用于分析受试者血样中疾病标记物的存在的方法

xiaoxiao2020-6-24  7

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专利名称:用于分析受试者血样中疾病标记物的存在的方法
技术领域
本发明属于医疗诊断领域,具体地属于疾病诊断和监测领域。本发明涉及一种用于检测疾病的标记物,涉及一种用于检测疾病的方法,以及涉及一种用于确定疾病治疗疗效的方法。
背景技术
在临床实践中,强烈需求能够在疾病早期阶段检测疾病以预测疾病的进展,并进行为病人定制的治疗。特别是肿瘤性疾病(癌症)的早期发现是至关重要的,以确保疾病的有利治疗。尽管医学研究中的许多进展,癌症仍然是全球死亡的一个重要原因。当患者求医时,他们一般都表现出远处转移症状,意为往往发现癌症为时已晚。肺癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌是最常见的肿瘤,并为了通过手术切除、放疗、化疗或其他已知的治疗方法有利于适当的补救行动,需要快速且简单的用于癌症的早期诊断的方法。同样重要的是用于癌症的好诊断方法的可用性以评估患者对治疗的反应,或评估由于在原来位置的再生或转移的复发。目前已知几种类型的癌症标记物,例如,癌基因产物、生长因子和生长因子受体、血管生长因子、蛋白酶、粘附因子和肿瘤抑制基因产物等,它们不仅被认为对于早期诊断是必要的,而且对于不明确的临床异常情况的患者的区别诊断也是必要的,例如区分恶性和良性异常情况;预测已确定恶性的具体患者对选择的治疗方法的治疗可能的反应;以及提供与人或动物受试者中恶性的风险、存在、状态,或未来的行为有关的信息。目前,通过检测肿瘤或癌症标记物来检测和诊断癌症的能力是广泛关注的领域,并因此存在对在患者标本中鉴定新的和更有用的肿瘤标记物的可重复的和可靠的方法的需求。胶质母细胞瘤是最常见的和最恶劣的人类原发性脑肿瘤类型。部分地由于阻碍了治疗药物的传递和潜在的重要的诊断标记物的检测的血脑屏障,该疾病很难诊断并且治疗甚至更难。胶质母细胞瘤的诊断标记物是可获得的,但只针对肿瘤组织本身并且需要肿瘤样品。为在早期阶段检测癌症并跟进疾病的进展,需要改进的筛选和检测方法。在癌症的情况下,我们的状态下,我们不仅需要检测肿瘤,而且还需要在它已达到不可返回的点之前检测它,此时治疗成为姑息治疗而非治愈性治疗。高危人群以及具有复发性癌症的患者,应广泛进行监控。此外,因为肿瘤对不同的治疗方法能有不同的反应,病人分层变得非常重要。使用肿瘤活检的遗传分析已经允许对癌症的诊断和新兴的病人分层策略有用的许多突变的鉴定。然而,当前肿瘤的遗传分析的缺点是需要肿瘤活检,这往往不可能解剖患者。此外,使用的活检是静态的,并且不允许遗传监测随时间推移的肿瘤恶化或复发。而且,许多肿瘤是异质的,从而导致这类肿瘤活检的潜在的假阳性或假阴性的遗传特性。最近,将循环肿瘤细胞用于肿瘤进展或复发的诊断和监测表明将血液用作肿瘤来源的材料源,特别是细胞形式的组织碎片。然而,循环肿瘤细胞的使用对于大多数癌症是无效的。一般情况下,疾病标记物定义为,与正常健康受试者比较时,患病患者的生物流体中浓度改变,优选浓度升高的化合物,并且其随后可用作表明疾病的标记物化合物。然而,在多种体液中作为疾病例如癌症的标记物的具体化合物例如蛋白质的鉴定,已经由缺乏其合适的技术而受到阻碍。另外,在癌症以外的疾病的情况下,标记物可以利用但难以检测。这阻碍疾病的早期诊断。本发明旨在克服现有技术的问题:并非所有患病组织或疾病类型(例如肿瘤)都产生循环患病细胞(例如循环肿瘤细胞)。本发明还旨在克服用于检测疾病例如癌症的蛋白质标记物难以检测的问题。另外,本发明旨在提供不需要活检并允许广泛监测患者的方法。

发明内容
本发明的第一方面提供一种分析受试者血样中疾病标记物的存在的方法。所述方法包括下述步骤:a)从所述血样的无核血细胞,优选凝血细胞(thrombocyte)中提取核酸,以提供无核血细胞提取的核酸片段(fraction),以及b)分析所述无核血细胞提取的核酸片段中疾病标记物的存在,其中,所述疾病标记物是所述受试者的有核细胞的基因中的疾病特异突变,或其中所述疾病标记物是所述受试者的有核细胞的基因的疾病特异表达谱(expression profile)。本文使用的术语“无核血细胞”指没有细胞核的细胞。该术语包括对红细胞和凝血细胞的引用。在本发明各方面中无核细胞的优选实施方式是凝血细胞。术语“无核血细胞”优选不包括对作为错误的细胞分裂的结果而没有细胞核的细胞的引用。本文使用的术语“有核细胞”指具有细胞核的细胞。该术语包括对体细胞、生殖细胞和干细胞的引用,并且可包括来自结肠、胰腺、脑、膀胱、乳腺、前列腺、肺、乳腺、卵巢、子宫、肝、肾、脾、胸腺、甲状腺、神经组织、结缔组织、血液、上皮组织、淋巴结、骨、肌肉和皮肤组织的细胞。有核细胞优选来自病变组织的细胞。因此,本发明一般旨在分析从有细胞核的细胞已转移到没有细胞核的细胞中的核酸,其中,所述没有细胞核的细胞能容易地从血液流中分离并包含来自有核细胞的核酸。术语“细胞核”指在真核细胞中发现的膜封闭的细胞器,其包含大部分以染色体形式组织的细胞的遗传物质。这些染色体内的基因是细胞的核基因组。细胞核的内部包含一些亚核体(subnuclear body),该亚核体包括主要参与含RNA的核糖体的组装的含RNA的核糖体。在细胞核内产生后,核糖体输出至它们翻译mRNA的细胞质。无核血细胞提取的核酸片段优选是指包括染色体DNA、核糖体RNA、细胞核RNA和/或信使RNA的片段。本文所用的术语“基因”,并且特别是表述为“有核细胞的基因中的突变”的术语意思是指有核细胞(体细胞)的染色体和染色体外的任何核酸序列,优选细胞核核酸序列,并且可包括转录序列和非转录序列以及核糖体RNA序列,最优选转录成RNA的染色体序列。在本发明方法的优选实施方式中,所述疾病特异突变发生在染色体基因内。在另一优选实施方式中,所述基因不是来自无核血细胞的基因。
在本发明方法的优选实施方式中,所述疾病特异表达谱是染色体基因表达谱。具体地来自有核细胞的染色体基因,它的mRNA存在于凝血细胞中。在本发明方法的另一优选实施方式中,所述核酸是核糖核酸(RNA),更优选是信使核糖核酸(mRNA)。在本发明方法的优选实施方式中,所述核酸不是mtDNA。因此,线粒体核酸优选不是本发明的方面。在根据本发明分析血样的方法的另一优选实施方式中,分析所述无核血细胞提取的核酸片段中疾病标记物的存在的所述步骤b)包括选择性扩增:i)所述突变,使用至少一种核酸突变特异扩增引物或探针,通过反转录酶聚合酶链反应扩增,或ii)多个mRNA,通过反转录酶聚合酶链反应扩增,以确定编码所述mRNA的染色体基因的表达水平,由此以提供所述基因的表达谱,并将所述表达谱与参考谱进行比较。优选血样在体外。在本发明方法的优选实施方式中,所述疾病选自由癌症、自身免疫性疾病、皮肤疾病、眼疾病、内分泌疾病、神经紊乱以及心血管疾病组成的组。在本发明方法的另一优选实施方式中,所述疾病选自由自身免疫性疾病、皮肤疾病、眼疾病、内分泌疾病、神经紊乱以及心血管疾病组成的组。在本发明方法的另一优选实施方式中,所述疾病是癌症。在本发明方法的又一优选实施方式中,所述癌症是优选选自结肠、胰腺、脑、膀胱、乳腺、前列腺、肺、乳腺、卵巢、子宫、肝、肾、脾、胸腺、甲状腺、神经组织、上皮组织、淋巴结、骨、肌肉和皮肤的实体肿瘤癌症。在本发明各方面的优选实施方式中,自体免疫性疾病选自由下述疾病组成的组:胃酸缺乏自身免疫性主动慢性肝炎;急性播散性脑脊髓炎;急性出血性脑白质炎;阿狄森氏病;无丙种球蛋白血症;斑秃;肌萎缩侧索硬化症;强直性脊柱炎;反GBM/TBM肾炎;抗磷脂综合症;抗合成酶综合症;多发性关节炎;特应性变态反应;特应性皮炎;自身免疫性再生障碍性贫血;自身免疫性心肌病;自身免疫性肠病;自身免疫性溶血性贫血;自身免疫性肝炎;自身免疫性内耳病;自身免疫性淋巴细胞增生性综合症;自身免疫性周围神经病变;自身免疫性胰腺炎;自身免疫性多内分泌腺综合症;自身免疫性黄体酮皮炎;自身免疫性血小板减少性紫癜;自身免疫性葡萄膜炎;巴洛疾病/巴洛同心硬化症;白塞氏综合症;贝格尔氏疾病;比克斯塔夫脑炎;布劳综合症(Blau syndrome);大疱性类天疱疮;卡斯尔曼疾病(Castleman’ s disease);脂泻病;美洲锥虫病;慢性疲劳免疫功能障碍综合症;慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病;慢性复发性多灶性骨髓炎;慢性莱姆疾病;慢性阻塞性肺疾病;变应性肉芽肿性血管炎(Churg-Strauss syndrome);瘢痕性类天疱疮;乳糜湾;耳蜗前庭综合症;冷凝集素疾病;补体成分2不足;颅动脉炎;CREST综合症;克罗恩氏疾病;库欣氏综合症;皮肤白细胞破碎性血管炎;恶性萎缩性丘疹病(Dego’ s disease);德尔肯氏疾病;疱疹样皮炎;皮肌炎;1型糖尿病;弥漫性皮肤全身性硬化症;德雷斯勒综合症;盘状红斑狼疮;湿疹;子宫内膜异位症;起止点炎相关的关节炎;嗜酸性筋膜炎;嗜酸细胞性胃肠炎;获得性大疱性表皮松解症;结节性红斑;特发性混合性冷球蛋白血症;伊文氏综合症;进行性骨化性纤维增殖不良症;纤维肌痛/纤维肌炎;纤维性肺泡炎(Fibrosingaveolitis);胃炎;胃肠道类天疱疮;巨细胞动脉炎;肾小球肾炎;肺出血肾炎综合症;格雷夫斯氏疾病;吉兰-巴雷综合症;桥本氏脑炎;桥本氏甲状腺炎;溶血性贫血;过敏性紫癜;妊娠疱疹;化脓性汗腺炎;休斯综合症;低丙球蛋白血症;特发性炎症性脱髓鞘性疾病;特发性肺纤维化;特发性血小板减少性紫癜;IgA肾病;包涵体肌炎;炎症性脱髓鞘性多发性神经病变;间质性膀胱炎;肠易激综合症(IBS);幼年特发性关节炎;幼年类风湿关节炎;川崎病;兰伯特-伊顿肌无力综合症;白细胞破碎性血管炎;扁平苔藓;硬化性苔藓;线性IgA疾病;卢伽雷氏病;狼疮样肝炎;红斑狼疮;马吉德综合症;梅尼埃疾病;显微镜下多血管炎;米勒-费雪综合症;混合性结缔组织疾病;硬斑疾病;木栅-赫伯曼疾病;穆-韦二氏综合症;多发性骨髓瘤;多发性硬化症;重症肌无力;肌炎;发作性睡病;视神经脊髓炎;神经性肌强直;眼瘢痕性类天疱疮;视性眼阵挛肌阵挛综合症;奥德甲状腺炎;复发性风湿病;伴链球菌感染性小儿自身免疫性神经精神病;副肿瘤性小脑变性;阵发性睡眠性血红蛋白尿症;帕-罗二氏综合症;帕森-特纳综合症(Parsonnage-Turner syndrome);睫状体平坦部炎;天疱疮;寻常型天疱疮;恶性贫血;静脉周围性脑脊髓炎;P0EMS综合症;结节性多动脉炎;风湿性多肌痛;多发性肌炎;原发性胆汁性肝硬化;原发性硬化性胆管炎;进炎性病变;牛皮癣;银屑病关节炎;坏疽性脓皮病;纯红细胞再生障碍;拉斯姆森脑炎;雷诺现象;复发性多软骨炎;赖特尔氏综合症;下肢不宁综合症;腹膜后纤维化;类风湿关节炎;类风湿发热;肉样瘤病;精神分裂症;施密特综合症;施尼茨勒综合症;巩膜炎;硬皮病;干燥综合症;脊柱关节病;粘血综合症;斯提耳病;僵人综合症;亚急性细菌性心内膜炎(SBE);苏萨克综合症(Susac’ s syndrome);急性发热性嗜中性皮肤病;西德哈姆舞蹈病;交感性眼炎;高安氏综合症;颞动脉炎;托洛萨-亨特综合症;横贯性脊髓炎;溃疡性结肠炎;未分化结缔组织疾病;未分化脊柱关节病;血管炎;白癜风;韦格纳肉芽肿病;威尔逊氏综合症和威斯科特-奥尔德里奇综合症。在本发明各方面的其他优选实施方式中,皮肤疾病选自选自由下述疾病组成的组:痤疮样皮疹;自发性炎症综合症;慢性起疱;粘膜疾病;皮肤附属器疾病;皮下脂肪疾病;先天性异常;结缔组织疾病(如真皮纤维和弹性组织异常);真皮增长和皮下增长;皮炎(包括特应性皮炎、接触性皮炎、湿疹、脓疱性皮炎和脂溢性皮炎);色素沉着紊乱;药疹;内分泌有关的皮肤疾病;嗜酸性粒细胞;表皮痣、赘生物、囊肿;红斑;遗传性皮肤病;感染相关的皮肤疾病;苔藓皮疹;淋巴有关的皮肤疾病;黑色素细胞痣和赘生物(包括黑色素瘤);单核细胞和巨噬细胞相关的皮肤疾病;粘蛋白增多症(Mucinoses);神经皮肤;非感染性免疫缺陷相关的皮肤疾病;营养相关的皮肤疾病;丘疹鳞屑性角化过度症(包括掌跖角化病);妊娠相关的皮肤疾病;瘙痒;银屑病;反应性中性粒细胞;顽拗性掌跖皮疹;新陈代谢中错误导致的;物理因素(包括电离辐射诱导)导致的;荨麻疹和血管性水肿;血管相关的皮肤疾病。在本发明各方面的其他优选实施方式中,内分泌疾病选自由肾上腺紊乱;葡萄糖体内平衡失调;甲状腺紊乱;钙体内平衡失调和代谢性骨病;脑垂体紊乱;和性激素紊乱组成的组。在本发明各方面的其他优选实施方式中,眼疾病选自由下述疾病组成的组:H00-H06眼睑、泪腺系统和眼眶疾病;H10-H13结膜疾病;H15_H22巩膜、角膜、虹膜和睫状体疾病;H25-H28晶状体疾病;H30-H36脉络膜和视网膜疾病(包括H30脉络膜视网膜炎症、H31脉络膜的其他疾病、H32分类在他处疾病中的脉络膜视网膜紊乱、H33视网膜脱离和断裂、H34视网膜血管闭塞、H35其他视网膜疾病,和H36分类在他处疾病中的视网膜疾病);H40-H42青光眼;H43-H45玻璃体和眼球疾病;H46_H48视神经和视觉通路疾病;H49_H52眼球外肌、双眼运动、调节和屈光疾病;H53-H54.9视力障碍和失明;H55_H59眼和附器疾病。在本发明各方面的其他优选实施方式中,神经疾病选自由下述疾病组成的组:辨重不能;获得性癫痫性失语;急性播散性脑脊髓炎;肾上腺脑白质营养不良;胼胝体发育不全;失认症;艾卡迪综合症;亚历山大病;异手综合症;感觉定侧不能;阿尔珀斯疾病(Alpers^ disease);交替性偏瘫;阿尔茨海默氏病;肌萎缩侧索硬化症(见运动神经元疾病);无脑畸形;安格曼综合症(Angelman syndrome);血管瘤;缺氧症;失语症;失用症;蛛网膜囊肿;蛛网膜炎;阿诺德-基亚里畸形;动静脉畸形;共济失调毛细血管扩张;注意缺陷多动障碍;听觉处理障碍;植物神经功能紊乱;背疼痛;巴藤病;白塞氏病;贝尔麻痹;良性特发性眼睑痉挛;良性颅内高压;双侧额顶骨多小脑回;宾斯万格氏病;眼睑痉挛;布洛赫-苏兹贝格综合症(Bloch-Sulzberger syndrome);臂丛神经损伤;脑脓肿;脑损害;脑损伤;脑肿瘤;布朗-赛尔卡综合症;卡纳万病病;腕管综合症;灼性神经痛;中枢性疼痛综合症;脑桥中央髓鞘溶解;中央核性肌病;头部疾病;脑动脉瘤;脑动脉硬化;脑萎缩;大脑性巨人症;大脑性麻痹;脑血管炎;颈椎椎管狭窄症;腓骨肌萎缩症;小脑扁桃体下疝畸形(Chiari malformation);舞蹈病;慢性疲劳综合症;慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP);慢性疼痛;科-勒二氏综合症;昏迷;复杂区域疼痛综合症;嵌压性神经病;先天性两侧面瘫;皮质基底节变性;颅动脉炎;颅缝早闭;克罗伊茨费尔特-雅各布病;累积创伤失调;库欣综合症;巨细胞包涵体病(CIBD);巨细胞病毒感染;丹迪-沃克综合症;道森疾病;德摩西埃综合症(De Morsierj s syndrome);德热里钠-克隆普克麻痹(Dejerine-Klumpke palsy);德热里钠-索塔斯病;睡眠时相延迟综合症;痴呆;皮肌炎;发育性运动障碍;糖尿病神经病变;弥漫性硬化症;婴儿严重肌阵挛性癫痫(Dravetsyndrome);家族性自主神经失调;计算障碍;书写困难;诵读困难;肌张力障碍;空蝶鞍综合症;脑炎;脑膨出;脑三叉神经血管瘤病;大便失禁;癫痫;新生儿臂丛神经损伤(Erb’ 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sclerosis);婴儿肌阵挛性脑病;肌阵挛;肌病;肌管性肌病;先天性肌强直症;发作性睡病;神经纤维瘤病;神经阻滞剂恶性综合症;艾滋病的神经系统表现;狼疮性神经系统后遗症;神经性肌强直;神经元蜡样脂褐质沉积症;神经元迁移障碍;尼曼-皮克病;非24小时睡眠-觉醒综合症;非语言学习障碍;奥沙利文-麦克劳德综合症(O’ Sullivan-McLeod syndrome);枕神经痛;隐性脊柱神经管闭合不全序列症;大田原综合症(Ohtahara syndrome);橄榄体脑桥小脑萎缩;视性眼阵挛肌阵挛综合症;视神经炎;直立位性低血压;过度使用综合症;持续后像(Palinopsia);感觉异常;帕金森氏病;先天性肌强直病;肿瘤伴随综合症;阵发性发作;帕-罗二氏综合症;佩利措伊斯-梅茨巴赫病病;周期性瘫痪;周围神经病变;持续性生长状态;广泛性发育障碍;光喷嚏反射;植烷酸贮积病;皮克氏病;神经挟捏;垂体肿瘤;PMG ;脊髓灰质炎;多小脑回(Polymicrogyria);多发性肌炎;脑穿通畸形;脊髓灰质炎后综合症;疱疫后神经痛(PHN);感染后脑脊髓炎;体位性低血压;普拉德-威利综合症;原发性侧索硬化症;朊病毒疾病;进行性半面萎缩;进行性多灶性脑白质病;进行性核上性麻痹;进行性核上性麻痹;狂犬病;拉姆齐-亨特综合症(I型和II型);拉斯姆森脑炎(Rasmussen’ sencephalitis);反射神经血管营养不良;雷夫叙姆病;重复运动失调;重复性压力损伤;下肢不宁综合症;逆转录酶病毒相关的脊髓病;瑞特氏综合症(Rett syndrome);雷氏综合症;节律性运动障碍;罗姆伯格氏综合症;圣维图斯舞蹈病(Saint Vitus dance) ;GM2神经节苷脂忙积症变异型0(SandhofT disease);精神分裂症;弥漫性轴周性脑炎;脑裂畸形;感觉统合失调;视隔发育不良;婴儿摇晃综合症;带状疱疹;夏伊-德雷格综合症(Shy-Drager syndrome);干燥综合症;睡眠呼吸暂停;昏睡病;饱食(Snatiation);索托斯综合症(Sotos syndrome);痉挛状态;脊柱裂;脊髓损伤;脊髓肿瘤;脊髓性肌萎缩;脊髓小脑性共济失调;斯蒂尔-理查德森-欧斯祖斯基综合症(Steele-Richardson-Olszewskisyndrome);僵人综合症;中风;斯-韦综合症;亚急性硬化性全脑炎;皮层下动脉硬化性脑病;浅铁质沉着症;西德哈姆舞蹈病;晕厥;联觉;脊髓空洞症;跗管综合症;迟发性运动障碍;骶管囊肿(Tarlov cyst);泰-萨克斯病(Tay-Sachs disease);颞动脉炎;破伤风;脊髓栓系综合症;肌强直性白内障;胸廓出口综合症;三叉神经痛;托德瘫痪;拉塔综合症;中毒性脑病;短暂性脑缺血发作;传染性海绵状脑病;横贯性脊髓炎;外伤性脑损伤;震颤;三叉神经痛;热带痉挛性瘫痪;锥虫病;结节性脑硬化;希林二氏病;威流斯科脑脊髓炎(Viliuisk Encephalomyelitis);瓦伦伯格氏综合症;韦德尼希-霍夫曼病;韦斯特综合症;颈椎(Whiplash);威廉斯综合症;威尔逊氏症和脑肝肾综合症。在本发明各方面的其他优选实施方式中,心血管疾病选自由动脉瘤;心绞痛;动脉粥样硬化;脑血管意外(中风);脑血管疾病;充血性心力衰竭;冠心病;心肌梗死(心脏病发作)以及周围血管疾病组成的组。另一方面,本发明提供一种使用根据本发明的血样分析方法诊断受试者疾病的方法。因此,在本发明方法的另一优选实施方式中,根据本发明的分析血样的所述方法是诊断受试者疾病方法的一部分,并且其中,所述无核血细胞提取的核酸片段中所述疾病标记物的存在表明所述受试者患有所述疾病。另一方面,本发明提供一种用于确定受试者疾病治疗的疗效的方法,该方法包括下述步骤:使用根据本发明的分析血样的方法在第一时间点分析受试者血样中疾病标记物的存在,由此以提供所述受试者中所述疾病标记物的含量的第一值;使用根据本发明的分析血样的方法在早于或晚于,优选晚于所述第一时间点的第二时间点分析所述受试者血样中疾病标记物的存在,由此以提供所述受试者中所述疾病标记物的含量的第二值,其中,所述受试者已经在所述第一时间点和所述第二时间点之间接受过疾病治疗;以及比较所述第一值和所述第二值以确定所述受试者的所述疾病治疗的疗效。本领域技术人员将理解,所述第一时间点之前的治疗和随后在稍后的第二时间点的测量(在所述时间点之间没有进行任何疾病治疗)包括在本发明的用于确定疾病治疗的疗效的各方面中。另一方面,本发明提供一种用于确定疾病阶段的方法。为了确定疾病阶段,将通过本发明方法确定的疾病标记物的值与疾病阶段关联起来是有利的。疾病标记物的单个测量然后可与一个或多个参考值比较以得到疾病阶段的指示。另一方面,本发明提供一种用于确定受试者的疾病阶段的方法,该方法包括下述步骤:使用根据本发明的分析受试者血样中疾病标记物的存在的方法分析血样中疾病标记物的存在,由此以提供所述受试者中所述疾病标记物的含量的测试值;提供所述疾病标记物的含量的参考值,其中,所述参考值与疾病的特定阶段相关;以及比较所述测试值和所述参考值以确定所述受试者的疾病阶段。又一方面,本发明提供一种适于实施如本文上述的本发明方法的部件(part)的试剂盒,包括包装材料的所述试剂盒包括下述至少之一:用于盛放从血样中分离的无核血细胞,优选凝血细胞的容器;用于从所述无核血细胞中提取核酸的试剂;用于由提取自所述无核血细胞的所述核酸选择性扩增如本文上述的疾病特异标记物的试剂,例如通过反转录酶聚合酶链反应扩增,所述疾病特异标记物例如为受试者的有核细胞的基因中的疾病特异突变,或来自所述受试者有核细胞的核酸的疾病特异表达谱;以及用于实施如本文上述本发明方法的印刷操作指南或电子操作指南,所述试剂盒还包括:所述疾病标记物的参考标准,其中,所述参考标准表明所述无核血细胞提取核酸片段中所述疾病标记物的存在或不存在。
在根据本发明试剂盒的优选实施方式中,所述参考标准是健康的对照受试者或患有疾病的对照受试者的无核血细胞中包括所述疾病特异突变的核酸的含量的参考值,或其中所述参考标准是参考表达谱,例如来自健康的对照受试者或患有疾病的对照受试者的无核血细胞中的多个mRNA。在根据本发明试剂盒的另一优选实施方式中,所述试剂或操作指南选自粒子(particle)或突光标记物标记的抗无核血细胞抗体(优选突光标记物标记的抗凝血细胞抗体)、用于基于微珠(bead-based)的无核血细胞分离(优选凝血细胞分离)的操作指南、用于无核血细胞(优选凝血细胞的)FACS分选的操作指南、用于通过离心回收无核血细胞(优选凝血细胞)的操作指南,或用于非无核血细胞成分(优选非凝血细胞成分)的负选择的操作指南。在又一方面,本发明提供一种用于诊断疾病的器件,所述器件包括支撑体和用于具体确定受试者无核血细胞样品中至少一种核酸突变体的含量和/或活性的至少一种试齐U,以及具有用于实施如上文所述本发明方法的计算机可执行指令的计算机可读介质。所述试剂附着于所述支撑体。在根据本发明器件的优选实施方式中,所述至少一种试剂是寡核苷酸探针或测序引物。在根据本发明器件的优选实施方式中,所述器件包括用于进行无核血细胞提取的核酸和至少一种核酸突变特异扩增引物或寡核苷酸探针之间,或无核血细胞提取的核酸和多个基因特异扩增引物或寡核苷酸探针之间的核酸杂交反应的横向流动设备(lateralflow device)、浸量尺或套筒,用于提供疾病特异基因表达谱。


图1示出使用安捷伦生物分析仪皮可芯片(Agilent Bioanalyzer Picochip)(安捷伦科技公司)分析的RNA谱,X-轴为RNA的长度(以核苷酸数目的形式),以及Y-轴为RNA的量(以荧光单位的形式)。这里描述,源自血清部分中的微泡的RNA(左),源自血浆部分中的微泡的RNA(中)或源自凝血细胞的RNA(右)。结果表明,I)在血清和血浆的微泡中以及在凝血细胞中存在RNA,2)从血浆样品中分离的微泡比从血清样品中分离的微泡包含较少的RNA,以及3)从血浆样品中分离的凝血细胞包含多种尺寸的RNA,包括相对长的RNA链(> 200个核苷酸(nt),并且甚至> 1000个核苷酸)的重要片段。图2示出从脑肿瘤患者的凝血细胞中发现的源于肿瘤的遗传物质的结果。从患者(P1-14)中取血样(全血管(血清(S))和抗凝血剂-EDTA血液(血浆(P))。从血浆管中通过离心实验规程收集凝血细胞(T)。作为对照,从健康个体(C1-6)中收集凝血细胞。一些患者缺乏血清样品,在图2中用X表示,以及一些患者有混合的血清(pooled serum)和血浆样品,在图2中用SP表示。使用用于RNA检测的巢式PCR,15个患者中的4个胶质母细胞瘤患者(27% ) (P4、P5、P9、P10)的凝血细胞中能检测出突变体EGFRvIII (V3)。这符合发表的文献,在20%的高等级神经胶质瘤中发现突变体EGFRvIII (Liu等,2005年)。这些实验确实提供了通过识别源于肿瘤的核酸,凝血细胞能用作诊断癌症的生物标记物源的原理的证据。图3:(A)用PKH67绿色荧光染料标记并且用分离的血小板培养U87源于神经胶质瘤的微泡。在存在和不存在微泡下培养15分钟和60分钟后,洗涤血小板,并进行PKH67荧光的FACS分析。此外,将血小板染色,并通过共聚焦显微镜分析以确定微泡吸收。从在不同条件下用微泡培养后的RNA酶处理过的血小板中分离RNA。进行RT-PCR以检测EGFRvIIIRNA。MV/MVEGFRvII1:从U87/U87_EGFRvIII细胞中分离的微泡。(B)从健康的对照受试者或神经胶质瘤患者的血小板中分离RNA并且进行RT-PCR分析。相应的神经胶质瘤组织的活组织检查作为对照。PC = U87-EGFRvIII RNA ;NC = H20 ;nd =没有确定;*表示正信号。(C)对(B)中的RNA进行基因表达阵列。前30个神经胶质瘤的生物标记物的热图(heatmap)示于左侧。前10个RNA各自的表达水平描述在右侧。虚线=BG (背景)。图4:从健康的对照受试者(n = 8)和前列腺癌症患者(n = 12)的血小板中分离RNA并且进行PCA3、PSA和GAPDH RT-PCR分析。*表示弱正信号。图5示出用于检测图3C中显示的基因的探针序列。
具体实施例方式如本文使用的术语“癌症”指由瘤原性转化细胞的增殖导致的疾病或病症。采用“癌症”以包括广泛的良性肿瘤或恶性肿瘤中的任何一种或多种,包括能够经过人体或动物体或他们的一部分(例如:通过淋巴系统和/或血液)蔓延性生长和转移的那些。尽管本发明特别针对恶性肿瘤和实体癌症的诊断或检测,如本文使用,术语“肿瘤”包括良性肿瘤和恶性肿瘤或实体生长物。癌症还包括但不限于癌(carcinomas)、淋巴瘤,或肉瘤,例如卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌、尿道癌、子宫癌、急性淋巴性白血病、霍奇金病、肺的小细胞癌、黑色素瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤(例如成胶质细胞瘤)、软组织肉瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、肉瘤和腺癌。在本发明各方面的优选实施方式中,不要求凝血细胞癌症。如本文使用的术语“源于癌症的”指始发于癌症或癌症细胞。采用术语“源于癌症的核酸”以表示具体表明受试者癌症的任何核酸,并且在最优选的实施方式中,表示突变体DNA或RNA,表明癌症中突变体基因存在的突变体DNA或RNA由受试者的癌症细胞表达或存在于受试者的癌症细胞中,相对于健康的对照受试者的正常基因,该突变体基因的核酸序列改变。还采用术语“源于癌症的核酸”以包括(i)由癌症细胞而不是正常的健康(非癌性)细胞产生的或表达的核酸,或在癌症细胞而不是在正常的健康(非癌性)细胞中存在的核酸,或相较于正常细胞,由癌症细胞或在癌症细胞中改变(提高或降低)其产生或表达的核酸;或(ii)由正常细胞而不是癌症细胞产生的或表达的核酸,或在正常细胞中而不是在癌症细胞中存在的核酸。因此,该核酸不必须是具有变异序列的突变体核酸而可能是具有野生型(非癌症)序列的正常核酸,但相对于正常的细胞其谱和表达水平在癌症细胞中改变。在一个优选实施方式中,源于癌症的核酸是对癌症特异的突变体核酸(DNA、cDNA或RNA),优选RNA转录物。如本文中详细说明,在另一非常优选的实施方式中,源于癌症的核酸是表明源于癌症的或癌症特异的核酸表达谱。本文使用的术语“癌症标记物”具体指癌症标记物基因或癌症标记物基因表达谱。本文使用的术语“癌症标记物基因”指其单独或与其他基因组合的序列或表达水平与癌症或癌症的预后相关的基因。该相关性可涉及由从凝血细胞中得到的核酸片段中的所述基因的RNA表达产物存在的增加或降低反映的基因表达的增加或降低。例如,基因的表达可表明癌症,或缺乏基因的表达可与癌症患者的不良预后相关。在前列腺癌症AMACR的情况下,PCA3和PSA是合适的癌症标记物。在结直肠癌症的情况下,KRAS突变是合适的癌症标记物。在肺癌的情况下,EGFR突变是合适的癌症标记物。在黑色素瘤的情况下,BRAF突变是合适的癌症标记物。在神经胶质瘤的情况下,EGFRvIII突变是合适的癌症标记物。其它合适的癌症标记物可来自本文提供的表I和表2,或来自实施例或附图。本领域技术人员将明白许多其他癌症标记物可应用于本发明的方面和实施例中。如本文使用,术语“癌症阶段”指癌症发展程度的定性或定量评估。采用的确定癌症阶段的标准包括但不限于肿瘤的大小,肿瘤是否已扩散到身体的其他部分以及癌症已经扩散到何处(例如,在身体的相同的器官或区域内或扩散到其他器官)。在术语“源于癌症的”、“癌症标记物”、“癌症标记物基因”和/或“癌症阶段”中的术语“癌症”可以概括为术语“疾病”,因为癌症的定义通常适用于本文指出的所有疾病。如本文使用的术语“源于疾病的”指始发于疾病或患病的细胞。采用术语“源于疾病的核酸”以表示具体表明受试者疾病的任何核酸,并且在最优选的实施方式中,表示表明突变体基因疾病的存在的突变体DNA或RNA,该突变体基因由受试者的患病细胞表达或在受试者的患病细胞中存在,其中相对于健康的对照受试者的正常基因,突变体基因的核酸序列改变。还采用术语“源于疾病的核酸”以包括(i)由患病细胞而不是正常的健康(非癌性)细胞产生的或表达的的核酸,或在患病细胞而不是在正常的健康(非疾病)细胞中存在的核酸,或相较于正常细胞,由患病细胞或在患病细胞中改变(提高或降低)其产生或表达的核酸;或(ii)由正常细胞而不是患病细胞产生的或表达的核酸,或在正常细胞中而不是在患病细胞中存在的核酸。因此,该核酸不必须是具有变异序列的突变体核酸而可能是具有野生型(非癌症)序列的正常核酸,但相对于正常的细胞其谱和表达水平在患病细胞中改变。在一个优选实施方式中,源于疾病的核酸是对该疾病特异的突变体核酸(DNA、cDNA或RNA),优选RNA转录物。如本文中详细说明,在另一非常优选实施方式中,源于疾病的核酸是表明源于疾病的或疾病特异的核酸表达谱。本文使用的术语“疾病标记物”具体指疾病标记物基因或疾病标记物基因表达谱。本文使用的术语“疾病标记物基因”指其单独或与其他基因组合的序列或表达水平与疾病或该疾病的预后相关的基因。该相关性可涉及由从凝血细胞中得到的核酸片段中的所述基因的RNA表达产物存在的增加或降低反映的基因表达的增加或降低。例如,基因的表达可表明疾病,或缺乏基因的表达可与患者的不良预后相关。如本文使用,术语“疾病阶段”指疾病发展程度的定性或定量评估。采用的确定疾病阶段的标准包括但不限于疾病是否已扩散到身体的其他部分以及疾病已经扩散到何处(例如,在身体的相同的器官或区域内或扩散到其他器官)。本文使用的术语疾病指癌症、自身免疫性疾病、皮肤疾病、眼疾病、内分泌疾病、神经紊乱以及心血管疾病。因此,除癌症外能使用本发明的手段和方法检测的疾病包括例如下列自身免疫性疾病:胃酸缺乏自身免疫性主动慢性肝炎;急性播散性脑脊髓炎;急性出血性脑白质炎;阿狄森氏病;无丙种球蛋白血症;斑秃;肌萎缩侧索硬化症;强直性脊柱炎;反GBM/TBM肾炎;抗磷脂综合症;抗合成酶综合症;多发性关节炎;特应性变态反应;特应性皮炎;自身免疫性再生障碍性贫血;自身免疫性心肌病;自身免疫性肠病;自身免疫性溶血性贫血;自身免疫性肝炎;自身免疫性内耳病;自身免疫性淋巴细胞增生性综合症;自身免疫性周围神经病变;自身免疫性胰腺炎;自身免疫性多内分泌腺综合症;自身免疫性黄体酮皮炎;自身免疫性血小板减少性紫癜;自身免疫性葡萄膜炎;巴洛疾病/巴洛同心硬化症;白塞氏综合症;贝格尔氏疾病;比克斯塔夫脑炎;布劳综合症(Blau syndrome);大疱性类天疱疮;卡斯尔曼疾病(Castleman’ s disease);脂湾病;美洲锥虫病;慢性疲劳免疫功能障碍综合症;慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病;慢性复发性多灶性骨髓炎;慢性莱姆疾病;慢性阻塞性肺疾病;变应性肉芽肿性血管炎(Churg-Strauss syndrome);瘢痕性类天疱疮;乳糜泻;耳蜗前庭综合症;冷凝集素疾病;补体成分2不足;颅动脉炎;CREST综合症;克罗恩氏疾病;库欣氏综合症;皮肤白细胞破碎性血管炎;恶性萎缩性丘疹病(Dego’s disease) ’德尔肯氏疾病;疱疹样皮炎;皮肌炎;1型糖尿病;弥漫性皮肤全身性硬化症;德雷斯勒综合症;盘状红斑狼疮;湿疹;子宫内膜异位症;起止点炎相关的关节炎;嗜酸性筋膜炎;嗜酸细胞性胃肠炎;获得性大疱性表皮松解症;结节性红斑;特发性混合性冷球蛋白血症;伊文氏综合症;进行性骨化性纤维增殖不良症;纤维肌痛/纤维肌炎;纤维性肺泡炎(Fibrosingaveolitis);胃炎;胃肠道类天疱疮;巨细胞动脉炎;肾小球肾炎;肺出血肾炎综合症;格雷夫斯氏疾病;吉兰-巴雷综合症;桥本氏脑炎;桥本氏甲状腺炎;溶血性贫血;过敏性紫癜;妊娠疱疹;化脓性汗腺炎;休斯综合症;低丙球蛋白血症;特发性炎症性脱髓鞘性疾病;特发性肺纤维化;特发性血小板减少性紫癜;IgA肾病;包涵体肌炎;炎症性脱髓鞘性多发性神经病变;间质性膀胱炎;肠易激综合症(IBS);幼年特发性关节炎;幼年类风湿关节炎;川崎病;兰伯特-伊顿肌无力综合症;白细胞破碎性血管炎;扁平苔藓;硬化性苔藓;线性IgA疾病;卢伽雷 氏病;狼疮样肝炎;红斑狼疮;马吉德综合症;梅尼埃疾病;显微镜下多血管炎;米勒-费雪综合症;混合性结缔组织疾病;硬斑疾病;木栅-赫伯曼疾病;穆-韦二氏综合症;多发性骨髓瘤;多发性硬化症;重症肌无力;肌炎;发作性睡病;视神经脊髓炎;神经性肌强直;眼瘢痕性类天疱疮;视性眼阵挛肌阵挛综合症;奥德甲状腺炎;复发性风湿病;伴链球菌感染性小儿自身免疫性神经精神病;副肿瘤性小脑变性;阵发性睡眠性血红蛋白尿症;帕-罗二氏综合症;帕森-特纳综合症(Parsonnage-Turner syndrome);睫状体平坦部炎;天疱疮;寻常型天疱疮;恶性贫血;静脉周围性脑脊髓炎;P0EMS综合症;结节性多动脉炎;风湿性多肌痛;多发性肌炎;原发性胆汁性肝硬化;原发性硬化性胆管炎;进炎性病变;牛皮癣;银屑病关节炎;坏疽性脓皮病;纯红细胞再生障碍;拉斯姆森脑炎;雷诺现象;复发性多软骨炎;赖特尔氏综合症;下肢不宁综合症;腹膜后纤维化;类风湿关节炎;类风湿发热;肉样瘤病;精神分裂症;施密特综合症;施尼茨勒综合症;巩膜炎;硬皮病;干燥综合症;脊柱关节病;粘血综合症;斯提耳病;僵人综合症;亚急性细菌性心内膜炎(SBE);苏萨克综合症(Susac’ s syndrome);急性发热性嗜中性皮肤病;西德哈姆舞蹈病;交感性眼炎;高安氏综合症;颞动脉炎;托洛萨-亨特综合症;横贯性脊髓炎;溃疡性结肠炎;未分化结缔组织疾病;未分化脊柱关节病;血管炎;白癜风;韦格纳肉芽肿病;威尔逊氏综合症和威斯科特-奥尔德里奇综合症。除上述疾病外,本发明的方面还适用于下列皮肤疾病的预后和诊断:痤疮样皮疹;自发性炎症综合症;慢性起疱;粘膜疾病;皮肤附属器疾病;皮下脂肪疾病;先天性异常;结缔组织疾病(如真皮纤维和弹性组织异常);真皮增长和皮下增长;皮炎(包括特应性皮炎、接触性皮炎、湿疹、脓疱性皮炎和脂溢性皮炎);色素沉着紊乱;药疹;内分泌有关的皮肤疾病;嗜酸性粒细胞;表皮痣、赘生物、囊肿;红斑;遗传性皮肤病;感染相关的皮肤疾病;苔藓皮疹;淋巴有关的皮肤疾病;黑色素细胞痣和赘生物(包括黑色素瘤);单核细胞和巨噬细胞相关的皮肤疾病;粘蛋白增多症(Mucinoses);神经皮肤;非感染性免疫缺陷相关的皮肤疾病;营养相关的皮肤疾病;丘疹鳞屑性角化过度症(包括掌跖角化病);妊娠相关的皮肤疾病;瘙痒;银屑病;反应性中性粒细胞;顽拗性掌跖皮疹;新陈代谢中错误导致的;物理因素(包括电离辐射诱导)导致的;荨麻疹和血管性水肿;血管相关的皮肤疾病。除上述疾病外,本发明的方面还适用于下列内分泌疾病的预后和诊断:肾上腺紊乱;葡萄糖体内平衡失调;甲状腺紊乱;钙体内平衡失调和代谢性骨病;脑垂体紊乱;和性激素紊乱。除上述疾病外,本发明的方面还适用于下列眼疾病的预后和诊断:H00-H06眼睑、泪腺系统和眼眶疾病;H10-H13结膜疾病;H15-H22巩膜、角膜、虹膜和睫状体疾病;H25_H28晶状体疾病;H30-H36脉络膜和视网膜疾病(包括H30脉络膜视网膜炎症、H31脉络膜的其他疾病、H32分类在他处疾病中的脉络膜视网膜紊乱、H33视网膜脱离和断裂、H34视网膜血管闭塞、H35其他视网膜疾病,和H36分类在他处疾病中的视网膜疾病);H40-H42青光眼;H43-H45玻璃体和眼球疾病;H46-H48视神经和视觉通路疾病;H49_H52眼球外肌、双眼运动、调节和屈光疾病; H53-H54.9视力障碍和失明;H55_H59眼和附器疾病。除上述疾病外,本发明的方面还适用于下列神经紊乱的预后和诊断:辨重不能;获得性癫痫性失语;急性播散性脑脊髓炎;肾上腺脑白质营养不良;胼胝体发育不全;失认症;艾卡迪综合症;亚历山大病;异手综合症;感觉定侧不能;阿尔珀斯疾病(Alpers^ disease);交替性偏瘫;阿尔茨海默氏病;肌萎缩侧索硬化症(见运动神经元疾病);无脑畸形;安格曼综合症(Angelman syndrome);血管瘤;缺氧症;失语症;失用症;蛛网膜囊肿;蛛网膜炎;阿诺德-基亚里畸形;动静脉畸形;共济失调毛细血管扩张;注意缺陷多动障碍;听觉处理障碍;植物神经功能紊乱;背疼痛;巴藤病;白塞氏病;贝尔麻痹;良性特发性眼睑痉挛;良性颅内高压;双侧额顶骨多小脑回;宾斯万格氏病;眼睑痉挛;布洛赫-苏兹贝格综合症(Bloch-Sulzberger syndrome);臂丛神经损伤;脑脓肿;脑损害;脑损伤;脑肿瘤;布朗-赛尔卡综合症;卡纳万病病;腕管综合症;灼性神经痛;中枢性疼痛综合症;脑桥中央髓鞘溶解;中央核性肌病;头部疾病;脑动脉瘤;脑动脉硬化;脑萎缩;大脑性巨人症;大脑性麻痹;脑血管炎;颈椎椎管狭窄症;腓骨肌萎缩症;小脑扁桃体下疝畸形(Chiari malformation);舞蹈病;慢性疲劳综合症;慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP);慢性疼痛;科-勒二氏综合症;昏迷;复杂区域疼痛综合症;嵌压性神经病;先天性两侧面瘫;皮质基底节变性;颅动脉炎;颅缝早闭;克罗伊茨费尔特-雅各布病;累积创伤失调;库欣综合症;巨细胞包涵体病(CIBD);巨细胞病毒感染;丹迪-沃克综合症;道森疾病;德摩西埃综合症(De Morsierj s syndrome);德热里钠-克隆普克麻痹(Dejerine-Klumpke palsy);德热里钠-索塔斯病;睡眠时相延迟综合症;痴呆;皮肌炎;发育性运动障碍;糖尿病神经病变;弥漫性硬化症;婴儿严重肌阵挛性癫痫(Dravetsyndrome);家族性自主神经失调;计算障碍;书写困难;诵读困难;肌张力障碍;空蝶鞍综合症;脑炎;脑膨出;脑三叉神经血管瘤病;大便失禁;癫痫;新生儿臂丛神经损伤(Erb’ spalsy);红斑性肢痛症;特发性震颤;弥漫性体血管角质瘤;法尔综合症;昏厥;家族性痉挛性瘫痪;热性惊厥;费雪氏综合症;弗里德赖希氏共济失调;纤维肌痛;高歇尔氏病;格斯特曼氏综合症;巨细胞动脉炎;巨细胞包涵体疾病;球形细胞脑白质营养不良;脑灰质异位症;吉兰-巴雷综合症;HTLV-1相关性脊髓病;哈勒沃登-施帕茨疾病;颅脑损伤;头痛;半面痉挛;遗传性痉挛性截瘫;雷弗素姆氏病;耳带状疱疹;带状疱疹;平山郁夫综合症(Hirayama syndrome);前脑无裂畸形;亨廷顿氏病;积水性无脑;脑积水;皮质醇增多症;缺氧;免疫介导性脑脊髓炎;包涵体肌炎;色素失调症;婴幼儿植烷酸贮积疾病;婴幼儿雷夫叙姆病;婴儿痉挛症;炎症性肌病;颅内囊肿;颅内压增高;伯特综合症(Joubertsyndrome);卡拉克综合症(Karak syndrome);卡恩斯-塞尔综合症;肯尼迪病;金斯布林纳综合症;克利佩尔-费尔综合症;克拉伯疾病;库格尔贝格-韦兰德疾病;苦鲁病;拉福拉疾病;兰伯特-伊顿肌无力综合症;获得性癫痫失语(Landau-Kleffner syndrome);延髓外侧综合症(瓦伦贝格综合症);无学习能力;利氏病(Leigh’ s disease);肌阵挛性起立不能小发作(Lennox-Gastaut syndrome);莱施-奈恩综合症;脑白质营养不良;路易体痴呆;平脑症;闭锁综合症;卢伽雷氏病(见运动神经元疾病);腰椎间盘疾病;腰椎管狭窄症;莱姆病-神经系统后遗症;马查多-约瑟夫病(Machado-Joseph disease)(脊髓小脑性共济失调3型);巨脑;视物显大症;巨脑畸形;梅-罗综合症状(Melkersson-Rosenthalsyndrome);美尼尔氏病(Menieres disease);脑膜炎;门克斯病;异染性脑白质病变;小头畸形;视物显小症;偏头痛;米勒费雪综合症;小中风(短暂性脑缺血发作);线粒体肌病;默比厄斯氏综合症;单肢性肌萎缩(Monomelic amyotrophy);运动神经元疾病;运动技能障碍;烟雾病;黏多糖病;多发性脑梗死性痴呆;多灶性运动神经病;多发性硬化症;多系统萎缩症;肌营养不良症;肌痛性脑脊髓炎;重症肌无力;髓鞘破坏弥漫性硬化症(Myelinoclastic diffuse sclerosis);婴儿肌阵挛性脑病;肌阵挛;肌病;肌管性肌病;先天性肌强直症;发作性睡病;神经纤维瘤病;神经阻滞剂恶性综合症;艾滋病的神经系统表现;狼疮性神经系统后遗症;神经性肌强直;神经元蜡样脂褐质沉积症;神经元迁移障碍;尼曼-皮克病;非24小时睡眠-觉醒综合症;非语言学习障碍;奥沙利文-麦克劳德综合症(O’ Sullivan-McLeod syndrome);枕神经痛;隐性脊柱神经管闭合不全序列症;大田原综合症(Ohtahara syndrome);橄榄体脑桥小脑萎缩;视性眼阵挛肌阵挛综合症;视神经炎;直立位性低血压;过度使用综合症;持续后像(Palinopsia);感觉异常;帕金森氏病;先天性肌强直病;肿瘤伴随综合症;阵发性发作;帕-罗二氏综合症;佩利措伊斯-梅茨巴赫病病;周期性瘫痪;周围神经病变;持续性生长状态;广泛性发育障碍;光喷嚏反射;植烷酸贮积病;皮克氏病;神经挟捏;垂体肿瘤;PMG ;脊髓灰质炎;多小脑回(Polymicrogyria);多发性肌炎;脑穿通畸形;脊髓灰质炎后综合症;疱疫后神经痛(PHN);感染后脑脊髓炎;体位性低血压;普拉德-威利综合症;原发性侧索硬化症;朊病毒疾病;进行性半面萎缩;进行性多灶性脑白质病;进行性核上性麻痹;真脑瘤;狂犬病;拉姆齐-亨特综合症(I型和II型);拉斯姆森脑炎(Rasmussen’ s encephalitis);反射神经血管营养不良;雷夫叙姆病;重复运动失调;重复性压力损伤;下肢不宁综合症;逆转录酶病毒相关的脊髓病;瑞特氏综合症(Rett syndrome);雷氏综合症;节律性运动障碍;罗姆伯格氏综合症;圣维图斯舞蹈病(Saint Vitus dance) ;GM2神经节苷脂忙积症变异型0(Sandhoff disease);精神分裂症;弥漫性轴周性脑炎;脑裂畸形;感觉统合失调;视隔发育不良;婴儿摇晃综合症;带状疱疫;夏伊-德雷格综合症(Shy-Drager syndrome);干燥综合症;睡眠呼吸暂停;昏睡病;饱食(Snatiation);索托斯综合症(Sotos syndrome);痉挛状态;脊柱裂;脊髓损伤;脊髓肿瘤;脊髓性肌萎缩;脊髓小脑性共济失调;斯蒂尔-理查德森-欧斯祖斯基综合症(Steele-Richardson-Olszewski syndrome);僵人综合症;中风;斯-韦综合症;亚急性硬化性全脑炎;皮层下动脉硬化性脑病;浅铁质沉着症;西德哈姆舞蹈病;晕厥;联觉;脊髓空洞症;跗管综合症;迟发性运动障碍;骶管囊肿(Tarlov cyst);泰-萨克斯病(Tay-Sachs disease);颞动脉炎;破伤风;脊髓栓系综合症;肌强直性白内障;胸廓出口综合症;三叉神经痛;托德瘫痪;拉塔综合症;中毒性脑病;短暂性脑缺血发作;传染性海绵状脑病;横贯性脊髓炎;外伤性脑损伤;震颤;三叉神经痛;热带痉挛性瘫痪;锥虫病;结节性脑硬化;希林二氏病;威流斯科脑脊髓炎(ViliuiskEncephalomyelitis);瓦伦伯格氏综合症;韦德尼希-霍夫曼病;韦斯特综合症;颈椎(Whiplash);威廉斯综合症;威尔逊氏症和脑肝肾综合症。除上述疾病外,本发明的方面还适用于下列心血管疾病的预后和诊断:动脉瘤;心绞痛;动脉粥样硬化;脑血管意外(中风);脑血管疾病;充血性心力衰竭;冠心病;心肌梗死(心脏病发作)以及周围血管疾病。如本文使用,“核酸”包括对单链形式或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物的引用,并且除非另有限定,还包括具有天然核苷酸基本性质的已知的类似物,因为它们以类似于天然存在的核苷酸(例如,肽核酸)的方式杂交到单链核酸。术语“RNA”指核糖核酸,编码蛋白质产物或不编码蛋白质产物(如miRNA,但不排除其他非编码RNA)的RNA分子。RNA从DNA模板转录而来。本文使用的术语“突变体”指由天然野生型(native wild type)编码序列或其亚基的突变产生的核酸化合物、蛋白质、分子、载体或细胞。本文使用的术语“突变”是指改变天然编码序列的,通过置换、添加、缺失、插入、交联或其他破坏或取代天然编码序列的一个或多个核苷酸的任何变化,包括天然发生的剪接变体。具体地,上述突变提供使细胞成为癌症细胞的基因。这些突变包括肿瘤抑制基因和/或癌基因的遗传突变和后天突变。“扩增”是指使用至少一个核酸序列作为模板构建多份核酸序列或多份互补的核酸序列。扩增系统包括聚合酶链反应(PCR)系统、连接酶链反应(LCR)系统、基于核酸序列的扩增(NASBA, Cangene公司,米西索加,安大略湖)、Q-0复制酶系统、基于转录的扩增系统(TAS)和链置换扩增(SDA)。参见例如Diagnostic Molecular Microbiology.Principlesand Applications, D.H.Persing et al., Ed., American Society for Microbiology,Washington, D.C.(1993)。扩增的产物称为扩增子。术语“杂交”指由互补核苷酸之间的氢键形成的双链核酸分子或双螺旋核酸分子。术语“使杂交”或“使退火”指单链核酸序列通过互补核苷酸之间的氢键形成双螺旋节段(segment)的过程。术语“寡核苷酸”指通过含磷的连接体(例如,磷酸二酯、烷基磷酸酯和芳基磷酸酯、硫代磷酸酯),或不含磷的连接体(例如,肽、氨基磺酸盐等)连接的短序列核苷酸单体(通常为6 100个核苷酸)。寡核苷酸可包含具有修饰的碱基(例如,5-甲基胞嘧啶)和修饰的糖基(如,2’ -0-甲基核糖、2’ -0-甲氧基乙基核糖、2’ -氟核糖、2’ -氨基核糖等)的修饰的核苷酸。寡核苷酸可以是具有环形、支链或直链形状并且可选地包括能形成稳定二级结构(例如,莖-环结构和环-莖-环结构)的域(domain)的双链DNA和单链DNA以及双链RNA和单链RNA的天然存在或合成的分子。本文使用的术语“引物”指寡核苷酸,当放在诱导作为核酸链互补物的引物延伸产物的合成条件下,即在核苷酸和聚合试剂例如DNA聚合酶存在下并在合适的温度和pH值下,其能使扩增目标退火,使DNA聚合酶附着在其上作为DNA合成的引发点。为了最大的扩增效率,(扩增)引物优选为单链。优选地,引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长,以在聚合试剂存在下指引延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于许多因素,包括温度和弓I物来源。本文使用的“双向引物对”,指在DNA扩增技术例如PCR扩增中通常使用的一个正向引物和一个反向引物。术语“探针”指单链寡核苷酸序列,该序列将识别目标核酸序列分析物或其cDNA衍生物中的互补序列并与其形成氢键双螺旋。术语“严格性”或“严格的杂交条件”指影响杂交种的稳定性的杂交条件,例如,温度、盐浓度、PH值、甲酰胺浓度等。凭经验优化这些条件以最大化引物或探针与目标核酸序列的特定结合,并最小化引物或探针与目标核酸序列的非特定结合。使用这些术语包括对下述条件的引用:探针或引物将杂交到其目标序列以至比其他序列具有能检测的更大程度(例如,超过背景的至少2倍)的条件。严格的条件是取决于序列的,并且在不同环境下会有所不同。较长的序列具体在较高的温度下杂交。一般而言,严格的条件选择为,在限定的离子强度和PH值下,比特定序列的热力学熔点(Tm)低约5°C。Tm是50%的互补目标序列杂交到完全匹配的探针或引物的温度(在限定的离子强度和PH值下)。通常,严格的条件将是下述条件:pH为7.0 8.3下,盐浓度小于约1.0M的Na+离子,通常为约0.01 1.0M的Na+离子浓度(或其他盐),并且对于短探针或引物(例如,10 50个核苷酸)温度为至少约30°C以及对于长探针或引物(例如,大于50个核苷酸)温度为至少约60°C。严格的条件还可通过添加去稳定剂如甲酰胺获得。示例性低严格的条件下或“降低严格性的条件”包括在37°C下用30%甲酰胺、IM NaClU% SDS的缓冲液杂交,并且在40°C下在2XSSC中清洗。示例性高严格的条件包括在37°C下在50%甲酰胺、IMNaClU% SDS中杂交,并在60°C下在0.1XSSC中清洗。杂交过程是本领域中公知的并描述在例如Ausubel et al, CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons Inc.,1994。本文使用的“受试者”包括但不限于哺乳动物,包括例如人、非人类灵长动物、小鼠、猪、牛、山羊、猫、兔、大鼠、豚鼠、仓鼠、八齿鼠、马、猴、绵羊,或其他非人类哺乳动物;以及非哺乳动物,包括例如非哺乳类脊椎动物,例如鸟(例如鸡或鸭)或鱼,和无脊椎动物。受试者可以是接受常规健康检查的健康的动物受试者或人受试者。另外,受试者可以是具有疾病危险的受试者[例如,遗传性易患病的受试者;具有癌症医疗和/或家族病史的受试者;已接触过致癌物、职业危害,环境危害的受试者]和/或表现出疾病的可疑临床迹象的受试者[如便中有血或黑粪症、不明原因的疼痛、出汗、不明原因的发热、不明原因的体重减轻直至厌食、大便习惯改变(便秘和/或腹泻)、里急后重(不完全的排便感,特别是直肠癌症)、贫血和/或全身无力]。根据另一实施方式,受试者可以是诊断患有疾病并在治疗之间正在进行常规检查的患者。本文使用的术语“凝血细胞”指血液血小板,即不具有包含DNA的细胞核的小不规则形状的细胞碎片,并且在哺乳动物的血液中循环。凝血细胞直径是2 3 y m,并且源自前体巨核细胞的碎片。凝血细胞的平均寿命是5 9天。凝血细胞参与止血并在其中发挥着重要作用,致使血凝块的形成。本文使用的术语“血液”指全血(包括血浆和细胞)并且包括动脉血液、毛细血管血液和静脉血液。本文使用的术语“有核细胞”优选指巴多林腺细胞;唾腺粘液细胞;唾腺浆液细胞;艾伯纳腺细胞;乳腺细胞;泪腺细胞;耵聍腺细胞;排泄汗腺细胞;大汗腺细胞;睫毛腺细胞(Gland of Moll cell);皮脂腺细胞;嗅腺细胞;十二指肠腺细胞;精囊细胞;前列腺细胞;尿道球腺细胞;尿道腺细胞;子宫子宫内膜细胞;孤立杯状细胞;胃衬粘液细胞;胃腺产酶细胞;胃腺壁细胞;胰腺腺细胞;潘纳斯细胞型肺细胞;克拉拉细胞;垂体前叶细胞;中间垂体细胞;大细胞神经分泌细胞;甲状腺细胞;甲状旁腺细胞;肾上腺细胞;间质细胞;卵泡内膜细胞;黄体细胞;球旁细胞;致密斑细胞;极周细胞(Peripolar cell);系膜细胞;血管和淋巴血管内皮有孔细胞;血管和淋巴血管内皮连续细胞;血管和淋巴血管内皮脾细胞;滑膜细胞;浆膜细胞;鳞状细胞;柱状细胞;暗细胞;前庭膜细胞;血管纹基底细胞;血管纹边缘细胞;克劳狄乌斯细胞;伯特歇尔细胞;脉络丛细胞;软膜蛛网膜鳞状细胞;色素睫状体上皮细胞;无色素睫状体上皮细胞;角膜内皮细胞;闰细胞;呼吸道纤毛细胞;输卵管纤毛细胞;子宫内膜纤毛细胞;睾丸网纤毛细胞;输出小管纤毛细胞;纤毛室管膜细胞;表皮角化细胞;表皮基底细胞;角化细胞;指甲床基底细胞;髓质毛干细胞;皮层毛干细胞;角质层毛干细胞;角质层毛根鞘细胞;外毛根鞘细胞;毛母质细胞;表面上皮细胞;基底细胞;尿路上皮细胞;听内毛细胞;听外毛细胞;初级感觉神经元;梅克尔细胞;嗅觉受体神经元;光感受器细胞;颈动脉体细胞(血液PH传感器);毛细胞;味蕾细胞;胆碱能神经细胞;肾上腺素能神经细胞;肽能神经细胞;内柱细胞;外柱细胞;内指状细胞;外指状细胞;边缘细胞;汉森细胞(Hensen cell);前庭器官支持细胞;味蕾支持细胞;嗅觉上皮支持细胞;神经膜细胞;卫星细胞;肠神经胶质细胞;星形胶质细胞;神经元细胞;少突细胞;纺锤体神经元;前晶状体上皮细胞;含晶体蛋白晶状体纤维细胞;肝细胞;脂肪细胞;肝脂肪细胞;肾小球壁细胞;肾小球足细胞;肾近曲小管刷状缘细胞;海氏套细段细胞(Loop of Henle thin segment cell);肾远端小管细胞;肾集尿管细胞;肺泡;胰管细胞;无横纹管细胞;管细胞;肠刷状缘细胞;外分泌腺纹状管细胞;胆囊上皮细胞;输出小管道无纤毛细胞;附睾主细胞;附睾基底细胞;成釉上皮细胞;半月平面上皮细胞(Planumsemilunatum epithelial cell);哥蒂氏齿间上皮细胞;疏松结缔组织成纤维细胞;角膜成纤维细胞;腱成纤维细胞;骨髓网状组织成纤维细胞;其他非上皮成纤维细胞;周细胞;髓核细胞;成牙骨质细胞/牙骨质细胞;成牙质细胞/牙质细胞(odontocyte);透明软骨软骨细胞;纤维软骨软骨细胞;弹性软骨软骨细胞;成骨细胞/骨细胞;骨原细胞;玻璃体细胞;星状细胞;肝星状细胞;胰腺形状细胞(Pancreatic stelle cell);骨骼肌细胞;卫星细胞;心肌细胞;平滑肌细胞;肌上皮细胞;巨核细胞;单核细胞;结缔组织巨噬细胞;表皮郎格罕斯细胞;破骨细胞;树突细胞;小神经胶质细胞;嗜中性粒细胞;嗜酸性粒细胞;嗜碱性粒细胞;肥大细胞;辅助性T细胞;抑制性T细胞;细胞毒性T细胞;自然杀伤T细胞;B细胞;自然杀伤细胞;网织红细胞;黑素细胞;视网膜色素上皮细胞;卵原细胞/卵母细胞;精子细胞;精母细胞;精原细胞;精子;卵泡细胞;塞尔托利细胞;胸腺上皮细胞和间质肾细胞。目标治疗和个性化医疗非常依赖于对疾病的剖析(profi I ing)和伴随诊断(companion diagnostic)的发展。在源于疾病的核酸中的突变能高度预测目标治疗的响应。然而,容易地获得高质量的核酸仍然是重要的发展障碍。血液一般包含150000 350000个凝血细胞(血小板)每毫升,为研究和临床使用提供高度可用的生物标记物源。此外,凝血细胞分离相对简单并且在血库/血液学实验室里是标准过程。因为血小板不包含细胞核,它们的RNA转录-维持功能需要的-在凝血细胞产生期间来自骨髓巨核细胞。现已发现,凝血细胞可在通过多种传输机制的循环过程中吸收RNA。肿瘤细胞释放大量的遗传物质积聚物(collection),其中的一些由突变RNA形式的微泡分泌。在血液循环过程中,凝血细胞吸收由癌症细胞及其他患病细胞分泌的遗传物质,用作个性化医疗背景下上述癌症和其他疾病的伴随诊断的有吸引力的平台。在下面的实施例中,表明从健康的人对照受试者中分离的血小板具有从来自人脑肿瘤细胞(神经胶质瘤)的包含RNA的微泡中吸收RNA的能力,之后,它们包含肿瘤相关的RNA,在神经胶质瘤患者的情况下包括例如突变体EGFRvIII mRNA。因此,确定从神经胶质瘤患者中分离的循环的血小板包含RNA生物标记物。使用RT-PCR以证实在凝血细胞中发现的突变体EGFRvIII mRNA反映了神经胶质瘤组织的存在。肿瘤标记物信息的存在不是神经胶质瘤患者的血小板独有的,而更普遍地适用于本文确定的广泛的疾病。编码前列腺癌症标记物PCA3和PSA的信使RNA可在前列腺癌患者的血小板中显示,而这些标记物在健康对照受试者的血小板中不存在。除检测与癌症或其他疾病相关的基因突变外,本发明人还发现,能使用基因表达阵列以分类患有特定类型(实体瘤)癌症或其他疾病的受试者的凝血细胞核酸样品。已证实用从健康的对照受试者分离的血小板中提取的核酸或从神经胶质瘤患者分离的血小板中提取的核酸得到mRNA表达谱明显不同。如图3C中示出的前30个点击(hit),得到了不同的mRNA表达谱,并且能检测到最小的神经胶质瘤生物标记物签名(biomarkersignature)。图3C中示出的不同谱包括下列基因的表达的明显增加:WFDC1、KremenUDEF4A、ARG1、FKBP5、ACRC、ENST0328043、A_32_P167111、MAP2、ECTL8、UNC13B、TP53I3、FDXR、BXl19718、S0RT1、PFN4、C1QTNF5、A_24_P237896、PGLYRP1、SEC14L2、BC018626、MA0B、TCNl、AM0TL1、TSP50、CD109、A_24_P927015、THC2325987、C18orfl 和 LIN28 (这些基因名称中一些参考微阵列编号(Microarray Accession number),例如安捷伦芯片(Agilent Chip)的寡核苷酸探针)。将理解的是,该谱不限制本发明的范围,因为通常本领域技术人员清楚地知道如何使用本发明的方法获得其他癌症和其他疾病的其他合适的基因表达谱。本发明人现已经发现,血液中的血小板包含源于肿瘤的或肿瘤相关的或源于疾病的核酸或核酸表达谱形式的癌症标记物和疾病标记物,并且发现这些血小板可用作本文限定的癌症和其他疾病的分子剖析的诊断平台。这在个性化医疗的背景下非常有用。本发明提供一种新的且易于使用的方法以分离用于遗传分析的循环的源于疾病的物质(例如本文使用的疾病标记物)。本发明人从循环的凝血细胞中分离源于肿瘤的RNA,产生纯RNA,并由此提供一种简单的方式以从少量血液中提取高质量的RNA。凝血细胞核酸(NA)的分离和随后的分析显示血液中循环NA的诊断灵敏度显著增加。本发明人发现在患病的患者体内循环凝血细胞包含显著量的源于疾病的RNA。该源于疾病的RNA显示关于疾病的独特的遗传信息,其可用于确定疾病的类型、疾病的程度、疾病对治疗可能的感受性。分析凝血细胞RNA中特定源于疾病的RNA的存在,如本文表明的源于神经胶质瘤肿瘤的EGFRvIII突变体RNA。本发明描述一种方法,该方法用于发现源于从血液中提取的无核血细胞例如凝血细胞内的疾病起源的有核细胞的特定转录。该方法是耐用(robust)且容易的。这归因于快速和直通(straight forward)的提取过程和提取的NA的质量。在临床使用情况下,凝血细胞提取(从血样中)已经在一般的生物样品采集中实施,因此预见实施到临床上是相对容易的。本发明提供一种用于分析受试者血液中源于疾病的核酸的存在的通用方法以及一种使用所述通用方法诊断受试者疾病的方法。当本文引用本发明方法时,指的是两类实施方式。本发明方法能在包括无核血细胞的任何合适的体样品(body sample)上实施,例如包括血液的组织样品,但优选所述样品是全血。受试者血样能通过任何标准的方法获得,例如通过静脉提取。需要的血液量没有特别的限制。根据采用的方法,本领域技术人员将能确定实施本发明方法的各个步骤需要的样品量,并获得用于遗传分析的足够的NA。通常,这些量将包括0.01 ii I IOOml范围的体积。体样品可在样品采集后立即分析。或者,根据本发明方法的分析能在储存的体样品上或在储存的其无核血细胞的部分优选凝血细胞上实施。用于测试的体样品或其无核血细胞的部分能使用本领域公知的方法和装置保藏。在采集的无核血细胞部分中,凝血细胞优选保持在非活性状态(即处于非激活状态)。以这种方式,最好地保藏细胞的完整性和源于疾病的核酸。假如无核血细胞的部分是凝血细胞部分,该血小板分离部分优选不包括贫血小板的血浆或富含血小板的血浆(PRP)。优选进一步分离血小板以得到最佳分辨率。体样品可适当地用其他方式处理,例如,它可被纯化,或消化,或可从中提取特定化合物。根据表征所述样品的无核血细胞中存在的NA的方法(该方法优选包括RT-PCR),通过本领域技术人员已知的方法可从样品中提取无核血细胞,并转移到分析方法需要的适于从中提取NA的任何合适的介质中。为防止早期破坏核酸,可处理接受受试者的体样品以从中除去大量的核酸降解酶(如核糖核酸酶、DNA酶)。自受试者的体样品中提取凝血细胞可包括任何可提供的方法。在输血医学中,凝血细胞经常通过单血液成分法采集,单血液成分法是一种医疗技术,其中捐赠者或患者的血液经过一种分离出一种特定的成分并将剩余部分返回循环的装置。各个血液成分的分离用专业离心机完成。血小板分离置换法(Plateletpheresis)(也称为血小板分离法(thrombopheresis)或血小板提取法(thrombocytapheresis))是采集凝血细胞的单血液成分采集过程。现代自动血小板分离置换法允许献血者捐出他们的凝血细胞的一部分,同时保持他们的红血细胞和血浆的至少一部分。虽然可能通过单血液成分法提供本文想像的包括凝血细胞的体样品,但采集全血并通过离心从中分离凝血细胞部分通常更容易。一般来说,在这样的实验规程中,通过室温下约120 Xg的离心步骤约20分钟,凝血细胞首先与其他血细胞分离从而得到富含血小板的血浆(PRP)部分。然后清洗上述凝血细胞(例如,在PBS-EDTA中)以除去血浆蛋白质并且富集凝血细胞。清洗步骤通常在室温下在850 IOOOXg下进行约10分钟。能进行进一步的富集以产生更纯的凝血细胞部分。
血小板分尚一般包括在含有抗凝血剂朽1檬酸葡萄糖(例如,36晕升朽1檬酸、5晕摩尔/升KC1、90毫摩尔/升NaCl、5毫摩尔/升葡萄糖、10毫摩尔/升EDTApH6.8)的真空采血试管(Vacutainer tube)中的血样采集。用于血小板分离的合适的实验规程描述在Ferretti 等(J Clin Endocrinol Metab2002 ;87:2180 2184)。该方法包括初步离心步骤(1300rpm每10分钟)以得到富含血小板的血浆(PRP)。然后在抗聚集缓冲液(Tris-HCllO毫摩尔/升;NaC1150毫摩尔/升;EDTA1毫摩尔/升;葡萄糖5毫摩尔/升;pH7.4)中清洗血小板三次,并如上所述离心以避免被血浆蛋白质的任何污染并除去任何残余的红细胞。然后,可在4000rpm下进行最后的离心20分钟以分离血小板。可清洗血小板颗粒(pellet)(例如,在磷酸盐缓冲盐水中)。为用于疾病标记物含量的定量确定,能将血小板细胞膜的蛋白质浓度用作内部参照。该蛋白质浓度可使用血清白蛋白作为标准,通过布拉德福德法(method of Bradford)确定(Anal Biocheml976 ;72:248 254)。提供受试者的体样品并且从中提取无核血细胞后,检测受试者无核血细胞中疾病特异的核酸的存在。如果在受试者无核血细胞中遇到疾病特异的核酸,或如果在受试者无核血细胞中比在对照受试者的未受影响的血样的无核血细胞中遇到更高含量的疾病特异的核酸,认为该疾病特异的核酸源自存在于受试者中的患病细胞或疾病组织,则所述受试者被诊断为患有本文限定的疾病。疾病特异的核酸(RNA和/或DNA疾病标记物)限定为源自包含与上述疾病相关的或该疾病特异的核酸序列中的突变或无突变的疾病细胞,并且还包括与来自健康献血者无核血细胞中的核酸相比上调或下调的源于疾病的无核血细胞的核酸。因此,本文中术语“疾病特异的核酸”和“源于疾病的核酸”互换使用。将理解的是,未突变的基因能被识别并能用于疾病诊断。如果某些基因在某些疾病中被过度表达,这些核酸可转移到无核血细胞。然而,如果这些核酸已经在健康受试者的无核血细胞中存在,人们能期望在这些患病的患者的无核血细胞中核酸份数增加。因此,在本发明方面的某些实施方式中,无核血细胞中某些基因的份数(或微阵列,例如通过定量PCR)的定量可有益于检测过度表达这些基因的疾病的存在。本发明方法的再一步骤是提供无核血细胞提取的核酸片段。该核酸片段随后用于其中疾病标记物的检测。该无核血细胞提取的核酸片段可通过任何可提供的NA提取方法获得。通常通过使用离液剂(chaotropic reagent)进行RNA提取。从细胞或组织中分离总RNA的第一步骤是在变性条件下破开细胞。1979年,Chirgwin等(Biochemistry, 18 [24]:5294 9,1979)发明了一种通过在具有0.1M2-巯基乙醇的4M的强效蛋白变性剂硫氰酸胍溶液中均质化以破坏蛋白质二硫键的有效分离总RNA的方法。然后通过乙醇提取或通过氯化铯超速离心来分离 RNA。1987 年,Chomczynski 和 Sacchi (Analytical Biochemistry,162[1]:156 9,1987)修改该方法,从而发明了使用硫氰酸胍和苯酚-氯仿混合物的快速单步提取过程,一种对于处理大量样品或对于从少量细胞或组织中分离RNA特别有用的方法。任何商业试剂盒也能用于RNA的提取,其非限制性实例包括Ambion’s RNAqueousTM系统、BiolOl’s RNaid Plus 试剂盒、Bioline Ltd.’s RNAce 试剂盒、CL0NTECH’s NucleoSpin RNA II 和 Nucleo Trap mRNA 试剂盒、Invitrogen Corp.’ s S.N.A.P.全 RNA 分离试剂盒以及QIAGEN’ s RNeasy试剂盒。提取的核酸样品中的源于疾病的核酸的检测,可通过适合用于检测疾病特异的核酸中的核酸序列突变或表达谱的任何可提供的遗传分析技术进行。通常,通过选择性核酸杂交能容易地检测该序列突变,该选择性核酸杂交包括通过两个单链核酸序列彼此选择性杂交形成的双螺旋核酸结构的形成。选择性杂交包括对下述杂交的引用:在严格的杂交条件下,核酸序列杂交到指定的核酸目标序列以至比其杂交到非目标核酸序列以及基本排除的非目标核酸更大的能检测的程度(例如,超过背景的至少2倍)。选择性杂交的序列彼此通常具有约至少80%的序列一致性,优选90%的序列一致性,并且最优选100%的序列一致性(即,互补)。或者,源于疾病的核酸的检测可通过测序技术例如DNA测序和RNA测序进行。当检测RNA中的序列突变或RNA的表达谱时,优选在检测其序列突变或定量表达量前将RNA转录成cDNA。使用RNA依赖性DNA聚合酶,例如来自病毒、反转录转座子、细菌等的反转录酶,能将RNA反转录成cDNA。这些聚合酶能具有核糖核酸酶H活性,或能使用如此突变以至于反转录酶的核糖核酸酶H活性受到限制或不存在(例如,MMLV-RT核糖核酸酶H-)的反转录酶。RNA依赖性DNA的合成(反转录)也能通过下述酶进行,经过突变该酶显示出更改的核酸依赖性或改变的反应条件,并由此获得RNA依赖性DNA聚合酶的功能。将RNA反转录成cDNA的商业试剂盒是可提供的。 一旦将RNA反转录成cDNA,使用例如上述选择性核酸杂交,能分析该DNA序列中癌症特异突变的存在或能分析表达谱。这些技术是本领域众所周知的,并且可包括使用对将被检测的突变特异的扩增引物的选择性扩增,或使用mRNA特异探针选择性杂交到核酸阵列。或者,一般的引物能用于扩增DNA,该DNA包括可疑突变,然后使用对该突变特异的探针通过选择性核酸杂交能在扩增子中检测该突变。表达谱通常使用在本领域很好地描述的定量杂交法得到,其示例描述在实施例中。本发明方法原则上能通过使用任何核酸扩增方法实施,例如聚合酶链反应(PCR ;Mullisl987,美国专利号4683195,4683202,4800159),或通过使用扩增反应,如连接酶链反应(LCR ;Barany1991, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA88:189 193;欧洲专利申请号 320308),自主序列复制(3SR ;Guatelli et al., 1990, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA87:1874 1878),链置换扩增(SDA,美国专利号5270184、5455166),转录扩增系统(TAS ;Kwoh et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:1173 1177), Q-0 复制酶(Lizardi etal., 1988, Bio/Technology6:1197),滚环扩增(Rolling Circle Amplification) (RCA,美国专利号5871921),基于核酸序列的扩增(NASBA),裂解酶碎片长度多态性(CleavaseFragment Length Polymorphism)(美国专利号5719028),等温和嵌合引物引发的核酸的扩增(ICAN),分枝延伸扩增法(Ramification-extension Amplification Method) (RAM,美国专利号5719028和5942391),或其他合适的扩增DNA的方法。为了将具有少数失配的DNA扩增至一个或多个扩增引物,扩增反应可在降低严格性的条件下进行(例如使用退火温度为38°C或在3.5mM MgCl2存在下的PCR扩增)。本领域技术人员将能够选择合适严格性的条件。本文的引物选择为“基本上”与它们在将被放大的每个特定序列的不同链上存在的目标区域互补(即至少65%,更优选至少80%完全互补)。可能使用包含例如肌醇残基或模糊碱基的弓I物序列或甚至使用当与目标序列相比时,包含一个或多个失配的引物。一般而言,认为表现出与目标DNA寡核苷酸序列至少65%,更优选至少80%的同源性的序列适用于本发明方法。当使用低严格性杂交条件时,序列失配也不是关键的。原则上扩增产物的检测能通过本领域已知的任何合适的方法完成。检测的碎片(fragment)可用放射性标记物、抗体、发光染料、突光染料,或酶试剂直接染色或标记。直接的DNA染色剂包括例如嵌入性染料(intercalating dye),例如卩丫唳橙、溴化乙锭、溴化乙锭单叠氮化物或赫克斯特染料(Hoechst dye)。或者,上述DNA碎片可通过将标记的dNTP碱基并入到合成的DNA碎片中检测。可与核苷酸碱基相关的检测标记包括,例如荧光素、花菁染料或溴脱氧尿苷(BrdUrd)。当使用基于探针的检测系统时,在本发明中使用的合适的检测过程可包括例如酶免疫测定(EIA)形式(Jacobs et al.,1997,J.Clin.Microbiol.35,791795)。为实施通过EIA过程的检测,扩增反应中使用的正向引物或反向引物可包括捕获基(capturinggroup),例如用于将目标DNAPCR扩增子固定在例如链霉亲和素涂覆的微量滴定板的孔(well)上的生物素基,用于随后的目标DNA扩增子序列EIA的检测(见下文)。本领域技术人员将理解,可采用将目标DNA PCR扩增子固定为EIA形式的其他基团。本文公开的对目标DNA的检测有用的探针优选只结合到通过DNA扩增过程扩增的DNA序列区域的至少一部分。如本文描述,基于目标DNA的核苷酸序列,本领域技术人员能制备合适的用于检测的探针,而无需过多的实验。此外,目标DNA的互补序列可适当地用作本发明方法中的检测探针,只要该互补链在采用的扩增反应中被扩增。本文使用的合适的检测过程可包括扩增子的固定并通过例如DNA印迹法探测其DNA序列。其他形式可包括上述EIA形式。为便于结合的检测,特异的扩增子检测探针可包括标记部分,如荧光团、生色团、酶或放射性标记物,以便于监测探针结合到扩增反应的反应产物。这些标记是本领域技术人员众所周`知的并包括例如,异硫氰酸荧光素(FITC)、
半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、链霉亲和素、生物素、异羟基洋地黄毒甙元、35S或1251。其他实例对于本领域技术人员将是显而易见的。检测还可通过例如由Van den Brule 等描述的(2002, J.Clin.Microbiol.40,779787)所谓的反向线印迹(RLB)阵列实施。为此,RLB探针优选用5’氨基合成,用以随后固定在例如羧基涂覆的尼龙膜上。RLB形式的优点是该系统的简易性和其速度,从而允许高通过量样品处理。用于检测DNA碎片的核酸探针的使用在本领域是众所周知的。大部分这些过程包括目标DNA与探针的杂交,随后是杂交后清洗。特异性通常是杂交后清洗的功能,关键因素是最后清洗溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体,Tm(热力学熔点,即在限定的离子强度和PH值下,50%的互补目标序列杂交到完全匹配的探针的温度)能由 Meinkoth 和 Wahl 方程(Anal.Biochem.,138:267 284 (1984))估算:Tm =81.5°C +16.6 (1gM) +0.41(% GC) -0.61 (%甲酰胺)-500/L,其中,M是单价阳离子的摩尔浓度,% GC是DNA中鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分比,%甲酰胺是杂交溶液中甲酰胺的百分比,以及L是碱基对中杂交体的长度。每I %失配Tm降低约I°C;因此,能调节杂交和/或清洗条件以杂交到所需一致性的序列。例如,如果追求具有> 90%—致性的序列Tm能降低10°C。一般而言,对于特定的序列及其互补序列,在限定的离子强度和pH值下,严格的条件选择为比Tm低约5°C。然而,非常严格的条件能利用比1 低11:、21:、31:或41:下的杂交和/或清洗;中等严格的条件能利用比Tm低6°C、7°C、8°C、9°C或10°C下的杂交和/或清洗;低严格的条件能利用比Tm低11°C、12°C、13°C、14°C、15°C或20°C下的杂交和/或清洗。使用上述方程,杂交和清洗组合物,以及所需Tm,本领域普通技术人员将理解本质上描述了严格的杂交和/或清洗溶液的严格性的变型。如果所需的失配程度致使低于45°C (水溶液)或32°C (甲酰胺溶液)的Tm,优选增加SSC浓度从而能使用更高的温度。核酸杂交的详尽的指南在 Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter2 “Overview ofprinciples of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays,,,Elsevier.New York(1993)以及 Current Protocols in Molecular Bio logy, Chapter2,Ausubel,et al.,Eds.,Greene Publishing and ffiley-1nterscience,New York(1995)中找到。检测探针优选选择为“基本上”与由本发明方法的扩增反应产生的双链DNA扩增子的链中的一个链互补。优选上述探针基本上与由目标DNA产生的扩增子的可固定的(例如生物素标记的)反义链互补。检测探针包含与它们的目标序列一个或多个失配是允许的。一般而言,认为表现出与目标DNA寡核苷酸序列至少65%,更优选至少80%的同源性的序列适用于本发明方法。分析无核血细胞提取的核酸片段中疾病标记物的存在的步骤因此能通过标准的核酸分析技术进行。相对于未受影响的血样,确定所述核酸片段中所述核酸标记物的含量是否有改变的步骤,将包括无核血细胞中疾病标记物的量的(半)定量测量。因此,从无核血细胞中分离的核酸中检测疾病特异标记物的非常优选的实验规程是定量反转录PCR(qRT-PCR)(Freeman et al., Bio Techniques26:112 125(1999))。上述“未受影响的血样”指健康的对照受试者或来自疾病初现之前的同一受试者的无核血细胞中疾病标记物的含量。因为无核血细胞的特性和无核血细胞成分的数量除其他外取决于物种和年龄,优选未患病的对照无核血细胞来自相同物种,相同年龄的受试者以及来自相同的子人群(如吸烟者/不吸烟者)。或者,对照数据可取自数据库和文献。将理解的是,为分析疾病的进展对照样品也可取自特定时间点的疾病受试者。疾病标记物包括癌症/特异突变并且癌症-结合突变可包括多种已知的与癌症相关的突变。多种癌症突变实例的非限制性列表提供在http://www.sanRer.ac.uk/genetics/CGP/Census/以及本文的表中。本发明进一步提供一种用于在受试者中诊断疾病的试剂盒,包括包装材料的所述试剂盒包括用于具体确定受试者无核血细胞样品中至少一种核酸突变体的含量和/或活性和/或核酸谱的至少一种试剂。如本文使用,术语“诊断”指确定疾病的存在,分类疾病,确定疾病的严重性(等级或阶段),监测疾病的进展,预测疾病的结果和/或恢复的前景。将理解的是,检测源于疾病的核酸必需的工具可提供为试剂盒,如FDA批准的试剂盒,其可包括含用于通过本发明方法检测无核血细胞中源于疾病的核酸的活性组分的一个或多个单位剂量形式。或者,上述试剂盒可包括用于采集样品的装置和单独包装的特异扩增引物和/或检测引物。
上述试剂盒可伴随有用于实施本发明方法的操作指南。例如,上述试剂盒可包括在诸如浸量尺或套筒的器件中,(可选地包括在外壳中),对该器件可应用血样,或分离的和/或扩增的无核血细胞核酸样品,并且该器件检测所述样品中源于疾病的核酸或疾病特异的核酸或核酸谱。该器件可包括能具体检测源于疾病的核酸的任何试剂。例如,该器件可包括固定的突变特异的杂交探针(其结合源于疾病的核酸)和用于检测结合的指示剂中的一种或其组合。在本发明实施方式中,在上述器件中提供杂交探针可除去地或固定地附着在其上的支撑体。根据一种实施方式,上述器件可以是包括入口装置的横向流动设备,其用于使血样或分离的和/或扩增的无核血细胞核酸样品流动至与能检测源于疾病的核酸的试剂接触。测试器件还能包括用于保证测试正常进行的流量控制装置。作为证实合适流量的样品流体经过测试器件的手段,该流量控制装置能包括结合到载体上的对照核酸,该核酸捕获添加到样品中的检测探针。或者,上述流量控制装置能包括在控制区域中的捕获探针,其捕获在所述样品中天然存在的对照核酸或添加到其中作为对照的核酸,再次指示上述器件内合适的流量通过。另一方面,本发明提供本发明器件的用途,该用途为使用本文上述任一方法诊断受试者中疾病。用于使用本文上述任一方法诊断受试者中疾病的非常合适的器件包括例如Nagalla&Bray (2010)Bloodl 15 (I):2 3 和 Gnatenko et al.Bloodll5 (I):7 14 中描述的血小板RNA芯片。本发明现将通过以下非限制性实施例例示。实施例实施例1通过离心步骤,从4个胶质母细胞瘤患者和4个健康献血者的血样中分离凝血细胞。然后使用Trizol RNA分离法,对凝血细胞进行RNA提取。纯化的血小板RNA样品然后转化成cDNA,并使用标准的微阵列实验规程通过Agilent4X44K表达微阵列分析。这使得在不同的凝血细胞制剂中剖析mRNA。来自健康献血者的血小板中约8500个RNA转录物通过表达微阵列不能检测到。来自健康献血者的凝血细胞中,这些转录物以低于Agilent4X44K芯片检出限的含量存在。因此,这些RNA可全是潜在的用于癌症诊断的生物标记物。来自健康献血者的凝血细胞中通过表达微阵列不能检测到的RNA中,相当量的RNA在来自胶质母细胞瘤患者的凝血细胞中检测到。表I总结了在来自胶质母细胞瘤患者的凝血细胞中而不是在来自健康献血者的凝血细胞中通过表达微阵列检测到的独特的血小板RNA转录物。在4/4患者样品中(表1A)或3/4患者样品(表1B)中但不是在四个对照样品任一个中检测到的独特的RNA转录物总结在表I中。表I在来自胶质母细胞瘤患者的凝血细胞中而不是来自健康献血者的凝血细胞中通过表达微阵列检测到的独特的血小板RNA转录物IA在四个患者样品的四个中的凝血细胞中检测到而在来自对照样品的凝血细胞
中未检测到的转录物
权利要求
1.一种分析受试者血样中疾病标记物的存在的方法,所述方法包括下述步骤: a)从所述血样的无核血细胞,优选凝血细胞中提取核酸,以提供无核血细胞提取的核酸片段;以及 b)分析所述无核血细胞提取的核酸片段中疾病标记物的存在; 其中,所述疾病标记物是所述受试者的有核细胞的基因中的疾病特异突变;或 其中,所述疾病标记物是所述受试者的有核细胞的基因的疾病特异表达谱。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述无核血细胞是凝血细胞或红细胞,优选凝血细胞。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中,所述疾病选自癌症、自身免疫性疾病、皮肤疾病、眼疾病、内分泌疾病、神经紊乱以及心血管疾病组成的组。
4.根据权利要求3所述的方法,其中,所述疾病是癌症,优选其中所述癌症是优选选自结肠、胰腺、脑、膀胱、乳腺、前列腺、肺、乳腺、卵巢、子宫、肝、肾、脾、胸腺、甲状腺、神经组织、上皮组织、淋巴结、骨、肌肉和皮肤的实体肿瘤癌症。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述疾病特异突变发生在染色体基因内,或其中,所述疾病特异表达谱是染色体基因的表达谱。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述核酸是核糖核酸(RNA),优选mRNAo
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,分析所述无核血细胞提取的核酸片段中疾病标记物的存在的所述步骤b)包括选择性扩增: i)所述突变,使用至少一种核酸突变特异扩增引物或探针,通过反转录酶聚合酶链反应扩增,或 ii)多个mRNA,通过反转录酶聚合酶链反应扩增,以确定编码所述mRNA的染色体基因的表达水平,由此以提供所述基因的表达谱,并将所述表达谱与参考谱进行比较。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述方法是诊断受试者所述疾病方法的一部分,并且其中,所述无核血细胞提取的核酸片段中所述疾病标记物的存在表明所述受试者患有所述疾病。
9.一种用于确定受试者的疾病阶段或疾病治疗的疗效的方法,包括下述步骤: 使用根据权利要求1 8中任一项所述的方法在第一时间点分析受试者血样中疾病标记物的存在,由此提供所述受试者中所述疾病标记物的含量的第一值; 使用根据权利要求1 8中任一项所述的方法在第二时间点分析所述受试者血样中疾病标记物的存在,由此提供所述受试者中所述疾病标记物的含量的第二值,其中,所述受试者已经在所述第一时间点和所述第二时间点之间接受过疾病治疗;以及 比较所述第一值和所述第二值以确定所述受试者的所述疾病治疗的疗效。
10.一种用于确定受试者的疾病阶段的方法,包括下述步骤: 使用根据权利要求1 8中任一项所述的方法分析受试者血样中疾病标记物的存在,由此提供所述受试者中所述疾病标记物的含量的测试值; 提供所述疾病标记物的含量的参考值,其中,所述参考值与疾病的特定阶段相关;以及 比较所述测试值和所述参考值以确定所述受试者的疾病阶段。
11.一种适于实施根据权利要求1 10中任一项所述的方法的部件的试剂盒,包括包装材料的所述试剂盒包括下述至少之一: 用于盛放从受试者血样中分离的无核血细胞的容器; 用于从所述无核血细胞中提取核酸的试剂; 用于通过反转录酶聚合酶链反应扩增由提取自所述无核血细胞的所述核酸选择性扩增所述受试者的有核细胞的基因中的疾病特异突变的试剂;以及 用于实施根据权利要求1 10中任一项所述的方法的印刷操作指南或电子操作指南, 所述试剂盒还包括: 所述疾病标记物的参考标准,其中,所述参考标准指示出所述无核血细胞提取的核酸片段中所述疾病标记物的存在或不存在。
12.根据权利要求11所述的试剂盒, 其中,所述参考标准是健康的对照受试者或患有所述疾病的对照受试者的凝血细胞中包括所述疾病特异突变的核酸的含量的参考值,或 其中,所述参考标准是来自健康的对照受试者或患有所述疾病的对照受试者的无核血细胞中的所述多个mRNA的参考表达谱。
13.根据权利要求11或12所述的试剂盒,所述试剂选自粒子或荧光标记物标记的抗无核血细胞抗体,或其中所述操作指南选自用于基于微珠的无核血细胞分离的操作指南、用于无核血细胞FACS分选的操作指南、用于通过离心回收无核血细胞的操作指南或用于非无核血细胞成分的负选择的操作指南。
14.一种用于诊断疾病的器件,所述器件包括支撑体和附着于所述支撑体的用于具体确定受试者无核血细胞样品中至少一种核酸突变体的含量和/或活性的至少一种试剂,以及 具有用于实施根据权利要求1 10中任一项所述的方法的计算机可执行指令的计算机可读介质。
15.根据权利要求14所述的器件,其中,所述至少一种试剂是寡核苷酸探针或测序引物。
16.根据权利要求14或15所述的器件,包括横向流动设备、浸量尺或套筒,它们用于进行: 无核血细胞提取的核酸和至少一种核酸突变特异扩增引物或寡核苷酸探针之间的核酸杂交反应,其中,所述核酸突变特异扩增引物或寡核苷酸探针对疾病特异突变是特异性的;或 无核血细胞提取的核酸和多种基因特异扩增引物或寡核苷酸探针之间用于提供疾病特异基因表达谱的核酸杂交反应 。
全文摘要
本发明涉及一种分析受试者血样中疾病标记物的存在的方法。所述方法包括下述步骤a)从所述血样的无核血细胞中提取核酸以提供无核血细胞提取的核酸片段,以及b)分析所述无核血细胞提取的核酸片段中疾病标记物的存在,其中,所述疾病标记物是所述受试者细胞的基因中的疾病特异突变,或其中所述疾病标记物是所述受试者的细胞的基因的疾病特异表达谱。
文档编号G01N33/48GK103168235SQ201180044900
公开日2013年6月19日 申请日期2011年7月15日 优先权日2010年7月16日
发明者托马斯·武丁格尔, 罗尔夫·乔纳斯·尼尔松 申请人:阿姆斯特丹自由大学及阿姆斯特丹自由大学医疗中心基金会

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