抗肿瘤抗原抗体及其使用方法

xiaoxiao2020-6-24  4

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专利名称:抗肿瘤抗原抗体及其使用方法
抗肿瘤抗原抗体及其使用方法交叉引用本申请要求于2010年7月22日提交的美国临时专利申请N0.61/366,823,该申请通过引用整体并入本文。关于联邦资助研究的声明本发明是在由美国国家卫生研究院颁发的第CA058207号拨款下借助政府资助进行的。政府对本发明具有一定的权利。引言癌症转录模式的广泛研究已导致发现区分恶性与良性癌症以及区分最具侵略性的癌症与侵略性较差的癌症的分子靶标。癌症通常过表达许多蛋白质,包括某些细胞表面抗原,例如细胞表面受体。结合此类过表达的细胞表面抗原的抗体可促进此类癌症的检测和治疗。已利用许多方法来产生可用作潜在治疗剂的癌细胞表面受体的抗体。对过表达的细胞表面受体和结合它们的抗体的鉴定提供了开发癌症治疗的路径,尤其提供了具有较差预后和对传统疗法具有抗性的那些癌症亚型。CD44和EphA2是两种此类过表达的细胞表面受体,并且由转录特征识别和蛋白质组分析为人们所知,在基底乳腺癌中过表达。对在许多癌症上过表达的细胞表面受体特异的抗体已被用于开发靶向的免疫治疗剂。例如,HER2、⑶20和EGFR在许多肿瘤上过表达并且已开发识别这些受体的抗体来治疗转移性乳腺癌(曲妥珠单抗(trastuzamab))、淋巴瘤(利妥昔单抗(rituximab))和结直肠瘤(西妥昔单抗(cetuximab))。数种治疗方法(包括抗体-药物缀合物、免疫毒素和靶向核酸递送)需要不仅结合受体而且在结合时内化到细胞中的抗体。简述本文公开了结合肿瘤相关抗原CD44或肿瘤相关抗原EphA2的抗体,以及相关组合物及使用方法。使用方法包括癌症疗法、诊断和筛选方法。在某些实施方案中,抗体结合哺乳动物细胞表面抗原(例如,酵母展示的哺乳动物细胞表面抗原),在其他实施方案中,它们在与哺乳动物细胞结合后被胞吞。在一个实施方案中,提供了分离的单克隆抗体,其特异性结合被抗体F2-1A6特异性结合的CD44表位或与抗体F2-1A6竞争结合CD44。所述抗体可以当与活哺乳动物细胞的表面上的CD44结合时被胞吞(被细胞)。在一个实施方案中,所述抗体包含F2-1A6的VhCDR1、F2-1A6的Vh CDR2和F2-1A6的Vh CDR3。在另一个实施方案中,所述抗体包含F2-1A6的Vl CDRUF2-1A6的\ CDR2和F2-1A6的\ CDR3。在又一个实施方案中,所述抗体与包含F2-1A6的全长Vh和F2-1A6的全长\的抗体竞争结合CD44表位。
在另一个实施方案中,提供了分离的单克隆抗体,其特异性结合被抗体F2-1H9特异性结合的CD44表位或与抗体F2-1H9竞争结合CD44。所述抗体可以当与活哺乳动物细胞的表面上的⑶44结合时被胞吞。在一个实施方案中,所述抗体包含F2-1H9的Vh⑶R1、F2-1H9的Vh CDR2和F2-1H9的Vh CDR3。在另一个实施方案中,所述抗体包含F2-1H9的\CDR1、F2-1H9的Vl CDR2和F2-1H9的Vl CDR3。在又一个实施方案中,所述抗体包含F2-1H9的全长Vh和F2-1H9的全长
在另一个实施方案中,提供了分离的单克隆抗体,其特异性结合被选自E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、DIC5、DID1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF I 和 HH3 的抗体特异性结合的 CD44 表位;或与选自 E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HFl和HH3的抗体竞争结合CD44。在一个实施方案中,所述抗体包含:E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1 或 HH3 的Vh CDRl ;E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或 HH3 的 Vh CDR2 ;和 E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的VHCDR3。在另一个实施方案中,所述抗体包含:E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1 或 HH3 的 Vl CDRl ;E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1 或 HH3 的 \ CDR2 ;和E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、DlDl、HB8、HC2、HC4、HE3、HFl 或 HH3的Vl⑶R3。在另一个实施方案中,所述抗体包含:E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1 或 HH3 的全长 Vh ;和 E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1 或 HH3 的全长 VL。在另一个实施方案中,提供了分离的单克隆抗体,其特异性结合被抗体2D6特异性结合的EphA2表位或与抗体2D6竞争结合EphA2。所述抗体可以当与活哺乳动物细胞的表面上的EphA2结合时被胞吞。在另一个实施方案中,提供了分离的单克隆抗体,其特异性结合被抗体D2-1A7特异性结合的EphA2表位或与抗体D2-1A7竞争结合EphA2。所述抗体可以当与活哺乳动物细胞的表面上的EphA2结合时被胞吞。在另一个实施方案中,提供了分离的单克隆抗体,其特异性结合被抗体D2-1A9特异性结合的EphA2表位或与抗体D2-1A9竞争结合EphA2。所述抗体可以当与活哺乳动物细胞的表面上的EphA2结合时被胞吞。在另一方面,提供了分离的单克隆抗体,其特异性结合被抗体D2-1B1特异性结合的EphA2表位或与抗体D2-1B1竞争结合EphA2。所述抗体可以当与活哺乳动物细胞的表面上的EphA2结合时被胞吞。在另一个实施方案中,提供了分离的单克隆抗体,其特异性结合被选自A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8 和 15H11 的抗体特异性结合的 EphA2 表位或与选自 A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8和15H11的抗体竞争结合EphA2。在一个实施方案中,所述抗体包含:A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8 或 15H11 的 Vh CDRl ;A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8 或 15H11 的 Vh CDR2 ;和 A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8 或 15H11 的 Vh CDR3。在另一个实施方案中,所述抗体包含:A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8 或 15H11 的 VlCDRI ;A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8 或 15H11 的 Vl CDR2 ;和 A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7UD8 或 15H11 的 \ CDR3。在某些实施方案中,任一种前述单克隆抗体是单链Fv(scFv)、IgG、Fab、(Fabj)2或(scFv’)2。任一种所述抗体可被标记和/或与抗癌剂缀合。
在一个实施方案中,提供了包含表面和内部空间的脂类纳米粒子,所述内部空间包含抗癌剂,其中前述分离的抗体中的任一种或多种与所述脂类纳米粒子的表面连接。在一个实施方案中,当脂类纳米粒子与表达细胞表面EphA2或细胞表面CD44的细胞接触时,所述抗体与细胞表面EphA2或细胞表面CD44结合并且脂类纳米粒子被胞吞。在一个实施方案中,提供了组合物,其包含药学上可接受的载体和任何一种前述抗体或任何一种前述脂类纳米粒子。所述组合物可被配制用于胃肠外施用。可选地,所述组合物可被配制用于静脉内、鞘内或室内施用或用于增强传送的递送。在一个实施方案中,提供了包含该组合物的试剂盒。在另一个实施方案中,提供了治疗患有癌症的受试者的方法,所述方法包括向所述受试者施用一定量的任何一种前述抗体或任何一种前述脂类纳米粒子,其中所述量足以延缓癌症的发展。在一个实施方案中,所述抗体被内化到癌细胞中。在一个实施方案中,提供了检测受试者的癌细胞的方法,包括使任何一种前述抗体的抗体与疑似为癌性的所述受试者细胞接触并且检测与所述细胞结合的所述抗体。在另一个实施方案中,提供了分离的核酸,包含编码以下氨基酸序列的核苷酸序列:包含克隆F2-1A6的抗体的Vh CDR1、Vh CDR2和Vh CDR3的Vh ;包含克隆F2-1A6的抗体的 Vl CDRl、Vl CDR2 和 Vl CDR3 的 Vl ;包含克隆 F2-1H9 的抗体的 Vh CDRl、Vh CDR2 和 VhCDR3的Vh ;包含克隆F2-1H9的抗体的Vl CDRl、Vl CDR2和VLCDR3的Vl ;包含选自E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、DlDl、HB8、HC2、HC4、HE3、HFl 和 HH3 的抗体的 Vh CDRUVh 0 2和¥11 CDR3 的 Vh ;或包含选自 E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、DlDl、HB8、HC2、HC4、HE3、HFl 和 HH3 的抗体的 Vl CDRl、Vl CDR2 和 VLCDR3 的\。在一个实施方案中,所述核酸包含编码以下氨基酸序列的核苷酸序列:包含克隆F2-1A6的抗体的Vh CDRl、Vh CDR2和Vh CDR3的Vh和包含克隆F2-1A6的抗体的Vl CDRl、Vl CDR2和Vl CDR3的Vl ;包含克隆F2-1H9的抗体的Vh CDRl、Vh CDR2和Vh CDR3的Vh和包含克隆F2-1H9 的抗体的 Vl CDRUVl CDR2 和 VLCDR3 的 Vl ;或包含选自 E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1 C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1 和 HH3 的抗体的 Vh CDRUVh CDR2 和Vh CDR3 的 Vh 和包含选自 E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、DlDU HB8、HC2、HC4、HE3、HFl 和 HH3 的抗体的 \CDR1、\CDR2 和 \CDR3 的 \。在另一个实施方案中,提供了分离的核酸,其包含编码以下氨基酸序列的核苷酸序列:包含克隆2D6的抗体的Vh CDRl、Vh CDR2和Vh CDR3的Vh、包含克隆2D6的抗体的\CDRl、Vl CDR2 和 Vl CDR3 的包含克隆 D2-1A7 的抗体的 Vh CDRl、Vh CDR2 和 Vh CDR3 的VH、包含克隆D2-1A7的抗体的Vl CDR1、Vl CDR2和Vl CDR3的Vl、包含克隆D2-1A9的抗体的Vh CDRl、Vh CDR2 和 Vh CDR3 的 Vh、包含克隆 D2-1A9 的抗体的 Vl CDRl、Vl CDR2 和 Vl CDR3的Vl、包含克隆D2-1B1的抗体的Vh CDRl、Vh CDR2和Vh CDR3的Vh、包含克隆D2-1B1的抗体的 Vl CDRl、Vl CDR2 和 VLCDR3 的 Vl ;包含选自 A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8 和 15H11 的抗体的 Vh CDRl、Vh CDR2 和 Vh CDR3 的 Vh ;包含选自 A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8 和 15H11 的抗体的Vl CDRUVl CDR2和Vl CDR3的Vl ;或分离的核酸,其包含编码I)和2) ;3)和4) ;5)和6);7)和8);或9)和10)的氨基酸序列的核苷酸序列。在一个实施方案中,提供了表达载体,其包含任一种前述核酸。在另一个实施方案中,提供了重组宿主细胞(“基因修饰的宿主细胞”),其包含所述载体。在一个实施方案中,该细胞表达抗_EphA2抗体或抗-⑶44抗体。附图简述

图1.抗原结构域在酵母表面上的展示。图A,受体EphA2的胞外结构域(E⑶)在酵母表面上展示并且被抗-EphA2抗体和重组小鼠肝配蛋白A1(R&D, Minneapolis)识别,如通过流式细胞术分析来测定。图B,CD44的连接结构域(结构域1,或Dl)在酵母表面上展示并且被抗-CD44兔单克隆抗体识别,如通过流式细胞术分析来测定。两种抗_EphA2和抗-CD44抗体不识别在酵母表面上展示的无关蛋白。图2.噬菌体抗体从酵母展示的抗原中的回收率。图A,已知结合EphA2(2D6)的噬菌体抗体从展示EphA2ECD的酵母(Y-Ep hA2)中的回收率与从展示无关蛋白的酵母(Y-CON)中的回收率的比较。用酵母展示的抗原中的每一种孵育总计IO11个抗-EphA2噬菌体抗体2D6。图B,洗脱缓冲液对从展示EphA2ECD的酵母的表面洗脱的EphA2噬菌体抗体的效价的影响。在洗脱之前用酵母展示的抗原蛋白质中的每一种孵育总计IO11个抗-EphA2噬菌体抗体2D6。图C,输入噬菌体效价对洗脱的噬菌体效价的影响。用酵母展示的EphA2ECD或无关酵母展示的蛋白质孵育指示效价的抗_EphA2噬菌体抗体2D6并且测定洗脱的噬菌体的效价。图3.选择内化抗原特异性噬菌体抗体的策略。图A,在基底乳腺癌细胞系MDAMB231上的内化的两轮选择后,用无关对照酵母第一次孵育噬菌体抗体库以除去任何酵母结合抗体,然后对展示EphA2ECD或CD44结构域I的酵母进行淘选。图B,通过使用流式细胞术来测量2轮淘选后多克隆噬菌体抗体库与EphA2ECD或CD44结构域I的结合信号。用未选择的噬菌体抗体文库(RO)、第I轮(Rl)和第2轮(R2)多克隆噬菌体染色无关对照酵母。图C,对酵母展示的抗原的I轮和2轮选择后抗原特异性噬菌体抗体的频率。通过分析96个随机挑选的与酵母展示的抗原结合的噬菌体抗体用流式细胞术来测定结合频率。用未选择的噬菌体文库(RO)以及分别来自Rl和R2的多克隆噬菌体染色所诱导的展示无关蛋白、EphA2-ECD或CD44结构域I的酵母细胞。未诱导的酵母细胞(仅酵母)、无关噬菌体抗体(噬菌体对照)和未选择的噬菌体抗体文库用作对照。图4.来自酵母抗原生物淘选的单克隆噬菌体抗体的结合特异性。图A,通过流式细胞术测定的单克隆噬菌体抗体与酵母展示的抗原结构域的结合。用从Y_EphA2和Y-CD44D1选择分离的单克隆噬菌体抗体染色所诱导的展示无关蛋白(Y-C0N)、EphA2-ECD(Y-EphA2ECD)、CD44 连接结构域(Y-CD44ECD Dl)和 CD44 全长 ECD (Y-CD44ECD)的酵母细胞。图B显示通过流式细胞术测定的单克隆噬菌体抗体与MDAMB231细胞的结合。图C显示单克隆噬菌体抗体与包括鲁米那乳腺癌细胞系SUM52PE和MCF7的乳腺癌细胞系,以及基底乳腺癌细胞系MDAMB231的差异结合。图5.通过蛋白质印迹和流式细胞术对scFv抗体的表征。图A,使用抗-EphA2scFv2D6或D2-1A7和抗_CD44scFv F2-1A6来免疫沉淀来自MDAMB231细胞的其革巴抗原。通过蛋白质印迹使用抗-EphA2抗体D7 (Upstate Biotech,Billerica)或抗-0)44抗体 Ab-4 (NeoMarkers,Fremont)来检测抗原。图 B,EphA2 抗体 D2-1A7、D2-1A9 和 2D6 与肝配蛋白Al竞争结合MDAMB231细胞。通过流式细胞术来测定噬菌体抗体D2_1A7、D2_1A9和2D6在递增浓度的EphA2配体肝配蛋白Al的存在下与MDAMB231细胞结合的能力。
图6.对EphA2和⑶44特异的噬菌体抗体被MDAMB231细胞胞吞。在37 °C用无关噬菌体(图A)、抗-EphA2噬菌体D2-1A7 (图B)和D2-1A9 (图C)、抗-CD44噬菌体F2-1A6 (图D和E)孵育经培养的细胞3小时,然后甘氨酸缓冲液洗涤。通过用抗_fd抗体检测胞内噬菌体、并且通过共焦显微镜分析来测定胞吞作用。图7.对来自各种克隆的⑶44特异的抗体的全长Vh和\的氨基酸序列。也指示框架和互补决定区。SEQ ID NO是指全长可变区。图8.对来自各种克隆的EphA2特异的抗体的全长Vh和\的氨基酸序列。也指示框架和互补决定区。SEQ ID NO是指全长可变区。图9A和9B.来自克隆2D6的全长抗体的氨基酸序列和编码核酸序列。图1OA和10B.来自克隆D2-1A7的全长scFv抗体的氨基酸序列和编码核酸序列。图1IA和11B.来自克隆D2-1A9的全长scFv抗体的氨基酸序列和编码核酸序列。图12A和12B.来自克隆D2-1B1的全长scFv抗体的氨基酸序列和编码核酸序列。图13A和13B.来自克隆F2-1A6的全长scFv抗体的氨基酸序列和编码核酸序列。图14A和14B.来自克隆F2-1H9的全长scFv抗体的氨基酸序列和编码核酸序列。图15A和15B.来自克隆E8H11的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:19)和编码核酸(SEQ ID NO:20)序列。图16A和16B.来自克隆E8H7的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:58)和编码核酸(SEQ ID NO:59)序列。

图17A和17B.来自克隆E8G12的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:60)和编码核酸(SEQ ID NO:61)序列。图18A和18B.来自克隆E8F11的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:63)和编码核酸(SEQ ID NO:64)序列。图19A和19B.来自克隆E8C9的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:72)和编码核酸(SEQ ID NO:73)序列。图20A和20B.来自克隆D6G9的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:85)和编码核酸(SEQ ID NO:86)序列。图21A和21B.来自克隆D6D3的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:127)和编码核酸(SEQ ID NO:128)序列。图22A和22B.来自克隆A3H9的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO: 129)和编码核酸(SEQ ID NO:130)序列。图23A和23B.来自克隆A3G3的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO: 138)和编码核酸(SEQ ID NO:139)序列。图24A和24B.来自克隆A3D10的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO: 140)和编码核酸(SEQ ID NO:141)序列。图25A和25B.来自克隆A3D1的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:310)和编码核酸(SEQ ID NO:311)序列。图26A和26B.来自克隆A3C8的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:312)和编码核酸(SEQ ID NO:313)序列。图27A和27B.来自克隆1A3的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:314)和编码核酸(SEQ ID NO:315)序列。图28A和28B.来自克隆1A5的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:316)和编码核酸(SEQ ID NO:317)序列。图29A和29B.来自克隆1A8的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:318)和编码核酸(SEQ ID NO:319)序列。图30A和30B.来自克隆1A12的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:320)和编码核酸(SEQ ID NO:321)序列。图31A和31B.来自克隆1B2的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:322)和编码核酸(SEQ ID NO:323)序列。图32A和32B.来自克隆1C2的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:324)和编码核酸(SEQ ID NO:325)序列。图33A和33B.来自克隆1C7的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:326)和编码核酸(SEQ ID NO:327)序列。图34A和34B.来自克隆1D8的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:328)和编码核酸(SEQ ID NO:329)序列。图35A和35B.来自克隆15H11的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:330)和编码核酸(SEQ ID NO:331)序列。图36A和36B.来自克隆D1C5的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:332)和编码核酸(SEQ ID NO:333)序列。图37A和37B.来自克隆DlDl的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:334)和编码核酸(SEQ ID NO:335)序列。图38A和38B.来自克隆H1B8 (在本文也称为“HB8”)的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:336)和编码核酸(SEQ ID NO:337)序列。图39A和39B.来自克隆H1C2 (在本文也称为“HC2”)的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:338)和编码核酸(SEQ ID NO:339)序列。图40A和40B.来自克隆H1C4 (在本文也称为“HC4” )的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:340)和编码核酸(SEQ ID NO:341)序列。图41A和41B.来自克隆H1E3 (在本文也称为“HE3”)的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:342)和编码核酸(SEQ ID NO:343)序列。图42A和42B.来自克隆HlFl (在本文也称为“HF1 ” )的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:344)和编码核酸(SEQ ID NO:345)序列。图43A和43B.来自克隆H1H3 (在本文也称为“HH3”)的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:346)和编码核酸(SEQ ID NO:347)序列。图44.对来自各种克隆的⑶44特异的抗体的全长Vh和\的氨基酸序列。也指示框架和互补决定区。SEQ ID NO是指全长可变区。提供E8H11(SEQ ID NO:348) ;E8H7 (SEQID NO:349) ;E8G12(SEQ ID NO:350) ;E8F11(SEQ ID NO:351) ;E8C9(SEQ ID NO:352);D6G9 (SEQ ID NO:353) #PD6D3(SEQ ID NO:354)的 Vh 序列。提供 E8H11 (SEQ ID NO:355);E8H7(SEQ ID NO:356) ;E8G12(SEQ I D NO:357) ;E8F11(SEQ ID NO:358) ;E8C9(SEQ ID NO:359) ;D6G9 (SEQ ID NO:360) JPD6D3(SEQ ID NO:361)的 Vl 序列。
图45A和45B.对来自各种克隆的⑶44特异的抗体的全长Vh和'的氨基酸序列。也指示框架和互补决定区。SEQ ID NO是指全长可变区。提供D1C5(SEQ ID NO:362);DlDl (SEQ ID NO:363) ;HB8(SEQ ID NO:364) ;HC2(SEQ ID NO:365) ;HC4(SEQ ID NO:366) ;HE3 (SEQ ID NO:367) ; HF I (SEQ ID NO:368) jPHH3(SEQ ID NO:369)的 Vh 序列。提供 D1C5(SEQ ID NO:370) ;D1D1(SEQ ID NO:371) ;HB8(SEQ ID NO:372) ;HC2(SEQ ID NO:373) ;HC4(SEQ ID NO:374) ;HE3 (SEQ ID NO:375) ; HF I (SEQ ID NO:376) JPHH3(SEQ IDNO:377)的 Vl 序列。图46.对来自各种克隆的EphA2特异的抗体的全长Vh和\的氨基酸序列。也指示框架和互补决定区。SEQ ID NO是指全长可变区。提供A3H9(SEQ ID NO:378) ;A3G3 (SEQID NO:379) ;A3D10(SEQ ID NO:380) ;A3D1 (SEQ ID NO:381) #PA3C8(SEQ ID NO:382)的 Vh 序列。提供 A3H9(SEQ ID NO:383) ;A3G3 (SEQ ID NO:384) ;A3D10(SEQ ID NO:385);A3D1 (SEQ ID NO:386) JPA3C8(SEQ ID NO:387)的 Vl 序列。图47.对来自各种克隆的EphA2特异的抗体的全长Vh和\的氨基酸序列。也指示框架和互补决定区。SEQ ID NO是指全长可变区。提供1A3(SEQ ID NO:388) ;1A5(SEQID NO:389) ; 1A8(SEQ ID NO:390) ;1A12(SEQ ID NO:391) ;1B2(SEQ ID NO:392) ;1C2(SEQID NO:393) ;1C7(SEQ ID NO:394);和 1D8 (SEQ ID NO:395)的 Vh 序列。提供 1A3 (SEQ IDNO:396) ; 1A5(SEQ ID NO:397) ; 1A8(SEQ ID NO:398) ;1A12(SEQ ID NO:399) ;1B2(SEQ IDNO:400) ;1C2(SEQ ID NO:401) ;1C7(SEQ ID NO:402) JP1D8(SEQ ID NO:403)的Vl序列。定义下列缩写可在 本文使用:⑶R,互补决定区;Fab,具有可变结构域和第一恒定结构域的免疫球蛋白的抗原结合片段;FACS,荧光活化细胞分选;IgG,免疫球蛋白G ;KD,解离平衡常数,缔合速率常数,解离速率常数;mAb,单克隆抗体;MFI,平均荧光强度;PBS,磷酸盐缓冲盐水;PCR,聚合酶链反应;SCFv,单链形式的抗体可变区;VH,重链可变区;',轻链可变区;TAA,肿瘤相关抗原;EGFR,表皮生长因子受体;ECD,胞外结构域;IMAC,固定化金属亲和色谱;IL,免疫脂质体;IPTG,异丙基-β -D-硫代半乳糖吡喃糖苷;2-ΜΕΑ,2-巯基乙胺;DTT,二硫苏糖醇;TEA,三乙胺;TBS-T,Tris-缓冲盐水Tween-20 ;Ni_NTA,镍-次氮基三乙酸;PE,藻红蛋白;HMEC,人乳腺上皮细胞,如本文所用的,“EphA2”是指可结合肝配蛋白A配体的受体酪氨酸激酶家族的成员,并且也可被称为“上皮细胞激酶(ECK)”。术语“EphA2”可以是指任何天然存在同种型的EphA2。EphA2的氨基酸序列是已知的并且可以作为GenBank登录号NP_004422.2被发现。如本文所用的,“⑶44”是指透明质酸(HA)的受体,并且也可以被称为“吞噬细胞糖蛋白I”、“透明质酸盐受体”或“⑶44抗原”。例如,术语“⑶44”可以是指任何一种天然存在同种型的⑶44。⑶44的氨基酸序列是已知的并且最长同种型的⑶44可以作为GenBank登录号NP_000601.3被发现。术语“多肽”、“肽”或“蛋白”可在本文交换地使用,指通过相邻残基的α -氨基和羧基之间的肽键彼此连接到一起的一系列线性氨基酸残基。此外,除了 20个“标准”遗传上可编码的氨基酸之外,氨基酸还包括氨基酸类似物。而且,应当指出,在氨基酸残基序列的开始或结束处的破折号,表示与一个或多个氨基酸残基的另一序列的肽键,或与羧基或羟基末端基团的共价键。然而,缺少破折号不应是指羧基或羟基末端基团的此类肽键或共价键不存在,因为表示氨基酸序列时省略破折号是约定俗成的。“抗体”涵盖组合物,其包含单独或作为包含其多个的制备物的抗原-结合蛋白,具有一种或多种可以由免疫球蛋白基因、或免疫球蛋白基因的片段遗传上编码或包含获自或源自免疫球蛋白的CDR并且结合目标抗原的多肽。轻链被分为K或λ。重链可被分为Υ、μ、α、δ或ε,其分别定义免疫球蛋白类别,IgG, IgM, IgA、IgD和IgE0抗体的实例是具有由两对多肽链(每对多肽链具有一条“轻”链和一条“重”链)组成的四聚体的结构单元的抗体。每条链的N-端部分定义介导抗原结合的可变区。术语可变轻链和可变重链(Vh)分别是指轻链和重链。“抗体”还涵盖含有连接在一起作为单一多肽的重链和轻链的单链抗体,尽管如此这种连接的重链或轻链中的每条在本文被称为重链或轻链。抗体还可以是指仅有重链的抗体例如重链抗体或HCAb。如上所述,“抗体”涵盖完整的免疫球蛋白以及抗体的抗原-结合片段。因此,本文所用的术语“抗体”还包括抗体的抗原结合部分,其可通过全抗体的修饰来制备或重新使用重组DNA方法来合成。实例包括但不限于Fab’、Fab' 2、scFv、纳米抗体、单抗体(unibody)和双链抗体。“纳米抗体”是指单链抗体的最小抗原-结合片段,也被称为VhH或单结构域抗体(dAb)。“单克隆抗体”是指包含一个或多个抗体的组合物,所述抗体获自大体上均质的抗体的群体,即,除可以以少量存在的任何天然存在的突变之外其单独抗体是相同的群体。单克隆抗体针对单一抗原位 点并且一般针对抗原上的单一表位是高度特异性的。修饰词“单克隆”是指获自大体上均质的抗体群体的抗体的字符,并且不要求抗体由任何特定方法产生或为组合物中的唯一抗体。单链Fv( “scFv”)多肽是共价连接的VH:异二聚体,其可由包括直接连结或通过肽-编码连接体连结的Vh-和编码序列的核酸表达(Huston,等人(1988) Proc.Nat.Acad.Sc1.USA, 85:5879-5883)。许多结构可用于将来自抗体V区的多肽轻链和重链转化成scFv分子,scFv分子将折叠成大体上类似于抗原-结合位点的结构的三维结构。除为双链抗体外,scFvs还可以三链抗体或四链抗体存在。应当指出,尽管各种抗体片段根据完整抗体的消化来定义,但是本领域技术人员将理解此类片段可用化学方法或通过利用重组DNA方法来重新合成。术语“抗体”涵盖多克隆和单克隆抗体,并且进一步涵盖任何类别(例如,IgM.1gG及其子类)的抗体。“抗体”还涵盖杂交抗体、双特异性抗体、异种抗体、嵌合抗体、人源化抗体和其保留抗原结合的功能片段。“双特异性抗体”可类似单一抗体(或抗体片段)但具有两个不同的抗原结合位点(可变区)。异种抗体是指两个或更多个连接在一起的抗体或抗体结合片段(例如,Fab),每个抗体或片段具有不同的特异性。抗体可与其它部分缀合,和/或可结合至支架(例如,固体支架)例如聚苯乙烯板或珠、测试条等。免疫球蛋白轻链或重链可变区由被三个高可变区(也称为“互补决定区”或“CDR”)截断的“框架”区(FR)组成。框架区和CDR的范围可基于本领域已知的数据库被定义。参见,例如,“Sequences of Proteins of Immunological Interest,,E.Kabat 等人,Sequences of proteins of immunological interest,第 4 版 U.S.Dept.Health andHuman Services, Public Health Services, Bethesda, MD(1987), Lefranc 等人 IMGT,the international ImMunoGeneTics information system .Nuc1.Acids Res., 2005, 33:D593-D597 (WWW.1mgt.0rg/textes/IMGTScientif icChart/)和 / 或在 vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/的V Base)。不同轻链或重链的框架区的序列在物种内相对保守。抗体的框架区(其为组成型轻链和重链的组合框架区)用于定位并对齐⑶R。⑶R主要负责与抗原的表位结合。除非另有指示,否则由本公开提供的所有CDR和框架根据Kabat等人(同上)来定义。“抗-EphA2抗体”或"抗-⑶44抗体"是指优选以高亲和性与EphA2或⑶44特异性结合的抗体。对EphA2或⑶44特异的抗体未显示相对于EphA2或⑶44的结合,与EphA2或CD44无关的其他抗原相当的结合。术语“高亲和性”当针对抗体使用时是指特异性结合(“识别”)其靶的亲和性(Kd)值小于或等于10_6M、小于ιο 、小于10_8M、优选小于10_9M、小于ΙΟ,Μ或小于1(ΓηΜ的抗体。较低Kd值对应于较高的结合亲和性(B卩,较强的结合)以使10_7的Kd值指示比10_6的Kd值高的结合亲和性。“抗原-结合位点”或“结合部分”是指参与免疫反应性抗原结合的抗体分子的部分(例如免疫球蛋白分子或scFv的片段)。抗原结合位点通过重(“H”)链和/或轻(“L”)链的N-端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。重链和轻链的V区内的三个高度发散的延伸部分被称为“高可变区”,其插入在称为“框架区”或“FR”的更保守侧翼延伸部分之间。因此,术语“FR”是指免疫球蛋白中天然存在于高可变区之间和与高可变区相邻的氨基酸序列。在三聚体抗体分子中,轻链的三个高可变区和重链的三个高可变区在三维空间中相对于彼此布置以形成抗原结合“表面”。 该表面介导靶抗原的识别和结合。重链和/或轻链中的每个链的三个高可变区被称为“互补决定区”或“⑶R”并且例如基于Kabat等人(同上)来测定。" F2-1A6抗体”是指由克隆F2-1A6表达的抗体或以其它方式合成但是具有与由克隆F2-1A6表达的抗体相同的CDR并且任选地具有相同的框架区,并且具有大体上相同的抗原结合特异性的抗体。类似地,抗体2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、F2-1H9等(例如,抗体E8H11、E8H7、E8G12、E8F11 和 E8C9 ;抗体 D6G9 和 D6D3 ;抗体 D1C5 和 DlDl ;抗体 HB8、HC2、HC4、HE3、HF1 和 HH3 ;抗体 A3H9、A3G3、A3D10、A3D1 和 A3C8 ;抗体 1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7和1D8 ;以及抗体15H11)是指由相应克隆表达的抗体和/或以其它方式合成但是具有与参考抗体相同的CDR并且任选地具有相同的框架区,并且具有大体上相同的抗原结合特异性的抗体。这些抗体的⑶R通过Kabat等人(同上)来定义,如图7、8和44-47以及下表所示。“表位”是抗体所结合的抗原上的位点(例如EphA2胞外结构域(EOT)上的位点)。表位可以由连续氨基酸或通过蛋白的折叠(例如,三级折叠)而并置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位暴露于变性溶剂后通常仍保持,然而通过折叠形成的表位用变性溶剂的处理后通常丧失。在线性或空间构象中,表位通常包括至少3个、更通常至少5或8-10个氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括,例如,X-射线结晶学和2维核磁共振。参见,例如,Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,Vol.66,GlennE.Morris编辑(1996)。数个商业实验室提供表位作图服务。通过与膜相关抗原具有免疫反应性的抗体结合的表位可位于细胞的表面(例如跨膜蛋白的胞外区中),以使此类表位被认为是细胞表面可及的,溶剂可及的和/或细胞表面暴露的。“分离的”是指在与实体可天然出现的环境不同的环境中的目标实体(例如蛋白,如抗体)。“分离的”实体从本质上伴随其的所有或一些组分分离并且可以是大体上富集的。“分离的”也是指从在生成(例如,化学合成、重组表达、培养基等)过程中伴随其的所有或一些组分分离的实体的状态。主题抗体可以是大体上纯的。“大体上纯的”可以是指其中至少75 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少98 %、至少99 %或多于99 %的总组合物是目标实体(例如,主题抗体)的组合物。当提及抗体时,短语“特异性结合”、“对...特异”、“免疫反应性”和“免疫反应性”和“抗原结合特异性”是指与抗原的结合反应,其对抗原或其片段具有高优先性,以使在抗原的异质群体(例如,蛋白和群体生物制品,例如在组织中)存在下确定抗原的存在。因此,在特定的免疫测定条件下,指定的抗体与特定抗原结合并且不以显著量与存在于样品中的其他抗原结合。在此类条件下与抗原的特异性结合可需要因其对特定抗原的特异性而被选择的抗体。例如,抗-CD44抗体可以与CD44特异性结合,并且不展示与存在于组织样品中的其他蛋白相当的结合(例如,不展示可检测的结合)。参见Harlow和Lane (1988)Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York,用于描述可用于确定特异性免疫反应性的免疫测定形式和条件。详述本文公开了与肿瘤相关抗原CD44特异性结合的抗体和与肿瘤相关抗原EphA2特异性结合的抗体,以及相关组合物及使用方法。使用方法包括癌症治疗、诊断和筛选方法。当抗体对CD44特异时,抗体含有克隆?2-认6、?2-1!1948!11148!174861248卩11、E8C9、D6G9、D6D3、DIC5、DID1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF I 或 HH3 (例如,通过其表达而获得)的抗体的Vh的至少一个、两个或所有三个⑶R。抗体还涵盖含有克隆F2-1A6、F2-1H9、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、 E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、DlDl、HB8、HC2、HC4、HE3、HFl 或 HH3 的抗体的\的至少一个、两个或所有三个⑶R的抗体。抗体还涵盖含有独立地选自克隆F2-1A6、F2-1H9、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的抗体的'和Vh中的每个的至少一个、两个或所有三个⑶R的抗体。可选地,抗体与克隆 F2-1A6、F2-1H9、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HFl或HH3的抗体(例如,结合与其相同的表位)竞争结合⑶44。当抗体对EphA2 特异时,抗体含有克隆 2D6、D2_1A7、D2-1A9、D2_1B1、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8 或 15H11 的抗体的至少一个、两个或所有三个重链(Vh)互补决定区(⑶R)。抗体还涵盖含有克隆2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8 或 15H11 的抗体的至少一个、两个或所有三个轻链(V互补决定区(OTR)的抗体。抗体还涵盖含有独立地选自克隆 2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的抗体的Vl和Vh中的每个的至少一个、两个或所有三个CDR 的抗体。可选地,抗体与克隆 2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的抗体(例如,结合与其相同的表位)竞争结合EphA2。
本公开的抗体也可以含有克隆F2-1A6、F2_1H9、2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、DlDl、HB8、HC2、HC4、HE3、HFl、HH3、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8 或 15H11 的抗体的所有乂11 CDR 和 / 或 Vl CDR。抗体可以含有克隆 F2-1A6、F2-1H9、2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、DlDl、HB8、HC2、HC4、HE3、HFl、HH3、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8 或 15H11 的抗体的全长Vh链。抗体也可以或可选地含有克隆F2-1A6、F2-1H9、2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、DlDl、HB8、HC2、HC4、HE3、HFl、HH3、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8 或 15H11 的抗体的全长Vl链。抗体可以是全长抗体(即,包含至少一个全长Vh序列和至少一个全长'序列的抗体)或片段例如单链Fv(scFv )、Fab、(Fab’)2、(ScFv)2等。抗体可以是IgG(例如,IgG2)或任何其他同种型,或可以是双特异性抗体。抗体可以例如与抗癌药物、标记、或与改善或提升血清半衰期(例如聚(乙二醇)(PEG))、胞吞、或另一种生物功能或特征的部分缀合。抗体也可以在包含药学上可接受的赋形剂的组合物中,例如,适用于注射的组合物(例如,在单位剂量制剂中)。本公开还提供包括一个或多个抗体的组合物,所述抗体选自本文所述的抗体和/或包含一个或多个来自这些抗体的CDR的抗体,和/或包含这些抗体的突变体或衍生物的一个或多个抗体。组合物可以包括一种或多种抗体,例如 F2-1A6、F2-1H9、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1、HH3、2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8 或 15H11。本公开的方法包括提供以有效治疗患有表达由一个或多个主题抗体特异性结合的抗原的癌症的受试者的量施用一个或多个本文公开的主题抗体的方法。由本公开提供的抗体也可以用于诊断/预后癌症或使癌症成像。本文提供的核酸编码本文描述的一个或多个抗体。本文还提供含有此类核酸的宿主细胞,以及生成主题抗体(例如通过分泌)的宿主细胞。还提供用于制备含有主题抗体的组合物或用于进行主题方法的试剂盒。优选的抗体对肿瘤相关抗原(TAA)、EphA2或⑶44中的一个或多个具有高亲和性(例如,显示IO-7M或更低的Kd值),在至少一些部分的细胞周期中细胞表面暴露于癌细胞上。还设想对EphA2或⑶44具有较低亲和性(例如,具有10_5M至10_6M的Kd值)的抗体。癌细胞例如包括源自乳腺癌细胞(例如MDAMB231)等等的癌细胞。主题抗体包括在与抗原例如活哺乳动物细胞的表面上的抗原结合时,例如通过胞吞、例如受体介导的胞吞内化到细胞中的那些。主题抗体包括与克隆F2-1A6、F2-1H9、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的抗体竞争性结合CD44表位的那些。抗体还涵盖与克隆 2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的抗体竞争性结合EphA2上的表位的抗体。特定抗体识别与另一抗体相同的表位的能力可通过一个抗体竞争性抑制第二抗体(例如,竞争性结合)与抗原的结合来测定(例如,通过竞争性结合测定例如美国专利公布N0.20090291085中公开的那些来测定)。结合的竞争性抑制也可以被称为抗体的交叉反应性。许多竞争性结合测定的任一种可用于测量两个抗体对相同抗原的竞争。例如,夹心ELISA测定可以用于该目的。交叉反应性的测定方法为本领域技术人员所熟知(参见,例如,Dowbenko 等人(1988) J.Virol.62:4703-4711)。如果在第一抗体存在下第二抗体与抗原的结合减少至少30%、通常至少约40%、50%、60%或75%、常常至少约90% (使用任一种用于评估竞争性结合的测定),则抗体被认为竞争性抑制第二抗体与抗原的结合。这可以通过提供连接至固体支架的一个或多个分离的靶TAA、EphA2和/或⑶44并且测定抗体结合靶TAA或与 ·本文所述的抗体竞争结合靶TAA的能力(例如使用表面等离子体共振)来确定。如上所述,主题抗体涵盖与下列抗体中的一种或多种竞争的那些:2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、F2-1A6、F2-1H9、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1、HH3、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8和15H11。此外,抗体对EphA2或⑶44可以具有结合亲和性,与约1χ10_6Μ相当或大于约1x10_6M(即,抗体可显示低于10_6M,例如约10_7M、10_8M、10_9M、KTkiM的Kd值或甚至更高的结合亲和性例如约10_nM或10_12M的Kd值)。在相关实施方案中,主题抗体涵盖结合与F2-1A6或F2-1H9相同的表位,或结合2D6、D2-1A7、D2-1A9 或 D2-1B1 的表位,或结合 E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、DlDl、HB8、HC2、HC4、HE3、HFl 或 HH3 的表位,或结合 A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的表位的那些。表位作图可使用导致接近饱和及至少100相对单位(RU)的所结合抗体的浓度的抗体对来执行。测定一对中每个成员的所结合抗体的量,然后将两个抗体混合在一起以得到等于用于测量各个抗体的浓度的最终浓度。识别不同表位的抗体显示一起注入时所结合的RU的实质累积增加,尽管识别相同表位的抗体仅显示RU的最小增加。据信抗体可以是交叉反应性的,如果当一起“注入”时它们显示实质累积增加(例如增加至少约1.4倍、增加至少约1.6倍、或增加至少约1.8或2倍)。抗体的表位也可通过许多其它标准技术(参见,例如,Geysen等人(1987)J.1mmunol.Meth 102 =259-2 74)来测定。该技术包括大量EphA2或CD44的重叠肽的合成。然后针对一个或多个原型抗体(例如,2D6等)筛选合成肽并且由这些抗体特异性结合的特征表位可以通过结合特异性和亲和性来鉴定。由此得以鉴定的表位可适宜地用于本文所述的竞争性测定以鉴定交叉反应抗体。用于表位作图的肽可适宜地使用“Multipin”肽合成技术来制备(参见,例如,Geysen 等人(1987) Science 235:1184-1190)。使用一个或多个 EphA2 和 / 或 CD44 的已知序列,重叠多肽序列可在一个或多个96-孔显微检验板的阵列中的胶针上以相继方式逐一合成。杭-CD44本公开的抗体包括特异性结合⑶44的抗体。抗-⑶44抗体涵盖与F2-1A6、F2-1H9、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1 或 HH3 竞争性结合CD44的表位(例如在结构域I中)的那些。由抗-CD44抗体结合的表位存在于来自残基位置21-169的⑶44的连续氨基酸序列,如下所列出。QIDLNITCRFAGVFHVEKNGRYSISRTEAADLCKAFNSTLPTMAQMFKALSIGFETCRYGFIEGHVVIPRIHPNSICAANNTGVYILTSNTSQYDTYCFNASAPPEEDCTSVTDLPNAFDGPITIIIVNRDGTRYVQKGEYRTNPEDIY(SEQ ID NO:1)CD44的残基位置数基于GenBank登录号NP_000601.3或UniProt登录号P16070中列出的序列来测定。共享与⑶44类似的表位的抗原也可以是主题抗体的结合靶。当与⑶44结合时,主题抗体可以被表达CD44蛋白的细胞内化。抗-CD44抗体对其具有亲和性的表位在很多癌细胞上,特别在细胞质膜上是细胞表面暴露的并且溶剂可及的。当细胞活着时,表位对于主题抗体可以是可及的。例如,表位可以在源自乳腺癌、结肠癌、腺癌、头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、前列腺癌、胰腺癌等的癌细胞上存在。抗-CD44抗体对其具有亲和性的癌细胞也可以来自任何转移性癌症和/或具有转移潜力。主题抗体的附加实例涵盖具有相同结合特异性并且包含至少两个⑶R的那些,每个CDR各自独立地与图7、44和45 (45A和45B)和下表中所示的抗体的Vh CDR(例如F2-1A6、F2-1H9、E8H11、E8H7、E8G12、E8F1 1、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的Vh⑶Rl)的氨基酸序列共有至少约80%、至少约87%、至少约93%、至少约94%或最高100%氨基酸序列同一性。主题抗体还可包括来自图7、44和45中所示的每个抗体的任何Vh⑶R的所有三个⑶R,以使主题抗体中的每AVh⑶R选自图7、44和45或下表(例如,表I)中所示的单一抗体并且每个Vh CDR独立地与图7、44或45或下表(例如,表I)中所示的抗体的Vh CDR的氨基酸序列共有至少约80%、至少约87%、至少约93%、至少约94%或最高100%氨基酸序列同一性。例如,主题抗体的重链可含有F2-1A6的两个Vh⑶R或所有三个Vh⑶R。可选地,重链可含有F2-1H9的两个Vh⑶R或所有三个Vh⑶R。作为进一步的实例,主题抗体的重链可含有任何一种E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1 和 HH3 的两个 Vh CDR 或所有三个 Vh CDR。同样对于轻链,主题抗体将具有相同结合特异性并且可含有至少两个⑶R,每个CDR各自独立地与图7、44和45(45A和45B)或下表中所示的每个抗体的Vl CDR(例如F2-1A6 的 Vl CDRl ;例如,E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、DlDU HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的\ CDR1)的氨基酸序列具有至少约80%、至少约87%、至少约93%、至少约94%或最高100%氨基酸序列同一性。主题抗体也可以或可选地包括来自图7、44和45或下表(例如,表2)中所示的任一种抗体的所有三个\⑶R并且每个' ⑶R独立地与图7、44或45或下表中所示的抗体的\⑶R的氨基酸序列共有至少约80%、至少约87%、至少约93%、至少约94%或最高100%氨基酸序列同一性。例如,主题抗体的轻链可含有F2-1A6的两个Vl⑶R或所有三个Vl⑶R。可选地,轻链可含有F2-1H9的两个Vl⑶R或所有三个' CDR。作为进一步的实例,主题抗体的轻链可含有E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1 或 HH3 的两个' CDR 或所有三个'CDR。任选地,抗体可含有与图7、44和45或下表(例如,下表I和2)中提供的重链或轻链的任一种相应框架序列相同(即100%同一性)、类似或不同的框架序列(FR),只要大体上维持结合特异性。在框架序列类似时,框架可以与图7、44和45或下表(例如,下表I和2)中所示的任一种抗体的相应框架序列具有至少约85%、至少约86%、至少约90%、至少约93%、至少约96%、至少约98%或最高100%同一性。本公开的抗体因此可含有与图7、44或45或下表中所示的全长Vh或\序列具有至少80%同一性、至少85%、至少90%、至少95%、最高100%氨基酸序列同一性的全长Vh和/或全长'序列。例如,主题抗体可含有F2-1A6的全长V1^P/或全长可选地,主题抗体可含有F2-1H9的全长V1^P/或全长作为进一步的实例,主题抗体可含有E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1 或 HH3 的全长 Vh和/或全长与CD44结合的本公开的抗体的实例列于下表(例如,表I和2)中。表1.特异性结合⑶ 44的抗体的重链FR和⑶R
权利要求
1.一种分离的单克隆抗体,其特异性结合被抗体F2-1A6特异性结合的CD44表位或与抗体F2-1A6竞争结合CD44。
2.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体,当其与活哺乳动物细胞的表面上的CD44结合时被胞吞。
3.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体,其中所述抗体包含:a)F2-1A6 的 Vh CDRl ;b)F2-lA6的 Vh CDR2 ;和c)F2-lA6的 Vh CDR3。
4.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体,其中所述抗体包含:a)F2-1A6 的 \ CDRl ;b)F2-lA6的 Vl CDR2 ;和c)F2-lA6的 \ CDR3。
5.根据权利要求1所述的分离的抗体,其中所述抗体包含: a)F2-lA6的全长Vh;和 b)F2-lA6的全长 Vl。
6.一种分离的单克隆抗体,其特异性结合被抗体F2-1H9特异性结合的CD44表位或与抗体F2-1H9竞争结合CD44。
7.根据权利要求6所述的分离的单克隆抗体,当其与活哺乳动物细胞的表面上的CD44结合时被胞吞。
8.根据权利要求6所述的分离的单克隆抗体,其中所述抗体包含:a)F2-1H9 的 Vh CDRl ;b)F2-lH9的 Vh CDR2 ;和c)F2-lH9的 Vh CDR3。
9.根据权利要求6所述的分离的单克隆抗体,其中所述抗体包含:a)F2-1H9 的 \ CDRl ;b)F2-lH9的 Vl CDR2 ;和c)F2-lH9的 \ CDR3。
10.根据权利要求6所述的分离的抗体,其中所述抗体包含: a)F2-lH9的全长Vh;和 b)F2-lH9的全长 Vl。
11.一种分离的单克隆抗体,其特异性结合被选自E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1 和 HH3 的抗体特异性结合的 CD44 表位;或与选自 E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、DlDl、HB8、HC2、HC4、HE3、HFl和HH3的抗体竞争结合⑶44。
12.根据权利要求11所述的分离的单克隆抗体,其中所述抗体包含:a)E8Hll、E8H7、E8G12、E8Fll、E8C9、D6G9、D6D3、DlC5、DlDl、HB8、HC2、HC4、HE3、HFl或HH3 的 Vh CDRl ; b)E8Hll、E8H7、E8G12、E8Fll、E8C9、D6G9、D6D3、DlC5、DlDl、HB8、HC2、HC4、HE3、HFl或HH3 的 Vh CDR2 ;和c)E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1 或HH3 的 Vh CDR3。
13.根据权利要求11所述的分离的单克隆抗体,其中所述抗体包含:a)E8Hll、E8H7、E8G12、E8Fll、E8C9、D6G9、D6D3、DlC5、DlDl、HB8、HC2、HC4、HE3、HFl或HH3 的 \ CDRl ;b)E8Hll、E8H7、E8G12、E8Fll、E8C9、D6G9、D6D3、DlC5、DlDl、HB8、HC2、HC4、HE3、HFl或HH3 的 Vl CDR2 ;和c)E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3 的 \ CDR3。
14.根据权利要求11所述的分离的抗体,其中所述抗体包含:a)E8Hll、E8H7、E8G12、E8Fll、E8C9、D6G9、D6D3、DlC5、DlDl、HB8、HC2、HC4、HE3、HFl或HH3的全长Vh ;和b)E8Hll、E8H7、E8G12、E8Fll、E8C9、D6G9、D6D3、DlC5、DlDl、HB8、HC2、HC4、HE3、HFl或HH3的全长\。
15.一种分离的单克隆抗体,其 特异性结合被抗体2D6特异性结合的EphA2表位或与抗体2D6竞争结合EphA2。
16.根据权利要求15所述的分离的抗体,当其与活哺乳动物细胞的表面上的EphA2结合时被胞吞。
17.一种分离的单克隆抗体,其特异性结合被抗体D2-1A7特异性结合的EphA2表位或与抗体D2-1A7竞争结合EphA2。
18.根据权利要求17所述的分离的抗体,当其与活哺乳动物细胞的表面上的EphA2结合时被胞吞。
19.一种分离的单克隆抗体,其特异性结合被抗体D2-1A9特异性结合的EphA2表位或与抗体D2-1A9竞争结合EphA2。
20.根据权利要求19所述的分离的抗体,当其与活哺乳动物细胞的表面上的EphA2结合时被胞吞。
21.一种分离的单克隆抗体,其特异性结合被抗体D2-1B1特异性结合的EphA2表位或与抗体D2-1B1竞争结合EphA2。
22.根据权利要求21所述的分离的单克隆抗体,当其与活哺乳动物细胞的表面上的EphA2结合时被胞吞。
23.一种分离的单克隆抗体,其特异性结合被选自A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8和15H11的抗体特异性结合的EphA2表位或与选自A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8 和 15H11 的抗体竞争结合EphA20
24.根据权利要求23所述的分离的单克隆抗体,其中所述抗体包含:a)A3H9、A3G3、A3D10、A3Dl、A3C8、lA3、lA5、lA8、lA12、lB2、lC2、lC7、lD8或 15H11 的 VhCDRl ;b)A3H9、A3G3、A3D10、A3Dl、A3C8、lA3、lA5、lA8、lA12、lB2、lC2、lC7、lD8或 15H11 的 VhCDR2 ;和c)A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8 或 15H11 的 VhCDR3。
25.根据权利要求23所述的分离的单克隆抗体,其中所述抗体包含:a)A3H9、A3G3、A3D10、A3Dl、A3C8、lA3、lA5、lA8、lA12、lB2、lC2、lC7、lD8或 15H11 的 \CDRl ;b)A3H9、A3G3、A3D10、A3Dl、A3C8、lA3、lA5、lA8、lA12、lB2、lC2、lC7、lD8或 15H11 的 \CDR2 ;和c)A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或 15H11 的 \CDR3。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的分离的单克隆抗体,其中所述抗体是单链Fv (scFv)、IgG、Fab、(Fab,) 2 或(scFv,) 2。
27.根据权利要求1-25中任一项所述的分离的单克隆抗体,其中所述抗体被标记。
28.根据权利要求1-25中任一项所述的分离的单克隆抗体,其中所述抗体与抗癌剂缀入口 o
29.—种包含表面和内部空间的脂类纳米粒子,所述内部空间包含抗癌剂,其中根据权利要求1-28中任一项所述的分离的抗体与所述脂类纳米粒子的表面连接。
30.根据权利要求29所述的脂类纳米粒子,其中当所述脂类纳米粒子与表达细胞表面EphA2或细胞表面CD44的细胞接触时,所述抗体与细胞表面EphA2或细胞表面CD44结合并且所述脂类纳米粒子被胞吞。
31.一种组合物,其包含: 药学上可接受的载体;和 根据权利要求1-28中任一项所述的分离的抗体或根据权利要求29或权利要求30所述的脂类纳米粒子。
32.根据权利要求31所述的组合物,其中所述组合物被配制用于胃肠外施用。
33.根据权利要求32所述的组合物,其中所述组合物被配制用于静脉内、鞘内或室内施用或用于增强传送的递送。
34.一种治疗患有癌症的受试者的方法,其包括: 向所述受试者施用一定量的根据权利要求1-28中任一项所述的抗体或根据权利要求29或权利要求30所述的脂类纳米粒子,其中所述量足以延缓所述癌症的发展。
35.根据权利要求34所述的方法,其中所述抗体被内化到癌细胞中。
36.一种检测受试者的癌细胞的方法,其包括: 将根据权利要求1-28中任一项所述的抗体与疑似为癌性的所述受试者细胞接触;和 检测与所述细胞结合的所述抗体。
37.一种分离的核酸,其包含编码以下氨基酸序列的核苷酸序列: 包含克隆F2-1A6的抗体的Vh CDRl、Vh CDR2和Vh CDR3的Vh ; 包含克隆F2-1A6的抗体的Vl CDRl、Vl CDR2和Vl CDR3的Vl ; 包含克隆F2-1H9的抗体的Vh CDRl、Vh CDR2和Vh CDR3的Vh ; 包含克隆F2-1H9的抗体的Vl CDRl、Vl CDR2和Vl CDR3的Vl ; 包含选自 E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HFl 和 HH3 的抗体的 Vh CDRl、Vh CDR2 和 Vh CDR3 的 Vh ;或 包含选自 E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HFl 和 HH3 的抗体的 Vl CDRl、Vl CDR2 和 Vl CDR3 的 Vl。
38.根据权利要求37所述的分离的核酸,其中所述核酸包含编码以下氨基酸序列的核苷酸序列: 包含克隆F2-1A6的抗体的Vh CDR1、Vh CDR2和Vh CDR3的Vh和包含克隆F2-1A6的抗体的 Vl CDRl、Vl CDR2 和 Vl CDR3 的 Vl ;包含克隆F2-1H9的抗体的Vh CDR1、Vh CDR2和Vh CDR3的Vh和包含克隆F2-1H9的抗体的 Vl CDRl、Vl CDR2 和 Vl CDR3 的 Vl ;或 包含选自 E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、DlDl、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1 和 HH3 的抗体的乂11 CDRUVh CDR2 和 Vh CDR3 的 Vh 和包含选自 E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1 和 HH3 的抗体的 Vl CDRUVlCDR2 和 \ CDR3 的
39.一种分离的核酸,其包含编码以下氨基酸序列的核苷酸序列: 1)包含克隆2D6的抗体的VhCDRl、Vh CDR2和Vh CDR3的Vh, 2)包含克隆2D6的抗体的VlCDRl、Vl CDR2和Vl CDR3的Vl, 3)包含克隆D2-1A7的抗体的VhCDRl、Vh CDR2和Vh CDR3的Vh, 4)包含克隆D2-1A7的抗体的VlCDRl、Vl CDR2和Vl CDR3的\, 5)包含克隆D2-1A9的抗体的VhCDRl、Vh CDR2和Vh CDR3的Vh, 6)包含克隆D2-1A9的抗体的VlCDRl、Vl CDR2和Vl CDR3的\, I)包含克隆D2-1B1的抗体的Vh CDRUVh CDR2和Vh CDR3的VH, 8)包含克隆D2-1B1的抗体的VlCDRl、Vl CDR2和Vl CDR3的Vl ; 9)包含选自A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8 和15H11 的抗体的 Vh CDRl、Vh CDR2 和 Vh CDR3 的 Vh ;或 10)包含选自A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8 和15H11 的抗体的 Vl CDRl、Vl CDR2 和 Vl CDR3 的 Vl 或., 一种分离的核酸,其包含编码D和2) ;3)和4) ;5)和6) ;7)和8);或9)和10)的氨基酸序列的核苷酸序列。
40.—种表达载体,其包含根据权利要求37、38或39所述的核酸。
41.一种重组宿主细胞,其包含根据权利要求40所述的载体。
42.根据权利要求40所述的重组宿主细胞,其中所述细胞表达抗_EphA2抗体或抗-⑶44抗体。
43.一种试剂盒,其包含根据权利要求31所述的组合物。
全文摘要
本发明公开了结合肿瘤相关抗原CD44或肿瘤相关抗原EphA2的抗体,以及相关组合物及使用方法。使用方法包括癌症疗法、诊断和筛选方法。
文档编号C12P21/08GK103168104SQ201180044968
公开日2013年6月19日 申请日期2011年7月22日 优先权日2010年7月22日
发明者周育, J·D·马克斯 申请人:加利福尼亚大学董事会

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