生产细胞系的制作方法
专利名称：生产细胞系的制作方法
生产细胞系本发明涉及一种制备用于在细胞培养物中生成目标多肽(POI)的高产生产细胞系的方法。背景重组DNA技术的开发允许使用数种微生物作为宿主来表达具有制药和工业应用的异源蛋白质。今天使用许多不同宿主细胞来生产此类异源蛋白质。用真核宿主实现了成功的重组蛋白生产。最突出的例子是芽殖酵母像啤酒糖酵母/酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)或多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha,),丝状真菌像泡盛曲霉(Aspergillus awamori)或瑞氏木霉(Trichodermareesei)，或哺乳动物细胞像例如CHO细胞。酵母对于生产重组蛋白和小代谢物是有吸引力的宿主。巴斯德毕赤酵母(一种甲基营养性酵母)频繁用作表达系统来生产重组蛋白，而且最近还用于生产小代谢物(Marxet al.Microb Cell Fact7:23 (2008))。毕赤酵母具有高生长速率，而且能够在简单、便宜的培养基上生长。毕赤酵母能在摇瓶或发酵罐中生长，使得它适合于小和大规模生产。最近将巴斯德毕赤酵母重分类入一个新属，Komagataella,而且分成三个新种:Komagataellapastoris,K.phaffii,和K.pseudopastoris (Kurtzman CP.1nt J Syst Evol Microbiol55,973-976 (2005))。因此，巴斯德毕赤酵母是 K.pastoris, K.phaffii 和 K.pseudopastoris这所有三个种的同义词。依照先前的文献，贯穿本文使用巴斯德毕赤酵母，隐含表示任何Komagataella物种。类似地,多形汉逊酵母和安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)同义。在大多数情况中，为工业生产以补料分批工艺培养宿主细胞。此类工艺的总体生产力是生物量随时间的积分和生物量比生产力(qP)的函数。qP与比生长速率(μ)有关，通常随μ升闻而持续升闻。因此，在闻u处实现闻qP，而以初始闻P，然后很低μ实现最佳生物量-时间积分(A)。这体现为下述公式，其用于计算恒定qP时的产物产量(P):P=A.qP
图1显不巴斯德毕赤酵母中qP和μ白勺关系(Maurer et al.2006, Micr.Cell Fact.5:37do1:10.1186/1475-2859-5-37)。因此，以μ的妥协来实现最佳生产力，通常在补料分批中通过受到限制的底物补料来控制。补料分批工艺的一种典型情况是用微生物或哺乳动物细胞生产重组蛋白。虽然细胞团块中产物浓度的描述在细胞外产物的情况中较为直截了当，但是分泌产物的动力学的预测更加复杂。分泌系统的一种典型情况是重组酵母。由于酵母中许多蛋白质的生产对成本相当敏感，因此努力来预测和控制生产力、加工时间和产物滴度。用于优化甲基营养性酵母巴斯德毕赤酵母的补料分批工艺的办法已有记载(Zhang et al.Biotechnol.Prog.2005,21:386-393 ；Maurer et al.2006, Micr.Cell Fact.)。生物工艺的可变 成本与所需发酵单元的体积容量及此单元生成规定量的产物所需的加工时间有关。如此，体积生产力Qp似乎是最可行的优化标的。在给定的过程时间点t, Qp定义为:Qp=P/ (V.t)细胞周期或细胞分裂周期指细胞中发生一系列事件，导致其分裂和复制。真核细胞分裂经由受到高度调节的细胞周期来行进，包括称作Gl (间隙I)、S (合成)、G2 (间隙2)和M( 有丝分裂)的连续阶段。阶段GO称作休眠期，其中休眠细胞在某些情况下或在受到特定刺激后会启动RNA和蛋白质合成(Gl期)，它们是有效进行其DNA倍增和细胞分裂成两个子细胞所必需的。随后，DNA合成开始(S期)；一旦细胞复制了它的DNA，就开始第二个蛋白质合成晚时段(G2期)，它是使细胞准备好分裂(M期)的短阶段。G2和M期都以两套染色体为特征，而且常常被一起看做G2+M阶段。在简短的有丝分裂期期间，真核细胞将其细胞核中的染色体在两个子核中分成相同的两套。通常，有丝分裂之后紧接着就是胞质分裂，即将胞质分成两个子细胞以提供细胞成分的同等分配。
细胞分裂后，每个子细胞开始新周期的分裂间期。临时或非临时停止分裂的细胞就说是进入静止或衰老状态(GO)。细胞周期行进受到规定的时间和空间表达、定位和一些细胞周期调节剂(它们在细胞周期期间展现高度动态的行为)破坏的紧密调节。例如，在特定细胞周期阶段，一些蛋白质自核易位至胞质，或反之，而一些蛋白质被快速降解。关于已知细胞周期控制成分和相互作用的详情，参见 Alberghina L, Coccetti P, Orlandi 1.Systems biology ofthe cell cycle of Saccharomyces cerevisiae:From network mining to system-levelproperties.Biotechnol Adv.2009Nov_Dec; 27 (6): 960-78。细胞周期过程是复杂的且受到高度调节。细胞周期中的错误会经由凋亡杀死细胞，或者可以导致不受控制的细胞分裂，而且在一些情况中导致癌症。细胞周期分析(主要经由研究贯穿G0/G1、S和G2/M细胞周期阶段的细胞分布)已证明可用于分析肿瘤样品及研究对不同刺激的增殖应答以及其它领域。DNA复制(S期)和有丝分裂(M期)的时机和互相依赖性受到细胞周期蛋白依赖性激酶(Cdk)活性振荡的控制。高等真核生物具有多种Cdk，而在酵母中，细胞周期行进需要一种Cdk，在裂殖酵母中称作Cdc2而在芽殖酵母中称作Cdc28。激酶活性波动很大程度上由Cdk的调节性细胞周期蛋白亚基的细胞周期依赖性合成和降解来决定。进入M期取决于出现B型细胞周期蛋白，其相关激酶活性促进有丝分裂纺锤体形成。在芽殖酵母中，S期期间出现的两对相关B型细胞周期蛋白(Clb3，4)和G2(Clbl，2)涉及纺锤体形成和延长。Cross 等人(Molecular Biology of the Cell (2005) 16:2129-2138)描述了真核细胞周期对照系统依赖于Clb2表达水平的一种定量行为。预测了 Clb2过表达系统的稳健性的损失。据记载，一系列真菌调节剂(包括细胞周期调节剂)改进真菌代谢物生成的产量(W001/29073)。在一项改进来自生产细胞系的蛋白质表达的努力中，共表达重组p21或另一种细胞周期抑制剂蛋白以增强单细胞生产力(W002/099100A2)。p21是细胞周期蛋白激酶的一种通用抑制剂，赋予稳定且定量的细胞周期阻滞。如此，在它的细胞抑制效应之外，还不得不小心避免触发细胞死亡或凋亡。W00216590A2公开了通过使细胞自复制状态转换至生产状态(其为假衰老状态)(RP转换)来延长细胞培养物的蛋白质生物合成。这可以通过条件性表达阻滞细胞分裂的细胞周期阻断剂的经转化细胞来实现。通过阻止细胞增殖(诱导分化至衰老样状态)，会获得提高的生物产物产量。通过中止细胞周期于特定阶段或将不同阶段的细胞分开，数种方法可用于使细胞培养物同步。例如，血清饥饿或添加阿尔法因子会将细胞中止在Gl阶段，有丝分裂摇落、秋水仙素处理和诺考达唑(nocodazole)处理将细胞中止在M阶段，而5_氟脱氧尿苷处理将细胞中止在S阶段。延长细胞培养物的生产阶段的一项共同措施是一旦生物量生长至某种程度就限制底物。类似地，据记载，培养基添加剂影响细胞周期。KR100254810B1公开了将抗生素新生霉素添加至CHO细胞培养物来提高重组红细胞生成素的生成。新生霉素充当细胞周期早期阶段(M前)的抑制剂。Uchiyama 等人(Biotechnol Bioeng54:262-271 (1997))描述了酿酒酵母的同步和阻滞培养。使用温度敏感性cdc突变体和阻滞细胞周期行进的抑制剂来诱导同步性，从而研究细胞周期依赖性。通过将许可温度转换成阻抑温度或者通过添加细胞周期抑制剂来停止细胞周期。普遍阻断细胞生长和增殖能有效引起细胞阻滞和早期凋亡，导致细胞培养物的生产期段。一般地，用现有技术很难维持细胞生长缺失下延长的生产力。本发明的目的是延长细胞培养物的高生产阶段以提高生物产物的产量。发明概述 通过提供本申请的实施方案实现了上述目的。依照本发明，提供了一种制备用于在细胞培养物中生成目标多肽(POI)的高产生产细胞系的方法，包括遗传工程改造真核细胞系以专门引起G2+M细胞周期阶段延长。具体而言，该方法用于在细胞培养物中生成重组目标多肽(POI)，包括遗传工程改造真核细胞系-在预培养阶段中以专门引起G2+M细胞周期阶段延长，及-在预培养阶段后的生产阶段中生成Ρ0Ι。预培养阶段中的细胞培养物(即培养中的细胞系)特别用来使细胞生长及建立G2+M细胞周期阶段作为稳态。通过将细胞培养物条件转换至生产阶段，有效生成重组POI和最终由此类POI介导的相应代谢物，仍然维持有利的G2+M细胞周期状态。如此，分阶段培养方法有效提供第一阶段中细胞培养物对能够生成高POI产量的细胞的富集及第二阶段中POI的生成。
具体而言，该细胞系是在其基因组中稳定整合有用于表达细胞周期调控剂的表达盒的细胞系。优选地，该细胞系接受改造以调控细胞周期调节剂，优选通过专门过表达、激活、突变、下调、删除、降解或抑制细胞周期调节剂来进行。依照本发明使用的优选的细胞周期调节剂选自下组:Cdk/细胞周期蛋白复合物诸如细胞周期蛋白依赖性激酶(Cdk)，G1特异性细胞周期蛋白，G2/有丝分裂特异性细胞周期蛋白，及其转录或降解因子,诸如 Clb2，Clbl，Clb3-6，Clnl-3，Cdc6，Cdcl4，Cdc20,Cdc28,Cdc48, CdhI, Karl, Mad2, MBF，Mcml, Pdsl, Rrp42, SBF，Sicl, SweI, Swi5, Whi2。依照一个具体实施方案，所述细胞系是野生-插件宿主细胞系或接受改造以生成细胞周期调控剂和所述POI的生产细胞系。具体而言，优选的POI选自血清蛋白质，诸如免疫球蛋白或血清清蛋白，酶，激素，信号分子，基质蛋白质，其片段或衍生物，或介导宿主细胞代谢物生成的多肽。依照本发明使用的真核细胞系优选是真菌细胞，优选酵母细胞，诸如毕赤酵母属的细胞，特别是巴斯德毕赤酵母菌株的细胞，或高等真核细胞，优选哺乳动物或植物细胞。本发明进一步提供了可通过本发明方法获得的高产生产细胞系，其具有至少0.1 μ g/ (g.h),优选至少0.lmg/ (g.h),更优选至少lmg/ (g.h)的比生产力qP来生成所述POI，例如在工业或技术酶的情况中，在工业规模的生产条件下的细胞培养物中。本发明进一步提供了可通过依照本发明的方法获得的高产生产细胞培养物，其中在占补料时间至少50%的过程时间里至少50%的细胞在G2+M阶段中。具体而言，该细胞培养物能在至少10小时的时段里稳定维持于稳态诸如G2+M分布。依照具体方面，该细胞培养物是补料-分批或连续细胞培养物。在一个特别优选的实施方 案中，本发明的细胞培养物具有至少0.1 μ g/(L.h)，优选至少10 μ g/ (L.h),更优选至少0.lmg/ (L.h),甚至更优选至少lmg/ (L.h)的体积生产力QP，例如在工业或技术酶的情况中，通常在工业规模的生产条件下，例如采用100L至IOm3或更大的反应器体积中的补料分批培养，采用数天的典型过程时间，或大约50 - 1000L或更大的发酵罐体积中的连续工艺，稀释速率为大约0.05-0.15h'依照本发明，进一步提供了一种在细胞培养物中提高重组POI生产的产量的方法，包括a)遗传工程改造真核生产细胞系以专门引起G2+M细胞周期阶段延长，b)培养所述生产细胞系，并c)收集细胞培养物含有POI的级分。具体而言，该方法用于在细胞培养物中提高重组POI生产的产量，包括a)遗传工程改造真核生产细胞系以专门引起G2+M细胞周期阶段延长，b)在预培养阶段中培养所述生产细胞系以获得G2+M细胞周期阶段延长的稳态细胞培养物，c)在所述预培养阶段后的生产阶段中培养所述稳态细胞培养物以生成该Ρ0Ι，并d)收集细胞培养物含有POI的级分。生产阶段中的生产细胞培养物有时称作主培养；下文实施例部分提供了一个例子。依照本发明的又一个方面，提供了一种在细胞培养物中延长真核生产细胞系用于生成重组POI的生产阶段，即重组POI生产阶段的方法，包括遗传工程改造细胞系以专门引起G2+M细胞周期阶段延长。附图简述图1:巴斯德毕赤酵母中qP和μ的关系。下面的线:野生型细胞中的实际关系。上面的线:最闻生广力的最佳关系。
此图显示巴斯德毕赤酵母细胞培养物中Fab表达比生产力和细胞生长的函数关系。曲线的陡度指示给定μ处qp对μ的比，而且是在此给定μ处能实现的产物滴度的度量。如此，通过高初始生长速率，继以延长的一段时间里稳态生产阶段，可以实现最佳产量。图2:巴斯德毕赤酵母中qP、μ和细胞周期分布的关系。qP(黑色线)依照Monod函数依赖于μ。Gl阶段(一套染色体，左柱)和G2+M阶段(至少两套染色体，右柱)细胞的分数指示qP与G2+M阶段的正相关。图3:工程化巴斯德毕赤酵母中qP和μ的关系。正方形:对照(野生型菌株)。三角形:Clb2过表达菌株的改良关系。图4:工程化巴斯德毕赤酵母中μ和细胞周期分布的关系。左条:G1阶段的细胞的分数，右条:G2+M阶段的细胞的分数。发明详述因此，本发明基于一种有利效果，即细胞培养物内处于G2+M阶段的真核细胞数目相对增多或G2+M阶段特异性延长提供高生产力生物工厂装置来生产POI。这通过遗传工程改造细胞系以获得具有下述基因组修饰的重组细胞系来实现，所述基因组修饰会稳定表达引起所述G2+M细胞周期阶段延长的效应器分子。令人惊讶地发现相应细胞培养物会以低比生长速率，由此提高体积产量，从而以高产量稳定生成POI。如此，本发明的生产细胞系不仅可用于补料分批工艺，而且还可用于连续生产工艺，其中维持细胞培养物使得G2+M细胞的分数在延长的生产时间里维持于高水平。如依照本发明使用的，术语“细胞周期调控剂”指上调或下调细胞周期抑制剂、激酶或细胞周期控制系统的其它 酶或辅因子的效应器分子。该术语应当包括细胞周期调节齐U，而且还应当指积极涉及细胞周期过程的此类效应器分子、细胞周期抑制剂或相应酶的激动剂或拮抗剂，激活剂或抑制剂。细胞周期调控剂可以是细胞周期控制机制的生理学效应器、合成剂或化学药品、或证明有调控活性的生物学物质。如此，细胞周期调控剂对细胞周期调节具有直接或间接影响。本领域技术人员能自现有技术衍生此类化合物，并最终通过标准手段测试它们对真核细胞周期的影响。术语“细胞周期调节剂”应当指积极涉及真核细胞的细胞周期控制的生理学(任选内源)物质。术语“细胞系”应当指特定细胞类型已建立的克隆，其已经获得在延长的时段里增殖的能力。术语“宿主细胞系”指用于表达重组基因以生成多肽或由此类多肽介导的细胞代谢物的细胞系。生产宿主细胞系通常理解为准备好在生产工艺中在生物反应器中培养以获得基因产物的细胞系。术语“表达”或“表达系统”或“表达盒”指如下的核酸分子，其含有可操作连接的期望编码序列和控制序列，使得用这些序列转化或转染的宿主能够生成所编码的蛋白质。为了实现转化，表达系统可以包括在载体上；然而，有关DNA也可以整合入宿主染色体中。本文中使用的“表达载体”或“载体”定义为在合适的宿主生物体中转录所克隆的重组核苷酸序列(即重组基因的)和翻译它们的mRNA所需要的DNA序列。此类表达载体通常包含用于在宿主细胞中自主复制的起点、可选择标志物(例如氨基酸合成基因或赋予对抗生素诸如zeocin、卡那霉素、G418或潮霉素的抗性的基因)、多个限制酶切割位点、合适的启动子序列和转录终止子，这些成分可操作连接在一起。如本文中使用的，术语质粒和载体包括自主复制核苷酸序列以及基因组整合核苷酸序列。术语“真核宿主”应当表示任何真核细胞或生物体，其可以培养以表达POI或宿主细胞代谢物。完全理解该术语不包括人类。术语“G2+M细胞周期阶段”(也称作G2/M阶段或G2/M转换)应当表示合成阶段
(S)后面的细胞周期短阶段，其中细胞携带至少两套染色体，为分裂做好准备且为有丝分裂(M)而加工。G2+M阶段后面是以一套染色体为特征的阶段。术语“多肽”指含有两个或更多个氨基酸，通常至少3个，优选至少20个，更优选至少30个，更优选至少50个氨基酸的蛋白质或肽。该术语还指更高分子量的多肽，诸如蛋白质。在下文中，术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用。如本文中使用的，术语“目标多肽”或POI指在宿主细胞中生成的生物产物。更具体地，生成在宿主细胞中天然不存在的多肽，例如异源蛋白。其它多肽对于宿主细胞可以是天然的，例如同源蛋白，但是是例如如下生成的，即通过用含有编码POI的核酸序列的自身复制载体转化，或在一个或多个拷贝的编码POI的核酸序列通过重组技术整合入宿主细胞的基因组中之后，或通过重组修饰一种或多种控制编码POI的基因表达的调节序列，例如启动子 序列。在一些情况中，如本文中使用的，术语POI还指任何由重组表达的蛋白质介导的由宿主细胞生成的代谢物。术语“野生-插件宿主细胞”应当表示通过遗传工程制备成包含调节基因(诸如那些编码细胞周期调控剂的)且准备好并入目标基因(GOI)的宿主细胞。野生-插件细胞系因此是预先形成的宿主细胞系，其特征在于它表达任何期望POI的能力。这遵循一种用于生成用于生成生物药物的生产细胞系(也称作表达宿主细胞系)的创新性“野生-插件”策略，例如使用位点特异性重组酶介导的盒式交换或同源重组。例如，此类新宿主细胞便于在几天内将GOI克隆入预先确定的基因组表达热点中以得到能繁殖的、高效的生产细胞系。在确定酵母巴斯德毕赤酵母的qP、μ、和其它细胞特性的关系时，令人惊讶地发现qP还与宿主细胞的细胞周期分布有关(图2)。发现培养物在更多细胞处于细胞周期的G2+M阶段时更有生产力。根据这些出乎意料的数据，得出结论，以如下方式改造细胞就能实现更好的细胞特性，即改变低μ时细胞周期阶段的分布，使得与野生型相比更多的细胞处于细胞周期的G2+M阶段。依照本发明，如此实现了在低μ时展示高qP，由此延长细胞培养物生成POI的生产阶段的宿主细胞。通过本发明方法，qP和产物浓度这两个参数优选提高至少30%，优选至少40%，更优选至少50%。依照本发明实现的高生产力具体特征在于qP/μ比为至少3 μ g产物/g干生物量。优选地,获得的体积产量在0.01至IOmg/ (L.h)的范围中，优选在lmg/ (L.h)以上。依照本发明，制备了具有经修饰细胞周期控制机制(其在延长的时段里作为稳态将细胞保持于G2+M细胞周期阶段)的细胞突变体，并证明了其实现与野生型相比更高总体生产力和更高产物浓度。通过有效延长相对较短的G2+M细胞周期阶段，优选获得宿主细胞培养物中高百分比的G2+M细胞。依照本发明的工业工艺中使用的生产细胞系中实现的优选G2+M阶段细胞含量为至少50%，优选至少60%，更优选至少70%,甚至更优选至少80%直至90%。如果将细胞培养物中的期望份额G2+M细胞维持延长的时段，那么会实现稳态生产阶段。优选地，贯穿补料时间的主体维持稳态，优选补料时间的至少50%，更优选至少60%，至少70%，至少80%或至少90%。典型地，在补料分批工艺中会在至少10小时、优选至少15小时、更优选至少20小时的工艺时间里维持稳态，这反映细胞培养的生产阶段。在连续工艺中，工艺时间甚至会延长更久。典型地，细胞群的细胞周期状态可以使用对细胞核的DNA内容物染色的荧光染料通过流式细胞术来测定。流式细胞术也适合于检查群体内细胞的整体细胞周期分布。通过细胞DNA内含物的定量信息，可以确定处于细胞周期G1、S和G2+M阶段的细胞的相对数目。由于细胞核DNA内含物贯穿细胞周期以能够合理预测的方式变化，因此有可能监测细胞周期不同阶段之间细胞的相对分布。由于将细胞指派至G2或M阶段的不确定性，该技术通常不会精确确定任何细胞个体的细胞周期位置。如此，提高处于G2+M阶段的细胞分布的和。遗传工程的靶优选是细胞周期调节剂，其可以特异性过表达、激活、突变、下调、降解或抑制。过表达通过例如经由采用高生产性表达盒或经由导入额外的编码细胞周期调节剂的基因表达额外的细胞周期调节剂拷贝来实现。激酶经由磷酸化的活化得到例如相应磷酸化因子和辅因子的支持。也可以修饰细胞周期调节剂以提供降解抗性突变体。用于下调细胞周期调节剂的例示性手段采用沉默相应基因，使用siRNA、反义RNA或microRNA来进行。也可以通过提高相应酶或抑制剂浓·度或活性来降解或抑制细胞周期调节剂，例如通过调控特定蛋白酶或激酶的活性来进行。依照一个具体实施方案，可以使用敲除宿主细胞，其中破坏了编码细胞周期调控剂的基因以下调或消除它们的表达。可以通过用于部分或完全敲低相应基因的方法来生成敲除宿主细胞。在基因功能或表达被下调或消除的那些情况中，所得细胞或生物体也可以称作敲除。生成敲低细胞或生物体的方法的一个实施方案包含向要敲低某基因的细胞或生物体中导入靶向该基因或其调节序列的RNA并在发生反义RNA的条件下维持所得细胞或生物体，导致相应mRNA或其调节序列降解或灭活，由此生成敲低细胞或生物体。在另一个实施方案中，通过基因删除、启动子交换、或创建温度敏感性突变体来生成敲低细胞或生物体。为了改造宿主细胞来表达细胞周期调控剂，可以使表达盒稳定整合入宿主细胞基因组中。通过合适手段，可以构建包含一种或多种细胞周期调控剂的合适表达载体，而且可以测定它们对G2+M阶段分布的影响。可以将共表达POI获得的产量与野生型比较以确定调控剂对POI表达的影响。实验规程的详细描述可以见下文实施例。可以使表达细胞周期调控剂的优选表达盒稳定整合入宿主细胞基因组中以制备依照本发明的宿主细胞系。依照一个优选实施方案，细胞周期调节剂Clb2或其它细胞周期调节剂诸如别的G2/有丝分裂特异性细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(Cdk)、及其调节因子诸如 Clb2、Clbl、Clb3-6、Cdcl4、Cdc20、Cdc28、Mad2、Pdsl、Rrp42、Whi2 的过表达通过导入编码此类细胞周期调节剂的基因，由此增加拷贝数和相应活性来实现。由此，细胞实际证明有低μ处与野生型相比更高的qP。通过共表达合适细胞周期调控剂和Ρ0Ι，有可能在可比较条件下提供相对于野生型至少相同，或至少约1.3倍、或至少约2倍、或至少约3倍、4倍、5倍、直至10倍产量提高。野生-插件细胞系可以通过改造宿主细胞以生成相应细胞周期调控剂作为第一步来制备。然后，可以将野生-插件细胞系变成生产细胞系，其接受改造以表达POI。或者，宿主细胞可以同时重组编码细胞周期调控剂的基因和别的目标基因。而且，宿主细胞也可以首先改造成表达Ρ0Ι，然后重组编码细胞周期调控剂的基因。POI可以是任何真核、原核或合成多肽。它可以是天然分泌蛋白或胞内蛋白，即天然不分泌的蛋白质。本发明还提供天然蛋白质的功能性同系物、功能性等同变体、衍生物和生物学活性片段的重组生成。功能性同系物优选与序列相同或与序列对应或具有序列的功能特征。本文中提到的POI可以是但不限于适合作为生物制药物质的蛋白质像抗体或抗体片段、生长因子、激素、酶、疫苗、或可用于工业应用的蛋白质像例如酶。优选的POI选自下组:人血清蛋白质，诸如免疫球蛋白或血清清蛋白，酶，激素，信号分子，基质蛋白，其片段或衍生物，或介导宿主细胞代谢物生成的多肽。POI优选是异源重组多肽或蛋白质，其可以在真核细胞(优选酵母细胞)中有利地生成，优选作为分泌蛋白。优选生成的蛋白质的例子是免疫球蛋白、免疫球蛋白片段、抑肽酶、组织因子途径抑制剂或其它蛋白酶抑制剂、和胰岛素或胰岛素前体、胰岛素类似物、生长激素、白介素、组织纤溶酶原激活剂、转化生长因子a或b、高血糖素、高血糖素样肽I (GLP-1)、高血糖素样肽2 (GLP-2)、GRPP、因子VI1、因子VII1、因子XII1、血小板衍生生长因子1、血清清蛋白、酶诸如脂肪酶或蛋白酶、或任一种这些蛋白质的功能性类似物。在本发明语境中，术语“功能性类似物”意图指具有与天然蛋白相似的功能的多肽。多肽可以在结构上与天然蛋白相似，而且可以通过对天然蛋白C和N末端任一或二者或侧链添加一个或多个氨基酸、替代天然氨基酸序列中一个或多个不同位点处的一个或多个氨基酸、删除天然蛋白两端任一或二者处或氨基酸序列中一个或多个位点处的一个或多个氨基酸、或在 天然氨基酸序列中的一个或多个位点处插入一个或多个氨基酸而衍生自天然蛋白。此类修饰对于上文提到的几种蛋白质是公知的。 重组POI通常通过重组技术经由包含编码此类POI的目标重组基因的重组生成细胞系来生成。具体理解的是，根据情况，此类POI(如依照本发明生成的)不是细胞周期调控剂或细胞周期调节剂，但是任选作为由同一细胞培养物生成的任何重组细胞周期调控剂之外的重组产物来生成。POI也可以选自在宿主细胞中提供生物化学反应的底物、酶、抑制剂或辅因子，目的是获得所述生物化学反应或一系列数个反应的产物，例如获得宿主细胞的代谢物。例示性产物可以是维生素，诸如核黄素、有机酸、和醇或抗生素，它们可以在依照本发明表达重组蛋白或POI后以提高的产量获得。通常，表达重组产物的宿主细胞可以是任何适合于重组表达POI的真核细胞。优选用作本发明宿主细胞的酵母细胞的例子包括但不限于糖酵母/酵母(Saccharomyces)属(例如啤酒糖酵母/酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、毕赤酵母(Pichia)属(例如巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)或甲醇毕赤酵母(P.methanolica))、Komagataella 属(K.pastoris、K.pseudopastoris 或 K.phaffii)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)或乳克鲁维酵母(Kluyveromyces Iactis)。更新的文献将巴斯德毕赤酵母划分和重命名成Komagataella pastoris、Komagataella phaffii和Komagataella pseudopastoris。在本文中，巴斯德毕赤酵母与 Komagataella pastoris、Komagataella phaffii 和 Komagataella pseudopastoris 全部同义使用。依照本发明优选使用的酵母生产生物体可以是任何合适酵母生物体，其在培养上生成大量的所讨论异源蛋白或多肽。合适酵母生物体的优选例子是选自酵母物种啤酒糖酵母/酿酒酵母、克鲁弗利氏糖酵母(Saccharomyces kluyveri)、粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、葡萄汁糖酵母(Saccharomyces uvarum)、乳克鲁维酵母、多形汉逊酵母、巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、克鲁弗利氏毕赤酵母(Pichia kluyveri)、解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia Iipolytica)、假丝酵母(Candida sp.)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、可可假丝酵母(Candida cacaoi)、地霉(Geotrichum sp.)、和发酵地霉(Geotrichum fermentans)的菌株。最优选的酵母宿主细胞衍生自甲基营养型酵母,诸如毕赤酵母或Komagataella,例如巴斯德毕赤酵母，或 Komoagataella pastoris,或 K.phaffii,或 K.pseudopastoris.宿主的例子包括酵母，诸如巴斯德毕赤酵母。巴斯德毕赤酵母菌株的例子包括CBS704 (=NRRL Y_1603=DSMZ70382)、CBS2612 (=NRRL Y-7556)、CBS7435 (=NRRL Y-11430),CBS9173-9189、和DSMZ70877 (德国微生物和细胞培养物保藏中心)，但是还有例子Invitrogen的菌株，诸如X-33、GS115、KM71和SMD1168。酿酒酵母菌株的例子包括W303、CEN.PK和BY系列(EUROSCARF保藏中心)。上文描述的所有菌株已经成功用于生成转化子和表达异源基因。合适高等真核细胞(诸如哺乳动物、昆虫或植物细胞)的例子是CHO、Per.C6、HEK293、Sf-9、烟草(Nicotiana tabacum) NT-1 或 BY-2。通常，本文中提到的目标蛋白质可以通过本领域技术人员公知的重组表达方法来生成。依照本发明，可以采用本领域技术范围内的常规分子生物学、微生物学、和重组DNA技术。文献中充分解释了此类技术。参见例如Maniatis, Fritsch&Sambrook, "MolecularCloning:A Laboratory Manual(1982)。可用于改造如依照本发明使用的，能提供改良重组蛋白生成的宿主细胞的核苷酸序列可以自多种来源获得。启动子的起源优选来自酵母细胞，最优选来自甲基营养型酵母诸如来自毕赤酵母属。核苷酸序列的优选同源起源便于其并入同一属的宿主细胞中，如此能够稳定生成P0I，有可能在工业制造工艺中提高产量。也可以使用来自其它合适宿主的异源功能等同核苷酸序列。适宜表达载体包含适合于在真核宿主细胞中表达编码异源多肽或蛋白质的DNA的调节序列。调节序列的例子包括启动子、操纵基因、和增强子、核糖体结合位点、和控制转录和翻译起始和终止的序列。调节序列可以与要表达的DNA序列可操作连接。例如，如果启动子控制编码序列的转录，就说启动子序列与编码序列可操作连接。依照本发明，优选提供包含与编码细胞周期调控剂的核苷酸序列及与编码POI的核苷酸序列可操作连接的调节序列的巴斯德毕赤酵母宿主，任选进一步采用与它们可操作连接的调节序列。依照一个优选实施方案，依照本发明的方法采用编码POI的重组核苷酸序列，其在适合于整合入宿主细胞基因组中的质粒上以每个细胞一个或多个拷贝提供。编码POI的重组核苷酸序列也可以在自主复制质粒上以每个细胞一个或多个拷贝提供。依照本发明的优选方法采用质粒，它是真核表达载体，优选酵母表达载体。表达载体可包括但不限于克隆载体、改良克隆载体和专门设计的质粒。本发明中使用的优选表达载体可以是适合于在宿主细胞中表达重组基因的任何表达载体，而且根据宿主生物体来选择。重组表达载体可以是能够在宿主生物体中复制或整合入宿主生物体基因组中的任何载体，也称作宿主载体，诸如酵母载体。优选的酵母表达载体用于选自下组的酵母中的表达:甲基营养型酵母，以汉逊酵母(Hansenula)属、毕赤酵母属、假丝酵母(Candida)属和球拟酵母(Torulopsis)属为代表。 在本发明中，优选使用自pPICZ、pGAPZ、pPIC9、pPICZalfa、pGAPZalfa、pPIC9K、pGAPHis或pPUZZLE衍生的质粒作为载体。为了容许在宿主细胞中表达重组核苷酸序列，表达载体可以提供与编码序列5’端邻接(例如在信号肽基因上游)的具有功能性启动子的重组核苷酸序列。由此通过此启动子序列来调节和启动转录。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何合适DNA序列，而且可以衍生自编码对于宿主而言同源或异源的蛋白质的基因。启动子优选衍生自编码对于宿主细胞而言同源的蛋白质的基因。启动子可以是内源启动子，或者对于宿主细胞而言是异源的。与哺乳动物宿主细胞一起使用的合适启动子序列可以包括但不限于自病毒基因组获得的启动子、异源哺乳动物启动子(例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子)、和热休克蛋白启动子。启动子不限于任何特定物种，前提是它们能在真核宿主细胞中(特别是在酵母中)发挥功能。别的与酵母宿主细胞一起使用的合适启动子序列可以包括但不限于自编码已知以高浓度在细胞中存在的代谢酶的基因获得的启动子，例如糖酵解酶，像磷酸丙糖异构酶(TPI)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、醇氧化酶(AOX)、乳糖酶(LAC)和半乳糖苷酶(GAL)。合适启动子的优选例子是酵母启动子，其含有发挥酵母细胞中基因转录启动子功能的DNA序列。优选例子是酿酒酵母Ma1、TP1、CUP、ADH或PGK启动子，或巴斯德毕赤酵母葡萄糖-6-磷酸异构酶启动子(PPGI)、3_磷酸甘油酸激酶启动子(PPGK)或甘油醛_3_磷酸脱氢酶启动子PGAP、醇氧化酶启动子(PAOX)、甲醛脱氢酶启动子(PFLD)、异柠檬酸裂合酶启动子(PICL)、翻译延伸因子启动子(PTEF)，和巴斯德毕赤酵母烯醇酶I (PENOl)、磷酸丙糖异构酶(PTPI)、α-酮异己酸脱羧酶(PTHI)、核糖体亚基蛋白(PRPS2、PRPS7、PRPS31、PRPLI)、热休克蛋白家族成员(PSSA1、PHSP90、PKAR2)、6_磷酸葡萄糖脱氢酶(PGNDl)、磷酸甘油酸变位酶(PGPMl)、转酮醇酶(PTKLl)、磷脂酰肌醇核酶(PPISl)、铁-02-氧化还原酶(PFET3)、高亲和力铁通透酶(PFTRl)、可阻抑碱性磷酸酶(PPH08)、N-肉豆蘧酰转移酶(PNMTl)、外激素应答转录因子(PMCMl)、泛素(PUBI4)、单链DNA内切核酸酶(PRAD2)的启动子和线粒体内膜主要ADP/ATP载体(PPET9)的启动子。在一种优选的表达系统中，启动子是诱导型或组成性启动子。依照本发明的一个优选实施方案，通过将有关基因连接入载体中来获得重组构建物。通过使用此类载体转化宿主细胞，这些基因可以稳定整合入宿主细胞基因组中。可以使用重组宿主细胞系生成由基因编码的多肽通过培养转化子，如此获得在适宜培养基中，自培养物分离所表达的POI，并纯化它通过适合于表达产物的方法，特别是将POI与污染性蛋白质分开。用于连接DNA序列(例如分别编码细胞周期调控剂和/或Ρ0Ι、启动子和终止子的)，并将它们插入含有整合或宿主复制所必需的信息的合适载体中的规程是本领域技术人员公知的，例如记载于 J.Sambrook et al., "Molecular Cloning2nd ed.〃，Cold SpringHarbor Laboratory Press (1989)。会理解，可以构建一种或多种利用编码细胞周期调控剂和/或POI的基因作为整合靶的载体，或是通过首先制备含有编码调控剂和/或POI的完整DNA序列的DNA构建物，随后将构建物插入一种或多种合适的表达载体中，或是通过序贯插入含有各种基因的遗传信息的DNA片段，接着连接。还有，可以依照本发明使用多克隆载体(即具有多克隆位点的载体)，其中可以在多克隆位点处并入期望基因以提供表达载体。在表达载体中，启动子放置在POI基因的上游并调节基因的表达。在多克隆载体的情况中，因为在多克隆位点处导入POI基因，所以启动子放置在多克隆位点的上游。用于真核宿主细胞中POI表达和分泌的几种不同办法是优选的。通过用包含编码期望蛋白质的DNA和至少一种本发明调节元件的表达载体转化真核生物体，制备经转化生物体的培养物，培养培养物并自培养液回收蛋白质，表达、加工并分泌蛋白质。所采用的信号肽可以是本发明的信号肽或备选的信号肽，例如异源信号肽或天然信号肽与异源信号肽的杂合物。信号肽的功能是容许异源蛋白质分泌以进入内质网。信号肽通常在此过程中被切掉。信号肽对于生成蛋白质的宿主生物体可以是异源的或同源的。为了获得依照本发明的重组宿主细胞而提供的DNA构建物可以通过已建立的标准方法(例如亚磷酰胺方法)以 合成方式制备。DNA构建物也可以是基因组或cDNA起源的，例如通过制备基因组或cDNA文库并依照标准技术使用合成寡核苷酸探针通过杂交筛选编码整个或部分POI的DNA序列来获得。最后，DNA构建物可以是混合的合成和基因组、混合的合成和cDNA、或混合的基因组和cDNA起源的，通过根据需要依照标准技术使合成、基因组或cDNA起源的片段退火来制备，其中所述片段对应于完整DNA构建物的各个部分。本发明的转化子可以通过将此类载体DNA(例如质粒DNA)导入宿主中并选择以高产量表达POI或宿主细胞代谢物的转化子来获得。通过常规用于转化真核细胞的方法(诸如电脉冲方法、原生质体方法、醋酸锂方法、及其改良方法)处理宿主细胞，使得它们能够并入外来DNA。巴斯德毕赤酵母优选通过电穿孔来转化。在另一个优选实施方案中，酵母表达载体能够稳定整合入酵母基因组中，例如通过同源重组。要理解，本文中公开的方法可进一步包括在允许POI表达(优选以分泌形式)的条件下培养所述重组宿主细胞。然后可以自细胞培养液或其它细胞培养物级分分离分泌的重组生成的POI或宿主细胞代谢物并通过本领域技术人员公知的技术进一步纯化。依照本发明的一种优选方法指提高细胞培养物中重组POI生产的产量，包括a)遗传工程改造真核生产细胞系以专门引起G2+M细胞周期阶段延长，b)培养所述生产细胞系，并c)收集含有POI的细胞培养物级分。
合适的培养技术可以涵盖在生物反应器中培养，以分批阶段开始，接着是较短的处于高比生长速率的指数式补料分批阶段，再接着是处于低比生长速率的补料分批阶段。另一种合适的培养技术可以涵盖分批阶段，接着是处于低稀释速率的连续培养阶段。优选的发酵技术是分批、补料分批或连续培养。工业规模的生产条件指例如反应器体积100L至IOm3或更大、采用几天的典型工艺时间的补料分配培养，或发酵罐体积大约50 - 1000L或更大、稀释速率大约0.05 -0.151Γ1的连续工艺。还可以在没有重组细胞周期调控剂影响的情况中获得本发明高产生产细胞培养物，例如通过会延长G2+M阶段的特定培养技术。其中有受控温度条件(像低于最适生长温度的温度)或底物补料(像间歇补料控制或底物或化学药品脉冲)等等。由此，细胞培养物能以稳态维持于适于支持细胞培养物高生产力的期望G2+M分布。通过用编码细胞周期调控剂的基因和/或POI基因转化细胞获得的依照本发明的转化子宿主细胞可以优选首先在没有表达异源蛋白的负担下以有效生长至大细胞数目的条件培养。当细胞系准备好POI表达且细胞培养物实现通常为10g/L细胞干重的细胞密度时，选择生成表达产物的培养技术。优选的是，在生物反应器中在生长条件下培养依照本发明的宿主细胞系以获得至少lg/L细胞干重、更优选至少10g/L细胞干重、优选至少50g/L细胞干重但少于150或少于200、优选少于100的细胞密度。当转化子在诱导性刺激下培养时，可以激活细胞周期调控剂以实现G2+M稳态并表达POI。诱导性刺激优选是热，或添 加钙、铜、渗透压提高剂、过氧化氢、乙醇、甲醇、甲胺等等。或者，可以通过去阻抑(例如通过消除或稀释葡萄糖或硫胺)等等来刺激基因表达。优选地，在具有合适碳源的矿质培养基中培养酵母，由此进一步显著简化分离工艺。优选的矿质培养基的一个例子是一种含有可利用碳源(例如葡萄糖、甘油或甲醇)、含有宏量元素(钾、镁、钙、铵、氯化物、硫酸盐、磷酸盐)和痕量元素(铜、碘化物、锰、钥酸盐、钴、锌、和铁盐、和硼酸)的盐、和任选的维生素或氨基酸(例如用于补足营养缺陷型)的矿质培养基。有利的是以中试或工业规模提供POI生产。工业工艺规模会优选采用至少50L、优选至少lm3、优选至少10m3、最优选至少IOOm3的体积。优选采用生成至少lmg/L、优选至少10mg/L、优选至少100mg/L、最优选至少lg/L产量的条件来表达POI。优选通过至少一种下述测试对依照本发明的宿主细胞测试其表达能力或产量:ELISA，活性测定法，HPLC,或其它合适测试。在适合于实现期望POI表达的条件下培养转化细胞，可以根据表达系统和所表达蛋白质的性质，例如蛋白质是否与信号肽融合及蛋白质是可溶性的还是膜结合的，自细胞或培养液纯化期望Ρ0Ι。正如技术人员会理解的，培养条件会依照包括宿主细胞的类型和所采用的特定表达载体在内的因素而变化。优选的是，收集细胞培养物的特定级分以获得作为生物产物的Ρ0Ι。典型地，会收集细胞培养物上清液，例如为了获得分泌的Ρ0Ι。根据POI特征，可以自细胞内级分或细胞碎片回收POI。例如，超声或机械、酶促或化学破碎培养的转化子细胞以获得含有期望POI的细胞提取物，自其分离和纯化POI。自酵母细胞分泌重组表达产物通常是有利的，原因包括便于纯化工艺，因为可以自培养物上清液而非自破碎酵母细胞以释放细胞内蛋白质时产生的复杂蛋白质混合物回收产物。通常可以使用现有技术来分离和纯化期望化合物。作为用于获得重组多肽或蛋白质产物的分离和纯化方法，可以使用诸如利用溶解度差异的方法(像盐析和溶剂沉淀)、利用分子量差异的方法(诸如超滤和凝胶电泳)、利用电荷差异的方法(诸如离子交换层析)、利用特异性亲和的方法(诸如亲和层析)、利用疏水性差异的方法(诸如反相高效液体层析)、和利用等电点差异的方法(诸如等电聚焦)等方法。优选采用具体纯化步骤来分开任何共表达且会污染POI制备物的细胞周期调控剂。高度纯化的产物基本上不含污染性蛋白质，而且优选具有至少90%，更优选至少95%，或甚至至少98%，直至100%的纯度。纯化的产物可以通过纯化细胞培养物上清液或自细胞碎片来获得。分离并纯化的POI可以通过常规方法如Western印迹或测定其活性的方法来鉴定。纯化的化合物的结构可以通过氨基酸分析、氨基末端分析、一级结构分析、等等来确定。优选的是，大量且高纯度获得化合物，如此达到在药物组合物中作为活性组分使用的必要要求。依照本发明的优选宿主细胞系维持依照本发明采用的遗传特性，而且表达水平保持较高，例如至少在μ g水平，甚至在约20代培养之后，优选至少30代，更优选至少40代，最优选至少50代。重组宿主细胞惊人地稳定，这在用于工业规模蛋白质生产时极为有利。在下面的实施例中更为详细地描述本发明，它们绝非意图限制本发明的要求保护的范围。
实施例 实施例1.在特定生长速率的细胞周期分布为了分析处于不同特定生长速率的巴斯德毕赤酵母细胞，在恒化培养物中以介于0.0ltT1和0.211Γ1之间的稀释速率范围培养它们。当分批培养结束时启动恒化培养。每一种稀释速率维持至少五个停留时间，之后采集样品来测定生物量干重、Fab片段浓度和细胞周期分布。恒化培养基GLUOl:每IOOOmL ddH20溶解1.0g柠檬酸单水合物、55g葡萄糖单水合物、4.4g(NH4)2HP04、0.7g MgS04*7H20、1.7g KC1、0.01gCaCl2*2H20、1.6mL 痕量金属溶液(PTMl)和1.0mL生物素溶液(0.ZgL—1)，接着无菌过滤。通过清洗并干燥IOmL等分试样培养物的生物量来测定干生物量浓度。如Dragosits et al.2009 (J.Proteome Res.2009Mar; 8 (3): 1380-92)所述通过 ELISA 来测定Fab片段浓度。通过将Fab浓度除以干生物量浓度并乘以稀释速率来计算比生产力。对于细胞周期阶段分布分析，清洗每个样品点的乙醇固定细胞样品并用RNA酶A处理。然后超声处理细胞并在碘化丙啶溶液中温育以容许试剂进入细胞并对基因组DNA染色。流式细胞术容许测量数千细胞。以事件数50，000作为标准数量。在剩余样品中细胞浓度很低的情况中，不得不降低这个阈值。借助FCS Express软件来评估数据。如下计算处于细胞周期G2+M阶段的细胞的百分比:(%G2+M细胞)/ [ (%G1细胞)+ (%G2+M细胞)]。结果是，处于Gl阶段的细胞的百分比为100-(%G2+M细胞)。这种计算忽略了所有没有指派至Gl或G2+M阶段的细胞。图3显示了不同特定生长速率时的比生产力qP和细胞周期阶段分布。实施例2.巴斯德毕赤酵母中CLB2的过表达及测定特定生长速率的细胞周期分布a)共过表达质粒的构建为了生成适合于在早就表达异源蛋白质的菌株中共过表达巴斯德毕赤酵母CLB2基因的质粒，通过PCR自巴斯德毕赤酵母cDNA文库扩增CLB2基因。通过使用相应正向寡核苷酸引物(5，-GATCCACCTGCAGGCCATGTCTAATGTTCAGCCTAACGA-3’，SEQ ID N0.1)和反向寡核苷酸引物(5，-TCGGCCGAGGCGGCCCTACAAAATTGGATCCATGATGC-3’，SEQ ID N0.2)来添加非模板编码的巴斯德毕赤酵母Kozak序列和SbfI和SfiI限制性位点。将经SbfI和SfiI处理的PCR产物克隆入pPuzzleKanR(经SbfI和SfiI消化并用碱性磷酸酶处理)中。将新的共过表达质粒pPuzzleKanR_CLB2转化入大肠杆菌ToplO (Invitrogen)中。进行了限制性内切核酸酶消化和测序来验证构建质粒的正确身份。b)共过表达重组人抗体Fab片段3H6和新的辅助因子基因的巴斯德毕赤酵母菌株的构建使用自实施例2步骤a)中描述的克隆规程获得的质粒pPuzzleKanR-CLB2来转化为在 GAP 启动子(Dragosits et al.2009, J Proteome Res.2009Mar; 8 (3): 1380-92)控制下高水平表达重组人抗体Fab片段3H6而预选择的巴斯德毕赤酵母菌株。选择基于Zeocin抗性(用于Fab片段基因)和遗传霉素抗性(用于辅助因子基因)。为了评估共过表达的 细胞周期调节剂基因的效果，还用无细胞周期调节剂基因的pPuzzleKanR质粒转化表达Fab片段的菌株。
_5] 实施例3.过表达/删除其它细胞周期调节剂以改变细胞周期a)对于过表达其它细胞周期调节剂，如实施例2.a所述构建表达载体，只是扩增并克隆期望的细胞周期调节剂基因来代替CLB2。如此将酿酒酵母MAD2和TOS1、和巴斯德毕赤酵母 RRP42 克隆入 pPuzzleKanR 中以构建 pPuzzleKanR_MAD2、pPuzzIeKanR-PDSUPpPuzzIeKanR-RRP42。如实施例2.b所述将这些质粒转化入生成3H6Fab的巴斯德毕赤酵母中。b)自巴斯德毕赤酵母基因组敲除细胞周期调节剂基因通过PCR扩增细胞周期调节剂基因长度大约350bp的两种片段，并克隆到赋予G418抗性的kanMX4标志物盒两侧。转化巴斯德毕赤酵母并选择G418抗性后，通过PCR验证细胞周期调节剂基因的一部分的删除。实施例4.培养细胞培养物及分析细胞周期调节剂过表达的效果过表达CLB2的菌株(如实施例2.b中描述的)在50mL管中的2.5mLYPD(20g/L大豆胨(HY QUEST)，10g/L酵母提取物，20g/L葡萄糖，pH7.4)中的预培养物用来自板的细胞接种。次日，以0.1的0D_接种全部主培养物(50mL管中的IOmL合成摇瓶培养基)。主培养物培养基:每IOOOmL ddH20溶解22g柠檬酸单水合物，22g葡萄糖单水合物，
3.15g (NH4)2HPO4,0.492g MgS04*7H20，0.8040g KCl，0.0268g CaCl2*2H20，1.47mL 痕量金属溶液(PTMl)和2.0mL生物素溶液(0.2g L-1)。用K0H25%将pH调至5，接着无菌过滤。
主培养以0.1的OD6tltl开始，并于室温以170rpm摇动。大约24小时后及48小时后结束时测量光密度。在这两个时间点采集用于蛋白质分析的上清液样品。关联通过ELISA分析的细胞外Fab浓度与培养24和48小时后的培养物光密度。每种菌株培养四个转化子，并与它们相应对照菌株比较。平均产物/生物量:CLB2克隆较之载体对照的倍数变化:
权利要求
1.一种在细胞培养物中生成重组目标多肽(POI)的方法，包括遗传工程改造真核细胞系 -以在预培养阶段中专门引起G2+M细胞周期阶段延长，及 -以在预培养阶段后的生产阶段中生成Ρ0Ι。
2.权利要求1的方法，其中所述细胞系是在其基因组中稳定整合了用于表达细胞周期调控剂的表达盒的细胞系。
3.权利要求1或2的方法，其中所述细胞系接受工程改造以调控细胞周期调节剂，优选通过特异性过表达、激活、突变、下调、删除、降解或抑制细胞周期调节剂来进行。
4.权利要求3的方法，其中所述细胞周期调节剂选自下组:Cdk/细胞周期蛋白复合物诸如细胞周期蛋白依赖性激酶(Cdk)，G1特异性细胞周期蛋白，G2/有丝分裂特异性细胞周期蛋白，及其转录或降解因子,诸如 Clb2，Clbl，Clb3-6，Clnl-3，Cdc6，Cdcl4，Cdc20,Cdc28,Cdc48, CdhI, Karl, Mad2, MBF，Mcml, Pdsl, Rrp42, SBF，Sicl, SweI, Swi5, Whi2。
5.权利要求1至4任一项的方法,其中所述细胞系是野生-插件(wild-card)宿主细胞系或接受改造以生成细胞周期调控剂和所述POI的生产细胞系。
6.权利要求1至5任一项的方法，其中所述POI选自下组:血清蛋白质，诸如免疫球蛋白或血清清蛋白，酶，激素，信号分子，基质蛋白质，其片段或衍生物，或介导宿主细胞代谢物生成的多肽。
7.权利要求1至6任一项的方法，其中所述细胞是真菌细胞，优选酵母细胞，诸如毕赤酵母(Pichia)属的细胞,特别是巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)菌株的细胞,或高等真核细胞，优选哺乳动物或植物细胞。
8.通过权利要求1至7任一项的方法获得的高产生产细胞系，其具有至少0.1 μ g/(g.h)的比生产力qP来生成所述Ρ0Ι。
9.通过权利要求1至7任一项的方法获得的细胞系的高产生产细胞培养物，其中在占补料时间至少50%的过程时间里至少50%的细胞在G2+M阶段中。
10.权利要求9的细胞培养物，其在至少10小时的时段里处于稳态。
11.权利要求9或10的细胞培养物，其为补料-分批或连续细胞培养物。
12.权利要求9至11任一项的细胞培养物，其在工业规模具有至少0.1 μ g/ (L.h)的体积生产力Qp。
13.细胞培养物中提高重组POI生产的产量的方法，包括 a)遗传工程改造真核生产细胞系以专门引起G2+M细胞周期阶段延长， b)在预培养阶段中培养所述生产细胞系以获得G2+M细胞周期阶段延长的稳态细胞培养物， c)在所述预培养阶段后的生产阶段中培养所述稳态细胞培养物以生成该Ρ0Ι，并 d)收集细胞培养物含有POI的级分。
14.细胞培养物中延长真核生产细胞系的重组POI生产阶段的方法，包括遗传工程改造细胞系以专门弓I起G2+M细胞周期阶段延长。
全文摘要
本发明涉及一种在细胞培养物中生成重组目标多肽(POI)的方法，包括遗传工程改造真核细胞系-以在预培养阶段中专门引起G2+M细胞周期阶段延长，及-以在预培养阶段后的生产阶段中生成POI，本发明还涉及一种高产生产细胞系和细胞培养物，以及一种提高细胞培养物中重组POI生产的产量的方法。
文档编号C12N1/15GK103097542SQ201180042739
公开日2013年5月8日 申请日期2011年7月4日 优先权日2010年7月5日
发明者D.马塔诺维奇, M.德拉戈赛茨, B.加瑟, M.莫勒, M.索尔 申请人:维也纳农业大学
生产细胞系本发明涉及一种制备用于在细胞培养物中生成目标多肽(POI)的高产生产细胞系的方法。背景重组DNA技术的开发允许使用数种微生物作为宿主来表达具有制药和工业应用的异源蛋白质。今天使用许多不同宿主细胞来生产此类异源蛋白质。用真核宿主实现了成功的重组蛋白生产。最突出的例子是芽殖酵母像啤酒糖酵母/酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)或多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha,),丝状真菌像泡盛曲霉(Aspergillus awamori)或瑞氏木霉(Trichodermareesei)，或哺乳动物细胞像例如CHO细胞。酵母对于生产重组蛋白和小代谢物是有吸引力的宿主。巴斯德毕赤酵母(一种甲基营养性酵母)频繁用作表达系统来生产重组蛋白，而且最近还用于生产小代谢物(Marxet al.Microb Cell Fact7:23 (2008))。毕赤酵母具有高生长速率，而且能够在简单、便宜的培养基上生长。毕赤酵母能在摇瓶或发酵罐中生长，使得它适合于小和大规模生产。最近将巴斯德毕赤酵母重分类入一个新属，Komagataella,而且分成三个新种:Komagataellapastoris,K.phaffii,和K.pseudopastoris (Kurtzman CP.1nt J Syst Evol Microbiol55,973-976 (2005))。因此，巴斯德毕赤酵母是 K.pastoris, K.phaffii 和 K.pseudopastoris这所有三个种的同义词。依照先前的文献，贯穿本文使用巴斯德毕赤酵母，隐含表示任何Komagataella物种。类似地,多形汉逊酵母和安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)同义。在大多数情况中，为工业生产以补料分批工艺培养宿主细胞。此类工艺的总体生产力是生物量随时间的积分和生物量比生产力(qP)的函数。qP与比生长速率(μ)有关，通常随μ升闻而持续升闻。因此，在闻u处实现闻qP，而以初始闻P，然后很低μ实现最佳生物量-时间积分(A)。这体现为下述公式，其用于计算恒定qP时的产物产量(P):P=A.qP
图1显不巴斯德毕赤酵母中qP和μ白勺关系(Maurer et al.2006, Micr.Cell Fact.5:37do1:10.1186/1475-2859-5-37)。因此，以μ的妥协来实现最佳生产力，通常在补料分批中通过受到限制的底物补料来控制。补料分批工艺的一种典型情况是用微生物或哺乳动物细胞生产重组蛋白。虽然细胞团块中产物浓度的描述在细胞外产物的情况中较为直截了当，但是分泌产物的动力学的预测更加复杂。分泌系统的一种典型情况是重组酵母。由于酵母中许多蛋白质的生产对成本相当敏感，因此努力来预测和控制生产力、加工时间和产物滴度。用于优化甲基营养性酵母巴斯德毕赤酵母的补料分批工艺的办法已有记载(Zhang et al.Biotechnol.Prog.2005,21:386-393 ；Maurer et al.2006, Micr.Cell Fact.)。生物工艺的可变 成本与所需发酵单元的体积容量及此单元生成规定量的产物所需的加工时间有关。如此，体积生产力Qp似乎是最可行的优化标的。在给定的过程时间点t, Qp定义为:Qp=P/ (V.t)细胞周期或细胞分裂周期指细胞中发生一系列事件，导致其分裂和复制。真核细胞分裂经由受到高度调节的细胞周期来行进，包括称作Gl (间隙I)、S (合成)、G2 (间隙2)和M( 有丝分裂)的连续阶段。阶段GO称作休眠期，其中休眠细胞在某些情况下或在受到特定刺激后会启动RNA和蛋白质合成(Gl期)，它们是有效进行其DNA倍增和细胞分裂成两个子细胞所必需的。随后，DNA合成开始(S期)；一旦细胞复制了它的DNA，就开始第二个蛋白质合成晚时段(G2期)，它是使细胞准备好分裂(M期)的短阶段。G2和M期都以两套染色体为特征，而且常常被一起看做G2+M阶段。在简短的有丝分裂期期间，真核细胞将其细胞核中的染色体在两个子核中分成相同的两套。通常，有丝分裂之后紧接着就是胞质分裂，即将胞质分成两个子细胞以提供细胞成分的同等分配。
细胞分裂后，每个子细胞开始新周期的分裂间期。临时或非临时停止分裂的细胞就说是进入静止或衰老状态(GO)。细胞周期行进受到规定的时间和空间表达、定位和一些细胞周期调节剂(它们在细胞周期期间展现高度动态的行为)破坏的紧密调节。例如，在特定细胞周期阶段，一些蛋白质自核易位至胞质，或反之，而一些蛋白质被快速降解。关于已知细胞周期控制成分和相互作用的详情，参见 Alberghina L, Coccetti P, Orlandi 1.Systems biology ofthe cell cycle of Saccharomyces cerevisiae:From network mining to system-levelproperties.Biotechnol Adv.2009Nov_Dec; 27 (6): 960-78。细胞周期过程是复杂的且受到高度调节。细胞周期中的错误会经由凋亡杀死细胞，或者可以导致不受控制的细胞分裂，而且在一些情况中导致癌症。细胞周期分析(主要经由研究贯穿G0/G1、S和G2/M细胞周期阶段的细胞分布)已证明可用于分析肿瘤样品及研究对不同刺激的增殖应答以及其它领域。DNA复制(S期)和有丝分裂(M期)的时机和互相依赖性受到细胞周期蛋白依赖性激酶(Cdk)活性振荡的控制。高等真核生物具有多种Cdk，而在酵母中，细胞周期行进需要一种Cdk，在裂殖酵母中称作Cdc2而在芽殖酵母中称作Cdc28。激酶活性波动很大程度上由Cdk的调节性细胞周期蛋白亚基的细胞周期依赖性合成和降解来决定。进入M期取决于出现B型细胞周期蛋白，其相关激酶活性促进有丝分裂纺锤体形成。在芽殖酵母中，S期期间出现的两对相关B型细胞周期蛋白(Clb3，4)和G2(Clbl，2)涉及纺锤体形成和延长。Cross 等人(Molecular Biology of the Cell (2005) 16:2129-2138)描述了真核细胞周期对照系统依赖于Clb2表达水平的一种定量行为。预测了 Clb2过表达系统的稳健性的损失。据记载，一系列真菌调节剂(包括细胞周期调节剂)改进真菌代谢物生成的产量(W001/29073)。在一项改进来自生产细胞系的蛋白质表达的努力中，共表达重组p21或另一种细胞周期抑制剂蛋白以增强单细胞生产力(W002/099100A2)。p21是细胞周期蛋白激酶的一种通用抑制剂，赋予稳定且定量的细胞周期阻滞。如此，在它的细胞抑制效应之外，还不得不小心避免触发细胞死亡或凋亡。W00216590A2公开了通过使细胞自复制状态转换至生产状态(其为假衰老状态)(RP转换)来延长细胞培养物的蛋白质生物合成。这可以通过条件性表达阻滞细胞分裂的细胞周期阻断剂的经转化细胞来实现。通过阻止细胞增殖(诱导分化至衰老样状态)，会获得提高的生物产物产量。通过中止细胞周期于特定阶段或将不同阶段的细胞分开，数种方法可用于使细胞培养物同步。例如，血清饥饿或添加阿尔法因子会将细胞中止在Gl阶段，有丝分裂摇落、秋水仙素处理和诺考达唑(nocodazole)处理将细胞中止在M阶段，而5_氟脱氧尿苷处理将细胞中止在S阶段。延长细胞培养物的生产阶段的一项共同措施是一旦生物量生长至某种程度就限制底物。类似地，据记载，培养基添加剂影响细胞周期。KR100254810B1公开了将抗生素新生霉素添加至CHO细胞培养物来提高重组红细胞生成素的生成。新生霉素充当细胞周期早期阶段(M前)的抑制剂。Uchiyama 等人(Biotechnol Bioeng54:262-271 (1997))描述了酿酒酵母的同步和阻滞培养。使用温度敏感性cdc突变体和阻滞细胞周期行进的抑制剂来诱导同步性，从而研究细胞周期依赖性。通过将许可温度转换成阻抑温度或者通过添加细胞周期抑制剂来停止细胞周期。普遍阻断细胞生长和增殖能有效引起细胞阻滞和早期凋亡，导致细胞培养物的生产期段。一般地，用现有技术很难维持细胞生长缺失下延长的生产力。本发明的目的是延长细胞培养物的高生产阶段以提高生物产物的产量。发明概述 通过提供本申请的实施方案实现了上述目的。依照本发明，提供了一种制备用于在细胞培养物中生成目标多肽(POI)的高产生产细胞系的方法，包括遗传工程改造真核细胞系以专门引起G2+M细胞周期阶段延长。具体而言，该方法用于在细胞培养物中生成重组目标多肽(POI)，包括遗传工程改造真核细胞系-在预培养阶段中以专门引起G2+M细胞周期阶段延长，及-在预培养阶段后的生产阶段中生成Ρ0Ι。预培养阶段中的细胞培养物(即培养中的细胞系)特别用来使细胞生长及建立G2+M细胞周期阶段作为稳态。通过将细胞培养物条件转换至生产阶段，有效生成重组POI和最终由此类POI介导的相应代谢物，仍然维持有利的G2+M细胞周期状态。如此，分阶段培养方法有效提供第一阶段中细胞培养物对能够生成高POI产量的细胞的富集及第二阶段中POI的生成。
具体而言，该细胞系是在其基因组中稳定整合有用于表达细胞周期调控剂的表达盒的细胞系。优选地，该细胞系接受改造以调控细胞周期调节剂，优选通过专门过表达、激活、突变、下调、删除、降解或抑制细胞周期调节剂来进行。依照本发明使用的优选的细胞周期调节剂选自下组:Cdk/细胞周期蛋白复合物诸如细胞周期蛋白依赖性激酶(Cdk)，G1特异性细胞周期蛋白，G2/有丝分裂特异性细胞周期蛋白，及其转录或降解因子,诸如 Clb2，Clbl，Clb3-6，Clnl-3，Cdc6，Cdcl4，Cdc20,Cdc28,Cdc48, CdhI, Karl, Mad2, MBF，Mcml, Pdsl, Rrp42, SBF，Sicl, SweI, Swi5, Whi2。依照一个具体实施方案，所述细胞系是野生-插件宿主细胞系或接受改造以生成细胞周期调控剂和所述POI的生产细胞系。具体而言，优选的POI选自血清蛋白质，诸如免疫球蛋白或血清清蛋白，酶，激素，信号分子，基质蛋白质，其片段或衍生物，或介导宿主细胞代谢物生成的多肽。依照本发明使用的真核细胞系优选是真菌细胞，优选酵母细胞，诸如毕赤酵母属的细胞，特别是巴斯德毕赤酵母菌株的细胞，或高等真核细胞，优选哺乳动物或植物细胞。本发明进一步提供了可通过本发明方法获得的高产生产细胞系，其具有至少0.1 μ g/ (g.h),优选至少0.lmg/ (g.h),更优选至少lmg/ (g.h)的比生产力qP来生成所述POI，例如在工业或技术酶的情况中，在工业规模的生产条件下的细胞培养物中。本发明进一步提供了可通过依照本发明的方法获得的高产生产细胞培养物，其中在占补料时间至少50%的过程时间里至少50%的细胞在G2+M阶段中。具体而言，该细胞培养物能在至少10小时的时段里稳定维持于稳态诸如G2+M分布。依照具体方面，该细胞培养物是补料-分批或连续细胞培养物。在一个特别优选的实施方 案中，本发明的细胞培养物具有至少0.1 μ g/(L.h)，优选至少10 μ g/ (L.h),更优选至少0.lmg/ (L.h),甚至更优选至少lmg/ (L.h)的体积生产力QP，例如在工业或技术酶的情况中，通常在工业规模的生产条件下，例如采用100L至IOm3或更大的反应器体积中的补料分批培养，采用数天的典型过程时间，或大约50 - 1000L或更大的发酵罐体积中的连续工艺，稀释速率为大约0.05-0.15h'依照本发明，进一步提供了一种在细胞培养物中提高重组POI生产的产量的方法，包括a)遗传工程改造真核生产细胞系以专门引起G2+M细胞周期阶段延长，b)培养所述生产细胞系，并c)收集细胞培养物含有POI的级分。具体而言，该方法用于在细胞培养物中提高重组POI生产的产量，包括a)遗传工程改造真核生产细胞系以专门引起G2+M细胞周期阶段延长，b)在预培养阶段中培养所述生产细胞系以获得G2+M细胞周期阶段延长的稳态细胞培养物，c)在所述预培养阶段后的生产阶段中培养所述稳态细胞培养物以生成该Ρ0Ι，并d)收集细胞培养物含有POI的级分。生产阶段中的生产细胞培养物有时称作主培养；下文实施例部分提供了一个例子。依照本发明的又一个方面，提供了一种在细胞培养物中延长真核生产细胞系用于生成重组POI的生产阶段，即重组POI生产阶段的方法，包括遗传工程改造细胞系以专门引起G2+M细胞周期阶段延长。附图简述图1:巴斯德毕赤酵母中qP和μ的关系。下面的线:野生型细胞中的实际关系。上面的线:最闻生广力的最佳关系。
此图显示巴斯德毕赤酵母细胞培养物中Fab表达比生产力和细胞生长的函数关系。曲线的陡度指示给定μ处qp对μ的比，而且是在此给定μ处能实现的产物滴度的度量。如此，通过高初始生长速率，继以延长的一段时间里稳态生产阶段，可以实现最佳产量。图2:巴斯德毕赤酵母中qP、μ和细胞周期分布的关系。qP(黑色线)依照Monod函数依赖于μ。Gl阶段(一套染色体，左柱)和G2+M阶段(至少两套染色体，右柱)细胞的分数指示qP与G2+M阶段的正相关。图3:工程化巴斯德毕赤酵母中qP和μ的关系。正方形:对照(野生型菌株)。三角形:Clb2过表达菌株的改良关系。图4:工程化巴斯德毕赤酵母中μ和细胞周期分布的关系。左条:G1阶段的细胞的分数，右条:G2+M阶段的细胞的分数。发明详述因此，本发明基于一种有利效果，即细胞培养物内处于G2+M阶段的真核细胞数目相对增多或G2+M阶段特异性延长提供高生产力生物工厂装置来生产POI。这通过遗传工程改造细胞系以获得具有下述基因组修饰的重组细胞系来实现，所述基因组修饰会稳定表达引起所述G2+M细胞周期阶段延长的效应器分子。令人惊讶地发现相应细胞培养物会以低比生长速率，由此提高体积产量，从而以高产量稳定生成POI。如此，本发明的生产细胞系不仅可用于补料分批工艺，而且还可用于连续生产工艺，其中维持细胞培养物使得G2+M细胞的分数在延长的生产时间里维持于高水平。如依照本发明使用的，术语“细胞周期调控剂”指上调或下调细胞周期抑制剂、激酶或细胞周期控制系统的其它 酶或辅因子的效应器分子。该术语应当包括细胞周期调节齐U，而且还应当指积极涉及细胞周期过程的此类效应器分子、细胞周期抑制剂或相应酶的激动剂或拮抗剂，激活剂或抑制剂。细胞周期调控剂可以是细胞周期控制机制的生理学效应器、合成剂或化学药品、或证明有调控活性的生物学物质。如此，细胞周期调控剂对细胞周期调节具有直接或间接影响。本领域技术人员能自现有技术衍生此类化合物，并最终通过标准手段测试它们对真核细胞周期的影响。术语“细胞周期调节剂”应当指积极涉及真核细胞的细胞周期控制的生理学(任选内源)物质。术语“细胞系”应当指特定细胞类型已建立的克隆，其已经获得在延长的时段里增殖的能力。术语“宿主细胞系”指用于表达重组基因以生成多肽或由此类多肽介导的细胞代谢物的细胞系。生产宿主细胞系通常理解为准备好在生产工艺中在生物反应器中培养以获得基因产物的细胞系。术语“表达”或“表达系统”或“表达盒”指如下的核酸分子，其含有可操作连接的期望编码序列和控制序列，使得用这些序列转化或转染的宿主能够生成所编码的蛋白质。为了实现转化，表达系统可以包括在载体上；然而，有关DNA也可以整合入宿主染色体中。本文中使用的“表达载体”或“载体”定义为在合适的宿主生物体中转录所克隆的重组核苷酸序列(即重组基因的)和翻译它们的mRNA所需要的DNA序列。此类表达载体通常包含用于在宿主细胞中自主复制的起点、可选择标志物(例如氨基酸合成基因或赋予对抗生素诸如zeocin、卡那霉素、G418或潮霉素的抗性的基因)、多个限制酶切割位点、合适的启动子序列和转录终止子，这些成分可操作连接在一起。如本文中使用的，术语质粒和载体包括自主复制核苷酸序列以及基因组整合核苷酸序列。术语“真核宿主”应当表示任何真核细胞或生物体，其可以培养以表达POI或宿主细胞代谢物。完全理解该术语不包括人类。术语“G2+M细胞周期阶段”(也称作G2/M阶段或G2/M转换)应当表示合成阶段
(S)后面的细胞周期短阶段，其中细胞携带至少两套染色体，为分裂做好准备且为有丝分裂(M)而加工。G2+M阶段后面是以一套染色体为特征的阶段。术语“多肽”指含有两个或更多个氨基酸，通常至少3个，优选至少20个，更优选至少30个，更优选至少50个氨基酸的蛋白质或肽。该术语还指更高分子量的多肽，诸如蛋白质。在下文中，术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用。如本文中使用的，术语“目标多肽”或POI指在宿主细胞中生成的生物产物。更具体地，生成在宿主细胞中天然不存在的多肽，例如异源蛋白。其它多肽对于宿主细胞可以是天然的，例如同源蛋白，但是是例如如下生成的，即通过用含有编码POI的核酸序列的自身复制载体转化，或在一个或多个拷贝的编码POI的核酸序列通过重组技术整合入宿主细胞的基因组中之后，或通过重组修饰一种或多种控制编码POI的基因表达的调节序列，例如启动子 序列。在一些情况中，如本文中使用的，术语POI还指任何由重组表达的蛋白质介导的由宿主细胞生成的代谢物。术语“野生-插件宿主细胞”应当表示通过遗传工程制备成包含调节基因(诸如那些编码细胞周期调控剂的)且准备好并入目标基因(GOI)的宿主细胞。野生-插件细胞系因此是预先形成的宿主细胞系，其特征在于它表达任何期望POI的能力。这遵循一种用于生成用于生成生物药物的生产细胞系(也称作表达宿主细胞系)的创新性“野生-插件”策略，例如使用位点特异性重组酶介导的盒式交换或同源重组。例如，此类新宿主细胞便于在几天内将GOI克隆入预先确定的基因组表达热点中以得到能繁殖的、高效的生产细胞系。在确定酵母巴斯德毕赤酵母的qP、μ、和其它细胞特性的关系时，令人惊讶地发现qP还与宿主细胞的细胞周期分布有关(图2)。发现培养物在更多细胞处于细胞周期的G2+M阶段时更有生产力。根据这些出乎意料的数据，得出结论，以如下方式改造细胞就能实现更好的细胞特性，即改变低μ时细胞周期阶段的分布，使得与野生型相比更多的细胞处于细胞周期的G2+M阶段。依照本发明，如此实现了在低μ时展示高qP，由此延长细胞培养物生成POI的生产阶段的宿主细胞。通过本发明方法，qP和产物浓度这两个参数优选提高至少30%，优选至少40%，更优选至少50%。依照本发明实现的高生产力具体特征在于qP/μ比为至少3 μ g产物/g干生物量。优选地,获得的体积产量在0.01至IOmg/ (L.h)的范围中，优选在lmg/ (L.h)以上。依照本发明，制备了具有经修饰细胞周期控制机制(其在延长的时段里作为稳态将细胞保持于G2+M细胞周期阶段)的细胞突变体，并证明了其实现与野生型相比更高总体生产力和更高产物浓度。通过有效延长相对较短的G2+M细胞周期阶段，优选获得宿主细胞培养物中高百分比的G2+M细胞。依照本发明的工业工艺中使用的生产细胞系中实现的优选G2+M阶段细胞含量为至少50%，优选至少60%，更优选至少70%,甚至更优选至少80%直至90%。如果将细胞培养物中的期望份额G2+M细胞维持延长的时段，那么会实现稳态生产阶段。优选地，贯穿补料时间的主体维持稳态，优选补料时间的至少50%，更优选至少60%，至少70%，至少80%或至少90%。典型地，在补料分批工艺中会在至少10小时、优选至少15小时、更优选至少20小时的工艺时间里维持稳态，这反映细胞培养的生产阶段。在连续工艺中，工艺时间甚至会延长更久。典型地，细胞群的细胞周期状态可以使用对细胞核的DNA内容物染色的荧光染料通过流式细胞术来测定。流式细胞术也适合于检查群体内细胞的整体细胞周期分布。通过细胞DNA内含物的定量信息，可以确定处于细胞周期G1、S和G2+M阶段的细胞的相对数目。由于细胞核DNA内含物贯穿细胞周期以能够合理预测的方式变化，因此有可能监测细胞周期不同阶段之间细胞的相对分布。由于将细胞指派至G2或M阶段的不确定性，该技术通常不会精确确定任何细胞个体的细胞周期位置。如此，提高处于G2+M阶段的细胞分布的和。遗传工程的靶优选是细胞周期调节剂，其可以特异性过表达、激活、突变、下调、降解或抑制。过表达通过例如经由采用高生产性表达盒或经由导入额外的编码细胞周期调节剂的基因表达额外的细胞周期调节剂拷贝来实现。激酶经由磷酸化的活化得到例如相应磷酸化因子和辅因子的支持。也可以修饰细胞周期调节剂以提供降解抗性突变体。用于下调细胞周期调节剂的例示性手段采用沉默相应基因，使用siRNA、反义RNA或microRNA来进行。也可以通过提高相应酶或抑制剂浓·度或活性来降解或抑制细胞周期调节剂，例如通过调控特定蛋白酶或激酶的活性来进行。依照一个具体实施方案，可以使用敲除宿主细胞，其中破坏了编码细胞周期调控剂的基因以下调或消除它们的表达。可以通过用于部分或完全敲低相应基因的方法来生成敲除宿主细胞。在基因功能或表达被下调或消除的那些情况中，所得细胞或生物体也可以称作敲除。生成敲低细胞或生物体的方法的一个实施方案包含向要敲低某基因的细胞或生物体中导入靶向该基因或其调节序列的RNA并在发生反义RNA的条件下维持所得细胞或生物体，导致相应mRNA或其调节序列降解或灭活，由此生成敲低细胞或生物体。在另一个实施方案中，通过基因删除、启动子交换、或创建温度敏感性突变体来生成敲低细胞或生物体。为了改造宿主细胞来表达细胞周期调控剂，可以使表达盒稳定整合入宿主细胞基因组中。通过合适手段，可以构建包含一种或多种细胞周期调控剂的合适表达载体，而且可以测定它们对G2+M阶段分布的影响。可以将共表达POI获得的产量与野生型比较以确定调控剂对POI表达的影响。实验规程的详细描述可以见下文实施例。可以使表达细胞周期调控剂的优选表达盒稳定整合入宿主细胞基因组中以制备依照本发明的宿主细胞系。依照一个优选实施方案，细胞周期调节剂Clb2或其它细胞周期调节剂诸如别的G2/有丝分裂特异性细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(Cdk)、及其调节因子诸如 Clb2、Clbl、Clb3-6、Cdcl4、Cdc20、Cdc28、Mad2、Pdsl、Rrp42、Whi2 的过表达通过导入编码此类细胞周期调节剂的基因，由此增加拷贝数和相应活性来实现。由此，细胞实际证明有低μ处与野生型相比更高的qP。通过共表达合适细胞周期调控剂和Ρ0Ι，有可能在可比较条件下提供相对于野生型至少相同，或至少约1.3倍、或至少约2倍、或至少约3倍、4倍、5倍、直至10倍产量提高。野生-插件细胞系可以通过改造宿主细胞以生成相应细胞周期调控剂作为第一步来制备。然后，可以将野生-插件细胞系变成生产细胞系，其接受改造以表达POI。或者，宿主细胞可以同时重组编码细胞周期调控剂的基因和别的目标基因。而且，宿主细胞也可以首先改造成表达Ρ0Ι，然后重组编码细胞周期调控剂的基因。POI可以是任何真核、原核或合成多肽。它可以是天然分泌蛋白或胞内蛋白，即天然不分泌的蛋白质。本发明还提供天然蛋白质的功能性同系物、功能性等同变体、衍生物和生物学活性片段的重组生成。功能性同系物优选与序列相同或与序列对应或具有序列的功能特征。本文中提到的POI可以是但不限于适合作为生物制药物质的蛋白质像抗体或抗体片段、生长因子、激素、酶、疫苗、或可用于工业应用的蛋白质像例如酶。优选的POI选自下组:人血清蛋白质，诸如免疫球蛋白或血清清蛋白，酶，激素，信号分子，基质蛋白，其片段或衍生物，或介导宿主细胞代谢物生成的多肽。POI优选是异源重组多肽或蛋白质，其可以在真核细胞(优选酵母细胞)中有利地生成，优选作为分泌蛋白。优选生成的蛋白质的例子是免疫球蛋白、免疫球蛋白片段、抑肽酶、组织因子途径抑制剂或其它蛋白酶抑制剂、和胰岛素或胰岛素前体、胰岛素类似物、生长激素、白介素、组织纤溶酶原激活剂、转化生长因子a或b、高血糖素、高血糖素样肽I (GLP-1)、高血糖素样肽2 (GLP-2)、GRPP、因子VI1、因子VII1、因子XII1、血小板衍生生长因子1、血清清蛋白、酶诸如脂肪酶或蛋白酶、或任一种这些蛋白质的功能性类似物。在本发明语境中，术语“功能性类似物”意图指具有与天然蛋白相似的功能的多肽。多肽可以在结构上与天然蛋白相似，而且可以通过对天然蛋白C和N末端任一或二者或侧链添加一个或多个氨基酸、替代天然氨基酸序列中一个或多个不同位点处的一个或多个氨基酸、删除天然蛋白两端任一或二者处或氨基酸序列中一个或多个位点处的一个或多个氨基酸、或在 天然氨基酸序列中的一个或多个位点处插入一个或多个氨基酸而衍生自天然蛋白。此类修饰对于上文提到的几种蛋白质是公知的。 重组POI通常通过重组技术经由包含编码此类POI的目标重组基因的重组生成细胞系来生成。具体理解的是，根据情况，此类POI(如依照本发明生成的)不是细胞周期调控剂或细胞周期调节剂，但是任选作为由同一细胞培养物生成的任何重组细胞周期调控剂之外的重组产物来生成。POI也可以选自在宿主细胞中提供生物化学反应的底物、酶、抑制剂或辅因子，目的是获得所述生物化学反应或一系列数个反应的产物，例如获得宿主细胞的代谢物。例示性产物可以是维生素，诸如核黄素、有机酸、和醇或抗生素，它们可以在依照本发明表达重组蛋白或POI后以提高的产量获得。通常，表达重组产物的宿主细胞可以是任何适合于重组表达POI的真核细胞。优选用作本发明宿主细胞的酵母细胞的例子包括但不限于糖酵母/酵母(Saccharomyces)属(例如啤酒糖酵母/酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、毕赤酵母(Pichia)属(例如巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)或甲醇毕赤酵母(P.methanolica))、Komagataella 属(K.pastoris、K.pseudopastoris 或 K.phaffii)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)或乳克鲁维酵母(Kluyveromyces Iactis)。更新的文献将巴斯德毕赤酵母划分和重命名成Komagataella pastoris、Komagataella phaffii和Komagataella pseudopastoris。在本文中，巴斯德毕赤酵母与 Komagataella pastoris、Komagataella phaffii 和 Komagataella pseudopastoris 全部同义使用。依照本发明优选使用的酵母生产生物体可以是任何合适酵母生物体，其在培养上生成大量的所讨论异源蛋白或多肽。合适酵母生物体的优选例子是选自酵母物种啤酒糖酵母/酿酒酵母、克鲁弗利氏糖酵母(Saccharomyces kluyveri)、粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、葡萄汁糖酵母(Saccharomyces uvarum)、乳克鲁维酵母、多形汉逊酵母、巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、克鲁弗利氏毕赤酵母(Pichia kluyveri)、解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia Iipolytica)、假丝酵母(Candida sp.)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、可可假丝酵母(Candida cacaoi)、地霉(Geotrichum sp.)、和发酵地霉(Geotrichum fermentans)的菌株。最优选的酵母宿主细胞衍生自甲基营养型酵母,诸如毕赤酵母或Komagataella,例如巴斯德毕赤酵母，或 Komoagataella pastoris,或 K.phaffii,或 K.pseudopastoris.宿主的例子包括酵母，诸如巴斯德毕赤酵母。巴斯德毕赤酵母菌株的例子包括CBS704 (=NRRL Y_1603=DSMZ70382)、CBS2612 (=NRRL Y-7556)、CBS7435 (=NRRL Y-11430),CBS9173-9189、和DSMZ70877 (德国微生物和细胞培养物保藏中心)，但是还有例子Invitrogen的菌株，诸如X-33、GS115、KM71和SMD1168。酿酒酵母菌株的例子包括W303、CEN.PK和BY系列(EUROSCARF保藏中心)。上文描述的所有菌株已经成功用于生成转化子和表达异源基因。合适高等真核细胞(诸如哺乳动物、昆虫或植物细胞)的例子是CHO、Per.C6、HEK293、Sf-9、烟草(Nicotiana tabacum) NT-1 或 BY-2。通常，本文中提到的目标蛋白质可以通过本领域技术人员公知的重组表达方法来生成。依照本发明，可以采用本领域技术范围内的常规分子生物学、微生物学、和重组DNA技术。文献中充分解释了此类技术。参见例如Maniatis, Fritsch&Sambrook, "MolecularCloning:A Laboratory Manual(1982)。可用于改造如依照本发明使用的，能提供改良重组蛋白生成的宿主细胞的核苷酸序列可以自多种来源获得。启动子的起源优选来自酵母细胞，最优选来自甲基营养型酵母诸如来自毕赤酵母属。核苷酸序列的优选同源起源便于其并入同一属的宿主细胞中，如此能够稳定生成P0I，有可能在工业制造工艺中提高产量。也可以使用来自其它合适宿主的异源功能等同核苷酸序列。适宜表达载体包含适合于在真核宿主细胞中表达编码异源多肽或蛋白质的DNA的调节序列。调节序列的例子包括启动子、操纵基因、和增强子、核糖体结合位点、和控制转录和翻译起始和终止的序列。调节序列可以与要表达的DNA序列可操作连接。例如，如果启动子控制编码序列的转录，就说启动子序列与编码序列可操作连接。依照本发明，优选提供包含与编码细胞周期调控剂的核苷酸序列及与编码POI的核苷酸序列可操作连接的调节序列的巴斯德毕赤酵母宿主，任选进一步采用与它们可操作连接的调节序列。依照一个优选实施方案，依照本发明的方法采用编码POI的重组核苷酸序列，其在适合于整合入宿主细胞基因组中的质粒上以每个细胞一个或多个拷贝提供。编码POI的重组核苷酸序列也可以在自主复制质粒上以每个细胞一个或多个拷贝提供。依照本发明的优选方法采用质粒，它是真核表达载体，优选酵母表达载体。表达载体可包括但不限于克隆载体、改良克隆载体和专门设计的质粒。本发明中使用的优选表达载体可以是适合于在宿主细胞中表达重组基因的任何表达载体，而且根据宿主生物体来选择。重组表达载体可以是能够在宿主生物体中复制或整合入宿主生物体基因组中的任何载体，也称作宿主载体，诸如酵母载体。优选的酵母表达载体用于选自下组的酵母中的表达:甲基营养型酵母，以汉逊酵母(Hansenula)属、毕赤酵母属、假丝酵母(Candida)属和球拟酵母(Torulopsis)属为代表。 在本发明中，优选使用自pPICZ、pGAPZ、pPIC9、pPICZalfa、pGAPZalfa、pPIC9K、pGAPHis或pPUZZLE衍生的质粒作为载体。为了容许在宿主细胞中表达重组核苷酸序列，表达载体可以提供与编码序列5’端邻接(例如在信号肽基因上游)的具有功能性启动子的重组核苷酸序列。由此通过此启动子序列来调节和启动转录。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何合适DNA序列，而且可以衍生自编码对于宿主而言同源或异源的蛋白质的基因。启动子优选衍生自编码对于宿主细胞而言同源的蛋白质的基因。启动子可以是内源启动子，或者对于宿主细胞而言是异源的。与哺乳动物宿主细胞一起使用的合适启动子序列可以包括但不限于自病毒基因组获得的启动子、异源哺乳动物启动子(例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子)、和热休克蛋白启动子。启动子不限于任何特定物种，前提是它们能在真核宿主细胞中(特别是在酵母中)发挥功能。别的与酵母宿主细胞一起使用的合适启动子序列可以包括但不限于自编码已知以高浓度在细胞中存在的代谢酶的基因获得的启动子，例如糖酵解酶，像磷酸丙糖异构酶(TPI)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、醇氧化酶(AOX)、乳糖酶(LAC)和半乳糖苷酶(GAL)。合适启动子的优选例子是酵母启动子，其含有发挥酵母细胞中基因转录启动子功能的DNA序列。优选例子是酿酒酵母Ma1、TP1、CUP、ADH或PGK启动子，或巴斯德毕赤酵母葡萄糖-6-磷酸异构酶启动子(PPGI)、3_磷酸甘油酸激酶启动子(PPGK)或甘油醛_3_磷酸脱氢酶启动子PGAP、醇氧化酶启动子(PAOX)、甲醛脱氢酶启动子(PFLD)、异柠檬酸裂合酶启动子(PICL)、翻译延伸因子启动子(PTEF)，和巴斯德毕赤酵母烯醇酶I (PENOl)、磷酸丙糖异构酶(PTPI)、α-酮异己酸脱羧酶(PTHI)、核糖体亚基蛋白(PRPS2、PRPS7、PRPS31、PRPLI)、热休克蛋白家族成员(PSSA1、PHSP90、PKAR2)、6_磷酸葡萄糖脱氢酶(PGNDl)、磷酸甘油酸变位酶(PGPMl)、转酮醇酶(PTKLl)、磷脂酰肌醇核酶(PPISl)、铁-02-氧化还原酶(PFET3)、高亲和力铁通透酶(PFTRl)、可阻抑碱性磷酸酶(PPH08)、N-肉豆蘧酰转移酶(PNMTl)、外激素应答转录因子(PMCMl)、泛素(PUBI4)、单链DNA内切核酸酶(PRAD2)的启动子和线粒体内膜主要ADP/ATP载体(PPET9)的启动子。在一种优选的表达系统中，启动子是诱导型或组成性启动子。依照本发明的一个优选实施方案，通过将有关基因连接入载体中来获得重组构建物。通过使用此类载体转化宿主细胞，这些基因可以稳定整合入宿主细胞基因组中。可以使用重组宿主细胞系生成由基因编码的多肽通过培养转化子，如此获得在适宜培养基中，自培养物分离所表达的POI，并纯化它通过适合于表达产物的方法，特别是将POI与污染性蛋白质分开。用于连接DNA序列(例如分别编码细胞周期调控剂和/或Ρ0Ι、启动子和终止子的)，并将它们插入含有整合或宿主复制所必需的信息的合适载体中的规程是本领域技术人员公知的，例如记载于 J.Sambrook et al., "Molecular Cloning2nd ed.〃，Cold SpringHarbor Laboratory Press (1989)。会理解，可以构建一种或多种利用编码细胞周期调控剂和/或POI的基因作为整合靶的载体，或是通过首先制备含有编码调控剂和/或POI的完整DNA序列的DNA构建物，随后将构建物插入一种或多种合适的表达载体中，或是通过序贯插入含有各种基因的遗传信息的DNA片段，接着连接。还有，可以依照本发明使用多克隆载体(即具有多克隆位点的载体)，其中可以在多克隆位点处并入期望基因以提供表达载体。在表达载体中，启动子放置在POI基因的上游并调节基因的表达。在多克隆载体的情况中，因为在多克隆位点处导入POI基因，所以启动子放置在多克隆位点的上游。用于真核宿主细胞中POI表达和分泌的几种不同办法是优选的。通过用包含编码期望蛋白质的DNA和至少一种本发明调节元件的表达载体转化真核生物体，制备经转化生物体的培养物，培养培养物并自培养液回收蛋白质，表达、加工并分泌蛋白质。所采用的信号肽可以是本发明的信号肽或备选的信号肽，例如异源信号肽或天然信号肽与异源信号肽的杂合物。信号肽的功能是容许异源蛋白质分泌以进入内质网。信号肽通常在此过程中被切掉。信号肽对于生成蛋白质的宿主生物体可以是异源的或同源的。为了获得依照本发明的重组宿主细胞而提供的DNA构建物可以通过已建立的标准方法(例如亚磷酰胺方法)以 合成方式制备。DNA构建物也可以是基因组或cDNA起源的，例如通过制备基因组或cDNA文库并依照标准技术使用合成寡核苷酸探针通过杂交筛选编码整个或部分POI的DNA序列来获得。最后，DNA构建物可以是混合的合成和基因组、混合的合成和cDNA、或混合的基因组和cDNA起源的，通过根据需要依照标准技术使合成、基因组或cDNA起源的片段退火来制备，其中所述片段对应于完整DNA构建物的各个部分。本发明的转化子可以通过将此类载体DNA(例如质粒DNA)导入宿主中并选择以高产量表达POI或宿主细胞代谢物的转化子来获得。通过常规用于转化真核细胞的方法(诸如电脉冲方法、原生质体方法、醋酸锂方法、及其改良方法)处理宿主细胞，使得它们能够并入外来DNA。巴斯德毕赤酵母优选通过电穿孔来转化。在另一个优选实施方案中，酵母表达载体能够稳定整合入酵母基因组中，例如通过同源重组。要理解，本文中公开的方法可进一步包括在允许POI表达(优选以分泌形式)的条件下培养所述重组宿主细胞。然后可以自细胞培养液或其它细胞培养物级分分离分泌的重组生成的POI或宿主细胞代谢物并通过本领域技术人员公知的技术进一步纯化。依照本发明的一种优选方法指提高细胞培养物中重组POI生产的产量，包括a)遗传工程改造真核生产细胞系以专门引起G2+M细胞周期阶段延长，b)培养所述生产细胞系，并c)收集含有POI的细胞培养物级分。
合适的培养技术可以涵盖在生物反应器中培养，以分批阶段开始，接着是较短的处于高比生长速率的指数式补料分批阶段，再接着是处于低比生长速率的补料分批阶段。另一种合适的培养技术可以涵盖分批阶段，接着是处于低稀释速率的连续培养阶段。优选的发酵技术是分批、补料分批或连续培养。工业规模的生产条件指例如反应器体积100L至IOm3或更大、采用几天的典型工艺时间的补料分配培养，或发酵罐体积大约50 - 1000L或更大、稀释速率大约0.05 -0.151Γ1的连续工艺。还可以在没有重组细胞周期调控剂影响的情况中获得本发明高产生产细胞培养物，例如通过会延长G2+M阶段的特定培养技术。其中有受控温度条件(像低于最适生长温度的温度)或底物补料(像间歇补料控制或底物或化学药品脉冲)等等。由此，细胞培养物能以稳态维持于适于支持细胞培养物高生产力的期望G2+M分布。通过用编码细胞周期调控剂的基因和/或POI基因转化细胞获得的依照本发明的转化子宿主细胞可以优选首先在没有表达异源蛋白的负担下以有效生长至大细胞数目的条件培养。当细胞系准备好POI表达且细胞培养物实现通常为10g/L细胞干重的细胞密度时，选择生成表达产物的培养技术。优选的是，在生物反应器中在生长条件下培养依照本发明的宿主细胞系以获得至少lg/L细胞干重、更优选至少10g/L细胞干重、优选至少50g/L细胞干重但少于150或少于200、优选少于100的细胞密度。当转化子在诱导性刺激下培养时，可以激活细胞周期调控剂以实现G2+M稳态并表达POI。诱导性刺激优选是热，或添 加钙、铜、渗透压提高剂、过氧化氢、乙醇、甲醇、甲胺等等。或者，可以通过去阻抑(例如通过消除或稀释葡萄糖或硫胺)等等来刺激基因表达。优选地，在具有合适碳源的矿质培养基中培养酵母，由此进一步显著简化分离工艺。优选的矿质培养基的一个例子是一种含有可利用碳源(例如葡萄糖、甘油或甲醇)、含有宏量元素(钾、镁、钙、铵、氯化物、硫酸盐、磷酸盐)和痕量元素(铜、碘化物、锰、钥酸盐、钴、锌、和铁盐、和硼酸)的盐、和任选的维生素或氨基酸(例如用于补足营养缺陷型)的矿质培养基。有利的是以中试或工业规模提供POI生产。工业工艺规模会优选采用至少50L、优选至少lm3、优选至少10m3、最优选至少IOOm3的体积。优选采用生成至少lmg/L、优选至少10mg/L、优选至少100mg/L、最优选至少lg/L产量的条件来表达POI。优选通过至少一种下述测试对依照本发明的宿主细胞测试其表达能力或产量:ELISA，活性测定法，HPLC,或其它合适测试。在适合于实现期望POI表达的条件下培养转化细胞，可以根据表达系统和所表达蛋白质的性质，例如蛋白质是否与信号肽融合及蛋白质是可溶性的还是膜结合的，自细胞或培养液纯化期望Ρ0Ι。正如技术人员会理解的，培养条件会依照包括宿主细胞的类型和所采用的特定表达载体在内的因素而变化。优选的是，收集细胞培养物的特定级分以获得作为生物产物的Ρ0Ι。典型地，会收集细胞培养物上清液，例如为了获得分泌的Ρ0Ι。根据POI特征，可以自细胞内级分或细胞碎片回收POI。例如，超声或机械、酶促或化学破碎培养的转化子细胞以获得含有期望POI的细胞提取物，自其分离和纯化POI。自酵母细胞分泌重组表达产物通常是有利的，原因包括便于纯化工艺，因为可以自培养物上清液而非自破碎酵母细胞以释放细胞内蛋白质时产生的复杂蛋白质混合物回收产物。通常可以使用现有技术来分离和纯化期望化合物。作为用于获得重组多肽或蛋白质产物的分离和纯化方法，可以使用诸如利用溶解度差异的方法(像盐析和溶剂沉淀)、利用分子量差异的方法(诸如超滤和凝胶电泳)、利用电荷差异的方法(诸如离子交换层析)、利用特异性亲和的方法(诸如亲和层析)、利用疏水性差异的方法(诸如反相高效液体层析)、和利用等电点差异的方法(诸如等电聚焦)等方法。优选采用具体纯化步骤来分开任何共表达且会污染POI制备物的细胞周期调控剂。高度纯化的产物基本上不含污染性蛋白质，而且优选具有至少90%，更优选至少95%，或甚至至少98%，直至100%的纯度。纯化的产物可以通过纯化细胞培养物上清液或自细胞碎片来获得。分离并纯化的POI可以通过常规方法如Western印迹或测定其活性的方法来鉴定。纯化的化合物的结构可以通过氨基酸分析、氨基末端分析、一级结构分析、等等来确定。优选的是，大量且高纯度获得化合物，如此达到在药物组合物中作为活性组分使用的必要要求。依照本发明的优选宿主细胞系维持依照本发明采用的遗传特性，而且表达水平保持较高，例如至少在μ g水平，甚至在约20代培养之后，优选至少30代，更优选至少40代，最优选至少50代。重组宿主细胞惊人地稳定，这在用于工业规模蛋白质生产时极为有利。在下面的实施例中更为详细地描述本发明，它们绝非意图限制本发明的要求保护的范围。
实施例 实施例1.在特定生长速率的细胞周期分布为了分析处于不同特定生长速率的巴斯德毕赤酵母细胞，在恒化培养物中以介于0.0ltT1和0.211Γ1之间的稀释速率范围培养它们。当分批培养结束时启动恒化培养。每一种稀释速率维持至少五个停留时间，之后采集样品来测定生物量干重、Fab片段浓度和细胞周期分布。恒化培养基GLUOl:每IOOOmL ddH20溶解1.0g柠檬酸单水合物、55g葡萄糖单水合物、4.4g(NH4)2HP04、0.7g MgS04*7H20、1.7g KC1、0.01gCaCl2*2H20、1.6mL 痕量金属溶液(PTMl)和1.0mL生物素溶液(0.ZgL—1)，接着无菌过滤。通过清洗并干燥IOmL等分试样培养物的生物量来测定干生物量浓度。如Dragosits et al.2009 (J.Proteome Res.2009Mar; 8 (3): 1380-92)所述通过 ELISA 来测定Fab片段浓度。通过将Fab浓度除以干生物量浓度并乘以稀释速率来计算比生产力。对于细胞周期阶段分布分析，清洗每个样品点的乙醇固定细胞样品并用RNA酶A处理。然后超声处理细胞并在碘化丙啶溶液中温育以容许试剂进入细胞并对基因组DNA染色。流式细胞术容许测量数千细胞。以事件数50，000作为标准数量。在剩余样品中细胞浓度很低的情况中，不得不降低这个阈值。借助FCS Express软件来评估数据。如下计算处于细胞周期G2+M阶段的细胞的百分比:(%G2+M细胞)/ [ (%G1细胞)+ (%G2+M细胞)]。结果是，处于Gl阶段的细胞的百分比为100-(%G2+M细胞)。这种计算忽略了所有没有指派至Gl或G2+M阶段的细胞。图3显示了不同特定生长速率时的比生产力qP和细胞周期阶段分布。实施例2.巴斯德毕赤酵母中CLB2的过表达及测定特定生长速率的细胞周期分布a)共过表达质粒的构建为了生成适合于在早就表达异源蛋白质的菌株中共过表达巴斯德毕赤酵母CLB2基因的质粒，通过PCR自巴斯德毕赤酵母cDNA文库扩增CLB2基因。通过使用相应正向寡核苷酸引物(5，-GATCCACCTGCAGGCCATGTCTAATGTTCAGCCTAACGA-3’，SEQ ID N0.1)和反向寡核苷酸引物(5，-TCGGCCGAGGCGGCCCTACAAAATTGGATCCATGATGC-3’，SEQ ID N0.2)来添加非模板编码的巴斯德毕赤酵母Kozak序列和SbfI和SfiI限制性位点。将经SbfI和SfiI处理的PCR产物克隆入pPuzzleKanR(经SbfI和SfiI消化并用碱性磷酸酶处理)中。将新的共过表达质粒pPuzzleKanR_CLB2转化入大肠杆菌ToplO (Invitrogen)中。进行了限制性内切核酸酶消化和测序来验证构建质粒的正确身份。b)共过表达重组人抗体Fab片段3H6和新的辅助因子基因的巴斯德毕赤酵母菌株的构建使用自实施例2步骤a)中描述的克隆规程获得的质粒pPuzzleKanR-CLB2来转化为在 GAP 启动子(Dragosits et al.2009, J Proteome Res.2009Mar; 8 (3): 1380-92)控制下高水平表达重组人抗体Fab片段3H6而预选择的巴斯德毕赤酵母菌株。选择基于Zeocin抗性(用于Fab片段基因)和遗传霉素抗性(用于辅助因子基因)。为了评估共过表达的 细胞周期调节剂基因的效果，还用无细胞周期调节剂基因的pPuzzleKanR质粒转化表达Fab片段的菌株。
_5] 实施例3.过表达/删除其它细胞周期调节剂以改变细胞周期a)对于过表达其它细胞周期调节剂，如实施例2.a所述构建表达载体，只是扩增并克隆期望的细胞周期调节剂基因来代替CLB2。如此将酿酒酵母MAD2和TOS1、和巴斯德毕赤酵母 RRP42 克隆入 pPuzzleKanR 中以构建 pPuzzleKanR_MAD2、pPuzzIeKanR-PDSUPpPuzzIeKanR-RRP42。如实施例2.b所述将这些质粒转化入生成3H6Fab的巴斯德毕赤酵母中。b)自巴斯德毕赤酵母基因组敲除细胞周期调节剂基因通过PCR扩增细胞周期调节剂基因长度大约350bp的两种片段，并克隆到赋予G418抗性的kanMX4标志物盒两侧。转化巴斯德毕赤酵母并选择G418抗性后，通过PCR验证细胞周期调节剂基因的一部分的删除。实施例4.培养细胞培养物及分析细胞周期调节剂过表达的效果过表达CLB2的菌株(如实施例2.b中描述的)在50mL管中的2.5mLYPD(20g/L大豆胨(HY QUEST)，10g/L酵母提取物，20g/L葡萄糖，pH7.4)中的预培养物用来自板的细胞接种。次日，以0.1的0D_接种全部主培养物(50mL管中的IOmL合成摇瓶培养基)。主培养物培养基:每IOOOmL ddH20溶解22g柠檬酸单水合物，22g葡萄糖单水合物，
3.15g (NH4)2HPO4,0.492g MgS04*7H20，0.8040g KCl，0.0268g CaCl2*2H20，1.47mL 痕量金属溶液(PTMl)和2.0mL生物素溶液(0.2g L-1)。用K0H25%将pH调至5，接着无菌过滤。
主培养以0.1的OD6tltl开始，并于室温以170rpm摇动。大约24小时后及48小时后结束时测量光密度。在这两个时间点采集用于蛋白质分析的上清液样品。关联通过ELISA分析的细胞外Fab浓度与培养24和48小时后的培养物光密度。每种菌株培养四个转化子，并与它们相应对照菌株比较。平均产物/生物量:CLB2克隆较之载体对照的倍数变化:
权利要求
1.一种在细胞培养物中生成重组目标多肽(POI)的方法，包括遗传工程改造真核细胞系 -以在预培养阶段中专门引起G2+M细胞周期阶段延长，及 -以在预培养阶段后的生产阶段中生成Ρ0Ι。
2.权利要求1的方法，其中所述细胞系是在其基因组中稳定整合了用于表达细胞周期调控剂的表达盒的细胞系。
3.权利要求1或2的方法，其中所述细胞系接受工程改造以调控细胞周期调节剂，优选通过特异性过表达、激活、突变、下调、删除、降解或抑制细胞周期调节剂来进行。
4.权利要求3的方法，其中所述细胞周期调节剂选自下组:Cdk/细胞周期蛋白复合物诸如细胞周期蛋白依赖性激酶(Cdk)，G1特异性细胞周期蛋白，G2/有丝分裂特异性细胞周期蛋白，及其转录或降解因子,诸如 Clb2，Clbl，Clb3-6，Clnl-3，Cdc6，Cdcl4，Cdc20,Cdc28,Cdc48, CdhI, Karl, Mad2, MBF，Mcml, Pdsl, Rrp42, SBF，Sicl, SweI, Swi5, Whi2。
5.权利要求1至4任一项的方法,其中所述细胞系是野生-插件(wild-card)宿主细胞系或接受改造以生成细胞周期调控剂和所述POI的生产细胞系。
6.权利要求1至5任一项的方法，其中所述POI选自下组:血清蛋白质，诸如免疫球蛋白或血清清蛋白，酶，激素，信号分子，基质蛋白质，其片段或衍生物，或介导宿主细胞代谢物生成的多肽。
7.权利要求1至6任一项的方法，其中所述细胞是真菌细胞，优选酵母细胞，诸如毕赤酵母(Pichia)属的细胞,特别是巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)菌株的细胞,或高等真核细胞，优选哺乳动物或植物细胞。
8.通过权利要求1至7任一项的方法获得的高产生产细胞系，其具有至少0.1 μ g/(g.h)的比生产力qP来生成所述Ρ0Ι。
9.通过权利要求1至7任一项的方法获得的细胞系的高产生产细胞培养物，其中在占补料时间至少50%的过程时间里至少50%的细胞在G2+M阶段中。
10.权利要求9的细胞培养物，其在至少10小时的时段里处于稳态。
11.权利要求9或10的细胞培养物，其为补料-分批或连续细胞培养物。
12.权利要求9至11任一项的细胞培养物，其在工业规模具有至少0.1 μ g/ (L.h)的体积生产力Qp。
13.细胞培养物中提高重组POI生产的产量的方法，包括 a)遗传工程改造真核生产细胞系以专门引起G2+M细胞周期阶段延长， b)在预培养阶段中培养所述生产细胞系以获得G2+M细胞周期阶段延长的稳态细胞培养物， c)在所述预培养阶段后的生产阶段中培养所述稳态细胞培养物以生成该Ρ0Ι，并 d)收集细胞培养物含有POI的级分。
14.细胞培养物中延长真核生产细胞系的重组POI生产阶段的方法，包括遗传工程改造细胞系以专门弓I起G2+M细胞周期阶段延长。
全文摘要
本发明涉及一种在细胞培养物中生成重组目标多肽(POI)的方法，包括遗传工程改造真核细胞系-以在预培养阶段中专门引起G2+M细胞周期阶段延长，及-以在预培养阶段后的生产阶段中生成POI，本发明还涉及一种高产生产细胞系和细胞培养物，以及一种提高细胞培养物中重组POI生产的产量的方法。
文档编号C12N1/15GK103097542SQ201180042739
公开日2013年5月8日 申请日期2011年7月4日 优先权日2010年7月5日
发明者D.马塔诺维奇, M.德拉戈赛茨, B.加瑟, M.莫勒, M.索尔 申请人:维也纳农业大学
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