适应于无血清培养和悬浮培养的mdck来源的细胞系与利用该细胞制备疫苗病毒的方法
专利名称：适应于无血清培养和悬浮培养的mdck来源的细胞系与利用该细胞制备疫苗病毒的方法
技术领域：
本发明涉及一种新的MDCK来源的细胞系(MDCK-derived cell line),该MDCK来源的细胞系可以通过无血清培养和悬浮培养且不需要依附于载体(carriers)而制得，制备所述MDCK来源的细胞系的方法，以及利用所述MDCK来源的细胞系制备疫苗病毒的方法。
背景技术：
通常利用受精卵、鼠脑、原代细胞以及已建立的细胞系作为疫苗制备的来源。然而，这种传统的疫苗来源存在许多问题。例如，当试图将已受精的鸡卵用于疫苗制备时，在饲养鸡、管理依赖于疫苗生产计划的受精卵以及提纯来源于卵蛋白的成分方面存在阻碍。通常加入胎牛血清作为生长因子用于细胞培养。然而，血清容易受到朊病毒和病毒污染的影响并且血清的商品化产品可能存在质量的差异。而且，来自于澳大利亚和新西兰牛犊(calves)的高质量的胎牛血清产品的定价高，致使生产成本增加。MDCK细胞系为已建立的细胞系，可以利用其增殖多种病毒。由于MDCK细胞系表现出较强的附着于其他表面的倾向，因此大规模培养依赖于大面积的培养器皿和载体，从而产生大量的费用。特别地，用于培养仪器或载体的投资费用是巨大的并且需要处理步骤来移除附着于载体上的细胞，从而构成了细胞损失和细胞损伤的风险。因此，需要一种可以通过无血清培养和悬浮培养制备并且进而以经济和安全的方式适用于通过动物细胞培养物制备疫苗的细胞系。美国专 利N0.6，825，036公开了一种可以在没有固体载体的无血清培养和悬浮培养中生长的MDCK来源的细胞系。该美国专利采用了两个方式使得细胞系适应于悬浮培养。根据第一个方式，通过直接在旋转瓶(spinner flask)中悬浮培养来获得MDCK来源的细胞。在这个情况下，细胞密度没有达到1.0X IO6个细胞/毫升(工业规模制备所需的水平)。根据第二种方式，在作为载体的珠子的存在下培养原始MDCK细胞而获得MDCK来源的细胞系，扩大了培养规模并且在没有载体的存在下使培养的细胞生长。第二种方式存在培养过程相对复杂的缺陷。有许多报道称原始MDCK细胞系是致瘤的(tumorigenic)。因此，将原始MDCK细胞系用于疫苗制备时，存在潜在的致瘤性的危险。在这些情况下，需要开发一种新的能够通过无血清培养和悬浮培养制备并且优选具有极低致瘤性或无致瘤性的细胞系。
发明内容
技术问题设计本发明用于解决现有技术的问题，因此本发明的目的是提供一种可以方便地通过无血清培养和悬浮培养制备、与可以用于培养疫苗病毒的原始MDCK细胞系相比具有极低致瘤性或无致瘤性的MDCK来源的细胞系。本发明的另一个目的是提供一种利用所述细胞系制备病毒特别是流感病毒的方法。
问题的解决方案相关申请的交叉引用根据35USC119(a)，本申请要求2010年9月6日提交的PCT专利申请N0.PCT/KR2010/006041以及2011年8月26日在韩国提交的韩国专利申请N0.10-2011-0085902的优先权，其全部内容通过引用的方式并入本文中。 技术方案为了达到以上目的，本发明提供了一种特定的马丁达比犬肾传代细胞(Madin-Darby canine kidney, MDCK)来源的细胞系，该MDCK来源的细胞系来源于保藏的编号为ATCC CCL-34的MDCK细胞，该MDCK来源的细胞系不需要用于细胞生长的血清并且可以通过悬浮培养制备而不需要依附于载体。本发明的MDCK来源的细胞系可以通过以下步骤制备:S1)用无血清培养基(serum-free medium)驯化原始MDCK细胞系，以制备适应于无血清培养的细胞系；和S2)在不经载体驯化的情况下，直接用悬浮培养驯化适用于无血清培养的细胞系，并筛选目的细胞系。更特别地，制备本发明所述的MDCK来源的细胞系的方法可以包括(a)准备保藏的编号为ATCC CCL-34的原始MDCK细胞，(b)用化学成分确定的无血清培养基驯化所述原始MDCK细胞，以使原始MDCK细胞在无血清培养基中生长，以及(c)在不经载体驯化的情况下，在化学成分确定的无血清培养基中诱导步骤(b)中驯化的附着的MDCK细胞直接适应于悬浮培养，以使MDCK细胞在没有载体的悬浮状态下生长。通过所述方法新建立的MDCK来源的细胞系可以通过无血清培养和悬浮培养制备。优选地，本发明所述的MDCK来源的细胞系选自已于2011年I月27日保藏在德国布伦瑞克德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)的 MDCKSkyl023(DSM ACC3112)、MDCK Skyl0234(DSMACC3114)和 MDCKSky3851(DSM ACC3113)。本文中所使用的术语“无血清培养基”表示基本没有添加血清并且可以通过培养制备本发明建立的细胞系的培养基。短语“基本没有添加血清”表示血清以低于0.5体积％的量存在，优选0.1体积％以下，更优选0.01体积％以下，最为优选的是完全不存在。美国专利N0.6，825，036采用两种方式在无血清培养基中通过悬浮培养制备MDCK来源的细胞系。第一种方式尝试在旋转瓶中直接悬浮培养原始MDCK细胞系。在这种情况中，细胞密度没有达到1.0X IO6个细胞/毫升(工业规模制备所需的水平。根据第二种方式，在存在载体的条件下培养原始MDCK细胞并且在不存在载体的条件下使培养的细胞生长而获得MDCK来源的细胞系。相反的，本发明尝试直接在旋转瓶中不经载体驯化地培养原始MDCK细胞，以制备可以通过悬浮培养在无血清培养基中制备的新建立的细胞系。美国专利N0.6，825，036建立的细胞系B-702在一周内达到了 1.0X IO6个细胞/毫升的细胞密度，而本发明建立的细胞系在大约3天内达到了至少1.0X IO6个细胞/毫升的细胞密度，表现出更优良的增殖潜力。一些报道指出目前已知的MDCK细胞系是致瘤的。相反的，与已知的MDCK细胞系相比较时，本发明所建立的细胞系具有极低致瘤性或无致瘤性。特别地，通过在裸鼠中利用细胞系、细胞裂解物和细胞DNAs测试，与已存在的MDCK细胞系相比，实施例中制备的新建立的MDCK来源的细胞系被证实具有极低致瘤性或无致瘤性。通过这些测试结果，可以总结的是，本发明的MDCK来源的细胞系用于疫苗制备是足够稳定的。更优选地，本发明的MDCK来源的细胞系可以通过无血清培养和悬浮培养制备。本发明也提供了利用所述MDCK来源的细胞系制备疫苗病毒的方法。可以用MDCK来源的细胞系培养的病毒的例子包括流感病毒(influenza viruses)、麻疫病毒(measlesviruses)、日本脑炎病毒(Japanese encephalitis viruses)、腿腺炎病毒(mumpsviruses)、风疫病毒(rubella viruses)、脊髓灰质炎病毒(polio viruses)、单纯抱疫病毒-KHSV-1)、单纯疱疹病毒-2(HSV-2)、狂犬病毒(rabies viruses)、呼吸道合胞病毒(RSviruses)、3 型呼吸道肠道病毒(reovirus type3)、黄热病毒(yellow fever virus)、细小病毒(parvoviruses)、柯萨奇病毒(coxsackie viruses)^I 至 47 型腺病毒(adenovirus)、拉沙病毒(Lassa viruses)和痘苗病毒(vacciniaviruses)。本发明的MDCK来源的细胞系最适合用于流感病毒的制备。更特别地，本发明提供了一种从细胞培养物中制备流感病毒的方法，该方法包括:(a)将MDCK来源的细胞以大约I X IO4个细胞/毫升至I X IO6个细胞/毫升的浓度接种于无血清培养基中；(b)使MDCK来源的细胞在一次性生物反应器系统中生长，直至细胞密度至少达到约5X IO6个细胞/毫升,包括在保持选自由约40rpm至约IOOrpm的搅拌速率、约
6.5至约7.5的pH以及约35%至约100%的溶解氧(DO)浓度组成的的组中的一个或多个培养条件下培养MDCK来源的细胞；(c)用流感病毒感染培养的MDCK来源的细胞；(d)在使流感病毒繁殖的条件下培养已感染的培养的MDCK来源的细胞；和(e)从细胞培养混合物中分离流感病毒。优选地，本发明的流感病毒制备方法进一步包括在步骤(b)中往细胞培养物中添加新鲜的培养基或用新鲜培养基替换部分培养基。本发明还提供了由病毒制备方法制得的病毒或病毒抗原。本发明也提供了包括病毒抗原的免疫原性药物组合物。本发明的有益效果本发明的新的MDCK来源的细胞系可以通过无血清培养和悬浮培养制备并具有极低致瘤性或无致瘤性的优点。并且，本发明的新的MDCK来源的细胞系可以有效地用于病毒增殖。另外，本发明新的MDCK来源的细胞系适用于制备病毒，特别是流感病毒。
附图简介附图与上述公开的内容相结合介绍了本发明的优选实施方式，用于提供对本发明技术思路的进一步理解。然而，本发明并不被理解为限制于附图。
图1表示MDCK来源的细胞系在旋转瓶中悬浮培养的细胞生长曲线；图2为显示典型的流感病毒纯化过程的流程图；和图3表示利用在MDCK来源的细胞系中生长的病毒纯化样品的动物试验中获得的HI血清测试结果。
具体实施例方式
提供以下实施例以帮助进一步理解本发明。然而，这些实施例可以有许多其他形式，并且本发明的范围并不被理解为限制于此。这些实施例仅用于为有本发明所属领域常识的人提供对本发明更加全面的解释。<实施例1>通过无血清培养和悬浮培养制备MDCK来源的细胞系MDCK细胞系中的CCL-34，由ATCC提供。在T-25瓶中，在添加有10%血清的EMEM培养基中于37°C和5%C02下培养CCL-34。在细胞扩增后，将细胞在由EMEM培养基和无血清培养基(50%)组成的培养基中培养。在培养过程中确认细胞的生长是否正常。当确认细胞生长正常时，将生长的细胞在含有无血清培养基(75%)的培养基中培养。重复该过程以获得适应于无血清培养基(100%)的细胞系。EX-CELL MDCK (Sigma)、UltraMDCK (Lonza)以及VP-SFM (Invitrogen)可以作为无血清培养的培养基。在T形瓶(T-flask)中充分地扩增适应于无血清培养基的细胞系。而后，在旋转瓶(Corning)中在37°C和5%C02下以40_80rpm的速率搅拌使扩增的细胞系适应于悬浮培养。当培养基的PH下降或细胞生长高于预计的水平时，将培养基替换为新的培养基或将细胞传代(subculture)。在适应于悬浮培养3_6个月后，细胞浓度达到2X IO6个细胞/毫升以上。细胞活力为95%以上并且可以观察到悬浮培养至单个细胞。EX-CELL302CH0 (Sigma)、UltraCHO (Lonza)以及SMIF-6 (Invitrogen)可以作为悬浮培养的培养基。无血清培养和悬浮培养的结果是获得了三种MDCK来源的细胞系，且称为MDCK Skyl023、MDCK Skyl0234和 MDCK Sky3851。<实施例2>细胞系增殖潜力的评估在表I所示的条件下培养在无血清培养基中培养制得的MDCK来源的细胞系。评估MDCK来源的细胞系的增殖潜力。MDCK细胞系(ATCCCCL-34)作为阴性对照培养于添加了10%血清的培养基中。表I[表 I][表]
权利要求
1.一种马丁达比犬肾传代细胞(MDCK)来源的细胞系，该MDCK来源的细胞系来源于保藏的编号为ATCC CCL-34的MDCK细胞，该MDCK来源的细胞系不需要用于细胞生长的血清并且通过悬浮培养制备而不需要依附于载体。
2.根据权利要求1所述的MDCK来源的细胞系，其中，与原始MDCK细胞系相比，所述MDCK来源的细胞系具有低致瘤性或无致瘤性。
3.根据权利要求1所述的MDCK来源的细胞系，其中，所述MDCK来源的细胞系为MDCKSkyl023(DSM ACC3112)、MDCK Skyl0234(DSM ACC3114)或 MDCK Sky3851 (DSM ACC3113)。
4.一种利用权利要求1-3中任意一项所述的MDCK来源的细胞系制备疫苗病毒的方法。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述病毒选自由流感病毒、麻疹病毒、日本脑炎病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、脊髓灰质炎病毒、单纯疱疹病毒-1、单纯疱疹病毒_2、狂犬病毒、呼吸道合胞病毒、3型呼吸道肠道病毒、黄热病毒、细小病毒、柯萨奇病毒、I至47型腺病毒、拉沙病毒和痘苗病毒所组成的组中。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述病毒为流感病毒。
7.一种从细胞培养物中制备流感病毒的方法，该方法包括: Ca)将根据权利要求1-3中任意一项所述的MDCK来源的细胞以IX IO4个细胞/毫升至I X IO6个细胞/毫升的浓度接种于无血清培养基中； (b)使MDCK来源的细胞在一次性生物反应器系统中生长，直至细胞密度至少达到 5X IO6个细胞/毫升，包括在保持选自由40rpm至IOOrpm的搅拌速率、6.5至7.5的pH和35%至100%的溶解氧(DO)浓度所组成的组中的一个或多个培养条件下培养MDCK来源的细胞； (c)用流感病毒感染培养的MDCK来源的细胞； (d)在使流感病毒繁殖的条件下培养已感染的培养的MDCK来源的细胞；和 Ce)从细胞培养混合物中分离流感病毒。
8.根据权利要求7所述的方法，所述方法进一步包括在步骤(b)中往细胞培养物中添加新鲜的培养基或用新鲜培养基替换部分培养基。
9.权利要求7或8所述的方法制得的病毒或病毒抗原。
10.一种制备MDCK来源的细胞系的方法，所述MDCK来源的细胞系不需要用于细胞生长的血清并且通过悬浮培养制备而不需要依附于载体，该方法包括: Ca)准备保藏的编号为ATCC CCL-34的原始MDCK细胞； (b)用无血清培养基驯化所述原始MDCK细胞，以使所述原始MDCK细胞在无血清培养基中生长；和 (c)用无血清培养基驯化步骤(b)中驯化的附着的MDCK细胞，以使MDCK细胞在不需要载体的悬浮状态下生长。
全文摘要
本发明公开了一种马丁达比犬肾传代细胞(MDCK)来源的细胞系。该MDCK来源的细胞系来源于保藏的编号为ATCC CCL-34的MDCK细胞。所述MDCK来源的细胞系可以通过无血清培养和悬浮培养制备。优选地，所述MDCK来源的细胞系具有低致瘤性或无致瘤性。优选所述MDCK来源的细胞系选自MDCK Sky1023、MDCK Sky10234和MDCK Sky3851。进一步公开的是培养所述MDCK来源的细胞的培养方法以及利用所述MDCK来源的细胞制备疫苗病毒的方法。
文档编号C12N5/02GK103154238SQ201180042923
公开日2013年6月12日 申请日期2011年9月6日 优先权日2010年9月6日
发明者朴容郁, 李建世, 李峰镛, 朴万勋, 金勋, 金允熙, 李受陈 申请人:Sk化学公司
技术领域：
本发明涉及一种新的MDCK来源的细胞系(MDCK-derived cell line),该MDCK来源的细胞系可以通过无血清培养和悬浮培养且不需要依附于载体(carriers)而制得，制备所述MDCK来源的细胞系的方法，以及利用所述MDCK来源的细胞系制备疫苗病毒的方法。
背景技术：
通常利用受精卵、鼠脑、原代细胞以及已建立的细胞系作为疫苗制备的来源。然而，这种传统的疫苗来源存在许多问题。例如，当试图将已受精的鸡卵用于疫苗制备时，在饲养鸡、管理依赖于疫苗生产计划的受精卵以及提纯来源于卵蛋白的成分方面存在阻碍。通常加入胎牛血清作为生长因子用于细胞培养。然而，血清容易受到朊病毒和病毒污染的影响并且血清的商品化产品可能存在质量的差异。而且，来自于澳大利亚和新西兰牛犊(calves)的高质量的胎牛血清产品的定价高，致使生产成本增加。MDCK细胞系为已建立的细胞系，可以利用其增殖多种病毒。由于MDCK细胞系表现出较强的附着于其他表面的倾向，因此大规模培养依赖于大面积的培养器皿和载体，从而产生大量的费用。特别地，用于培养仪器或载体的投资费用是巨大的并且需要处理步骤来移除附着于载体上的细胞，从而构成了细胞损失和细胞损伤的风险。因此，需要一种可以通过无血清培养和悬浮培养制备并且进而以经济和安全的方式适用于通过动物细胞培养物制备疫苗的细胞系。美国专 利N0.6，825，036公开了一种可以在没有固体载体的无血清培养和悬浮培养中生长的MDCK来源的细胞系。该美国专利采用了两个方式使得细胞系适应于悬浮培养。根据第一个方式，通过直接在旋转瓶(spinner flask)中悬浮培养来获得MDCK来源的细胞。在这个情况下，细胞密度没有达到1.0X IO6个细胞/毫升(工业规模制备所需的水平)。根据第二种方式，在作为载体的珠子的存在下培养原始MDCK细胞而获得MDCK来源的细胞系，扩大了培养规模并且在没有载体的存在下使培养的细胞生长。第二种方式存在培养过程相对复杂的缺陷。有许多报道称原始MDCK细胞系是致瘤的(tumorigenic)。因此，将原始MDCK细胞系用于疫苗制备时，存在潜在的致瘤性的危险。在这些情况下，需要开发一种新的能够通过无血清培养和悬浮培养制备并且优选具有极低致瘤性或无致瘤性的细胞系。
发明内容
技术问题设计本发明用于解决现有技术的问题，因此本发明的目的是提供一种可以方便地通过无血清培养和悬浮培养制备、与可以用于培养疫苗病毒的原始MDCK细胞系相比具有极低致瘤性或无致瘤性的MDCK来源的细胞系。本发明的另一个目的是提供一种利用所述细胞系制备病毒特别是流感病毒的方法。
问题的解决方案相关申请的交叉引用根据35USC119(a)，本申请要求2010年9月6日提交的PCT专利申请N0.PCT/KR2010/006041以及2011年8月26日在韩国提交的韩国专利申请N0.10-2011-0085902的优先权，其全部内容通过引用的方式并入本文中。 技术方案为了达到以上目的，本发明提供了一种特定的马丁达比犬肾传代细胞(Madin-Darby canine kidney, MDCK)来源的细胞系，该MDCK来源的细胞系来源于保藏的编号为ATCC CCL-34的MDCK细胞，该MDCK来源的细胞系不需要用于细胞生长的血清并且可以通过悬浮培养制备而不需要依附于载体。本发明的MDCK来源的细胞系可以通过以下步骤制备:S1)用无血清培养基(serum-free medium)驯化原始MDCK细胞系，以制备适应于无血清培养的细胞系；和S2)在不经载体驯化的情况下，直接用悬浮培养驯化适用于无血清培养的细胞系，并筛选目的细胞系。更特别地，制备本发明所述的MDCK来源的细胞系的方法可以包括(a)准备保藏的编号为ATCC CCL-34的原始MDCK细胞，(b)用化学成分确定的无血清培养基驯化所述原始MDCK细胞，以使原始MDCK细胞在无血清培养基中生长，以及(c)在不经载体驯化的情况下，在化学成分确定的无血清培养基中诱导步骤(b)中驯化的附着的MDCK细胞直接适应于悬浮培养，以使MDCK细胞在没有载体的悬浮状态下生长。通过所述方法新建立的MDCK来源的细胞系可以通过无血清培养和悬浮培养制备。优选地，本发明所述的MDCK来源的细胞系选自已于2011年I月27日保藏在德国布伦瑞克德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)的 MDCKSkyl023(DSM ACC3112)、MDCK Skyl0234(DSMACC3114)和 MDCKSky3851(DSM ACC3113)。本文中所使用的术语“无血清培养基”表示基本没有添加血清并且可以通过培养制备本发明建立的细胞系的培养基。短语“基本没有添加血清”表示血清以低于0.5体积％的量存在，优选0.1体积％以下，更优选0.01体积％以下，最为优选的是完全不存在。美国专利N0.6，825，036采用两种方式在无血清培养基中通过悬浮培养制备MDCK来源的细胞系。第一种方式尝试在旋转瓶中直接悬浮培养原始MDCK细胞系。在这种情况中，细胞密度没有达到1.0X IO6个细胞/毫升(工业规模制备所需的水平。根据第二种方式，在存在载体的条件下培养原始MDCK细胞并且在不存在载体的条件下使培养的细胞生长而获得MDCK来源的细胞系。相反的，本发明尝试直接在旋转瓶中不经载体驯化地培养原始MDCK细胞，以制备可以通过悬浮培养在无血清培养基中制备的新建立的细胞系。美国专利N0.6，825，036建立的细胞系B-702在一周内达到了 1.0X IO6个细胞/毫升的细胞密度，而本发明建立的细胞系在大约3天内达到了至少1.0X IO6个细胞/毫升的细胞密度，表现出更优良的增殖潜力。一些报道指出目前已知的MDCK细胞系是致瘤的。相反的，与已知的MDCK细胞系相比较时，本发明所建立的细胞系具有极低致瘤性或无致瘤性。特别地，通过在裸鼠中利用细胞系、细胞裂解物和细胞DNAs测试，与已存在的MDCK细胞系相比，实施例中制备的新建立的MDCK来源的细胞系被证实具有极低致瘤性或无致瘤性。通过这些测试结果，可以总结的是，本发明的MDCK来源的细胞系用于疫苗制备是足够稳定的。更优选地，本发明的MDCK来源的细胞系可以通过无血清培养和悬浮培养制备。本发明也提供了利用所述MDCK来源的细胞系制备疫苗病毒的方法。可以用MDCK来源的细胞系培养的病毒的例子包括流感病毒(influenza viruses)、麻疫病毒(measlesviruses)、日本脑炎病毒(Japanese encephalitis viruses)、腿腺炎病毒(mumpsviruses)、风疫病毒(rubella viruses)、脊髓灰质炎病毒(polio viruses)、单纯抱疫病毒-KHSV-1)、单纯疱疹病毒-2(HSV-2)、狂犬病毒(rabies viruses)、呼吸道合胞病毒(RSviruses)、3 型呼吸道肠道病毒(reovirus type3)、黄热病毒(yellow fever virus)、细小病毒(parvoviruses)、柯萨奇病毒(coxsackie viruses)^I 至 47 型腺病毒(adenovirus)、拉沙病毒(Lassa viruses)和痘苗病毒(vacciniaviruses)。本发明的MDCK来源的细胞系最适合用于流感病毒的制备。更特别地，本发明提供了一种从细胞培养物中制备流感病毒的方法，该方法包括:(a)将MDCK来源的细胞以大约I X IO4个细胞/毫升至I X IO6个细胞/毫升的浓度接种于无血清培养基中；(b)使MDCK来源的细胞在一次性生物反应器系统中生长，直至细胞密度至少达到约5X IO6个细胞/毫升,包括在保持选自由约40rpm至约IOOrpm的搅拌速率、约
6.5至约7.5的pH以及约35%至约100%的溶解氧(DO)浓度组成的的组中的一个或多个培养条件下培养MDCK来源的细胞；(c)用流感病毒感染培养的MDCK来源的细胞；(d)在使流感病毒繁殖的条件下培养已感染的培养的MDCK来源的细胞；和(e)从细胞培养混合物中分离流感病毒。优选地，本发明的流感病毒制备方法进一步包括在步骤(b)中往细胞培养物中添加新鲜的培养基或用新鲜培养基替换部分培养基。本发明还提供了由病毒制备方法制得的病毒或病毒抗原。本发明也提供了包括病毒抗原的免疫原性药物组合物。本发明的有益效果本发明的新的MDCK来源的细胞系可以通过无血清培养和悬浮培养制备并具有极低致瘤性或无致瘤性的优点。并且，本发明的新的MDCK来源的细胞系可以有效地用于病毒增殖。另外，本发明新的MDCK来源的细胞系适用于制备病毒，特别是流感病毒。
附图简介附图与上述公开的内容相结合介绍了本发明的优选实施方式，用于提供对本发明技术思路的进一步理解。然而，本发明并不被理解为限制于附图。
图1表示MDCK来源的细胞系在旋转瓶中悬浮培养的细胞生长曲线；图2为显示典型的流感病毒纯化过程的流程图；和图3表示利用在MDCK来源的细胞系中生长的病毒纯化样品的动物试验中获得的HI血清测试结果。
具体实施例方式
提供以下实施例以帮助进一步理解本发明。然而，这些实施例可以有许多其他形式，并且本发明的范围并不被理解为限制于此。这些实施例仅用于为有本发明所属领域常识的人提供对本发明更加全面的解释。<实施例1>通过无血清培养和悬浮培养制备MDCK来源的细胞系MDCK细胞系中的CCL-34，由ATCC提供。在T-25瓶中，在添加有10%血清的EMEM培养基中于37°C和5%C02下培养CCL-34。在细胞扩增后，将细胞在由EMEM培养基和无血清培养基(50%)组成的培养基中培养。在培养过程中确认细胞的生长是否正常。当确认细胞生长正常时，将生长的细胞在含有无血清培养基(75%)的培养基中培养。重复该过程以获得适应于无血清培养基(100%)的细胞系。EX-CELL MDCK (Sigma)、UltraMDCK (Lonza)以及VP-SFM (Invitrogen)可以作为无血清培养的培养基。在T形瓶(T-flask)中充分地扩增适应于无血清培养基的细胞系。而后，在旋转瓶(Corning)中在37°C和5%C02下以40_80rpm的速率搅拌使扩增的细胞系适应于悬浮培养。当培养基的PH下降或细胞生长高于预计的水平时，将培养基替换为新的培养基或将细胞传代(subculture)。在适应于悬浮培养3_6个月后，细胞浓度达到2X IO6个细胞/毫升以上。细胞活力为95%以上并且可以观察到悬浮培养至单个细胞。EX-CELL302CH0 (Sigma)、UltraCHO (Lonza)以及SMIF-6 (Invitrogen)可以作为悬浮培养的培养基。无血清培养和悬浮培养的结果是获得了三种MDCK来源的细胞系，且称为MDCK Skyl023、MDCK Skyl0234和 MDCK Sky3851。<实施例2>细胞系增殖潜力的评估在表I所示的条件下培养在无血清培养基中培养制得的MDCK来源的细胞系。评估MDCK来源的细胞系的增殖潜力。MDCK细胞系(ATCCCCL-34)作为阴性对照培养于添加了10%血清的培养基中。表I[表 I][表]
权利要求
1.一种马丁达比犬肾传代细胞(MDCK)来源的细胞系，该MDCK来源的细胞系来源于保藏的编号为ATCC CCL-34的MDCK细胞，该MDCK来源的细胞系不需要用于细胞生长的血清并且通过悬浮培养制备而不需要依附于载体。
2.根据权利要求1所述的MDCK来源的细胞系，其中，与原始MDCK细胞系相比，所述MDCK来源的细胞系具有低致瘤性或无致瘤性。
3.根据权利要求1所述的MDCK来源的细胞系，其中，所述MDCK来源的细胞系为MDCKSkyl023(DSM ACC3112)、MDCK Skyl0234(DSM ACC3114)或 MDCK Sky3851 (DSM ACC3113)。
4.一种利用权利要求1-3中任意一项所述的MDCK来源的细胞系制备疫苗病毒的方法。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述病毒选自由流感病毒、麻疹病毒、日本脑炎病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、脊髓灰质炎病毒、单纯疱疹病毒-1、单纯疱疹病毒_2、狂犬病毒、呼吸道合胞病毒、3型呼吸道肠道病毒、黄热病毒、细小病毒、柯萨奇病毒、I至47型腺病毒、拉沙病毒和痘苗病毒所组成的组中。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述病毒为流感病毒。
7.一种从细胞培养物中制备流感病毒的方法，该方法包括: Ca)将根据权利要求1-3中任意一项所述的MDCK来源的细胞以IX IO4个细胞/毫升至I X IO6个细胞/毫升的浓度接种于无血清培养基中； (b)使MDCK来源的细胞在一次性生物反应器系统中生长，直至细胞密度至少达到 5X IO6个细胞/毫升，包括在保持选自由40rpm至IOOrpm的搅拌速率、6.5至7.5的pH和35%至100%的溶解氧(DO)浓度所组成的组中的一个或多个培养条件下培养MDCK来源的细胞； (c)用流感病毒感染培养的MDCK来源的细胞； (d)在使流感病毒繁殖的条件下培养已感染的培养的MDCK来源的细胞；和 Ce)从细胞培养混合物中分离流感病毒。
8.根据权利要求7所述的方法，所述方法进一步包括在步骤(b)中往细胞培养物中添加新鲜的培养基或用新鲜培养基替换部分培养基。
9.权利要求7或8所述的方法制得的病毒或病毒抗原。
10.一种制备MDCK来源的细胞系的方法，所述MDCK来源的细胞系不需要用于细胞生长的血清并且通过悬浮培养制备而不需要依附于载体，该方法包括: Ca)准备保藏的编号为ATCC CCL-34的原始MDCK细胞； (b)用无血清培养基驯化所述原始MDCK细胞，以使所述原始MDCK细胞在无血清培养基中生长；和 (c)用无血清培养基驯化步骤(b)中驯化的附着的MDCK细胞，以使MDCK细胞在不需要载体的悬浮状态下生长。
全文摘要
本发明公开了一种马丁达比犬肾传代细胞(MDCK)来源的细胞系。该MDCK来源的细胞系来源于保藏的编号为ATCC CCL-34的MDCK细胞。所述MDCK来源的细胞系可以通过无血清培养和悬浮培养制备。优选地，所述MDCK来源的细胞系具有低致瘤性或无致瘤性。优选所述MDCK来源的细胞系选自MDCK Sky1023、MDCK Sky10234和MDCK Sky3851。进一步公开的是培养所述MDCK来源的细胞的培养方法以及利用所述MDCK来源的细胞制备疫苗病毒的方法。
文档编号C12N5/02GK103154238SQ201180042923
公开日2013年6月12日 申请日期2011年9月6日 优先权日2010年9月6日
发明者朴容郁, 李建世, 李峰镛, 朴万勋, 金勋, 金允熙, 李受陈 申请人:Sk化学公司
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