新的细胞外分泌型核酸酶的制作方法

xiaoxiao2020-6-24  7

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专利名称:新的细胞外分泌型核酸酶的制作方法
技术领域
本发明涉及新的细胞外分泌型核酸酶、其制造方法及该制造方法中使用的新的链霉菌属细菌。另外,本发明涉及使用该细胞外分泌型核酸酶的分解核酸的方法。
背景技术
核酸酶(Nuclease)是特异性地分解核酸的核酸分解酶的总称。使核酸酶作用于脱氧核糖核酸或核糖核酸等核酸时,核酸中的糖与磷酸之间的磷酸二酯键水解而生成核苷酸。核酸酶被分类为EC编号(Enzyme Commission numbers,酶学委员会编号)为EC.3.1的酯水解酶的一种。另外,核酸酶除了分类为分解RNA的核糖核酸酶和分解DNA的脱氧核糖核酸酶以外,还可以根据分解的方式进行分类。用于催化从序列中间的内部(endo-)将核酸切断的反应的酶称为核酸内切酶。作为代表性的核酸内切酶,可以列举各种限制性内切酶。与此相对,用于催化以从核酸序列的外侧(exo-)朝向内部、从核酸的5’端或3’端进行切削的方式将核酸切断的反应的酶称为核酸外切酶。作为代表性的核酸外切酶,已知核酸外切酶III等。目前,核酸酶在从研究室规模至工业规模的多种多样的场合中使用。例如,使用核酸酶时,可以利用其核酸分解活性使细胞提取液的粘性降低。因此,分离和纯化细胞提取液中的蛋白质及其他目标物质时,如果使用核酸酶,则可以期待缩短工艺时间、提高目标物质的收量、改善利用离心分离法的分级(颗粒与上清的分离性)、使溶液的过滤(特别是超滤)顺畅、提高层析工艺的效率等。另外,如果在分离和纯化核酸所非特异性吸附的病毒或包涵体等时使用核酸酶,则可以期待使它们的收率提高。此外,如果在用于分析生物试样的ELISA、层析、2D-PAGE或足迹分析等样品制备中使用核酸酶,则能够避免不期望的由核酸引起的测定误差。作为这样的能够在各种规模和场合下使用的核酸酶,已知来源于沙雷氏菌(Serratia spp.)的核酸内切酶(分别参考作为专利文献I和2的日本专利第2604365号说明书和美国专利第5173418号说明书,专利文献I和2的记载作为公开的内容特别援引于此)。沙雷氏菌属微生物中,有作为机会感染菌而具有病原性的微生物。因此,专利文献I中记载的核酸内切酶利用基因重组技术使用大肠杆菌以分泌到细胞外的细胞外分泌型酶的形式制造。另外,专利文献I中记载的来源于沙雷氏菌的核酸内切酶以 >'/少一S (注册商标)的商品名市售(参考作为非专利文献I的“ O '/ f —七二二一々々工> K ^夕> 7 一七(> '/ f 一七独特的核酸内切酶)”、[online] ,2008年I月I日、々株式会社、[2010 年 7 月 30 日检索]、 互联网 <URL:http://www2.merck.c0.jp/japan/chemical/pdf/info_pdf/071225_Ben zonase_16p.pdf>,非专利文献I的记载作为公开的内容特别援引于此)。作为非病原性微生物来源的核酸酶,已知放线菌的一种链霉菌属细菌(Streptomyces spp.)产生的核酸酶(分别参考作为非专利文献2 7的Biochem.J.1995306, 93-100 ;Biochem.J.1992 281, 231-237 ;Appl Microbiol Biotechnol.1995Nov;43(6):1056-1060 ;Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-General Subjects, Volumel721, Issuesl-3, 18January2005, 116-123 ;FEMS Microbiology Letters, Volume237, Issue2, 15August2004,273-278 和 Process Biochemistry Volume40,Issues3_4, March2005, 1271-1278,非专利文献2 7的记载作为公开的内容特别援引于此)。非专利文献2和3中记载的核酸酶以细胞内蓄积型酶的形式生产。与此相对,非专利文献4 7中记载的核酸酶为分泌到细胞外的细胞外分泌型酶。现有技术 文献专利文献专利文献1:日本专利第2604365号说明书专利文献2:美国专利第5173418号说明书非专利文献非专利文献1:“<>'/ f 一七二二一夕々工 > K ^ ” > 7* —七 ”、[online] ,2008年I月I日、J卟夕株式会社、[2010年7月30日检索]、互联网<URL:http://www2.merck.c0.jp/japan/chemical/pdf/info_pdf/071225_Benzonase_16p.pdf>非专利文献2:Santiago CAL, Jesus F.APARIC10, Clara G.DE LOSREYES-GAVILAN, Rebeca G.NICIEZA and Jesus SANCHEZ, Biochem.J.1995 306,93-100非专利文献3:Jesus F.APARIC10, Carlos HARD ISSON and JesusSANCHEZ, Biochem.J.1992 281,231-237非专利文献4:Vukelic B, Ritonja A, Vitale L., ApplMicrobiolBiotechnol.1995 年 11 月;43(6):1056-1060.
非专利文献 5:Zuzana Brnakova, Andrej Godany and JozefTimko, Biochimicaet Biophysica Acta (BBA)-General Subjects, Volumel721, Issuesl-3, 2005 年 I 月 18日,116-123非专利文献6:Sumedha S.Deshmukh and Vepatu Shankar, FEMS MicrobiologyLetters, Volume237, Issue2, 2004 年 8 月 15 日,273-278 页非专利文献7:Nitin S.Patil, Sumedha S.Deshmukh andVepatu Shankar, ProcessBiochemistry Volume40, Issues3_4, 2005 年 3 月,1271-1278 页

发明内容
发明所要解决的问题专利文献I和2中记载的核酸酶以及非专利文献I中记载的 > '/ t — 是使用非病原性微生物制造的核酸酶。但是,由于这些核酸酶利用基因重组大肠杆菌进行生产,因此,生产率低于来源微生物的生产率。因此,为了得到工业性规模的核酸酶,需要重复或延长生产步骤等,操作方面、经济方面和时间上的负担的增大成为问题。因此,作为核酸酶的生产方法,期望不使用基因重组技术而使用天然的非病原性微生物进行生产。非专利文献2和3中记载的核酸酶是蓄积在非病原性微生物体内的细胞内蓄积型酶。因此,为了得到这些核酸酶,必须将蓄积有核酸酶的微生物体破碎、接着从得到的微生物破碎物中分离纯化核酸酶。因此,得到非专利文献2和3中记载的核酸酶的工艺复杂,并且存在混入杂质的可能性高的问题。与此相对,非专利文献4 7中记载的核酸酶是分泌到非病原性微生物的体外的细胞外分泌型酶,不会引起制造上述的专利文献I和2以及非专利文献I 3中记载的核酸酶时产生的问题。但是,非专利文献4 7中记载的核酸酶存在活性非常低这一共同的问题。如果将非专利文献4 7中记载的核酸酶的比活性换算成非专利文献I中记载的单位,则分别为 3.5X105U/mg 蛋白、9.7X 103U/mg 蛋白、1.3X 104U/mg 蛋白和 3.2X 104U/mg 蛋白,活性比非专利文献I中记载的核酸酶低约3倍 约100倍。另外,非专利文献4 和5中记载的核酸酶容易因NaCl而使酶活性受到抑制。非专利文献4中记载的核酸酶在IOmM NaCl存在下的比活性与在非专利文献4中记载的标准活性条件下的比活性相比为32%。非专利文献5中记载的核酸酶在IOOmM NaCl存在下的比活性与在非专利文献5中记载的标准活性条件下的比活性相比为40 50%。因此,将非专利文献4和5中记载的核酸酶进行稀释等时,不能使用一般广泛使用的PBS等含有NaCl的缓冲液。另外,在借助微生物的培养而进行的产业性的制造工艺中,为了提高菌体浊度,一般使用含有IOOmM以上的一价金属盐的高营养的培养基来培养微生物。通过这样的培养得到的培养液中的核酸可能在盐浓度高的条件下实施分解。非专利文献6和7中记载的核酸酶在以纯化酶的形式利用EDTA进行透析时,完全丧失活性。为了恢复其活性,需要使用Mn2+,不能使用Mg2+等其他二价金属离子来代替。锰盐非常昂贵,且存在残留毒性的危险。因此,由于比活性低、容易因NaCl而使酶活性受到抑制、酶活性所需的二价金属离子限定于Mn2+等问题,非专利文献4 7中记载的核酸酶未在工业性规模的核酸分解时使用。因此,本发明所要解决的第一问题在于提供由天然的非病原性微生物分泌到细胞外且比活性比现有核酸酶的比活性高、在工业性规模的核酸分解中有用的核酸酶。另外,本发明所要解决的第二问题在于提供由天然的非病原性微生物分泌到细胞外、NaCl对酶活性的影响小、并且在酶活性方面需要比锰廉价且毒性小的二价金属离子、在工业性规模的核酸分解中有用的核酸酶。此外,本发明所要解决的另一问题在于提供制造上述核酸酶的方法及能够供于该方法的非病原性微生物。 用于解决问题的手段本发明人反复 进行了深入研究,结果成功地从深海中分离出在培养液中分泌比活性高的核酸酶的微生物。接着对该微生物进行了鉴定,结果获知其是作为放线菌之一的非病原性的链霉菌属细菌,本发明人将该微生物命名为链霉菌(Sti^ptomyces sp.)MBE174。从链霉菌MBE174的培养液中分离和纯化显示核酸酶活性的蛋白质级分,结果得到了以双链DNA、单链DNA和RNA为底物且比活性比非专利文献I中记载的 > '/ f 一七的比活性高的核酸酶(NucS)以及以双链DNA和单链DNA为底物、能够在高浓度的Na+存在下维持比活性、并且能够需要比锰廉价且毒性小的镁的核酸酶(NucL)这两种核酸酶。上述NucS和NucL是随着链霉菌MBE174的增殖在维持核酸酶活性的情况下分泌到培养液中的核酸酶。因此,链霉菌MBE174的培养液、该培养液的干燥物及简单纯化物能够作为含有NucS和NucL这两种核酸酶的粗酶而供于工业性规模的核酸分解,有用性高。本发明是基于上述发现而完成的发明。因此,根据本发明,提供一种链霉菌属细菌来源的细胞外分泌型核酸酶作为本发明的第一方式的核酸酶,其以双链DNA、单链DNA和RNA为底物,并且纯化后在含有ImMMgClJP ImM CaCl2、pH为8.5的20mM Tris/HCl中在37°C下供于双链DNA30分钟时的比活性与 > '/于一七(注册商标)的比活性为同等程度或高于 > '/ f 一七' 的比活性。优选利用SDS-PAGE法测定的分子量为17000 21000。优选需要Mg2+或Mn2+作为二价金属离子。优选链霉菌属细菌为链霉菌MBE174 (保藏编号:FERM P-21987)。根据本发明的另一方面,提供一种核酸酶作为本发明的第二方式的核酸酶,其中,包含:(1)序列表的序列号I中记载的氨基酸序列、(2)序列表的序列号I中记载的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个至数个氨基酸后得到的氨基酸序列、或(3)与序列表的序列号I中记载的氨基酸序列具有90%以上的同源性的氨基酸序列。根据本发明的另一方面,提供一种链霉菌属细菌来源的细胞外分泌型核酸酶作为本发明的第三方式的核酸酶,其以双链DNA和单链DNA为底物,并且在IOOmM Na+存在下的比活性为未添加Na+时的比活性的60%以上。优选利用SDS-PAGE法测定的分子量为约66500。优选需要Mg2+作为二价金属离子。优选链霉菌属细菌为链霉菌MBE174 (保藏编号:FERM P-21987)。根据本发明的另一方面,提供一种核酸酶作为本发明的第四方式的核酸酶,其中,包含:(a)序列表的序列号2中记载的氨基酸序列、(b)序列表的序列号2中记载的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个至数个氨基酸后得到的氨基酸序列、或(c)与序列表的序列号2中记载的氨基酸序列具有85%以上的同源性的氨基酸序列。根据本发明的另一方面,提供一种粗酶,其中,含有本发明的第一或第二方式的核酸酶和/或本发明的第三或第四方式的核酸酶作为核酸酶活性成分。根据本发明的另一方面,提供一种细胞外分泌型核酸酶的制造方法,其中,包括对链霉菌MBE174(保藏编号:FERM P-21987)进行培养而得到至少一种细胞外分泌型核酸酶的步骤。根据本发明的另一方面,提供一种细胞外分泌型核酸酶或其粗酶,其通过本发明的制造方法得到。
根据本发明的另一方面,提供链霉菌MBE174(保藏编号:FERM P-21987)。根据本发明的另一方面,提供一种分解核酸的方法,其中,包括将本发明的第一或第二方式的核酸酶和/或本发明的第三或第四方式的核酸酶供于含有核酸的试样而使所述核酸分解的步骤。优选所述核酸为DNA。发明效果本发明的核酸酶是由一种作为天然的非病原性微生物的链霉菌属细菌分泌到细胞外的核酸酶,因此,生产本发明的核酸酶的链霉菌属细菌的培养液、该培养液的干燥物或粗纯化物能够作为粗酶使用。另外,本发明的核酸酶具有比活性比现有核酸酶的比活性高或即使在高盐浓度存在下也会维持活性、并且所需的二价金属离子为镁的特征,因此,能够供于工业性规模的核酸分解。本发明的两种 核酸酶可以根据例如盐浓度而分开使用。具体而言,在低盐浓度的环境下,可以利用比活性大的一种酶(例如NucS)使DNA和RNA迅速分解,在高盐浓度的环境下,可以期待利用另一种酶(例如NucL)进行DNA分解和RNA的蓄积。因此,如果准备含有本发明的两种核酸酶的混合物,则能够通过改变盐浓度而实现期望的核酸的分解和蓄积。另外,本发明的在高盐浓度的环境下维持活性的酶(例如NucL)能够分解DNA而不分解RNA。发挥这种不分解RNA的特性,能够将例如本发明的酶用于特异性制备RNA的方法。在使用本发明的核酸酶分离和纯化细胞提取液中的蛋白质及其他目标物质的情况下,能够期待缩短工艺时间、提高目标物质的收量、改善利用离心分离法的分级(颗粒与上清的分离性)、使溶液的过滤(特别是超滤)顺畅、提高层析工艺的效率、提高病毒或包涵体等的收率、避免ELISA、层析、2D-PAGE、足迹分析等的测定误差等。


图1是表示部分纯化NucS的SDS-PAGE和活性染色的图。图2是表示纯化NucL的SDS-PAGE和活性染色的图。图3是表示NucS的pH与活性的相关性的图。图4是表示NucL的pH与活性的相关性的图。图5是表示NucS和NucL的温度与活性的相关性的图。图6是表示NucS和NucL的热稳定性试验的结果的图。图7是表示一价盐(NaCl)对NucL的酶活性的影响的图。图8是表示一价盐(KCl)对NucL的酶活性的影响的图。图9是表示二价金属盐(MgCl2)对NucS和NucL的酶活性的影响的图。图10是表示二价金属盐(MnCl2)对NucS和NucL的酶活性的影响的图。图11是表示磷酸 盐对NucL的酶活性的影响的图。图12是表示NucS、NucL和> '/ f 一七、使环状质粒DNA分解的模式的分析结果的图。图13是表示利用NucL得到的环状质粒DNA的分解结果的图。
图14是表示利用NucS对环状质粒DNA进行的分解反应初期的反应结果的图。图15是表示利用NucL对环状质粒DNA进行的分解反应初期的反应结果的图。图16是表示利用NucS得到的直链双链DNA的分解结果的图。图17是表示利用NucL得到的直链双链DNA的分解结果的图。
具体实施例方式以下,对本发 明的详细内容进行说明。本发明的核酸酶涉及链霉菌属细菌来源的细胞外分泌型核酸酶。本发明的核酸酶根据其性质、功能和结构分类为两个酶组。以下,使用“核酸酶A”和“核酸酶B”的名称对本发明的核酸酶进行说明。[I]本发明的核酸酶A本发明的核酸酶A涉及以双链DNA例如超螺旋型和松弛型等的双链DNA、单链DNA和RNA为底物的核酸酶。本发明的核酸酶A具有如下特征:纯化后在含有ImM MgClJP ImMCaCl2, pH为8.5的20mM Tris/HCl中在37°C下供于双链DNA30分钟时的比活性与> '/于一七(注册商标)的比活性为同等程度或高于 >'/于一七的比活性。本说明书中的> '/ f 一七' (注册商标)”是指非专利文献I中以“生物技术用^ ^ I级(99%) 250U/μ L”的产品名记载的、市售的核酸酶。后述的实施例所示的在含有 ImM MgCl2 和 ImM CaCl2, pH 为 8.5 的 20mM Tris/HCl 中在 37°C下供于双链 DNA30分钟时的 >'/于一七' (注册商标)的比活性为9.4X105U/mg蛋白。关于本说明书中的“与 >'/f 一七' (注册商标)的比活性为同等程度”,只要是与 > '/于一七的比活性近似的值则没有特别限制,例如为> '/于一七的比活性的±10%以内,优选为±5%以内,更优选为±2%以内。关于本说明书中的“高于>'/f 一
(注册商标)的比活性”,只要高于 >'/于一七的比活性则没有特别限制,例如为 >'/于一七' 的比活性的1.1倍以上,优选为1.5倍以上,更优选为2.0倍以上,进一步优选为
2.5倍以上,更优选为3.0倍以上。与《> '/ f 一七' 的比活性进行比较时,本发明的核酸酶A使用纯化后的核酸酶A。本发明的核酸酶A的纯化使用阴离子交换(SuperQ)、羟磷灰石、阳离子交换(CM琼脂糖)、肝素亲和层析和凝胶过滤层析进行纯化。对于在作为本发明的优选方式的后述的实施例中记载的NucS而言,纯化后的比活性为3.6X106U/mg蛋白。与此相对,O'/于一七(注册商标)的比活性为9.4X 105U/mg蛋白。因此,纯化后的本发明的核酸酶A的比活性优选为^ ^ f 一七的比活性的约3.8倍。本发明的核酸酶A的底物特异性通过如下方法测定:以双链DNA、单链DNA、RNA等各种核酸为底物,在含有ImM MgCl2和ImM CaCl2、pH为8.5的20mM Tris/HCl中在37°C下供给30分钟来考察这些底物的分解活性。本发明的核酸酶A只要是底物和比活性如上所述的核酸酶则没有特别限制,优选利用SDS-PAGE法测定的分子量为17000 21000,并且/或者需要Mg2+或Mn2+作为二价金属离子。本发明的核酸酶A除了可以以上述的底物催化活性和比活性作为指标以外,还可以以分子量和二价金属需要性等作为指标通过考察对链霉菌属细菌、例如生存在深海(水面下200m以下的海)中的链霉菌属细菌进行培养而得到的培养上清中的核酸酶活性的筛选法来分离。作为生存在深海中的链霉菌属细菌,优选为链霉菌MBE174。另外,该链霉菌MBE174在2010年7月27日以FERM P-21987的保藏编号保藏于独立行政法人产业技术综合研究所的专利生物保藏中心(邮政编码305-8566,茨城县筑波市东1-1-1筑波中心中央第6)。本发明 的核酸酶A的具体方式为包含下述氨基酸序列的核酸酶:(1)序列表的序列号I中记载的氨基酸序列、(2)序列表的序列号I中记载的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个至数个氨基酸后得到的氨基酸序列或⑶与序列表的序列号I中记载的氨基酸序列具有90%以上的同源性的氨基酸序列。包含上述⑴序列表的序列号I中记载的氨基酸序列的核酸酶是利用SDS-PAGE法测定的分子量为17000 21000的酶组,具有ALPTPVSAATAR(序列表的序列号27)作为共有序列。序列表的序列号I是指以共有氨基酸序列ALPTPVSAATAR为N末端的起点、计算为17kDa的共有氨基酸序列(157个氨基酸)。本发明的核酸酶A的更具体的方式为后述的实施例中记载的NucS,其为由214个氨基酸(序列表的序列号3)构成的核酸酶。关于上述(2)的氨基酸序列的“缺失、取代或添加一个至数个氨基酸”中的“一个至数个”的范围,只要包含上述(2)的氨基酸序列的核酸酶的纯化后的比活性在含有ImMMgClJP ImM CaCl2、pH为8.5的20mM Tris/HCl中在37°C下供于双链DNA30分钟的条件下与 >'/于一七(注册商标)的比活性为同等程度或高于 >'/于一七的比活性的范围则没有特别限定,例如表示约I个至约20个,优选为约I个至约10个,更优选为约I个至约7个,进一步优选为约I个至约5个,特别优选为约I个至约3个。另外,“氨基酸的缺失”表示序列中的氨基酸残基欠缺或消失,“氨基酸的取代”表示序列中的氨基酸残基被取代成其他氨基酸残基,“氨基酸的添加”表示序列中添加有新的氨基酸残基。作为“缺失、取代或添加一个至数个氨基酸”的具体方式,有将一个至数个氨基酸利用在化学方面类似的其他氨基酸来取代的方式。例如,可以列举:将某疏水性氨基酸取代成其他疏水性氨基酸的情况、将某极性氨基酸取代成具有相同电荷的其他极性氨基酸情况等。这种化学性质类似的氨基酸对于每种氨基酸而言在该技术领域中是已知的。如果列举具体例,则作为非极性(疏水性)氨基酸,可以列举丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸等。作为极性(中性)氨基酸,可以列举甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等。作为带有正电荷的(碱性)氨基酸,可以列举精氨酸、组氨酸、赖氨酸等。另外,作为带有负电荷的(酸性)氨基酸,可以列举天冬氨酸、谷氨酸等。上述(3)的氨基 酸序列中的“同源性”是指包含上述(3)的氨基酸序列的核酸酶的纯化后的比活性在含有ImM MgCl2和ImM CaCl2, pH为8.5的20mM Tris/HCl中在37°C下供于双链DNA30分钟的条件下与 >'/f 一七' (注册商标)的比活性为同等程度或者为高于> '/ f 一七的比活性的范围即90%以上,优选为93%以上,更优选为95%以上,进一步优选为97%以上,更进一步优选为99%以上。获取本发明的核酸酶A的方法没有限制,除了上述的筛选法以外,可以参考例如序列表的序列号I和3的记载通过物理化学方法来合成,也可以通过基因工程方法由编码序列表的序列号I和3中记载的氨基酸序列的核酸来制作。
[2]本发明的核酸酶B本发明的核酸酶B涉及以双链DNA例如超螺旋型和松弛型等的双链DNA和单链DNA为底物且实质上不以RNA为底物的核酸酶。本发明的核酸酶B具有如下特征:在IOOmM Na+存在下的比活性为未添加Na+时的比活性的60%以上,优选为70%以上,更优选为80%以上,进一步优选为90%以上。Na+对本 发明的核酸酶B的比活性的影响可以通过如下方法来考察:在含有ImMMgCl2和O IOOmM NaCl、pH为8.5的IOmM Tris/HCl中,以0.4mg/mL来自于鲑鱼精的脱氧核糖核酸钠盐(西格玛奥德里奇公司制造,目录号D1626-1G)为底物,在25°C下测定各NaCl浓度的核酸分解活性。本发明的核酸酶B的底物特异性可以与本发明的核酸酶A的底物特异性同样地进
行考察。本发明的核酸酶B只要是底物和对Na+的稳定性如上所述的核酸酶则没有特别限制,优选利用SDS-PAGE法测定的分子量为约66500并且/或者需要Mg2+作为二价金属离子。本发明的核酸酶B除了可以以上述的底物催化活性和对Na+的稳定性作为指标以外,还可以以分子量和二价金属需要性等作为指标通过考察对链霉菌属细菌、例如生存在深海(水面下200m以下的海)中的链霉菌属细菌进行培养而得到的培养上清中的核酸酶活性的筛选法来分离。作为生存在深海中的链霉菌属细菌,优选为链霉菌MBE174(保藏编号:FERM P-21987)。本发明的核酸酶B的具体方式为包含下述序列的核酸酶:(a)序列表的序列号2中记载的氨基酸序列、(b)序列表的序列号2中记载的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个至数个氨基酸后得到的氨基酸序列或(c)与序列表的序列号2中记载的氨基酸序列具有85%以上的同源性的氨基酸序列。包含上述(a)序列表的序列号2中记载的氨基酸序列的核酸酶是利用SDS-PAGE法测定的分子量为66500且N末端部不含信号肽的成熟蛋白质(575个氨基酸)。本发明的核酸酶B的更具体的方式为后述的实施例中记载的NucL,其由607个氨基酸(序列表的序列号4)构成,且N末端不含信号肽。关于上述(b)的氨基酸序列的“缺失、取代或添加一个至数个氨基酸”中的“一个至数个”的范围,只要包含上述(b)的氨基酸序列的核酸酶在IOOmM Na+存在下的比活性为未添加Na+时的比活性的60%以上的范围则没有特别限定,例如表示约I个至约20个,优选为约I个至约10个,更优选为约I个至约7个,进一步优选为约I个至约5个,特别优选为约I个至约3个。另外,上述(b)的氨基酸序列中的“氨基酸的缺失”、“氨基酸的取代”和“氨基酸的添加”的含义以及“缺失、取代或添加一个至数个氨基酸”的具体方式与在作为本发明的核酸酶A的具体方式的(2)的氨基酸序列中说明过的同样。上述(c)的氨基酸序列中的“同源性”是指包含上述(C)的氨基酸序列的核酸酶在IOOmM Na+存在下的比活性为未添加Na+时的比活性的60%以上的范围即85%以上,优选为88%以上,更优选为90%以上,进一步优选为95%以上,更进一步优选为99%以上。获取本发明的核酸酶B的方法没有限制,除了上述的筛选法以外,例如可以参考序列表的序列号2和4的记载通过物理化学方法来合成,也可以通过基因工程方法由编码序列表的序列号2和4中记载的氨基酸序列的核酸来制作。[3]本发明的粗酶本发明的粗酶含有本发明的核酸酶A、本发明的核酸酶B或这两种核酸酶作为核酸酶活性成分。本发明的粗酶中,本发明的核酸酶A和核酸酶B的存在比没有特别限制,可以根据作为底物的核酸的种类或浓度、给这些核酸酶的活性带来影响的物质的种类或浓度等适当选择。本发明的粗酶 显示出所含有的本发明的核酸酶A和/或核酸酶B的性质。根据本发明的粗酶,例如,在低盐浓度的环境下,可以期待利用比活性大的本发明的核酸酶A使DNA和RNA迅速分解,在高盐浓度的环境下,可以期待利用本发明的核酸酶B进行DNA分解和RNA的蓄积。因此,根据本发明的粗酶,可以通过改变盐浓度而实现期望的核酸的分解和蓄积。本发明的粗酶可以以对生产本发明的核酸酶A和核酸酶B的链霉菌属细菌、优选链霉菌MBE174 (保藏编号:FERM P-21987)进行培养而得到的培养物的形式来制造。[4]本发明的制造方法本发明的制造方法为包括对链霉菌MBE174(保藏编号:FERM P-21987)进行培养而得到至少一种细胞外分泌型核酸酶的步骤的细胞外分泌型核酸酶的制造方法。具体而言,本发明的制造方法为根据常规方法将链霉菌MBE174(保藏编号:FERM P-21987)接种到适当的培养基中后在适当的条件下培养、并从所得到的培养物中采集细胞外分泌型核酸酶的细胞外分泌型核酸酶的制造方法。作为细胞外分泌型核酸酶,优选本发明的核酸酶A和/或本发明的核酸酶B。本发明的制造方法大致包括:(a)对链霉菌MBE174 (保藏编号:FERM P-21987)进行培养而得到含有细胞外分泌型核酸酶的培养物的步骤和(b)从该培养物中得到细胞外分泌型核酸酶的步骤这两个步骤。作为链霉菌MBE174(保藏编号:FERM P-21987)的培养中使用的营养培养基,可以广泛使用作为链霉菌属细菌用的培养基而已知的培养基,例如,除了可以使用YMA(酵母提取物-麦芽提取物琼脂)培养基(酵母提取物4.0g/Ι、麦芽提取物10.0g/Ι、葡萄糖4.0g/1、琼脂18.0g/l ;pH7.3)或白蛋白培养基(卵白蛋白0.25g/l、葡萄糖1.0g/l、K2HP04 0.5g/1、MgSO4.7Η200.2g/l、Fe2 (SO4) 31% 溶液 1ml、琼脂 18.0g/1 ;pH6.8-7.0)等合成培养基以夕卜,还可以使用天然培养基,可以优选使用酵母提取物4.0g/Ι、麦芽提取物10.0g/Ι、葡萄糖30.0g/Ι、多聚蛋白胨S50.0g/Ι、碳酸钙6.0g/Ι ;未调节pH。但是,在直接将培养物作为粗酶使用的情况下,在培养基制备中要注意pH、一价盐、二价金属盐、磷酸盐以及其他影响酶活性的化合物的浓度。优选根据期望的核酸酶活性来增减它们的浓度。作为培养法,优选液体 培养法(振荡培养法或通气搅拌培养法),工业上优选通气搅拌培养法。链霉菌MBE174(保藏编号:FERM P-21987)的培养通常在选自温度20 45°C、优选25 40°C、pH5 9、优选6 8的条件下以需氧方式实施。培养时间只要是使链霉菌MBE174(保藏编号:FERM P-21987)开始增殖的时间以上的时间即可,优选为8 120小时,进一步优选为直到使期望的核酸酶活性达到最大值为止的时间。确认菌体增殖的方法没有特别限制,例如,可以采集培养物并利用显微镜来观察,也可以利用吸光度来观察。另夕卜,培养液的溶解氧浓度没有特别限制,通常优选为0.5 20ppm。因此,可以调节通气量、进行搅拌或在通气中追加氧气。培养方式可以是分批培养、流加培养、连续培养或灌流培养中的任何一种方式。从以上述方式培养得到的培养物中采集细胞外分泌型核酸酶。细胞外分泌型核酸酶的采集法可以根据一般的酶采集方法来进行。例如,可以在通过固液分离等通常已知的方法除去细胞后,将培养上清作为粗酶使用。固液分离可以没有限制地使用通常已知的方法,例如,采用直接将培养物本身进行离心分离的方法、通过向培养物中添加过滤助剂或利用预涂有过滤助剂的预涂过滤器等进行过滤分离的方法、使用平膜、中空丝膜等进行膜过滤分离的方法等。粗酶可以 直接使用,也可以纯化后使用。例如,不限于在此列举的方法,可以通过将热处理等利用耐热性的差的方法;透析、超滤、树脂柱、凝胶过滤、凝胶过滤层析和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳等利用分子量的差的方法;盐沉淀、硫酸铵沉淀、醇沉淀及其他溶剂沉淀等利用溶解性的差的方法;使用DEAE-T0Y0PEARL树脂等的离子交换层析等利用电荷的差的方法;亲和层析等利用特异性亲和性的方法;使用丁基-T0Y0PEARL树脂等的疏水层析和反相层析等利用疏水性的差的方法;吸附层析等利用物理化学上的吸附性的差的方法;等电点电泳和等电点层析等利用等电点的差的方法等通常已知的方法单独或组合供于所得到的粗酶来制备工业用途的纯化酶。也可以将粗酶及纯化酶固定化。例如,可以采用与离子交换体结合的结合法、与树脂和膜等的共价结合-吸附法、使用高分子物质的包埋法等。利用本发明的制造方法得到的细胞外分泌型核酸酶或其粗酶作为本发明的另一方式提供。另外,本发明的制造方法中使用的链霉菌属细菌即链霉菌MBE174(保藏编号:FERM P-21987)也作为本发明的另一方式提供。作为本发明的制造方法的另一方式,提供一种制造细胞外分泌型核酸酶的方法,其中,包括如下步骤:参考编码本发明的核酸酶A的DNA的碱基序列例如序列表的序列号5中记载的碱基序列或编码本发明的核酸酶B的DNA的碱基序列例如序列表的序列号6中记载的碱基序列,利用物理化学方法或基因工程方法合成编码本发明的核酸酶A和核酸酶B的DNA片段,接着将合成的DNA片段重组到载体中,接着将重组有DNA片段的重组载体插入宿主细胞中而制作转化体,并对该转化体进行培养,由此得到细胞外分泌型核酸酶。[5]本发明的方法本发明的方法涉及一种分解核酸的方法,其中,包括向含有核酸的试样中供给本发明的核酸酶A、本发明的核酸酶B或这两种核酸酶而使所述核酸分解的步骤。本发明的核酸酶A和核酸酶B可以以固态或液态的粗酶和纯化酶的形式使用。本发明的核酸酶A和核酸酶B也可以以利用通常已知的方法固定化的固定化酶的形式使用。作为含有核酸的试样中的水性介质,只要不妨碍核酸分解反应则没有特别限制,可以列举例如水、缓冲液等。作为缓冲液,采用例如醋酸缓冲液、磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、琥珀酸缓冲液、Tris盐酸缓冲液等,由于本发明的核酸酶A存在因磷酸离子或钠离子而产生活性抑制的可能性,因此优选不含这些物质的Tris盐酸缓冲液等。本发明的核酸酶A和核酸酶B的使用量没有特别限制,从核酸分解的效率和经济性的观点出发,例如,本发明的核酸酶A的使用量相对于10 μ g核酸为I X 10_6 50U (单位),优选为I X IO-5 10U,更优选为I X 10_4 1U,进一步优选为I X 10_3 I X IO-1U ;本发明的核酸酶B的使用量相对于10 μ g核酸为I X 10_4 50U,优选为I X 10_3 20U,更优选为1X10_2 10U,进一步优选为IXKT1 IU。核酸的浓度只要是能溶解于溶液的范围则没有特别限定。核酸分解 反应优选在本发明的核酸酶A和核酸酶B具有活性且稳定地维持活性的温度附近、例如在25 35°C下实施。对于pH而言,优选在本发明的核酸酶A和核酸酶B具有活性且稳定地维持活性的条件下进行,例如在7.5 9.5下进行是适当的。在上述条件下观察到充分的核酸分解的时刻结束反应,通常在I 100小时结束反应。核酸分解反应结束后,在含有核酸的试样中含有目标物质的情况下,对目标物质进行分离纯化,分别回收本发明的核酸酶A和核酸酶B。根据目标物质和含有核酸的试样的性质,可以将反应液加热至60 135°C、优选65 100°C而使酶失活或者利用降低pH(添加盐酸等酸)等适当的方法使酶失活而停止反应。作为含有核酸的试样,可以假定为含有双链DNA、单链DNA、RNA等的试样,优选为含有能够成为本发明的核酸酶A和核酸酶B中的任何一种酶的底物的双链DNA和单链DNA等DNA的试样。以下,利用实施例更详细地说明本发明,但本发明不限于这些实施例。实施例1.培养上清中存在的核酸分解酶的利用活性染色的检测通过以对质粒DNA的核酸分解活性为指标的筛选,分离出在培养上清中分泌高产核酸分解酶的深海来源的链霉菌MBE174(以下也称为MBE174)。通过SDS-PAGE和以来自于鲑鱼精的脱氧核糖核酸钠盐(西格玛奥德里奇公司制造,目录号D1626-1G)为底物的活性染色,可知本菌株在培养上清中生产的核酸分解酶为分子量约66.5kDa和在17 21kDa的低分子区域具有分布的多个蛋白质。2.MBE174的分类学位置对MBE174的16S rRNA基因序列(1483个碱基对)进行了分析,结果与秋吉链霉菌(Streptomyces akiyoshiensis)NBRC12434T (AB184095) > 产绿色链霉菌(S.viridochromogenes)NBRC3113T(AB184728)、稀奇链霉菌(S.paradoxus)NBRC14887T(AB184628)、山丘链霉菌(S.collinus)NBRC12759T(AB184123)、灰黄链霉菌(S.griseoflavus)LMG19344T(AJ781322)有99%—致。由此判断本菌株为链霉菌属细菌。种水平上的鉴定需要进一步的分类学分析。3.低分子核酸分解酶核酸酶S的纯化使用阴离子交 换(SuperQ)、羟磷灰石、阳离子交换(CM琼脂糖)、肝素亲和层析(参考图1)、凝胶过滤层析对分子量约17 21kDa的低分子核酸分解酶(命名为核酸酶S,以下省略为NucS)进行纯化。纯化的概要示于表I中。[表 I]
权利要求
1.一种链霉菌属细菌来源的细胞外分泌型核酸酶,其以双链DNA、单链DNA和RNA为底物,并且纯化后在含有ImM MgCl2和ImM CaCl2、pH为8.5的20mM Tris/HCl中在37°C下供于双链DNA30分钟时的比活性与 >'/f 一七' (注册商标)的比活性为同等程度或高于 >'/f 一七的比活性。
2.如权利要求1所述 的核酸酶,其中,利用SDS-PAGE法测定的分子量为17000 21000。
3.如权利要求1所述的核酸酶,其中,需要Mg2+或Mn2+作为二价金属离子。
4.如权利要求1所述的核酸酶,其中,链霉菌属细菌是保藏编号为FERMP-21987的链霉菌(Streptomyces sp.)MBE174。
5.—种核酸酶,其中,包含: (1)序列表的序列号I中记载的氨基酸序列、 (2)序列表的序列号I中记载的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个至数个氨基酸后得到的氨基酸序列、或 (3)与序列表的序列号I中记载的氨基酸序列具有90%以上的同源性的氨基酸序列。
6.一种链霉菌属细菌来源的细胞外分泌型核酸酶,其以双链DNA和单链DNA为底物,并且在IOOmM Na+存在下的比活性为未添加Na+时的比活性的60%以上。
7.如权利要求6所述的核酸酶,其中,利用SDS-PAGE法测定的分子量为约66500。
8.如权利要求6所述的核酸酶,其中,需要Mg2+作为二价金属离子。
9.如权利要求6所述的核酸酶,其中,链霉菌属细菌是保藏编号为FERMP-21987的链霉菌(Streptomyces sp.)MBE174。
10.一种核酸酶,其中,包含: (a)序列表的序列号2中记载的氨基酸序列、 (b)序列表的序列号2中记载的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个至数个氨基酸后得到的氨基酸序列、或 (c)与序列表的序列号2中记载的氨基酸序列具有85%以上的同源性的氨基酸序列。
11.一种粗酶,其中,含有权利要求1 5中任一项所述的核酸酶和/或权利要求6 IO中任一项所述的核酸酶作为核酸酶活性成分。
12.—种细胞外分泌型核酸酶 的制造方法,其中,包括对保藏编号为FERM P-21987的链霉菌(Streptomyces sp.)MBE174进行培养而得到至少一种细胞外分泌型核酸酶的步骤。
13.一种细胞外分泌型核酸酶或其粗酶,其通过权利要求12所述的制造方法得到。
14.链霉菌(Sti^ptomycessp.)MBE174,其保藏编号为 FERMP-21987。
15.—种分解核酸的方法,其中,包括将权利要求1 5中任一项所述的核酸酶和/或权利要求6 10中任一项所述的核酸酶供于含有核酸的试样而使所述核酸分解的步骤。
16.如权利要求15所述的方法,其中,所述核酸为DNA。
全文摘要
本发明的目的在于提供由天然的非病原性微生物分泌到细胞外且比活性比现有核酸酶的比活性高、在工业性规模的核酸分解中有用的核酸酶。上述目的通过一种链霉菌属细菌来源的细胞外分泌型核酸酶来实现,其以双链DNA、单链DNA和RNA为底物,并且纯化后在含有1mM MgCl2和1mM CaCl2、pH为8.5的20mM Tris/HCl中在37℃下供于双链DNA30分钟时的比活性与ベンゾナーゼ(注册商标)的比活性为同等程度或高于ベンゾナーゼ的比活性。
文档编号C12Q1/42GK103108950SQ20118004491
公开日2013年5月15日 申请日期2011年9月15日 优先权日2010年9月16日
发明者森梢, 大田优佳莉, 秦田勇二, 中村信之, 宫崎征行 申请人:独立行政法人海洋研究开发机构

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