逆转录病毒检测的制作方法

xiaoxiao2020-6-24  5

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专利名称:逆转录病毒检测的制作方法
技术领域
本发明涉及用于检测受试者或样品中的逆转录病毒的方法和组合物。
背景技术
异嗜性鼠白血病病毒相关病毒(XMRV)是最近发现的类似于异嗜性MLV的人Y逆转录病毒,但是其与异嗜性MLV在其包膜的序列是有区别的((Urisman等,PLOSpathogens2(3):e25,2006 ;和 Dong 等,PNAS 104:1655,2007)。所有到目前为止检验的分离体均是彼此高度同源的(>98%的序列同一性),并使得与异嗜性MLV有区别。该序列保守的原因目前还不清楚。原始的感染克隆称为XMRV VP62 (GenBank登录号EF185282)。最初描述XMRV与前列腺癌有关,并提出进一步的相关(R.Schlaberg等,PNAS2009,doi_10.1073_pnas.0906922106),6-23 %的前列腺癌患者检测呈阳性。另外,V.C.Lombardi 等(Science 2009 doil0.1126/science.1179052)证明可能与慢性疲劳综合征相关,与3.7%的正常者相比,67%的患者检测呈阳性。来自研究者的在美国一般人群中的患病率的总体估计在2-4%的范围内。不过,在欧洲最近的几项研究都没有以相似的频率或相似的相关检测到XMRV(Fischer等,Journal of Clinical Virology 43:277-2832008 ;Hohn 等,Retrovirology 6:92 2009;FJM van Kuppeveld 等,BMJ 340:cl018,2010)。在德国的一项研究中,Fischer等发现105名前列腺癌患者中有I名以及70名对照受试者中有I名是XMRV阳性。Hohn等在德国筛查了 589名前列腺癌患者,没有检测到一个阳性的。在荷兰,Van Kuppeveld等在32名慢性疲劳综合征患者中或在42名匹配的对照者中也没有检测到任何DNA或RNA阳性。最近的来自Fischer等的另一篇文章(EmergInfect Dis.2010)显示,在德国的一项研究中,来自162名免疫抑制患者的痰的RNA约10%阳性,以及168名正常患者的痰RNA 2-3%阳性。这些测定看起来并没有不同,并且对差异并没有提供解释。结果的不一致对目前测试方法的可靠性提出了质疑,特别是DNA扩增。根据Lombardi等的引领,所有研究者迄今用基于XMRV序列的引物应用巢式PCR,之后样品在凝胶上跑胶和寻找可见带(visible band)。已知该方法在灵敏 度上是可变的,取决于核酸样品的质量。还描述了 XMRV RNA的检测主要使用基于Urisman等,2006的Dong等的方法,PNAS 2007。在该测定中,RNA从组织和/或血液制备,逆转录为cDNA,以及通过使用XMRV特异性引物的QPCR检测cDNA。如所注意到的,这导致了不一致的结果(Enserink等,Science329:18-19,2010)。对这些测试已声称不同的灵敏度,但是不可能验证这些中的任一个,并且这些测定看起来被不完全地表征。
最近已经开发了对人血液中XMRV的基于PCR的诊断筛选测定法(www[.] vipdx.com),该测定法使用巢式PCR和扩增产物的凝胶检测(Lombardi等),对于该巢式DNA PCR有约600个前病毒拷贝/测试的估计灵敏度。另外,Lombardi等的报道没有证明gag和erw检测的完全一致,观察到在一些受试者中gag阳性和env阴性。这归因于在测定中的可变性。在所有目前开发的测定法中,已极小心地使用将区分MLV和XMRV的引物,以使得仅检测XMRV。因此,非常需要用于来自志愿者或患者的可得样品中的XMRV DNA和RNA的可靠且经过验证的测定法,以确定阳性的真实频率以及是否与疾病相关。另外,可靠的血液筛选测定是不可获得的。最近的数据表明在许多情况下XMRV的检测由人为产物(artifact) (Paprotka T., Science, 333,97-101, 2011)或小鼠 DNA 的污染(RobinsonMJ.等,Retrovirology, 7:108 do1:10.1186/1742-4690-7-108,2010)引起的。此外,基于MLV的基因治疗载体正被使用,包括基于复制型MLV的载体。例如,已经使用基于双嗜性MLV且携带额外的胞嘧啶脱氨酶基因的复制性逆转录病毒作为癌症治疗剂,所述癌症包括导致多形性成胶质细胞瘤(GBM)的原发性脑癌(Tai等,Mol.Ther.,12:842-851 2005 ;http:(//)oba.0d.nih.gov/oba/RAC/meetings/Jun2009/976_Agh1.pdf ;W02010036986)。Tocagen 公司(San Diego, CA)正在开发示例性载体,称为Toca511(临床试验.政府试验#NCT01156584)。Toca511给药后,给予患者5-氟胞嘧啶,其原位转化为有效的抗癌化合物5-氟尿嘧啶。由于病毒通常仅能在肿瘤中复制,这导致非常特异的抗癌效果。为了确定在肿瘤外是否存在复制,为了安全和/或与效力的相关性,需要检测血液中前病毒DNA和血浆中MLV RNA的测定法。FDA目前要求对经历使用整合型病毒载体进行此类研究性治疗的患者进行治疗后15年的随访(行业指南-基于逆转录病毒载体的基因治疗产品中和在使用逆转录病毒载体的临床试验中的患者随访过程中,测试复制型逆转录病毒的补充指导意见=FDA生物制品评价和研究中心,2006年11月;http://www.fda.gov/Bio1gicsBloodVaccines/GuidanceCompIianceRegulatorylnform ation/Guidances/CellularandGeneTherapy/ucm072961.htm) 0 这需要测定法来完成,用于一般性的病毒性疾病以及特别是逆转录病毒性疾病的疾病风险和疾病进展的普遍接受的标记是是随着时间血液或血细胞中的病毒水平(Gurunathan S, Habib RE等,Vaccine.2009;27:1997-2015 ;Low A.,Okeoma CM.等,Virology 2009 ;385:455-463)。另一方面,在肿瘤中病毒的复制可能漏到外周和血流中,因此监测血液中作为DNA或RNA的病毒序列的出现和水平的测定可用于确定是否有有效的治疗以及是否需要修改治疗方案,例如再给予该病毒载体或使用将有利于病毒在肿瘤中复制的辅助剂(如类固醇)。

发明内容
本发明提供用于样品、组织或受试者中MLV相关多核苷酸的扩增和检测的寡核苷酸引物和探针。在一个实施方案中,本发明提供能够扩增多株MLV和XMRV的引物以及能够检测MLV或XMRV之一或两者的探针。在另一实施方案中,本发明提供引物和探针,用于监测经历用表达异源基因如胞嘧啶脱氨酶的复制型逆转录病毒治疗的受试者。在该实施方案中,使用“伴随”诊断以确保用于该治疗的载体的效果、表达、传播和长期感染。
因此,本发明提供分离的寡核苷酸,其由选自以下组成的组的序列组成:SEQ IDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或表 I 或 2 中所列的任
何序列和与任何前述序列至少95%相同且能与MLV相关的多核苷酸杂交的寡核苷酸。在一些实施方案中,引物和探针可以与前述序列或表I或2中列出的序列在Y和/或:V端有1-10个核苷酸的不同。在另一个实施方案中,引物对由SEQ ID NO:1和2以及与SEQ IDNO:1和2至少95%相同且与MLV相关的多核苷酸杂交的序列组成。在再另一个实施方案中,引物对由SEQ ID NO:4和5以及与SEQ ID NO:4和5至少95%相同且与MLV相关的多核苷酸杂交的序列组成。在再另一个实施方案中,引物对由SEQ ID NO:7和8以及与SEQID NO:7和8至少95%相同且与MLV相关的多核苷酸杂交的序列组成。在再另一个实施方案中,引物对由SEQ ID NO:10和11以及与SEQ ID NO:10和11至少95%相同且与MLV相关的多核苷酸杂交的序列组成。在再另一个实施方案中,引物对由SEQ ID NO:13和14以及与SEQ ID NO:13和14至少95%相同且与MLV相关的多核苷酸杂交的序列组成。在再另一个实施方案中,引物对由SEQ ID NO: 16和17以及与SEQ ID NO:16和17至少95%相同且与MLV相关的多核苷酸杂交的序列组成。在再另一个实施方案中,引物对由SEQ ID NO:19和20以及与SEQ ID NO:19和20至少95%相同且与MLV相关的多核苷酸杂交的序列组成。在再另一个实施方案中,所述寡核苷酸包含选自XMRV和MLV之间同源区域的引物。本发明还提供确定在将要经历或正在经历使用MLV相关病毒进行逆转录病毒基因递送治疗的受试者中病毒含量的方法,该方法包括:从所述受试者获得样品;在适合核酸扩增的条件下使所述样品与上述的一个或多个引物对接触,以获得扩增产物;使所述样品接触与扩增产物杂交的一个或多个探针;检测杂交产物;指示受试者具有包含MLV相关病毒的病毒含量。在一个实施方案中,所述MLV相关病毒是用于基因递送的重组逆转录病毒载体。在另一个实施方案中,所述MLV相关病毒是XMRV病毒。在再另一个实施方案中,在递送MLV相关逆转录病毒载体用于基因递送之前进行所述方法。在再另一个实施方案中,在递送MLV相关逆转录病毒载体用于基因递送之后进行所述方法。MLV相关病毒包 含5’ LTR、gag基因、pol基因、env基因、与要递送的异源多核苷酸连接的env基因调节域3'和3’LTR以及在5’LTR中用于在哺乳动物细胞中表达的启动子。在另一实施方案中,所述调节域是内部核糖体进入位点(IRES)。在再另一个实施方案中,所述异源多核苷酸编码具有胞嘧啶脱氨酶活性的多肽。在实施方式和以上描述中,该方法监测MLV相关逆转录病毒载体的传播。在另一个实施方案中,该方法在病程年(courseyear)期间定期进行。本发明还提供用于检测样品中病毒剂存在的方法,该方法包括:使用定量聚合酶链反应或其它扩增方法测量样品中多核苷酸的量,所述定量聚合酶链反应或其它扩增方法包括使用选自以下组成的组的寡核苷酸引物/探针组合:(i) SEQ ID NO:1、2和3 ;(ii)SEQID NO:4、5 和 6 ; (iii)SEQ ID NO:7、8 和 9 ; (iv) SEQ ID NO:10、11 和 12 ;和(v)根据权利要求9的引物对和与XMRV和MLV两者具有至少95%同一性的相应探针。在一个实施方案中,所述多核苷酸是DNA或RNA。在以上各种实施方案中,通过定量聚合酶链反应例如RT-qPCR进行定量和扩增。在上述方法的任何一个中,该测量检测病毒剂相关核酸的单个拷贝。在前述实施方案的任何一个中,所述样品可以是哺乳动物组织(例如血液)。在前述实施方案的任何一个中,要检测的病毒剂可以是基因治疗载体。在一个实施方案中,所述基因治疗载体是复制型载体。在另一个实施方案中,在包括基因治疗载体治疗的治疗方案之前进行所述方法。在再另一个实施方案中,在包括基因治疗载体的治疗方案之后对受试者进行所述方法。可进行所述方法以监测受试者中包括基因治疗载体的治疗方案的剂量。在再另一个实施方案中,所述基因治疗载体包括复制型MLV载体。在再另一个实施方案中,在包括基因治疗载体的治疗方案之前进行所述方法。在一个实施方案中,在包括基因治疗载体的治疗方案之后进行所述方法。在再另一个实施方案中,可进行所述方法以监测包括基因治疗载体的治疗方案的剂量。本发明还提供用于进行前述方法中任何一个且包含本发明公开的寡核苷酸组合物(例如SEQ ID NO:1-21, I和2)中任何一个的试剂盒。本发明还提供用于检测从固定的组织病理学切片提取的样品中的< 100拷贝的MLV相关DNA的方法。本发明还提供用于检测从固定的组织病理学切片提取的样品中的< 100拷贝的MLV相关RNA的方法。本发明还提供检测MLV和XMRV两者以及它们的变体的方法。在其它实施方案中,所述方法仅检测MLV相关的病毒,而不检测XMRV。在某些实施方案中,所述方法检测XMRVgag和MLV gag。在再另一个实施方案中,所述方法检测XMRV pol和MLV pol。本发明提供检测XMRV Env和MLV Env的方法。本发明还提供用于检测来自哺乳动物宿主的血浆或血清中XMRV或MLV相关病毒的方法。本发明提供选择性检测人中MLV相关病毒而不检测XMRV的方法,该方法包括使用选自以下组成的组的引物:SEQ ID N0:1(^P11;SEQ ID吣:13和14說0 ID NO:16和17;SEQ ID NO:19和20 ;与前述序列至少95%相同的序列;及它们的组合,使用本文所述的方法。本发明还提供确定人受试者是否有患前列腺癌或慢性疲劳综合征的风险的方法,所述方法包括使用如SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14所述的引物对和探针或如表I或2所述的引物/探针扩增来自受试者的样品中的多核苷酸,其中扩增产物的存在指示前列腺癌或慢性疲劳综合征的风险。本发明还提供针对MLV、MLV变体或XMRV感染筛选血液供给或组织库的方法,所述方法包括利用如SEQ ID NO:4、5、7、8、10、11、13、14所述的弓丨物或表I或2中的任何弓I物针对血液供给和组织库进行扩增反应,和检测扩增产物。本发明涉及可在人组织血液或血清中存在的异嗜性鼠白血病病毒相关病毒(XMRV)或与鼠白血病病毒相关的其它逆转录病毒的检测。特别地,本发明涉及敏感可靠的定量PCR测定,用于检测来自人和动物受试者血液DNA中XMRV前病毒,以及通过反转录(RT)和聚合酶链反应用于敏感且可靠地检测来自人和动物受试者血浆或血清的XMRVRNA (可能来自病毒颗粒)。在一个实施方案中,定量测定是使用基于XMRV病毒基因组构建的引物和探针的'「aqMa ri 测定法。与使用XMRV特异性引物/探针组和避免与MLV同源的引物/探针组的其他技术相反,本发明构建基于PCR的测定法,其通过使用MLV特异性qPCR引物和探针检测人样品中可以是或不是XMRV的MLV相关病毒,该测定法还检测XMRV。这些测定法可与用于与XMRV不同源的MLV序列的测定法组合以确定在用复制型逆转录病毒治疗的患者中是否发生了重组,所述患者还可以是XMRV阳性的。本发明还涉及包含用于检测XMRV和MLV相关病毒的核酸分子的诊断试剂盒。此外,为了当监测用MLV相关载体治疗的患者时,检测MLV载体,本发明还公开了检测由MLV载体携带的转基因的诊断试剂盒。本发明的一个或多个实施方案的细节在附图和以下说明中阐述。从所述说明和附图及权利要求,其它特征、目的和优点将是显而易见的。


图1显示在pUC57-XMRV gag质粒DNA中的XMRV gag标准。插入相应于XMRV VP62克隆序列(NC_007815)的核苷酸628至764。衍生的序列由BioBasic公司合成,并在BamHI和ApaI位点之间的Sma I位点插入pUC57骨架(backone)中。图2显示在pET28b-XMRV env质粒DNA中的XMRV env标准序列。插入相应于XMRVVP62克隆序列(NC_007815)的核苷酸6252至6391。衍生的序列由BioBasic公司合成,并在BssHI和HpaI位点之间的EcoRV位点插入pET28b+骨架中。图3显不在pAZ3_emd质粒DNA中的MLV poll和pol2标准序列,该pAZ3_emd质粒DNA编码亲嗜性莫洛尼MLV gag-pol、双嗜性env和env下游的IRES-GFP emd盒(Logg等.J.Virol.75:6989-6998,2001)。图4显示用于治疗GBM患者的Toca511 (前病毒形式)和XMRV前病毒(VP62,NCBI参考序列NC_007815.1)序列的比较,注意LTR、gag、pol和包膜区域的全部同源性。还显示poll和pol2扩增子区域。在pAZ3_emd质粒DNA中的MLV poll和pol2标准序列。图5 显示 XMRV 序列(VP62, NCBI ref.NC_007815.1,目标序列(Sbjct))和MoMLV(NCBI参考NC _001501.1,待查序列(query))的BLAST核酸序列比较,显示完全同源的20个或更多个核苷酸序列(下划线/高亮显示)。图6显示在IEO至1E7的pUC57_XMRV gag质粒DNA扩增曲线中的XMRVgag标准。图7显示在IEO至1E7的pET28b_XMRV env质粒DNA扩增曲线中的XMRV env标准。图8A-C显示a) I阶段qPCR方案:用XMRV gag引物/探针组靶向的pUC57_XMRVgag质粒标准。用XMRV gag弓丨物靶向TE中的pUC57_XMRV gag质粒DNA,并进行I阶段qPCR方案。计算平均Ct和标准差;b)显示I阶段qPCR方案:用XMRV gag引物/探针组靶向的对照。用XMRV gag引物/探针组靶向22Rvl gDNA阳性对照、未感染(na‘ive)人血液gDNA阴性对照和NTC,并进行I阶段qPCR方案。计算平均Ct、标准差和拷贝数/反应。“ND”意思是“未检出”;c)显示I阶段qPCR方案:用XMRV gag引物/探针组靶向的掺入的人血液gDNA。未掺杂(neat)人血液gDNA中掺入8个对数(log)浓度的pUC57_XMRV gag质粒DNA(1E0至1E8个拷贝/反应)。用XMRV gag引物/探针组靶向样品,并进行I阶段qPCR方案。确定平均Ct、标准差、拷贝/反应和输入拷贝/反应的%回收率(%回收率通过使用以下公式确定:检测到的拷贝/反应除以输入拷贝/反应再乘以100)。图9A-C显示a) I阶段qPCR方案:用XMRV env引物/探针组靶向的pET28b_XMRVenv质粒标准。用XMRV env引物靶向在TE中的pET28b_XMRV env质粒DNA,并进行I阶段qPCR方案。计算平均Ct和标准差;b)显示I阶段qPCR方案:用XMRV env引物/探针组靶向对照。用XMRV env引物/探针组靶向22Rvl gDNA阳性对照、未感染人血液gDNA阴性对照和NTC,并进行I阶段qPCR方案。计算平均Ct、标准差和拷贝数/反应。“ND”意思是“未检出”;C)显示I阶段qPCR方案:用XMRV env引物/探针组靶向的掺入的人血液gDNA。未掺杂人血液gDNA中掺入8个对数浓度的pET28b-XMRV env质粒DNA(1E0至1E8个拷贝/反应)。用XMRV env引物/探针组靶向样品,并进行I阶段qPCR方案。确定平均Ct、标准差、拷贝/反应和输入拷贝/反应的%回收率回收率通过使用以下公式确定:检测到的拷贝/反应除以输入拷贝/反应乘以100)。图10A-C显示a) I阶段qPCR方案:用XMRV pol2引物/探针组靶向的pAZ3_emdpol2质粒标准。用XMRV pol2引物靶向TE中的pAZ3_emd pol2质粒DNA,并进行I阶段qPCR方案。计算平均Ct和标准差;b)显示I阶段qPCR方案:用XMRV pol2引物/探针组靶向对照。用XMRV pol2引物/探针组靶向22Rvl gDNA阳性对照和未感染人血液gDNA阴性对照,并进行I阶段qPCR方案。计算平均Ct、标准差和拷贝数/反应。“ND”意思是“未检出” ;c)显示I阶段qPCR方案:用XMRV pol2引物/探针组靶向的掺入的人血液gDNA。未掺杂人血液gDNA中掺入8个对数浓度的pAZ3-emd pol2质粒DNA(1E0至1E8个拷贝/反应)。用XMRV pol 2引物/探针组靶向样品,并进行I阶段qPCR方案。确定平均Ct、标准差、拷贝数/反应和输入拷贝/反应的%回收率回收率通过使用以下公式确定:检测到的拷贝/反应除以输入拷贝/反应乘以100)。图1lA-B显示a) 0阶段比I阶段qPCR方案:pUC57 XMRV gag标准。进行0阶段和I阶段qPCR方案,使用XMRV gag引物靶向pUC57 XMRV gag质粒。‘pUC57 XMRV gag’指掺入单个qPCR反应中的pUC57 XMRV gag拷贝数;b)显示0阶段对比I阶段qPCR方案:pUC57XMRV gag掺入物到CA人血液gDNA中。进行0阶段和I阶段qPCR方案,靶向pUC57 XMRVgag掺入物到CA人血液gDNA中,并使用XMRV gag引物。‘pUC57 XMRV gag/001 gDNA’指在单个qPCR反应中掺入到供体001 gDNA中的pUC57 XMRV gag拷贝数,'00广指,供体#001',,ND'意思是‘未检出,。图12A-B)显示a) 0阶段对比I阶段qPCR方案:pET28b XMRV env标准。进行0阶段和I阶段qPCR方案,使用XMRV env引物靶向pET28b XMRV env质粒。‘pET28b XMRVenv’指掺入到单个qPCR反应中的pET28b XMRV env拷贝数;b)显示0阶段对比I阶段qPCR方案:pET28b XMRV env掺入物到001人血液gDNA中。进行0阶段和I阶段qPCR方案,靶向pET28b XMRV env掺入物到001人血液gDNA中,并使用XMRV env引物。‘pET28bXMRV 61^/001§0嫩’指在单个9 0 反应中掺入供体001§0嫩中的口£了28匕XMRV env拷贝数,'001'指'供体#001',' ND'意思是‘未检出,。图13A-B显示0阶段对比I阶段qPCR方案:pAZ3_emd pol2标准。进行0阶段和I阶段qPCR方案,使用XMRV pol2引物靶向pAZ3_emd pol2质粒。‘pAZ3_emd pol2’指掺入到单个qPCR反应中的pAZ3-emd pol2拷贝数;'ND'意思是‘未检出’ ;b)显示0阶段比I阶段qPCR方案:pAZ3-emd pol2掺入物到001人血液gDNA中。进行0阶段和I阶段qPCR方案,将pAZ3-emd pol2掺入物(spike in)革巴向入001人血液gDNA中,并使用XMRV pol2引物。‘pAZ3-emdpol2/001 gDNA’指在单个qPCR反应中掺入供体OOlgDNA中的pAZ3_emdpol2拷贝数,'001'指'供体#001',' ND'意思是‘未检出,。图14显示使用MLV和ENV2引物组从被MLV感染的福尔马林固定石蜡包埋组织(FFPE)中检测MLV。将Paz3-emd掺入物加入到IOOng冻存的新鲜肿瘤样品中或加入到IOOng FFPE DNA肿瘤样品中。使用MLV和ENV2引物组进行qPCR。
图15显示通过RTPCR使用XMRV特异性引物组XMRV gag,XMRV pol2、XMRV env检测全血中XMRV。图16A-B显示使用本文描述的用于全血DNA中的前病毒DNA(MLVLTR引物和探针)、用于血浆中的病毒RNA(通过env RT-PCR)以及用于血浆中的抗病毒抗体反应的测定法监测患者随着时间的结果。这些受试者(复发性多形性成胶质细胞瘤(GBM)患者)通过颅内注射2.6xl03TU/g脑的编码修饰的酵母胞嘧啶脱氨酶的T5.0002双嗜性MLV逆转录病毒(W02010036986、W02010045002)治疗,之后给予约130mg/kg/日的5-氟胞嘧啶疗程。(A)患者 101 ; (B)患者 102。
具体实施例方式此外,除非另有说明,使用“或”是指“和/或”。类似地,“包含”、“包括”和“含有”是可互换的,而无意于是限制性的。还应理解,对于各种实施方案的描述使用术语“包含”时,本领域技术人员应理解,
在一些特定的情况下,实施方案或者可使用语言“基本由......组成”或“由......组成”
进行描述。除非另有定义,本文所用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同的含义。虽然任何类似或等同于本文所描述的那些的方法和试剂可用于实践所公开的方法和组合物,现说明示例性的方法和材料。如本文及所附的权利要求书中所用,除非上下文清楚地另有规定,“一”和“该”包括复数对象。因此,例 如,提及“一寡核苷酸”包括多个此类寡核苷酸,而提及“该多核苷酸”包括提及本领域技术人员已知的一个或多个多聚核苷酸,等等。通过核酸扩增技术在人或动物组织、血液或血浆/血清中检测XMRV或MLV相关的逆转录病毒用于确定前列腺癌及其风险、慢性疲劳系统及其风险、血液供应和组织捐赠材料的污染以及追踪受试者状态,所述受试者接受使用包含异源基因序列的MLV衍生治疗性病毒例如基于双嗜性MLV的工程化逆转录复制(replicatog)病毒(例如Toca511)的治疗。例如,本发明的方法和组合物可用于监测使用包含与MLV基本上相同的序列的逆转录病毒载体的治疗,以确定在治疗载体和XMRV或其它MLV相关的自然感染之间是否发生重组,以及用于确定受试者是否携带XMRV或其它MLV相关的自然存在病毒。所述测定法还可用于筛选血液供应以排除XMRV或其它MLV相关逆转录病毒阳性的受试者。所述测定法还可用于确定随时间MLV相关病毒的水平,并提供何时开始给予抗逆转录病毒治疗是有用的信息,该抗逆转录病毒治疗对于抗MLV也是有活性的,例如AZT (Sakuma等,Virology, 2009 ;Powell等,J.Virol.,73:8813-8816,1999 ;G.B.Beck-Engeser, PNAS, 2009)。所述测定法当与组织病理学样品一起使用时可用于确定患者储存样品中XMRV或其它MLV相关逆转录病毒的存在与否,或用于确定XMRV或MLV相关病毒的流行病学。所述测定法还可用于监测已被给予基于复制MLV载体的治疗性载体的患者。这些测量可用于跟踪随着时间的推移治疗的安全性(例如,至15年及以上),这是因为基因组DNA中持续高水平(大于30,000、100,000或300,000拷贝/微克)的MLV或大于30,000、100,000或300,000RNA拷贝/ml血浆)或随时间增加水平的这些,可作为信号来更加密切监测可能是使用包含MLV或MLV相关序列的基因治疗载体治疗继发的疾病如白血病,或来开始抗逆转录病毒治疗。不过,由于“溢出”至IJ循环系统的可能性,还可以使用这些测量判断靶组织中MLV或MLV相关载体复制的程度(即成功治疗的效力或易感性)。这些测定法用于临床监测的其它应用对于本领域技术人员而目将是显而易见的。可监测的工程化逆转录病毒载体包括下述的那些:RCR 载体-pAC_yCD2tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataacttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatgttcccatagtaacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgcccacttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggcccgcctggcattatgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtcatcgctattaccatggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacggggatttccaagtctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttccaaaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataagcagagctgg tttagtgaac cggcgccagt cctccgattg actgagtcgc ccgggtaccc gtgtatccaataaaccctcttgcagttgca tccgacttgt ggtctcgctg ttccttggga gggtctcctc tgagtgattgactacccgtcagcgggggtc tttcatttgg gggctcgtcc gggatcggga gacccctgcc cagggaccaccgacccacca ccgggaggta agctggccag caacttatct gtgtctgtcc gattgtctag tgtctatgactgattttatg cgcctgcgtc ggtactagtt agctaactag ctctgtatct ggcggacccg tggtggaactgacgagttcg gaacacccgg ccgcaaccct gggagacgtc ccagggactt cgggggccgt ttttgtggcccgacctgagtccaaaaatcc cgatcgtttt ggactctttg gtgcaccccc cttagaggag ggatatgtggttctggtagg agacgagaac ctaaaacagt tcccgcctcc gtctgaattt ttgctttcgg tttgggaccgaagccgcgccgcgcgtcttg tctgctgcag catcgttctg tgttgtctct gtctgactgt gtttctgtatttgtctgaga atatgggcca gactgttacc actcccttaa gtttgacctt aggtcactgg aaagatgtcgagcggatcgctcacaaccag tcggtagatg tcaagaagag acgttgggtt accttctgct ctgcagaatggccaacctttaacgtcggat ggccgcgaga cggcaccttt aaccgagacc tcatcaccca ggttaagatcaaggtcttttcacctggccc gcatggacac ccagaccagg tcccctacat cgtgacctgg gaagccttggcttttgacccccctccctgg gtcaagccct ttgtacaccc taagcctccg cctcctcttc ctccatccgccccgtctctcccccttgaac ctcctcgttc gaccccgcct cgatcctccc tttatccagc cctcactccttctctaggcg ccaaacctaa acctcaagtt ctttctgaca gtggggggcc gctcatcgac ctacttacagaagaccccccgccttatagg gacccaagac cacccccttc cgacagggac ggaaatggtg gagaagcgacccctgcggga gaggcaccgg acccctcccc aatggcatct cgcctacgtg ggagacggga gccccctgtggccgactcca ctacctcgca ggcattcccc ctccgcgcag gaggaaacgg acagcttcaa tactggccgttctcctcttctgacctttac aactggaaaa ataataaccc ttctttttct gaagatccag gtaaactgacagctctgatcgagtctgttc tcatcaccca tcagcccacc tgggacgact gtcagcagct gttggggactctgctgaccg gagaagaaaa acaacgggtg ctcttagagg ctagaaaggc ggtgcggggc gatgatgggcgccccactca actgcccaat gaagtcgatg ccgcttttcc cctcgagcgc ccagactggg attacaccacccaggcaggtaggaaccacc tagtccacta tcgccagttg ctcctagcgg gtctccaaaa cgcgggcagaagccccacca atttggccaa ggtaaaagga ataacacaag ggcccaatga gtctccctcg gccttcctagagagacttaa ggaagcctat cgcaggtaca ctccttatga ccctgaggac ccagggcaag aaactaatgt
权利要求
1.分离的寡核苷酸,其由选自以下组成的组的序列组成:SEQID N0:l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或表I或2中所列的任何序列以及与前述任何序列至少95%相同且能与MLV相关的多核苷酸杂交的寡核苷酸。
2.权利要求1所述的分离的寡核苷酸,其包含由SEQID NO:1和2以及与SEQ ID NO:1和2至少95%相同且与MLV相关的多核苷酸杂交的序列组成的引物对。
3.权利要求1所述的分离的寡核苷酸,其包含由SEQID NO:4和5以及与SEQ ID NO:4和5至少95%相同且与MLV相关的多核苷酸杂交的序列组成的引物对。
4.权利要求1所述的分离的寡核苷酸,其包含由SEQID NO:7和8以及与SEQ ID NO:7和8至少95%相同且与MLV相关的多核苷酸杂交的序列组成的引物对。
5.权利要求1所述的分离的寡核苷酸,其包含由SEQID NO:10和11以及与SEQ IDNO:10和11至少95%相同且与MLV相关的多核苷酸杂交的序列组成的引物对。
6.权利要求1所述的分离的寡核苷酸,其包含由SEQID NO:13和14以及与SEQ IDNO:13和14至少95%相同且与MLV相关的多核苷酸杂交的序列组成的引物对。
7.权利要求1所述的分离的寡核苷酸,其包含由SEQID NO:16和17以及与SEQ IDNO:16和17至少95%相同且与MLV相关的多核苷酸杂交的序列组成的引物对。
8.权利要求1所述的分离的寡核苷酸,其包含由SEQID NO: 19和20以及与SEQ IDNO:19和20至少95%相同且与MLV相关的多核苷酸杂交的序列组成的引物对。
9.权利要求1所述的寡核苷酸,其中所述寡核苷酸包含选自XMRV和MLV之间同源区域的引物。
10.确定将要经历或正在经历使用MLV相关病毒的逆转录病毒基因递送治疗的受试者中病毒含量的方法,该方法包括: 从所述受试者获得样品; 在适合核酸扩增的条件下使所述样品与权利要求1-9中任一项所描述的一个或多个引物对接触,以获得扩增产物; 使所述样品与一个或多个与所述扩增产物杂交的探针接触; 检测杂交产物; 指示受试者具有包含MLV相关病毒的病毒含量。
11.权利要求10所述的方法,其中所述MLV相关病毒是用于基因递送的重组逆转录病毒载体。
12.权利要求10所述的方法,其中所述MLV相关病毒是XMRV病毒。
13.权利要求10所述的方法,其中在递送MLV相关逆转录病毒载体用于基因递送之前进行所述方法。
14.权利要求10所述的方法,其中在递送MLV相关逆转录病毒载体用于基因递送之后进行所述方法。
15.权利要求10所述的方法,其中所述MLV相关病毒包含5’LTR、gag基因、pol基因、env基因、与将被递送的异源多核苷酸连接的env基因的调节域3'、以及3’ LTR和在5’ LTR中用于在哺乳动物细胞中表达的启动子。
16.权利要求15所述的方法,其中所述调节域是内部核糖体进入位点(IRES)。
17.权利要求15或16所述的方法,其中所述异源多核苷酸编码具有胞嘧啶脱氨酶活性的多肽。
18.权利要求14-17任一项所述的方法,其中所述方法监测MLV相关逆转录病毒载体的传播。
19.权利要求18所述的方法,其中所述方法在病程年期间定期进行。
20.一种用于检测样品中病毒剂存在的方法,该方法包括: 使用定量聚合酶链反应或其它扩增方法测量样品中多核苷酸的量,所述定量聚合酶链反应或其它扩增方法包括使用选自以下组成的组的寡核苷酸引物/探针组合:(i)SEQID NO:1、2 和 3 ;(ii)SEQID NO:4、5 和 6 ;(iii)SEQID NO:7、8 和 9 ;(iv)SEQ ID NO:10U1 和 12 ;和 (v)根据权利要求9的引物对以及与XMRV和MLV两者具有至少95%同一性的相应探针。
21.权利要求20所述的方法,其中所述多核苷酸是DNA。
22.权利要求20所述的方法,其中所述多核苷酸是RNA。
23.权利要求20所述的方法,其中所述定量聚合酶链反应是RT-qPCR。
24.权利要求20所述的方法,所述测量检测病毒剂相关的核酸的单拷贝。
25.权利要求20所述的方法,其中所述病毒剂包含MLV相关病毒和/或XMRV。
26.权利要求20所述的方法,其中所述样品是哺乳动物组织。
27.权利要求20所述的方法,其中所述样品是哺乳动物血液。
28.权利要求25所述的方法,其中所述病毒剂是基因治疗载体。
29.权利要求28所述的方法,其中所述基因治疗载体是复制型载体。
30.权利要求20所述的方法,其中在包括基因治疗载体治疗的治疗方案之前进行所述方法。
31.权利要求20所述的方法,其中在包括基因治疗载体的治疗方案之后对受试者进行所述方法。
32.权利要求20所述的方法,其中进行所述方法以监测受试者中包括基因治疗载体的治疗方案的剂量。
33.权利要求28至32任 一项所述的方法,其中所述基因治疗载体包括复制型MLV载体。
34.权利要求12所述的方法,其中在包括基因治疗载体的治疗方案之前进行所述方法。
35.权利要求20所述的方法,其中在包括基因治疗载体的治疗方案之后进行所述方法。
36.权利要求20所述的方法,其中进行所述方法以监测包括基因治疗载体的治疗方案的剂量。
37.权利要求20所述的方法,其中所述样品来自受试者。
38.一种试剂盒,其用于进行权利要求10-19任一项所述的方法。
39.一种试剂盒,其用于进行权利要求20所述的方法。
40.权利要求10-36任一项所述的方法,用于检测从固定的组织病理学切片提取的样品中的< 100拷贝的MLV相关DNA。
41.权利要求10-36任一项所述的方法,用于检测从固定的组织病理学切片提取的样品中的< 100拷贝的MLV相关RNA。
42.权利要求10或20所述的方法,其中所述方法检测MLV相关病毒和XMRV两者。
43.权利要求10或20所述的方法,其中所述方法仅检测MLV相关病毒,而不检测XMRV。
44.权利要求10或20所述的方法,所述方法检测XMRVgag和MLV gag。
45.权利要求10或20所述的方法,其中所述方法检测XMRVpol和MLV pol。
46.权利要求10或20所述的方法,其中所述方法检测XMRVEnv和MLV Env0
47.权利要求10或20所述的方法,用于检测来自哺乳动物宿主的血浆或血清中的XMRV或MLV相关病毒。
48.一种使用权利要求10所述的方法选择性检测人中MLV相关病毒而不检测XMRV的方法,该方法包括使用选自由以下序列组成的组的引物:SEQ ID NO:10 和 11 ;SEQ ID NO:13 和 14 ;SEQ ID NO:16 和 17 ;SEQ ID NO:19 和 20 ; 与前述序列至少95%相同的序列; 及它们的组合。
49.一种确定人受试者是否具有患前列腺癌或慢性疲劳综合征的风险的方法,该方法包括使用SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14所述的引物对和探针或表I或2所述的引物/探针,扩增来自受试者的样品中的多核苷酸,其中扩增产物的存在指示前列腺癌或慢性疲劳综合征的风险。
50.一种针对MLV、MLV变体或XMRV感染筛选血液供给或组织库的方法,包括利用SEQID NO:4、5、7、8、10、11、13、14所述的引物或表I或2中的任何引物针对血液供给和组织库进行扩增反应,和检测扩增产物。
全文摘要
本发明提供用于检测生物样品中病毒感染或污染的方法或组合物。
文档编号C12N15/867GK103140581SQ201180044680
公开日2013年6月5日 申请日期2011年7月16日 优先权日2010年7月16日
发明者道格拉斯·J·乔利, 奥马尔·佩雷斯, 艾米·林 申请人:托卡根公司

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