肺癌和结直肠癌中的bard1同工型及其应用的制作方法
专利名称：肺癌和结直肠癌中的bard1同工型及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及对肺癌和结直肠癌具有特异性的新型BARDl同工型、其检测方法和用于治疗和/或预防肺癌和结直肠癌的方法。
背景技术：
肺癌是全世界癌症死亡的主要原因。外科手术之外的治疗方法不是非常有效并且会引起抗性。因此，迫切需要了解肺癌及其发展的病因学。结直肠癌是癌症相关死亡的另一主要原因，是全球第四大常见癌症。结直肠癌患者的存活和预后取决于诊断时的肿瘤阶段。早期结直肠癌是可以被治愈的。不幸的是，在诊断时超过57%的患者该疾病已经区域性扩散或远端扩散。尽管在处理癌症中进行了巨大投资并取得了发展，但是对于晚期结直肠癌患者而言五年存活率仅为15%。最近，许多研究组通过将肿瘤中的蛋白、RNA和微RNA与健康组织进行比较而提出了驱动肺癌的机制。除了 TP53(肺癌中最常缺失或突变的基因)之外，认为P53-ARF途径的组分也缺失、突变或在表观遗传学上经修饰。对于结直肠癌，挑战在于理解分子基础，和确定引起形成(development)和驱动发展的因素。涉及结直肠癌发生和转移性发展的分子事件仅被部分地分类。最近的研究已经揭示了结直肠癌中的分子和生化标志物在预测化疗的后果和对化疗的反应上的潜在应用，如MLH1、MSH2、β -连环蛋白和ρ53。分子谱图作为非小细胞肺癌(NSCLC)的预测和预后参数而出现，包括DNA损伤修复中涉及的基因，例如ERCCURRM1和BRCA1。提出了将乳癌易感基因BRCAl的上调表达作为对NSCLC治疗的反应的预后和预测标志物。关于结直肠癌，BRCAl的研究主要受限于结直肠癌风险和BRCAl突变。数种研究试图将BRCAl突变与结直肠癌风险关联起来，但没有任何明确的结论。基于当前有限的可利用证据，应当认为BRCA突变携带者具有较高额度结直肠癌风险。但是结·直肠癌中BRCAl表达的具体作用是不清楚的。BRCAl在许多增生组织中表达并且在DNA修复途径和细胞周期控制中充当肿瘤抑制剂。BRCAl蛋白稳定性和功能取决于其与BARDl (BRCA1相关的RING结构域蛋白I)的相互作用。BRCA1-BARD1异二聚体具有E3泛素连接酶活性，由此通过泛素化控制关键靶蛋白的稳定性。BARDl还参与p53-依赖性凋亡，在大多数肺癌中p53_依赖性凋亡是有缺陷的。BARDl稳定p53和促进其磷酸化，p53在导致凋亡的信号传导中发挥正确功能需要BARDl的表达。因此，BARDl在肿瘤抑制中起双重作用，同时为BRCAl和p53的结合伴侣。数个研究已经显示，BARDl在有丝分裂过程中上调，通过E2F进行转录和通过磷酸化进行翻译后修饰，并且重要的是，其对于有丝分裂是重要的。根据其它研究，BRCAl和BARDl都显示与hMSH2(通常与遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC)相关的基因)相互作用，hMSH2的突变似乎占HNPCC的约30 40%。BRCAl-hMSH2信号传导过程的缺陷导致对肿瘤形成的易感性增加。W098/12327 (Board of Regents,德克萨斯大学系统)公开了在基于与乳癌蛋白BRCAl结合的筛选检测中鉴定出的数种基因。这些基因中的一种称为BARDl，是与BRCAl相互作用的RING蛋白，并且设想了其在各种癌症相关诊断和治疗方法中的应用，特别是与乳癌、卵巢癌和子宫癌相关的诊断和治疗方法中的应用。W02008/119802(日内瓦大学)公开了在妇科癌症中，带有缺失的BARDl同工型过表达，异常地定位到细胞质，并且它们的表达与乳癌和卵巢癌的预后不良相关。这些同工型的结构分析表明，它们缺乏与BRCAl相互作用或诱导凋亡的区域。这些同工型对于妇科癌症具有特异性，被命名为α、β、η、Y、ε、φ、δ和Θ。由于肺癌和结直肠癌的严重性和不可治愈性，仍然需要开发可鉴别这些癌症的有效检测方法，和需要进一步开发治疗或预防这些癌症的有效方法和组合物。主要问题在于，迄今为止尚未开发出解决该问题的有效方法或策略。
发明内容
本发明提供一种用于检测获自受试对象的生物样品中对肺癌和结直肠癌具有特异性的BARDl同工型的存在的方法，所述方法包括检测所述样品中对肺癌和结直肠癌具有特异性的至少一种BARDl同工型的步骤，所述至少一种BARDl同工型选自包含以下同工型的组:同工型JI，同工型JI包含SEQ ID NO:1、其生物活性片段或与SEQ ID NO:1具有至少95%同源性的序列，和同工型K，同工型K包含SEQ ID NO:2、其生物活性片段或与SEQ ID NO:2具有至少95%同源性的序列，其中，在获自所述受试对象的样品中所述对肺癌和结直肠癌具有特异性的BARDl同工型的存在是所述受试对象罹患肺癌和/或结直肠癌、患肺癌和/或结直肠癌的风险增力口、以及/或者治疗肺癌和/或结直肠癌 后具有复发的风险的标志。本发明还提供一种在权利要求1 6所述的方法中用作生物标志物的分离和/或纯化的多肽，所述分离和/或纯化的多肽包含SEQ ID NO:1、其生物活性片段或与SEQ IDNO:1具有至少95%同源性的序列；和提供一种在权利要求1 6所述的方法中用作生物标志物的分离和/或纯化的多肽，所述分离和/或纯化的多肽包含SEQ ID NO:2、其生物活性片段或与SEQ ID NO:2具有至少95%同源性的序列。本发明另一目的是选自包含SEQ ID NO:13 80的组中的肽，所述肽用于本发明的检测BARDl同工型的存在的方法。本发明的另一目的是用于检测获自受试对象的样品中对肺癌和结直肠癌具有特异性的BARDl同工型的存在的试剂盒，所述试剂盒包含:至少一种多核苷酸引物或探针，其中所述多核苷酸引物或探针对编码至少一种所述BARDl同工型的多核苷酸具有特异性，所述BARDl同工型包含选自包含SEQ ID NO: 1-7,105-106、其生物活性片段和/或与SEQ ID NO:1_7、105-106具有至少95%同源性的序列的组中的氨基酸序列，和/或与至少一种所述BARDl同工型的不同表位特异性结合的抗体或其片段的组合，所述BARDl同工型包含选自包含SEQ ID NO:1_7、105-106、其生物活性片段或与SEQ ID NO:1-7,105-106具有至少95%同源性的序列的组中的氨基酸序列，和/或至少一种选自包含SEQ ID NO: 13 80的组的肽。
本发明还涉及一种将肺癌和结直肠癌与妇科癌症相区分的方法，所述方法包括检测获自受试对象的生物样品中至少一种对肺癌和结直肠癌具有特异性的BARDl同工型的步骤，所述BARDl同工型选自包含以下同工型的组:包含SEQ ID NO:1的同工型π、其生物活性片段或与SEQ ID NO:1具有至少95%同源性的序列，和
包含SEQ ID NO:2的同工型κ、其生物活性片段或与SEQ ID NO:2具有至少95%同源性的序列，其中所述对肺癌和结直肠癌具有特异性的BARDl同工型的存在是肺癌和/或结直肠癌的标志。另外，本发明涉及在治疗和/或预防肺癌和结直肠癌的方法中使用的抗体、重组siRNA和本发明的BARDl同工型的生物活性调节剂。
图1 显示了 NSCLC 中的 BARDl 表达。用 BARDl 抗体 Ν19、C20、PVC、WFS 和 BRCAl对100个NSCLC病例进行免疫组织化学分析。(A)具有上述蛋白基序作为RING指(RING)、锚蛋白重复(ANK)和BRCT结构域的BARDl外显子(1_11)的示意性表示。标明各种抗体识别的表位的大概位置(N19、PVC、WFS、C20)。(B-D)使用BARDl抗体和BRCAl抗体的免疫组织化学染色的实例。BARD1N19和C20显示出细胞质颗粒状染色，并且有时共定位在相同的细胞或区域。BARDIPVC和WFS染色是细胞质的染色或弥漫性细胞核和弥漫性细胞质的染色。BRCAl染色与BARD1N19染色共定位(B)。示出了未被或几乎未被PVC和WFS (C)染色的实例和被N19和C20染色(D)可忽略不计的实例。标明了比例尺(上图=200 μ m ;下图=100 μ m)。(E)观察到的用所有四种N19、PVC、WFS和C20探测的100个NSCLC病例中的73个的染色。“ + ”表示阳性染色，表示阴性染色。具有所有四种抗体的阳性染色是频率最高的表达模式。(F)BARD1N19、PVC、WFS和C20染色的成对比较。BARD1N19和C20以及PVC和WFS强相关。在N19和PVC之间、N19和WFS之间、C20和PVC之间、C20和WFS之间观察到弱相关或不相关。图2显示了在肿瘤组织和肿瘤周围组织中的BARDl表达的比较以及与临床特征的相关性。(A) 20名(10名男性和10名女性)NSCLC患者的肿瘤组织和肿瘤周围组织中的BARD1N19.BARD1C20和BRCAl染色的比较。与“正常”组织相比，肿瘤组织中所有抗体的染色增加。(B)在10名女性和10名男性NSCLC患者的肿瘤组织中测试BARD1N19、BARDIC20和BRCAl染色。与男性患者相比，来自女性患者的肿瘤中所有抗体的染色增加。(C) 100个NSCLC病例中BARD抗体染色和肿瘤类型的比较。阳性染色在非-腺癌(AC)(包括鳞状细胞癌和大细胞癌)中比在腺癌中频率更高。PVC和WFS染色增加具有统计学显著性。(D-E)BARDl表达与患者存活的相关性。(D)如图1E所定义的根据4种抗体阳性染色的组合和小于4种抗体阳性染色的组合进行的无病存活(DFS)的Kaplan-Meyer分析。(E)如图1E所定义的根据4种抗体阳性染色的组合和小于4种抗体阳性染色的组合进行的总存活(OS)的 Kaplan-Meyer 分析。图3显示了在诱导了肺癌的实验小鼠模型中BARDl同工型表达的时间过程。(A)经尿烷(urethane)处理的动物的形态学正常的肺组织(正常)中的BARDl表达。在16周(wk)时BARD1PVC和WFS表位在一些II型肺泡上皮细胞中检测出，但未在I型肺泡上皮细胞中检测出。在24周和32周时所有表位都在II型和I型肺泡上皮细胞中表达，并且从24周至32周表达上调。C20染色与其它相反:在16周时强染色，在24周时弱染色，在32周时几乎是阴性的。(B)肿瘤中的BARDl表达。在肿瘤区，从16周至32周BARD1PVC、特别是WFS表达上调，而从16周至32周C20表达下调。(C-D)在三只小鼠的正常(C)组织和肿瘤
(D)组织中的BARDl表位的表达模式。标出了染色分数、阳性细胞百分比(O表示阴性染色、I 4表示具有阳性染色的细胞的强度和数量增加)。图4显示了人肺肿瘤组织和肿瘤周围组织中BARDl转录物的表达和结构。(A-D)用扩增整个BARDl编码区(一个或多个)的引物进行RT-PCR，该编码区包含外显子1_4或1-6。扩增GAPDH作为对照RT-PCR。分子尺寸标志物(M)示于左侧。推定的FL BARDl和不同剪接的同工型示于右侧。(A)正常肺组织中的BARD1RNA表达。对具有良性肺疾病的个体的肺活检组织进行的RT-PCR(参见方法部分)显示BARDl表达在多数样品中不存在，并且在8个病例中的5个中显示各同工型(Y、δ、η)的扩增。(B)使用外显子I中的正向引物、在外显子11或外显子4中的反向引物对FL BARDl和截短的同工型进行的扩增。对于来自男性和女性患者的组织，显示了成对的正常肿瘤周围(N)组织和肿瘤(T)组织的实例。推定的FL BARDl和不同剪接的同工型示于右侧。正常组织和肿瘤组织表达相同模式的同工型。(C)对外显子I 6进行扩增以区分FL BARDU β和新型同工型κ和Ji。同工型η在肿瘤中特异性表达，而在正常组织中不表达或弱表达。(D)在多数病例中发现了通过RT-PCR确定的雌激素受体α的表达。在男性和女性的正常样品和肿瘤样品中发现类似的表达水平。(E)已知BARDl同工型和肺癌特异性新形式的同工型κ和Ji的结构。指出了 FL BARDl的示意性外显子(I 11)结构与蛋白特征(RING，ANK，BRCT)和核定位信号(NLS)，以及引物的位置。下方以灰·色示出同工型的示意性假定蛋白结构，以白色示出非编码外显子，并且以浅灰点(点)示出选择性开放阅读框(β、Υ和H)。示出了新型同工型κ，其外显子3缺失并且推定的翻译起点(ATG)在外显子4内。将新型同工型π指定为具有外显子4内的缺失，指出了定位到该区域内的已知BARDl突变和多态性。同工型的指定名称示于左侧，大小(氨基酸)和分子量(MW)示于右侧。图5显示了在女性和男性NSCLC患者的形态学正常的肿瘤周围组织(左侧)中和在肿瘤组织(右侧)中的BARDKBRCAI和Aurora B表达的比较。利用BARDl (N19和C20)以及C末端特异性抗体p8、BRCAl和Aurora B抗体染色进行免疫组织化学分析。符号n=细胞核染色。图6显示了外显子4内的选择性剪接和/或转录起始。(A)用外显子(Ex) 4、外显子5和外显子6内的正向引物(位于左侧)和外显子11中的反向引物(位于右侧)扩增的BARDl的各种片段的图。引物的位置和扩增带的预期大小在括号中标出(bp)。⑶示出了用A所示的引物对在男性(左图)和女性(右图)NSCLC患者的人肺肿瘤组织(T)和邻近的正常肿瘤周围组织(N)中的BARDl转录物进行的扩增。注意用外显子4内的引物进行的扩增在不同样品中是可变的，但所有样品都可以用外显子5或外显子6内的引物进行扩增。BARDl mRNA和蛋白表达的变化可能归因于该区域中转录的选择性剪接或不同起始。图7示出了在女性和男性患者的肿瘤组织(肿瘤)和肿瘤周围组织(正常)中BARDl mRNA同工型表达的比较和相关性。对20对肿瘤/形态学上正常的组织样品(包括10名男性和10名女性)的FL BARDl和BARDl同工型进行评分并将其示出。用ImageJ软件对表达进行定量(参见方法部分)。结果在图中表示为值的平均值土SE(标准误差)。(A)肿瘤周围组织和肿瘤组织中FL BARDl和同工型的比较。除了同工型β和κ之外，所有同工型在肿瘤中上调，具有统计学显著性。(B-C)在男性(B)和女性(C)中，FLBARDI和BARDl同工型都在肿瘤组织中比在肿瘤周围组织中更丰富。(D/E)肿瘤组织(D)中和正常组织(E)中男性和女性之间BARDI表达的比较。在肿瘤组织和肿瘤周围组织中，BARDl同工型β和κ在来自男性的组织中比来自女性的组织中表达更多。这具有统计学显著性。在肿瘤组织和肿瘤周围组织中，FL BARDl和BARDl同工型γ、ε和η在来自女性的组织中可能比来自男性的组织中表达更多，但这不具有统计学显著性。(F)在年轻(〈60岁)和老年(>60岁)患者组中FL BARDl和同工型的比较。FL BARDl和同工型Y在年轻(〈60岁)患者中上调。这具有统计学显著性。图8显示了结直肠癌中BARDl和BRCAl表达的免疫组织化学分析的实例。通过BARDl抗体N19、C20、PVC、WFS和BRCAl对148个结直肠癌病例的样品进行了免疫组织化学分析。将所有样品都表示为组织微阵列，每个病例一式四份。免疫组织化学检测后145个样品对于分析是合格的。⑷针对BARDl的BRCAl抗体的阳性染色病例的频率。四个抗体中的每一个的阳性染色率是可变的。BARDl N19和C20染色以及BRCAl染色频率较低。在多数结直肠癌病例中观察到BARDl PVC和WFS阳性染色。(B)结直肠癌中的BARDl表达模式。基于每个病例的阳性⑴染色和阴性㈠染色，用4种BARDl抗体获得表达模式。PVC和WFS阳性染色，但N19和C20阴性染色是频率最高的表达模式，“所有四种抗体阳性”染色其次，N19阴性但PVC、WFS和C20阳性染色是观察到的频率第三高的表达模式。(C-F)使用BARDl抗体和BRCAl抗体的免疫组织染色的实例。BARDl N19和C20显示出细胞质颗粒状染色，并且共定位在相同的细胞和区域。BARDl PVC和WFS染色是弥漫性细胞质的。BRCAl染色在细胞质和细胞核中都是颗粒状。示出了以下实例:使用BARDl抗体和BRCAl抗体的阳性染色(C)、使用N-19和C20(D)的可忽略不计的染色(D)、使用所有四种BARDl抗体的阳性染色
(E)和使用N19(F)的阴性染色。标明了比例尺(上图=200 μ m;下图=50 μ m)。图9显示了对于结直肠癌中BARDl和BRCAl的不同抗体染色之间的相关性。(A)BARDl N19、PVC、WFS和C20染色的相关性。BARDl N19和C20染色强相关，PVC和WFS、PVC和C20以及WFS和C20弱相关。N19和PVC之间以及N19和WFS之间未观察到相关。(B)BRCAl和BARDl的抗体染色的相关性。BRCAl染色不与四种BARDl抗体的任何染色相关。图10显示了 BARDl和BRCAl的不同表位表达与结直肠癌中的临床变量的相关性。BARDl N19阳性染色在女性中频率更高(P=0.014) (A)。在不同抗体的BARDl和BRCAl染色与肿瘤组织病理学级别(级别)(B)、肿瘤大小或附近的组织浸润(肿瘤)(C)、淋巴结累及(结)(D)、远端转移(转移)(E)和肿瘤阶段(阶段)(F)之间未发现相关性。通过X 2检验获得P值。图11显示了结直肠癌组织(T )和正常肿瘤周围组织(N)中BARDl转录物的表达和结构。(A)使用外显子I中的正向引物和外显子Il(Exl-1l)或外显子4(Exl-4)中的反向引物对FL BARDl和/或截短的同工型进行的扩增。作为实例，示出了 5名男性患者和5名女性患者的成对的肿瘤周围组织和肿瘤组织。对于相同的样品示出甘油醛3-磷酸脱氢酶表达作为标准物。分子标志物示于左侧(M)。推定的FL BARDl和截短的同工型示于右侦U。肿瘤周围组织和肿瘤组织表达不同模式的同工型:肿瘤周围组织比肿瘤组织中的表达频率低。也在NSCLC中鉴定出的两种新型同工型，κ和Ji，在结直肠癌中表达。(B)相同样品中雌激素受体a (ERa)的扩增，使用MCF-7作为阳性对照(右侧)。在结直肠组织中，无论在男性还是女性的肿瘤周围样品中还是肿瘤样品中都未观察到ERa表达。图12示出了在患有结直肠癌的男性和女性患者的肿瘤组织(肿瘤)和肿瘤周围(正常)组织中的BARDl mRNA同工型表达的比较。对结直肠癌的20对肿瘤组织/肿瘤周围组织样品(包括10名男性和10名女性)的FL BARDl和BARDl同工型进行评分并将其示出。基于各个肿瘤周围样品或肿瘤样品(A)中的存在或不存在，和各个同工型(B、C、D)的表达的存在或不存在，对表达进行定量。(A)基于任何形式的BARDl的存在和不存在，对肿瘤周围组织和肿瘤组织中(包括在男性样品、女性样品中和在联合样品中)BARDl表达的比较。无论在女性(P=O-OOlO)中还是在男性(P=0.0679)中，BARDl表达在来自肿瘤的组织中比在来自肿瘤周围的组织中更丰富和频率更高(P=0.0003)。(B)肿瘤周围组织和肿瘤组织中的FL BARDl和同工型表达的比较。肿瘤中所有形式都上调，具有统计学显著性(对于所有形式P〈0.05)。(C/D)在来自男性和女性的结直肠组织中的FL BARDl和同工型表达的比较。无论在肿瘤周围组织(C)中还是在肿瘤组织(D)中，FL BARDl和同工型的表达在来自男性和女性的组织中相似(对于所有形式P〈0.05)。通过X 2检验获得P值。图13显示FL BARDl和同工型mRNA表达与结直肠癌中的临床病理变量的相关性。(A)在年轻(〈60岁)和老年(>60岁)患者中FL BARDl和同工型表达的比较。FL BARDl和除同工型β之外的所有同工型，在老年患者中比在年轻患者中上调更多。具体而言，同工型φ、δ和Ji的表达与老年患者显著相关(P〈0.01)。(B-E)通过原发肿瘤和淋巴结状态、以及肿瘤阶段和级别，比较FL BARDl和同工型表达。BARDl同工型κ表达与较大尺寸的肿瘤或附近的组织浸润(B)、淋巴结累积(C)、以及晚期(III期和IV期)(D)显著相关。在BARDl同工型表达和肿瘤组织病理学级别之间未发现相关性(E)。通过X 2检验获得P值。未示出Ρ>0.05的比较 。图14显示用于对血液或血清中的BARDl同工型特异性抗体检测的ELISA测试的实例。图15显示用位于ATG处和π中的缺失连接(deletion junction)处的引物进行的同工型η的扩增。鉴定出由外显子2的另外缺失导致的第二同工型，π’。图16显示了对HeLa、MCF7、RPEl和NLF细胞用抗-Bardl抗体进行的蛋白质印迹。Ab Bethyl BL518 (BL)识别在中部外显子4中编码的表位。针对由外显子I中的β-特异性选择性ORF编码的表位产生Ab PGP。识别了 BARDl同工型β和BARDl同工型β-d_5 ( β ’)和BARDl同工型η。图17显示BARDl同工型的siRNA抑制。A) siRNA靶序列的位置。使用外显子4中的两个siRNA，K401和K423。K401位于同工型π的缺失内，Κ423在缺失的上游。B_C)K401比K423对生长的作用小。B) siRNA表达与GFP表达相结合。许多阳性细胞在表达K401的细胞中生长，少量在表达K423的细胞中生长。C)生长曲线确认，K423抑制细胞生长与之前报道的靶向所有形式的BARDl的K78 —样有效。图18显示微RNA影响BARDl和BARDl同工型表达。RT-PCR显示所有形式的BARDl都被miR-203轻微抑制。蛋白质印迹显示miR-203过表达对FL、β和π的强烈抑制。
具体实施例方式虽然可将与本文所述类似或等效的方法和材料用于本发明的实践或测试，但合适的方法和材料描述如下。通过参考并入本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献的全部内容。提供本文所述的出版物和申请仅仅是为了公开在本申请的提交日之前的内容。此处决不能解释为承认由于之前的发明导致本发明没有资格早于此类出版物。此外，材料、方法和实例仅是说明性的，不是意图进行限制。在矛盾的情况下，以本说明书(包括定义)为准。除非另外定义，本文所用所有科技术语具有与本文主题所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。如本文所用，为了便于理解本发明提供以下定义。术语“包含”通常以包括的意思使用，也就是说允许存在一种或多种特征或成分。如说明书和权利要求所用，单数形式的"a"、" an"和"the"包括多个指代对象，除非上下文明确做出了不同规定。例如BARDl同工型是指至少一种BARDl同工型。如本文所用术语“同工型”是同一蛋白的数种不同形式中的一种，如本发明的BARDl蛋白。诸如BARDl等蛋白的不同形式，可以从相关基因生产，或可以由同一基因通过选择性剪接而产生。大量同工型可由单核苷酸多态性或SNP(同一基因的等位基因之间的较小遗传学差异)引起。这些出现在基因的特定的个别核苷酸位置。如本文所用术语“受试对象”或“患者”是本领域公知的，并且在本文中用于指哺乳动物，最优选是人。在某些实施方式中，所述受试对象是需要治疗的受试对`象或患有肺癌和/或结直肠癌的受试对象。但是，在其它实施方式中，所述受试对象可以是尚未发展出肺癌和/或结直肠癌症状的正常受试对象或已经进行针对肺癌和/或结直肠癌的治疗的受试对象。该术语不指示特定的年龄或性别。因此，意图覆盖成年或幼年受试对象，无论男性还是女性。如本文所用，术语“肽”、“蛋白”、“多肽”和“肽的(p^tidic) ”可以相互替换地使用，来指通过相邻残基的α-氨基和羧基之间的肽键连接到其它氨基酸的一系列氨基酸残基。与所预期的相反，申请人已经令人惊奇地在来自100例非小细胞肺癌(NSCLC)和165例结直肠癌的患者群组的每个样品中鉴定出除已知的同工型α、β、η、Υ、ε
和Θ之外的两个新的其它BARDl同工型。另一令人惊奇的特征是同工型α在来自100例NSCLC和165例结直肠癌的患者群组的每个样品中都不存在。将这些新型同工型命名为κ和。实际上BARDl同工型在NSCLC和结直肠癌的肿瘤组织中表达相似的模式，它们都表达两种新型的同工型κ和，同工型κ和Ji不同于在妇科癌症中鉴定出的BARDl同工型(W02008/119802)。该发现表明BARDl的异常表达在女性激素依赖性肿瘤组织和非女性激素依赖性肿瘤组织中可能是不同的。新型同工型κ带有外显子3的缺失，从外显子2翻译到外显子4中不是框内的，但是翻译可以在外显子4内开始。所得的蛋白产物的抗体反应性与同工型β相似。新型同工型带有在外显子4内的编码第301 436位氨基酸的408bp的缺失。同工型π的翻译会产生与抗体PVC和WFS反应但却缺少重要的NLS的蛋白(图4C、E和图6)。同工型π源自新的剪接机制，该剪接机制产生外显子4的部分缺失，但保留外显子1-3以及外显子4的开始部分，因此保留BRCAl结合性RING指结构域。同工型π保留外显子1-3以及外显子4的开始部分，因此保留了被PVC和WFS识别的表位，所述表位为未在任何其它同工型中发现的表位的组合。同工型η可以用抗体PVC和WFS检测，这些抗体在小鼠晚期肺肿瘤中显示出染色增加。因此，同工型η可以是NSCLC中肿瘤发展的致癌驱动物。同工型η中外显子4的部分缺失可能是重要的区域，因为其具有数种癌症相关突变和NLS (图4Ε)，这可能解释PVC和WFS染色的细胞质定位。异常的胞内定位可能影响蛋白修饰，例如磷酸化和蛋白-蛋白相互作用。同工型π对于肺癌似乎特别重要，这是因为其是唯一的在肿瘤组织中显著上调和在肿瘤周围组织中缺乏或仅弱表达的同工型，而所有其它BARDl同工型在肿瘤组织和肿瘤周围组织中都相似地表达(图4Β ;图7)。外显子4的部分缺失引起BARDl上重要的NLS的丧失，这可能解释细胞质定位。由外显子2的缺失导致的另外的同工型π ’，在肺癌和结直肠癌中与同工型π共表达。申请人:证明，FLBARDI (全长BARD1)和剪接同工型在肿瘤组织和肿瘤周围组织中表达，并且可能促成肿瘤发生和发展。但是，同工型η在肿瘤中特异性表达，可能参与致癌发展。FL BARDl在mRNA水平上表达，但不存在FL BARDl的蛋白翻译。因此在蛋白水平上，BARDl同工型，而不是FL BARDl，在来自100个NSCLC和165个结直肠癌患者群组的每个样品中表达。同工型表达和定位与BRCAl不相关，表明BRCA1-BARD1异二聚体的E3泛素连接酶功能在两种类型的癌症中受损。BRCAl蛋白的稳定性和定位极大地依赖于BARDl。导致BRCA1-BARDI缺乏肿瘤抑制功能丧失的FL BARDl的缺失引起基因组不稳定和对凋亡的抗性。除了 FL BARDl的丧失的这个效果之外，过表达的差异性剪接BARDl同工型可能是肿瘤形成的驱动物。选择性剪接是肺癌中经常观察到的现象，并且对于许多调控性蛋白都得到验证。剪接同工型能够翻译成具有拮抗功能的异常蛋白同工型。对于两种BARDl剪接变体，BARDl β和BARDl δ，这已经得到验证，BARDl β和BARDl δ分别通过稳定Aurora B和作用在Era上对FL BARDl功能起拮抗作用。因此，NSCLC中的BARDl同工型表达可能不仅是旁观者，还可能是肿瘤形成的驱动者。实际上，分别被抗体PVC和WFS识别的定位到外显子3和4的表位的表达在诱导了肺癌的小鼠模型的肺肿瘤的侵袭阶段中增加。所有的肿瘤组织样品和肿瘤周围组织样品还表达在妇科癌症中发现的同工型；具体而言是同工型δ。BARDl同工型δ结合和稳定ER a，与BRCA1-BARD1异二聚体的功能相反。由于ERa也在所有样品中表达，BARDl同工型可能通过雌激素而得到上调并参与肺癌中的雌激素信号传导。因此，数种BARDl同工型似乎与癌形成相关。由于癌细胞需要BARDl或BARDl同工型以增殖，NSCLC和结直肠癌中的BARDl同工型表达不仅是旁观者，还可能是肿瘤形成的驱动者。特别是表达定位到外显子3和4的表位的同工型，似乎与NSCLC和结直肠癌中的较短存活都相关。这些表位在小鼠肺癌模型的侵袭性肿瘤中上调。NSCLC和结直肠癌中表达的BARDl同工型源自选择性剪接。例如，剪接同工型能够翻译成具有拮抗功能的异常蛋白同工型。
所有的肺肿瘤样品和肿瘤周围组织样品都表达ERa和同工型δ。但是，在系列结直肠癌病例中不存在ERa mRNA表达，并且在BARDl同工型表达和性别之间未发现差异。但是，令人感兴趣的是，高频率的N19阳性染色与结直肠癌的女性性别显著相关(P=0.014)，并且该发现和NSCLC中与女性性别相关的BARDlN端表位的表达一致(统计学显著性是临界的，P=0.051)。NSCLC中，在女性中观察到BARDl同工型γ、ε和η的高mRNA水平的表达，而在男性中同工型β和κ过表达。同工型Y和ε表达能够通过BARDl Ν19检测，而同工型β、κ和η不能。因此，BARDl同工型表达的蛋白水平和mRNA水平是一致的，表明性别特异性BARDl同工型在这些癌症中表达。BARDl同工型在NSCLC和结直肠癌的肿瘤组织与肿瘤周围组织中显示了不同的表达模式。NSCLC中，除了同工型π之外的所有同工型在肿瘤周围组织中表达并在肿瘤组织中仅轻微增加，但在获自良性肺疾病的对照组织中观察到任何形式的BARDl表达较少或不表达。相反，在结直肠癌中，BARDl同工型在肿瘤组织中表达的频率较高，但在肿瘤周围组织中不表达或表达较少。该结果可以通过根据不同细胞类型对外部刺激或某些病理学状况和/或在肺组织和结直肠组织之间ERa表达的差异的应答而多样性调节选择性剪接来解释。用PVC抗体或WFS抗体或二者获得的阳性染色与NSCLC患者的存活减少相关。但是，四种抗体的阳性染色模式与结直肠癌中的存活较长显著相关，对于Ν19阳性染色情况也是如此；而PVC和WFS阳性染色模式 ，而不是它们各自的阳性染色，与存活较短强相关。事实上，不同的表达模式不仅反映了不同BARDl同工型的表达，还反映了同工型的组合的表达。根据BARDl表达的不同表位的相关性，似乎观察到数种BARDl同工型:NSCLC和结直肠癌中的N端和C端截短形式以及内部缺失形式，以及结直肠癌中N端丧失的其它形式。四种抗体阳性染色的表达模式未表明同工型η的表达，但可能反映了 BARDl的不同同工型的同时表达。事实上，BARDl同工型π的表达与被PVC和WFS识别的表位一致，所述表位为未在任何其它同工型中发现的表位的组合。实际上，PVC和WFS染色是细胞质的染色。PVC和WFS的表达与NSCLC和结直肠癌的不良预后明显相关，PVC和WFS染色还与小鼠肺癌模型中的癌症发展相关。PVC和WFS反应性表位的强表达，加上N端和C端表位的弱表达可能表明这些表位被空间构型和/或蛋白-蛋白相互作用封闭。FL BARDl与BARDl同工型的翻译后调节或差异性蛋白稳定性可能还解释说明了在蛋白水平上FL BARDl的不存在，而其在mRNA水平上存在。申请人:证明BARDl同工型的表达在NSCLC和结直肠癌中是常见的。这些同工型的表达与NSCLC和结直肠癌的预后(不良预后或良好预后)显著相关，强烈地表明BARDl同工型参与了肿瘤形成、发展和致死性。因此，BARDl及其同工型可以是有前景的诊断和预后标志物，不仅用于鉴定对更具侵袭性的治疗具有不良预后可能的个体，还为搜寻有效的分子靶向治疗指明了新方向。例如，诸如κ和等BARDl同工型可以是肺癌和结直肠癌治疗新策略的靶标。检测特异性同工型K和π有助于在潜在的治愈性外科手术治疗之前和/或之后鉴定有死于NSCLC和结直肠癌的最高风险的受试对象，这是因为其是选择用辅助性化疗进行随后治疗的受试对象的关键步骤。
本发明提供了一种用于检测获自受试对象的生物样品中对肺癌和结直肠癌具有特异性的BARDl同工型的存在的方法，所述方法包括检测所述样品中对肺癌和结直肠癌具有特异性的至少一种BARDl同工型的步骤，所述至少一种BARDl同工型选自包含以下同工型的组:同工型Ji，其包含SEQ ID NO:1、其生物活性片段或与SEQ ID NO:1具有至少95%同源性的序列，和同工型κ，其包含SEQ ID NO:2、其生物活性片段或与SEQ ID NO:2具有至少95%同源性的序列，其中，在获自所述受试对象的样品中所述对肺癌和结直肠癌具有特异性的所述BARDl同工型的存在是所述受试对象罹患肺癌和/或结直肠癌、具有升高的患肺癌和/或结直肠癌的风险、以及/或者治疗肺癌和/或结直肠癌后具有复发的风险的标志。优选的是，所述检测步骤包括检测BARDl同工型π和BARDl同工型κ，BARDl同工型π包含SEQ ID NO:1、其生物活性片段或与SEQ ID NO:1具有至少95%同源性的序列，BARDl同工型κ包含SEQ ID NO:2、其生物活性片段或与SEQ ID NO:2具有至少95%同源性的序列。还优选的是，本发明的方法包括检测所述生物样品中由SEQ ID NO:1组成的BARDl同工型和由SEQ ID NO:2组成的BARDl同工型κ的步骤。本发明的方法还包括检测所述生物样品中选自包含以下同工型的组中的至少一种BARDl同工型:同工型JI ’，同工型’包含SEQ ID NO: 105、其生物活性片段或与SEQ ID NO:105具有至少95%同源性的序列，同工型β，同工型β包含SEQ ID NO:5、其生物活性片段或与SEQ ID NO:5具有至少95%同源性的序列，同工型δ，同工型δ包含SEQ ID NO:6、其生物活性片段或与SEQ ID NO:6具有至少95%同源性的序列，和同工型Y，同工型Y包含SEQ ID NO:7、其生物活性片段或与SEQ ID NO:7具有至少95%同源性的序列，同工型β ’，同工型β ’包含SEQ ID NO: 106、其生物活性片段或与SEQ ID NO:106具有至少95%同源性的序列。优选的是，本发明的方法还包括检测所述生物样品中选自包含以下同工型的组中的至少一种BARDl同工型:同工型Ji ’，同工型JI ’包含SEQ ID NO: 105、其生物活性片段或与SEQ ID NO:105具有至少95%同源性的序列，同工型β，同工型β包含SEQ ID NO:5、其生物活性片段或与SEQ ID NO:5具有至少95%同源性的序列，同工型β ’，同工型β ’包含SEQ ID NO: 106、其生物活性片段或与SEQ ID NO:106具有至少95%同源性的序列。还优选的是，本发明的方法包括检测所述生物样品中由SEQ ID NO:1组成的BARDl同工型、由S EQ ID NO:2组成的BARDl同工型κ和由SEQ ID NO:5组成的BARDl同工型β的步骤。在本发明的上下文中，“生物活性片段”是指本发明的BARDl同工型的区域，其对于BARDl同工型的正常功能，例如拮抗功能而言是必须的。生物活性片段包括包含与SEQID NO:1 7、105 106的氨基酸序列具有足够同源性或源自SEQ ID Ν0:1 7、105 106的氨基酸序列的氨基酸序列，其包含的氨基酸比全长BARDl同工型少，并且展示至少一种拮抗活性。通常，生物活性片段包含具有至少一种拮抗活性的结构域或基序。本发明的BARDl同工型的生物活性片段可以是长度为例如10个、25个、50个、100个或更多个氨基酸残基的多肽。此外，其中缺失其它区域的其它生物活性片段可以通过重组技术制备，并对其就本发明的天然BARDl同工型的一种或多种功能活性进行评价。例如，同工型π的一种生物活性片段可以由SEQ ID NO:3组成，同工型κ的一种生物活性片段可以由SEQ ID Ν0:4组成，同工型β的一种生物活性片段可以由SEQ ID NO:4组成。
在另外的实施方式中，本发明的BARDl同工型是以下多肽，所述多肽包含与包含SEQ ID NO:1 7、105 106的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%或99%，优选为95%同源性的氨基酸序列，并且保持包含SEQ ID NO:1 7、105 106的BARDl同工型的活性。为了确定两个氨基酸序列的同源性百分比，为了最佳比较目的将序列进行比对(例如，为了与第二氨基酸序列进行最佳比对，可以在第一氨基酸序列中引入空位)。然后比较在相应氨基酸位置处的氨基酸残基。当第一序列中的位置被与在第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基占据时，则分子在该位置是同源的。比对和百分比同源性可以使用本领域已知的任何合适的软件，例如⑶RRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel等(eds) 1987, Supplement30,第7.7.18小节)中描述的软件确定。优选的程序包括 GCG Pileup 程序、FASTA(Pearson 等(1988)Proc.Natl, Acad.Sci USA 85:2444-2448)和 BLAST(BLAST Manual, Altschul 等,Natl.Cent.Biotechnol.1nf., NatlLib.Med.(NCIB NLM NIH)，Bethesda, Md.，和 Altschul 等，(1997) NAR25:3389-3402)。另一优选的比对程序是 ALIGN Plus (Scientific and Educational Software, PA),优选使用默认参数。发现有用的另一序列软件程序是Sequence Software Package Version6.0中可获得的 TFASTA Data Searching Program (Genetics Computer Group, University ofWisconsin, Madison, ffis.)。片段是与本发明的BARDl同工型的各序列在长度上共有至少40%的氨基酸的序列。可以使用这些序列，只要它们展现与它们所源自的天然序列相同的生物学性质，例如拮抗活性。优选的是，这些序列与其所源自的各序列在长度上共有超过70%、优选超过80%特别是超过90%且最优选95%的氨基酸。这些片段可以通过本领域已知的各种方法和技术(例如化学合成)来制备。本发明还包括BARDl同工型的变体。变体是这样的肽或多肽，它们具有的氨基酸序列在一定程度上不同于天然序列的肽或多肽，它们是通过保守性氨基酸取代而不同于天然序列的氨基酸序列，由此一个或多个氨基酸被具有相同特征和构象作用的另外的氨基酸取代。氨基酸序列变体在天然氨基酸序列的氨基酸序列内的某些位置处拥有取代、缺失、侧链修饰和/或插入。此处将保守性氨基酸取代定义为在以下五组中的一组内的交换:1.小的脂肪族的非极性或轻微极性的残基:Ala、Ser、Thr、Pro、Gly
I1.极性的带正电的残基:His、Arg、LysII1.极性的带负电的残基及其酰胺:Asp、Asn、Glu、GlnIV.大的芳香族残基:Phe、Tyr、TrpV.大的脂肪族的非极性残基:Met、Leu、lie、Val、Cys。应该理解，一些非常规氨基酸也可以是天然存在的氨基酸的合适的取代物。例如，Lys残基可以被鸟氨酸、高精氨酸、nor-Lys、N-甲基-Lys、N, N- 二甲基-Lys和N, N, N-三甲基-Lys取代。Lys残基还可以被合成的碱性氨基酸取代，所述碱性氨基酸包括，但不限于，N-1-(2-吡唑啉基)-Arg、2-(4-哌啶基)-Gly、2-(4-哌啶基)_Ala、2_[3_(2S)吡咯啉基]-Gly和2-[3-(2S)吡咯啉基]-Ala。Tyr残基可以被4-甲氧基酪氨酸(MeY)、间-Tyr、邻-Tyr、nor-Ty;r、1251_Tyr、单齒素-Tyr、二齒素-Tyr、0_ 横-Tyr、0_ 憐-Tyr 和硝基-Tyr取代。Tyr残基还可以被3_羟基或2_羟基异构体(分别为间-Tyr或邻-Tyr)和相应的O-磺-和O-磷衍生物取代。Tyr残基还可以被合成的含有羟基的氨基酸取代，合成的含有羟基的氨基酸包括但不限于4-羟基甲基-Phe、4-羟基苯基-Gly、2，6- 二甲基-Tyr和5-氨基-Tyr。脂肪族氨基酸可以被带有非天然脂肪族支链或直链侧链CnH2n+2的合成衍生物取代，CnH2n+2 中η是从I至最多8且包括8的数值。合适的被非常规氨基酸保守性取代的实例在W002/064740中给出。插入包括加入一个或多个天然存在的或非常规的氨基酸残基。缺失包括一个或多个氨基酸残基的缺失。此外，由于天然肽(为L型)的固有问题是被天然酶降解，可以将本发明的生理活性蛋白制备为包括所述肽的D型和/或“逆反异构体(retro-1nverso isomers) ”。优选的是，制备本发明生理活性蛋白的较短部分的逆反异构体、变体或组合。例如如Sela和Zisman在出版于FASEB J.1997 May; 11 (6):449-56的综述中所述，为已知序列的肽制备逆反肽。“逆反异构体”是指直链肽的异构体，其中序列的方向相反并且各氨基酸残基的手性反转，因此可以不存在端基互补。本发明还包括其中一个或多个肽键已经被备选类型的不容易受肽酶切割影响的共价键代替的类似物(“肽模拟物”)。在注入受试对象之后肽的蛋白水解降解成为问题的情况下，将特别敏感的肽键替换为不可切割的肽模拟物会使所得的肽更稳定，因此作为活性物质更有用。此类模拟物以及将它们弓I入肽的方法是本领域公知的。优选的是，所述生物样品选自包含以下样品的组:活组织检查样品、组织学样品、肺液、冷冻组织样品、肿瘤组织样品、粪便样品、脑脊髓液(CSF)、循环肿瘤细胞(CTC)和血液样品，更优选的是受试对象是人类。最优选的是生物样品是源自获自受试对象的血液样品的血清。检测本发明的BARDl同工型的存在可以通过常规方法进行，例如蛋白免疫染色、蛋白免疫沉淀、免疫电泳、免疫印迹、BCA蛋白检验、蛋白质印迹、分光光度法。BARDl同工型的存在还可以利用常规方法经由其相应的mRNA的存在来检测，所述常规方法例如RNA印迹、核酸酶保护检验(NPA)、原位杂交和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。优选的是，在循环肿瘤细胞(CTC)中检测BARDl同工型特异性RNA的表达。在本发明的实施方式中，BARDl同工型的存在通过使用对本发明的BARDl同工型具有特异性的抗体来检测。优选的是，所述抗体是与至少一种BARDl同工型特异性结合的多克隆抗体或单克隆抗体或它们的片段，所述BARDl同工型包含选自包含SEQ ID NO:1_7、105-106、其生物活性片段或与SEQ ID NO:1_7、105-106具有至少95%同源性的序列的组中的氨基酸序列。还优选的是，所述抗体是与至少一种BARDl同工型的不同表位特异性结合的抗体或其片段的组合，所述BARDl同工型包含选自包含SEQ ID NO: 1_7、105-106、其生物活性片段或与SEQ ID NO: 1-7、105-106具有至少95%同源性的序列的组中的氨基酸序列。优选的是，所述表位是外显子3和4。优选的是，所述多克隆抗体或单克隆抗体或抗体的所述组合与至少一种BARDl同工型特异性结合，所述BARDl同工型包含选自包含SEQ ID NO:1和2、其生物活性片段或与SEQ ID NO:1-2具有至少95%同源性的序列的组中的氨基酸序列。例如，允许检测本发明的BARDl同工型的抗体为以下抗体:- N19、C20 和 H300(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA),-生成PVC和WSF(外显子4的开始部分)并如之前所述应用(Irminger-Finger
I等，Mol Cell 8:1255-66, 2001 ;Feki A 等，Oncogene 24:3726-36, 2005 ；Hayami R等，Cancer Res 65:6-10, 2005 ；Li L 等，Int J Biochem Cell Biol 39:1659-72, 2007 ；Redente EF 等，Anti cancer Res 29:5095-101, 2009 ；Fabbro M等，J Biol Chem 277:21315-24，2002)，- BL(Bethy Laboratories),- JH2 和 JH3 (Gautier 等 Cancer Rsearch, 2000),- PGP(Ryser 等 ，Cancer Research, 2000),- ELS 和 KPD,由 Applicants 生产- MIQ(Irminger-Finger 等，JCB1998)所述检测可以通过免疫组织化学分析进行，并总结于表I中:- BARDl同工型π应该对Ν19 (或PVC或MIQ)加上或者BL(或WFS)为阳性，并且对JH2为阴性。为了区分同工型π和η ’ U-d-2)，可以通过蛋白质印迹中的尺寸(size)来完成。- BARDl同工型κ应该对BL(或WFS)为阳性，并且对Ν19 (或PVC或MIQ)为阴性。- BARDl同工型β应该对PGP，以及或者WFS或BL为阳性。为了区分同工型β和β’(β-(1-5)，同工型β对ELS为阳性。- BARDl同工型δ应该对Ν19为阳性，对PVC (或MIQ)为阴性并且对BL (或WFS)为阴性。- BARDl同工型Y应该对Ν19以及任一 PVC(或MIQ)为阳性，但对C20 (或KPD)为阴性。
权利要求
1.一种用于检测获自受试对象的生物样品中对肺癌和结直肠癌具有特异性的BARDl同工型的存在的方法，所述方法包括在所述样品中检测对肺癌和结直肠癌具有特异性的至少一种BARDl同工型的步骤，所述至少一种BARDl同工型选自包含以下同工型的组 同工型Ji，同工型Ji包含SEQ ID NO :I、其生物活性片段或与SEQ ID NO :I具有至少95%同源性的序列，和 同工型K，同工型K包含SEQ ID NO :2、其生物活性片段或与SEQ ID NO :2具有至少95%同源性的序列， 其中，在获自所述受试对象的样品中所述对肺癌和结直肠癌具有特异性的BARDl同工型的存在是所述受试对象罹患肺癌和/或结直肠癌、患肺癌和/或结直肠癌的风险增加、以及/或者治疗肺癌和/或结直肠癌后具有复发的风险的标志。
2.如权利要求I所述的方法，其中，所述方法包括在所述生物样品中检测由SEQIDNO 1组成的BARDl同工型和由SEQ ID NO 2组成的BARDl同工型κ的步骤。
3.如权利要求I或2所述的方法，其中，所述方法还包括在所述样品中检测选自包含以下同工型的组中的至少一种BARDl同工型 同工型Ji ’，同工型Ji ’包含SEQ ID NO : 105、其生物活性片段或与SEQ ID NO :105具有至少95%同源性的序列， 同工型β，同工型β包含SEQ ID NO :5、其生物活性片段或与SEQ ID NO :5具有至少95%同源性的序列， 同工型δ，同工型δ包含SEQ ID NO :6、其生物活性片段或与SEQ ID NO 6具有至少95%同源性的序列，和 同工型Y，同工型Y包含SEQ ID NO :7、其生物活性片段或与SEQ ID NO :7具有至少95%同源性的序列， 同工型β'，同工型β'包含SEQ ID NO : 106、其生物活性片段或与SEQ ID NO :106具有至少95%同源性的序列。
4.如权利要求3所述的方法，其中，所述方法包括在所述生物样品中检测由SEQIDNO 1组成的BARDl同工型、由SEQ ID NO 2组成的BARDl同工型κ和由SEQ ID NO 5组成的BARDl同工型β。
5.如权利要求I 4中任一项所述的方法，其中，所述生物样品选自包含以下样品的组活组织检查样品、组织学样品、肺液、冷冻组织样品、肿瘤组织样品、粪便样品、脑脊髓液(CSF)、循环肿瘤细胞(CTC)和血液样品。
6.如权利要求I 5中任一项所述的方法，其中，所述受试对象是人类。
7.如权利要求I 6中任一项所述的方法，其中，所述BARDl同工型的存在通过使用对所述BARDl同工型具有特异性的抗体进行检测。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述抗体是与至少一种BARDl同工型的不同表位特异性结合的抗体或其片段的组合，所述至少一种BARDl同工型包含选自包含SEQ ID NO1-7、105-106、其生物活性片段或与SEQ ID NO : 1_7、105-106具有至少95%同源性的序列的组中的氨基酸序列。
9.如权利要求I 6中任一项所述的方法，其中，所述BARDl同工型的存在通过检测编码至少一种BARDl同工型的mRNA的水平来检测，所述至少一种BARDl同工型包含选自包含SEQ ID NO : 1-7、105-106、其生物活性片段或与SEQ ID NO : 1-7、105-106具有至少95%同源性的序列的组中的氨基酸序列。
10.如权利要求I 6中任一项所述的方法，其中，所述BARDl同工型的存在通过检测获自所述受试对象的血液样品中对所述BARDl同工型具有特异性的自身免疫抗体的存在来检测，并且其中使用选自包含SEQ ID NO :13-80的组中的至少四种抗原以检测对所述BARDl同工型具有特异性的所述自身免疫抗体。
11.如权利要求I 6中任一项所述的方法，其中，所述BARDl同工型的存在通过以下方式来检测 检测编码至少一种BARDl同工型的mRNA的水平，所述至少一种BARDl同工型包含选自包含SEQ ID NO :1-7、105-106、其生物活性片段或与SEQ ID NO : 1-7、105-106具有至少95%同源性的序列的组中的氨基酸序列，和 检测获自所述受试对象的血液样品中对所述BARDl同工型具有特异性的自身免疫抗体的存在，并且其中使用选自包含SEQ ID NO :13-80的组中的至少四种抗原以检测对所述BARDl同工型具有特异性的所述自身免疫抗体。
12.—种在权利要求I 6所述的方法中用作生物标志物的分离和/或纯化的多肽，所述分离和/或纯化的多肽包含SEQ ID NO: I、其生物活性片段或与SEQ ID NO : I具有至少95%同源性的序列。
13.—种在权利要求I 6所述的方法中用作生物标志物的分离和/或纯化的多肽，所述分离和/或纯化的多肽包含SEQ ID NO :2、其生物活性片段或与SEQ ID NO :2具有至少95%同源性的序列。
14.选自包含SEQID NO : 13 80的组中的肽，所述肽在权利要求I 6所述的用于检测BARDl同工型的存在的方法中使用。
15.一种用于检测获自受试对象的样品中对肺癌和结直肠癌具有特异性的BARDl同工型的存在的试剂盒，所述试剂盒包含 至少一种多核苷酸引物或探针，其中所述多核苷酸引物或探针对编码至少一种所述BARDl同工型的多核苷酸具有特异性，所述至少一种BARDl同工型包含选自包含SEQ IDNO : 1-7、105-106、其生物活性片段和/或与SEQ ID NO : 1-7、105-106具有至少95%同源性的序列的组中的氨基酸序列，和/或 与至少一种所述BARDl同工型的不同表位特异性结合的抗体或其片段的组合，所述至少一种BARDl同工型包含选自包含SEQ ID NO : 1_7、105-106、其生物活性片段或与SEQ IDNO : 1-7、105-106具有至少95%同源性的序列的组中的氨基酸序列，和/或 至少一种选自包含SEQ ID NO : 13 80的组中的肽。
16.一种将肺癌和结直肠癌与妇科癌症相区分的方法，所述方法包括在获自受试对象的生物样品中检测至少一种对肺癌和结直肠癌具有特异性的BARDl同工型的步骤，所述BARDl同工型选自包含以下同工型的组 同工型Ji，同工型Ji包含SEQ ID NO :I、其生物活性片段或与SEQ ID NO :I具有至少95%同源性的序列，和 同工型κ，同工型κ包含SEQ ID NO :2、其生物活性片段或与SEQ ID NO :2具有至少95%同源性的序列，其中，所述对肺癌和结直肠癌具有特异性的BARDl同工型的存在是肺癌和/或结直肠癌的标志。
17.选自包含SEQID NO : 13 80的组中的肽，所述肽在检测获自受试对象的生物样品中BARDl同工型的存在的方法中用作抗原，其中所述BARDl同工型的存在通过检测对所述BARDl同工型具有特异性的自身免疫抗体的存在来检测，并且其中所述BARDl同工型在所述样品中的存在是所述患者罹患癌症的标志。
18.一种抗体或其片段，所述抗体或其片段与SEQ ID NO :144所示的表位结合。
19.一种在治疗和/或预防肺癌和结直肠癌的方法中使用的抗体或其片段，所述抗体或其片段与SEQ ID NO :144所示的表位结合。
20.一种在治疗和/或预防肺癌和结直肠癌的方法中使用的重组SiRNA分子，所述重组siRNA分子与单链或双链RNA分子结合，其中所述单链或双链RNA分子包含编码至少一种BARDl同工型的mRNA Jy^iSBARDl同工型包含选自包含SEQ IDNO : 1-7、105-106、其生物活性片段或与SEQ ID NO : 1-7、105-106具有至少95%同源性的序列的组中的氨基酸序列，由此所述BARDl同工型的表达受到抑制。
21.一种在治疗和/或预防肺癌和结直肠癌的方法中使用的BARDl同工型的生物活性的调节剂，所述BARDl同工型包含选自包含SEQ ID NO : 1_7、105-106、其生物活性片段或与SEQ ID N0:l-7、105-106具有至少95%同源性的序列的组中的氨基酸序列。
22.如权利要求20所述的BARDl同工型的生物活性的调节剂，其中，所述调节剂是选自包含SEQ ID NO. 111 140的组中的微RNA。
全文摘要
本发明涉及对肺癌和结直肠癌具有特异性的新型BARD1同工型、其检测方法以及用于治疗和/或预防肺癌和结直肠癌的方法。
文档编号C12Q1/68GK103238069SQ201180044183
公开日2013年8月7日 申请日期2011年8月17日 优先权日2010年8月17日
发明者I·艾尔明格-菲格尔, 张永强 申请人:日内瓦大学, 日内瓦大学医院
技术领域：
本发明涉及对肺癌和结直肠癌具有特异性的新型BARDl同工型、其检测方法和用于治疗和/或预防肺癌和结直肠癌的方法。
背景技术：
肺癌是全世界癌症死亡的主要原因。外科手术之外的治疗方法不是非常有效并且会引起抗性。因此，迫切需要了解肺癌及其发展的病因学。结直肠癌是癌症相关死亡的另一主要原因，是全球第四大常见癌症。结直肠癌患者的存活和预后取决于诊断时的肿瘤阶段。早期结直肠癌是可以被治愈的。不幸的是，在诊断时超过57%的患者该疾病已经区域性扩散或远端扩散。尽管在处理癌症中进行了巨大投资并取得了发展，但是对于晚期结直肠癌患者而言五年存活率仅为15%。最近，许多研究组通过将肿瘤中的蛋白、RNA和微RNA与健康组织进行比较而提出了驱动肺癌的机制。除了 TP53(肺癌中最常缺失或突变的基因)之外，认为P53-ARF途径的组分也缺失、突变或在表观遗传学上经修饰。对于结直肠癌，挑战在于理解分子基础，和确定引起形成(development)和驱动发展的因素。涉及结直肠癌发生和转移性发展的分子事件仅被部分地分类。最近的研究已经揭示了结直肠癌中的分子和生化标志物在预测化疗的后果和对化疗的反应上的潜在应用，如MLH1、MSH2、β -连环蛋白和ρ53。分子谱图作为非小细胞肺癌(NSCLC)的预测和预后参数而出现，包括DNA损伤修复中涉及的基因，例如ERCCURRM1和BRCA1。提出了将乳癌易感基因BRCAl的上调表达作为对NSCLC治疗的反应的预后和预测标志物。关于结直肠癌，BRCAl的研究主要受限于结直肠癌风险和BRCAl突变。数种研究试图将BRCAl突变与结直肠癌风险关联起来，但没有任何明确的结论。基于当前有限的可利用证据，应当认为BRCA突变携带者具有较高额度结直肠癌风险。但是结·直肠癌中BRCAl表达的具体作用是不清楚的。BRCAl在许多增生组织中表达并且在DNA修复途径和细胞周期控制中充当肿瘤抑制剂。BRCAl蛋白稳定性和功能取决于其与BARDl (BRCA1相关的RING结构域蛋白I)的相互作用。BRCA1-BARD1异二聚体具有E3泛素连接酶活性，由此通过泛素化控制关键靶蛋白的稳定性。BARDl还参与p53-依赖性凋亡，在大多数肺癌中p53_依赖性凋亡是有缺陷的。BARDl稳定p53和促进其磷酸化，p53在导致凋亡的信号传导中发挥正确功能需要BARDl的表达。因此，BARDl在肿瘤抑制中起双重作用，同时为BRCAl和p53的结合伴侣。数个研究已经显示，BARDl在有丝分裂过程中上调，通过E2F进行转录和通过磷酸化进行翻译后修饰，并且重要的是，其对于有丝分裂是重要的。根据其它研究，BRCAl和BARDl都显示与hMSH2(通常与遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC)相关的基因)相互作用，hMSH2的突变似乎占HNPCC的约30 40%。BRCAl-hMSH2信号传导过程的缺陷导致对肿瘤形成的易感性增加。W098/12327 (Board of Regents,德克萨斯大学系统)公开了在基于与乳癌蛋白BRCAl结合的筛选检测中鉴定出的数种基因。这些基因中的一种称为BARDl，是与BRCAl相互作用的RING蛋白，并且设想了其在各种癌症相关诊断和治疗方法中的应用，特别是与乳癌、卵巢癌和子宫癌相关的诊断和治疗方法中的应用。W02008/119802(日内瓦大学)公开了在妇科癌症中，带有缺失的BARDl同工型过表达，异常地定位到细胞质，并且它们的表达与乳癌和卵巢癌的预后不良相关。这些同工型的结构分析表明，它们缺乏与BRCAl相互作用或诱导凋亡的区域。这些同工型对于妇科癌症具有特异性，被命名为α、β、η、Y、ε、φ、δ和Θ。由于肺癌和结直肠癌的严重性和不可治愈性，仍然需要开发可鉴别这些癌症的有效检测方法，和需要进一步开发治疗或预防这些癌症的有效方法和组合物。主要问题在于，迄今为止尚未开发出解决该问题的有效方法或策略。
发明内容
本发明提供一种用于检测获自受试对象的生物样品中对肺癌和结直肠癌具有特异性的BARDl同工型的存在的方法，所述方法包括检测所述样品中对肺癌和结直肠癌具有特异性的至少一种BARDl同工型的步骤，所述至少一种BARDl同工型选自包含以下同工型的组:同工型JI，同工型JI包含SEQ ID NO:1、其生物活性片段或与SEQ ID NO:1具有至少95%同源性的序列，和同工型K，同工型K包含SEQ ID NO:2、其生物活性片段或与SEQ ID NO:2具有至少95%同源性的序列，其中，在获自所述受试对象的样品中所述对肺癌和结直肠癌具有特异性的BARDl同工型的存在是所述受试对象罹患肺癌和/或结直肠癌、患肺癌和/或结直肠癌的风险增力口、以及/或者治疗肺癌和/或结直肠癌 后具有复发的风险的标志。本发明还提供一种在权利要求1 6所述的方法中用作生物标志物的分离和/或纯化的多肽，所述分离和/或纯化的多肽包含SEQ ID NO:1、其生物活性片段或与SEQ IDNO:1具有至少95%同源性的序列；和提供一种在权利要求1 6所述的方法中用作生物标志物的分离和/或纯化的多肽，所述分离和/或纯化的多肽包含SEQ ID NO:2、其生物活性片段或与SEQ ID NO:2具有至少95%同源性的序列。本发明另一目的是选自包含SEQ ID NO:13 80的组中的肽，所述肽用于本发明的检测BARDl同工型的存在的方法。本发明的另一目的是用于检测获自受试对象的样品中对肺癌和结直肠癌具有特异性的BARDl同工型的存在的试剂盒，所述试剂盒包含:至少一种多核苷酸引物或探针，其中所述多核苷酸引物或探针对编码至少一种所述BARDl同工型的多核苷酸具有特异性，所述BARDl同工型包含选自包含SEQ ID NO: 1-7,105-106、其生物活性片段和/或与SEQ ID NO:1_7、105-106具有至少95%同源性的序列的组中的氨基酸序列，和/或与至少一种所述BARDl同工型的不同表位特异性结合的抗体或其片段的组合，所述BARDl同工型包含选自包含SEQ ID NO:1_7、105-106、其生物活性片段或与SEQ ID NO:1-7,105-106具有至少95%同源性的序列的组中的氨基酸序列，和/或至少一种选自包含SEQ ID NO: 13 80的组的肽。
本发明还涉及一种将肺癌和结直肠癌与妇科癌症相区分的方法，所述方法包括检测获自受试对象的生物样品中至少一种对肺癌和结直肠癌具有特异性的BARDl同工型的步骤，所述BARDl同工型选自包含以下同工型的组:包含SEQ ID NO:1的同工型π、其生物活性片段或与SEQ ID NO:1具有至少95%同源性的序列，和
包含SEQ ID NO:2的同工型κ、其生物活性片段或与SEQ ID NO:2具有至少95%同源性的序列，其中所述对肺癌和结直肠癌具有特异性的BARDl同工型的存在是肺癌和/或结直肠癌的标志。另外，本发明涉及在治疗和/或预防肺癌和结直肠癌的方法中使用的抗体、重组siRNA和本发明的BARDl同工型的生物活性调节剂。
图1 显示了 NSCLC 中的 BARDl 表达。用 BARDl 抗体 Ν19、C20、PVC、WFS 和 BRCAl对100个NSCLC病例进行免疫组织化学分析。(A)具有上述蛋白基序作为RING指(RING)、锚蛋白重复(ANK)和BRCT结构域的BARDl外显子(1_11)的示意性表示。标明各种抗体识别的表位的大概位置(N19、PVC、WFS、C20)。(B-D)使用BARDl抗体和BRCAl抗体的免疫组织化学染色的实例。BARD1N19和C20显示出细胞质颗粒状染色，并且有时共定位在相同的细胞或区域。BARDIPVC和WFS染色是细胞质的染色或弥漫性细胞核和弥漫性细胞质的染色。BRCAl染色与BARD1N19染色共定位(B)。示出了未被或几乎未被PVC和WFS (C)染色的实例和被N19和C20染色(D)可忽略不计的实例。标明了比例尺(上图=200 μ m ;下图=100 μ m)。(E)观察到的用所有四种N19、PVC、WFS和C20探测的100个NSCLC病例中的73个的染色。“ + ”表示阳性染色，表示阴性染色。具有所有四种抗体的阳性染色是频率最高的表达模式。(F)BARD1N19、PVC、WFS和C20染色的成对比较。BARD1N19和C20以及PVC和WFS强相关。在N19和PVC之间、N19和WFS之间、C20和PVC之间、C20和WFS之间观察到弱相关或不相关。图2显示了在肿瘤组织和肿瘤周围组织中的BARDl表达的比较以及与临床特征的相关性。(A) 20名(10名男性和10名女性)NSCLC患者的肿瘤组织和肿瘤周围组织中的BARD1N19.BARD1C20和BRCAl染色的比较。与“正常”组织相比，肿瘤组织中所有抗体的染色增加。(B)在10名女性和10名男性NSCLC患者的肿瘤组织中测试BARD1N19、BARDIC20和BRCAl染色。与男性患者相比，来自女性患者的肿瘤中所有抗体的染色增加。(C) 100个NSCLC病例中BARD抗体染色和肿瘤类型的比较。阳性染色在非-腺癌(AC)(包括鳞状细胞癌和大细胞癌)中比在腺癌中频率更高。PVC和WFS染色增加具有统计学显著性。(D-E)BARDl表达与患者存活的相关性。(D)如图1E所定义的根据4种抗体阳性染色的组合和小于4种抗体阳性染色的组合进行的无病存活(DFS)的Kaplan-Meyer分析。(E)如图1E所定义的根据4种抗体阳性染色的组合和小于4种抗体阳性染色的组合进行的总存活(OS)的 Kaplan-Meyer 分析。图3显示了在诱导了肺癌的实验小鼠模型中BARDl同工型表达的时间过程。(A)经尿烷(urethane)处理的动物的形态学正常的肺组织(正常)中的BARDl表达。在16周(wk)时BARD1PVC和WFS表位在一些II型肺泡上皮细胞中检测出，但未在I型肺泡上皮细胞中检测出。在24周和32周时所有表位都在II型和I型肺泡上皮细胞中表达，并且从24周至32周表达上调。C20染色与其它相反:在16周时强染色，在24周时弱染色，在32周时几乎是阴性的。(B)肿瘤中的BARDl表达。在肿瘤区，从16周至32周BARD1PVC、特别是WFS表达上调，而从16周至32周C20表达下调。(C-D)在三只小鼠的正常(C)组织和肿瘤
(D)组织中的BARDl表位的表达模式。标出了染色分数、阳性细胞百分比(O表示阴性染色、I 4表示具有阳性染色的细胞的强度和数量增加)。图4显示了人肺肿瘤组织和肿瘤周围组织中BARDl转录物的表达和结构。(A-D)用扩增整个BARDl编码区(一个或多个)的引物进行RT-PCR，该编码区包含外显子1_4或1-6。扩增GAPDH作为对照RT-PCR。分子尺寸标志物(M)示于左侧。推定的FL BARDl和不同剪接的同工型示于右侧。(A)正常肺组织中的BARD1RNA表达。对具有良性肺疾病的个体的肺活检组织进行的RT-PCR(参见方法部分)显示BARDl表达在多数样品中不存在，并且在8个病例中的5个中显示各同工型(Y、δ、η)的扩增。(B)使用外显子I中的正向引物、在外显子11或外显子4中的反向引物对FL BARDl和截短的同工型进行的扩增。对于来自男性和女性患者的组织，显示了成对的正常肿瘤周围(N)组织和肿瘤(T)组织的实例。推定的FL BARDl和不同剪接的同工型示于右侧。正常组织和肿瘤组织表达相同模式的同工型。(C)对外显子I 6进行扩增以区分FL BARDU β和新型同工型κ和Ji。同工型η在肿瘤中特异性表达，而在正常组织中不表达或弱表达。(D)在多数病例中发现了通过RT-PCR确定的雌激素受体α的表达。在男性和女性的正常样品和肿瘤样品中发现类似的表达水平。(E)已知BARDl同工型和肺癌特异性新形式的同工型κ和Ji的结构。指出了 FL BARDl的示意性外显子(I 11)结构与蛋白特征(RING，ANK，BRCT)和核定位信号(NLS)，以及引物的位置。下方以灰·色示出同工型的示意性假定蛋白结构，以白色示出非编码外显子，并且以浅灰点(点)示出选择性开放阅读框(β、Υ和H)。示出了新型同工型κ，其外显子3缺失并且推定的翻译起点(ATG)在外显子4内。将新型同工型π指定为具有外显子4内的缺失，指出了定位到该区域内的已知BARDl突变和多态性。同工型的指定名称示于左侧，大小(氨基酸)和分子量(MW)示于右侧。图5显示了在女性和男性NSCLC患者的形态学正常的肿瘤周围组织(左侧)中和在肿瘤组织(右侧)中的BARDKBRCAI和Aurora B表达的比较。利用BARDl (N19和C20)以及C末端特异性抗体p8、BRCAl和Aurora B抗体染色进行免疫组织化学分析。符号n=细胞核染色。图6显示了外显子4内的选择性剪接和/或转录起始。(A)用外显子(Ex) 4、外显子5和外显子6内的正向引物(位于左侧)和外显子11中的反向引物(位于右侧)扩增的BARDl的各种片段的图。引物的位置和扩增带的预期大小在括号中标出(bp)。⑶示出了用A所示的引物对在男性(左图)和女性(右图)NSCLC患者的人肺肿瘤组织(T)和邻近的正常肿瘤周围组织(N)中的BARDl转录物进行的扩增。注意用外显子4内的引物进行的扩增在不同样品中是可变的，但所有样品都可以用外显子5或外显子6内的引物进行扩增。BARDl mRNA和蛋白表达的变化可能归因于该区域中转录的选择性剪接或不同起始。图7示出了在女性和男性患者的肿瘤组织(肿瘤)和肿瘤周围组织(正常)中BARDl mRNA同工型表达的比较和相关性。对20对肿瘤/形态学上正常的组织样品(包括10名男性和10名女性)的FL BARDl和BARDl同工型进行评分并将其示出。用ImageJ软件对表达进行定量(参见方法部分)。结果在图中表示为值的平均值土SE(标准误差)。(A)肿瘤周围组织和肿瘤组织中FL BARDl和同工型的比较。除了同工型β和κ之外，所有同工型在肿瘤中上调，具有统计学显著性。(B-C)在男性(B)和女性(C)中，FLBARDI和BARDl同工型都在肿瘤组织中比在肿瘤周围组织中更丰富。(D/E)肿瘤组织(D)中和正常组织(E)中男性和女性之间BARDI表达的比较。在肿瘤组织和肿瘤周围组织中，BARDl同工型β和κ在来自男性的组织中比来自女性的组织中表达更多。这具有统计学显著性。在肿瘤组织和肿瘤周围组织中，FL BARDl和BARDl同工型γ、ε和η在来自女性的组织中可能比来自男性的组织中表达更多，但这不具有统计学显著性。(F)在年轻(〈60岁)和老年(>60岁)患者组中FL BARDl和同工型的比较。FL BARDl和同工型Y在年轻(〈60岁)患者中上调。这具有统计学显著性。图8显示了结直肠癌中BARDl和BRCAl表达的免疫组织化学分析的实例。通过BARDl抗体N19、C20、PVC、WFS和BRCAl对148个结直肠癌病例的样品进行了免疫组织化学分析。将所有样品都表示为组织微阵列，每个病例一式四份。免疫组织化学检测后145个样品对于分析是合格的。⑷针对BARDl的BRCAl抗体的阳性染色病例的频率。四个抗体中的每一个的阳性染色率是可变的。BARDl N19和C20染色以及BRCAl染色频率较低。在多数结直肠癌病例中观察到BARDl PVC和WFS阳性染色。(B)结直肠癌中的BARDl表达模式。基于每个病例的阳性⑴染色和阴性㈠染色，用4种BARDl抗体获得表达模式。PVC和WFS阳性染色，但N19和C20阴性染色是频率最高的表达模式，“所有四种抗体阳性”染色其次，N19阴性但PVC、WFS和C20阳性染色是观察到的频率第三高的表达模式。(C-F)使用BARDl抗体和BRCAl抗体的免疫组织染色的实例。BARDl N19和C20显示出细胞质颗粒状染色，并且共定位在相同的细胞和区域。BARDl PVC和WFS染色是弥漫性细胞质的。BRCAl染色在细胞质和细胞核中都是颗粒状。示出了以下实例:使用BARDl抗体和BRCAl抗体的阳性染色(C)、使用N-19和C20(D)的可忽略不计的染色(D)、使用所有四种BARDl抗体的阳性染色
(E)和使用N19(F)的阴性染色。标明了比例尺(上图=200 μ m;下图=50 μ m)。图9显示了对于结直肠癌中BARDl和BRCAl的不同抗体染色之间的相关性。(A)BARDl N19、PVC、WFS和C20染色的相关性。BARDl N19和C20染色强相关，PVC和WFS、PVC和C20以及WFS和C20弱相关。N19和PVC之间以及N19和WFS之间未观察到相关。(B)BRCAl和BARDl的抗体染色的相关性。BRCAl染色不与四种BARDl抗体的任何染色相关。图10显示了 BARDl和BRCAl的不同表位表达与结直肠癌中的临床变量的相关性。BARDl N19阳性染色在女性中频率更高(P=0.014) (A)。在不同抗体的BARDl和BRCAl染色与肿瘤组织病理学级别(级别)(B)、肿瘤大小或附近的组织浸润(肿瘤)(C)、淋巴结累及(结)(D)、远端转移(转移)(E)和肿瘤阶段(阶段)(F)之间未发现相关性。通过X 2检验获得P值。图11显示了结直肠癌组织(T )和正常肿瘤周围组织(N)中BARDl转录物的表达和结构。(A)使用外显子I中的正向引物和外显子Il(Exl-1l)或外显子4(Exl-4)中的反向引物对FL BARDl和/或截短的同工型进行的扩增。作为实例，示出了 5名男性患者和5名女性患者的成对的肿瘤周围组织和肿瘤组织。对于相同的样品示出甘油醛3-磷酸脱氢酶表达作为标准物。分子标志物示于左侧(M)。推定的FL BARDl和截短的同工型示于右侦U。肿瘤周围组织和肿瘤组织表达不同模式的同工型:肿瘤周围组织比肿瘤组织中的表达频率低。也在NSCLC中鉴定出的两种新型同工型，κ和Ji，在结直肠癌中表达。(B)相同样品中雌激素受体a (ERa)的扩增，使用MCF-7作为阳性对照(右侧)。在结直肠组织中，无论在男性还是女性的肿瘤周围样品中还是肿瘤样品中都未观察到ERa表达。图12示出了在患有结直肠癌的男性和女性患者的肿瘤组织(肿瘤)和肿瘤周围(正常)组织中的BARDl mRNA同工型表达的比较。对结直肠癌的20对肿瘤组织/肿瘤周围组织样品(包括10名男性和10名女性)的FL BARDl和BARDl同工型进行评分并将其示出。基于各个肿瘤周围样品或肿瘤样品(A)中的存在或不存在，和各个同工型(B、C、D)的表达的存在或不存在，对表达进行定量。(A)基于任何形式的BARDl的存在和不存在，对肿瘤周围组织和肿瘤组织中(包括在男性样品、女性样品中和在联合样品中)BARDl表达的比较。无论在女性(P=O-OOlO)中还是在男性(P=0.0679)中，BARDl表达在来自肿瘤的组织中比在来自肿瘤周围的组织中更丰富和频率更高(P=0.0003)。(B)肿瘤周围组织和肿瘤组织中的FL BARDl和同工型表达的比较。肿瘤中所有形式都上调，具有统计学显著性(对于所有形式P〈0.05)。(C/D)在来自男性和女性的结直肠组织中的FL BARDl和同工型表达的比较。无论在肿瘤周围组织(C)中还是在肿瘤组织(D)中，FL BARDl和同工型的表达在来自男性和女性的组织中相似(对于所有形式P〈0.05)。通过X 2检验获得P值。图13显示FL BARDl和同工型mRNA表达与结直肠癌中的临床病理变量的相关性。(A)在年轻(〈60岁)和老年(>60岁)患者中FL BARDl和同工型表达的比较。FL BARDl和除同工型β之外的所有同工型，在老年患者中比在年轻患者中上调更多。具体而言，同工型φ、δ和Ji的表达与老年患者显著相关(P〈0.01)。(B-E)通过原发肿瘤和淋巴结状态、以及肿瘤阶段和级别，比较FL BARDl和同工型表达。BARDl同工型κ表达与较大尺寸的肿瘤或附近的组织浸润(B)、淋巴结累积(C)、以及晚期(III期和IV期)(D)显著相关。在BARDl同工型表达和肿瘤组织病理学级别之间未发现相关性(E)。通过X 2检验获得P值。未示出Ρ>0.05的比较 。图14显示用于对血液或血清中的BARDl同工型特异性抗体检测的ELISA测试的实例。图15显示用位于ATG处和π中的缺失连接(deletion junction)处的引物进行的同工型η的扩增。鉴定出由外显子2的另外缺失导致的第二同工型，π’。图16显示了对HeLa、MCF7、RPEl和NLF细胞用抗-Bardl抗体进行的蛋白质印迹。Ab Bethyl BL518 (BL)识别在中部外显子4中编码的表位。针对由外显子I中的β-特异性选择性ORF编码的表位产生Ab PGP。识别了 BARDl同工型β和BARDl同工型β-d_5 ( β ’)和BARDl同工型η。图17显示BARDl同工型的siRNA抑制。A) siRNA靶序列的位置。使用外显子4中的两个siRNA，K401和K423。K401位于同工型π的缺失内，Κ423在缺失的上游。B_C)K401比K423对生长的作用小。B) siRNA表达与GFP表达相结合。许多阳性细胞在表达K401的细胞中生长，少量在表达K423的细胞中生长。C)生长曲线确认，K423抑制细胞生长与之前报道的靶向所有形式的BARDl的K78 —样有效。图18显示微RNA影响BARDl和BARDl同工型表达。RT-PCR显示所有形式的BARDl都被miR-203轻微抑制。蛋白质印迹显示miR-203过表达对FL、β和π的强烈抑制。
具体实施例方式虽然可将与本文所述类似或等效的方法和材料用于本发明的实践或测试，但合适的方法和材料描述如下。通过参考并入本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献的全部内容。提供本文所述的出版物和申请仅仅是为了公开在本申请的提交日之前的内容。此处决不能解释为承认由于之前的发明导致本发明没有资格早于此类出版物。此外，材料、方法和实例仅是说明性的，不是意图进行限制。在矛盾的情况下，以本说明书(包括定义)为准。除非另外定义，本文所用所有科技术语具有与本文主题所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。如本文所用，为了便于理解本发明提供以下定义。术语“包含”通常以包括的意思使用，也就是说允许存在一种或多种特征或成分。如说明书和权利要求所用，单数形式的"a"、" an"和"the"包括多个指代对象，除非上下文明确做出了不同规定。例如BARDl同工型是指至少一种BARDl同工型。如本文所用术语“同工型”是同一蛋白的数种不同形式中的一种，如本发明的BARDl蛋白。诸如BARDl等蛋白的不同形式，可以从相关基因生产，或可以由同一基因通过选择性剪接而产生。大量同工型可由单核苷酸多态性或SNP(同一基因的等位基因之间的较小遗传学差异)引起。这些出现在基因的特定的个别核苷酸位置。如本文所用术语“受试对象”或“患者”是本领域公知的，并且在本文中用于指哺乳动物，最优选是人。在某些实施方式中，所述受试对象是需要治疗的受试对`象或患有肺癌和/或结直肠癌的受试对象。但是，在其它实施方式中，所述受试对象可以是尚未发展出肺癌和/或结直肠癌症状的正常受试对象或已经进行针对肺癌和/或结直肠癌的治疗的受试对象。该术语不指示特定的年龄或性别。因此，意图覆盖成年或幼年受试对象，无论男性还是女性。如本文所用，术语“肽”、“蛋白”、“多肽”和“肽的(p^tidic) ”可以相互替换地使用，来指通过相邻残基的α-氨基和羧基之间的肽键连接到其它氨基酸的一系列氨基酸残基。与所预期的相反，申请人已经令人惊奇地在来自100例非小细胞肺癌(NSCLC)和165例结直肠癌的患者群组的每个样品中鉴定出除已知的同工型α、β、η、Υ、ε
和Θ之外的两个新的其它BARDl同工型。另一令人惊奇的特征是同工型α在来自100例NSCLC和165例结直肠癌的患者群组的每个样品中都不存在。将这些新型同工型命名为κ和。实际上BARDl同工型在NSCLC和结直肠癌的肿瘤组织中表达相似的模式，它们都表达两种新型的同工型κ和，同工型κ和Ji不同于在妇科癌症中鉴定出的BARDl同工型(W02008/119802)。该发现表明BARDl的异常表达在女性激素依赖性肿瘤组织和非女性激素依赖性肿瘤组织中可能是不同的。新型同工型κ带有外显子3的缺失，从外显子2翻译到外显子4中不是框内的，但是翻译可以在外显子4内开始。所得的蛋白产物的抗体反应性与同工型β相似。新型同工型带有在外显子4内的编码第301 436位氨基酸的408bp的缺失。同工型π的翻译会产生与抗体PVC和WFS反应但却缺少重要的NLS的蛋白(图4C、E和图6)。同工型π源自新的剪接机制，该剪接机制产生外显子4的部分缺失，但保留外显子1-3以及外显子4的开始部分，因此保留BRCAl结合性RING指结构域。同工型π保留外显子1-3以及外显子4的开始部分，因此保留了被PVC和WFS识别的表位，所述表位为未在任何其它同工型中发现的表位的组合。同工型η可以用抗体PVC和WFS检测，这些抗体在小鼠晚期肺肿瘤中显示出染色增加。因此，同工型η可以是NSCLC中肿瘤发展的致癌驱动物。同工型η中外显子4的部分缺失可能是重要的区域，因为其具有数种癌症相关突变和NLS (图4Ε)，这可能解释PVC和WFS染色的细胞质定位。异常的胞内定位可能影响蛋白修饰，例如磷酸化和蛋白-蛋白相互作用。同工型π对于肺癌似乎特别重要，这是因为其是唯一的在肿瘤组织中显著上调和在肿瘤周围组织中缺乏或仅弱表达的同工型，而所有其它BARDl同工型在肿瘤组织和肿瘤周围组织中都相似地表达(图4Β ;图7)。外显子4的部分缺失引起BARDl上重要的NLS的丧失，这可能解释细胞质定位。由外显子2的缺失导致的另外的同工型π ’，在肺癌和结直肠癌中与同工型π共表达。申请人:证明，FLBARDI (全长BARD1)和剪接同工型在肿瘤组织和肿瘤周围组织中表达，并且可能促成肿瘤发生和发展。但是，同工型η在肿瘤中特异性表达，可能参与致癌发展。FL BARDl在mRNA水平上表达，但不存在FL BARDl的蛋白翻译。因此在蛋白水平上，BARDl同工型，而不是FL BARDl，在来自100个NSCLC和165个结直肠癌患者群组的每个样品中表达。同工型表达和定位与BRCAl不相关，表明BRCA1-BARD1异二聚体的E3泛素连接酶功能在两种类型的癌症中受损。BRCAl蛋白的稳定性和定位极大地依赖于BARDl。导致BRCA1-BARDI缺乏肿瘤抑制功能丧失的FL BARDl的缺失引起基因组不稳定和对凋亡的抗性。除了 FL BARDl的丧失的这个效果之外，过表达的差异性剪接BARDl同工型可能是肿瘤形成的驱动物。选择性剪接是肺癌中经常观察到的现象，并且对于许多调控性蛋白都得到验证。剪接同工型能够翻译成具有拮抗功能的异常蛋白同工型。对于两种BARDl剪接变体，BARDl β和BARDl δ，这已经得到验证，BARDl β和BARDl δ分别通过稳定Aurora B和作用在Era上对FL BARDl功能起拮抗作用。因此，NSCLC中的BARDl同工型表达可能不仅是旁观者，还可能是肿瘤形成的驱动者。实际上，分别被抗体PVC和WFS识别的定位到外显子3和4的表位的表达在诱导了肺癌的小鼠模型的肺肿瘤的侵袭阶段中增加。所有的肿瘤组织样品和肿瘤周围组织样品还表达在妇科癌症中发现的同工型；具体而言是同工型δ。BARDl同工型δ结合和稳定ER a，与BRCA1-BARD1异二聚体的功能相反。由于ERa也在所有样品中表达，BARDl同工型可能通过雌激素而得到上调并参与肺癌中的雌激素信号传导。因此，数种BARDl同工型似乎与癌形成相关。由于癌细胞需要BARDl或BARDl同工型以增殖，NSCLC和结直肠癌中的BARDl同工型表达不仅是旁观者，还可能是肿瘤形成的驱动者。特别是表达定位到外显子3和4的表位的同工型，似乎与NSCLC和结直肠癌中的较短存活都相关。这些表位在小鼠肺癌模型的侵袭性肿瘤中上调。NSCLC和结直肠癌中表达的BARDl同工型源自选择性剪接。例如，剪接同工型能够翻译成具有拮抗功能的异常蛋白同工型。
所有的肺肿瘤样品和肿瘤周围组织样品都表达ERa和同工型δ。但是，在系列结直肠癌病例中不存在ERa mRNA表达，并且在BARDl同工型表达和性别之间未发现差异。但是，令人感兴趣的是，高频率的N19阳性染色与结直肠癌的女性性别显著相关(P=0.014)，并且该发现和NSCLC中与女性性别相关的BARDlN端表位的表达一致(统计学显著性是临界的，P=0.051)。NSCLC中，在女性中观察到BARDl同工型γ、ε和η的高mRNA水平的表达，而在男性中同工型β和κ过表达。同工型Y和ε表达能够通过BARDl Ν19检测，而同工型β、κ和η不能。因此，BARDl同工型表达的蛋白水平和mRNA水平是一致的，表明性别特异性BARDl同工型在这些癌症中表达。BARDl同工型在NSCLC和结直肠癌的肿瘤组织与肿瘤周围组织中显示了不同的表达模式。NSCLC中，除了同工型π之外的所有同工型在肿瘤周围组织中表达并在肿瘤组织中仅轻微增加，但在获自良性肺疾病的对照组织中观察到任何形式的BARDl表达较少或不表达。相反，在结直肠癌中，BARDl同工型在肿瘤组织中表达的频率较高，但在肿瘤周围组织中不表达或表达较少。该结果可以通过根据不同细胞类型对外部刺激或某些病理学状况和/或在肺组织和结直肠组织之间ERa表达的差异的应答而多样性调节选择性剪接来解释。用PVC抗体或WFS抗体或二者获得的阳性染色与NSCLC患者的存活减少相关。但是，四种抗体的阳性染色模式与结直肠癌中的存活较长显著相关，对于Ν19阳性染色情况也是如此；而PVC和WFS阳性染色模式 ，而不是它们各自的阳性染色，与存活较短强相关。事实上，不同的表达模式不仅反映了不同BARDl同工型的表达，还反映了同工型的组合的表达。根据BARDl表达的不同表位的相关性，似乎观察到数种BARDl同工型:NSCLC和结直肠癌中的N端和C端截短形式以及内部缺失形式，以及结直肠癌中N端丧失的其它形式。四种抗体阳性染色的表达模式未表明同工型η的表达，但可能反映了 BARDl的不同同工型的同时表达。事实上，BARDl同工型π的表达与被PVC和WFS识别的表位一致，所述表位为未在任何其它同工型中发现的表位的组合。实际上，PVC和WFS染色是细胞质的染色。PVC和WFS的表达与NSCLC和结直肠癌的不良预后明显相关，PVC和WFS染色还与小鼠肺癌模型中的癌症发展相关。PVC和WFS反应性表位的强表达，加上N端和C端表位的弱表达可能表明这些表位被空间构型和/或蛋白-蛋白相互作用封闭。FL BARDl与BARDl同工型的翻译后调节或差异性蛋白稳定性可能还解释说明了在蛋白水平上FL BARDl的不存在，而其在mRNA水平上存在。申请人:证明BARDl同工型的表达在NSCLC和结直肠癌中是常见的。这些同工型的表达与NSCLC和结直肠癌的预后(不良预后或良好预后)显著相关，强烈地表明BARDl同工型参与了肿瘤形成、发展和致死性。因此，BARDl及其同工型可以是有前景的诊断和预后标志物，不仅用于鉴定对更具侵袭性的治疗具有不良预后可能的个体，还为搜寻有效的分子靶向治疗指明了新方向。例如，诸如κ和等BARDl同工型可以是肺癌和结直肠癌治疗新策略的靶标。检测特异性同工型K和π有助于在潜在的治愈性外科手术治疗之前和/或之后鉴定有死于NSCLC和结直肠癌的最高风险的受试对象，这是因为其是选择用辅助性化疗进行随后治疗的受试对象的关键步骤。
本发明提供了一种用于检测获自受试对象的生物样品中对肺癌和结直肠癌具有特异性的BARDl同工型的存在的方法，所述方法包括检测所述样品中对肺癌和结直肠癌具有特异性的至少一种BARDl同工型的步骤，所述至少一种BARDl同工型选自包含以下同工型的组:同工型Ji，其包含SEQ ID NO:1、其生物活性片段或与SEQ ID NO:1具有至少95%同源性的序列，和同工型κ，其包含SEQ ID NO:2、其生物活性片段或与SEQ ID NO:2具有至少95%同源性的序列，其中，在获自所述受试对象的样品中所述对肺癌和结直肠癌具有特异性的所述BARDl同工型的存在是所述受试对象罹患肺癌和/或结直肠癌、具有升高的患肺癌和/或结直肠癌的风险、以及/或者治疗肺癌和/或结直肠癌后具有复发的风险的标志。优选的是，所述检测步骤包括检测BARDl同工型π和BARDl同工型κ，BARDl同工型π包含SEQ ID NO:1、其生物活性片段或与SEQ ID NO:1具有至少95%同源性的序列，BARDl同工型κ包含SEQ ID NO:2、其生物活性片段或与SEQ ID NO:2具有至少95%同源性的序列。还优选的是，本发明的方法包括检测所述生物样品中由SEQ ID NO:1组成的BARDl同工型和由SEQ ID NO:2组成的BARDl同工型κ的步骤。本发明的方法还包括检测所述生物样品中选自包含以下同工型的组中的至少一种BARDl同工型:同工型JI ’，同工型’包含SEQ ID NO: 105、其生物活性片段或与SEQ ID NO:105具有至少95%同源性的序列，同工型β，同工型β包含SEQ ID NO:5、其生物活性片段或与SEQ ID NO:5具有至少95%同源性的序列，同工型δ，同工型δ包含SEQ ID NO:6、其生物活性片段或与SEQ ID NO:6具有至少95%同源性的序列，和同工型Y，同工型Y包含SEQ ID NO:7、其生物活性片段或与SEQ ID NO:7具有至少95%同源性的序列，同工型β ’，同工型β ’包含SEQ ID NO: 106、其生物活性片段或与SEQ ID NO:106具有至少95%同源性的序列。优选的是，本发明的方法还包括检测所述生物样品中选自包含以下同工型的组中的至少一种BARDl同工型:同工型Ji ’，同工型JI ’包含SEQ ID NO: 105、其生物活性片段或与SEQ ID NO:105具有至少95%同源性的序列，同工型β，同工型β包含SEQ ID NO:5、其生物活性片段或与SEQ ID NO:5具有至少95%同源性的序列，同工型β ’，同工型β ’包含SEQ ID NO: 106、其生物活性片段或与SEQ ID NO:106具有至少95%同源性的序列。还优选的是，本发明的方法包括检测所述生物样品中由SEQ ID NO:1组成的BARDl同工型、由S EQ ID NO:2组成的BARDl同工型κ和由SEQ ID NO:5组成的BARDl同工型β的步骤。在本发明的上下文中，“生物活性片段”是指本发明的BARDl同工型的区域，其对于BARDl同工型的正常功能，例如拮抗功能而言是必须的。生物活性片段包括包含与SEQID NO:1 7、105 106的氨基酸序列具有足够同源性或源自SEQ ID Ν0:1 7、105 106的氨基酸序列的氨基酸序列，其包含的氨基酸比全长BARDl同工型少，并且展示至少一种拮抗活性。通常，生物活性片段包含具有至少一种拮抗活性的结构域或基序。本发明的BARDl同工型的生物活性片段可以是长度为例如10个、25个、50个、100个或更多个氨基酸残基的多肽。此外，其中缺失其它区域的其它生物活性片段可以通过重组技术制备，并对其就本发明的天然BARDl同工型的一种或多种功能活性进行评价。例如，同工型π的一种生物活性片段可以由SEQ ID NO:3组成，同工型κ的一种生物活性片段可以由SEQ ID Ν0:4组成，同工型β的一种生物活性片段可以由SEQ ID NO:4组成。
在另外的实施方式中，本发明的BARDl同工型是以下多肽，所述多肽包含与包含SEQ ID NO:1 7、105 106的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%或99%，优选为95%同源性的氨基酸序列，并且保持包含SEQ ID NO:1 7、105 106的BARDl同工型的活性。为了确定两个氨基酸序列的同源性百分比，为了最佳比较目的将序列进行比对(例如，为了与第二氨基酸序列进行最佳比对，可以在第一氨基酸序列中引入空位)。然后比较在相应氨基酸位置处的氨基酸残基。当第一序列中的位置被与在第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基占据时，则分子在该位置是同源的。比对和百分比同源性可以使用本领域已知的任何合适的软件，例如⑶RRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel等(eds) 1987, Supplement30,第7.7.18小节)中描述的软件确定。优选的程序包括 GCG Pileup 程序、FASTA(Pearson 等(1988)Proc.Natl, Acad.Sci USA 85:2444-2448)和 BLAST(BLAST Manual, Altschul 等,Natl.Cent.Biotechnol.1nf., NatlLib.Med.(NCIB NLM NIH)，Bethesda, Md.，和 Altschul 等，(1997) NAR25:3389-3402)。另一优选的比对程序是 ALIGN Plus (Scientific and Educational Software, PA),优选使用默认参数。发现有用的另一序列软件程序是Sequence Software Package Version6.0中可获得的 TFASTA Data Searching Program (Genetics Computer Group, University ofWisconsin, Madison, ffis.)。片段是与本发明的BARDl同工型的各序列在长度上共有至少40%的氨基酸的序列。可以使用这些序列，只要它们展现与它们所源自的天然序列相同的生物学性质，例如拮抗活性。优选的是，这些序列与其所源自的各序列在长度上共有超过70%、优选超过80%特别是超过90%且最优选95%的氨基酸。这些片段可以通过本领域已知的各种方法和技术(例如化学合成)来制备。本发明还包括BARDl同工型的变体。变体是这样的肽或多肽，它们具有的氨基酸序列在一定程度上不同于天然序列的肽或多肽，它们是通过保守性氨基酸取代而不同于天然序列的氨基酸序列，由此一个或多个氨基酸被具有相同特征和构象作用的另外的氨基酸取代。氨基酸序列变体在天然氨基酸序列的氨基酸序列内的某些位置处拥有取代、缺失、侧链修饰和/或插入。此处将保守性氨基酸取代定义为在以下五组中的一组内的交换:1.小的脂肪族的非极性或轻微极性的残基:Ala、Ser、Thr、Pro、Gly
I1.极性的带正电的残基:His、Arg、LysII1.极性的带负电的残基及其酰胺:Asp、Asn、Glu、GlnIV.大的芳香族残基:Phe、Tyr、TrpV.大的脂肪族的非极性残基:Met、Leu、lie、Val、Cys。应该理解，一些非常规氨基酸也可以是天然存在的氨基酸的合适的取代物。例如，Lys残基可以被鸟氨酸、高精氨酸、nor-Lys、N-甲基-Lys、N, N- 二甲基-Lys和N, N, N-三甲基-Lys取代。Lys残基还可以被合成的碱性氨基酸取代，所述碱性氨基酸包括，但不限于，N-1-(2-吡唑啉基)-Arg、2-(4-哌啶基)-Gly、2-(4-哌啶基)_Ala、2_[3_(2S)吡咯啉基]-Gly和2-[3-(2S)吡咯啉基]-Ala。Tyr残基可以被4-甲氧基酪氨酸(MeY)、间-Tyr、邻-Tyr、nor-Ty;r、1251_Tyr、单齒素-Tyr、二齒素-Tyr、0_ 横-Tyr、0_ 憐-Tyr 和硝基-Tyr取代。Tyr残基还可以被3_羟基或2_羟基异构体(分别为间-Tyr或邻-Tyr)和相应的O-磺-和O-磷衍生物取代。Tyr残基还可以被合成的含有羟基的氨基酸取代，合成的含有羟基的氨基酸包括但不限于4-羟基甲基-Phe、4-羟基苯基-Gly、2，6- 二甲基-Tyr和5-氨基-Tyr。脂肪族氨基酸可以被带有非天然脂肪族支链或直链侧链CnH2n+2的合成衍生物取代，CnH2n+2 中η是从I至最多8且包括8的数值。合适的被非常规氨基酸保守性取代的实例在W002/064740中给出。插入包括加入一个或多个天然存在的或非常规的氨基酸残基。缺失包括一个或多个氨基酸残基的缺失。此外，由于天然肽(为L型)的固有问题是被天然酶降解，可以将本发明的生理活性蛋白制备为包括所述肽的D型和/或“逆反异构体(retro-1nverso isomers) ”。优选的是，制备本发明生理活性蛋白的较短部分的逆反异构体、变体或组合。例如如Sela和Zisman在出版于FASEB J.1997 May; 11 (6):449-56的综述中所述，为已知序列的肽制备逆反肽。“逆反异构体”是指直链肽的异构体，其中序列的方向相反并且各氨基酸残基的手性反转，因此可以不存在端基互补。本发明还包括其中一个或多个肽键已经被备选类型的不容易受肽酶切割影响的共价键代替的类似物(“肽模拟物”)。在注入受试对象之后肽的蛋白水解降解成为问题的情况下，将特别敏感的肽键替换为不可切割的肽模拟物会使所得的肽更稳定，因此作为活性物质更有用。此类模拟物以及将它们弓I入肽的方法是本领域公知的。优选的是，所述生物样品选自包含以下样品的组:活组织检查样品、组织学样品、肺液、冷冻组织样品、肿瘤组织样品、粪便样品、脑脊髓液(CSF)、循环肿瘤细胞(CTC)和血液样品，更优选的是受试对象是人类。最优选的是生物样品是源自获自受试对象的血液样品的血清。检测本发明的BARDl同工型的存在可以通过常规方法进行，例如蛋白免疫染色、蛋白免疫沉淀、免疫电泳、免疫印迹、BCA蛋白检验、蛋白质印迹、分光光度法。BARDl同工型的存在还可以利用常规方法经由其相应的mRNA的存在来检测，所述常规方法例如RNA印迹、核酸酶保护检验(NPA)、原位杂交和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。优选的是，在循环肿瘤细胞(CTC)中检测BARDl同工型特异性RNA的表达。在本发明的实施方式中，BARDl同工型的存在通过使用对本发明的BARDl同工型具有特异性的抗体来检测。优选的是，所述抗体是与至少一种BARDl同工型特异性结合的多克隆抗体或单克隆抗体或它们的片段，所述BARDl同工型包含选自包含SEQ ID NO:1_7、105-106、其生物活性片段或与SEQ ID NO:1_7、105-106具有至少95%同源性的序列的组中的氨基酸序列。还优选的是，所述抗体是与至少一种BARDl同工型的不同表位特异性结合的抗体或其片段的组合，所述BARDl同工型包含选自包含SEQ ID NO: 1_7、105-106、其生物活性片段或与SEQ ID NO: 1-7、105-106具有至少95%同源性的序列的组中的氨基酸序列。优选的是，所述表位是外显子3和4。优选的是，所述多克隆抗体或单克隆抗体或抗体的所述组合与至少一种BARDl同工型特异性结合，所述BARDl同工型包含选自包含SEQ ID NO:1和2、其生物活性片段或与SEQ ID NO:1-2具有至少95%同源性的序列的组中的氨基酸序列。例如，允许检测本发明的BARDl同工型的抗体为以下抗体:- N19、C20 和 H300(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA),-生成PVC和WSF(外显子4的开始部分)并如之前所述应用(Irminger-Finger
I等，Mol Cell 8:1255-66, 2001 ;Feki A 等，Oncogene 24:3726-36, 2005 ；Hayami R等，Cancer Res 65:6-10, 2005 ；Li L 等，Int J Biochem Cell Biol 39:1659-72, 2007 ；Redente EF 等，Anti cancer Res 29:5095-101, 2009 ；Fabbro M等，J Biol Chem 277:21315-24，2002)，- BL(Bethy Laboratories),- JH2 和 JH3 (Gautier 等 Cancer Rsearch, 2000),- PGP(Ryser 等 ，Cancer Research, 2000),- ELS 和 KPD,由 Applicants 生产- MIQ(Irminger-Finger 等，JCB1998)所述检测可以通过免疫组织化学分析进行，并总结于表I中:- BARDl同工型π应该对Ν19 (或PVC或MIQ)加上或者BL(或WFS)为阳性，并且对JH2为阴性。为了区分同工型π和η ’ U-d-2)，可以通过蛋白质印迹中的尺寸(size)来完成。- BARDl同工型κ应该对BL(或WFS)为阳性，并且对Ν19 (或PVC或MIQ)为阴性。- BARDl同工型β应该对PGP，以及或者WFS或BL为阳性。为了区分同工型β和β’(β-(1-5)，同工型β对ELS为阳性。- BARDl同工型δ应该对Ν19为阳性，对PVC (或MIQ)为阴性并且对BL (或WFS)为阴性。- BARDl同工型Y应该对Ν19以及任一 PVC(或MIQ)为阳性，但对C20 (或KPD)为阴性。
权利要求
1.一种用于检测获自受试对象的生物样品中对肺癌和结直肠癌具有特异性的BARDl同工型的存在的方法，所述方法包括在所述样品中检测对肺癌和结直肠癌具有特异性的至少一种BARDl同工型的步骤，所述至少一种BARDl同工型选自包含以下同工型的组 同工型Ji，同工型Ji包含SEQ ID NO :I、其生物活性片段或与SEQ ID NO :I具有至少95%同源性的序列，和 同工型K，同工型K包含SEQ ID NO :2、其生物活性片段或与SEQ ID NO :2具有至少95%同源性的序列， 其中，在获自所述受试对象的样品中所述对肺癌和结直肠癌具有特异性的BARDl同工型的存在是所述受试对象罹患肺癌和/或结直肠癌、患肺癌和/或结直肠癌的风险增加、以及/或者治疗肺癌和/或结直肠癌后具有复发的风险的标志。
2.如权利要求I所述的方法，其中，所述方法包括在所述生物样品中检测由SEQIDNO 1组成的BARDl同工型和由SEQ ID NO 2组成的BARDl同工型κ的步骤。
3.如权利要求I或2所述的方法，其中，所述方法还包括在所述样品中检测选自包含以下同工型的组中的至少一种BARDl同工型 同工型Ji ’，同工型Ji ’包含SEQ ID NO : 105、其生物活性片段或与SEQ ID NO :105具有至少95%同源性的序列， 同工型β，同工型β包含SEQ ID NO :5、其生物活性片段或与SEQ ID NO :5具有至少95%同源性的序列， 同工型δ，同工型δ包含SEQ ID NO :6、其生物活性片段或与SEQ ID NO 6具有至少95%同源性的序列，和 同工型Y，同工型Y包含SEQ ID NO :7、其生物活性片段或与SEQ ID NO :7具有至少95%同源性的序列， 同工型β'，同工型β'包含SEQ ID NO : 106、其生物活性片段或与SEQ ID NO :106具有至少95%同源性的序列。
4.如权利要求3所述的方法，其中，所述方法包括在所述生物样品中检测由SEQIDNO 1组成的BARDl同工型、由SEQ ID NO 2组成的BARDl同工型κ和由SEQ ID NO 5组成的BARDl同工型β。
5.如权利要求I 4中任一项所述的方法，其中，所述生物样品选自包含以下样品的组活组织检查样品、组织学样品、肺液、冷冻组织样品、肿瘤组织样品、粪便样品、脑脊髓液(CSF)、循环肿瘤细胞(CTC)和血液样品。
6.如权利要求I 5中任一项所述的方法，其中，所述受试对象是人类。
7.如权利要求I 6中任一项所述的方法，其中，所述BARDl同工型的存在通过使用对所述BARDl同工型具有特异性的抗体进行检测。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述抗体是与至少一种BARDl同工型的不同表位特异性结合的抗体或其片段的组合，所述至少一种BARDl同工型包含选自包含SEQ ID NO1-7、105-106、其生物活性片段或与SEQ ID NO : 1_7、105-106具有至少95%同源性的序列的组中的氨基酸序列。
9.如权利要求I 6中任一项所述的方法，其中，所述BARDl同工型的存在通过检测编码至少一种BARDl同工型的mRNA的水平来检测，所述至少一种BARDl同工型包含选自包含SEQ ID NO : 1-7、105-106、其生物活性片段或与SEQ ID NO : 1-7、105-106具有至少95%同源性的序列的组中的氨基酸序列。
10.如权利要求I 6中任一项所述的方法，其中，所述BARDl同工型的存在通过检测获自所述受试对象的血液样品中对所述BARDl同工型具有特异性的自身免疫抗体的存在来检测，并且其中使用选自包含SEQ ID NO :13-80的组中的至少四种抗原以检测对所述BARDl同工型具有特异性的所述自身免疫抗体。
11.如权利要求I 6中任一项所述的方法，其中，所述BARDl同工型的存在通过以下方式来检测 检测编码至少一种BARDl同工型的mRNA的水平，所述至少一种BARDl同工型包含选自包含SEQ ID NO :1-7、105-106、其生物活性片段或与SEQ ID NO : 1-7、105-106具有至少95%同源性的序列的组中的氨基酸序列，和 检测获自所述受试对象的血液样品中对所述BARDl同工型具有特异性的自身免疫抗体的存在，并且其中使用选自包含SEQ ID NO :13-80的组中的至少四种抗原以检测对所述BARDl同工型具有特异性的所述自身免疫抗体。
12.—种在权利要求I 6所述的方法中用作生物标志物的分离和/或纯化的多肽，所述分离和/或纯化的多肽包含SEQ ID NO: I、其生物活性片段或与SEQ ID NO : I具有至少95%同源性的序列。
13.—种在权利要求I 6所述的方法中用作生物标志物的分离和/或纯化的多肽，所述分离和/或纯化的多肽包含SEQ ID NO :2、其生物活性片段或与SEQ ID NO :2具有至少95%同源性的序列。
14.选自包含SEQID NO : 13 80的组中的肽，所述肽在权利要求I 6所述的用于检测BARDl同工型的存在的方法中使用。
15.一种用于检测获自受试对象的样品中对肺癌和结直肠癌具有特异性的BARDl同工型的存在的试剂盒，所述试剂盒包含 至少一种多核苷酸引物或探针，其中所述多核苷酸引物或探针对编码至少一种所述BARDl同工型的多核苷酸具有特异性，所述至少一种BARDl同工型包含选自包含SEQ IDNO : 1-7、105-106、其生物活性片段和/或与SEQ ID NO : 1-7、105-106具有至少95%同源性的序列的组中的氨基酸序列，和/或 与至少一种所述BARDl同工型的不同表位特异性结合的抗体或其片段的组合，所述至少一种BARDl同工型包含选自包含SEQ ID NO : 1_7、105-106、其生物活性片段或与SEQ IDNO : 1-7、105-106具有至少95%同源性的序列的组中的氨基酸序列，和/或 至少一种选自包含SEQ ID NO : 13 80的组中的肽。
16.一种将肺癌和结直肠癌与妇科癌症相区分的方法，所述方法包括在获自受试对象的生物样品中检测至少一种对肺癌和结直肠癌具有特异性的BARDl同工型的步骤，所述BARDl同工型选自包含以下同工型的组 同工型Ji，同工型Ji包含SEQ ID NO :I、其生物活性片段或与SEQ ID NO :I具有至少95%同源性的序列，和 同工型κ，同工型κ包含SEQ ID NO :2、其生物活性片段或与SEQ ID NO :2具有至少95%同源性的序列，其中，所述对肺癌和结直肠癌具有特异性的BARDl同工型的存在是肺癌和/或结直肠癌的标志。
17.选自包含SEQID NO : 13 80的组中的肽，所述肽在检测获自受试对象的生物样品中BARDl同工型的存在的方法中用作抗原，其中所述BARDl同工型的存在通过检测对所述BARDl同工型具有特异性的自身免疫抗体的存在来检测，并且其中所述BARDl同工型在所述样品中的存在是所述患者罹患癌症的标志。
18.一种抗体或其片段，所述抗体或其片段与SEQ ID NO :144所示的表位结合。
19.一种在治疗和/或预防肺癌和结直肠癌的方法中使用的抗体或其片段，所述抗体或其片段与SEQ ID NO :144所示的表位结合。
20.一种在治疗和/或预防肺癌和结直肠癌的方法中使用的重组SiRNA分子，所述重组siRNA分子与单链或双链RNA分子结合，其中所述单链或双链RNA分子包含编码至少一种BARDl同工型的mRNA Jy^iSBARDl同工型包含选自包含SEQ IDNO : 1-7、105-106、其生物活性片段或与SEQ ID NO : 1-7、105-106具有至少95%同源性的序列的组中的氨基酸序列，由此所述BARDl同工型的表达受到抑制。
21.一种在治疗和/或预防肺癌和结直肠癌的方法中使用的BARDl同工型的生物活性的调节剂，所述BARDl同工型包含选自包含SEQ ID NO : 1_7、105-106、其生物活性片段或与SEQ ID N0:l-7、105-106具有至少95%同源性的序列的组中的氨基酸序列。
22.如权利要求20所述的BARDl同工型的生物活性的调节剂，其中，所述调节剂是选自包含SEQ ID NO. 111 140的组中的微RNA。
全文摘要
本发明涉及对肺癌和结直肠癌具有特异性的新型BARD1同工型、其检测方法以及用于治疗和/或预防肺癌和结直肠癌的方法。
文档编号C12Q1/68GK103238069SQ201180044183
公开日2013年8月7日 申请日期2011年8月17日 优先权日2010年8月17日
发明者I·艾尔明格-菲格尔, 张永强 申请人:日内瓦大学, 日内瓦大学医院
最新回复(0)