M0RI3K-85菌悬液,在4°C解冻,16,000Xg离心2min。倒掉上清后,将细胞团重悬于480yL的50mM EDTA (乙二胺四乙酸)中,与120 μ L细胞裂解液在37°C孵育30min。以相同方式离心(16,000X g,2min),然后将上清转移到一个新的1.5mL微量离心管(Eppendorf管)中。向上清中加入600 μ L核裂解液(包含在基因组提取试剂盒中,美国Promega公司),然后在80°C孵育5min,将反应液冷却至室温。然后,该反应液与3 μ L RNase溶液轻轻混合5次,37°C孵育30min,并冷却至室温。随后,将该反应液与200 μ L蛋白沉淀溶液混合并置于冰上反应5min以除去蛋白,然后16,000 X g离心2min得到上清。向上清中加入600 μ L异丙醇,将混合物在16,000 X g离心2min。移去上清后,沉淀(pellet)用600 μ L70%乙醇洗3次,然后16,000X g离心2min。蒸发残余乙醇来 干燥沉淀,并溶解于30 μ L DNA再水化溶液(rehydration solution)(包含在基因组提取试剂盒中,美国Promega公司)中,65°C水浴中放置60min。〈1-3>用限制酶消化制备的DNA片段用限制酶BamH 1.Hind III和EcoR I (美国Promega公司)消化。将由I μ L上述获得的基因组DNA (I μ g/ μ L)、16.3 μ L无菌水、2 μ LlO X缓冲液和0.2 μ L牛血清白蛋白(10yg/yL)与0.5 μ L限制酶组成的混合物在37°C水浴中放置lhr,然后在65 °C水浴中孵育15min以终止限制消化反应。随后,制备含200 μ L溴化乙锭(2 μ g/mL)的0.5%琼脂糖凝胶120mL并成型。将
5μ L限制酶消化产物与I μ L染色剂缓冲液(dye buffer)混合后加样5 μ L至0.5%琼脂糖凝胶中。然后,将5 μ Llkb DNA标记物(美国PiOmega公司)与I μ L染色剂缓冲液混合后加样5 μ L至0.5%琼脂糖凝胶中。加样后凝胶中的样品在50V电压下跑胶30min,用紫外透射仪(美国UVP公司)进行紫外线照射以显示条带。经BamH I消化后,DNA片段的较大部分为6kb或更大。另一方面,Hind III的消化产物大小主要为2-7kb(图1)。经BamH I消化的DNA片段被用于后续构建转化体。<1-4>DNA片段与dCCIBAC载体连梓为克隆该DNA片段,将实施例1的〈1-3>中经BamH I消化所得的DNA片段IOOng与 I μ L CopyControl pCClBAC Cloning-Ready BamH I 载体(美国 Epicentre 公司;图2)混合,向该DNA混合物中加入无菌水至总体积87 μ L0所得DNA溶液在55°C孵育IOmin,在室温下冷却15min,与10 μ LlOXFast-Link连接缓冲液(包含在CopyControlpCClBAC Cloning-Ready BamH I 试剂盒中,美国 Epicentre 公司)、I μ LlOOmM ATP 和 2 μ LFast-Link DNA连接酶(CopyControl pCCIBAC Cloning-Ready BamH I 试剂盒,Epicentre,美国)混合,达到总体积100 μ L0所得混合物在16°C孵育4hr,然后于65°C加热15min以灭活连接酶。为用于将所得连接产物溶液脱盐,通过加热煮沸,将0.9g葡萄糖和0.5g琼脂糖完全溶解于50mL初级蒸馏水中,冷却至50°C,然后以800 μ L的等份加入至1.5mL管中,在凝固之前向该管中插入0.5mL管以形成圆锥形。向其中加入连接产物溶液,冰上孵育lhr。所得重组载体被用于转化大肠杆菌。<1~5>转化体的构律使用TransforMax EPI300 电感受:态大肠杆菌(美国Epicentre公司)进行转化,将电穿孔小管和1.5mL管置于冰上。在1.5mL管中,50 μ L大肠杆菌菌液在冰上缓慢解冻,并与2μ L脱盐的连接产物溶液混合。将混合物转移至冷的电穿孔小管中,采用Gene Pulser (美国Bio-Rad公司),在12kV/cm电场下进行电穿孔。将管中转化的细胞与950 μ L SOC培养基(2%Bacto牌蛋白胨,0.5%Bacto牌酵母提取物,IOmM NaCl, 2.5mMKCl, 20mM Mg2+ 缓冲液(MgCl26H20,MgS047H20),20mM 葡萄糖)混合,转移至 50mL 管中,37°C以220 230rpm振荡孵育lhr。将IOOmL的细胞溶液涂布于含12.5 μ g/mL氯霉素、40 μ g/mL5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-吡喃半乳糖苷(X-Gal)和50 μ g/mL40mM异丙基β -D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)的Luria-Bertani (LB)平板上,放置在培养箱中,37°C培养12hr。从平板上挑取白色菌落,于LB液体培养基中培养。所得培养物用于筛选产1-脱氧野尻霉素的克隆。实施例2通过测定抑制α -葡萄糖苷酶活性进行筛选为了从所述白色菌落中筛选出能产1-脱氧野尻霉素的克隆,采用测定抑制α -葡萄糖苷酶活性的方法。实施 例1的〈1-5>中制备的培养物在100°C加热10min,8,OOOrpm离心lOmin。向5μ L上清中加入75μ L0.1M磷酸钾缓冲液(ρΗ6.8)、作为底物的50 μ L12mM对硝基苯基-α -吡喃葡萄糖苷和20 μ L粗酶液。为了制备该粗酶液,称取0.Sg大鼠小肠丙酮粉(美国Sigma公司),在IOOmL0.1M磷酸钾缓冲液中提取lhr。所得溶液在12,OOOrpm离心lOmin,得到的上清用作粗酶液。混合物在37°C孵育35min,用50 μ L200mM碳酸钠终止酶反应。在酶标仪(美国分子设备(Molecular device)公司)上读取405nm处的吸光值。通过以下公式I计算,筛选出具有20%或更高α-葡萄糖苷酶抑制活性的克隆(Sc0filed,A.M.等人,生命科学(LifeSc1.),第 39 卷,29-32 页,1986)。< 公式 1>
权利要求
1.具有SEQID NO: 16的氨基酸序列的多肽,其含有gabTl、yktcl和gutBl基因的编码区。
2.具有SEQID N0:17的氨基酸序列的多肽,其含有gabTl、yktcl、gutBl和ybaR基因的编码区。
3.具有SEQID N0:18的氨基酸序列的多肽,其含有glcPl、gabTl、yktcl、gutBl、ybaR、ybaS和ybbA基因的编码区。
4.具有SEQID NO: 19的核苷酸序列的多核苷酸,其编码权利要求1所述的多肽,或与所述序列互补的核苷酸序列。
5.具有SEQID NO:20的核苷酸序列的多核苷酸,其编码权利要求2所述的多肽,或与所述序列互补的核苷酸序列。
6.具有SEQID NO:1的核苷酸序列的多核苷酸,其编码权利要求3所述的多肽,或与所述序列互补的核苷酸序列。
7.根据权利要求1-3任一项所述的多肽,其中所述多肽与1-脱氧野尻霉素的生物合成相关。
8.根据权利要求1-3任一项所述的多肽,其中所述多肽具有对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。
9.含有权利要求4-6任一项所述多核苷酸的重组载体。
10.用权利要求9所述的重组载体转化的转化体。
11.根据权利要求10所述的转化体,其中所述转化体选自下组:酵母、芽孢杆菌(Bacillus sp.)和大肠杆菌(E.coli)。
12.生产与1-脱氧野尻霉素合成相关的多肽的方法,包括: (1)培养权利要求10所述的转化体;以及 (2)从培养物中分离出与1-脱氧野尻霉素合成相关的多肽。
13.生产1-脱氧野尻霉素的方法,包括: (1)培养权利要求10所述的转化体;以及 (2)从培养物中分离出1-脱氧野尻霉素。
全文摘要
本发明涉及一种与抑制α-葡萄糖苷酶活性的物质1-脱氧野尻霉素的生物合成相关的多肽,编码该多肽的多核苷酸,含有该多核苷酸的载体,含有该载体的转化体,以及将该转化体用于生产与1-脱氧野尻霉素合成相关的多肽或1-脱氧野尻霉素的方法。本发明的多核苷酸可用于1-脱氧野尻霉素的批量生产,或通过使用重组技术用于寻找新的1-脱氧野尻霉素衍生物的研究,因此可用于开发致病性病毒的抑制剂和用于糖尿病患者的降血糖药。
文档编号C12N15/63GK103168047SQ201180042602
公开日2013年6月19日 申请日期2011年7月21日 优先权日2010年9月3日
发明者成洙一, 黄教列, 李载渊, 姜景敦, 朴永植, 赵勇锡, 陆媛晶 申请人:拓邦生物科技有限公司

最新回复(0)