棒状细菌转化体及使用该转化体的苯酚的制造方法
专利名称：棒状细菌转化体及使用该转化体的苯酚的制造方法
技术领域：
本发明涉及苯酚生产技木。更详细而言，本发明涉及为了赋予苯酚生产功能而实施了特定基因操作的棒状细菌的转化体及使用该转化体的高效的苯酚的制造方法。
背景技术：
在全球变暖和化石资源枯竭问题的背景下，已经认识到以可再生资源为原料的化学品制造与生物燃料制造并列地作为新产业生物炼制而成为实现低碳社会的重要策略，并聚焦了广泛的关注。但是，对于以可再生资源为原料的生物苯酚生产而言，与乳酸、こ醇的生产相比，从作为原料的糖类开始的代谢反应阶段非常多，因此生产率低，并且作为产物的苯酚会使细菌的增殖受到抑制或者存在由苯酚产生的细胞毒性等，基于上述理由，目前还不能进行エ业性的生产。作为苯酚的重要用途，可以列举酚醛树脂。酚醛树脂是由苯酚与醛类的加成缩合反应生成且在塑料中具有最古老历史的树脂，由于其优良的耐热性、耐久性等优点，目前仍被用于汽车用金属替代材料、半导体密封材料、电路基板等各种用途。另外，对于迄今为止的酚醛树脂而言，由于原料苯酚与醛类的反应性极高，所得到的高分子形成复杂的三维网状结构，因此，难以实现聚合物的精密结构设计和在纳米材料中的发展，从而认为难以应用于高附加价值的用途。但是近年来，随着高分子的物性理论和仿真技术的快速发展，只要使网状结构精密化则能够由酚醛树脂创制高功能性材料。在这样的背景下，日本的酚醛树脂生产量正在逐年増加。目前的苯酚的エ业生产法(异丙苯法)是以石油来源的苯和丙烯作为原料、需要大量的溶剂类和大量的热能的 、典型的化学エ业的高能耗型エ艺。因此，从保护地球环境和減少温室效应气体的观点出发，当务之急是开发ニ氧化碳排放少的节能型的、能够由可再生资源制造的、废弃物排放低的环境和谐型エ艺，即建立生物苯酚制造技木。迄今为止尚未报道过自然界中的苯酚生产菌。作为利用基因重组菌的苯酚生产技术，可以列举非专利文献I。非专利文献I的方法中，公开了下述技术:制作向耐溶剂性菌恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)S12株中导入成团泛菌(Pantoea agglomerans)来源的编码酪氨酸酹解酶的tpl基因而得到的菌株和向恶臭假单胞菌S12株中导入恶臭假单胞菌S12株来源的编码DAHP合成酶(3-deoxy-D-arabino_heptulosonate7-phosphate(DAHP) synthase,3_ 脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸(DAHP)合成酶)的aroF-1基因而得到的菌株来使用。另外，从向恶臭假单胞菌S12株中导入恶臭假单胞菌S12株来源的编码DAHP合成酶的aroF-1基因而得到的菌株中获取对苯丙氨酸和酪氨酸的类似物(代谢拮抗物质)即间氟-DL-苯丙氨酸(m-fluoro-DL-phenylalanine)具有抗性的菌株来使用。进而，从该菌株中获取对间氟-L-酪氨酸(m-fluoro-L-tyrosine)具有抗性的菌株来使用。然后，将这些菌株供于以葡萄糖为唯一碳源的需氧条件下的补料分批培养而生产苯酚。
但是，非专利文献I的方法中，苯酚的生产率在实用上不充分。现有技术文献非专利文献非专利文献I:Applied and Environmental Microbiolology, Vol.71, 2005, 8221-8227.
发明内容
发明所要解决的问题本发明的课题在于提供能够以糖类为原料高效地制造苯酚的微生物及使用该微生物、能够以糖类为原料高效地制造苯酚的方法。用于解决问题的手段为了解决上述问题，本发明人反复进行了研究，得到下述发现。(i)棒状细菌对苯酚具有高耐性。(ii)向棒状细菌中导入酪氨酸酚解酶基因而得到的转化体高效地生产苯酚。(iii)该转化体中，存在于宿主棒状细菌的染色体上的预苯酸脱水酶基因和/或苯酚2-单加氧酶基因被破坏或发生缺陷吋，能够更高效地生产苯酚。(iv)该转化体中，DAHP合成酶基因和/或分支酸变位酶基因以比转化前的宿主基因的表达水平高的水平进行表达时，能够更高效地生产苯酚。(V)该转化体在还原条件下的反应液中实质上不增殖的状态下进行反应时，苯酚生产效率比在需氧性的反应液中增殖并反应时高。本发明是基于上述发现而完成的，其提供下述转化体及苯酚的制造方法。第I项.ー种具有苯酚生产能力的转化体，其通过将编码具有酪氨酸酚解酶(tyrosine phenol-lyase)活性的酶的基因导入宿主棒状细菌而得到。第2项.如第I项所述的转化体，其中，编码具有酪氨酸酚解酶活性的酶的基因为成团泛菌(Pantoea agglomerans)来源的基因、布氏朽1檬酸杆菌(Citrobacter braakii)来源的基因、哥本哈根脱亚硫酸菌(Desulfitobacterium hafniense)来源的基因、橙色绿屈接菌(Chloroflexus aurantiacus)来源的基因、点型念珠蓝细菌(Nostoc punctiforme)来源的基因或齿垢密螺旋体(Treponema denticola)来源的基因。第3项.如第I项所述的转化体，其中，编码具有酪氨酸酚解酶活性的酶的基因为下述(a)或(b)的DNA，(a)由序列号36的碱基序列构成的DNA、由序列号39的碱基序列构成的DNA、由序列号42的碱基序列构成的DNA、由序列号45的碱基序列构成的DNA、由序列号48的碱基序列构成的DNA或由序列号51的碱基序列构成的DNA，(b)在严格的条件下与由(a)中任一个碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交且编码具有酪氨酸酚解酶活性的多肽的DNA。
第4项.如第I 3项中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌为存在于其染色体上的下述(c)和/或(d)的基因被破坏或发生缺陷的棒状细菌，(c)编码具有预苯酸脱水酶(prephenate dehydratase)活性的酶的基因，(d)编码具有苯酹2-单加氧酶(phenol2_monooxygenase)活性的酶的基因。
第5项.如第I 4项中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌的下述(e)和/或(f)的代谢基因在宿主中高表达，(e)编码具有 DAHP 合成酶(3-deoxy-D-arabino_heptulosonate7-phosphate (DAHP) synthase，3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸(DAHP)合成酶)活性的酶的基因，(f)编码具有分支酸变位酶(chorismate mutase)活性的酶的基因。第6项.如第I 5项中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌为谷氨酸棒杆菌。第7项.如第6项所述的转化体，其中，宿主谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌R(FERMP-18976)、ATCC13032 或 ATCC13869。第8项.如第6项所述的转化体，其中，宿主谷氨酸棒杆菌为存在于谷氨酸棒杆菌R(FERM P-18976)、ATCC13032或ATCC13869的染色体上的下述(c)和/或(d)的基因被破坏或发生缺陷的谷氨酸棒杆菌，(c)编码具有预苯酸脱水酶(prephenate dehydratase)活性的酶的基因，(d)编码具有苯酹2-单加氧酶(phenol2_monooxygenase)活性的酶的基因。第9项.如第6或8项所述的转化体，其中，宿主谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌R(FERM P-18976)、ATCC13032或ATCC13869中下述(e)和/或(f)的代谢基因高表达的谷氨酸棒杆菌，(e)编码具有 DAHP 合成酶(3-deoxy-D-arabino_heptulosonate7-phosphate (DAHP) synthase)活性的酶的基因，(f)编码具有分支酸变位酶(chorismate mutase)活性的酶的基因。第10项.谷氨酸棒杆菌PHE7 (保藏编号:NITE BP-976)转化体。第11项.一种苯酚的制造方法，其中，包括如下步骤:使第I 10项中任一项所述的转化体在还原条件下、在含有糖类的反应液中反应；以及回收反应液中的苯酹。第12项.如第11项所述的苯酚的制造方法，其中，在反应步骤中，转化体实质上不增殖。第13项.如第11或12项所述的苯酚的制造方法，其中，还原条件下的反应液的氧化还原电位为-200 -500毫伏。第14项.如第11 13项中任一项所述的苯酚的制造方法，其中，糖类为选自由葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、纤维二糖、海藻糖和甘露糖醇组成的组中的糖。发明效果通过使用本发明的转化体，与现有公知的转化体相比，能够由糖类高效率地制造苯酚。一般而言，微生物的增殖会因苯酚这样的溶剂的细胞毒性而受到抑制，因此，难以使用微生物来制造苯酚，但根据本发明方法，能够使用微生物以实用上足够良好的效率来制造苯酹。
图1是表示苯酚对各种微生物在需氧条件下的增殖的影响的图。
图2是表示苯酚对棒状杆菌在还原条件下的糖消耗的影响的图。图3是实施例中使用的各种质粒的构建图。图4是实施例中使用的各种质粒的构建图。
具体实施例方式以下，对本发明进行详细说明。(I)具有苯酚生产能力的转化体本发明的具有苯酚生产能力的转化体为将编码具有酪氨酸酚解酶(tyrosinephenol-lyase)活性的酶的基因导入宿主棒状细菌而得到的转化体。宿丰棒状细菌是BargeysManual of Determinative Bacteriology(伯杰氏系统细菌学手册)，Vol.8，599 (1974)中定义的一组微生物，只要是在通常的需氧条件下增殖的棒状细菌则没有特别限定。如果列举具体例，可以列举棒状杆菌属菌、短杆菌属菌、节杆菌属菌、分枝杆菌属菌、微球菌属菌等。棒状细菌中，优选棒状杆菌属菌。作为棒状杆菌属菌，可以列举谷氨酸棒杆菌、有效棒杆菌(Corynebacteriumefficiens)> 产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、耐盐棒杆菌(Corynebacterium halotolerance)、角军烧棒杆菌(Corynebacterium alkanolyticum)等。其中，从安全且苯酚生产率高的观点出发，优选谷氨酸棒杆菌。作为优选的菌株，可以列举:谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) R 株(FERM P-18976)、ATCC13032 株、ATCC13869 株、ATCC13058 株、ATCC13059 株、ATCC13060 株、ATCC13232 株、ATCC13286 株、ATCC13287 株、ATCC13655 株、ATCC13745 株、ATCC13746 株、ATCC13761 株、ATCC14020 株、ATCC31831 株、MJ-233(FERM BP-1497)、MJ-233AB-41 (FERM BP-1498)等。其中，优选 R 株(FERM P-18976) ,ATCC13032 株、ATCC13869 株。 另外,根据分子生物学的分类,黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、散枝短杆菌(Brevibacterium divaricatum)、百合棒杆菌(Corynebacterium lilium)等棒状细菌的菌名也统一在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中[Liebl, ff.et al.,Transfer of Brevibacteriumdivaricatum DSM20297T, “Brevibacterium flavum” DSM20411，“Brevibacteriumlactofermentum，，DSM20412and DSM1412, and Corynebacterium glutamicum and theirdistinction by rRNA gene restriction patterns.1nt J Syst Bacteriol.41:255-260.(1991)，驹形和男等，棒状细菌的分类，发酵与工业，45:944-963 (1987)]。旧分类的乳糖发酵短杆菌ATCC13869株、黄色短杆菌的MJ-233株(FERMBP-1497)、MJ-233AB-41株(FERM BP-1498)等也是优选的谷氨酸棒杆菌。作为短杆菌属菌，可以列举产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)(例如ATCC6872 株)等。作为节杆菌属菌，可以列举球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)(例如ATCC8010 株、ATCC4336 株、ATCC21056 株、ATCC31250 株、ATCC31738 株、ATCC35698 株)等。作为分枝杆菌属菌，可以列举牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)(例如ATCC19210 株、ATCC27289 株)等。
作为微球菌属菌，可以列举弗氏微球菌(Micrococcus freudenreichii)(例如 N0.239 株(FERM P-13221))、藤黄微球菌(Micrococcus Ieuteus)(例如 N0.240 株(FERM P-13222))、服微球菌(Micrococcus ureae)(例如 IAM1010 株)、玫瑰色微球菌(Micrococcus roseus)(例如 IF03764 株)等。另外，除了野生株以外，棒状细菌也可以是其突变株或人工的基因重组体。可以列举例如乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyrvate carboxylase)、苹果酸脱氧酶(malate dehydrogenase)等的基因的破坏株。通过使用这种基因破坏株作为宿主，能够提高苯酚的生产率或抑制副产物的生成。其中，优选乳酸脱氢酶基因的破坏株。该基因破坏株中，乳酸脱氢酶基因被破坏，由此使丙酮酸至乳酸的代谢途径被阻断。其中，优选谷氨酸棒杆菌的乳酸脱氢酶基因的破坏株，特别是谷氨酸棒杆菌R(FERM P-18976)株的乳酸脱氢酶基因的破坏株。这种基因破坏株可以通过基因工程的方法按照常规方法来制作。例如，W02005/010182A1中记载了乳酸脱氢酶破坏株及其制作方法。酪氨酸酚解酶基因(tpl)酪氨酸酚解酶为催化下述两个反应的酶。酪氨酸+H2Oe苯酚+丙酮酸+NH3
儿茶酚 + 丙酮酸 +NH3 — L-D0PA+H20编码具有酪氨酸酚解酶活性的酶的基因的来源没有特别限定，优选成团泛菌(Pantoea agglomerans)来源的基因、布氏朽1檬酸杆菌(Citrobacter braakii)来源的基因、哥本哈根脱亚硫酸菌(Desulfitobacterium hafniense)来源的基因、橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)来源的基因、点型念珠蓝细菌(Nostoc punctiforme)来源的基因、齿垢密螺旋体(Trep onema denticola)来源的基因。其中，优选成团泛菌来源的基因、布氏柠檬酸杆菌来源的基因或哥本哈根脱亚硫酸菌来源的基因，更优选布氏柠檬酸杆菌来源的基因。作为成团泛菌来源的酪氨酸酚解酶基因，可以列举由序列号36的碱基序列构成的DNA，作为布氏柠檬酸杆菌来源的酪氨酸酚解酶基因，可以列举由序列号39的碱基序列构成的DNA，作为哥本哈根脱亚硫酸菌来源的酪氨酸酚解酶基因，可以列举由序列号42的碱基序列构成的DNA，作为橙色绿屈挠菌来源的酪氨酸酚解酶基因，可以列举由序列号45的碱基序列构成的DNA，作为点型念珠蓝细菌来源的酪氨酸酚解酶基因，可以列举由序列号48的碱基序列构成的DNA，作为齿垢密螺旋体来源的酪氨酸酚解酶基因，可以列举由序列号51的碱基序列构成的DNA。另外，本发明中，也可以使用在严格的条件下与由序列号36、39、42、45、48或51的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交且编码具有酪氨酸酚解酶活性的多肽的DNA。本发明中，“严格的条件”是指一般的条件、例如Molecular Cloning, A LaboratoryManual (分子克隆实验指南)，第二版，1989，Vol2, pll.45中记载的条件。具体而言,是指在比完全杂交的解链温度(Tm)低5 10°C的温度下发生杂交的情况。酪氨酸酚解酶活性可以利用后述的实施例3中记载的方法测定。另外，本发明中，也可以使用由与序列号36、39、42、45、48或51的碱基序列具有90%以上的同一性、优选具有95%以上的同一性、更优选具有98%以上的同一性的碱基序列构成且编码具有酪氨酸酚解酶活性的多肽的DNA。碱基序列的同一性是利用GENETYX第8版(GENETYX株式会社七^ r ^ ^ ^制造)算出的值。由序列号36、39、42、45、48或51的碱基序列构成的DNA的同源物可以通过例如使用基于这些碱基序列按照常规方法设计的引物或探针的PCR或杂交由其他生物种的DNA文库中选择，由此以高概率得到编码具有酪氨酸酚解酶活性的多肽的DNA。用于转化的载体的构建将通过PCR扩增得到的编码酪氨酸酚解酶的DNA克隆到能够在宿主中扩增的适当的载体中即可。作为质粒载体，只要是包含在棒状细菌内担负自主复制功能的基因的质粒载体即可。作为其具体例，可以列举:乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum) 2256来源的 pAM330[日本特开昭 58-67699]、[Miwaj K.et al.,Cryptic plasmids inglutamic acid-producing bacteria.Agric.Biol.Chem.48:2901-2903 (1984)]和[Yamaguchi，R.et al.，Determination of the complete nucleotide sequence ofthe Brevibacterium lactofermentum plasmid pAM330and the analysis of itsgenetic information.Nucleic Acids Symp.Ser.16:265-267(1985)]、谷氨酸棒杆菌 ATCC13058 来源的 pHM1519[Miwa，K.et al.,Cryptic plasmids in glutamicacid-producing bacteria.Agric.Biol.Chem.48:2901-2903 (1984)]和pCRY30 [Kurusu，Y.et al.，Identification of plasmid partition function in coryneform bacteria.App1.Environ.Microbiol.57:759-764(1991)]、谷氨酸棒杆菌 T250 来源的 pCG4[日本特开昭 57-1837 99]、[Katsumata, R.et al., Protoplast transformation ofglutamate-producing bacteria with plasmid DNA.J.Bacteriol.、159:306-311(1984)]、pAGl、pAG3、pAG14、pAG50 [日本特开昭 62-166890]、pEKO、pEC5、pEKExl [Eikmanns，B.J.etal., A family of Corynebacterium glutamicum/Escherichia coli shuttle vectors forcloning,controlled gene expression,and promoter probing.Gene, 102:93-98(1991)]
坐寸ο作为优选的启动子，可以列举谷氨酸棒杆菌R来源的甘油醛-3-磷酸脱氢酶A基因(gapA)的启动子PgapA、苹果酸脱氢酶基因(mdh)的启动子Pmdh、乳酸脱氢酶A基因(IdhA)的启动子PldhA等,其中，优选PgapA。作为优选的终止子，可以列举大肠杆菌rRNA操纵子的rrnB T1T2终止子、大肠杆菌的trpA终止子、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)的trp终止子等，其中，优选rrnB TIT2终止子。MiL转化方法可以没有限制地使用公知的方法。作为这样的公知的方法，可以列举例如氯化钙/氯化铷法、磷酸钙法、DEAE-葡聚糖介导的转染、电穿孔法等。其中，对于棒状细菌优选电脉冲法，电 脉冲法可以通过公知的方法[Kurusu, Y.et al.，Electroporation-transformation system for Coryneform bacteria by auxotrophiccomplementation.Agric.Biol.Chem.54:443-447 (1990)]和[Vertes A.A.etal., Presence of mrr-and mcr-like restriction systems in Coryneform bacteria.Res.Microbiol.144:181-185(1993)]进行。转化体使用微生物的培养中通常使用的培养基进行培养即可。作为该培养基，通常可以使用含有碳源、氮源、无机盐类及其他营养物质等的天然培养基或合成培养基等。作为碳源，可以列举:葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖、麦芽糖、甘露糖醇、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、淀粉、糖蜜、山梨糖醇、甘油等糖质或糖醇；乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、马来酸或葡糖酸等有机酸；乙醇、丙醇等醇等。另外，还可以根据期望使用正链烷烃等烃等。碳源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。培养基中的这些碳源的浓度通常设定为约0.1 约10 (w/v%)即可。作为氮源，可以列举:氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵等无机铵化合物或有机铵化合物、尿素、氨水、硝酸钠、硝酸钾等。另外，也可以使用玉米浆、肉提取物、蛋白胨、NZ-胺、蛋白质水解物、氨基酸等含氮有机化合物等。氮源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。培养基中的氮源浓度因使用的氮化合物而异，通常设定为约0.1 约10(w/v%)即可。作为无机盐类，可以列举例如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴或碳酸钙等。这些无机盐可以单独使用一种或者两种以上混合使用。培养基中的无机盐类浓度因使用的无机盐而异，通常设定为约0.01 约I (w/v%)即可。作为营养物质，可以列举例如肉提取物、蛋白胨、多聚蛋白胨、酵母提取物、干酵母、玉米浆、脱脂奶粉、脱脂大豆盐酸水解物或者动植物或微生物菌体的提取物或它们的分解物等。营养物质的培养基浓度因使用的营养物质而异，通常设定为约0.1 约10(w/v%)即可。另外，还可以根据需要添加维生素类。作为维生素类，可以列举例如生物素、硫胺素(维生素BI)、吡哆醇(维生素B6)、泛酸、肌醇、尼克酸等。培养基的pH优选约5 约8。作为优选的微生物培养培养基，可以列举A培养基[Inui, M.et al., Metabolicanalysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinateproductions under oxygen deprivation conditions.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.7:182-196(2004)]、BT 培养基[Omumasaba, C.A.et al., Corynebacteriumglutami cum glyceraldehyde — 3-phosphate dehydrogenase isoforms withopposite, ATP-dependent regulation.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8:91-103(2004)]
坐寸ο培养温度设定为约15°C 约45°C即可，培养时间设定为约I天 约7天即可。宿主染色体基因的破坏或缺失宿主棒状细菌中，优选存在于其染色体上的编码具有预苯酸脱水酶(prephenate dehydratase)活性的酶的基因(pheA)和/或编码具有苯酹2_单加氧酶(phenol2-monooxygenase)活性的酶的基因(poxF)被破坏或发生缺失，由此能够更高效地制造苯酹。更优选pheA和poxF均被破坏或均发生缺失。制作以使基因的部分序列缺失而不产生正常发挥功能的酶蛋白的方式进行改变后的缺失型基因，利用包含该基因的DNA转化细菌，在缺失型基因与染色体上的基因之间引起同源重组，由此能够将染色体上的基 因置换成缺失型或破坏型的基因。由缺失型或破坏型的基因编码的酶蛋白即使生成也具有与野生型酶蛋白不同的立体结构，功能降低或消失。由这种利用同源重组的基因置换所致的基因缺失或破坏方法已经确立，有:使用包含温度敏感性复制起点的质粒、能够进行接合转移的质粒的方法；利用在宿主内不具有复制起点的自杀载体的方法等(美国专利第6303383号、日本特开平05-007491号)。具体而言，通过实施例2的项目中记载的方法，能够得到预苯酸脱水酶基因、苯酚2-单加氧酶基因被破坏或缺失的棒状细菌。代谢基因的_表达宿主棒状细菌中，优选DAHP 合成酶(3-deoxy-D-arabino_heptulosonate7-phosphate (DAHP) synthase)基因(aroG)和 / 或分支酸变位酶(chorismate mutase)基因(csm)以比宿主本来的水平、即野生型宿主的水平高的水平进行表达。该高表达通过增加利用转化的基因导入或宿主染色体上的基因的拷贝数来实现。更优选aroG和csm均进行高表达。对转化进行说明，导入的DAHP合成酶基因和分支酸变位酶基因可以是与宿主的基因相同或实质上相同的DAHP合成酶基因和分支酸变位酶基因，也可以是其他的DAHP合成酶基因和分支酸变位酶基因。优选导入与宿主的基因相同或实质上相同的DAHP合成酶基因和/或分支酸变位酶基因。例如，作为谷氨酸棒杆菌来源的DAHP合成酶基因，可以列举由序列号30的碱基序列构成的DNA，作为谷氨酸棒杆菌来源的分支酸变位酶基因，可以列举由序列号31的碱基序列构成的DNA。作为其他的棒状细菌的DHAP合成酶基因，有:有效棒杆菌(Corynebacteriumefficiens)来源的基因(序列号62，日本DNA数据库:CE2073)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)来源的基因(序列号63,日本DNA数据库:MSMEG_4244)、混池红球菌(Rhodococcus opacus)来源的基因(序列号64,日本DNA数据库:R0P_08400)等，作为分支酸变位酶基因，有:有效棒杆菌来源的基因(序列号65，日本DNA数据库:CE0929)、耻垢分枝杆菌来源的基因(序列号66，日本DNA数据库:MSMEG_5536)、混浊红球菌来源的基因(序列号67，日本DNA数据库:R0P_56380)等。另外，关于DAHP合成酶基因或分支酸变位酶基因，“实质上相同的基因”可以列举编码与该基因所编码的多肽的氨基酸序列具有90%以上的同一性、优选具有95%以上的同一性、更优选具有98%以上的同一性且具有DAHP合成酶活性或分支酸变位酶活性的多肽的DNA。另外，关于DAHP合成酶基因或分支酸变位酶基因，“实质上相同的基因”可以列举与该基因具有90%以上的同一性、优选具有95%以上的同一性、更优选具有98%以上的同一性且编码具有DAHP合成酶活性或分支酸变位酶活性的多肽的DNA。
DAHP合成酶活性的有无可以通过以磷酸烯醇式丙酮酸和赤藻糖-4-磷酸为底物进行反应并利用使用硫代巴比妥酸的显色法对生成的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸(DAHP)进行定量(Appl.Environ.Microbiol., 74:5497-5503 (2008).)来检测。另外，对于分支酸变位酶活性的有无，可以在以分支酸为底物进行反应后，利用终浓度为0.67Ν的盐酸将生成的预苯酸(prephenate)转换为苯丙酮酸(phenylpyruvate)(温育约10分钟)，然后基于320nm的吸光度增加(苯丙酮酸的生成)进行检测(Microbiology.，155，3382-3391 (2009).)。对提高宿主染色体上的DAHP合成酶基因或分支酸变位酶基因的拷贝数的方法进行说明，只要以多拷贝在棒状细菌的染色体DNA上导入这些基因即可。为了在微生物的染色体DNA上以多拷贝导入基因，可以利用以多拷贝存在于染色体DNA上的序列作为标靶，并利用同源重组法(Experiments in Molecular Genetics (分子遗传学实验)，冷泉港实验室(1972))进行。作为以多拷贝存在于染色体DNA上的序列，可以利用重复DNA、存在于转移因子的端部的反向重复序列。另外，也可以如日本特开平2-109985号公报中公开的那样，使目的基因与转座子一同发生转移而以多拷贝导入到染色体DNA上。此外，还可以通过使用Mu噬菌体的方法(日本特开平2-109985号)将目的基因重组到宿主染色体中。另外，也可以通过将棒状细菌的染色体上的DAHP合成酶基因和/或分支酸变位酶基因的启动子等表达调节序列转换成更强的表达调节序列来提闻这些基因的表达。例如，作为强启动子，已知tac启动子、Iac启动子、trc启动子、trp启动子等。另外，也可以如国际公开W000/18935中公开的那样，向基因的启动子区导入数个碱基的碱基置换而将其改变成更强的启动子。启动子强度的评价方法和强启动子的例子记载在Goldstein等的论文(Prokaryotic promoters in biotechnology.Biotechnol.Annu.Rev., 1995, I, 105-128)等中。表达调节序列的置换例如可以与使用温度敏感性质粒的基因置换同样地进行。此外，已知核糖体结合位点(RBS)与起始密码子之间的间隔区、特别是紧靠起始密码子的上游的序列中的数个核苷酸的置换会给mRNA的翻译效率带来非常大的影响，通过改变这些序列，也能够提高翻译量。作为进行上述基因置换的方法，例如有使用包含温度敏感性复制起点的质粒、能够进行接合转移的质粒的方法；利用在宿主内不具有复制起点的自杀载体的方法等(美国专利第6303383号说明书或日本特开平05-007491号公报)。(II)苯酷的制造方 法可以通过包括使上述说明过的本发明的转化体在还原条件下、在含有糖类的反应液中反应的步骤以及回收反应液中的苯酚的步骤的方法来制造苯酚。微牛物的增葙在反应之前，优选将转化体在需氧条件下在约25°C 约38°C的温度下培养约12小时 约48小时而使其增殖。培养用培养基反应之前的转化体的需氧培养中使用的培养基可以使用含有碳源、氮源、无机盐类及其他营养物质等的天然培养基或合成培养基。作为碳源，也可以使用:糖类(葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖等单糖；蔗糖、麦芽糖、乳糖、纤维二糖、木二糖、海藻糖等二糖；淀粉等多糖；糖蜜等);甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、甘油等糖醇；乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、马来酸、葡糖酸等有机酸；乙醇、丙醇等醇；正链烷烃等烃等。碳源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。作为氮源，可以使用氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵等无机铵或有机铵化合物、尿素、氨水、硝酸钠、硝酸钾等。另外，也可以使用玉米浆、肉提取物、蛋白胨、NZ-胺、蛋白质水解物、氨基酸等含氮有机化合物等。氮源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。氮源在培养基中的浓度因使用的氮化合物而异，通常设定为约0.1 约10(w/v%)即可。作为无机盐类，可以列举磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴、碳酸钙等。无机盐可以单独使用一种或者两种以上混合使用。无机盐类在培养基中的浓度因使用的无机盐而异，通常设定为约0.0l 约I (w/v%)即可。作为营养物质，可以列举肉提取物、蛋白胨、多聚蛋白胨、酵母提取物、干酵母、玉米浆、脱脂奶粉、脱脂大豆盐酸水解物、动植物或微生物菌体的提取物或它们的分解物等。营养物质在培养基中的浓度因使用的营养物质而异，通常设定为约0.1 约10(w/v%)即可。还可以根据需要进一步添加维生素类。作为维生素类，可以列举生物素、硫胺素(维生素BI)、吡哆醇(维生素B6)、泛酸、肌醇、尼克酸等。培养基的pH优选约6 约8。作为具体的优选的棒状细菌用培养基，可以列举A培养基[Inui，M.etal.,Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate andsuccinate productions under oxygen deprivation conditions.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.7:182-196(2004)]、BT 培养基[Omumasaba, C.A.et al., Corynebacteriumglutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms withopposite,ATP-dependent regulation.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8:91-103(2004)]等。这些培养基中，使糖类浓度在上述范围内来使用即可。反应液作为反应液，可以使用含有碳源、氮源、无机盐类及其他营养物质等的天然培养基或合成培养基。作为碳源，使用糖类。作为糖类，可以列举葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖等单糖；蔗糖、麦芽 糖、乳糖、纤维二糖、木二糖、海藻糖等二糖；淀粉等多糖；糖蜜等。其中，优选单糖，更优选葡萄糖。作为碳源，除了可以使用糖类以外，也可以使用甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、甘油等糖醇；乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、马来酸、葡糖酸等有机酸；乙醇、丙醇等醇；正链烷烃
寸工寸ο碳源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。反应液中的糖类的浓度优选约I 约20 (w/v%),更优选约2 约10 (w/v%),进一步优选约2 约5 (w/v%)。另外，包括糖类在内的全部碳源在反应液中的浓度通常设定为约2 约5(w/v%)即可。作为氮源，可以使用氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵等无机铵或有机铵化合物、尿素、氨水、硝酸钠、硝酸钾等。另外，也可以使用玉米浆、肉提取物、蛋白胨、NZ-胺、蛋白质水解物、氨基酸等含氮有机化合物等。氮源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。氮源在反应液中的浓度因使用的氮化合物而异，通常设定为约0.1 约10(w/v%)即可。作为无机盐类，可以列举磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴、碳酸钙等。无机盐可以单独使用一种或者两种以上混合使用。无机盐类在反应液中的浓度因使用的无机盐而异，通常设定为约0.01 约l(w/v%)即可。作为营养物质，可以列举肉提取物、蛋白胨、多聚蛋白胨、酵母提取物、干酵母、玉米浆、脱脂奶粉、脱脂大豆盐酸水解物、动植物或微生物菌体的提取物或它们的分解物等。营养物质在反应液中的浓度因使用的营养物质而异，通常设定为约0.1 约10(w/v%)即可。还可以根据需要进一步添加维生素类。作为维生素类，可以列举生物素、硫胺素(维生素BI)、吡哆醇(维生素B6)、泛酸、肌醇、尼克酸等。反应液的pH优选约6 约8。作为具体的优选的棒状细菌用培养基，可以列举前述的A培养基、BT培养基等。这些培养基中，使糖类浓度在上述范围内来使用即可。反应条件反应温度即转化体的存活温度优选约20°C 约50°C，更优选约25°C 约47°C。如果为上述温度范围，则能够高效地制造苯酚。另外，反应时间优选约I天 约7天，更优选约I天 约3天。培养可以是分批培养、流加培养、连续培养中的任何一种。其中，优选分批培养。反应可以在需氧条件下进行，也可以在还原条件下进行。<还原备件>在还原条件下，棒状细菌实质上不增殖，因而能够更高效地生产苯酚。还原条件由反应液的氧化还原电位规定。反应液的氧化还原电位优选约-200mV 约-500mV，更优选约_250mV 约_500mV。反应液的还原状态可以利用刃天青指示剂(在还原状态下由蓝色脱色为无色)简单地推测，使用氧化还原电位差计(例如，BROADLEY JAMES公司制造，ORP电极)可以准确地测定。处于还原条件下的反应液的制备方法可以没有限制地使用公知的方法。例如，可以使用反应液用水溶液代替蒸馏水等作为反应液的液体介质，反应液用水溶液的制备方法参考例如硫酸还原微生物等绝对厌氧性微生物用的培养液制备方法(Pfennig, Net.al.(1981):The dissimilatory sulfate-reducing bacteria, In The Prokaryotes, AHandbook on Habitats, Isolation and Identification of Bacteria, Ed.by Starr, M.P.et.al.p.926-940, Berlin, Springer Verlag.)或“农艺化学实验书第三卷、京都大学农学部农艺化学教室编、1990年第26次印刷、产业图书株式会社出版”等，能够得到期望的还原条件下的水溶液。具体而言，可以通过对蒸馏水等进行加热处理或减压处理将溶解气体除去而得到还原条件的反应液用水溶液。在这种情况下，可以通过在约IOmmHg以下、优选约5mmHg以下、更优选约3mmHg以下的减压条件下将蒸懼水等处理约I分钟 约60分钟、优选约5分钟 约40分钟来将溶解气体、特别是溶解氧除去而得到还原条件下的反应液用水溶液。另外，也可以添加适当的还原剂(例如，硫代乙醇酸、抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、巯基乙酸、硫代乙酸、谷胱甘肽、硫化钠等)来制备还原条件的反应液用水溶液。将上述方法适当组合而成的方法也是有效的还原条件的反应液用水溶液的制备方法。反应中也优选将反应液维持 于还原条件。为了维持反应过程中的还原条件，优选尽可能地防止从反应体系外混入氧，具体而言，可以列举将反应体系封入氮气等惰性气体或二氧化碳等中的方法。作为更有效地防止氧混入的方法，为了在反应过程中使本发明的需氧性细菌的菌体内的代谢功能高效地发挥作用，有时也需要添加维持反应体系的PH的调节液或适当添加各种营养素溶解液，在这种情况下，预先从添加溶液中除去氧是有效的。苯酚的回收通过以上述方式进行培养，在反应液中生产出苯酚。可以通过回收反应液来回收苯酚，也可以进一步利用公知的方法从反应液中分离出苯酚。作为这种公知的方法，可以列举蒸馏法、膜透过法、有机溶剂提取法等。实施例以下，利用实施例更详细地说明本发明，但本发明不受这些实施例的限定。实施例1作为苯酚生产用宿主的适性试验:苯酚对谷氨酸棒杆菌及其他种类菌体的影响(I)苯酚对需氧增殖的影响对谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌和恶臭假单胞菌进行需氧培养中的苯酚的生长抑制试验。另外，本试验中使用的恶臭假单胞菌S12作为耐溶剂性菌进行了报道，并公开了迄今为止唯一作为苯酚生产的宿主使用的技术。将谷氨酸棒杆菌R涂布在A琼脂培养基[将(NH2) 2C02g、(NH4) 2S047g、KH2P040.5g、K2HPO40.5g、MgSO4.7Η200.5g、0.06% (w/v) Fe2SO4.7H20+0.042% (w/v) MnSO4.2H201ml、0.02% (w/v)生物素溶液Iml、0.01% (w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、维生素分析酪蛋白水解物7g、葡萄糖40g、琼脂15g悬浊于IL蒸馏水中]上，在33°C下于暗处静置15小时。将一钼环的上述培养皿中生长的谷氨酸棒杆菌R接种到装有IOmlA液体培养基[将(NH2) 2C02g、(NH4) 2S047g、KH2PO40.5g、K2HPO40.5g、MgSO4.7Η200.5g、0.06% (w/v)Fe2SO4.7H20+0.042%(w/v) MnSO4.2H201ml、0.02%(w/v)生物素溶液 lml,0.01%(w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、维生素分析酪蛋白水解物7g、葡萄糖40g溶解于IL蒸馏水中]的试管中，在33°C下在需氧条件下进行13小时的振荡培养。将上述条件下生长的谷氨酸棒杆菌R接种到100ml A液体培养基中以使初始菌体浓度OD61tl为0.05，同时添加苯酚使终浓度为OmM、0.16mM、0.2mM、0.24mM、0.32mM，并在33°C下在需氧条件下进行振荡培养。菌体的生长通过测定OD61tl的吸光度来进行。将大肠杆菌JM109涂布在LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上，在37°C下于暗处静置15小时。将一钼环的上述培养皿中生长的大肠杆菌JM109接种到装有IOmlLB液体培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物和0.5%氯化钠]的试管中，在37°C下在需氧条件下进行13小时的振荡培养。将上述条件下生长的大肠杆菌JM109接种到IOOml LB液体培养基中以使初始菌体浓度OD61tl为0.05，同时添加苯酚使苯酚的终浓度为0mM、0.16mM、0.20mM,并在37°C下在需氧条件下进行振荡培养。菌体的生长通过测定OD61tl的吸光度来进行。将恶臭假单胞菌Fl和S12涂布在LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上，在30°C下于暗处静置15小时。将一钼环的上述培养皿中生长的恶臭假单胞菌Fl和S12接种到装有IOml LB (+葡萄糖)液体培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和0.4%葡萄糖]的试管中，在30°C下在需氧条件下进行13小时的振荡培养。将上述条件下生长的恶臭假单胞菌Fl和S12株接种到IOOml LB (+葡萄糖)液体培养基中以使初始菌体浓度OD61tl为0.05，同时添加苯酚使苯酚的终浓度为0mM、0.1OmM,0.20mM,并在30°C下在需氧条件下进行振荡培养。菌体的生长通过测定OD61tl的吸光度来进行。向培养基中添加苯酚对需氧增殖的影响的分析结果示于图1中。图1的纵轴为od61(i。对于大肠杆菌而言，在0.16%的苯酚存在下增殖显著受到抑制，在0.20%的苯酚存在下增殖完全被抑制。恶臭假单胞菌Fl和作为耐溶剂性菌被报道的恶臭假单胞菌S12显示出基本相同的倾向，在0.10%的苯酚存在下增殖显著受到抑制，在0.20%的苯酚存在下增殖完全被抑制。与此相对，谷氨酸棒杆菌即使在使大肠杆菌的增殖受到显著抑制的0.16%的苯酚存在下对增殖也几乎没有影响，即使在使大肠杆菌和恶臭假单胞菌的增殖完全被抑制的0.20%的苯酚存在下也显示出良好的生长。而且在0.24%的苯酚存在下能够增殖。由此表明，谷氨酸棒杆菌与大肠杆菌和恶臭假单胞菌相比对苯酚具有高耐性，作为苯酚生产的宿主具有高适性。(2)苯酚对还原条件下的糖代谢的影响将谷氨酸棒杆菌R涂布在A琼脂培养基上，在33°C下于暗处静置20小时。将一钼环的上述培养皿中生长的谷氨酸棒杆菌R接种到装有IOmlA液体培养基的试管中，在33°C下在需氧条件下进行15小时的振荡培养。将上述条件下生长的谷氨酸棒杆菌R接种到装有500ml A液体培养基的容量为2L的三角烧瓶中，在33°C下在需氧条件下进行15小时的振荡培养。通过离心分离(4°C、5000g、15分钟)回收以上述方式培养增殖的菌体。将所得到的菌体以10w/v%悬浊于BT (-尿素)液体培养基
中。将60ml的该各菌体悬浊液装入容量为IOOml的培养瓶中，在还原条件下(氧化还原电位:-450mV)添加8%的葡萄糖,并添加苯酹使苯酚浓度为0mM、0.24mM、0.38mM、0.46mM，在保持于33°C的水浴中边搅拌边反应。此时，在使用2.5N的氨水并利用pH控制器(工4 O株式会社制造，型号:DT-1023)进行控制以使反应液的PH不低于7.0的同时进行反应。将苯酚对谷氨酸棒杆菌R在还原条件下的糖代谢的影响的研究结果示于图2中。在还原条件下，即使是在需氧培养中观察到增殖抑制的0.24%的苯酚存在下也完全未观察到苯酚的影响，显示出与未添加苯酚时同等的糖消耗。而且，即使在0.38%的苯酚存在下也观察到糖消耗，即使在0.46%的苯酚存在下也显示出少量的糖消耗。由此表明，与需氧培养相比，谷氨酸棒杆菌R在还原条件下对苯酚显示出高耐性，还原条件下的以谷氨酸棒杆菌为宿主的苯酚生产比需氧条件下的生产更优越。实施例2苯酚生产基因的克隆与表达(I)从微牛物中提取染色体DNA从谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum) R(FERM P-18976)中提取染色体 DNA 的操作如下进行:向 A 培养基[ 将(NH2) 2C02g、(NH4) 2S047g、KH2PO40.5g、K2HPO40.5g、MgSO4.7Η200.5g、0.06% (w/v) Fe2SO4.7H20+0.042% (w/v) MnSO4.2H201ml、0.02% (w/v)生物素溶液1ml、0.01% (w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、维生素分析酪蛋白水解物7g溶解于IL蒸馏水中]中添加最终浓度为4%的50%(w/v)葡萄糖溶液作为碳源，使用钼环接种后，在33°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名:GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒,安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从成团泛菌(Pantoea agglomerans)NBRC12686中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到NBRC Medium N0.802培养基[将多聚蛋白胨10g、酵母提取物2g、MgSO4.7H201g溶解于IL蒸馏水中]中后，在30°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名=GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒,安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从布氏朽1檬酸杆菌(Citrobacter braakii)ATCC6750中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到营养肉汤培养基(BD公司制造的BD234000)中后，在37°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名KenomicPriip细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从哥本哈根脱亚硫酸菌(Desulfitobacterium hafniense) Y51中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到MMYP培养基[将K2HP047.8g、KH2P04l.2g、柠檬酸钠0.5g、MgSO4.7H200.lg、酵母提取物2.0g、丙酮酸钠5.5g、刃天青钠盐1.0mg溶解于IL蒸懼水中并调节PH至7.2]中后，进行厌氧培养，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名:GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒,安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从澄色绿屈接菌(Chloroflexusaurantiacus J-10-fl) ATCC29366 中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到绿屈挠菌培养基[次氮基三乙酸0.lg、微量营养素溶液 1.0ml、FeCl3 溶液 1.0m UCaSO4.2H200.06g、MgSO4.7Η200.lg、NaC10.008g、KNO30.103g、NaNO30.689g、Na2HP040.1llg^NH4Cl0.2g、酵母提取物 0.5g、甘氨酰甘氨酸 0.5g 溶解于 IL 蒸馏水中；微量营养素溶液:将 H2SO40.5ml、MnSO4.7Η202.28g、ZnSO4.7Η200.5g、H3BO30.5g、CuSO4.2H200.025g、Na2MoO4.2H200.025g、CoCl2.6H200.045g 溶解于 IL 蒸馏水中；FeCl3 溶液JfFeCl30.2905g溶解于IL蒸馏水中)]中后，进行钨灯照射并在50°C下振荡培养，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名AenomicPr印细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从哥本哈根脱亚硫酸菌(Desulfitobacterium hafniense) Y51中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到MMYP培养基[将K2HP047.8g、KH2P04l.2g、柠檬酸钠0.5g、MgSO4.7H200.lg、酵母提取物2.0g、丙酮酸钠5.5g、刃天青钠盐1.0mg溶解于IL蒸懼水中并调节PH至7.2]中后，进行厌氧培养，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名:GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒,安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从点型念珠蓝细菌(Nostoc punctiforme)ATCC29133中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到固氮蓝藻(Blue-green nitrogen-fixing)培养基[将K2HPO40.04g、MgSO4.7Η200.075g、CaCl2.2Η200.036g、柠檬酸 6.0mg、柠檬酸铁铵 6.0mg、EDTA1.0mg^Na2CO30.02g、痕量金属混合物A51.0ml溶解于IL蒸馏水中并调节pH至7.1 ;痕量金属混合物 A5 JfH3B032.86g、MnCl2.4Η201.81g、ZnS04.7Η200.222g,Na2MoO4.2Η200.39g、CuSO4.5Η200.079g、Co (NO3)2.6Η2049.4mg溶解于IL蒸馏水中]中后，进行光照射(2000 3000勒克斯)并在26 °C下培养，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名:GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒,安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。齿垢密螺旋体(Tr印onema denticola) JCM8153 的染色体 DNA (目录号 RDB6217)从独立行政法人理化学研究所获得。
_1] (2)克隆载体的构建克降载体DCRB22的构律通过以下的PCR法对分别包含乳酪棒杆菌JCMl2072来源的质粒pCASEl的DNA复制起点(以下记作pCASEl-ori)序列和克隆载体pHSG298 (宝生物株式会社制造)的DNA片段进行扩增。进行PCR时，为了分别将pCASEl-ori序列、克隆载体pHSG298克隆化，基于序列号I (pCASEl-ori序列)、序列号2 (克隆载体-pHSG298)分别合成下述一对引物来使用。pCASEl-ori序列扩增用引物(a-1):5，-AT AGATCT AGAACGTCCGTAGGAGC-3，(序列号 3)(b-Ι):5’ -AT AGATCT GACTTGGTTACGATGGAC-3’(序列号 4)另外，引物(a-Ι)和(b-Ι)上附加有BglII限制性内切酶位点。
克隆载体pHSG298扩增用引物(a-2):5，-AT AGATCT AGGITTCCCGACTGGAAAG-3’(序列号 5)(b-2):5，-AT AGATCT CGTGCCAGCTGCATTAATGA-3’(序列号 6)另外，引物(a-2)和(b-2)上附加有BglII限制性内切酶位点。模板DNA使用提取自由日本微生物保藏中心(JCM)获得的乳酪棒杆菌JCM12072的总DNA和克隆载体pHSG298 (宝生物株式会社制造)。实际的PCR中，使用热循环仪GeneAmp PCR系统9700 (应用生物系统公司制造)，并使用TaKaRa LA Taq(宝生物株式会社制造)作为反应试剂在下述的条件下进行。反应液:
权利要求
1.一种具有苯酚生产能力的转化体，其通过将编码具有酪氨酸酚解酶活性的酶的基因导入宿主棒状细菌而得到。
2.按权利要求1所述的转化体，其中，编码具有酪氨酸酚解酶活性的酶的基因为成团泛菌(Pantoea agglomerans)来源的基因、布氏朽1樣酸杆菌(Citrobacter braakii)来源的基因、哥本哈根脱亚硫酸菌(Desulfitobacterium hafniense)来源的基因、橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)来源的基因、点型念珠蓝细菌(Nostoc punctiforme)来源的基因或齿垢密螺旋体(Treponema denticola)来源的基因。
3.按权利要求1所述的转化体，其中，编码具有酪氨酸酚解酶活性的酶的基因为下述(a)或(b)的 DNA， (a)由序列号36的碱基序列构成的DNA、由序列号39的碱基序列构成的DNA、由序列号42的碱基序列构成的DNA、由序列号45的碱基序列构成的DNA、由序列号48的碱基序列构成的DNA或由序列号51的碱基序列构成的DNA， (b)在严格的条件下与由(a)中任一个碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交且编码具有酪氨酸酚解酶活性的多肽的DNA。
4.按权利要求1 3中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌为存在于其染色体上的下述(c)和/或(d)的基因被破坏或发生缺陷的棒状细菌， (c)编码具有预苯酸脱水酶活性的酶的基因， (d)编码具有苯酚2-单加氧酶活性的酶的基因。
5.按权利要求1 4中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌的下述(e)和/或(f)的代谢基因在宿主中高表达， (e)编码具有DAHP合成酶即3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸合成酶活性的酶的基因， (f)编码具有分支酸变位酶活性的酶的基因。
6.按权利要求1 5中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌为谷氨酸棒杆菌。
7.按权利要求6所述的转化体，其中，宿主谷氨酸棒杆菌是保藏编号为FERMP-18976的谷氨酸棒杆菌R、ATCC13032或ATCC13869。
8.按权利要求6所述的转化体，其中，宿主谷氨酸棒杆菌是存在于保藏编号为FERMP-18976的谷氨酸棒杆菌R、ATCC13032或ATCC13869的染色体上的下述(c)和/或(d)的基因被破坏或发生缺陷的谷氨酸棒杆菌， (c)编码具有预苯酸脱水酶活性的酶的基因， (d)编码具有苯酚2-单加氧酶活性的酶的基因。
9.按权利要求6或8所述的转化体，其中，宿主谷氨酸棒杆菌是保藏编号为FERMP-18976的谷氨酸棒杆菌R、ATCC13032或ATCC13869中下述(e)和/或(f)的代谢基因高表达的谷氨酸棒杆菌， (e)编码具有DAHP合成酶活性的酶的基因， (f)编码具有分支酸变位酶活性的酶的基因。
10.氨酸棒杆菌PHE7转化体，其保藏编号为NITEBP-976。
11.一种苯酚的制造方法，其中，包括如下步骤:使权利要求1 10中任ー项所述的转化体在还原条件下、在含有糖类的反应液中反应；以及回收反应液中的苯酹。
12.按权利要求11所述的苯酚的制造方法，其中，在反应步骤中，转化体实质上不增殖。
13.按权利要求11或12所述的苯酚的制造方法，其中，还原条件下的反应液的氧化还原电位为-200 -500毫伏。
14.按权利要求11 13中任一项所述的苯酹的制造方法,其中,糖类为选自由葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、纤维ニ糖、海藻糖和甘露糖醇组成的组中的糖。
全文摘要
将编码具有酪氨酸酚解酶(tyrosine phenol-lyase)活性的酶的基因导入宿主谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)而得到的、具有苯酚生产能力的转化体能够以糖类为原料高效地制造苯酚。具体而言，优选包括下述步骤的方法使该转化体在还原条件下、在含有糖类的反应液中反应；以及回收反应液中的苯酚。
文档编号C12N15/09GK103097530SQ20118004342
公开日2013年5月8日 申请日期2011年9月7日 优先权日2010年9月8日
发明者汤川英明, 乾将行 申请人:绿色苯酚·高机能苯酚树脂制造技术研究组合
技术领域：
本发明涉及苯酚生产技木。更详细而言，本发明涉及为了赋予苯酚生产功能而实施了特定基因操作的棒状细菌的转化体及使用该转化体的高效的苯酚的制造方法。
背景技术：
在全球变暖和化石资源枯竭问题的背景下，已经认识到以可再生资源为原料的化学品制造与生物燃料制造并列地作为新产业生物炼制而成为实现低碳社会的重要策略，并聚焦了广泛的关注。但是，对于以可再生资源为原料的生物苯酚生产而言，与乳酸、こ醇的生产相比，从作为原料的糖类开始的代谢反应阶段非常多，因此生产率低，并且作为产物的苯酚会使细菌的增殖受到抑制或者存在由苯酚产生的细胞毒性等，基于上述理由，目前还不能进行エ业性的生产。作为苯酚的重要用途，可以列举酚醛树脂。酚醛树脂是由苯酚与醛类的加成缩合反应生成且在塑料中具有最古老历史的树脂，由于其优良的耐热性、耐久性等优点，目前仍被用于汽车用金属替代材料、半导体密封材料、电路基板等各种用途。另外，对于迄今为止的酚醛树脂而言，由于原料苯酚与醛类的反应性极高，所得到的高分子形成复杂的三维网状结构，因此，难以实现聚合物的精密结构设计和在纳米材料中的发展，从而认为难以应用于高附加价值的用途。但是近年来，随着高分子的物性理论和仿真技术的快速发展，只要使网状结构精密化则能够由酚醛树脂创制高功能性材料。在这样的背景下，日本的酚醛树脂生产量正在逐年増加。目前的苯酚的エ业生产法(异丙苯法)是以石油来源的苯和丙烯作为原料、需要大量的溶剂类和大量的热能的 、典型的化学エ业的高能耗型エ艺。因此，从保护地球环境和減少温室效应气体的观点出发，当务之急是开发ニ氧化碳排放少的节能型的、能够由可再生资源制造的、废弃物排放低的环境和谐型エ艺，即建立生物苯酚制造技木。迄今为止尚未报道过自然界中的苯酚生产菌。作为利用基因重组菌的苯酚生产技术，可以列举非专利文献I。非专利文献I的方法中，公开了下述技术:制作向耐溶剂性菌恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)S12株中导入成团泛菌(Pantoea agglomerans)来源的编码酪氨酸酹解酶的tpl基因而得到的菌株和向恶臭假单胞菌S12株中导入恶臭假单胞菌S12株来源的编码DAHP合成酶(3-deoxy-D-arabino_heptulosonate7-phosphate(DAHP) synthase,3_ 脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸(DAHP)合成酶)的aroF-1基因而得到的菌株来使用。另外，从向恶臭假单胞菌S12株中导入恶臭假单胞菌S12株来源的编码DAHP合成酶的aroF-1基因而得到的菌株中获取对苯丙氨酸和酪氨酸的类似物(代谢拮抗物质)即间氟-DL-苯丙氨酸(m-fluoro-DL-phenylalanine)具有抗性的菌株来使用。进而，从该菌株中获取对间氟-L-酪氨酸(m-fluoro-L-tyrosine)具有抗性的菌株来使用。然后，将这些菌株供于以葡萄糖为唯一碳源的需氧条件下的补料分批培养而生产苯酚。
但是，非专利文献I的方法中，苯酚的生产率在实用上不充分。现有技术文献非专利文献非专利文献I:Applied and Environmental Microbiolology, Vol.71, 2005, 8221-8227.
发明内容
发明所要解决的问题本发明的课题在于提供能够以糖类为原料高效地制造苯酚的微生物及使用该微生物、能够以糖类为原料高效地制造苯酚的方法。用于解决问题的手段为了解决上述问题，本发明人反复进行了研究，得到下述发现。(i)棒状细菌对苯酚具有高耐性。(ii)向棒状细菌中导入酪氨酸酚解酶基因而得到的转化体高效地生产苯酚。(iii)该转化体中，存在于宿主棒状细菌的染色体上的预苯酸脱水酶基因和/或苯酚2-单加氧酶基因被破坏或发生缺陷吋，能够更高效地生产苯酚。(iv)该转化体中，DAHP合成酶基因和/或分支酸变位酶基因以比转化前的宿主基因的表达水平高的水平进行表达时，能够更高效地生产苯酚。(V)该转化体在还原条件下的反应液中实质上不增殖的状态下进行反应时，苯酚生产效率比在需氧性的反应液中增殖并反应时高。本发明是基于上述发现而完成的，其提供下述转化体及苯酚的制造方法。第I项.ー种具有苯酚生产能力的转化体，其通过将编码具有酪氨酸酚解酶(tyrosine phenol-lyase)活性的酶的基因导入宿主棒状细菌而得到。第2项.如第I项所述的转化体，其中，编码具有酪氨酸酚解酶活性的酶的基因为成团泛菌(Pantoea agglomerans)来源的基因、布氏朽1檬酸杆菌(Citrobacter braakii)来源的基因、哥本哈根脱亚硫酸菌(Desulfitobacterium hafniense)来源的基因、橙色绿屈接菌(Chloroflexus aurantiacus)来源的基因、点型念珠蓝细菌(Nostoc punctiforme)来源的基因或齿垢密螺旋体(Treponema denticola)来源的基因。第3项.如第I项所述的转化体，其中，编码具有酪氨酸酚解酶活性的酶的基因为下述(a)或(b)的DNA，(a)由序列号36的碱基序列构成的DNA、由序列号39的碱基序列构成的DNA、由序列号42的碱基序列构成的DNA、由序列号45的碱基序列构成的DNA、由序列号48的碱基序列构成的DNA或由序列号51的碱基序列构成的DNA，(b)在严格的条件下与由(a)中任一个碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交且编码具有酪氨酸酚解酶活性的多肽的DNA。
第4项.如第I 3项中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌为存在于其染色体上的下述(c)和/或(d)的基因被破坏或发生缺陷的棒状细菌，(c)编码具有预苯酸脱水酶(prephenate dehydratase)活性的酶的基因，(d)编码具有苯酹2-单加氧酶(phenol2_monooxygenase)活性的酶的基因。
第5项.如第I 4项中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌的下述(e)和/或(f)的代谢基因在宿主中高表达，(e)编码具有 DAHP 合成酶(3-deoxy-D-arabino_heptulosonate7-phosphate (DAHP) synthase，3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸(DAHP)合成酶)活性的酶的基因，(f)编码具有分支酸变位酶(chorismate mutase)活性的酶的基因。第6项.如第I 5项中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌为谷氨酸棒杆菌。第7项.如第6项所述的转化体，其中，宿主谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌R(FERMP-18976)、ATCC13032 或 ATCC13869。第8项.如第6项所述的转化体，其中，宿主谷氨酸棒杆菌为存在于谷氨酸棒杆菌R(FERM P-18976)、ATCC13032或ATCC13869的染色体上的下述(c)和/或(d)的基因被破坏或发生缺陷的谷氨酸棒杆菌，(c)编码具有预苯酸脱水酶(prephenate dehydratase)活性的酶的基因，(d)编码具有苯酹2-单加氧酶(phenol2_monooxygenase)活性的酶的基因。第9项.如第6或8项所述的转化体，其中，宿主谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌R(FERM P-18976)、ATCC13032或ATCC13869中下述(e)和/或(f)的代谢基因高表达的谷氨酸棒杆菌，(e)编码具有 DAHP 合成酶(3-deoxy-D-arabino_heptulosonate7-phosphate (DAHP) synthase)活性的酶的基因，(f)编码具有分支酸变位酶(chorismate mutase)活性的酶的基因。第10项.谷氨酸棒杆菌PHE7 (保藏编号:NITE BP-976)转化体。第11项.一种苯酚的制造方法，其中，包括如下步骤:使第I 10项中任一项所述的转化体在还原条件下、在含有糖类的反应液中反应；以及回收反应液中的苯酹。第12项.如第11项所述的苯酚的制造方法，其中，在反应步骤中，转化体实质上不增殖。第13项.如第11或12项所述的苯酚的制造方法，其中，还原条件下的反应液的氧化还原电位为-200 -500毫伏。第14项.如第11 13项中任一项所述的苯酚的制造方法，其中，糖类为选自由葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、纤维二糖、海藻糖和甘露糖醇组成的组中的糖。发明效果通过使用本发明的转化体，与现有公知的转化体相比，能够由糖类高效率地制造苯酚。一般而言，微生物的增殖会因苯酚这样的溶剂的细胞毒性而受到抑制，因此，难以使用微生物来制造苯酚，但根据本发明方法，能够使用微生物以实用上足够良好的效率来制造苯酹。
图1是表示苯酚对各种微生物在需氧条件下的增殖的影响的图。
图2是表示苯酚对棒状杆菌在还原条件下的糖消耗的影响的图。图3是实施例中使用的各种质粒的构建图。图4是实施例中使用的各种质粒的构建图。
具体实施例方式以下，对本发明进行详细说明。(I)具有苯酚生产能力的转化体本发明的具有苯酚生产能力的转化体为将编码具有酪氨酸酚解酶(tyrosinephenol-lyase)活性的酶的基因导入宿主棒状细菌而得到的转化体。宿丰棒状细菌是BargeysManual of Determinative Bacteriology(伯杰氏系统细菌学手册)，Vol.8，599 (1974)中定义的一组微生物，只要是在通常的需氧条件下增殖的棒状细菌则没有特别限定。如果列举具体例，可以列举棒状杆菌属菌、短杆菌属菌、节杆菌属菌、分枝杆菌属菌、微球菌属菌等。棒状细菌中，优选棒状杆菌属菌。作为棒状杆菌属菌，可以列举谷氨酸棒杆菌、有效棒杆菌(Corynebacteriumefficiens)> 产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、耐盐棒杆菌(Corynebacterium halotolerance)、角军烧棒杆菌(Corynebacterium alkanolyticum)等。其中，从安全且苯酚生产率高的观点出发，优选谷氨酸棒杆菌。作为优选的菌株，可以列举:谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) R 株(FERM P-18976)、ATCC13032 株、ATCC13869 株、ATCC13058 株、ATCC13059 株、ATCC13060 株、ATCC13232 株、ATCC13286 株、ATCC13287 株、ATCC13655 株、ATCC13745 株、ATCC13746 株、ATCC13761 株、ATCC14020 株、ATCC31831 株、MJ-233(FERM BP-1497)、MJ-233AB-41 (FERM BP-1498)等。其中，优选 R 株(FERM P-18976) ,ATCC13032 株、ATCC13869 株。 另外,根据分子生物学的分类,黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、散枝短杆菌(Brevibacterium divaricatum)、百合棒杆菌(Corynebacterium lilium)等棒状细菌的菌名也统一在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中[Liebl, ff.et al.,Transfer of Brevibacteriumdivaricatum DSM20297T, “Brevibacterium flavum” DSM20411，“Brevibacteriumlactofermentum，，DSM20412and DSM1412, and Corynebacterium glutamicum and theirdistinction by rRNA gene restriction patterns.1nt J Syst Bacteriol.41:255-260.(1991)，驹形和男等，棒状细菌的分类，发酵与工业，45:944-963 (1987)]。旧分类的乳糖发酵短杆菌ATCC13869株、黄色短杆菌的MJ-233株(FERMBP-1497)、MJ-233AB-41株(FERM BP-1498)等也是优选的谷氨酸棒杆菌。作为短杆菌属菌，可以列举产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)(例如ATCC6872 株)等。作为节杆菌属菌，可以列举球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)(例如ATCC8010 株、ATCC4336 株、ATCC21056 株、ATCC31250 株、ATCC31738 株、ATCC35698 株)等。作为分枝杆菌属菌，可以列举牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)(例如ATCC19210 株、ATCC27289 株)等。
作为微球菌属菌，可以列举弗氏微球菌(Micrococcus freudenreichii)(例如 N0.239 株(FERM P-13221))、藤黄微球菌(Micrococcus Ieuteus)(例如 N0.240 株(FERM P-13222))、服微球菌(Micrococcus ureae)(例如 IAM1010 株)、玫瑰色微球菌(Micrococcus roseus)(例如 IF03764 株)等。另外，除了野生株以外，棒状细菌也可以是其突变株或人工的基因重组体。可以列举例如乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyrvate carboxylase)、苹果酸脱氧酶(malate dehydrogenase)等的基因的破坏株。通过使用这种基因破坏株作为宿主，能够提高苯酚的生产率或抑制副产物的生成。其中，优选乳酸脱氢酶基因的破坏株。该基因破坏株中，乳酸脱氢酶基因被破坏，由此使丙酮酸至乳酸的代谢途径被阻断。其中，优选谷氨酸棒杆菌的乳酸脱氢酶基因的破坏株，特别是谷氨酸棒杆菌R(FERM P-18976)株的乳酸脱氢酶基因的破坏株。这种基因破坏株可以通过基因工程的方法按照常规方法来制作。例如，W02005/010182A1中记载了乳酸脱氢酶破坏株及其制作方法。酪氨酸酚解酶基因(tpl)酪氨酸酚解酶为催化下述两个反应的酶。酪氨酸+H2Oe苯酚+丙酮酸+NH3
儿茶酚 + 丙酮酸 +NH3 — L-D0PA+H20编码具有酪氨酸酚解酶活性的酶的基因的来源没有特别限定，优选成团泛菌(Pantoea agglomerans)来源的基因、布氏朽1檬酸杆菌(Citrobacter braakii)来源的基因、哥本哈根脱亚硫酸菌(Desulfitobacterium hafniense)来源的基因、橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)来源的基因、点型念珠蓝细菌(Nostoc punctiforme)来源的基因、齿垢密螺旋体(Trep onema denticola)来源的基因。其中，优选成团泛菌来源的基因、布氏柠檬酸杆菌来源的基因或哥本哈根脱亚硫酸菌来源的基因，更优选布氏柠檬酸杆菌来源的基因。作为成团泛菌来源的酪氨酸酚解酶基因，可以列举由序列号36的碱基序列构成的DNA，作为布氏柠檬酸杆菌来源的酪氨酸酚解酶基因，可以列举由序列号39的碱基序列构成的DNA，作为哥本哈根脱亚硫酸菌来源的酪氨酸酚解酶基因，可以列举由序列号42的碱基序列构成的DNA，作为橙色绿屈挠菌来源的酪氨酸酚解酶基因，可以列举由序列号45的碱基序列构成的DNA，作为点型念珠蓝细菌来源的酪氨酸酚解酶基因，可以列举由序列号48的碱基序列构成的DNA，作为齿垢密螺旋体来源的酪氨酸酚解酶基因，可以列举由序列号51的碱基序列构成的DNA。另外，本发明中，也可以使用在严格的条件下与由序列号36、39、42、45、48或51的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交且编码具有酪氨酸酚解酶活性的多肽的DNA。本发明中，“严格的条件”是指一般的条件、例如Molecular Cloning, A LaboratoryManual (分子克隆实验指南)，第二版，1989，Vol2, pll.45中记载的条件。具体而言,是指在比完全杂交的解链温度(Tm)低5 10°C的温度下发生杂交的情况。酪氨酸酚解酶活性可以利用后述的实施例3中记载的方法测定。另外，本发明中，也可以使用由与序列号36、39、42、45、48或51的碱基序列具有90%以上的同一性、优选具有95%以上的同一性、更优选具有98%以上的同一性的碱基序列构成且编码具有酪氨酸酚解酶活性的多肽的DNA。碱基序列的同一性是利用GENETYX第8版(GENETYX株式会社七^ r ^ ^ ^制造)算出的值。由序列号36、39、42、45、48或51的碱基序列构成的DNA的同源物可以通过例如使用基于这些碱基序列按照常规方法设计的引物或探针的PCR或杂交由其他生物种的DNA文库中选择，由此以高概率得到编码具有酪氨酸酚解酶活性的多肽的DNA。用于转化的载体的构建将通过PCR扩增得到的编码酪氨酸酚解酶的DNA克隆到能够在宿主中扩增的适当的载体中即可。作为质粒载体，只要是包含在棒状细菌内担负自主复制功能的基因的质粒载体即可。作为其具体例，可以列举:乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum) 2256来源的 pAM330[日本特开昭 58-67699]、[Miwaj K.et al.,Cryptic plasmids inglutamic acid-producing bacteria.Agric.Biol.Chem.48:2901-2903 (1984)]和[Yamaguchi，R.et al.，Determination of the complete nucleotide sequence ofthe Brevibacterium lactofermentum plasmid pAM330and the analysis of itsgenetic information.Nucleic Acids Symp.Ser.16:265-267(1985)]、谷氨酸棒杆菌 ATCC13058 来源的 pHM1519[Miwa，K.et al.,Cryptic plasmids in glutamicacid-producing bacteria.Agric.Biol.Chem.48:2901-2903 (1984)]和pCRY30 [Kurusu，Y.et al.，Identification of plasmid partition function in coryneform bacteria.App1.Environ.Microbiol.57:759-764(1991)]、谷氨酸棒杆菌 T250 来源的 pCG4[日本特开昭 57-1837 99]、[Katsumata, R.et al., Protoplast transformation ofglutamate-producing bacteria with plasmid DNA.J.Bacteriol.、159:306-311(1984)]、pAGl、pAG3、pAG14、pAG50 [日本特开昭 62-166890]、pEKO、pEC5、pEKExl [Eikmanns，B.J.etal., A family of Corynebacterium glutamicum/Escherichia coli shuttle vectors forcloning,controlled gene expression,and promoter probing.Gene, 102:93-98(1991)]
坐寸ο作为优选的启动子，可以列举谷氨酸棒杆菌R来源的甘油醛-3-磷酸脱氢酶A基因(gapA)的启动子PgapA、苹果酸脱氢酶基因(mdh)的启动子Pmdh、乳酸脱氢酶A基因(IdhA)的启动子PldhA等,其中，优选PgapA。作为优选的终止子，可以列举大肠杆菌rRNA操纵子的rrnB T1T2终止子、大肠杆菌的trpA终止子、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)的trp终止子等，其中，优选rrnB TIT2终止子。MiL转化方法可以没有限制地使用公知的方法。作为这样的公知的方法，可以列举例如氯化钙/氯化铷法、磷酸钙法、DEAE-葡聚糖介导的转染、电穿孔法等。其中，对于棒状细菌优选电脉冲法，电 脉冲法可以通过公知的方法[Kurusu, Y.et al.，Electroporation-transformation system for Coryneform bacteria by auxotrophiccomplementation.Agric.Biol.Chem.54:443-447 (1990)]和[Vertes A.A.etal., Presence of mrr-and mcr-like restriction systems in Coryneform bacteria.Res.Microbiol.144:181-185(1993)]进行。转化体使用微生物的培养中通常使用的培养基进行培养即可。作为该培养基，通常可以使用含有碳源、氮源、无机盐类及其他营养物质等的天然培养基或合成培养基等。作为碳源，可以列举:葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖、麦芽糖、甘露糖醇、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、淀粉、糖蜜、山梨糖醇、甘油等糖质或糖醇；乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、马来酸或葡糖酸等有机酸；乙醇、丙醇等醇等。另外，还可以根据期望使用正链烷烃等烃等。碳源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。培养基中的这些碳源的浓度通常设定为约0.1 约10 (w/v%)即可。作为氮源，可以列举:氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵等无机铵化合物或有机铵化合物、尿素、氨水、硝酸钠、硝酸钾等。另外，也可以使用玉米浆、肉提取物、蛋白胨、NZ-胺、蛋白质水解物、氨基酸等含氮有机化合物等。氮源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。培养基中的氮源浓度因使用的氮化合物而异，通常设定为约0.1 约10(w/v%)即可。作为无机盐类，可以列举例如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴或碳酸钙等。这些无机盐可以单独使用一种或者两种以上混合使用。培养基中的无机盐类浓度因使用的无机盐而异，通常设定为约0.01 约I (w/v%)即可。作为营养物质，可以列举例如肉提取物、蛋白胨、多聚蛋白胨、酵母提取物、干酵母、玉米浆、脱脂奶粉、脱脂大豆盐酸水解物或者动植物或微生物菌体的提取物或它们的分解物等。营养物质的培养基浓度因使用的营养物质而异，通常设定为约0.1 约10(w/v%)即可。另外，还可以根据需要添加维生素类。作为维生素类，可以列举例如生物素、硫胺素(维生素BI)、吡哆醇(维生素B6)、泛酸、肌醇、尼克酸等。培养基的pH优选约5 约8。作为优选的微生物培养培养基，可以列举A培养基[Inui, M.et al., Metabolicanalysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinateproductions under oxygen deprivation conditions.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.7:182-196(2004)]、BT 培养基[Omumasaba, C.A.et al., Corynebacteriumglutami cum glyceraldehyde — 3-phosphate dehydrogenase isoforms withopposite, ATP-dependent regulation.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8:91-103(2004)]
坐寸ο培养温度设定为约15°C 约45°C即可，培养时间设定为约I天 约7天即可。宿主染色体基因的破坏或缺失宿主棒状细菌中，优选存在于其染色体上的编码具有预苯酸脱水酶(prephenate dehydratase)活性的酶的基因(pheA)和/或编码具有苯酹2_单加氧酶(phenol2-monooxygenase)活性的酶的基因(poxF)被破坏或发生缺失，由此能够更高效地制造苯酹。更优选pheA和poxF均被破坏或均发生缺失。制作以使基因的部分序列缺失而不产生正常发挥功能的酶蛋白的方式进行改变后的缺失型基因，利用包含该基因的DNA转化细菌，在缺失型基因与染色体上的基因之间引起同源重组，由此能够将染色体上的基 因置换成缺失型或破坏型的基因。由缺失型或破坏型的基因编码的酶蛋白即使生成也具有与野生型酶蛋白不同的立体结构，功能降低或消失。由这种利用同源重组的基因置换所致的基因缺失或破坏方法已经确立，有:使用包含温度敏感性复制起点的质粒、能够进行接合转移的质粒的方法；利用在宿主内不具有复制起点的自杀载体的方法等(美国专利第6303383号、日本特开平05-007491号)。具体而言，通过实施例2的项目中记载的方法，能够得到预苯酸脱水酶基因、苯酚2-单加氧酶基因被破坏或缺失的棒状细菌。代谢基因的_表达宿主棒状细菌中，优选DAHP 合成酶(3-deoxy-D-arabino_heptulosonate7-phosphate (DAHP) synthase)基因(aroG)和 / 或分支酸变位酶(chorismate mutase)基因(csm)以比宿主本来的水平、即野生型宿主的水平高的水平进行表达。该高表达通过增加利用转化的基因导入或宿主染色体上的基因的拷贝数来实现。更优选aroG和csm均进行高表达。对转化进行说明，导入的DAHP合成酶基因和分支酸变位酶基因可以是与宿主的基因相同或实质上相同的DAHP合成酶基因和分支酸变位酶基因，也可以是其他的DAHP合成酶基因和分支酸变位酶基因。优选导入与宿主的基因相同或实质上相同的DAHP合成酶基因和/或分支酸变位酶基因。例如，作为谷氨酸棒杆菌来源的DAHP合成酶基因，可以列举由序列号30的碱基序列构成的DNA，作为谷氨酸棒杆菌来源的分支酸变位酶基因，可以列举由序列号31的碱基序列构成的DNA。作为其他的棒状细菌的DHAP合成酶基因，有:有效棒杆菌(Corynebacteriumefficiens)来源的基因(序列号62，日本DNA数据库:CE2073)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)来源的基因(序列号63,日本DNA数据库:MSMEG_4244)、混池红球菌(Rhodococcus opacus)来源的基因(序列号64,日本DNA数据库:R0P_08400)等，作为分支酸变位酶基因，有:有效棒杆菌来源的基因(序列号65，日本DNA数据库:CE0929)、耻垢分枝杆菌来源的基因(序列号66，日本DNA数据库:MSMEG_5536)、混浊红球菌来源的基因(序列号67，日本DNA数据库:R0P_56380)等。另外，关于DAHP合成酶基因或分支酸变位酶基因，“实质上相同的基因”可以列举编码与该基因所编码的多肽的氨基酸序列具有90%以上的同一性、优选具有95%以上的同一性、更优选具有98%以上的同一性且具有DAHP合成酶活性或分支酸变位酶活性的多肽的DNA。另外，关于DAHP合成酶基因或分支酸变位酶基因，“实质上相同的基因”可以列举与该基因具有90%以上的同一性、优选具有95%以上的同一性、更优选具有98%以上的同一性且编码具有DAHP合成酶活性或分支酸变位酶活性的多肽的DNA。
DAHP合成酶活性的有无可以通过以磷酸烯醇式丙酮酸和赤藻糖-4-磷酸为底物进行反应并利用使用硫代巴比妥酸的显色法对生成的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸(DAHP)进行定量(Appl.Environ.Microbiol., 74:5497-5503 (2008).)来检测。另外，对于分支酸变位酶活性的有无，可以在以分支酸为底物进行反应后，利用终浓度为0.67Ν的盐酸将生成的预苯酸(prephenate)转换为苯丙酮酸(phenylpyruvate)(温育约10分钟)，然后基于320nm的吸光度增加(苯丙酮酸的生成)进行检测(Microbiology.，155，3382-3391 (2009).)。对提高宿主染色体上的DAHP合成酶基因或分支酸变位酶基因的拷贝数的方法进行说明，只要以多拷贝在棒状细菌的染色体DNA上导入这些基因即可。为了在微生物的染色体DNA上以多拷贝导入基因，可以利用以多拷贝存在于染色体DNA上的序列作为标靶，并利用同源重组法(Experiments in Molecular Genetics (分子遗传学实验)，冷泉港实验室(1972))进行。作为以多拷贝存在于染色体DNA上的序列，可以利用重复DNA、存在于转移因子的端部的反向重复序列。另外，也可以如日本特开平2-109985号公报中公开的那样，使目的基因与转座子一同发生转移而以多拷贝导入到染色体DNA上。此外，还可以通过使用Mu噬菌体的方法(日本特开平2-109985号)将目的基因重组到宿主染色体中。另外，也可以通过将棒状细菌的染色体上的DAHP合成酶基因和/或分支酸变位酶基因的启动子等表达调节序列转换成更强的表达调节序列来提闻这些基因的表达。例如，作为强启动子，已知tac启动子、Iac启动子、trc启动子、trp启动子等。另外，也可以如国际公开W000/18935中公开的那样，向基因的启动子区导入数个碱基的碱基置换而将其改变成更强的启动子。启动子强度的评价方法和强启动子的例子记载在Goldstein等的论文(Prokaryotic promoters in biotechnology.Biotechnol.Annu.Rev., 1995, I, 105-128)等中。表达调节序列的置换例如可以与使用温度敏感性质粒的基因置换同样地进行。此外，已知核糖体结合位点(RBS)与起始密码子之间的间隔区、特别是紧靠起始密码子的上游的序列中的数个核苷酸的置换会给mRNA的翻译效率带来非常大的影响，通过改变这些序列，也能够提高翻译量。作为进行上述基因置换的方法，例如有使用包含温度敏感性复制起点的质粒、能够进行接合转移的质粒的方法；利用在宿主内不具有复制起点的自杀载体的方法等(美国专利第6303383号说明书或日本特开平05-007491号公报)。(II)苯酷的制造方 法可以通过包括使上述说明过的本发明的转化体在还原条件下、在含有糖类的反应液中反应的步骤以及回收反应液中的苯酚的步骤的方法来制造苯酚。微牛物的增葙在反应之前，优选将转化体在需氧条件下在约25°C 约38°C的温度下培养约12小时 约48小时而使其增殖。培养用培养基反应之前的转化体的需氧培养中使用的培养基可以使用含有碳源、氮源、无机盐类及其他营养物质等的天然培养基或合成培养基。作为碳源，也可以使用:糖类(葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖等单糖；蔗糖、麦芽糖、乳糖、纤维二糖、木二糖、海藻糖等二糖；淀粉等多糖；糖蜜等);甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、甘油等糖醇；乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、马来酸、葡糖酸等有机酸；乙醇、丙醇等醇；正链烷烃等烃等。碳源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。作为氮源，可以使用氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵等无机铵或有机铵化合物、尿素、氨水、硝酸钠、硝酸钾等。另外，也可以使用玉米浆、肉提取物、蛋白胨、NZ-胺、蛋白质水解物、氨基酸等含氮有机化合物等。氮源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。氮源在培养基中的浓度因使用的氮化合物而异，通常设定为约0.1 约10(w/v%)即可。作为无机盐类，可以列举磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴、碳酸钙等。无机盐可以单独使用一种或者两种以上混合使用。无机盐类在培养基中的浓度因使用的无机盐而异，通常设定为约0.0l 约I (w/v%)即可。作为营养物质，可以列举肉提取物、蛋白胨、多聚蛋白胨、酵母提取物、干酵母、玉米浆、脱脂奶粉、脱脂大豆盐酸水解物、动植物或微生物菌体的提取物或它们的分解物等。营养物质在培养基中的浓度因使用的营养物质而异，通常设定为约0.1 约10(w/v%)即可。还可以根据需要进一步添加维生素类。作为维生素类，可以列举生物素、硫胺素(维生素BI)、吡哆醇(维生素B6)、泛酸、肌醇、尼克酸等。培养基的pH优选约6 约8。作为具体的优选的棒状细菌用培养基，可以列举A培养基[Inui，M.etal.,Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate andsuccinate productions under oxygen deprivation conditions.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.7:182-196(2004)]、BT 培养基[Omumasaba, C.A.et al., Corynebacteriumglutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms withopposite,ATP-dependent regulation.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8:91-103(2004)]等。这些培养基中，使糖类浓度在上述范围内来使用即可。反应液作为反应液，可以使用含有碳源、氮源、无机盐类及其他营养物质等的天然培养基或合成培养基。作为碳源，使用糖类。作为糖类，可以列举葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖等单糖；蔗糖、麦芽 糖、乳糖、纤维二糖、木二糖、海藻糖等二糖；淀粉等多糖；糖蜜等。其中，优选单糖，更优选葡萄糖。作为碳源，除了可以使用糖类以外，也可以使用甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、甘油等糖醇；乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、马来酸、葡糖酸等有机酸；乙醇、丙醇等醇；正链烷烃
寸工寸ο碳源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。反应液中的糖类的浓度优选约I 约20 (w/v%),更优选约2 约10 (w/v%),进一步优选约2 约5 (w/v%)。另外，包括糖类在内的全部碳源在反应液中的浓度通常设定为约2 约5(w/v%)即可。作为氮源，可以使用氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵等无机铵或有机铵化合物、尿素、氨水、硝酸钠、硝酸钾等。另外，也可以使用玉米浆、肉提取物、蛋白胨、NZ-胺、蛋白质水解物、氨基酸等含氮有机化合物等。氮源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。氮源在反应液中的浓度因使用的氮化合物而异，通常设定为约0.1 约10(w/v%)即可。作为无机盐类，可以列举磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴、碳酸钙等。无机盐可以单独使用一种或者两种以上混合使用。无机盐类在反应液中的浓度因使用的无机盐而异，通常设定为约0.01 约l(w/v%)即可。作为营养物质，可以列举肉提取物、蛋白胨、多聚蛋白胨、酵母提取物、干酵母、玉米浆、脱脂奶粉、脱脂大豆盐酸水解物、动植物或微生物菌体的提取物或它们的分解物等。营养物质在反应液中的浓度因使用的营养物质而异，通常设定为约0.1 约10(w/v%)即可。还可以根据需要进一步添加维生素类。作为维生素类，可以列举生物素、硫胺素(维生素BI)、吡哆醇(维生素B6)、泛酸、肌醇、尼克酸等。反应液的pH优选约6 约8。作为具体的优选的棒状细菌用培养基，可以列举前述的A培养基、BT培养基等。这些培养基中，使糖类浓度在上述范围内来使用即可。反应条件反应温度即转化体的存活温度优选约20°C 约50°C，更优选约25°C 约47°C。如果为上述温度范围，则能够高效地制造苯酚。另外，反应时间优选约I天 约7天，更优选约I天 约3天。培养可以是分批培养、流加培养、连续培养中的任何一种。其中，优选分批培养。反应可以在需氧条件下进行，也可以在还原条件下进行。<还原备件>在还原条件下，棒状细菌实质上不增殖，因而能够更高效地生产苯酚。还原条件由反应液的氧化还原电位规定。反应液的氧化还原电位优选约-200mV 约-500mV，更优选约_250mV 约_500mV。反应液的还原状态可以利用刃天青指示剂(在还原状态下由蓝色脱色为无色)简单地推测，使用氧化还原电位差计(例如，BROADLEY JAMES公司制造，ORP电极)可以准确地测定。处于还原条件下的反应液的制备方法可以没有限制地使用公知的方法。例如，可以使用反应液用水溶液代替蒸馏水等作为反应液的液体介质，反应液用水溶液的制备方法参考例如硫酸还原微生物等绝对厌氧性微生物用的培养液制备方法(Pfennig, Net.al.(1981):The dissimilatory sulfate-reducing bacteria, In The Prokaryotes, AHandbook on Habitats, Isolation and Identification of Bacteria, Ed.by Starr, M.P.et.al.p.926-940, Berlin, Springer Verlag.)或“农艺化学实验书第三卷、京都大学农学部农艺化学教室编、1990年第26次印刷、产业图书株式会社出版”等，能够得到期望的还原条件下的水溶液。具体而言，可以通过对蒸馏水等进行加热处理或减压处理将溶解气体除去而得到还原条件的反应液用水溶液。在这种情况下，可以通过在约IOmmHg以下、优选约5mmHg以下、更优选约3mmHg以下的减压条件下将蒸懼水等处理约I分钟 约60分钟、优选约5分钟 约40分钟来将溶解气体、特别是溶解氧除去而得到还原条件下的反应液用水溶液。另外，也可以添加适当的还原剂(例如，硫代乙醇酸、抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、巯基乙酸、硫代乙酸、谷胱甘肽、硫化钠等)来制备还原条件的反应液用水溶液。将上述方法适当组合而成的方法也是有效的还原条件的反应液用水溶液的制备方法。反应中也优选将反应液维持 于还原条件。为了维持反应过程中的还原条件，优选尽可能地防止从反应体系外混入氧，具体而言，可以列举将反应体系封入氮气等惰性气体或二氧化碳等中的方法。作为更有效地防止氧混入的方法，为了在反应过程中使本发明的需氧性细菌的菌体内的代谢功能高效地发挥作用，有时也需要添加维持反应体系的PH的调节液或适当添加各种营养素溶解液，在这种情况下，预先从添加溶液中除去氧是有效的。苯酚的回收通过以上述方式进行培养，在反应液中生产出苯酚。可以通过回收反应液来回收苯酚，也可以进一步利用公知的方法从反应液中分离出苯酚。作为这种公知的方法，可以列举蒸馏法、膜透过法、有机溶剂提取法等。实施例以下，利用实施例更详细地说明本发明，但本发明不受这些实施例的限定。实施例1作为苯酚生产用宿主的适性试验:苯酚对谷氨酸棒杆菌及其他种类菌体的影响(I)苯酚对需氧增殖的影响对谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌和恶臭假单胞菌进行需氧培养中的苯酚的生长抑制试验。另外，本试验中使用的恶臭假单胞菌S12作为耐溶剂性菌进行了报道，并公开了迄今为止唯一作为苯酚生产的宿主使用的技术。将谷氨酸棒杆菌R涂布在A琼脂培养基[将(NH2) 2C02g、(NH4) 2S047g、KH2P040.5g、K2HPO40.5g、MgSO4.7Η200.5g、0.06% (w/v) Fe2SO4.7H20+0.042% (w/v) MnSO4.2H201ml、0.02% (w/v)生物素溶液Iml、0.01% (w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、维生素分析酪蛋白水解物7g、葡萄糖40g、琼脂15g悬浊于IL蒸馏水中]上，在33°C下于暗处静置15小时。将一钼环的上述培养皿中生长的谷氨酸棒杆菌R接种到装有IOmlA液体培养基[将(NH2) 2C02g、(NH4) 2S047g、KH2PO40.5g、K2HPO40.5g、MgSO4.7Η200.5g、0.06% (w/v)Fe2SO4.7H20+0.042%(w/v) MnSO4.2H201ml、0.02%(w/v)生物素溶液 lml,0.01%(w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、维生素分析酪蛋白水解物7g、葡萄糖40g溶解于IL蒸馏水中]的试管中，在33°C下在需氧条件下进行13小时的振荡培养。将上述条件下生长的谷氨酸棒杆菌R接种到100ml A液体培养基中以使初始菌体浓度OD61tl为0.05，同时添加苯酚使终浓度为OmM、0.16mM、0.2mM、0.24mM、0.32mM，并在33°C下在需氧条件下进行振荡培养。菌体的生长通过测定OD61tl的吸光度来进行。将大肠杆菌JM109涂布在LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上，在37°C下于暗处静置15小时。将一钼环的上述培养皿中生长的大肠杆菌JM109接种到装有IOmlLB液体培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物和0.5%氯化钠]的试管中，在37°C下在需氧条件下进行13小时的振荡培养。将上述条件下生长的大肠杆菌JM109接种到IOOml LB液体培养基中以使初始菌体浓度OD61tl为0.05，同时添加苯酚使苯酚的终浓度为0mM、0.16mM、0.20mM,并在37°C下在需氧条件下进行振荡培养。菌体的生长通过测定OD61tl的吸光度来进行。将恶臭假单胞菌Fl和S12涂布在LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上，在30°C下于暗处静置15小时。将一钼环的上述培养皿中生长的恶臭假单胞菌Fl和S12接种到装有IOml LB (+葡萄糖)液体培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和0.4%葡萄糖]的试管中，在30°C下在需氧条件下进行13小时的振荡培养。将上述条件下生长的恶臭假单胞菌Fl和S12株接种到IOOml LB (+葡萄糖)液体培养基中以使初始菌体浓度OD61tl为0.05，同时添加苯酚使苯酚的终浓度为0mM、0.1OmM,0.20mM,并在30°C下在需氧条件下进行振荡培养。菌体的生长通过测定OD61tl的吸光度来进行。向培养基中添加苯酚对需氧增殖的影响的分析结果示于图1中。图1的纵轴为od61(i。对于大肠杆菌而言，在0.16%的苯酚存在下增殖显著受到抑制，在0.20%的苯酚存在下增殖完全被抑制。恶臭假单胞菌Fl和作为耐溶剂性菌被报道的恶臭假单胞菌S12显示出基本相同的倾向，在0.10%的苯酚存在下增殖显著受到抑制，在0.20%的苯酚存在下增殖完全被抑制。与此相对，谷氨酸棒杆菌即使在使大肠杆菌的增殖受到显著抑制的0.16%的苯酚存在下对增殖也几乎没有影响，即使在使大肠杆菌和恶臭假单胞菌的增殖完全被抑制的0.20%的苯酚存在下也显示出良好的生长。而且在0.24%的苯酚存在下能够增殖。由此表明，谷氨酸棒杆菌与大肠杆菌和恶臭假单胞菌相比对苯酚具有高耐性，作为苯酚生产的宿主具有高适性。(2)苯酚对还原条件下的糖代谢的影响将谷氨酸棒杆菌R涂布在A琼脂培养基上，在33°C下于暗处静置20小时。将一钼环的上述培养皿中生长的谷氨酸棒杆菌R接种到装有IOmlA液体培养基的试管中，在33°C下在需氧条件下进行15小时的振荡培养。将上述条件下生长的谷氨酸棒杆菌R接种到装有500ml A液体培养基的容量为2L的三角烧瓶中，在33°C下在需氧条件下进行15小时的振荡培养。通过离心分离(4°C、5000g、15分钟)回收以上述方式培养增殖的菌体。将所得到的菌体以10w/v%悬浊于BT (-尿素)液体培养基
中。将60ml的该各菌体悬浊液装入容量为IOOml的培养瓶中，在还原条件下(氧化还原电位:-450mV)添加8%的葡萄糖,并添加苯酹使苯酚浓度为0mM、0.24mM、0.38mM、0.46mM，在保持于33°C的水浴中边搅拌边反应。此时，在使用2.5N的氨水并利用pH控制器(工4 O株式会社制造，型号:DT-1023)进行控制以使反应液的PH不低于7.0的同时进行反应。将苯酚对谷氨酸棒杆菌R在还原条件下的糖代谢的影响的研究结果示于图2中。在还原条件下，即使是在需氧培养中观察到增殖抑制的0.24%的苯酚存在下也完全未观察到苯酚的影响，显示出与未添加苯酚时同等的糖消耗。而且，即使在0.38%的苯酚存在下也观察到糖消耗，即使在0.46%的苯酚存在下也显示出少量的糖消耗。由此表明，与需氧培养相比，谷氨酸棒杆菌R在还原条件下对苯酚显示出高耐性，还原条件下的以谷氨酸棒杆菌为宿主的苯酚生产比需氧条件下的生产更优越。实施例2苯酚生产基因的克隆与表达(I)从微牛物中提取染色体DNA从谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum) R(FERM P-18976)中提取染色体 DNA 的操作如下进行:向 A 培养基[ 将(NH2) 2C02g、(NH4) 2S047g、KH2PO40.5g、K2HPO40.5g、MgSO4.7Η200.5g、0.06% (w/v) Fe2SO4.7H20+0.042% (w/v) MnSO4.2H201ml、0.02% (w/v)生物素溶液1ml、0.01% (w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、维生素分析酪蛋白水解物7g溶解于IL蒸馏水中]中添加最终浓度为4%的50%(w/v)葡萄糖溶液作为碳源，使用钼环接种后，在33°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名:GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒,安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从成团泛菌(Pantoea agglomerans)NBRC12686中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到NBRC Medium N0.802培养基[将多聚蛋白胨10g、酵母提取物2g、MgSO4.7H201g溶解于IL蒸馏水中]中后，在30°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名=GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒,安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从布氏朽1檬酸杆菌(Citrobacter braakii)ATCC6750中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到营养肉汤培养基(BD公司制造的BD234000)中后，在37°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名KenomicPriip细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从哥本哈根脱亚硫酸菌(Desulfitobacterium hafniense) Y51中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到MMYP培养基[将K2HP047.8g、KH2P04l.2g、柠檬酸钠0.5g、MgSO4.7H200.lg、酵母提取物2.0g、丙酮酸钠5.5g、刃天青钠盐1.0mg溶解于IL蒸懼水中并调节PH至7.2]中后，进行厌氧培养，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名:GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒,安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从澄色绿屈接菌(Chloroflexusaurantiacus J-10-fl) ATCC29366 中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到绿屈挠菌培养基[次氮基三乙酸0.lg、微量营养素溶液 1.0ml、FeCl3 溶液 1.0m UCaSO4.2H200.06g、MgSO4.7Η200.lg、NaC10.008g、KNO30.103g、NaNO30.689g、Na2HP040.1llg^NH4Cl0.2g、酵母提取物 0.5g、甘氨酰甘氨酸 0.5g 溶解于 IL 蒸馏水中；微量营养素溶液:将 H2SO40.5ml、MnSO4.7Η202.28g、ZnSO4.7Η200.5g、H3BO30.5g、CuSO4.2H200.025g、Na2MoO4.2H200.025g、CoCl2.6H200.045g 溶解于 IL 蒸馏水中；FeCl3 溶液JfFeCl30.2905g溶解于IL蒸馏水中)]中后，进行钨灯照射并在50°C下振荡培养，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名AenomicPr印细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从哥本哈根脱亚硫酸菌(Desulfitobacterium hafniense) Y51中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到MMYP培养基[将K2HP047.8g、KH2P04l.2g、柠檬酸钠0.5g、MgSO4.7H200.lg、酵母提取物2.0g、丙酮酸钠5.5g、刃天青钠盐1.0mg溶解于IL蒸懼水中并调节PH至7.2]中后，进行厌氧培养，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名:GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒,安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从点型念珠蓝细菌(Nostoc punctiforme)ATCC29133中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到固氮蓝藻(Blue-green nitrogen-fixing)培养基[将K2HPO40.04g、MgSO4.7Η200.075g、CaCl2.2Η200.036g、柠檬酸 6.0mg、柠檬酸铁铵 6.0mg、EDTA1.0mg^Na2CO30.02g、痕量金属混合物A51.0ml溶解于IL蒸馏水中并调节pH至7.1 ;痕量金属混合物 A5 JfH3B032.86g、MnCl2.4Η201.81g、ZnS04.7Η200.222g,Na2MoO4.2Η200.39g、CuSO4.5Η200.079g、Co (NO3)2.6Η2049.4mg溶解于IL蒸馏水中]中后，进行光照射(2000 3000勒克斯)并在26 °C下培养，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名:GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒,安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。齿垢密螺旋体(Tr印onema denticola) JCM8153 的染色体 DNA (目录号 RDB6217)从独立行政法人理化学研究所获得。
_1] (2)克隆载体的构建克降载体DCRB22的构律通过以下的PCR法对分别包含乳酪棒杆菌JCMl2072来源的质粒pCASEl的DNA复制起点(以下记作pCASEl-ori)序列和克隆载体pHSG298 (宝生物株式会社制造)的DNA片段进行扩增。进行PCR时，为了分别将pCASEl-ori序列、克隆载体pHSG298克隆化，基于序列号I (pCASEl-ori序列)、序列号2 (克隆载体-pHSG298)分别合成下述一对引物来使用。pCASEl-ori序列扩增用引物(a-1):5，-AT AGATCT AGAACGTCCGTAGGAGC-3，(序列号 3)(b-Ι):5’ -AT AGATCT GACTTGGTTACGATGGAC-3’(序列号 4)另外，引物(a-Ι)和(b-Ι)上附加有BglII限制性内切酶位点。
克隆载体pHSG298扩增用引物(a-2):5，-AT AGATCT AGGITTCCCGACTGGAAAG-3’(序列号 5)(b-2):5，-AT AGATCT CGTGCCAGCTGCATTAATGA-3’(序列号 6)另外，引物(a-2)和(b-2)上附加有BglII限制性内切酶位点。模板DNA使用提取自由日本微生物保藏中心(JCM)获得的乳酪棒杆菌JCM12072的总DNA和克隆载体pHSG298 (宝生物株式会社制造)。实际的PCR中，使用热循环仪GeneAmp PCR系统9700 (应用生物系统公司制造)，并使用TaKaRa LA Taq(宝生物株式会社制造)作为反应试剂在下述的条件下进行。反应液:
权利要求
1.一种具有苯酚生产能力的转化体，其通过将编码具有酪氨酸酚解酶活性的酶的基因导入宿主棒状细菌而得到。
2.按权利要求1所述的转化体，其中，编码具有酪氨酸酚解酶活性的酶的基因为成团泛菌(Pantoea agglomerans)来源的基因、布氏朽1樣酸杆菌(Citrobacter braakii)来源的基因、哥本哈根脱亚硫酸菌(Desulfitobacterium hafniense)来源的基因、橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)来源的基因、点型念珠蓝细菌(Nostoc punctiforme)来源的基因或齿垢密螺旋体(Treponema denticola)来源的基因。
3.按权利要求1所述的转化体，其中，编码具有酪氨酸酚解酶活性的酶的基因为下述(a)或(b)的 DNA， (a)由序列号36的碱基序列构成的DNA、由序列号39的碱基序列构成的DNA、由序列号42的碱基序列构成的DNA、由序列号45的碱基序列构成的DNA、由序列号48的碱基序列构成的DNA或由序列号51的碱基序列构成的DNA， (b)在严格的条件下与由(a)中任一个碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交且编码具有酪氨酸酚解酶活性的多肽的DNA。
4.按权利要求1 3中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌为存在于其染色体上的下述(c)和/或(d)的基因被破坏或发生缺陷的棒状细菌， (c)编码具有预苯酸脱水酶活性的酶的基因， (d)编码具有苯酚2-单加氧酶活性的酶的基因。
5.按权利要求1 4中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌的下述(e)和/或(f)的代谢基因在宿主中高表达， (e)编码具有DAHP合成酶即3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸合成酶活性的酶的基因， (f)编码具有分支酸变位酶活性的酶的基因。
6.按权利要求1 5中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌为谷氨酸棒杆菌。
7.按权利要求6所述的转化体，其中，宿主谷氨酸棒杆菌是保藏编号为FERMP-18976的谷氨酸棒杆菌R、ATCC13032或ATCC13869。
8.按权利要求6所述的转化体，其中，宿主谷氨酸棒杆菌是存在于保藏编号为FERMP-18976的谷氨酸棒杆菌R、ATCC13032或ATCC13869的染色体上的下述(c)和/或(d)的基因被破坏或发生缺陷的谷氨酸棒杆菌， (c)编码具有预苯酸脱水酶活性的酶的基因， (d)编码具有苯酚2-单加氧酶活性的酶的基因。
9.按权利要求6或8所述的转化体，其中，宿主谷氨酸棒杆菌是保藏编号为FERMP-18976的谷氨酸棒杆菌R、ATCC13032或ATCC13869中下述(e)和/或(f)的代谢基因高表达的谷氨酸棒杆菌， (e)编码具有DAHP合成酶活性的酶的基因， (f)编码具有分支酸变位酶活性的酶的基因。
10.氨酸棒杆菌PHE7转化体，其保藏编号为NITEBP-976。
11.一种苯酚的制造方法，其中，包括如下步骤:使权利要求1 10中任ー项所述的转化体在还原条件下、在含有糖类的反应液中反应；以及回收反应液中的苯酹。
12.按权利要求11所述的苯酚的制造方法，其中，在反应步骤中，转化体实质上不增殖。
13.按权利要求11或12所述的苯酚的制造方法，其中，还原条件下的反应液的氧化还原电位为-200 -500毫伏。
14.按权利要求11 13中任一项所述的苯酹的制造方法,其中,糖类为选自由葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、纤维ニ糖、海藻糖和甘露糖醇组成的组中的糖。
全文摘要
将编码具有酪氨酸酚解酶(tyrosine phenol-lyase)活性的酶的基因导入宿主谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)而得到的、具有苯酚生产能力的转化体能够以糖类为原料高效地制造苯酚。具体而言，优选包括下述步骤的方法使该转化体在还原条件下、在含有糖类的反应液中反应；以及回收反应液中的苯酚。
文档编号C12N15/09GK103097530SQ20118004342
公开日2013年5月8日 申请日期2011年9月7日 优先权日2010年9月8日
发明者汤川英明, 乾将行 申请人:绿色苯酚·高机能苯酚树脂制造技术研究组合
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