具有提高外源基因表达活性的dna元件的制作方法
专利名称：具有提高外源基因表达活性的dna元件的制作方法
技术领域：
本发明涉及转化的哺乳动物宿主细胞，其分泌外源蛋白的能力已通过利用具有DNA元件的外源基因表达载体而提高，并涉及利用宿主细胞生产外源蛋白的方法。
背景技术：
由于遗传重组技术的发展，蛋白质药物产品例如治疗性蛋白和抗体药物的市场快速增长。特别是抗体药物具有高特异性，即使将其给予人体也不引起不利的免疫反应，因此，一直在对其积极进行开发。可使用微生物、酵母、昆虫、动物或植物细胞、转基因动物或植物细胞等等，作为在其中产生由抗体药物代表的蛋白质药物的宿主细胞。为了使蛋白质药物具有生物学活性或免疫原性，翻译后修饰例如折叠或糖基化是必要的，因此不能进行复杂的翻译后修饰的微生物或具有不同聚糖结构的植物不适合作为以生物反应器操作的宿主细胞。考虑到培养的哺乳动物细胞例如来自于与人亲缘很近的物种的CHO细胞具有与人相似的聚糖结构，而且安全，并且可以使用所述细胞进行翻译后修饰，目前标准是使用这类细胞。在将培养的哺乳动物细胞用作宿主细胞的情况中，与微生物等(见非专利文件I)相比存在生长率低、生产率低、成本高等问题。此外，为了在临床试验中使用蛋白质药物产品，有必要给予大量产品。因此，其生产能力的缺乏也是世界性难题。因此，为了提高外源基因在培养的哺乳动物细胞中的生产率，迄今已进行了启动子、增强子、药物选择标记、基因扩增和培养工程技术等等的大量研究。然而，目前的情形是尚未建立能始终如一地提高基因表达的系统。作为外源蛋白低生产率的的原因之一，考虑到“位置效应”(见非专利文件2)。当将外源基因引入宿主细胞时，其被随机地整合到宿主染色体基因组，并且外源基因的转录受到外源基因整合区域周围DNA的很大影响。然而，位置效应受到例如外源基因的插入位点、拷贝数、结构等因素的影响，非常难以控制染色体中的插入位点。为了解决所述问题，业已鉴别了调控多核苷酸序列(也叫DNA元件)，例如基因座控制区(LCR)、支架/基质附着区(S/MAR)、绝缘子、遍在染色质开放元件(UCOE)和抗阻遏物(STAR元件)等(见非专利文件3-6)。LCR不需要在内源基因的基因座打开染色质结构。然而，LCR是转录调控元件，其具有打开外源基因被整合位点的DNA周围染色质结构的能力及当其与外源基因表达单元一起使用时重塑大范围染色质的能力，并且认为其需要富含AT的区域(见非专利文件7)。常将LCR代表的上述DNA元件与启动子联合使用，已知与只用启动子的情况相比，在DNA元件与启动子联合使用的情况中，外源基因表达水平增加。然而，至今报道了极少DNA元件类型，并且促进外源基因表达增强的各种机制也相互不同。另外，即使DNA元件和启动子联合使用，在DNA元件和启动子控制下也不能生产足量的治疗性蛋白。因此，不能说已获得能增加外源蛋白生产率的DNA元件的充足知识。因此，本发明目标是提供增加在蛋白质药物产品中待用的外源蛋白产量的方法，所述方法使用具有在宿主细胞例如培养的哺乳动物细胞中提高外源基因表达的高活性的DNA元件。引文列表
非专利文献
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NPL 4: Adam C.Bell，Adam G.West, Gary Felsenfeld (2001) Insulators andBoundaries: Versatile Regulatory elements in the Eukaryotic Genome (绝缘子和边界:真核基因组中多用途调控元件)，Science 291: 447-450
NPL 5: Steven Williams, Tracey Mustoe.等(2005) CpG-1sland fragmentsfrom the HNRPA2B1/CBX3 genomic locus reduce silencing and enhance transgeneexpression from the hCMV promoter/enhancer in mammalian cells (来自 HNRPA2B1/CBX3基因组位点的CpG-岛片段在哺乳动物细胞中降低沉默并提高自hCMV启动子/增强子的转基因表达).BMC Biotechnol.5(17): 1-9
NPL 6: Arie P.0ttej Ted H.J.Kwaks.等(2007) VariousExpression-Augmenting DNA elements Benefit from STAR-Selectj a Novel HighStringency Selection System for Protein Expression (各种增强表达的DNA兀件受益于STAR-Select这种用于蛋白质表达的新型高严格性选择系统).Biotechnol.Prog.23:801-807
NPL 7: Qiliang Li， Kenneth R.Peterson, Xiangdong Fang 和 GeorgeStamatoyannopoulosj (2002) Locus control regions (基因座控制区)，Blood 100(9):3077-3086发明概述技术问题
如上所述，仍然没有许多类型的作为调控多核苷酸序列的DNA元件，另外，其中只有极少DNA兀件在提1 外源基因表达中1 度有效。本发明的目标是提供利用DNA兀件在哺乳动物细胞中稳定实现高表达的方法等等，所述DNA元件通过伴随其中已引入外源基因表达单元的基因座周围的染色质结构的变化来提高转录激活。问题的解决方案
本发明人为了解决上述问题进行了深入的研究，结果发现待表达的外源蛋白在培养的哺乳动物细胞中的生产率和分泌可通过使用一种或多种特定类型的DNA元件来提高，由此完成了本发明。
换句话说，本发明包括以下发明。(I)由序列表中的SEQ ID NO:1代表的多核苷酸序列组成的多核苷酸。(2)由序列表中的SEQ ID NO: 2代表的多核苷酸序列组成的多核苷酸。(3)由序列表中的SEQ ID NO: 3代表的多核苷酸序列组成的多核苷酸。(4)由序列表中的SEQ ID NO: 4代表的多核苷酸序列组成的多核苷酸。(5)由序列表中的SEQ ID NO: 5代表的多核苷酸序列组成的多核苷酸。(6)包含序列表中的SEQ ID NO: 1_5中任一个所代表的多核苷酸序列的至少3000个连续核苷酸的多核苷酸。(7)包含序列表中的SEQ ID NO: 1_5中任一个所代表的多核苷酸序列的至少2000个连续核苷酸的多核苷酸。(8)包含序列表中的SEQ ID NO: 1_5中任一个所代表的多核苷酸序列的至少1500个连续核苷酸的多核苷酸。(9)由与(1)-(8)中任一项的多核苷酸的多核苷酸序列具有95%或更高同源性的多核苷酸序列组成的多核苷酸。(10)由与(1)-(8)中任一项的多核苷酸的多核苷酸序列具有99%或更高同源性的多核苷酸序列组成的多核苷酸。(11)由多核苷酸序列组成的多核苷酸，所述多核苷酸序列含有(I)-(IO)中任一项的多核苷酸的多核苷酸序列的两种或多种序列。(12)由两种或多种类型的选自(I)-(IO)中任一项的多核苷酸的多核苷酸组成的多核苷酸。(13)包含(1)-(12)中任一项的多核苷酸的多核苷酸序列的外源基因表达载体。(14) (13)的外源基因表达载体，其中由外源基因编码的蛋白是多聚体蛋白。(15) (14)的外源基因表达载体，其中外源基因编码的蛋白是异多聚体蛋白。(16) (15)的外源基因表达载体，其中外源基因编码的蛋白是抗体或其功能片段。(17)转化细胞，其中已引入(13)-(16)中任一项的外源基因表达载体。(18) (17)的转化细胞，其中所述细胞是源自哺乳动物的培养细胞。(19) (18)的转化细胞，其中所述源自哺乳动物的培养细胞为选自C0S-1细胞、293细胞和CHO细胞的细胞。(20) (17)-(18)中任一项的转化细胞，其中由外源基因编码的蛋白为多聚体蛋白。(21) (20)的转化细胞，其中所述外源基因编码的蛋白为异多聚体蛋白。
(22) (21)的转化细胞，其中所述外源基因编码的蛋白为抗体或其功能片段。(23)生产蛋白质的方法，所述方法特征在于包括培养(17)-(22)任一项的转化细胞并从得到的培养产物中获得由外源基因编码的蛋白。(24)在已引入外源基因或外源基因表达载体的转化细胞中提高外源基因表达的方法，所述方法特征在于使用(1)-(12)中任一项的多核苷酸或(13)-(16)中任一项的外源基因表达载体。(25) (1)-(12)中任一项的多核苷酸用于在转化细胞中提高外源基因表达的用途。
发明的有利作用
根据本发明，通过使用DNA元件将外源基因表达载体引入到哺乳动物宿主细胞，可显著提高治疗性蛋白、抗体等的外源基因的表达。附图简述
图1显示通过扩增GADPH区域来证实对其进行ChlP-on-chip的样品是用抗乙酰化组蛋白H3抗体经特异性染色质免疫沉淀的图表。图2为已插入DNA元件的SEAP表达载体的示意图。图3为显示在不含DNA元件或含DNA元件A2、A7、A18、B5或C14的稳定表达的CHO细胞系中，在CMV启动子控制下SEAP表达的图表。证实了 0嫩元件4237、418、85和(:14对提闻表达的作用。
图4包含两个图表，显示在不含DNA元件或含DNA元件A2或A7的稳定表达的CHO细胞系中，在EF-1a或SV40启动子控制下的SEAP表达。证实了 DNA元件A2和A7对提高表达的作用。图5是已插入DNA元件的抗体表达(抗体基因X重链和轻链共表达)载体的示意图。图6包含两个图表，显示在不含DNA元件或含DNA元件A7的稳定表达的CHO细胞系中，在CMV或EF-1 a启动子控制下的抗体分泌水平(通过ELISA法测量)。证实了 DNA兀件A7提闻表达的作用。图7是显不DNA兀件A2和相关序列的序列长度的表格。图8包含两个图表，显示在不含DNA元件或含DNA元件A2或相关序列的稳定表达的CHO细胞系中的SEAP表达。证实了 DNA元件A2和相关序列提高表达的作用。图9是显示DNA元件A7和相关序列的序列长度的表格。图10包含三个图表,显不在不含DNA兀件或含DNA兀件A7或相关序列的稳定表达的CHO细胞系中的SEAP表达。证实了 DNA元件A7和相关序列提高表达的作用。图11为显示DNA元件A18和相关序列的序列长度的表格。图12是显示在不含DNA元件或含DNA元件A18或相关序列的稳定表达的CHO细胞系中SEAP表达的图表。证实了 DNA元件A18和相关序列提高表达的作用。图13是显不DNA兀件B5和相关序列的序列长度的表格。图14是显示在不含DNA元件或含DNA元件B5或相关序列的稳定表达的CHO细胞系中SEAP表达的图表。证实了 DNA元件B5和相关序列提高表达的作用。图15是显示DNA元件C14和相关序列的序列长度的表格。图16包含三个图表，显示在不含DNA元件或含DNA元件C14或相关序列的稳定表达的CHO细胞系中的SEAP表达。证实了 DNA元件C14和相关序列提高表达的作用。图17是显示在不含DNA元件或含DNA元件A2、A7、A18、B5或C14的稳定表达的HEK293细胞系中SEAP表达的图表。证实了 DNA元件A2、A7、A18、B5和C14在HEK293细胞中提高表达的作用。图18是显示基于DNA元件A2、A7或A18全长序列的起点和终点的核苷酸的视图。图19是显示基于DNA元件B5或C14全长序列的起点和终点的核苷酸的视图。实施方案说明本发明在下文中将参考实施例进行具体描述。然而，这些实施例不限制本发明的技术范围。将在发明实施例中使用的质粒、限制酶、DNA修饰酶等为市售产品，并可按照通用程序使用。另外，本领域技术人员亦熟知或可从文献中获得用于以下方面的程序:DNA克隆、多核苷酸序列测定、宿主细胞的转化、经转化宿主细胞的培养、从获得的培养液中分离抗体、抗体的纯化等等。本文所用术语“基因”不仅包括DNA，也包括其mRNA、cDNA及其RNA。本文所用术语“多核苷酸”亦以与核酸相同的意思使用，并亦包括DNA、RNA、探针、寡核苷酸和引物。本文所用术语“多肽”和“蛋白”无差别地使用。本文所用术语“基因表达”指从基因转录mRNA的现象和/或从mRNA翻译蛋白质的现象。本文所用术语“外源基因”指人工引入宿主细胞的基因。本文所用术语“外源蛋白”指由外源基因编码的蛋白。本文所用术语“基因表达单元”指在转录阅读框方向具有至少启动子区域、外源基因和转录终止子区域(多聚(A)添加信号)的多核苷酸。本文所用术语“提高外源基 因表达的活性”，指通过创造对含有外源基因的基因表达单兀周围的DNA的转录和翻译有利的环境，并显者提闻转录和翻译效率，来提闻宿主细胞中外源蛋白的产量。本文所用术语“DNA元件”指具有提高外源基因表达活性的多核苷酸，其中所述多核苷酸位于基因表达单元附近或在含有基因表达单元的外源基因表达载体中。本文所用术语“抗体功能片段”，指具有抗原结合活性的部分抗体片段，其包括Fab、F(ab’)2等。然而，所述术语不限于这些分子，只要片段对抗原具有结合亲和力即可。1.用于提闻外源基因表达的DNA兀件
如实施例1所示，可通过利用乙酰化组蛋白H3和基因组DNA的相互作用来获得本发明的DNA元件。一般而言，认为组蛋白(H3和H4)的乙酰化与转录激活相关，并且一直在提倡两种主要理论。一种理论是组蛋白乙酰化与核小体构象改变有关，以此方式使得组蛋白尾部乙酰化,从而成为电中和的，导致DNA组蛋白相互作用减弱(Mellor J.(2006) Dynamicnucleosomes and gene transcription (动态核小体和基因转录).Trends Genet.22(6): 320-329)。另一个理论是组蛋白乙酰化与各种转录因子的募集相关(Nakatani Y.(2001) Histone acetylases - versatile players (组蛋白乙酸基转移酶-多面手).Genes Cells.6(2): 79_86)。在任何一个理论中,有高可能性的是,组蛋白乙酰化与转录激活相关，并且通过用抗乙酰化组蛋白H3抗体实施染色质免疫沉淀(ChIP)，可能浓缩与乙酰化组蛋白H3相互作用的DNA元件。在本发明中，A2是用于提高外源基因表达的DNA元件的实例。A2位于人15号染色体的80966429-80974878区域，为具有62.2% AT含量的8450 bp的多核苷酸序列。A2的多核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO:1代表。A7、A18、B5和C14是相似的DNA元件的实例。A7位于人11号染色体的88992123-89000542区域，为具有64.52% AT含量的8420 bp的多核苷酸序列。A7的多核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 2代表。
A18位于人4号染色体的111275976-111284450区域，为具有62.54% AT含量的8475 bp的多核苷酸序列。A18的多核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 3代表。B5位于人I号染色体的143034684-143043084区域，为具有66.37% AT含量的8401 bp的多核苷酸序列。B5的多核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 4代表。最后，C14位于人11号染色体的46089056-46097482区域，为具有63.81% AT含量的8427 bp的多核苷酸序列。C14的多核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 5代表。在本发明中，可通过使用由报告基因例如SEAP编码的蛋白活性作为指标来测定DNA元件提高外源基因表达的活性。与不存在DNA元件的情况相比，在存在DNA元件的情况中，当报告蛋白活性增加时(优选2倍或更高，更优选4倍或更高，再优选5倍或更高)，可确定DNA元件具有提高外源基因表达的活性。甚至在活性增加2倍或更多的情况中，也预期这将会降低细胞培养规模和细胞培养时间，因此可能增加产量和降低细胞培养成本。如果产量增加，那么可能稳定提供外源蛋白用作药物。此外，如果细胞培养成本降低，则外源蛋白用作药物的成本降低，并且待给予外源蛋白的患者的财务负担也会降低。在本发明中，以上任何一种DNA元件可以单独使用，也可使用一种类型的DNA元件的2个或多个拷贝。或者，也可以联合使用2种或多种不同类型的上述DNA元件。A2、A7、A18、B5和C14为本发明使用的DNA元件的优选实例。将用于本发明的D·NA元件可以是这样的多核苷酸序列，其包含与由SEQ ID NO:1-5代表的任何一个多核苷酸序列具有80%或更高同源性的多核苷酸序列，并具有提高外源基因表达的活性。80%或更高的同源性优选为90%或更高的同源性，更优选95%或更高的同源性，最优选99%或更高的同源性。可以用例如FASTA或BLAST程序在例如日本DNA数据库等中检索多核苷酸序列的同源性。将用于本发明的DNA元件可以是这样的DNA元件，其在严格条件下与这样的由多核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，并具有提高外源基因表达的活性:所述多核苷酸与由选自SEQ ID NO: 1-5代表的多核苷酸序列的多核苷酸序列组成的多核苷酸互补。本文所用术语“严格条件”指其中形成所谓的特异杂交物(hybrid)但不形成非特异杂交物的条件。例如，例示性严格条件为这样的条件，在此条件下由具有高同源性的多核苷酸序列组成的核酸互补链杂交，包含具有较低同源性的多核苷酸序列的核酸的互补链不杂交，所述具有高同源性的多核苷酸序列即与选自SEQ ID NO: 1-5代表的多核苷酸序列的多核苷酸序列具有80%或更高、优选90%或更高、更优选95%或更高、最优选99%或更高同源性的多核苷酸序列。更具体的是，可例示的条件为这样的条件，在此条件下，钠盐浓度为15-750禮、优选50-750禮、更优选300-750禮，温度为25_70°C、优选50_70°C、更优选55-65°C,甲酰胺浓度为0-50%、优选20-50%、更优选35-45%。另外，作为严格条件，可例示在杂交后洗涤滤纸的条件，其中钠盐浓度通常为15-600 mM、优选50-600 mM、更优选300-600禮，温度为50-70°C、优选55-70°C、更优选60-65°C。本领域技术人员可以参考分子克隆(Molecular Cloning) (Sambrook, J.等，Molecular Cloning: a Laboratory Manual 第二版,Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 10 Skyline Drive Plainview, NY (1989))等容易地获得这样的同源基因。另外,可以通过FASTA搜索或BLAST搜索以相同方式确定上述多核苷酸序列的同源性。可通过本技术领域已知方法引入突变(缺失、取代和/或添加)到上述多核苷酸序列，所述方法例如Kunkel法或缺口双链法或基于该方法。例如，可以使用利用定点诱变法的突变导入试剂盒(例如，Mutant-K (由TaKaRa Bio, Inc.制造)、Mutant_G (由TaKaRaBio, Inc.制造)或体外LA PCR诱变系列试剂盒(由TaKaRa Bio, Inc.制造))等。这样的突变多核苷酸也可作为本发明的DNA元件使用。可以使用包含由序列表中SEQ ID NO: 1_5任一个所代表的多核苷酸序列的至少3000或至少2000个连续核苷酸的部分片段作为本发明DNA元件。所述部分片段的实例包括:A2的部分片段A2-1到A2-17，A7的部分片段A7-1到A7-18，A18的部分片段A18-1到A18-4，B5的部分片段B5-1到B5-6，以及C14的部分片段C14-1到C14-14。然而，DNA元件不限于这些部分片段，只要其具有提高外源基因表达的活性即可。在本发明中，可以单独使用上述任何一个部分片段，也可以使用一种类型部分片段的2个或多个拷贝。或者，可联合使用2种或多种不同类型的部分片段。另外，可以联合使用上述任何DNA元件的全长序列和部分片段。在以上联合中，全长序列和部分片段可以源自相同DNA元件或源自不同DNA元件。关于A2的各个片段的多核苷酸序列:A2-1对应于序列表中SEQ ID NO:1的1-3000位核苷酸的多核苷酸序列；A2-2对应于序列表中SEQ ID NO:1的2801-5800位核苷酸的多核苷酸序列；A2-3对应于序列表中SEQ ID NO:1的5401-8450位核苷酸的多核苷酸序列；A2-4对应于序列表中SEQ ID NO:1的701-2700位核苷酸的多核苷酸序列；A2_5对应于序列表中SEQ ID NO:1的701-2200位核苷酸的多核苷酸序列；A2_6对应于序列表中SEQ ID NO:1的701-3700位核苷酸的多核苷酸序列；A2-7对应于序列表中SEQ ID NO:1的2001-5000位核苷酸的多核苷酸序列；A2-8对应于序列表中SEQ ID NO:1的4001-7000位核苷酸的多核苷酸序列；A2-9对应于序列表中SEQ ID NO:1的1-3700位核苷酸的多核苷酸序列；A2-10对应于序列表中SEQ ID NO:1的2001-5800位核苷酸的多核苷酸序列；A2-11对应于序列表中SEQ ID NO:1的2801-7000位核苷酸的多核苷酸序列；A2_12对应于序列表中SEQ ID NO:1的701-5800位核苷酸位核苷酸的多核苷酸序列；A2-13对应于序列表中SEQ ID NO:1的2001-7000位核苷酸的多核苷酸序列；A2_14对应于序列表中SEQID NO:1的2801-8450位核苷酸的多核苷酸序列；A2-15对应于序列表中SEQ ID NO:1的1-5800位核苷酸的多核苷酸序列；A2-16对应于序列表中SEQ ID NO:1的701-7000位核苷酸的多核苷酸序列；和A2-17对应于序列表中SEQ ID NO:1的2001-8450位核苷酸的多核苷酸序列。关于A7的各个片段的多核苷酸序列:A7-1对应于序列表中SEQ ID NO: 2的601-3600位核苷酸的多核苷酸序列；A7-2对应于序列表中SEQ ID NO: 2的3601-8420位核苷酸的多核苷酸序列；A7-3对应于序列表中SEQ ID NO: 2的5401-8420位核苷酸的多核苷酸序列；A7-4对应于序列表中 SEQ ID NO: 2的3401-6400位核苷酸的多核苷酸序列；A7-5对应于序列表中SEQ ID NO: 2的1501-4500位核苷酸的多核苷酸序列；A7-6对应于序列表中SEQ ID NO: 2的4401-7400位核苷酸的多核苷酸序列；A7-7对应于序列表中SEQID NO: 2的2401-5400位核苷酸的多核苷酸序列；A7_8对应于序列表中SEQ ID NO: 2的1-3600位核苷酸的多核苷酸序列；A7-9对应于序列表中SEQ ID NO: 2的1501-5400位核苷酸的多核苷酸序列；A7-10对应于序列表中SEQ ID NO: 2的2401-6400位核苷酸的多核苷酸序列；A7-11对应于序列表中SEQ ID NO: 2的3401-7400位核苷酸的多核苷酸序列；A7-12对应于序列表中SEQ ID NO: 2的4401-8420位核苷酸的多核苷酸序列；A7_13对应于序列表中SEQ ID NO: 2的1-5400位核苷酸的多核苷酸序列；A7-14对应于序列表中SEQID NO: 2的1501-6400位核苷酸的多核苷酸序列；A7-15对应于序列表中SEQ ID NO: 2的2401-7400位核苷酸的多核苷酸序列；A7-16对应于序列表中SEQ ID NO: 2的3401-8420位核苷酸的多核苷酸序列；A7-17对应于序列表中SEQ ID NO: 2的1-6400位核苷酸的多核苷酸序列，和A7-18对应于序列表中SEQ ID NO: 2的1501-7400位核苷酸的多核苷酸序列。关于A18的各个片段的多核苷酸序列:A18_1对应于序列表中SEQ ID NO: 3的1-5040位核苷酸的多核苷酸序列；A18-2对应于序列表中SEQ ID NO: 3的1001-6002位核苷酸的多核苷酸序列；A18-3对应于序列表中SEQ ID NO: 3的2001-7000位核苷酸的多核苷酸序列；A18-4对应于序列表中SEQ ID NO: 3的3000-7000位核苷酸的多核苷酸序列。A2、A7和A18的各个片段的起点和终点示于图18中。关于B5的各个片段的多核苷酸序列:B5-1对应于序列表中SEQ ID NO: 4的1-4001位核苷酸的多核苷酸序列；B5-2对应于序列表中SEQ ID NO: 4的1-3200位核苷酸的多核苷酸序列；B5-3对应于序列表中SEQ ID NO: 4的2491-5601位核苷酸的多核苷酸序列；B5-4对应于序列表中SEQ ID NO: 4的5373-8401位核苷酸的多核苷酸序列；B5-5对应于序列表中SEQ ID NO: 4的901-4001位核苷酸的多核苷酸序列；和B5-6对应于序列表中SEQ ID NO: 4的4001-7000位核苷酸的多核苷酸序列。关于C14的各个片段的多核苷酸序列:C14_1对应于序列表中SEQ ID NO: 5的960-4015位核苷酸的多核苷酸序列；C14-2对应于序列表中SEQ ID NO: 5的1987-5014位核苷酸的多核苷酸序列；C14-3对应于序列表中SEQ ID NO: 5的4020-7119位核苷酸的多核苷酸序列；C14-4对应于序列表中SEQ ID NO: 5的960-8141位核苷酸的多核苷酸序列；C14-5对应于序列表中SEQ ID NO: 5的960-6011位核苷酸的多核苷酸序列；C14-6对应于序列表中SEQ ID NO: 5的4939-8141位核苷酸的多核苷酸序列；C14-7对应于序列表中SEQID NO: 5的960-5014位核苷酸的多核苷酸序列；C14_8对应于序列表中SEQ ID NO: 5的2994-7119位核苷酸的多核苷酸序列；C14-9对应于序列表中SEQ ID NO: 5的4020-8141位核苷酸的多核苷酸序列；C14_10对应于序列表中SEQ ID NO: 5的1-5014位核苷酸的多核苷酸序列；C14-11对应于序列表中SEQ ID NO: 5的1987-7119位核苷酸的多核苷酸序列；C14-12对应于序列表中SEQ ID NO: 5的2994-8141位核苷酸的多核苷酸序列；C14-13对应于序列表中SEQ ID NO: 5的960-7119位核苷酸的多核苷酸序列；C14-14对应于序列表中SEQ ID NO: 5的1987-8141位核苷酸的多核苷酸序列。B5和C14各个片段的起点和终点亦示于图19中。2.多核苷酸的获取
在本发明中，可通过如下所述通用程序获得含有外源基因的多核苷酸，所述外源基因编码其产量将会增加的外源蛋白，这一点在后面阐述。例如，可使用基于外源基因片段合成的DNA探针，通过筛选源自表达外源基因的细胞或组织的cDNA文库，来分离所述多核苷酸。mRNA可以通过本技术领域常用 的方法来制备。例如，用胍试剂、酚试剂等处理细胞或组织，从而获得总RNA,此后通过使用寡聚(dT)纤维素柱或含有Sepharose 2B作为载体的聚U-Sepharose柱等等的亲和柱法,或通过分批处理法,获得多聚(A)+RNA (mRNA)。同样，多聚(A)+RNA可以通过蔗糖密度梯度离心法等进一步分级分离。然后，用由此获得的mRNA作为模板，同时亦使用寡聚dT引物和逆转录酶，合成单链cDNA。从由此获得的单链cDNA，用DNA聚合酶1、DNA连接酶、RNA酶H等合成双链cDNA。用T4DNA聚合酶使由此合成的双链cDNA具有平端，接着与衔接子(例如EcoI衔接子)连接，进行磷酸化等，将所得DNA掺入到诸如Agtll等λ噬菌体中以实现体内包装，藉此可制备cDNA文库。也可使用λ噬菌体以外的质粒载体来制备cDNA文库。此后，可自cDNA文库选择含有靶DNA的克隆(阳性克隆)。在待用于增加蛋白产量或增加含有外源基因的多核苷酸产量的上述DNA元件分离自基因组DNA情况下，或在含有启动子和终止子区域的多核苷酸分离自基因组DNA的情况下，参照通用程序(Molecular Cloning (1989), Methods in Enzymology 194 (1991)自待用作收集源的生物细胞系提取基因组DNA，选择并分离多核苷酸。可以参照例如Cryer等的方法(Methods in Cell Biology, 12, 39-44 (1975))或 P.Philippsen 等的方法(Methods Enzymo1., 194，169-182 (1991))进行基因组 DNA 的提取。也可以通过例如PCR 法(PCR Technology.Henry A.Erlich, Atockton press(1989))获得靶DNA元件或含有外源基因的多核苷酸。在用PCR法扩增多核苷酸时，使用20-到30-聚体的合成的单链DNA作为引物，并用基因组DNA作为模板。在确认基因的多核苷酸序列后使用扩增的基因。可以使用基因组DNA文库例如细菌人工染色体(BAC)作为PCR模板。
在另一方面，可以通过以下方法获得含有其序列未知的外源基因的多核苷酸:(a)按照通用程序制备基因文库；和(b)从制备好的基因文库中选择所期需多核苷酸并扩增所述多核苷酸。基因文库可如下制备:通过用合适的限制酶将染色体DNA部分消化，以使染色体DNA片段化，让所获得的片段与合适的载体连接，并将载体引入到合适的宿主，所述染色体DNA通过通用程序自用作采集源的生物细胞系获得。基因文库亦可如下制备:从细胞提取mRNA,从mRNA合成cDNA,让cDNA与合适的载体连接,将载体引入到合适的宿主。亦可使用用于基因文库制备的通常称作载体的质粒、噬菌体载体、粘粒等，作为在所述制备中使用的载体。可使用适于上述载体类型的宿主，作为待转化或转染的宿主。用含有对外源基因特异的序列的标记探针，通过菌落杂交法、噬菌斑杂交法等，从上述基因文库选择含有外源基因的多核苷酸。另外，也可以通过完全化学合成生产含有外源基因的多核苷酸。例如，可通过以下方法来合成基因:制备两对互补寡聚核苷酸并退火的方法；由DNA连接酶连接几种退火的DNA链的方法；制备几种部分配对的多核苷酸并且由PCR填充空隙的方法；等等。可通过常规技术例如双脱氧法(Sanger等，Proc.Natl.Acad.Sc1., USA, 74,5463-5467，(1977))等进行多核苷酸序列的测定。另外，也可以用市购序列测定试剂盒等容易地进行上述多核苷酸序列的测定。3.外源基因表达载体，元件载体
提供以下载体作为本发明的外源基因表达载体:含有一种类型的上述DNA元件，一种类型的上述DNA元件的两个或多个拷贝，或两个或多个不同类型的上述DNA元件的组合，并进一步含有外源基因表达单元的载体。当用上述外源基因表达载体在宿主细胞中表达外源基因时，DNA元件可紧邻基因表达单元的上游或下游，或可位于远离基因表达单元的位置。另外，可以使用一种含有多个所述DNA元件的外源基因表达载体。附带说一下，DNA元件可以以相对于基因表达单元的正向或反向插入。另外，亦包括以下载体作为待用于本发明的载体:含有一种类型的上述DNA元件，一种类型的上述DNA元件的两个或多个拷贝，或两种或多种不同类型的上述DNA元件组合，并且不含有基因表达单元(下文中也称作“元件载体”)的载体。所述元件载体可以与上述含有DNA元件的外源基因表达载体或不含DNA元件而仅包含外源基因表达单元的外源基因表达载体组合使用。与单独使用外源基因表达载体的情形相比，通过让元件载体与外源基因表达载体共存，外源基因的表达增强，因此，上述载体组合也包括在本发明的外源基因表达载体中。编码外源蛋白的基因不受特别限制，然而，其实例包括:报告基因，例如分泌性碱性磷酸酶(SEAP)、绿色荧光蛋白(GFP)和荧光素酶；各种酶基因，例如α-淀粉酶基因和α-半乳糖苷酶基因；各种干扰素基因，其为药学上有用并有生理活性的蛋白，例如α干扰素和Y干扰素基因；各种白细胞介素例如IL-1和IL-2基因；各种细胞因子基因，例如红细胞生成素(EPO)基因和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)基因；生长因子基因；和抗体基因。可以通过任何方法获得这些基因。
本发明在有关高度疏水蛋白和由于复合构成而难于分泌和生产的蛋白上特别有效。因此，上述外源蛋白包括多聚体蛋白，例如作为抗体或其功能片段的异多聚体。“抗体功能片段”指具有抗原结合活性的抗体的部分片段，包括Fab、F(ab’)2、Fv, scFv、双抗体、线性抗体、自抗体片段形成的多特异性抗体等。抗体的功能片段还包括Fab’，其为通过在还原条件下处理F(ab’)2获得的抗体可变区中的单价片段。然而，这些功能片段不限于这些分子，只要所述片段对抗原具有结合亲和力即可。另外，这些功能片段不仅包括通过用合适的酶处理抗体蛋白全长分子获得的片段，还包括在合适的宿主细胞中使用遗传修饰的抗体基因生广的蛋白。基因表达单元在转录阅读框方向具有至少启动子区域、外源基因和转录终止子区域(多聚(A)添加信号)。本文可使用的启动子可以是组成型表达启动子或诱导型表达启动子。组成型表达启动子的实例包括各种天然启动子，例如SV40早期启动子、腺病毒ElA启动子、CMV (巨细胞病毒)启动子、EF-1 α (人延伸因子-1 α )启动子、HSP70启动子、MT启动子、RSV启动子、UBC启动子和肌动蛋白启动子；和人工(融合)启动子，例如SRa启动子和CAG启动子。另外，多聚(A)添加序列可以是具有引起从启动子转录的转录终止的活性的序列，可以是与启动子相同或不同的基因的序列。需要使用强启动子来提高外源蛋白的生产。然而，当试图使用高活性启动子生产难以折叠的蛋白或难以分泌的蛋白时，所述蛋白反而可能不能分泌。这是因为当以超过进行翻译的核糖体和进行折叠和分泌的内质网容量的量生产时，过量生产的蛋白在细胞内变性、积累和泛素化，然后由蛋白体降解。因此，优选适当地选择这样的启动子，其可以达到这样程度的表达水平:得到的蛋白不变性或聚集，或得到的蛋白量不超过分泌容量。或者，通过调节(例如降低)启动子活性来使用启动子。在多聚体蛋白中，形成异多聚体的分子易受上述效应的影响，特别是诸如为异四聚体的抗体等分子。抗体具有相互缔合的两条重链分子和两条轻链分子，因此，为了恰当地缔合所述分子，其表达水平是重要因素。另外，本发明的外源基因表达载体和元件载体可以各自含有选择标记用于选择转化体。通过使用例如赋予对药物抗性的抗药标记，可以选择转化体，所述药物例如浅蓝菌素(cerulenin)、金担子素(aureobasidin)、Zeocin、刀豆氨酸(canavanine)、放线菌酮(cycloheximide)、潮霉素(hygromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、杀稻痕素(blasticidin)、四环素(tetracycline)、卡那霉素(kanamycin)、氨节西林(ampicillin)或新霉素(neomycin)。另外，当使用以下基因作为标记时,亦可选择转化子:赋予对例如乙醇等溶剂抗性、对甘油、盐等的渗透压抗性、对诸如铜离子等金属离子抗性的基因等等。本发明的外源基因表达载体和元件载体各自可以是不掺入到染色体DNA的载体。一般而言，将外源基因表达载体转染到宿主细胞，此后随机掺入到染色体中。然而，通过使用源于哺乳动物病毒例如猿猴病毒40 (SV40)、乳头瘤病毒(BPV、HPV)或EBV的组成型成分，载体可作为在转染宿主细胞中自主复制的游离型载体使用。例如，可以使用含有SV-40来源的复制起点(oriP)及编码为反式作用因子的SV40大T抗原的序列的载体、含有EBV来源的oriP和编码EBNA-1的序列的载体等等。可以通过提高外源基因表达的活性来表示DNA元件的作用，而与载体类型或其到染色体中的掺入存在或不存在情况无关。4.转化细胞
本发明的转化细胞是已经引入含有上文条目“I”所述的DNA元件的上文条目“3”所述的外源基因表达载体的转化细胞。作为外源基因表达载体，可以引入仅含有DNA元件的外源基因表达载体(A)，或可以联合引入含有DNA元件的外源基因表达载体以及在上文条目“3”所述的元件载体(B)。或者，可以联合引入不含有DNA元件的外源基因表达载体和元件载体(C)。可以按照例如以下方法来实施在使用以上⑶或(C)组合的宿主细胞中的外源基因的表达:Girod 等的方法(Biotechnology and Bioengineering, 91, 2-11 (2005))和Otte 等的方法(Biotechnol.Prog., 2007，23，801-807 (2007))。
待转化的宿主细胞的实例包括真核细胞，其优选实例包括哺乳动物细胞，更优选的实例包含源自人、小鼠、大鼠、仓鼠、猴或牛的细胞。所述哺乳动物细胞实例包括cos-ι细胞、293细胞和CHO细胞(CH0-K1、DG44、CH0 dhfr-、CH0-S)，然而，宿主细胞不限于这些。在本发明中，可以使用任何方法来将表达载体引入到宿主细胞中，只要所述方法允许引入的基因稳定存在于宿主细胞并且在其中适当地表达。通常使用的方法实例包括磷酸隹丐法(Ito 等，c (1984) Agric.Biol.Chem., 48, 341)、电穿孔法(Becker, D.Μ.等，1990; Methods.Enzymo1., 194, 182-187)、原生质球法(Creggh 等，Mol.Cell.Biol.,5，3376 (1985))、乙酸锂法(Itoh, H.(1983) J.Bacteriol.153，163-168)和脂转染法。5.生产外源蛋白的方法
在本发明中，可通过以下方法来生产外源蛋白:培养上文条目“4”所述的转化细胞，其中已经通过已知方法使用上文条目“3”所述的载体引入编码外源蛋白的基因；从所得培养产物中收集蛋白质，接着纯化蛋白。本文所用术语“培养产物”指除培养物上清液外还有培养细胞或细胞匀浆。附带说一下，不仅可以选择单体蛋白，还可以选择多聚体蛋白作为可以使用上文条目“4”所述的转化细胞生产的外源蛋白。在其中生产由多个不同亚基形成的异多聚体蛋白的情况中，必需分别将多个编码这些亚基的基因引入到上文条目“4”所述的宿主细胞中。
可以按照培养宿主细胞的常规方法来实施培养转化细胞的方法。在其中转化细胞为哺乳动物细胞的情况中，细胞在例如37°C和5%或8% CO2培养时间约24-1000小时的条件下培养。可以通过分批培养、补料分批培养、连续培养等在静置、振摇、搅拌或通气条件下进行培养。可以通过SDS-PSGE、Western分析、ELISA等从上述培养产物(培养液)中进行编码外源蛋白的基因表达产物的确认。为了分离和纯化生产的蛋白，可以使用常规蛋白分离和纯化方法。在完成培养后，在细胞中生产靶蛋白的情况下，使用超声匀浆器、弗氏压碎器、Manton-Gaulin勻衆器、Dinomil等使细胞勻衆化，由此获得祀蛋白。另外，在细胞外生产靶蛋白的情况下，使用培养液本身，或通过离心等方法去掉细胞。此后，用有机溶剂萃取等收集靶蛋白，然后可以通过使用以下技术来分离和纯化收集的靶蛋白:例如各种色谱技术(疏水色谱法、反相色谱法、亲和色谱法、离子交换色谱法等)、使用分子筛的凝胶过滤和使用聚丙烯酰胺凝胶电泳等等，它们可按照需要单独或组合使用。上述培养方法和纯化方法仅仅是实例，所述方法不限于此。可以通过已知的氨基酸分析技术例如使用Edman降解法的自动氨基酸序列测定,来确认纯化的基因产物的氨基酸序列。6.生产抗体蛋白的方法
作为将使用上文条目“5”所述的生产方法生产的异多聚体蛋白，可例示抗体蛋白。抗体蛋白是包含两个重链多肽分子和两个轻链多肽分子的四聚体蛋白。因此，为了获得保持抗原结合亲和力状态下的所述抗体蛋白，必需将重链和轻链基因两者引入到上文条目“4”所述的转化细胞。在这种情况下，重链和轻链基因表达单元可以存在于同一个表达载体或不同表达载体上。作为将在发明中生产的抗体，可例示通过用所期需抗原免疫诸如兔、小鼠或大鼠等实验动物而制备的抗体。另外，亦可例示通过使用上述抗体作为起始材料获得的嵌合抗体和人源化抗体作为本发明中将生产的抗体。另外，使用遗传修饰动物或噬菌体展示方法获得的人抗体也包括在本发明将生产的抗体中。将用于抗体生产的抗体基因不限于具有特异性多核苷酸序列的抗体基因，只要待从抗体基因转录和翻译的重链多肽和轻链多肽的组合具有结合给定抗原蛋白的活性即可。另外，不必要的是，抗体基因编码抗体全长分子，而可以使用编码抗体功能片段的基因。所述编码其功能片段的基因可以通过遗传修饰编码抗体蛋白全长分子的基因获得。7.其它外源蛋白的生产方法
除上述抗体外，将使用本发明生产方法生产的外源蛋白的实例还包括:各种源于人或非人的蛋白、其功能片段及其修饰产物。所述蛋白等等的实例包括肽激素，例如心房钠尿肽(ANP)、脑钠素(BNP)、C型利钠肽(CNP)、加压素、生长抑素、生长激素(GH)、胰岛素、催产素、生长素释放肽、瘦蛋白、脂连蛋白、肾素、降钙素、骨保护素和胰岛素样生长因子(IGF)；细胞因子类，例如白介素、趋化因子、干扰素、肿瘤坏死因子(例如TNF-α ,TNF-β和TNF超家族)、神经生长因子类(例如NGF)、细胞生长因子类(例如EGF、FGF、PDGF, HGF和TGF)、造血生长因子类(例如CSF、G-CSF和红细胞生成素)和脂肪因子(adipokine);受体，例如TNF受体；酶，例如溶菌酶、蛋白酶、蛋白水解酶和肽酶；其功能片段(具有原始蛋白部分或全部生物学功能的片段)；和包含这些蛋白中任何一种的融合蛋白。然而，所述蛋白不限于此。
实施例本发明在下文中将参考实施例进行具体描述。然而，这些实施例不限制本发明的技术范围。本发明实施例中待使用的质粒、限制性内切酶、DNA修饰酶等等为市购产品，并且可以按照通用程序使用。另外，用于DNA克隆、多核苷酸序列测定、宿主细胞转化、经转化宿主细胞的培养、从得到的培养产物中收集蛋白质、蛋白质纯化等等的程序亦为本领域技术人员所熟知，或可参见文献。实施例1 提取DNA元件
(1-1)使用抗-乙酰化组蛋白H3抗体的染色质免疫沉淀
用EZ ChIP (Upstate)按照以下程序实施使用抗-乙酰化组蛋白抗体的ChIP。顺便说一下，除非另外指出，否则使用Upstate产品作为在以下程序中使用的抗体、缓冲液等等。首先，使用GIBCO (注册商标)FreeStyleTM 293 培养基(Invitrogen)在 37°C和8% CO2条件下培养293F细胞(Invitrogen)，接着离心(1000 rpm, 5分钟，室温)，藉此收集生长期细胞。在含有1%甲醛的培养基中固定2 X IO7细胞10分钟后，将IOx甘氨酸加入其中，接着室温孵育5分钟。·离心(3000 rpm, 5分钟，4°C)后，移除上清，加入PBS至细胞沉淀中以悬浮细胞。然后，再次离心细胞悬液以移除PBS，此后将SDS裂解缓冲液加入至细胞沉淀中以悬浮和裂解细胞。在超声匀浆器(BRANSON)中对每个通过细胞裂解获得的样品进行DNA片段化，同时用冰水冷却样品，向其中加入含有蛋白酶抑制剂混合物和蛋白G-固定的琼脂糖的稀释缓冲液。在4°C让得到的混合物旋转I小时，接着离心，然后收集上清液。随后，向其中加入10 μ g标准兔IgG或α -乙酰组蛋白Η3抗体，接着4°C旋转过夜。向得到的溶液中加入G蛋白-固定的琼脂糖，并且在4°C旋转所得混合物I小时，接着离心，然后收集沉淀。用低盐免疫复合洗漆缓冲液(Low Salt Immune Complex Wash Buffer)对由此获得的沉淀洗涤两次，用高盐免疫复合洗涤缓冲液洗涤两次，用LiCl免疫复合洗涤缓冲液洗涤两次，最后用TE缓冲液洗涤4次。然后向其中加入洗脱缓冲液(含有20 μ I I M碳酸氢钠、10 μ I SDS和170 μ I无菌水)。30分钟后，离心混合物，收集上清液。随后，将5 M氯化钠加入上清液中，在65°C将所得混合物加热过夜。然后向其中加入RNA酶A，37°C孵育所得混合物30分钟。然后向其中加入0.5 M EDTAU M Tris-HCl和蛋白酶K，在45°C让所得混合物孵育2小时。最后，向其中加入通过用蛋白酶K处理获得的溶液的5倍量的试剂A、B和C，接着用旋转过滤器(Spin filter)离心(10000 rpm, 30秒,室温)，藉此纯化染色质-免疫沉淀的 DNA。(1-2)微阵列分析
通过使用GenomePlex全基因组扩增(WGA)试剂盒(Sigma),扩增在(1_1)中获得的每个ChIP样品。程序按照试剂盒附带的Sigma方案进行。为了证实ChIP，通过使用320 ng由WGA扩增的每一种DNA作为模板，亦使用以下引物和 SYBR (注册商标)预混 Ex Taq (Perfect Real Time) (TAKARA)，通过 PCR 方法扩增甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)内部基因(95°C 5秒和60°C 20秒x 45个循环)。附带说一下，GAPDH是待用作确定通过ChIP是否富集DNA元件的阳性对照的管家基因，并且用连接到EZ ChIP (Upstate)的引物来实施PCR方法。
5#-TACTAGCGGTTTTACGGGCG-3’
S#-TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3,如图1所示，确定了 GAPDH在用抗-乙酰化组蛋白H3抗体进行免疫沉淀的样品中特异性扩增。对每个通过WGA扩增的DNA样品进行微列阵分析(NimbleGen)以实施染色质免疫沉淀芯片(ChlP-on-chip) </‘ΟιΙΡ-0η-(Λ ρ”是用于通过对在(1_丨)中富集的每个DNA进行微阵列分析来鉴别每个DNA元件的技术。(1-3)提取 DNA 元件
基于在(1-2)中获得的ChlP-on-chip分析的结果，提取5个具有62%或更多AT含量的序列。A2:染色体 I5 (80966429-80974878)
A7:染色体 11 (88992123-89000542)
A18:染色体 4 (111275976-111284450)
B5:染色体 I (143034684-143043084)
C14:染色体 11 (46089056-46097482)
实施例2
用分泌性碱性磷酸酶(SEAP)表达作为DNA元件表达效果的指标 (2-1)构建SEAP表达载体
通过使用PSEAP2-对照(Clontech)作为模板，由PCR方法(94°C 30秒和68°C 2分钟X 40个循环)使用以下引物和KOD-plus- (Τ0Υ0Β0)来扩增SEAP基因。
5r^AAAGCTAGCATGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGGGCC-3r
5r-AAAAGATCTTCATGTCTGCTCGAAGC GGCCGGCCGC-3,随后通过琼脂糖凝胶电泳分离扩增的SEAP片段并从凝胶切割，接着用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化。将由此获得的DNA片段用作插入片段。用限制性内切酶NheI和BglII消化该插入片段，并且用限制性内切酶NheI和BamHI消化载体pIRES hyg3(Clontech)。分别对得到的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳来分离靶片段，并且从凝胶切割靶片段，接着纯化。然后，进行连接反应和转化。用LigaFast快速DNA连接体系(Promega)实施连接反应。转化如下进行。首先，解冻冷冻的感受态细胞JM109 (TAKARA)，并且将连接反应后获得的10 μ I溶液加入至解冻的细胞溶液，让得到的混合物置于冰上30分钟。此后，向混合物施用热激(42°C，45秒)，让混合物在冰上冷却5分钟。向该细胞悬液中加入Iml LB培养基，让得到的混合物在37°C振摇I小时。然后，将混合物铺板在含有0.1 mg/ml氨苄青霉素的LB平板上，让该平板在37°C孵育14-16小时。此后，通过碱裂解，从LB平板培养的菌落收集靶质粒。最后，测定通过碱裂解获得的质粒中的SEAP的多核苷酸序列，藉此构建 pCMV/SEAP ires Hygro (2-2)克隆 DNA 元件
随后，用来自含有对应于各DNA元件的多核苷酸序列的细菌人造染色体(BAC)的BAC亚克隆试剂盒(Gene Bridges)，将在实施例1中提取的各DNA元件克隆至(2_1)中获得的SEAP表达载体。首先，用限制性内切酶SpeI消化(2-1)中获得的pCMV/SEAP ires Hygro数小时，接着乙醇沉淀，用无菌水溶解沉淀。通过使用经SpeI消化的载体作为模板，使用以下引物和 KOD-plus- (TOYOBO)实施 PCR 方法(94°C 15 秒、55°C 30 秒和 68°C 10 分钟 x 30 个循环)。
权利要求
1.由序列表中的SEQID NO:1代表的多核苷酸序列组成的多核苷酸。
2.由序列表中的SEQID NO: 2代表的多核苷酸序列组成的多核苷酸。
3.由序列表中的SEQID N0:3代表的多核苷酸序列组成的多核苷酸。
4.由序列表中的SEQID NO: 4代表的多核苷酸序列组成的多核苷酸。
5.由序列表中的SEQID NO: 5代表的多核苷酸序列组成的多核苷酸。
6.包含由序列表中的SEQID NO: 1-5中任一个所代表的多核苷酸序列的至少3000个连续核苷酸的多核苷酸。
7.包含由序列表中的SEQID NO: 1-5中任一个所代表的多核苷酸序列的至少2000个连续核苷酸的多核苷酸。
8.包含由序列表中的SEQID NO: 1-5中任一个所代表的多核苷酸序列的至少1500个连续核苷酸的多核苷酸。
9.由与权利要求1-8中任一项的多核苷酸的多核苷酸序列具有95%或更高同源性的多核苷酸序列组成的多核苷酸。
10.由与权利要求1-8中任一项的多核苷酸的多核苷酸序列具有99%或更高同源性的多核苷酸序列组成的多核苷酸。
11.由多核苷酸序列组成的多核苷酸，所述多核苷酸序列含有权利要求1-10中任一项的多核苷酸的多核苷酸序 列的两种或多种序列。
12.由两种或多种类型的选自权利要求1-10中任一项的多核苷酸的多核苷酸组成的多核苷酸。
13.包含权利要求1-12中任一项的多核苷酸的多核苷酸序列的外源基因表达载体。
14.权利要求13的外源基因表达载体，其中由所述外源基因编码的蛋白是多聚体蛋白。
15.权利要求13的外源基因表达载体，其中由所述外源基因编码的蛋白是异多聚体蛋白。
16.权利要求15的外源基因表达载体，其中由所述外源基因编码的蛋白是抗体或其功能片段。
17.转化细胞，其中已引入权利要求13-16中任一项的外源基因表达载体。
18.权利要求17的转化细胞，其中所述细胞为源自哺乳动物的培养细胞。
19.权利要求18的转化细胞，其中所述源自哺乳动物的培养细胞为选自COS-1细胞、293细胞和CHO细胞的细胞。
20.权利要求17-19中任一项的转化细胞，其中由所述外源基因编码的蛋白是多聚体蛋白。
21.权利要求20的转化细胞，其中由所述外源基因编码的蛋白是异多聚体蛋白。
22.权利要求21的转化细胞，其中由所述外源基因编码的蛋白是抗体或其功能片段。
23.用于生产蛋白的方法，所述方法特征在于包括培养权利要求17-22中任一项的转化细胞，并从得到的培养产物中获得由所述外源基因编码的蛋白。
24.用于在已引入外源基因或外源基因表达载体的转化细胞中提高外源基因表达的方法，所述方法特征在于使用权利要求1-12中任一项的多核苷酸或权利要求13-16中任一项的外源基因表达载体。
25.权利要求1-12中任一项的多核苷酸用于在转化细胞中提高外源基因表达的用 途。
全文摘要
公开了使用新颖的DNA元件在哺乳动物细胞中稳定获得外源基因的高表达的方法。更特别地，公开了通过改变已引入外源基因表达单元的基因位点周围的染色质结构来增强转录激活的DNA元件。
文档编号C12N15/85GK103080321SQ201180043099
公开日2013年5月1日 申请日期2011年7月6日 优先权日2010年7月7日
发明者西宫大祐, 井上龙也 申请人:第一三共株式会社
技术领域：
本发明涉及转化的哺乳动物宿主细胞，其分泌外源蛋白的能力已通过利用具有DNA元件的外源基因表达载体而提高，并涉及利用宿主细胞生产外源蛋白的方法。
背景技术：
由于遗传重组技术的发展，蛋白质药物产品例如治疗性蛋白和抗体药物的市场快速增长。特别是抗体药物具有高特异性，即使将其给予人体也不引起不利的免疫反应，因此，一直在对其积极进行开发。可使用微生物、酵母、昆虫、动物或植物细胞、转基因动物或植物细胞等等，作为在其中产生由抗体药物代表的蛋白质药物的宿主细胞。为了使蛋白质药物具有生物学活性或免疫原性，翻译后修饰例如折叠或糖基化是必要的，因此不能进行复杂的翻译后修饰的微生物或具有不同聚糖结构的植物不适合作为以生物反应器操作的宿主细胞。考虑到培养的哺乳动物细胞例如来自于与人亲缘很近的物种的CHO细胞具有与人相似的聚糖结构，而且安全，并且可以使用所述细胞进行翻译后修饰，目前标准是使用这类细胞。在将培养的哺乳动物细胞用作宿主细胞的情况中，与微生物等(见非专利文件I)相比存在生长率低、生产率低、成本高等问题。此外，为了在临床试验中使用蛋白质药物产品，有必要给予大量产品。因此，其生产能力的缺乏也是世界性难题。因此，为了提高外源基因在培养的哺乳动物细胞中的生产率，迄今已进行了启动子、增强子、药物选择标记、基因扩增和培养工程技术等等的大量研究。然而，目前的情形是尚未建立能始终如一地提高基因表达的系统。作为外源蛋白低生产率的的原因之一，考虑到“位置效应”(见非专利文件2)。当将外源基因引入宿主细胞时，其被随机地整合到宿主染色体基因组，并且外源基因的转录受到外源基因整合区域周围DNA的很大影响。然而，位置效应受到例如外源基因的插入位点、拷贝数、结构等因素的影响，非常难以控制染色体中的插入位点。为了解决所述问题，业已鉴别了调控多核苷酸序列(也叫DNA元件)，例如基因座控制区(LCR)、支架/基质附着区(S/MAR)、绝缘子、遍在染色质开放元件(UCOE)和抗阻遏物(STAR元件)等(见非专利文件3-6)。LCR不需要在内源基因的基因座打开染色质结构。然而，LCR是转录调控元件，其具有打开外源基因被整合位点的DNA周围染色质结构的能力及当其与外源基因表达单元一起使用时重塑大范围染色质的能力，并且认为其需要富含AT的区域(见非专利文件7)。常将LCR代表的上述DNA元件与启动子联合使用，已知与只用启动子的情况相比，在DNA元件与启动子联合使用的情况中，外源基因表达水平增加。然而，至今报道了极少DNA元件类型，并且促进外源基因表达增强的各种机制也相互不同。另外，即使DNA元件和启动子联合使用，在DNA元件和启动子控制下也不能生产足量的治疗性蛋白。因此，不能说已获得能增加外源蛋白生产率的DNA元件的充足知识。因此，本发明目标是提供增加在蛋白质药物产品中待用的外源蛋白产量的方法，所述方法使用具有在宿主细胞例如培养的哺乳动物细胞中提高外源基因表达的高活性的DNA元件。引文列表
非专利文献
NPL1: Florian M.Wurm.(2004) Production of recombinant proteintherapeutics in cultivated mammalian cells (在培养哺乳动物细胞中生产重组蛋白治疗药物).Nat.Biotechnol.22(11): 1393-1398
NPL 2: Ted H.J.Kwaks 和 Arie P.0tte.(2006) Employing epigenetics toaugment the expression of therapeutic proteins in mammalian cells (米用表观遗传学来增加哺乳动物细胞中治疗性蛋白的表达).TRENDSinBiotechnol.24(3): 137-142NPL 3: Pierre-Alain Girodj Duc-Quang Nguyen.等(2007) Genome-wideprediction of matrix attachment regions that increase gene expression inmammalian cells (在哺乳动物细胞中增加基因表达的基质附着区的基因组范围预测).Nat.Methods.4(9): 747-753
NPL 4: Adam C.Bell，Adam G.West, Gary Felsenfeld (2001) Insulators andBoundaries: Versatile Regulatory elements in the Eukaryotic Genome (绝缘子和边界:真核基因组中多用途调控元件)，Science 291: 447-450
NPL 5: Steven Williams, Tracey Mustoe.等(2005) CpG-1sland fragmentsfrom the HNRPA2B1/CBX3 genomic locus reduce silencing and enhance transgeneexpression from the hCMV promoter/enhancer in mammalian cells (来自 HNRPA2B1/CBX3基因组位点的CpG-岛片段在哺乳动物细胞中降低沉默并提高自hCMV启动子/增强子的转基因表达).BMC Biotechnol.5(17): 1-9
NPL 6: Arie P.0ttej Ted H.J.Kwaks.等(2007) VariousExpression-Augmenting DNA elements Benefit from STAR-Selectj a Novel HighStringency Selection System for Protein Expression (各种增强表达的DNA兀件受益于STAR-Select这种用于蛋白质表达的新型高严格性选择系统).Biotechnol.Prog.23:801-807
NPL 7: Qiliang Li， Kenneth R.Peterson, Xiangdong Fang 和 GeorgeStamatoyannopoulosj (2002) Locus control regions (基因座控制区)，Blood 100(9):3077-3086发明概述技术问题
如上所述，仍然没有许多类型的作为调控多核苷酸序列的DNA元件，另外，其中只有极少DNA兀件在提1 外源基因表达中1 度有效。本发明的目标是提供利用DNA兀件在哺乳动物细胞中稳定实现高表达的方法等等，所述DNA元件通过伴随其中已引入外源基因表达单元的基因座周围的染色质结构的变化来提高转录激活。问题的解决方案
本发明人为了解决上述问题进行了深入的研究，结果发现待表达的外源蛋白在培养的哺乳动物细胞中的生产率和分泌可通过使用一种或多种特定类型的DNA元件来提高，由此完成了本发明。
换句话说，本发明包括以下发明。(I)由序列表中的SEQ ID NO:1代表的多核苷酸序列组成的多核苷酸。(2)由序列表中的SEQ ID NO: 2代表的多核苷酸序列组成的多核苷酸。(3)由序列表中的SEQ ID NO: 3代表的多核苷酸序列组成的多核苷酸。(4)由序列表中的SEQ ID NO: 4代表的多核苷酸序列组成的多核苷酸。(5)由序列表中的SEQ ID NO: 5代表的多核苷酸序列组成的多核苷酸。(6)包含序列表中的SEQ ID NO: 1_5中任一个所代表的多核苷酸序列的至少3000个连续核苷酸的多核苷酸。(7)包含序列表中的SEQ ID NO: 1_5中任一个所代表的多核苷酸序列的至少2000个连续核苷酸的多核苷酸。(8)包含序列表中的SEQ ID NO: 1_5中任一个所代表的多核苷酸序列的至少1500个连续核苷酸的多核苷酸。(9)由与(1)-(8)中任一项的多核苷酸的多核苷酸序列具有95%或更高同源性的多核苷酸序列组成的多核苷酸。(10)由与(1)-(8)中任一项的多核苷酸的多核苷酸序列具有99%或更高同源性的多核苷酸序列组成的多核苷酸。(11)由多核苷酸序列组成的多核苷酸，所述多核苷酸序列含有(I)-(IO)中任一项的多核苷酸的多核苷酸序列的两种或多种序列。(12)由两种或多种类型的选自(I)-(IO)中任一项的多核苷酸的多核苷酸组成的多核苷酸。(13)包含(1)-(12)中任一项的多核苷酸的多核苷酸序列的外源基因表达载体。(14) (13)的外源基因表达载体，其中由外源基因编码的蛋白是多聚体蛋白。(15) (14)的外源基因表达载体，其中外源基因编码的蛋白是异多聚体蛋白。(16) (15)的外源基因表达载体，其中外源基因编码的蛋白是抗体或其功能片段。(17)转化细胞，其中已引入(13)-(16)中任一项的外源基因表达载体。(18) (17)的转化细胞，其中所述细胞是源自哺乳动物的培养细胞。(19) (18)的转化细胞，其中所述源自哺乳动物的培养细胞为选自C0S-1细胞、293细胞和CHO细胞的细胞。(20) (17)-(18)中任一项的转化细胞，其中由外源基因编码的蛋白为多聚体蛋白。(21) (20)的转化细胞，其中所述外源基因编码的蛋白为异多聚体蛋白。
(22) (21)的转化细胞，其中所述外源基因编码的蛋白为抗体或其功能片段。(23)生产蛋白质的方法，所述方法特征在于包括培养(17)-(22)任一项的转化细胞并从得到的培养产物中获得由外源基因编码的蛋白。(24)在已引入外源基因或外源基因表达载体的转化细胞中提高外源基因表达的方法，所述方法特征在于使用(1)-(12)中任一项的多核苷酸或(13)-(16)中任一项的外源基因表达载体。(25) (1)-(12)中任一项的多核苷酸用于在转化细胞中提高外源基因表达的用途。
发明的有利作用
根据本发明，通过使用DNA元件将外源基因表达载体引入到哺乳动物宿主细胞，可显著提高治疗性蛋白、抗体等的外源基因的表达。附图简述
图1显示通过扩增GADPH区域来证实对其进行ChlP-on-chip的样品是用抗乙酰化组蛋白H3抗体经特异性染色质免疫沉淀的图表。图2为已插入DNA元件的SEAP表达载体的示意图。图3为显示在不含DNA元件或含DNA元件A2、A7、A18、B5或C14的稳定表达的CHO细胞系中，在CMV启动子控制下SEAP表达的图表。证实了 0嫩元件4237、418、85和(:14对提闻表达的作用。
图4包含两个图表，显示在不含DNA元件或含DNA元件A2或A7的稳定表达的CHO细胞系中，在EF-1a或SV40启动子控制下的SEAP表达。证实了 DNA元件A2和A7对提高表达的作用。图5是已插入DNA元件的抗体表达(抗体基因X重链和轻链共表达)载体的示意图。图6包含两个图表，显示在不含DNA元件或含DNA元件A7的稳定表达的CHO细胞系中，在CMV或EF-1 a启动子控制下的抗体分泌水平(通过ELISA法测量)。证实了 DNA兀件A7提闻表达的作用。图7是显不DNA兀件A2和相关序列的序列长度的表格。图8包含两个图表，显示在不含DNA元件或含DNA元件A2或相关序列的稳定表达的CHO细胞系中的SEAP表达。证实了 DNA元件A2和相关序列提高表达的作用。图9是显示DNA元件A7和相关序列的序列长度的表格。图10包含三个图表,显不在不含DNA兀件或含DNA兀件A7或相关序列的稳定表达的CHO细胞系中的SEAP表达。证实了 DNA元件A7和相关序列提高表达的作用。图11为显示DNA元件A18和相关序列的序列长度的表格。图12是显示在不含DNA元件或含DNA元件A18或相关序列的稳定表达的CHO细胞系中SEAP表达的图表。证实了 DNA元件A18和相关序列提高表达的作用。图13是显不DNA兀件B5和相关序列的序列长度的表格。图14是显示在不含DNA元件或含DNA元件B5或相关序列的稳定表达的CHO细胞系中SEAP表达的图表。证实了 DNA元件B5和相关序列提高表达的作用。图15是显示DNA元件C14和相关序列的序列长度的表格。图16包含三个图表，显示在不含DNA元件或含DNA元件C14或相关序列的稳定表达的CHO细胞系中的SEAP表达。证实了 DNA元件C14和相关序列提高表达的作用。图17是显示在不含DNA元件或含DNA元件A2、A7、A18、B5或C14的稳定表达的HEK293细胞系中SEAP表达的图表。证实了 DNA元件A2、A7、A18、B5和C14在HEK293细胞中提高表达的作用。图18是显示基于DNA元件A2、A7或A18全长序列的起点和终点的核苷酸的视图。图19是显示基于DNA元件B5或C14全长序列的起点和终点的核苷酸的视图。实施方案说明本发明在下文中将参考实施例进行具体描述。然而，这些实施例不限制本发明的技术范围。将在发明实施例中使用的质粒、限制酶、DNA修饰酶等为市售产品，并可按照通用程序使用。另外，本领域技术人员亦熟知或可从文献中获得用于以下方面的程序:DNA克隆、多核苷酸序列测定、宿主细胞的转化、经转化宿主细胞的培养、从获得的培养液中分离抗体、抗体的纯化等等。本文所用术语“基因”不仅包括DNA，也包括其mRNA、cDNA及其RNA。本文所用术语“多核苷酸”亦以与核酸相同的意思使用，并亦包括DNA、RNA、探针、寡核苷酸和引物。本文所用术语“多肽”和“蛋白”无差别地使用。本文所用术语“基因表达”指从基因转录mRNA的现象和/或从mRNA翻译蛋白质的现象。本文所用术语“外源基因”指人工引入宿主细胞的基因。本文所用术语“外源蛋白”指由外源基因编码的蛋白。本文所用术语“基因表达单元”指在转录阅读框方向具有至少启动子区域、外源基因和转录终止子区域(多聚(A)添加信号)的多核苷酸。本文所用术语“提高外源基 因表达的活性”，指通过创造对含有外源基因的基因表达单兀周围的DNA的转录和翻译有利的环境，并显者提闻转录和翻译效率，来提闻宿主细胞中外源蛋白的产量。本文所用术语“DNA元件”指具有提高外源基因表达活性的多核苷酸，其中所述多核苷酸位于基因表达单元附近或在含有基因表达单元的外源基因表达载体中。本文所用术语“抗体功能片段”，指具有抗原结合活性的部分抗体片段，其包括Fab、F(ab’)2等。然而，所述术语不限于这些分子，只要片段对抗原具有结合亲和力即可。1.用于提闻外源基因表达的DNA兀件
如实施例1所示，可通过利用乙酰化组蛋白H3和基因组DNA的相互作用来获得本发明的DNA元件。一般而言，认为组蛋白(H3和H4)的乙酰化与转录激活相关，并且一直在提倡两种主要理论。一种理论是组蛋白乙酰化与核小体构象改变有关，以此方式使得组蛋白尾部乙酰化,从而成为电中和的，导致DNA组蛋白相互作用减弱(Mellor J.(2006) Dynamicnucleosomes and gene transcription (动态核小体和基因转录).Trends Genet.22(6): 320-329)。另一个理论是组蛋白乙酰化与各种转录因子的募集相关(Nakatani Y.(2001) Histone acetylases - versatile players (组蛋白乙酸基转移酶-多面手).Genes Cells.6(2): 79_86)。在任何一个理论中,有高可能性的是,组蛋白乙酰化与转录激活相关，并且通过用抗乙酰化组蛋白H3抗体实施染色质免疫沉淀(ChIP)，可能浓缩与乙酰化组蛋白H3相互作用的DNA元件。在本发明中，A2是用于提高外源基因表达的DNA元件的实例。A2位于人15号染色体的80966429-80974878区域，为具有62.2% AT含量的8450 bp的多核苷酸序列。A2的多核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO:1代表。A7、A18、B5和C14是相似的DNA元件的实例。A7位于人11号染色体的88992123-89000542区域，为具有64.52% AT含量的8420 bp的多核苷酸序列。A7的多核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 2代表。
A18位于人4号染色体的111275976-111284450区域，为具有62.54% AT含量的8475 bp的多核苷酸序列。A18的多核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 3代表。B5位于人I号染色体的143034684-143043084区域，为具有66.37% AT含量的8401 bp的多核苷酸序列。B5的多核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 4代表。最后，C14位于人11号染色体的46089056-46097482区域，为具有63.81% AT含量的8427 bp的多核苷酸序列。C14的多核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 5代表。在本发明中，可通过使用由报告基因例如SEAP编码的蛋白活性作为指标来测定DNA元件提高外源基因表达的活性。与不存在DNA元件的情况相比，在存在DNA元件的情况中，当报告蛋白活性增加时(优选2倍或更高，更优选4倍或更高，再优选5倍或更高)，可确定DNA元件具有提高外源基因表达的活性。甚至在活性增加2倍或更多的情况中，也预期这将会降低细胞培养规模和细胞培养时间，因此可能增加产量和降低细胞培养成本。如果产量增加，那么可能稳定提供外源蛋白用作药物。此外，如果细胞培养成本降低，则外源蛋白用作药物的成本降低，并且待给予外源蛋白的患者的财务负担也会降低。在本发明中，以上任何一种DNA元件可以单独使用，也可使用一种类型的DNA元件的2个或多个拷贝。或者，也可以联合使用2种或多种不同类型的上述DNA元件。A2、A7、A18、B5和C14为本发明使用的DNA元件的优选实例。将用于本发明的D·NA元件可以是这样的多核苷酸序列，其包含与由SEQ ID NO:1-5代表的任何一个多核苷酸序列具有80%或更高同源性的多核苷酸序列，并具有提高外源基因表达的活性。80%或更高的同源性优选为90%或更高的同源性，更优选95%或更高的同源性，最优选99%或更高的同源性。可以用例如FASTA或BLAST程序在例如日本DNA数据库等中检索多核苷酸序列的同源性。将用于本发明的DNA元件可以是这样的DNA元件，其在严格条件下与这样的由多核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，并具有提高外源基因表达的活性:所述多核苷酸与由选自SEQ ID NO: 1-5代表的多核苷酸序列的多核苷酸序列组成的多核苷酸互补。本文所用术语“严格条件”指其中形成所谓的特异杂交物(hybrid)但不形成非特异杂交物的条件。例如，例示性严格条件为这样的条件，在此条件下由具有高同源性的多核苷酸序列组成的核酸互补链杂交，包含具有较低同源性的多核苷酸序列的核酸的互补链不杂交，所述具有高同源性的多核苷酸序列即与选自SEQ ID NO: 1-5代表的多核苷酸序列的多核苷酸序列具有80%或更高、优选90%或更高、更优选95%或更高、最优选99%或更高同源性的多核苷酸序列。更具体的是，可例示的条件为这样的条件，在此条件下，钠盐浓度为15-750禮、优选50-750禮、更优选300-750禮，温度为25_70°C、优选50_70°C、更优选55-65°C,甲酰胺浓度为0-50%、优选20-50%、更优选35-45%。另外，作为严格条件，可例示在杂交后洗涤滤纸的条件，其中钠盐浓度通常为15-600 mM、优选50-600 mM、更优选300-600禮，温度为50-70°C、优选55-70°C、更优选60-65°C。本领域技术人员可以参考分子克隆(Molecular Cloning) (Sambrook, J.等，Molecular Cloning: a Laboratory Manual 第二版,Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 10 Skyline Drive Plainview, NY (1989))等容易地获得这样的同源基因。另外,可以通过FASTA搜索或BLAST搜索以相同方式确定上述多核苷酸序列的同源性。可通过本技术领域已知方法引入突变(缺失、取代和/或添加)到上述多核苷酸序列，所述方法例如Kunkel法或缺口双链法或基于该方法。例如，可以使用利用定点诱变法的突变导入试剂盒(例如，Mutant-K (由TaKaRa Bio, Inc.制造)、Mutant_G (由TaKaRaBio, Inc.制造)或体外LA PCR诱变系列试剂盒(由TaKaRa Bio, Inc.制造))等。这样的突变多核苷酸也可作为本发明的DNA元件使用。可以使用包含由序列表中SEQ ID NO: 1_5任一个所代表的多核苷酸序列的至少3000或至少2000个连续核苷酸的部分片段作为本发明DNA元件。所述部分片段的实例包括:A2的部分片段A2-1到A2-17，A7的部分片段A7-1到A7-18，A18的部分片段A18-1到A18-4，B5的部分片段B5-1到B5-6，以及C14的部分片段C14-1到C14-14。然而，DNA元件不限于这些部分片段，只要其具有提高外源基因表达的活性即可。在本发明中，可以单独使用上述任何一个部分片段，也可以使用一种类型部分片段的2个或多个拷贝。或者，可联合使用2种或多种不同类型的部分片段。另外，可以联合使用上述任何DNA元件的全长序列和部分片段。在以上联合中，全长序列和部分片段可以源自相同DNA元件或源自不同DNA元件。关于A2的各个片段的多核苷酸序列:A2-1对应于序列表中SEQ ID NO:1的1-3000位核苷酸的多核苷酸序列；A2-2对应于序列表中SEQ ID NO:1的2801-5800位核苷酸的多核苷酸序列；A2-3对应于序列表中SEQ ID NO:1的5401-8450位核苷酸的多核苷酸序列；A2-4对应于序列表中SEQ ID NO:1的701-2700位核苷酸的多核苷酸序列；A2_5对应于序列表中SEQ ID NO:1的701-2200位核苷酸的多核苷酸序列；A2_6对应于序列表中SEQ ID NO:1的701-3700位核苷酸的多核苷酸序列；A2-7对应于序列表中SEQ ID NO:1的2001-5000位核苷酸的多核苷酸序列；A2-8对应于序列表中SEQ ID NO:1的4001-7000位核苷酸的多核苷酸序列；A2-9对应于序列表中SEQ ID NO:1的1-3700位核苷酸的多核苷酸序列；A2-10对应于序列表中SEQ ID NO:1的2001-5800位核苷酸的多核苷酸序列；A2-11对应于序列表中SEQ ID NO:1的2801-7000位核苷酸的多核苷酸序列；A2_12对应于序列表中SEQ ID NO:1的701-5800位核苷酸位核苷酸的多核苷酸序列；A2-13对应于序列表中SEQ ID NO:1的2001-7000位核苷酸的多核苷酸序列；A2_14对应于序列表中SEQID NO:1的2801-8450位核苷酸的多核苷酸序列；A2-15对应于序列表中SEQ ID NO:1的1-5800位核苷酸的多核苷酸序列；A2-16对应于序列表中SEQ ID NO:1的701-7000位核苷酸的多核苷酸序列；和A2-17对应于序列表中SEQ ID NO:1的2001-8450位核苷酸的多核苷酸序列。关于A7的各个片段的多核苷酸序列:A7-1对应于序列表中SEQ ID NO: 2的601-3600位核苷酸的多核苷酸序列；A7-2对应于序列表中SEQ ID NO: 2的3601-8420位核苷酸的多核苷酸序列；A7-3对应于序列表中SEQ ID NO: 2的5401-8420位核苷酸的多核苷酸序列；A7-4对应于序列表中 SEQ ID NO: 2的3401-6400位核苷酸的多核苷酸序列；A7-5对应于序列表中SEQ ID NO: 2的1501-4500位核苷酸的多核苷酸序列；A7-6对应于序列表中SEQ ID NO: 2的4401-7400位核苷酸的多核苷酸序列；A7-7对应于序列表中SEQID NO: 2的2401-5400位核苷酸的多核苷酸序列；A7_8对应于序列表中SEQ ID NO: 2的1-3600位核苷酸的多核苷酸序列；A7-9对应于序列表中SEQ ID NO: 2的1501-5400位核苷酸的多核苷酸序列；A7-10对应于序列表中SEQ ID NO: 2的2401-6400位核苷酸的多核苷酸序列；A7-11对应于序列表中SEQ ID NO: 2的3401-7400位核苷酸的多核苷酸序列；A7-12对应于序列表中SEQ ID NO: 2的4401-8420位核苷酸的多核苷酸序列；A7_13对应于序列表中SEQ ID NO: 2的1-5400位核苷酸的多核苷酸序列；A7-14对应于序列表中SEQID NO: 2的1501-6400位核苷酸的多核苷酸序列；A7-15对应于序列表中SEQ ID NO: 2的2401-7400位核苷酸的多核苷酸序列；A7-16对应于序列表中SEQ ID NO: 2的3401-8420位核苷酸的多核苷酸序列；A7-17对应于序列表中SEQ ID NO: 2的1-6400位核苷酸的多核苷酸序列，和A7-18对应于序列表中SEQ ID NO: 2的1501-7400位核苷酸的多核苷酸序列。关于A18的各个片段的多核苷酸序列:A18_1对应于序列表中SEQ ID NO: 3的1-5040位核苷酸的多核苷酸序列；A18-2对应于序列表中SEQ ID NO: 3的1001-6002位核苷酸的多核苷酸序列；A18-3对应于序列表中SEQ ID NO: 3的2001-7000位核苷酸的多核苷酸序列；A18-4对应于序列表中SEQ ID NO: 3的3000-7000位核苷酸的多核苷酸序列。A2、A7和A18的各个片段的起点和终点示于图18中。关于B5的各个片段的多核苷酸序列:B5-1对应于序列表中SEQ ID NO: 4的1-4001位核苷酸的多核苷酸序列；B5-2对应于序列表中SEQ ID NO: 4的1-3200位核苷酸的多核苷酸序列；B5-3对应于序列表中SEQ ID NO: 4的2491-5601位核苷酸的多核苷酸序列；B5-4对应于序列表中SEQ ID NO: 4的5373-8401位核苷酸的多核苷酸序列；B5-5对应于序列表中SEQ ID NO: 4的901-4001位核苷酸的多核苷酸序列；和B5-6对应于序列表中SEQ ID NO: 4的4001-7000位核苷酸的多核苷酸序列。关于C14的各个片段的多核苷酸序列:C14_1对应于序列表中SEQ ID NO: 5的960-4015位核苷酸的多核苷酸序列；C14-2对应于序列表中SEQ ID NO: 5的1987-5014位核苷酸的多核苷酸序列；C14-3对应于序列表中SEQ ID NO: 5的4020-7119位核苷酸的多核苷酸序列；C14-4对应于序列表中SEQ ID NO: 5的960-8141位核苷酸的多核苷酸序列；C14-5对应于序列表中SEQ ID NO: 5的960-6011位核苷酸的多核苷酸序列；C14-6对应于序列表中SEQ ID NO: 5的4939-8141位核苷酸的多核苷酸序列；C14-7对应于序列表中SEQID NO: 5的960-5014位核苷酸的多核苷酸序列；C14_8对应于序列表中SEQ ID NO: 5的2994-7119位核苷酸的多核苷酸序列；C14-9对应于序列表中SEQ ID NO: 5的4020-8141位核苷酸的多核苷酸序列；C14_10对应于序列表中SEQ ID NO: 5的1-5014位核苷酸的多核苷酸序列；C14-11对应于序列表中SEQ ID NO: 5的1987-7119位核苷酸的多核苷酸序列；C14-12对应于序列表中SEQ ID NO: 5的2994-8141位核苷酸的多核苷酸序列；C14-13对应于序列表中SEQ ID NO: 5的960-7119位核苷酸的多核苷酸序列；C14-14对应于序列表中SEQ ID NO: 5的1987-8141位核苷酸的多核苷酸序列。B5和C14各个片段的起点和终点亦示于图19中。2.多核苷酸的获取
在本发明中，可通过如下所述通用程序获得含有外源基因的多核苷酸，所述外源基因编码其产量将会增加的外源蛋白，这一点在后面阐述。例如，可使用基于外源基因片段合成的DNA探针，通过筛选源自表达外源基因的细胞或组织的cDNA文库，来分离所述多核苷酸。mRNA可以通过本技术领域常用 的方法来制备。例如，用胍试剂、酚试剂等处理细胞或组织，从而获得总RNA,此后通过使用寡聚(dT)纤维素柱或含有Sepharose 2B作为载体的聚U-Sepharose柱等等的亲和柱法,或通过分批处理法,获得多聚(A)+RNA (mRNA)。同样，多聚(A)+RNA可以通过蔗糖密度梯度离心法等进一步分级分离。然后，用由此获得的mRNA作为模板，同时亦使用寡聚dT引物和逆转录酶，合成单链cDNA。从由此获得的单链cDNA，用DNA聚合酶1、DNA连接酶、RNA酶H等合成双链cDNA。用T4DNA聚合酶使由此合成的双链cDNA具有平端，接着与衔接子(例如EcoI衔接子)连接，进行磷酸化等，将所得DNA掺入到诸如Agtll等λ噬菌体中以实现体内包装，藉此可制备cDNA文库。也可使用λ噬菌体以外的质粒载体来制备cDNA文库。此后，可自cDNA文库选择含有靶DNA的克隆(阳性克隆)。在待用于增加蛋白产量或增加含有外源基因的多核苷酸产量的上述DNA元件分离自基因组DNA情况下，或在含有启动子和终止子区域的多核苷酸分离自基因组DNA的情况下，参照通用程序(Molecular Cloning (1989), Methods in Enzymology 194 (1991)自待用作收集源的生物细胞系提取基因组DNA，选择并分离多核苷酸。可以参照例如Cryer等的方法(Methods in Cell Biology, 12, 39-44 (1975))或 P.Philippsen 等的方法(Methods Enzymo1., 194，169-182 (1991))进行基因组 DNA 的提取。也可以通过例如PCR 法(PCR Technology.Henry A.Erlich, Atockton press(1989))获得靶DNA元件或含有外源基因的多核苷酸。在用PCR法扩增多核苷酸时，使用20-到30-聚体的合成的单链DNA作为引物，并用基因组DNA作为模板。在确认基因的多核苷酸序列后使用扩增的基因。可以使用基因组DNA文库例如细菌人工染色体(BAC)作为PCR模板。
在另一方面，可以通过以下方法获得含有其序列未知的外源基因的多核苷酸:(a)按照通用程序制备基因文库；和(b)从制备好的基因文库中选择所期需多核苷酸并扩增所述多核苷酸。基因文库可如下制备:通过用合适的限制酶将染色体DNA部分消化，以使染色体DNA片段化，让所获得的片段与合适的载体连接，并将载体引入到合适的宿主，所述染色体DNA通过通用程序自用作采集源的生物细胞系获得。基因文库亦可如下制备:从细胞提取mRNA,从mRNA合成cDNA,让cDNA与合适的载体连接,将载体引入到合适的宿主。亦可使用用于基因文库制备的通常称作载体的质粒、噬菌体载体、粘粒等，作为在所述制备中使用的载体。可使用适于上述载体类型的宿主，作为待转化或转染的宿主。用含有对外源基因特异的序列的标记探针，通过菌落杂交法、噬菌斑杂交法等，从上述基因文库选择含有外源基因的多核苷酸。另外，也可以通过完全化学合成生产含有外源基因的多核苷酸。例如，可通过以下方法来合成基因:制备两对互补寡聚核苷酸并退火的方法；由DNA连接酶连接几种退火的DNA链的方法；制备几种部分配对的多核苷酸并且由PCR填充空隙的方法；等等。可通过常规技术例如双脱氧法(Sanger等，Proc.Natl.Acad.Sc1., USA, 74,5463-5467，(1977))等进行多核苷酸序列的测定。另外，也可以用市购序列测定试剂盒等容易地进行上述多核苷酸序列的测定。3.外源基因表达载体，元件载体
提供以下载体作为本发明的外源基因表达载体:含有一种类型的上述DNA元件，一种类型的上述DNA元件的两个或多个拷贝，或两个或多个不同类型的上述DNA元件的组合，并进一步含有外源基因表达单元的载体。当用上述外源基因表达载体在宿主细胞中表达外源基因时，DNA元件可紧邻基因表达单元的上游或下游，或可位于远离基因表达单元的位置。另外，可以使用一种含有多个所述DNA元件的外源基因表达载体。附带说一下，DNA元件可以以相对于基因表达单元的正向或反向插入。另外，亦包括以下载体作为待用于本发明的载体:含有一种类型的上述DNA元件，一种类型的上述DNA元件的两个或多个拷贝，或两种或多种不同类型的上述DNA元件组合，并且不含有基因表达单元(下文中也称作“元件载体”)的载体。所述元件载体可以与上述含有DNA元件的外源基因表达载体或不含DNA元件而仅包含外源基因表达单元的外源基因表达载体组合使用。与单独使用外源基因表达载体的情形相比，通过让元件载体与外源基因表达载体共存，外源基因的表达增强，因此，上述载体组合也包括在本发明的外源基因表达载体中。编码外源蛋白的基因不受特别限制，然而，其实例包括:报告基因，例如分泌性碱性磷酸酶(SEAP)、绿色荧光蛋白(GFP)和荧光素酶；各种酶基因，例如α-淀粉酶基因和α-半乳糖苷酶基因；各种干扰素基因，其为药学上有用并有生理活性的蛋白，例如α干扰素和Y干扰素基因；各种白细胞介素例如IL-1和IL-2基因；各种细胞因子基因，例如红细胞生成素(EPO)基因和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)基因；生长因子基因；和抗体基因。可以通过任何方法获得这些基因。
本发明在有关高度疏水蛋白和由于复合构成而难于分泌和生产的蛋白上特别有效。因此，上述外源蛋白包括多聚体蛋白，例如作为抗体或其功能片段的异多聚体。“抗体功能片段”指具有抗原结合活性的抗体的部分片段，包括Fab、F(ab’)2、Fv, scFv、双抗体、线性抗体、自抗体片段形成的多特异性抗体等。抗体的功能片段还包括Fab’，其为通过在还原条件下处理F(ab’)2获得的抗体可变区中的单价片段。然而，这些功能片段不限于这些分子，只要所述片段对抗原具有结合亲和力即可。另外，这些功能片段不仅包括通过用合适的酶处理抗体蛋白全长分子获得的片段，还包括在合适的宿主细胞中使用遗传修饰的抗体基因生广的蛋白。基因表达单元在转录阅读框方向具有至少启动子区域、外源基因和转录终止子区域(多聚(A)添加信号)。本文可使用的启动子可以是组成型表达启动子或诱导型表达启动子。组成型表达启动子的实例包括各种天然启动子，例如SV40早期启动子、腺病毒ElA启动子、CMV (巨细胞病毒)启动子、EF-1 α (人延伸因子-1 α )启动子、HSP70启动子、MT启动子、RSV启动子、UBC启动子和肌动蛋白启动子；和人工(融合)启动子，例如SRa启动子和CAG启动子。另外，多聚(A)添加序列可以是具有引起从启动子转录的转录终止的活性的序列，可以是与启动子相同或不同的基因的序列。需要使用强启动子来提高外源蛋白的生产。然而，当试图使用高活性启动子生产难以折叠的蛋白或难以分泌的蛋白时，所述蛋白反而可能不能分泌。这是因为当以超过进行翻译的核糖体和进行折叠和分泌的内质网容量的量生产时，过量生产的蛋白在细胞内变性、积累和泛素化，然后由蛋白体降解。因此，优选适当地选择这样的启动子，其可以达到这样程度的表达水平:得到的蛋白不变性或聚集，或得到的蛋白量不超过分泌容量。或者，通过调节(例如降低)启动子活性来使用启动子。在多聚体蛋白中，形成异多聚体的分子易受上述效应的影响，特别是诸如为异四聚体的抗体等分子。抗体具有相互缔合的两条重链分子和两条轻链分子，因此，为了恰当地缔合所述分子，其表达水平是重要因素。另外，本发明的外源基因表达载体和元件载体可以各自含有选择标记用于选择转化体。通过使用例如赋予对药物抗性的抗药标记，可以选择转化体，所述药物例如浅蓝菌素(cerulenin)、金担子素(aureobasidin)、Zeocin、刀豆氨酸(canavanine)、放线菌酮(cycloheximide)、潮霉素(hygromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、杀稻痕素(blasticidin)、四环素(tetracycline)、卡那霉素(kanamycin)、氨节西林(ampicillin)或新霉素(neomycin)。另外，当使用以下基因作为标记时,亦可选择转化子:赋予对例如乙醇等溶剂抗性、对甘油、盐等的渗透压抗性、对诸如铜离子等金属离子抗性的基因等等。本发明的外源基因表达载体和元件载体各自可以是不掺入到染色体DNA的载体。一般而言，将外源基因表达载体转染到宿主细胞，此后随机掺入到染色体中。然而，通过使用源于哺乳动物病毒例如猿猴病毒40 (SV40)、乳头瘤病毒(BPV、HPV)或EBV的组成型成分，载体可作为在转染宿主细胞中自主复制的游离型载体使用。例如，可以使用含有SV-40来源的复制起点(oriP)及编码为反式作用因子的SV40大T抗原的序列的载体、含有EBV来源的oriP和编码EBNA-1的序列的载体等等。可以通过提高外源基因表达的活性来表示DNA元件的作用，而与载体类型或其到染色体中的掺入存在或不存在情况无关。4.转化细胞
本发明的转化细胞是已经引入含有上文条目“I”所述的DNA元件的上文条目“3”所述的外源基因表达载体的转化细胞。作为外源基因表达载体，可以引入仅含有DNA元件的外源基因表达载体(A)，或可以联合引入含有DNA元件的外源基因表达载体以及在上文条目“3”所述的元件载体(B)。或者，可以联合引入不含有DNA元件的外源基因表达载体和元件载体(C)。可以按照例如以下方法来实施在使用以上⑶或(C)组合的宿主细胞中的外源基因的表达:Girod 等的方法(Biotechnology and Bioengineering, 91, 2-11 (2005))和Otte 等的方法(Biotechnol.Prog., 2007，23，801-807 (2007))。
待转化的宿主细胞的实例包括真核细胞，其优选实例包括哺乳动物细胞，更优选的实例包含源自人、小鼠、大鼠、仓鼠、猴或牛的细胞。所述哺乳动物细胞实例包括cos-ι细胞、293细胞和CHO细胞(CH0-K1、DG44、CH0 dhfr-、CH0-S)，然而，宿主细胞不限于这些。在本发明中，可以使用任何方法来将表达载体引入到宿主细胞中，只要所述方法允许引入的基因稳定存在于宿主细胞并且在其中适当地表达。通常使用的方法实例包括磷酸隹丐法(Ito 等，c (1984) Agric.Biol.Chem., 48, 341)、电穿孔法(Becker, D.Μ.等，1990; Methods.Enzymo1., 194, 182-187)、原生质球法(Creggh 等，Mol.Cell.Biol.,5，3376 (1985))、乙酸锂法(Itoh, H.(1983) J.Bacteriol.153，163-168)和脂转染法。5.生产外源蛋白的方法
在本发明中，可通过以下方法来生产外源蛋白:培养上文条目“4”所述的转化细胞，其中已经通过已知方法使用上文条目“3”所述的载体引入编码外源蛋白的基因；从所得培养产物中收集蛋白质，接着纯化蛋白。本文所用术语“培养产物”指除培养物上清液外还有培养细胞或细胞匀浆。附带说一下，不仅可以选择单体蛋白，还可以选择多聚体蛋白作为可以使用上文条目“4”所述的转化细胞生产的外源蛋白。在其中生产由多个不同亚基形成的异多聚体蛋白的情况中，必需分别将多个编码这些亚基的基因引入到上文条目“4”所述的宿主细胞中。
可以按照培养宿主细胞的常规方法来实施培养转化细胞的方法。在其中转化细胞为哺乳动物细胞的情况中，细胞在例如37°C和5%或8% CO2培养时间约24-1000小时的条件下培养。可以通过分批培养、补料分批培养、连续培养等在静置、振摇、搅拌或通气条件下进行培养。可以通过SDS-PSGE、Western分析、ELISA等从上述培养产物(培养液)中进行编码外源蛋白的基因表达产物的确认。为了分离和纯化生产的蛋白，可以使用常规蛋白分离和纯化方法。在完成培养后，在细胞中生产靶蛋白的情况下，使用超声匀浆器、弗氏压碎器、Manton-Gaulin勻衆器、Dinomil等使细胞勻衆化，由此获得祀蛋白。另外，在细胞外生产靶蛋白的情况下，使用培养液本身，或通过离心等方法去掉细胞。此后，用有机溶剂萃取等收集靶蛋白，然后可以通过使用以下技术来分离和纯化收集的靶蛋白:例如各种色谱技术(疏水色谱法、反相色谱法、亲和色谱法、离子交换色谱法等)、使用分子筛的凝胶过滤和使用聚丙烯酰胺凝胶电泳等等，它们可按照需要单独或组合使用。上述培养方法和纯化方法仅仅是实例，所述方法不限于此。可以通过已知的氨基酸分析技术例如使用Edman降解法的自动氨基酸序列测定,来确认纯化的基因产物的氨基酸序列。6.生产抗体蛋白的方法
作为将使用上文条目“5”所述的生产方法生产的异多聚体蛋白，可例示抗体蛋白。抗体蛋白是包含两个重链多肽分子和两个轻链多肽分子的四聚体蛋白。因此，为了获得保持抗原结合亲和力状态下的所述抗体蛋白，必需将重链和轻链基因两者引入到上文条目“4”所述的转化细胞。在这种情况下，重链和轻链基因表达单元可以存在于同一个表达载体或不同表达载体上。作为将在发明中生产的抗体，可例示通过用所期需抗原免疫诸如兔、小鼠或大鼠等实验动物而制备的抗体。另外，亦可例示通过使用上述抗体作为起始材料获得的嵌合抗体和人源化抗体作为本发明中将生产的抗体。另外，使用遗传修饰动物或噬菌体展示方法获得的人抗体也包括在本发明将生产的抗体中。将用于抗体生产的抗体基因不限于具有特异性多核苷酸序列的抗体基因，只要待从抗体基因转录和翻译的重链多肽和轻链多肽的组合具有结合给定抗原蛋白的活性即可。另外，不必要的是，抗体基因编码抗体全长分子，而可以使用编码抗体功能片段的基因。所述编码其功能片段的基因可以通过遗传修饰编码抗体蛋白全长分子的基因获得。7.其它外源蛋白的生产方法
除上述抗体外，将使用本发明生产方法生产的外源蛋白的实例还包括:各种源于人或非人的蛋白、其功能片段及其修饰产物。所述蛋白等等的实例包括肽激素，例如心房钠尿肽(ANP)、脑钠素(BNP)、C型利钠肽(CNP)、加压素、生长抑素、生长激素(GH)、胰岛素、催产素、生长素释放肽、瘦蛋白、脂连蛋白、肾素、降钙素、骨保护素和胰岛素样生长因子(IGF)；细胞因子类，例如白介素、趋化因子、干扰素、肿瘤坏死因子(例如TNF-α ,TNF-β和TNF超家族)、神经生长因子类(例如NGF)、细胞生长因子类(例如EGF、FGF、PDGF, HGF和TGF)、造血生长因子类(例如CSF、G-CSF和红细胞生成素)和脂肪因子(adipokine);受体，例如TNF受体；酶，例如溶菌酶、蛋白酶、蛋白水解酶和肽酶；其功能片段(具有原始蛋白部分或全部生物学功能的片段)；和包含这些蛋白中任何一种的融合蛋白。然而，所述蛋白不限于此。
实施例本发明在下文中将参考实施例进行具体描述。然而，这些实施例不限制本发明的技术范围。本发明实施例中待使用的质粒、限制性内切酶、DNA修饰酶等等为市购产品，并且可以按照通用程序使用。另外，用于DNA克隆、多核苷酸序列测定、宿主细胞转化、经转化宿主细胞的培养、从得到的培养产物中收集蛋白质、蛋白质纯化等等的程序亦为本领域技术人员所熟知，或可参见文献。实施例1 提取DNA元件
(1-1)使用抗-乙酰化组蛋白H3抗体的染色质免疫沉淀
用EZ ChIP (Upstate)按照以下程序实施使用抗-乙酰化组蛋白抗体的ChIP。顺便说一下，除非另外指出，否则使用Upstate产品作为在以下程序中使用的抗体、缓冲液等等。首先，使用GIBCO (注册商标)FreeStyleTM 293 培养基(Invitrogen)在 37°C和8% CO2条件下培养293F细胞(Invitrogen)，接着离心(1000 rpm, 5分钟，室温)，藉此收集生长期细胞。在含有1%甲醛的培养基中固定2 X IO7细胞10分钟后，将IOx甘氨酸加入其中，接着室温孵育5分钟。·离心(3000 rpm, 5分钟，4°C)后，移除上清，加入PBS至细胞沉淀中以悬浮细胞。然后，再次离心细胞悬液以移除PBS，此后将SDS裂解缓冲液加入至细胞沉淀中以悬浮和裂解细胞。在超声匀浆器(BRANSON)中对每个通过细胞裂解获得的样品进行DNA片段化，同时用冰水冷却样品，向其中加入含有蛋白酶抑制剂混合物和蛋白G-固定的琼脂糖的稀释缓冲液。在4°C让得到的混合物旋转I小时，接着离心，然后收集上清液。随后，向其中加入10 μ g标准兔IgG或α -乙酰组蛋白Η3抗体，接着4°C旋转过夜。向得到的溶液中加入G蛋白-固定的琼脂糖，并且在4°C旋转所得混合物I小时，接着离心，然后收集沉淀。用低盐免疫复合洗漆缓冲液(Low Salt Immune Complex Wash Buffer)对由此获得的沉淀洗涤两次，用高盐免疫复合洗涤缓冲液洗涤两次，用LiCl免疫复合洗涤缓冲液洗涤两次，最后用TE缓冲液洗涤4次。然后向其中加入洗脱缓冲液(含有20 μ I I M碳酸氢钠、10 μ I SDS和170 μ I无菌水)。30分钟后，离心混合物，收集上清液。随后，将5 M氯化钠加入上清液中，在65°C将所得混合物加热过夜。然后向其中加入RNA酶A，37°C孵育所得混合物30分钟。然后向其中加入0.5 M EDTAU M Tris-HCl和蛋白酶K，在45°C让所得混合物孵育2小时。最后，向其中加入通过用蛋白酶K处理获得的溶液的5倍量的试剂A、B和C，接着用旋转过滤器(Spin filter)离心(10000 rpm, 30秒,室温)，藉此纯化染色质-免疫沉淀的 DNA。(1-2)微阵列分析
通过使用GenomePlex全基因组扩增(WGA)试剂盒(Sigma),扩增在(1_1)中获得的每个ChIP样品。程序按照试剂盒附带的Sigma方案进行。为了证实ChIP，通过使用320 ng由WGA扩增的每一种DNA作为模板，亦使用以下引物和 SYBR (注册商标)预混 Ex Taq (Perfect Real Time) (TAKARA)，通过 PCR 方法扩增甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)内部基因(95°C 5秒和60°C 20秒x 45个循环)。附带说一下，GAPDH是待用作确定通过ChIP是否富集DNA元件的阳性对照的管家基因，并且用连接到EZ ChIP (Upstate)的引物来实施PCR方法。
5#-TACTAGCGGTTTTACGGGCG-3’
S#-TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3,如图1所示，确定了 GAPDH在用抗-乙酰化组蛋白H3抗体进行免疫沉淀的样品中特异性扩增。对每个通过WGA扩增的DNA样品进行微列阵分析(NimbleGen)以实施染色质免疫沉淀芯片(ChlP-on-chip) </‘ΟιΙΡ-0η-(Λ ρ”是用于通过对在(1_丨)中富集的每个DNA进行微阵列分析来鉴别每个DNA元件的技术。(1-3)提取 DNA 元件
基于在(1-2)中获得的ChlP-on-chip分析的结果，提取5个具有62%或更多AT含量的序列。A2:染色体 I5 (80966429-80974878)
A7:染色体 11 (88992123-89000542)
A18:染色体 4 (111275976-111284450)
B5:染色体 I (143034684-143043084)
C14:染色体 11 (46089056-46097482)
实施例2
用分泌性碱性磷酸酶(SEAP)表达作为DNA元件表达效果的指标 (2-1)构建SEAP表达载体
通过使用PSEAP2-对照(Clontech)作为模板，由PCR方法(94°C 30秒和68°C 2分钟X 40个循环)使用以下引物和KOD-plus- (Τ0Υ0Β0)来扩增SEAP基因。
5r^AAAGCTAGCATGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGGGCC-3r
5r-AAAAGATCTTCATGTCTGCTCGAAGC GGCCGGCCGC-3,随后通过琼脂糖凝胶电泳分离扩增的SEAP片段并从凝胶切割，接着用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化。将由此获得的DNA片段用作插入片段。用限制性内切酶NheI和BglII消化该插入片段，并且用限制性内切酶NheI和BamHI消化载体pIRES hyg3(Clontech)。分别对得到的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳来分离靶片段，并且从凝胶切割靶片段，接着纯化。然后，进行连接反应和转化。用LigaFast快速DNA连接体系(Promega)实施连接反应。转化如下进行。首先，解冻冷冻的感受态细胞JM109 (TAKARA)，并且将连接反应后获得的10 μ I溶液加入至解冻的细胞溶液，让得到的混合物置于冰上30分钟。此后，向混合物施用热激(42°C，45秒)，让混合物在冰上冷却5分钟。向该细胞悬液中加入Iml LB培养基，让得到的混合物在37°C振摇I小时。然后，将混合物铺板在含有0.1 mg/ml氨苄青霉素的LB平板上，让该平板在37°C孵育14-16小时。此后，通过碱裂解，从LB平板培养的菌落收集靶质粒。最后，测定通过碱裂解获得的质粒中的SEAP的多核苷酸序列，藉此构建 pCMV/SEAP ires Hygro (2-2)克隆 DNA 元件
随后，用来自含有对应于各DNA元件的多核苷酸序列的细菌人造染色体(BAC)的BAC亚克隆试剂盒(Gene Bridges)，将在实施例1中提取的各DNA元件克隆至(2_1)中获得的SEAP表达载体。首先，用限制性内切酶SpeI消化(2-1)中获得的pCMV/SEAP ires Hygro数小时，接着乙醇沉淀，用无菌水溶解沉淀。通过使用经SpeI消化的载体作为模板，使用以下引物和 KOD-plus- (TOYOBO)实施 PCR 方法(94°C 15 秒、55°C 30 秒和 68°C 10 分钟 x 30 个循环)。
权利要求
1.由序列表中的SEQID NO:1代表的多核苷酸序列组成的多核苷酸。
2.由序列表中的SEQID NO: 2代表的多核苷酸序列组成的多核苷酸。
3.由序列表中的SEQID N0:3代表的多核苷酸序列组成的多核苷酸。
4.由序列表中的SEQID NO: 4代表的多核苷酸序列组成的多核苷酸。
5.由序列表中的SEQID NO: 5代表的多核苷酸序列组成的多核苷酸。
6.包含由序列表中的SEQID NO: 1-5中任一个所代表的多核苷酸序列的至少3000个连续核苷酸的多核苷酸。
7.包含由序列表中的SEQID NO: 1-5中任一个所代表的多核苷酸序列的至少2000个连续核苷酸的多核苷酸。
8.包含由序列表中的SEQID NO: 1-5中任一个所代表的多核苷酸序列的至少1500个连续核苷酸的多核苷酸。
9.由与权利要求1-8中任一项的多核苷酸的多核苷酸序列具有95%或更高同源性的多核苷酸序列组成的多核苷酸。
10.由与权利要求1-8中任一项的多核苷酸的多核苷酸序列具有99%或更高同源性的多核苷酸序列组成的多核苷酸。
11.由多核苷酸序列组成的多核苷酸，所述多核苷酸序列含有权利要求1-10中任一项的多核苷酸的多核苷酸序 列的两种或多种序列。
12.由两种或多种类型的选自权利要求1-10中任一项的多核苷酸的多核苷酸组成的多核苷酸。
13.包含权利要求1-12中任一项的多核苷酸的多核苷酸序列的外源基因表达载体。
14.权利要求13的外源基因表达载体，其中由所述外源基因编码的蛋白是多聚体蛋白。
15.权利要求13的外源基因表达载体，其中由所述外源基因编码的蛋白是异多聚体蛋白。
16.权利要求15的外源基因表达载体，其中由所述外源基因编码的蛋白是抗体或其功能片段。
17.转化细胞，其中已引入权利要求13-16中任一项的外源基因表达载体。
18.权利要求17的转化细胞，其中所述细胞为源自哺乳动物的培养细胞。
19.权利要求18的转化细胞，其中所述源自哺乳动物的培养细胞为选自COS-1细胞、293细胞和CHO细胞的细胞。
20.权利要求17-19中任一项的转化细胞，其中由所述外源基因编码的蛋白是多聚体蛋白。
21.权利要求20的转化细胞，其中由所述外源基因编码的蛋白是异多聚体蛋白。
22.权利要求21的转化细胞，其中由所述外源基因编码的蛋白是抗体或其功能片段。
23.用于生产蛋白的方法，所述方法特征在于包括培养权利要求17-22中任一项的转化细胞，并从得到的培养产物中获得由所述外源基因编码的蛋白。
24.用于在已引入外源基因或外源基因表达载体的转化细胞中提高外源基因表达的方法，所述方法特征在于使用权利要求1-12中任一项的多核苷酸或权利要求13-16中任一项的外源基因表达载体。
25.权利要求1-12中任一项的多核苷酸用于在转化细胞中提高外源基因表达的用 途。
全文摘要
公开了使用新颖的DNA元件在哺乳动物细胞中稳定获得外源基因的高表达的方法。更特别地，公开了通过改变已引入外源基因表达单元的基因位点周围的染色质结构来增强转录激活的DNA元件。
文档编号C12N15/85GK103080321SQ201180043099
公开日2013年5月1日 申请日期2011年7月6日 优先权日2010年7月7日
发明者西宫大祐, 井上龙也 申请人:第一三共株式会社
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