一种微波驱动的杯状病毒rna聚合酶的rna聚合反应的制作方法
专利名称：一种微波驱动的杯状病毒rna聚合酶的rna聚合反应的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种以单链多核苷酸为模板合成互补RNA链的方法，该方法包括以下步骤:采用有效量的微波能量对含有所述模板以及一种杯状病毒科家族病毒的RNA聚合酶的混合物在RNA聚合反应条件下并在引物存在或缺席的条件下进行辐照，所述引物与模板杂交。本发明的另一主题涉及一种将一个或多个核苷酸转移至单链多核苷酸模板的3’端上的方法，该方法包括以下步骤:采用有效量的微波能量对含有杯状病毒科家族病毒的RNA聚合酶的混合物在rATP或rGTP或rUTP或rCTP或其修饰的或标记的类似物存在的条件下进行辐照。
背景技术：
杯状病毒科家族病毒的RNA依赖的RNA聚合酶(以下采用“RNA聚合酶”表示)已知被用于在引物存在或缺席的条件下合成一条与RNA模板互补的RNA链(参见W02007/12329A)。使用这种RNA聚合酶在通常的温度条件下进行的RNA标准扩增大概需要2小时。US5, 350，686大致要求保护了一种大分子的酶催化修饰的微波加速方法，但是实际上仅示出了限制性内切酶的成功的微波辅助反应。US7, 537，917描述了一种微波辅助DNA的PCR扩增方法。但是，并没有提供任何数据确实示出DNA聚合酶在微波辐照下进行了成功的DNA聚合反应。特别是关于使用PCR进行的DNA扩增，仅仅扩增循环中的加热(S卩，变性)步骤(而非聚合反应步骤)被报道为适用于微波应用的步骤；参见Ferm6r et al.(2003) EuropeanJ.Pharm.Sc1.18，129-132。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种以多核苷酸为模板进行RNA聚合反应的改进方法。上述技术问题的解决方法通过描述于此和权利要求所限定的本发明的实施例提供。尤其是，令人惊讶地发现，在使用杯状病毒科家族病毒的RNA聚合酶而非实验中所研究的其他RNA聚合酶时，通过微波辐照进行以单链多核苷酸为模板(RNA，DNA，混合RND/DNA或其混合物)合成互补RNA链的复杂反应是可行的并且得到了大大增强，从而形成了本发明。因此，本发明涉及一种以单链多核苷酸为模板合成互补RNA链的方法，该方法包括:采用有效量的微波 能量对含有所述模板以及一种杯状病毒科家族病毒的RNA聚合酶的混合物在RNA聚合反应条件下并在引物存在或缺席的条件下进行辐照，所述引物与模板杂交。杯状病毒的RNA聚合酶具有(但是，其他病毒的RNA依赖的RNA聚合酶，例如来源于脊髓灰质炎病毒或丙型肝炎病毒HCV均无法应用于本发明的方法；比照以下描述的实施例)以下共同的结构特征:所述杯状病毒科家族病毒的RNA聚合酶具有“右手螺旋构象”，并且所述RNA聚合酶的氨基酸序列包括以下基序的保守区域:a.XXDYS (SEQ ID NO:1)b.GXPSG(SEQ ID NO:2)c.YGDD(SEQ ID NO:3)d.XXYGL(SEQ ID NO:4)e.XXXXFLXRXX(SEQ ID NO:5)含义如下:D:天冬氨酸Y:酪氨酸S:丝氨酸
G:甘氨酸P:脯氨酸L:亮氨酸F:苯丙氨酸R:精氨酸X:任意氨基酸在此所说的“右手螺旋构象”(“right hand conformation”)是指RNA聚合酶的三级结构(构象)如同在大多数模板依赖的聚合酶中观察的一样像具有手指，手掌和拇指的
右手一样折叠。基序“XXDYS” (SEQ ID NO:1)就是所说的A基序。该A基序通常被用于区分核糖核苷和脱氧核糖核苷。基序“GXPSG” (SEQ ID NO:2)就是所说的B基序。该B基序在杯状病毒科家族的所有代表中是保守的。基序“YGDD”(C基序，SEQ ID N0:3)代表酶的活性中心。该基序，特别是第一个天冬氨基酸残基(黑体示出，YGDD)在Mg2+/Mn2+依赖的催化中对于金属离子的配位发挥重要的作用。基序“XXYGL” (SEQ ID NO:4)就是所说的D基序。该D基序是模板依赖的聚合酶的特征序列。最后，基序“XXXXFLXRXX”(E基序，SEQ ID NO: 5)是RNA依赖的RNA聚合酶(唯一)区别于DNA依赖的RNA聚合酶的特征序列。优选地，该RNA聚合酶是一种人源的和/或非人源的致病杯状病毒的RNA聚合酶。特别优选的是诺瓦克病毒、沙波病毒、水泡病毒或兔病毒的RNA聚合酶，例如，诺瓦克病毒HuCV/NL/Dresdenl74/1997/GE 株(GenBank Acc.No AY741811)的 RNA 聚合酶，或沙波病毒pJG-SapOl 株(GenBank Acc.No AY694184)的 RNA 聚合酶，或水泡病毒 FCV/Dresden/2006/GE 株(GenBank Acc.No DQ424892)的 RNA 聚合酶，或兔病毒 pJG-RHDV_DD06 株(GenBankAcc.N0.EF363035.1)的 RNA 聚合酶。根据本发明的特别优选实施例，该RNA聚合酶是一种包括(或具有)根据SEQ IDNO: 6 (诺瓦克病毒RNA聚合酶)、SEQ ID NO: 7 (沙波病毒RNA聚合酶)，或SEQ ID NO: 8 (水泡病毒RNA聚合酶)或SEQ ID NO:9 (兔病毒RNA聚合酶)的氨基酸序列的蛋白质。本领域技术人员直接就可以制备这种RNA聚合酶，例如使用合适的表达载体和宿主菌(参照W02007/012329A)进行重组表达。为了便于RNA聚合酶在重组表达之后的纯化，该RNA聚合酶优选表达为在相应序列的N-末端或C-末端具有一个合适的标签(例如GST或(His)6_tag)。例如，组氨酸标记允许蛋白质通过镍柱或钴柱以一种已知的方式通过亲和色谱法进行纯化。带有一个组氨酸标签的RNA聚合酶的实施例的例子为包括(或具有)根据SEQID NO: 10，SEQ ID NO: 11，SEQ ID NO: 12，SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14 的氨基酸序列的蛋白质。SEQ ID NO: 10相当于具有组氨酸标签的诺瓦克病毒的RNA聚合酶。SEQ ID NOill和SEQ ID NO: 12相当于具有组氨酸标签的沙波病毒的RNA聚合酶的氨基酸序列。SEQ IDNO: 13相当于具有组氨酸标签的水泡病毒的RNA聚合酶的氨基酸序列。SEQ ID NO: 14相当于具有组氨酸标签的兔病毒的RNA聚合酶的氨基酸序列。如上所述的杯状病毒的上述RNA聚合酶能够合成与核糖核苷酸(B卩，由RNA组成或含有RNA的多核苷酸模板)或脱氧核糖核苷酸(即，由DNA组成或含有DNA的多核苷酸模板)的多核苷酸链互补的RNA链。因此，该多核苷酸模板可以是单链RNA，单链DNA，单链混合的DNA/RNA或上述片段的混合物。如果该多核苷酸模板含有DNA或由DNA组成，该微波辐照则应当在修饰的GTP，优选2’端修饰的GTP，例如2’ -氟代-GTP，或α -硫代-GTP存在的条件下进行。通过具有与模板DNA的部分序列互补的序列的引物的延伸，或者通过在引物缺席的条件下互补链的从头合成，杯状病毒的RNA聚合酶合成一条与单链多核苷酸互补的RNA链。但是，如果含有脱氧核糖核苷酸的多核苷酸模板在其3’端具有的脱氧核糖核苷酸(即单链模板的3’端的最后 一个核苷酸)不是脱氧-C核苷酸(S卩，在其3’端具有脱氧-Τ，脱氧-A或脱氧-G核苷酸),适用于本发明的杯状病毒RNA聚合酶在合成与模板互补的RNA链时要求与模板杂交的引物存在。如果如本文所限定的多核苷酸模板在其3’端由一个或多个脱氧核糖核苷酸组成或含有一个或多个脱氧核糖核苷酸(即，模板的3’端是一个DNA片段或仅仅最后一个核苷酸是脱氧核糖核苷酸)，优选该模板的3’端的最后一个脱氧核糖核苷酸是dC，更优选该模板的3’端的至少最后2个，3个，4个或5个脱氧核糖核苷酸是dC，从而提高RNA合成在引物缺席的条件下从头引发的效率。在模板由RNA组成，或其3’端由核糖核苷酸组成的情况下，如果该模板是聚腺苷酸，聚鸟苷酸或聚尿苷酸，本发明微波辐照方法中的聚合反应则要求相应引物的存在。如果该模板是聚胞苷酸，杯状病毒RNA聚合酶的RNA合成在没有引物的条件下也是可能进行的。在该实施例中，优选模板中具有提高的rGTP水平(B卩，GTP相对于其他必需的rNTPs过量，例如 2x, 3x, 4x 或 5x)。该引物如果是理想的或必需的，分别可以是特定的(杂聚的)DNA或RNA或混合DNA/RNA引物，也可能是随机的引物(DNA或RNA或混合DNA/RNA)，或者可能是同聚物引物，例如寡-dT-引物或寡-U-引物的序列。该引物的长度对于实施本发明的方法是不重要的，但是通常具有，例如约5-25个碱基，更优选为约10-20个碱基，最优选为15-20个碱基的长度的寡核苷酸引物是特别有利的。杯状病毒RNA聚合酶的性能特征的更多细节可参见W02007/012329A。与其他RNA依赖的RNA聚合酶，例如QP复制酶相比，该杯状病毒的RNA聚合酶并不要求具有对聚合酶特定的识别序列的引物来启动RNA合成。因此，本文所使用的“引物”通常是不具有该识别序列的引物，特别是，不具有RNA聚合酶的识别序列。此外，该杯状病毒RNA聚合酶不同于普通的DNA依赖的RNA聚合酶，例如T7RNA聚合酶，因为他们不需要模板中具有特定的启动子序列。该单链多核苷酸模板可能包括至少一个脱氧核糖核苷酸的序列片段，S卩，至少一个ssDNA片段，例如在模板的3’端的至少一个DNA片段。本文中的“片段”是指至少两个或更多连续的脱氧核糖核苷酸。例如，根据本发明该多核苷酸模板可以是单链分子，其5’端由核糖核苷酸起始，随后的“中间”区域为脱氧核糖核苷酸(DNA)，末端(3’端)又是核糖核苷酸。也可以是，5 ’ -RNA-DNA-3 ’或5 ’ -DNA-RNA-3 ’，或任何其他具有RNA和DNA序列的多核苷酸。根据本发明的单链多核苷酸模板的其他例子还包括主要是ssDNA，但是在其5’端和/或3 ’端，优选在其3 ’端具有一个或多个(例如，I，2，3，4，5，6，7，8，9或10 )核糖核苷酸。可选地是，根据本发明所使用的模板可以主要是ssRNA，但是在其5’端和/或3’端，优选在其3’端具有一个或多个(例如，1，2，3，4，5，6，7，8，9或10)脱氧核糖核苷酸。当然，根据本发明该单链多核苷酸模板也可能仅由ssDNA或ssRNA组成。正如上文所提到的，本发明的在其3’端具有dA，dT或dG残基的多核苷酸模板通常要求引物来通过RNA聚合酶合成互补的RNA链。但是，即使3’端不具有C核苷酸的多核苷酸序列根据本发明的方法也能有效地转录进入RNA而无需引物；特别是在这种情况下，但是并非仅限于此，该方法进行的起始步骤为:采用有效量的微波能量对含有单链多核苷酸模板和如上所述的杯状病毒RNA聚合酶的混合物，在rCTP作为唯一的核苷酸存在的条件下进行辐照，并在一定条件下使得所述RNA聚合酶添加至少一个rC (或更多例如2，3，4或5个rC)核苷酸到该模板的3’端。其后,所生成的在3’端具有一个或多个C核糖核苷酸的模板可在如上所述的RNA聚合酶的作用下进行微波驱动的RNA合成，使得所述RNA聚合酶合成一条互补的RNA链，该步骤可在引物缺席的条件下进行。但是，应当理解为在该实施例中可以使用引物，例如，如果为了将一条选定的序列引入由该RNA聚合酶生产出的RNA链中时或是其他目的时则需要引物。鉴于杯状病毒RNA聚合酶的末端转移酶活性，本发明还提供一种将一个或多个核糖核苷酸转移至如上所述的单链多核苷酸模板的3’端的方法，该方法包括:采用有效量的微波能量对含有如上所述的杯状病毒科家族病毒的RNA聚合酶的混合物在rATP，rGTP,rUTP或rCTP或其修饰的或标记的类似物存在的条件下进行辐照。根据本发明方法的一个优选实施例，由RNA聚合酶在微波辐照下生成的双链分子分离成单链，从而生成ssRNA和模板。该步骤可在热变性或化学变性或酶催化下进行，例如，能够将单链多核苷酸分离成单链的酶，例如解旋酶。但是，根据本发明特别优选的实施例，由该RNA聚合酶产生双链多核苷酸的步骤和其他分离步骤在如上所述的微波辐照下采用相同的酶进行，即，该RNA聚合酶本身，该步骤同样优选在微波辐照下进行。该步骤有效利用了杯状病毒的RNA聚合酶的链置换活性。更优选为将如上所述获得的单链再次(或进一步)与如上所述的杯状病毒RNA聚合酶在微波辐照下温浴，并在一定条件下使得该RNA聚合酶合成与所述各单链互补的RNA链。显然该RNA合成步骤和链分离可重复一次或多次，例如，大约3-40次，优选为大约5-30次，更优选为大约10-20次。根据又一优选实施例，本发明的方法包括最后的RNA合成步骤。特别是在链分离和RNA合成的重复循环中，该方法导致产物几乎是纯的dsRNA，即使该原始模板含有DNA的(一个或多个)片段或由DNA组成。正如如上概述的那样，任何进一步的链分离步骤可在热变性或化学变性或酶催化下进行，例如能够将单链多核苷酸分离成单链的酶，比如解旋酶。但是，更加优选的是，进一步的链分离可在杯状病毒RNA聚合酶的作用下进行。因此，显然根据本发明包括数个或大量链分离和RNA合成步骤的优选方法可在同一温浴反应中进行(特别是当使用不需要引物就能在如上所述的RNA聚合酶的作用下进行RNA合成的模板时)，该温育反应仅仅要求对含有模板，杯状病毒的RNA聚合酶，适当的缓冲液(如下)和rNTPs (B卩，rATP，rUTP，rCTP和rGTP，或如下所述的修饰或标记的rNTPs)的反应混合物进行微波辐照。根据本发明，术语“RNA聚合反应条件”是指条件，特别涉及实现RNA聚合酶合成与模板链互补的RNA链的缓冲液，盐和金属离子(若适用)的条件。适当的缓冲液，盐，金属离子，还原剂(若适用)和其他RNA聚合酶的条件为本领域技术人员所知，例如参见W02007/012329A。因此，该多核苷酸模板通常以例如:1_4 μ g/50 μ L反应体积使用。该三磷酸核糖核苷酸(包括进一步如下所述的可选的修饰的或标记的三磷酸核糖核苷酸)的浓度优选在0.1μπιο1/1-1μπιο1/1的范围内，例如0.4 μ mol/1。该RNA聚合酶的浓度可以是lymol/l-10ymol/L.
典型的缓冲液为:10-80mM，更优选为20_50mM HEPES, pH7.0-8.0, l_5mM，例如 3mM醋酸镁，氯化镁，醋酸锰或氯化锰和l_5mM还原剂，例如DTT。典型的终止液含有:2-10mM，优选4-8mM醋酸铵，以及50_200mM，例如150mM EDTA。单链多核苷酸，例如ssRNA模板的长度和来源通常是不重要的。该模板可以具有天然序列或人工序列，并且该模板可以是化学合成的或多种来源，例如真核、原核或病毒的总的RNA，mRNA或基因组DNA，质粒DNA，cDNA,杆粒或任何其他来源的RNA和DNA。在作为模板在本发明的方法中使用之前，双链DNA或RNA需要分别通过加热或微波辐照或化学变性分离成ssDNA或ssRNA。本发明的方法在使用RNA模板提供双链RNA产物和/或扩增ssRNA模板中是特别有用的。本发明的特别优 选实施例涉及短RNA分子用于基因沉默应用的方法，或者通过反义技术或RNA干扰，或者用于针对微小RNA或非编码RNA的特定序列的反义从而实现抑制微小RNA驱动RNA干扰(antagomirs)的目的。对于这些应用，在本发明的方法中使用的模板(优选RNA)通常具有8-45个核苷酸，例如15-30个核苷酸,优选21-28个核苷酸,更优选21-23个核苷酸。后一长度的分子对于SiRNA应用通常是特别有益的。进一步可以预期该RNA聚合酶在RNA合成中(包括末端转移酶活性)在微波辐照下可采用修饰的核糖核苷酸(除了如上所述的可选的修饰的GTP(例如2’-氟代-GTP或α -硫代-GTP))。例如，该修饰可以是用于检测RNA聚合酶的双链RNA合成产物的标记。或者可选地，该标记还可用于检测链分离之后获得的ssRNA产物。本发明中所使用的标记包括荧光基团(例如荧光素)，放射基团(例如，32P标记的核糖核苷酸)以及特异性结合对，例如生物素化的rNTPs。在本发明的特定实施例中，在RNA聚合酶活性的作用下被合并进入互补链的至少一个修饰的核糖核苷酸可以在其核糖，磷酸和/或碱基上具有化学修饰基团(其中的一个或多个)。而对于具有增强稳定性的分子，特别是RNA降解酶，特别优选的是其骨架(即核糖和/或磷酸)上具有修饰基团。本发明的方法中化学修饰的RNA产物优选具有与未修饰的ssRNA或dsRNA类似物相比增强的稳定性。核糖修饰的核糖核苷酸的优选实施例为一组类似物，其中2’ -OH选自由H，OR, R，卤素，SH, SR，NH2, NHR, NR2或CN (其中R是C1-C6烷基，烯基或炔基，卤素是F，Cl，Br或I)组成的组中的基团取代。在本发明的文中，显然术语“修饰的三磷酸核糖核苷酸”或“修饰的核糖核苷酸”还包括可能每隔几个的2’脱氧衍生物，也称作“脱氧核苷酸”。这些在其2’位具有修饰核糖的核糖核苷酸类似物的典型实施例包括:5_氨基-尿苷，2’ -氨基-2’ -脱氧尿苷，2’ -叠氮-2’ -脱氧尿苷，2’ -氟代-2’ -脱氧鸟苷和2’ -O-甲基-5-甲基-尿苷。在理想的双链产物中形成磷酸骨架修饰的核糖核苷酸的例子为硫代磷酸酯类似物。根据本发明，至少一个修饰的核糖核苷酸可选自其碱基位上具有化学修饰的类似物。这种类似物的例子包括:6_氮杂-尿苷，8-氮杂-腺苷，5-溴代-尿苷，7-去氮杂-腺苷，7-去氮杂-鸟苷，N6-甲基-腺苷，5-甲基-胞苷，假-尿苷，以及4-硫代-尿苷。上述以及其他化学修饰的三磷酸核糖核苷均为市面上可买到的产品，例如可从Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Munich, Germany or Trilink technologies, USA 购买。应当理解，该多核苷酸模板可能含有如上所述的和/或进一步为本领域熟知的一个或多个修饰的或标记的核苷酸。短模板(例如，如上所述)通常由化学合成法制备。用于提供这种单链多核苷酸模板的其他方法还包括酶法操作，例如RNA的反转录以及RNA链的后续降解，采用限制性酶对较大dsDNA分子的切割，以及采用热变性或化学变性进行的后续链分离成ssDNA，总的细胞RNA的制备，mRNA的制备等等。优选反应体积范围为20-200 μ L，优选为50-100 μ L。典型地，如上所述的缓冲液条件和其他条件的制备包括:混合 适当的储备液(通常为5χ或IOx浓缩液)，加入RNA聚合酶，模板，和双蒸水或去离子水(优选在使用之前经过去RNAse和/或DNAse)补足至理想的终反应体积。术语“有效量的微波能量”是指使用杯状病毒的RNA聚合酶，分别进行合成与单链多核苷酸模板互补的链或者将至少一个核糖核苷酸转移到单链多核苷酸的3’端的RNA聚合反应所要求的微波能量的量。对于给定模板所需要的具体的微波能量的量可由本领域技术人员通过常规的实验确定并且特别取决于模板的类型和长度。本文所使用的术语“微波能量”，“微波辐照”或“采用微波辐照”或简单的“微波”均为同义使用，涉及的电磁波谱的部分包括波长大约为0.3-30cm，频率相当于1-100千兆赫，被发现于电磁波谱的无线电和红外线之间的电磁波。生物体所吸收的电磁能量的量由该组织，细胞和生物分子的介电性能决定。为了实现本发明的目的，该微波能量的形成方式并不重要，可采用为本领域熟知的任何手段。例如，用于将微波辐照施加给根据本发明所述的反应混合物的适当手段为微波炉，该微波炉可从许多供应商那里买到，并且通常是大多数生物学实验室的标准设备的构成部分。这些微波炉通常具有大约500W-1000W的最大功率水平。即使是最小的微波炉也可以为本发明的应用提供所需要的足够的微波辐照水平，并且因此，对于输出功率可调节的微波炉，使用较小的功率设置将是十分方便的。因此，根据公开于此的本发明方法的优选实施例，该混合物的辐照所采用的微波具有大约1500-3500MHZ的频率，并且具有大约50-1000W的功率。
根据本发明的优选实施例，在较长的时间间隔中使用更小的功率设置，能够降低局部能量吸收并且最小化导致分子损害的可能性。在一个特别优选的实施例中，微波能量以一系列的间隔施加于样品上，而在“停顿”间隔中微波能量不施加于样品上。能量施加间隔和停顿间隔通常分别在1-60秒之间，能量施加间隔优选在15-60秒之间，而停顿间隔优选在0.5-5秒之间。最优选地是，能量施加间隔为大约45秒，由停顿间隔1-2秒隔开。但是，特别是取决于单链多核苷酸模板的长度，该辐照步骤可在唯一的微波能量施加(间隔)中进行，该时间周期为ls-5min，更加优选为3s-120s。当使用较短长度的模板(例如用于制备短dsRNAs，比如siRNAs的模板)时则特别优选后一较短的时间周期。特别是关于从ssRNA模板到dsRNA的制备，根据本发明已经表明本文所述的方法具有与本领域已知的温育时间相比基本更短的反应时间。通过杯状病毒的RNA聚合酶制备双链多核苷酸产物时微波辐照的应用对于制备双链RNA十分有利。正如前文所提及的，迄今为止这些反应均是在30-42° C下使用更长的温育时间进行，以及通过加热来分离双链RNA产物。但是，在这种情况下获得的dsRNA容易降解，从而使得很难获得具有理想长度的纯的dsRNA产物。与此相反，根据本发明微波能量的应用加快了 RNA聚合酶的聚合反应，从而克服了 RNA降解的缺陷。应当理解，在实施本发明的一个优选方案中，除了将装置的“功率”设置调整到最大值以下，还将采取上述措施使得输入功率随着时间分布。事实上，许多市售的微波炉可维持不变的磁控管输出功率在650-900W之间，并且可通过改变磁控管的占空比调节输入功率。设置为“I”相当于10%的占空比，设置为“9”相当于90%的占空比。最优选地是，设置为1-8，即磁控管在输出功率为700-800W的条件下的占空比为10%-80%。该总输出能量将被施加于如上所述的多个间隔，或一个间隔，相当于70-35，000瓦-秒，优选为3000-3500瓦-秒/间隔。
图1示出了反应物电泳分离之后的溴化乙锭染色非变性20%聚丙烯酰胺凝胶的照片，证明了通过沙波病毒RNA聚合酶实现了微波驱动的引物非依赖的从头引发RNA合成以及双链RNA的形成。泳道1:RNA模板。泳道2:微波辐照(800W，60s)之后模板与沙波病毒RNA聚合酶的反应混合物产生了一条与25bp dsRNA标记共迁移的带。泳道3:泳道2的产物在经过SI核酸酶处理之后的产物。该25bp产物未被SI核酸酶消化，示出了产物的双链特性。M:RNA标记，包括如图所示的分别为17bp，21bp和25bp的dsRNA以及24nt的ssRNA。图2A示出了反应物电泳分离之后的溴化乙锭染色非变性20%聚丙烯酰胺凝胶的照片，该照片说明了通过沙波病毒RNA聚合酶实现微波驱动的引物非依赖的从头引发RNA合成以及双链RNA的形成所需要的能量条件。该沙波病毒RNA聚合酶与24nt ssRNA模板在微波辐照下温育60s，功率分别为80W (泳道1)，160W (泳道2)，240W (泳道3)，320W (泳M 4), 400W (泳道 5)，480W (泳道 6)，560W (泳道 7)，640W (泳道 8)，720W (泳道 9)和 800W(泳道10)。泳道1-10分别示出了与25bp dsRNA标记共迁移的产物。M =RNA标记，包括如图所示的分别为17bp，21bp和25bp的dsRNA,以及24nt的ssRNA。图2B示出了反应物电泳分离之后的溴化乙锭染色非变性20%聚丙烯酰胺凝胶的照片，该照片说明了通过沙波病毒RNA聚合酶实现微波驱动的引物非依赖的从头引发RNA合成以及双链RNA的形成所需要的辐照时间。该沙波病毒RNA聚合酶与24nt ssRNA模板在80W的微波辐照下分别温育60s (泳道1)，30s (泳道2)，15s (泳道3)和5s (泳道4)或者在800W下分别温育60s (泳道5)，30s (泳道6)，15s (泳道7)和5s (泳道8)。泳道1-8均示出了与25bp dsRNA标记共迁移的产物。M =RNA标记，包括如图所示的分别为17bp和25bp 的 dsRNA，以及 24nt 的 ssRNA。图3示出了反应物电泳分离之后的溴化乙锭染色非变性20%聚丙烯酰胺凝胶的照片，该照片证明了当反应物暴露于微波辐照中时，沙波病毒RNA聚合酶以引物非依赖性的方式以DNA为模板从头引发RNA合成，并将2’-氟代-GMP合并引入双链DNA/RNA产物。该沙波病毒RNA聚合酶与3’端具有5个dC的24nt的ssDNA模板(泳道I)或序列相同但是在其3’端具有5个rC的ssDNA模板(泳道2)在rATP，rCTP, rUTP和2’ -氟代-GTP存在的条件下，800W微波辐照60s。含有沙波病毒RNA聚合酶和与DNA模板序列相同的ssRNA模板的反应物作为对照，微波条件相同，并且含有rATP，rCTP, rUTP和rGTP (泳道3)。双链合成产物与单链模板均如图所述。图4示出了反应物电泳分离之后的溴化乙锭染色非变性20%聚丙烯酰胺凝胶的照片，该照片证明了当反应物暴露于微波辐照中时，沙波病毒RNA聚合酶以引物非依赖性的方式以DNA为模板从头引发RNA合成，并将α -硫代-GMP合并引入双链DNA/RNA产物。该沙波病毒RNA聚合酶与3’端具有5个dC的24nt的ssDNA模板(泳道I)或序列相同但是在其3’端具有5个rC的ssDNA模板(泳道2)在rATP, rCTP, rUTP和α -硫代-GTP存在的条件下，800W微波辐照60s。含有沙波病毒RNA聚合酶和与DNA模板序列相同的ssRNA模板的反应物作为对照，微波条件相同，并且含有rATP，rCTP, rUTP和rGTP (泳道3)。双链合成产物与单链模板均如图所述。图5示出了反应物电泳分离之后的溴化乙锭染色非变性20%聚丙烯酰胺凝胶的照片，该照片证明了杯状病毒RNA聚合酶能够实现微波驱动的从头引发RNA合成并且生成双链RNA，而其他病毒的RN A聚合酶则不能。24nt的ssRNA模板分别与沙波病毒(泳道I )，诺瓦克病毒(泳道2)，水泡病毒(泳道3)，兔病毒(泳道4)，脊髓灰质炎病毒(泳道5)或丙型肝炎病毒(泳道6)的RNA聚合酶在800W的微波辐照下辐照60s。杯状病毒的RNA聚合酶(泳道1-4)产生了与25bp dsRNA标记共迁移的双链产物，而脊髓灰质炎病毒(泳道5)或丙型肝炎病毒(泳道6)的RNA聚合酶则没有产生该产物。M:RNA标记，包括如图所示的分别为17bp 和 25bp 的 dsRNA,以及 24nt 的 ssRNA。图6示出了反应物电泳分离之后的溴化乙锭染色非变性20%聚丙烯酰胺凝胶的照片，证明了沙波病毒的RNA聚合酶实现了微波驱动的从头引发RNA合成并且以ssDNA为模板生成双链DNA/RNA产物。该沙波病毒RNA聚合酶与3’端具有5个dC的24nt的ssDNA模板(泳道I)或序列相同但是在其3’端具有5个rC的ssDNA模板(泳道3)在800W的微波辐照下辐照60s。作为对照，含有该沙波病毒RNA聚合酶以及相同序列的ssRNA模板的反应物(泳道2)在与之前相同的条件下进行微波辐照。所有的反应均在rATP，rCTP, rUTP和rGTP存在的条件下进行。与25bp dsRNA标记共迁移的双链产物在泳道2和3中可见，而在泳道I中不可见，该结果表明双链产物仅仅在ssDNA模板的3’端具有rC核苷酸的条件下生成。M =RNA标记，包括如图所示的20nt，40nt和80nt的ssDNA。
图7示出了反应物电泳分离之后的溴化乙锭染色非变性20%聚丙烯酰胺凝胶的照片，证明T7DNA依赖的RNA聚合酶在微波辐照下不能进行RNA合成。该T7DNA依赖的RNA聚合酶与dsDNA模板(含有116bpl8SrRNA序列的线性化质粒)在37° C下温育2h (泳道I)或在800W下微波福照60s(泳道2)。所有的反应均在T7_Megashortscript Kit (Ambion, Inc.)推荐的条件下进行。在37° C下等温温育2h (泳道I)之后可观察到反应产物，而在微波辐照(泳道2)之后则无法观察到。图8A示出的图表反映了沙波病毒RdRp在使用加热管产生的热量下进行引物非依赖的从头引发RNA合成的酶反应的动力学。为了测定该反应动力学，该沙波病毒RdRp(SEQID N0:11)与RNA模板(5’-AUACCUAGAAUCUGACCAACCCCC-3’；SEQ ID NO: 15)—起温育。该反应以25 μ I总体积在加热管中37° C下进行。该反应混合物含有I μ g模板，7.5 μ M RdRp,各为 0.4mM 的 ATP, CTP, UTP,以及 2mM GTP, 5 μ I 反应缓冲液(HEPES 250mM, MnCl225mM, DTT5mM, ρΗ7.6)，去 RNAse-DNAse 水补足至 25 μ I 总体积。图8Β示出的图表反映了沙波病毒RdRp在使用微波能量下进行引物非依赖的从头引发RNA合成的酶反应的动力学。为了测定该反应动力学，该沙波病毒RdRp (SEQ IDΝ0:11)与 RNA 模板(5，-AUACCUAGAAUCUGACCAACCCCC-3’ ; SEQ ID NO: 15)—起温育。该反应以25 μ I总体积在160W的微波下进行。该反应混合物含有I μ g模板，7.5 μ M RdRp，各为 0.4mM 的 ATP, CTP, UTP,以及 2mM GTP, 5 μ I 反应缓冲液(HEPES 250mM, MnCl2 25mM, DTT5mM, ρΗ7.6)，去 RNAse-DNAse 水补足至 25 μ I 总体积。
具体实施例方式本发明进一步通过以下非限制性例子进行阐述。
例1:通过沙波病毒RNA聚合酶实现的微波驱动的引物非依赖的从头引发RNA合成以及双链RNA的生成沙波病毒RNA 聚合酶(SEQ ID NO: 11)与 RNA 模板(5 ’ -AUACCUAGAAUCUGACCAACCCCC-3’ ;SEQ ID NO: 15)在常规微波炉中800W下微波辐照60s。该沙波病毒RNA聚合酶以单链RNA为模板生成双链RNA (如图1，泳道2)。该生成的产物与SI核酸酶进行温育。在与SI核酸酶进行温育之后产物并没有被消化(如图1，泳道3)，说明了产物为双链的性质。所有反应均在25 μ I总体积下进行。该RNA聚合酶反应物混合含有I μ g模板，7.5 μ M RNA聚合酶，各为 0.4mM 的 ATP, CTP, UTP，以及 2mMGTP，5y I 反应缓冲液(HEPES 250mM, MnCl225mM, DTT 5mM, pH7.6)，以及去RNAse-DNAse水补足至25 μ I总体积。对于SI核酸酶的消化，SI核酸酶(250U)被加入反应液，并且反应液在30° C下混合温育lh。该产物通过电泳在非变性20%聚丙烯酰胺凝胶中分离并通过溴化乙锭染色观察。例2:通过杯状病毒RNA聚合酶实现的微波驱动RNA合成所需的微波功率和辐照时间沙波病毒RNA 聚合酶(SEQ ID NO: 11)与 RNA 模板(5 ’ -AUACCUAGAAUCUGACCAACCCCC-3’ ;SEQ ID NO: 15)—起温育。该反应以25 μ I总体积在常规微波炉中分别在80W，I60W, 240W, 320W, 400W, 480W, 560W, 640W, 720W 和 800W 下辐照 60s。在另一实验中，该反应物在同一微波炉中80W下辐照60s，30s, 15s,或5s (如图2B，泳道1_4)，或在800W下进行60s, 30s, 15s,或5s(如图2B，泳道5_8)。所有反应中均产生了预期尺寸的产物(图2A，2B)。
该反应物混合含有I μ g模板，7.5 μ M RNA聚合酶，各为0.4mM的ATP, CTP, UTP,以及 2mM GTP，5y I 反应缓冲液(HEPES 250mM, MnCl2 25mM, DTT 5mM, pH 7.6)，以及去RNAse-DNAse水补足至25 μ I总体积。该产物通过电泳在非变性20%聚丙烯酰胺凝胶中分离并通过溴化乙锭染色观察。例3:杯状病毒RNA聚合酶在微波辐照下以DNA为模板以引物非依赖的方式从头引发RNA合成，并将2’ -氟代-GMP合并引入双链DNA/RNA产物沙波病毒RNA 聚合酶(SEQ ID NO: 11)与 ssDNA 模板(5 ’ -ATACCTAGAATCTGACCAACCCCC-3’ ；SEQ ID NO: 16)—起温育或具有相同序列但是在3’端具有(rC)5基序的DNA模板(5’_ATACCTAGAATCTGACCAArCrCrCrCrC-3’；SEQ ID NO: 17)。作为对照，将沙波病毒 RNA 聚合酶与单链 RNA (5’ -AUACCUAGAAUCUGACCAACCCCC-3’ ; SEQ ID NO: 15) —起温育，该单链 RNA 具有与上述单链DNA相同的序列。所有的反应以25 μ I总体积在常规微波炉里800W下进行辐照60s。该反应物混合含有I μ g模板，7.5 μΜ RNA聚合酶，各为0.4mM的ATP，CTP，UTP，以及GTP (使用ssRNA模板作为对照反应；如图3，泳道3)或2’ -氟代-GTP (使用ssDNA模板进行反应；如图 3，泳道 I和2)，5μ I 反应缓冲液(HEPES 250mM, MnCl2 25mM, DTT 5mM, pH7.6),以及去RNAse-DNAse水补足至25 μ I总体积。该产物通过电泳在非变性20%聚丙烯酰胺凝胶中分离并通过溴化乙锭染色观察。图3 (参见泳道I和2)证明了通过沙波病毒RNA聚合酶实现了以ssDNA为模板进行的微波驱动的RNA合成以及对2’ -氟代-GMP的引入。例4:杯状病毒RNA聚合酶在微波辐照下以DNA为模板以引物非依赖的方式从头引发RNA合成，并将α -硫代-GMP合并引入双链DNA/RNA产物将沙波病毒RNA 聚合酶(SEQ ID NO: 11)与 ssDNA 模板(5 ’ -ATACCTAGAATCTGACCAACCCCC-3’；SEQ ID NO: 16)或具有相同序列但是在3’端具有(rC) 5基序的DNA模板(5，-ATACCTAGAATCTGACCAArCrCrCrCrC-3’；SEQ ID NO: 17)—起温育。作为对照，将沙波病毒 RNA 聚合酶与单链 RNA(5’-AUACCUAGAAUCU`GACCAACCCCC-3’ ; SEQ ID NO: 15)—起温育，该单链 RNA 具有与上述单链DNA相同的序列。所有的反应以25 μ I总体积在常规微波炉里800W下进行辐照60s。该反应物混合含有I μ g模板，7.5 μ M RNA聚合酶，各为0.4mM的ATP, CTP, UTP,以及GTP (使用ssRNA模板作为对照反应；如图4，泳道3)或α -硫代-GTP (使用ssDNA模板进行反应；如图4，泳道 I和2)，5μ I 反应缓冲液(HEPES 250mM, MnCl2 25mM, DTT 5mM，pH7.6)，以及去RNAse-DNAse水补足至25 μ I总体积。该产物通过电泳在非变性20%聚丙烯酰胺凝胶中分离并通过溴化乙锭染色观察。图4 (参见泳道I和2)证明了通过沙波病毒RNA聚合酶实现了以ssDNA为模板进行的微波驱动的RNA合成以及对α -硫代-GMP的引入。例5:采用杯状病毒科的不同RNA聚合酶进行的微波驱动的引物非依赖的从头引发RNA合成以及双链RNA的形成将沙波病毒RNA聚合酶(SEQ ID NO: 11)，诺瓦克病毒RNA聚合酶(SEQ ID NO:9)，水泡病毒RNA聚合酶(SEQ ID NO: 13)，兔病毒RNA聚合酶(SEQ ID NO: 14)在微波辐照下与RNA 模板(5，-AUACCUAGAAUCUGACCAACCCCC-3’ ; SEQ ID NO: 15)—起温育。所有的杯状病毒RNA聚合酶以单链RNA为模板生成双链RNA (如图5，泳道1-4)。此外，本实施例还研究了是否其他病毒(脊髓灰质炎病毒，丙型肝炎病毒)来源的RNA聚合酶同样能够在微波辐照下进行相同的反应。因此，将该脊髓灰质炎病毒RNA聚合酶和丙型肝炎病毒RNA聚合酶与相同的ssRNA模板在微波辐照下进行温育。但是，该脊髓灰质炎病毒和丙型肝炎病毒的RNA聚合酶在与用于杯状病毒RNA聚合酶的相同的条件下并不产生双链RNA (如图5，泳道5和6)。所有的反应以25 μ I总体积在常规微波炉里800W下进行辐照60s。该反应物混合含有I μ g模板，7.5 μ M RNA聚合酶，各为0.4mM的ATP, CTP, UTP,以及2mM GTP, 5 μ I反应缓冲液(HEPES 250mM, MnCl2 25mM, DTT 5mM, ρΗ7.6)，以及去 RNAse-DNAse 水补足至 25 μ I 总体积。该产物通过电泳在非变性20%聚丙烯酰胺凝胶中分离并通过溴化乙锭染色观察。例6:通过沙波病毒RNA聚合酶实现以微波驱动的引物非依赖的方式从头引发RNA合成以及DNA-RNA-双链的形成将沙波病毒RNA聚合酶(SEQ ID NO: 11)与3 ’末端具有(dC) 5基序的DNA模板(5 ’-ATACCTAGAATCTGACCAACCCCC-3’ ; SEQ ID NO: 16)，或具有相同序列但是 3’端具有(1*05基序的 DNA 模板(5，-ATACCTAGAATCTGACCAArCrCrCrCrC-3，; SEQ ID NO: 17) 一起温育。作为对照，将该沙波病毒 RNA 聚合酶与单链 RNA (5’ -AUACCUAGAAUCUGACCAACCCCC-3’ ; SEQ IDNO: 15) 一起温育，该单链RNA具有与单链DNA模板相同的序列。该沙波病毒RNA聚合酶以单链DNA为模板形成了 DNA/RNA双链(如图6，泳道2和3)，该DNA模板的3’端具有C核糖核苷酸。所有的反应以25 μ I总 体积在常规微波炉里800W下进行辐照60s。该反应物混合含有I μ g模板，7.5 μ M RNA聚合酶，各为0.4mM的ATP, CTP, UTP,以及2mM GTP, 5 μ I反应缓冲液(HEPES 250mM, MnCl2 25mM, DTT 5mM, ρΗ7.6)，以及去 RNAse-DNAse 水补足至 25 μ I总体积。该产物通过电泳在非变性20%聚丙烯酰胺凝胶中分离并通过溴化乙锭染色观察。对照例:采用T7DNA依赖的RNA聚合酶(DdRp)分别在等温条件下与微波辐照下进行RNA合成的效率对比该T7DdRp以双链DNA为模板(含有116bp的18S rRNA序列的线性化质粒，I μ g/次)，在推荐的等温温育条件37° C下温育2h或使用微波辐照(800W，60s)来进行RNA合成。所使用的试剂为T7-Megaschortscritp Kit (Ambion, Inc)。所有的反应根据操作指南进行。在等温条件下温育的产物如图7中泳道I所示。相比之下，当反应混合物采用微波辐照时则没有产物生成(800W，60s ;如图7，泳道2)。反应产物通过电泳在非变性20%聚丙烯酰胺凝胶中分离并通过溴化乙锭染色观察。上述例子和对照例证明了杯状病毒科病毒家族(杯状病毒)的RNA聚合酶在微波辐照下能够以RNA，DNA或混合RNA/DNA为模板合成互补的RNA链，而结构相关的其他病毒(脊髓灰质炎病毒，HCV)的RNA依赖的RNA聚合酶或DNA-依赖的RNA聚合酶(T7DdRp)则无法实现。例7:沙波病毒RdRp在使用微波能量时具有与通过加热管所产生的热量相比增强的RNA合成催化效率为了测量反应动力学，将该沙波病毒RdRp (SEQ ID NO: 11)与RNA模板(5，-AUACCUAGAAUCUGACCAACCCCC-3’;SEQ ID NO: 15)—起温育。所有反应均以 25 μ I 总体积进行，或在加热管中37° C下，或在微波炉中160瓦特下进行。该反应物混合含有1μ g模板，7.5μΜ RdRp，各为 0.4mM 的 ATP，CTP，UTP，以及 2mM GTP，5 μ I 反应缓冲液(HEPES250mM, MnCl2 25mM, DTT 5mM, pH 7.6)，以及去 RNAse-DNAse 水补足至 25 μ I 总体积。图 8Α示出了采用由加热管产生的热量进行的反应的动力学。图8Β示出了使用微波能量进行的反应的动力学。还示出了四次独立测量的平均值+/-SEM (误差线)。 该沙波病毒RdRp在以微波为能量来源时具有与采用加热管所产生的热量相比增强的催化效率(Keat高达5倍 ，Kcat/KM高达1.6倍)。
权利要求
1.一种以单链多核苷酸为模板合成互补RNA链的方法，所述方法包括以下步骤: 米用有效量的微波能量对含有所述模板以及一种杯状病毒科家族病毒的RNA聚合酶的混合物在RNA聚合反应条件下并在引物存在或缺席的条件下进行辐照，所述引物与所述模板杂交，其附加条件为，如果所述模板含有脱氧核糖核苷酸，该辐照在修饰的GTP，优选2’_氟代-GTP或α -硫代-GTP存在的条件下进行，以及，如果所述模板含有的脱氧核糖核苷酸在其3’端具有非脱氧-C核苷酸时，该辐照步骤在引物存在的条件下进行，所述引物与所述模板杂交，另一附加条件为，如果所述模板分别是聚腺苷酸，聚鸟苷酸或聚尿苷酸RNA或分别是polyA, polyG或polyU RNA,该福照步骤在引物存在的条件下进行,所述引物与所述模板杂交，以及如果所述模板是聚胞苷酸，所述辐照步骤在引物缺席的条件下进行，所述混合物含有的GTP分别相对ATP，CTP和UTP过量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA聚合酶是一种诺瓦克病毒，沙波病毒，水泡病毒或兔病毒的RNA聚合酶。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述RNA聚合酶是一种诺瓦克病毒HuCV/NL/Dresdenl74/1997/GE 株(GenBank Acc.No AY741811)的 RNA 聚合酶，或沙波病毒pJG-SapOl 株(GenBank Acc.No AY694184)的 RNA 聚合酶，或水泡病毒 FCV/Dresden/2006/GE 株(GenBank Acc.No DQ424892)的 RNA 聚合酶，或兔病毒 pJG-RHDV_DD06 株(GenBankAcc.N0.EF363035.1)的 RNA 聚合酶。
4.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其特征在于，所述RNA聚合酶具有选自由 SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:8, SEQ ID N0:9, SEQ ID NO: 10, SEQ IDNO: 11，SEQ ID NO: 12，SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14 组成的组中的氨基酸序列。
5.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其特征在于，所述混合物采用频率为1500MHz-3500MHz以及功率为50-1000W的微波进行辐照。
6.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其特征在于，所述混合物采用微波辐照 3s-120s。
7.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其特征在于，所述混合物含有至少一种修饰的或标记的核糖核苷酸，可选地除了修饰GTP，优选2’-氟代-GTP或α -硫代-GTP。
8.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其特征在于，所述模板是单链RNA，单链DNA，混合单链DNA/RNA或其混合剂。
9.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其特征在于，所述模板具有15-30个核苷酸的长度，优选为21-28个核苷酸，更优选为21-23个核苷酸，并且所述辐照步骤在引物缺席的条件下进行。
10.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其特征在于，所述模板的3’端具有至少一个C核苷酸,优选1-5个C核苷酸。
11.根据权利要求1-9中的任意一项所述的方法，其特征在于，在RNA聚合反应条件下进行辐照步骤之前，所述含有模板和杯状病毒科家族病毒的RNA聚合酶的混合物首先采用有效量的微波能量在rCTP作为唯一核苷酸存在的条件下进行辐照。
12.根据前述权利要求中的任意 一项所述的方法，其特征在于，所述RNA聚合酶在微波辐照下将所述双链产物分离成单链，合成与各单链互补的RNA链，可选地在引物存在的条件下，并重复分离互补链和RNA合成步骤一次或多次，可选地在引物存在的条件下。
13.—种将 一个或多个核糖核苷酸转移至单链多核苷酸模板的3’端的方法，所述方法包括:采用有效量的微波能量对含有杯状病毒科家族病毒的RNA聚合酶的混合物在rATP或rGTP或rUTP或rCTP或其修饰的或标记的类似物存在的条件下进行辐照。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述模板是单链RNA，单链DNA，混合单链DNA/RNA或其混合剂。
全文摘要
本发明涉及一种以单链多核苷酸为模板合成互补RNA链的方法，该方法包括以下步骤采用有效量的微波能量对含有所述模板以及一种杯状病毒科家族病毒的RNA聚合酶的混合物在RNA聚合反应条件下并在引物存在或缺席的条件下进行辐照，所述引物与模板杂交。本发明的另一主题涉及一种将一个或多个核苷酸转移至单链多核苷酸模板的3’端上的方法，该方法包括以下步骤采用有效量的微波能量对含有杯状病毒科家族病毒的RNA聚合酶的混合物在rATP或rGTP或rUTP或rCTP或其修饰的或标记的类似物存在的条件下进行辐照。
文档编号C12Q1/68GK103119177SQ201180045060
公开日2013年5月22日 申请日期2011年9月20日 优先权日2010年9月21日
发明者贾克斯·洛哈耶姆 申请人:里博克斯艾克斯有限公司
技术领域：
本发明涉及一种以单链多核苷酸为模板合成互补RNA链的方法，该方法包括以下步骤:采用有效量的微波能量对含有所述模板以及一种杯状病毒科家族病毒的RNA聚合酶的混合物在RNA聚合反应条件下并在引物存在或缺席的条件下进行辐照，所述引物与模板杂交。本发明的另一主题涉及一种将一个或多个核苷酸转移至单链多核苷酸模板的3’端上的方法，该方法包括以下步骤:采用有效量的微波能量对含有杯状病毒科家族病毒的RNA聚合酶的混合物在rATP或rGTP或rUTP或rCTP或其修饰的或标记的类似物存在的条件下进行辐照。
背景技术：
杯状病毒科家族病毒的RNA依赖的RNA聚合酶(以下采用“RNA聚合酶”表示)已知被用于在引物存在或缺席的条件下合成一条与RNA模板互补的RNA链(参见W02007/12329A)。使用这种RNA聚合酶在通常的温度条件下进行的RNA标准扩增大概需要2小时。US5, 350，686大致要求保护了一种大分子的酶催化修饰的微波加速方法，但是实际上仅示出了限制性内切酶的成功的微波辅助反应。US7, 537，917描述了一种微波辅助DNA的PCR扩增方法。但是，并没有提供任何数据确实示出DNA聚合酶在微波辐照下进行了成功的DNA聚合反应。特别是关于使用PCR进行的DNA扩增，仅仅扩增循环中的加热(S卩，变性)步骤(而非聚合反应步骤)被报道为适用于微波应用的步骤；参见Ferm6r et al.(2003) EuropeanJ.Pharm.Sc1.18，129-132。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种以多核苷酸为模板进行RNA聚合反应的改进方法。上述技术问题的解决方法通过描述于此和权利要求所限定的本发明的实施例提供。尤其是，令人惊讶地发现，在使用杯状病毒科家族病毒的RNA聚合酶而非实验中所研究的其他RNA聚合酶时，通过微波辐照进行以单链多核苷酸为模板(RNA，DNA，混合RND/DNA或其混合物)合成互补RNA链的复杂反应是可行的并且得到了大大增强，从而形成了本发明。因此，本发明涉及一种以单链多核苷酸为模板合成互补RNA链的方法，该方法包括:采用有效量的微波 能量对含有所述模板以及一种杯状病毒科家族病毒的RNA聚合酶的混合物在RNA聚合反应条件下并在引物存在或缺席的条件下进行辐照，所述引物与模板杂交。杯状病毒的RNA聚合酶具有(但是，其他病毒的RNA依赖的RNA聚合酶，例如来源于脊髓灰质炎病毒或丙型肝炎病毒HCV均无法应用于本发明的方法；比照以下描述的实施例)以下共同的结构特征:所述杯状病毒科家族病毒的RNA聚合酶具有“右手螺旋构象”，并且所述RNA聚合酶的氨基酸序列包括以下基序的保守区域:a.XXDYS (SEQ ID NO:1)b.GXPSG(SEQ ID NO:2)c.YGDD(SEQ ID NO:3)d.XXYGL(SEQ ID NO:4)e.XXXXFLXRXX(SEQ ID NO:5)含义如下:D:天冬氨酸Y:酪氨酸S:丝氨酸
G:甘氨酸P:脯氨酸L:亮氨酸F:苯丙氨酸R:精氨酸X:任意氨基酸在此所说的“右手螺旋构象”(“right hand conformation”)是指RNA聚合酶的三级结构(构象)如同在大多数模板依赖的聚合酶中观察的一样像具有手指，手掌和拇指的
右手一样折叠。基序“XXDYS” (SEQ ID NO:1)就是所说的A基序。该A基序通常被用于区分核糖核苷和脱氧核糖核苷。基序“GXPSG” (SEQ ID NO:2)就是所说的B基序。该B基序在杯状病毒科家族的所有代表中是保守的。基序“YGDD”(C基序，SEQ ID N0:3)代表酶的活性中心。该基序，特别是第一个天冬氨基酸残基(黑体示出，YGDD)在Mg2+/Mn2+依赖的催化中对于金属离子的配位发挥重要的作用。基序“XXYGL” (SEQ ID NO:4)就是所说的D基序。该D基序是模板依赖的聚合酶的特征序列。最后，基序“XXXXFLXRXX”(E基序，SEQ ID NO: 5)是RNA依赖的RNA聚合酶(唯一)区别于DNA依赖的RNA聚合酶的特征序列。优选地，该RNA聚合酶是一种人源的和/或非人源的致病杯状病毒的RNA聚合酶。特别优选的是诺瓦克病毒、沙波病毒、水泡病毒或兔病毒的RNA聚合酶，例如，诺瓦克病毒HuCV/NL/Dresdenl74/1997/GE 株(GenBank Acc.No AY741811)的 RNA 聚合酶，或沙波病毒pJG-SapOl 株(GenBank Acc.No AY694184)的 RNA 聚合酶，或水泡病毒 FCV/Dresden/2006/GE 株(GenBank Acc.No DQ424892)的 RNA 聚合酶，或兔病毒 pJG-RHDV_DD06 株(GenBankAcc.N0.EF363035.1)的 RNA 聚合酶。根据本发明的特别优选实施例，该RNA聚合酶是一种包括(或具有)根据SEQ IDNO: 6 (诺瓦克病毒RNA聚合酶)、SEQ ID NO: 7 (沙波病毒RNA聚合酶)，或SEQ ID NO: 8 (水泡病毒RNA聚合酶)或SEQ ID NO:9 (兔病毒RNA聚合酶)的氨基酸序列的蛋白质。本领域技术人员直接就可以制备这种RNA聚合酶，例如使用合适的表达载体和宿主菌(参照W02007/012329A)进行重组表达。为了便于RNA聚合酶在重组表达之后的纯化，该RNA聚合酶优选表达为在相应序列的N-末端或C-末端具有一个合适的标签(例如GST或(His)6_tag)。例如，组氨酸标记允许蛋白质通过镍柱或钴柱以一种已知的方式通过亲和色谱法进行纯化。带有一个组氨酸标签的RNA聚合酶的实施例的例子为包括(或具有)根据SEQID NO: 10，SEQ ID NO: 11，SEQ ID NO: 12，SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14 的氨基酸序列的蛋白质。SEQ ID NO: 10相当于具有组氨酸标签的诺瓦克病毒的RNA聚合酶。SEQ ID NOill和SEQ ID NO: 12相当于具有组氨酸标签的沙波病毒的RNA聚合酶的氨基酸序列。SEQ IDNO: 13相当于具有组氨酸标签的水泡病毒的RNA聚合酶的氨基酸序列。SEQ ID NO: 14相当于具有组氨酸标签的兔病毒的RNA聚合酶的氨基酸序列。如上所述的杯状病毒的上述RNA聚合酶能够合成与核糖核苷酸(B卩，由RNA组成或含有RNA的多核苷酸模板)或脱氧核糖核苷酸(即，由DNA组成或含有DNA的多核苷酸模板)的多核苷酸链互补的RNA链。因此，该多核苷酸模板可以是单链RNA，单链DNA，单链混合的DNA/RNA或上述片段的混合物。如果该多核苷酸模板含有DNA或由DNA组成，该微波辐照则应当在修饰的GTP，优选2’端修饰的GTP，例如2’ -氟代-GTP，或α -硫代-GTP存在的条件下进行。通过具有与模板DNA的部分序列互补的序列的引物的延伸，或者通过在引物缺席的条件下互补链的从头合成，杯状病毒的RNA聚合酶合成一条与单链多核苷酸互补的RNA链。但是，如果含有脱氧核糖核苷酸的多核苷酸模板在其3’端具有的脱氧核糖核苷酸(即单链模板的3’端的最后 一个核苷酸)不是脱氧-C核苷酸(S卩，在其3’端具有脱氧-Τ，脱氧-A或脱氧-G核苷酸),适用于本发明的杯状病毒RNA聚合酶在合成与模板互补的RNA链时要求与模板杂交的引物存在。如果如本文所限定的多核苷酸模板在其3’端由一个或多个脱氧核糖核苷酸组成或含有一个或多个脱氧核糖核苷酸(即，模板的3’端是一个DNA片段或仅仅最后一个核苷酸是脱氧核糖核苷酸)，优选该模板的3’端的最后一个脱氧核糖核苷酸是dC，更优选该模板的3’端的至少最后2个，3个，4个或5个脱氧核糖核苷酸是dC，从而提高RNA合成在引物缺席的条件下从头引发的效率。在模板由RNA组成，或其3’端由核糖核苷酸组成的情况下，如果该模板是聚腺苷酸，聚鸟苷酸或聚尿苷酸，本发明微波辐照方法中的聚合反应则要求相应引物的存在。如果该模板是聚胞苷酸，杯状病毒RNA聚合酶的RNA合成在没有引物的条件下也是可能进行的。在该实施例中，优选模板中具有提高的rGTP水平(B卩，GTP相对于其他必需的rNTPs过量，例如 2x, 3x, 4x 或 5x)。该引物如果是理想的或必需的，分别可以是特定的(杂聚的)DNA或RNA或混合DNA/RNA引物，也可能是随机的引物(DNA或RNA或混合DNA/RNA)，或者可能是同聚物引物，例如寡-dT-引物或寡-U-引物的序列。该引物的长度对于实施本发明的方法是不重要的，但是通常具有，例如约5-25个碱基，更优选为约10-20个碱基，最优选为15-20个碱基的长度的寡核苷酸引物是特别有利的。杯状病毒RNA聚合酶的性能特征的更多细节可参见W02007/012329A。与其他RNA依赖的RNA聚合酶，例如QP复制酶相比，该杯状病毒的RNA聚合酶并不要求具有对聚合酶特定的识别序列的引物来启动RNA合成。因此，本文所使用的“引物”通常是不具有该识别序列的引物，特别是，不具有RNA聚合酶的识别序列。此外，该杯状病毒RNA聚合酶不同于普通的DNA依赖的RNA聚合酶，例如T7RNA聚合酶，因为他们不需要模板中具有特定的启动子序列。该单链多核苷酸模板可能包括至少一个脱氧核糖核苷酸的序列片段，S卩，至少一个ssDNA片段，例如在模板的3’端的至少一个DNA片段。本文中的“片段”是指至少两个或更多连续的脱氧核糖核苷酸。例如，根据本发明该多核苷酸模板可以是单链分子，其5’端由核糖核苷酸起始，随后的“中间”区域为脱氧核糖核苷酸(DNA)，末端(3’端)又是核糖核苷酸。也可以是，5 ’ -RNA-DNA-3 ’或5 ’ -DNA-RNA-3 ’，或任何其他具有RNA和DNA序列的多核苷酸。根据本发明的单链多核苷酸模板的其他例子还包括主要是ssDNA，但是在其5’端和/或3 ’端，优选在其3 ’端具有一个或多个(例如，I，2，3，4，5，6，7，8，9或10 )核糖核苷酸。可选地是，根据本发明所使用的模板可以主要是ssRNA，但是在其5’端和/或3’端，优选在其3’端具有一个或多个(例如，1，2，3，4，5，6，7，8，9或10)脱氧核糖核苷酸。当然，根据本发明该单链多核苷酸模板也可能仅由ssDNA或ssRNA组成。正如上文所提到的，本发明的在其3’端具有dA，dT或dG残基的多核苷酸模板通常要求引物来通过RNA聚合酶合成互补的RNA链。但是，即使3’端不具有C核苷酸的多核苷酸序列根据本发明的方法也能有效地转录进入RNA而无需引物；特别是在这种情况下，但是并非仅限于此，该方法进行的起始步骤为:采用有效量的微波能量对含有单链多核苷酸模板和如上所述的杯状病毒RNA聚合酶的混合物，在rCTP作为唯一的核苷酸存在的条件下进行辐照，并在一定条件下使得所述RNA聚合酶添加至少一个rC (或更多例如2，3，4或5个rC)核苷酸到该模板的3’端。其后,所生成的在3’端具有一个或多个C核糖核苷酸的模板可在如上所述的RNA聚合酶的作用下进行微波驱动的RNA合成，使得所述RNA聚合酶合成一条互补的RNA链，该步骤可在引物缺席的条件下进行。但是，应当理解为在该实施例中可以使用引物，例如，如果为了将一条选定的序列引入由该RNA聚合酶生产出的RNA链中时或是其他目的时则需要引物。鉴于杯状病毒RNA聚合酶的末端转移酶活性，本发明还提供一种将一个或多个核糖核苷酸转移至如上所述的单链多核苷酸模板的3’端的方法，该方法包括:采用有效量的微波能量对含有如上所述的杯状病毒科家族病毒的RNA聚合酶的混合物在rATP，rGTP,rUTP或rCTP或其修饰的或标记的类似物存在的条件下进行辐照。根据本发明方法的一个优选实施例，由RNA聚合酶在微波辐照下生成的双链分子分离成单链，从而生成ssRNA和模板。该步骤可在热变性或化学变性或酶催化下进行，例如，能够将单链多核苷酸分离成单链的酶，例如解旋酶。但是，根据本发明特别优选的实施例，由该RNA聚合酶产生双链多核苷酸的步骤和其他分离步骤在如上所述的微波辐照下采用相同的酶进行，即，该RNA聚合酶本身，该步骤同样优选在微波辐照下进行。该步骤有效利用了杯状病毒的RNA聚合酶的链置换活性。更优选为将如上所述获得的单链再次(或进一步)与如上所述的杯状病毒RNA聚合酶在微波辐照下温浴，并在一定条件下使得该RNA聚合酶合成与所述各单链互补的RNA链。显然该RNA合成步骤和链分离可重复一次或多次，例如，大约3-40次，优选为大约5-30次，更优选为大约10-20次。根据又一优选实施例，本发明的方法包括最后的RNA合成步骤。特别是在链分离和RNA合成的重复循环中，该方法导致产物几乎是纯的dsRNA，即使该原始模板含有DNA的(一个或多个)片段或由DNA组成。正如如上概述的那样，任何进一步的链分离步骤可在热变性或化学变性或酶催化下进行，例如能够将单链多核苷酸分离成单链的酶，比如解旋酶。但是，更加优选的是，进一步的链分离可在杯状病毒RNA聚合酶的作用下进行。因此，显然根据本发明包括数个或大量链分离和RNA合成步骤的优选方法可在同一温浴反应中进行(特别是当使用不需要引物就能在如上所述的RNA聚合酶的作用下进行RNA合成的模板时)，该温育反应仅仅要求对含有模板，杯状病毒的RNA聚合酶，适当的缓冲液(如下)和rNTPs (B卩，rATP，rUTP，rCTP和rGTP，或如下所述的修饰或标记的rNTPs)的反应混合物进行微波辐照。根据本发明，术语“RNA聚合反应条件”是指条件，特别涉及实现RNA聚合酶合成与模板链互补的RNA链的缓冲液，盐和金属离子(若适用)的条件。适当的缓冲液，盐，金属离子，还原剂(若适用)和其他RNA聚合酶的条件为本领域技术人员所知，例如参见W02007/012329A。因此，该多核苷酸模板通常以例如:1_4 μ g/50 μ L反应体积使用。该三磷酸核糖核苷酸(包括进一步如下所述的可选的修饰的或标记的三磷酸核糖核苷酸)的浓度优选在0.1μπιο1/1-1μπιο1/1的范围内，例如0.4 μ mol/1。该RNA聚合酶的浓度可以是lymol/l-10ymol/L.
典型的缓冲液为:10-80mM，更优选为20_50mM HEPES, pH7.0-8.0, l_5mM，例如 3mM醋酸镁，氯化镁，醋酸锰或氯化锰和l_5mM还原剂，例如DTT。典型的终止液含有:2-10mM，优选4-8mM醋酸铵，以及50_200mM，例如150mM EDTA。单链多核苷酸，例如ssRNA模板的长度和来源通常是不重要的。该模板可以具有天然序列或人工序列，并且该模板可以是化学合成的或多种来源，例如真核、原核或病毒的总的RNA，mRNA或基因组DNA，质粒DNA，cDNA,杆粒或任何其他来源的RNA和DNA。在作为模板在本发明的方法中使用之前，双链DNA或RNA需要分别通过加热或微波辐照或化学变性分离成ssDNA或ssRNA。本发明的方法在使用RNA模板提供双链RNA产物和/或扩增ssRNA模板中是特别有用的。本发明的特别优 选实施例涉及短RNA分子用于基因沉默应用的方法，或者通过反义技术或RNA干扰，或者用于针对微小RNA或非编码RNA的特定序列的反义从而实现抑制微小RNA驱动RNA干扰(antagomirs)的目的。对于这些应用，在本发明的方法中使用的模板(优选RNA)通常具有8-45个核苷酸，例如15-30个核苷酸,优选21-28个核苷酸,更优选21-23个核苷酸。后一长度的分子对于SiRNA应用通常是特别有益的。进一步可以预期该RNA聚合酶在RNA合成中(包括末端转移酶活性)在微波辐照下可采用修饰的核糖核苷酸(除了如上所述的可选的修饰的GTP(例如2’-氟代-GTP或α -硫代-GTP))。例如，该修饰可以是用于检测RNA聚合酶的双链RNA合成产物的标记。或者可选地，该标记还可用于检测链分离之后获得的ssRNA产物。本发明中所使用的标记包括荧光基团(例如荧光素)，放射基团(例如，32P标记的核糖核苷酸)以及特异性结合对，例如生物素化的rNTPs。在本发明的特定实施例中，在RNA聚合酶活性的作用下被合并进入互补链的至少一个修饰的核糖核苷酸可以在其核糖，磷酸和/或碱基上具有化学修饰基团(其中的一个或多个)。而对于具有增强稳定性的分子，特别是RNA降解酶，特别优选的是其骨架(即核糖和/或磷酸)上具有修饰基团。本发明的方法中化学修饰的RNA产物优选具有与未修饰的ssRNA或dsRNA类似物相比增强的稳定性。核糖修饰的核糖核苷酸的优选实施例为一组类似物，其中2’ -OH选自由H，OR, R，卤素，SH, SR，NH2, NHR, NR2或CN (其中R是C1-C6烷基，烯基或炔基，卤素是F，Cl，Br或I)组成的组中的基团取代。在本发明的文中，显然术语“修饰的三磷酸核糖核苷酸”或“修饰的核糖核苷酸”还包括可能每隔几个的2’脱氧衍生物，也称作“脱氧核苷酸”。这些在其2’位具有修饰核糖的核糖核苷酸类似物的典型实施例包括:5_氨基-尿苷，2’ -氨基-2’ -脱氧尿苷，2’ -叠氮-2’ -脱氧尿苷，2’ -氟代-2’ -脱氧鸟苷和2’ -O-甲基-5-甲基-尿苷。在理想的双链产物中形成磷酸骨架修饰的核糖核苷酸的例子为硫代磷酸酯类似物。根据本发明，至少一个修饰的核糖核苷酸可选自其碱基位上具有化学修饰的类似物。这种类似物的例子包括:6_氮杂-尿苷，8-氮杂-腺苷，5-溴代-尿苷，7-去氮杂-腺苷，7-去氮杂-鸟苷，N6-甲基-腺苷，5-甲基-胞苷，假-尿苷，以及4-硫代-尿苷。上述以及其他化学修饰的三磷酸核糖核苷均为市面上可买到的产品，例如可从Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Munich, Germany or Trilink technologies, USA 购买。应当理解，该多核苷酸模板可能含有如上所述的和/或进一步为本领域熟知的一个或多个修饰的或标记的核苷酸。短模板(例如，如上所述)通常由化学合成法制备。用于提供这种单链多核苷酸模板的其他方法还包括酶法操作，例如RNA的反转录以及RNA链的后续降解，采用限制性酶对较大dsDNA分子的切割，以及采用热变性或化学变性进行的后续链分离成ssDNA，总的细胞RNA的制备，mRNA的制备等等。优选反应体积范围为20-200 μ L，优选为50-100 μ L。典型地，如上所述的缓冲液条件和其他条件的制备包括:混合 适当的储备液(通常为5χ或IOx浓缩液)，加入RNA聚合酶，模板，和双蒸水或去离子水(优选在使用之前经过去RNAse和/或DNAse)补足至理想的终反应体积。术语“有效量的微波能量”是指使用杯状病毒的RNA聚合酶，分别进行合成与单链多核苷酸模板互补的链或者将至少一个核糖核苷酸转移到单链多核苷酸的3’端的RNA聚合反应所要求的微波能量的量。对于给定模板所需要的具体的微波能量的量可由本领域技术人员通过常规的实验确定并且特别取决于模板的类型和长度。本文所使用的术语“微波能量”，“微波辐照”或“采用微波辐照”或简单的“微波”均为同义使用，涉及的电磁波谱的部分包括波长大约为0.3-30cm，频率相当于1-100千兆赫，被发现于电磁波谱的无线电和红外线之间的电磁波。生物体所吸收的电磁能量的量由该组织，细胞和生物分子的介电性能决定。为了实现本发明的目的，该微波能量的形成方式并不重要，可采用为本领域熟知的任何手段。例如，用于将微波辐照施加给根据本发明所述的反应混合物的适当手段为微波炉，该微波炉可从许多供应商那里买到，并且通常是大多数生物学实验室的标准设备的构成部分。这些微波炉通常具有大约500W-1000W的最大功率水平。即使是最小的微波炉也可以为本发明的应用提供所需要的足够的微波辐照水平，并且因此，对于输出功率可调节的微波炉，使用较小的功率设置将是十分方便的。因此，根据公开于此的本发明方法的优选实施例，该混合物的辐照所采用的微波具有大约1500-3500MHZ的频率，并且具有大约50-1000W的功率。
根据本发明的优选实施例，在较长的时间间隔中使用更小的功率设置，能够降低局部能量吸收并且最小化导致分子损害的可能性。在一个特别优选的实施例中，微波能量以一系列的间隔施加于样品上，而在“停顿”间隔中微波能量不施加于样品上。能量施加间隔和停顿间隔通常分别在1-60秒之间，能量施加间隔优选在15-60秒之间，而停顿间隔优选在0.5-5秒之间。最优选地是，能量施加间隔为大约45秒，由停顿间隔1-2秒隔开。但是，特别是取决于单链多核苷酸模板的长度，该辐照步骤可在唯一的微波能量施加(间隔)中进行，该时间周期为ls-5min，更加优选为3s-120s。当使用较短长度的模板(例如用于制备短dsRNAs，比如siRNAs的模板)时则特别优选后一较短的时间周期。特别是关于从ssRNA模板到dsRNA的制备，根据本发明已经表明本文所述的方法具有与本领域已知的温育时间相比基本更短的反应时间。通过杯状病毒的RNA聚合酶制备双链多核苷酸产物时微波辐照的应用对于制备双链RNA十分有利。正如前文所提及的，迄今为止这些反应均是在30-42° C下使用更长的温育时间进行，以及通过加热来分离双链RNA产物。但是，在这种情况下获得的dsRNA容易降解，从而使得很难获得具有理想长度的纯的dsRNA产物。与此相反，根据本发明微波能量的应用加快了 RNA聚合酶的聚合反应，从而克服了 RNA降解的缺陷。应当理解，在实施本发明的一个优选方案中，除了将装置的“功率”设置调整到最大值以下，还将采取上述措施使得输入功率随着时间分布。事实上，许多市售的微波炉可维持不变的磁控管输出功率在650-900W之间，并且可通过改变磁控管的占空比调节输入功率。设置为“I”相当于10%的占空比，设置为“9”相当于90%的占空比。最优选地是，设置为1-8，即磁控管在输出功率为700-800W的条件下的占空比为10%-80%。该总输出能量将被施加于如上所述的多个间隔，或一个间隔，相当于70-35，000瓦-秒，优选为3000-3500瓦-秒/间隔。
图1示出了反应物电泳分离之后的溴化乙锭染色非变性20%聚丙烯酰胺凝胶的照片，证明了通过沙波病毒RNA聚合酶实现了微波驱动的引物非依赖的从头引发RNA合成以及双链RNA的形成。泳道1:RNA模板。泳道2:微波辐照(800W，60s)之后模板与沙波病毒RNA聚合酶的反应混合物产生了一条与25bp dsRNA标记共迁移的带。泳道3:泳道2的产物在经过SI核酸酶处理之后的产物。该25bp产物未被SI核酸酶消化，示出了产物的双链特性。M:RNA标记，包括如图所示的分别为17bp，21bp和25bp的dsRNA以及24nt的ssRNA。图2A示出了反应物电泳分离之后的溴化乙锭染色非变性20%聚丙烯酰胺凝胶的照片，该照片说明了通过沙波病毒RNA聚合酶实现微波驱动的引物非依赖的从头引发RNA合成以及双链RNA的形成所需要的能量条件。该沙波病毒RNA聚合酶与24nt ssRNA模板在微波辐照下温育60s，功率分别为80W (泳道1)，160W (泳道2)，240W (泳道3)，320W (泳M 4), 400W (泳道 5)，480W (泳道 6)，560W (泳道 7)，640W (泳道 8)，720W (泳道 9)和 800W(泳道10)。泳道1-10分别示出了与25bp dsRNA标记共迁移的产物。M =RNA标记，包括如图所示的分别为17bp，21bp和25bp的dsRNA,以及24nt的ssRNA。图2B示出了反应物电泳分离之后的溴化乙锭染色非变性20%聚丙烯酰胺凝胶的照片，该照片说明了通过沙波病毒RNA聚合酶实现微波驱动的引物非依赖的从头引发RNA合成以及双链RNA的形成所需要的辐照时间。该沙波病毒RNA聚合酶与24nt ssRNA模板在80W的微波辐照下分别温育60s (泳道1)，30s (泳道2)，15s (泳道3)和5s (泳道4)或者在800W下分别温育60s (泳道5)，30s (泳道6)，15s (泳道7)和5s (泳道8)。泳道1-8均示出了与25bp dsRNA标记共迁移的产物。M =RNA标记，包括如图所示的分别为17bp和25bp 的 dsRNA，以及 24nt 的 ssRNA。图3示出了反应物电泳分离之后的溴化乙锭染色非变性20%聚丙烯酰胺凝胶的照片，该照片证明了当反应物暴露于微波辐照中时，沙波病毒RNA聚合酶以引物非依赖性的方式以DNA为模板从头引发RNA合成，并将2’-氟代-GMP合并引入双链DNA/RNA产物。该沙波病毒RNA聚合酶与3’端具有5个dC的24nt的ssDNA模板(泳道I)或序列相同但是在其3’端具有5个rC的ssDNA模板(泳道2)在rATP，rCTP, rUTP和2’ -氟代-GTP存在的条件下，800W微波辐照60s。含有沙波病毒RNA聚合酶和与DNA模板序列相同的ssRNA模板的反应物作为对照，微波条件相同，并且含有rATP，rCTP, rUTP和rGTP (泳道3)。双链合成产物与单链模板均如图所述。图4示出了反应物电泳分离之后的溴化乙锭染色非变性20%聚丙烯酰胺凝胶的照片，该照片证明了当反应物暴露于微波辐照中时，沙波病毒RNA聚合酶以引物非依赖性的方式以DNA为模板从头引发RNA合成，并将α -硫代-GMP合并引入双链DNA/RNA产物。该沙波病毒RNA聚合酶与3’端具有5个dC的24nt的ssDNA模板(泳道I)或序列相同但是在其3’端具有5个rC的ssDNA模板(泳道2)在rATP, rCTP, rUTP和α -硫代-GTP存在的条件下，800W微波辐照60s。含有沙波病毒RNA聚合酶和与DNA模板序列相同的ssRNA模板的反应物作为对照，微波条件相同，并且含有rATP，rCTP, rUTP和rGTP (泳道3)。双链合成产物与单链模板均如图所述。图5示出了反应物电泳分离之后的溴化乙锭染色非变性20%聚丙烯酰胺凝胶的照片，该照片证明了杯状病毒RNA聚合酶能够实现微波驱动的从头引发RNA合成并且生成双链RNA，而其他病毒的RN A聚合酶则不能。24nt的ssRNA模板分别与沙波病毒(泳道I )，诺瓦克病毒(泳道2)，水泡病毒(泳道3)，兔病毒(泳道4)，脊髓灰质炎病毒(泳道5)或丙型肝炎病毒(泳道6)的RNA聚合酶在800W的微波辐照下辐照60s。杯状病毒的RNA聚合酶(泳道1-4)产生了与25bp dsRNA标记共迁移的双链产物，而脊髓灰质炎病毒(泳道5)或丙型肝炎病毒(泳道6)的RNA聚合酶则没有产生该产物。M:RNA标记，包括如图所示的分别为17bp 和 25bp 的 dsRNA,以及 24nt 的 ssRNA。图6示出了反应物电泳分离之后的溴化乙锭染色非变性20%聚丙烯酰胺凝胶的照片，证明了沙波病毒的RNA聚合酶实现了微波驱动的从头引发RNA合成并且以ssDNA为模板生成双链DNA/RNA产物。该沙波病毒RNA聚合酶与3’端具有5个dC的24nt的ssDNA模板(泳道I)或序列相同但是在其3’端具有5个rC的ssDNA模板(泳道3)在800W的微波辐照下辐照60s。作为对照，含有该沙波病毒RNA聚合酶以及相同序列的ssRNA模板的反应物(泳道2)在与之前相同的条件下进行微波辐照。所有的反应均在rATP，rCTP, rUTP和rGTP存在的条件下进行。与25bp dsRNA标记共迁移的双链产物在泳道2和3中可见，而在泳道I中不可见，该结果表明双链产物仅仅在ssDNA模板的3’端具有rC核苷酸的条件下生成。M =RNA标记，包括如图所示的20nt，40nt和80nt的ssDNA。
图7示出了反应物电泳分离之后的溴化乙锭染色非变性20%聚丙烯酰胺凝胶的照片，证明T7DNA依赖的RNA聚合酶在微波辐照下不能进行RNA合成。该T7DNA依赖的RNA聚合酶与dsDNA模板(含有116bpl8SrRNA序列的线性化质粒)在37° C下温育2h (泳道I)或在800W下微波福照60s(泳道2)。所有的反应均在T7_Megashortscript Kit (Ambion, Inc.)推荐的条件下进行。在37° C下等温温育2h (泳道I)之后可观察到反应产物，而在微波辐照(泳道2)之后则无法观察到。图8A示出的图表反映了沙波病毒RdRp在使用加热管产生的热量下进行引物非依赖的从头引发RNA合成的酶反应的动力学。为了测定该反应动力学，该沙波病毒RdRp(SEQID N0:11)与RNA模板(5’-AUACCUAGAAUCUGACCAACCCCC-3’；SEQ ID NO: 15)—起温育。该反应以25 μ I总体积在加热管中37° C下进行。该反应混合物含有I μ g模板，7.5 μ M RdRp,各为 0.4mM 的 ATP, CTP, UTP,以及 2mM GTP, 5 μ I 反应缓冲液(HEPES 250mM, MnCl225mM, DTT5mM, ρΗ7.6)，去 RNAse-DNAse 水补足至 25 μ I 总体积。图8Β示出的图表反映了沙波病毒RdRp在使用微波能量下进行引物非依赖的从头引发RNA合成的酶反应的动力学。为了测定该反应动力学，该沙波病毒RdRp (SEQ IDΝ0:11)与 RNA 模板(5，-AUACCUAGAAUCUGACCAACCCCC-3’ ; SEQ ID NO: 15)—起温育。该反应以25 μ I总体积在160W的微波下进行。该反应混合物含有I μ g模板，7.5 μ M RdRp，各为 0.4mM 的 ATP, CTP, UTP,以及 2mM GTP, 5 μ I 反应缓冲液(HEPES 250mM, MnCl2 25mM, DTT5mM, ρΗ7.6)，去 RNAse-DNAse 水补足至 25 μ I 总体积。
具体实施例方式本发明进一步通过以下非限制性例子进行阐述。
例1:通过沙波病毒RNA聚合酶实现的微波驱动的引物非依赖的从头引发RNA合成以及双链RNA的生成沙波病毒RNA 聚合酶(SEQ ID NO: 11)与 RNA 模板(5 ’ -AUACCUAGAAUCUGACCAACCCCC-3’ ;SEQ ID NO: 15)在常规微波炉中800W下微波辐照60s。该沙波病毒RNA聚合酶以单链RNA为模板生成双链RNA (如图1，泳道2)。该生成的产物与SI核酸酶进行温育。在与SI核酸酶进行温育之后产物并没有被消化(如图1，泳道3)，说明了产物为双链的性质。所有反应均在25 μ I总体积下进行。该RNA聚合酶反应物混合含有I μ g模板，7.5 μ M RNA聚合酶，各为 0.4mM 的 ATP, CTP, UTP，以及 2mMGTP，5y I 反应缓冲液(HEPES 250mM, MnCl225mM, DTT 5mM, pH7.6)，以及去RNAse-DNAse水补足至25 μ I总体积。对于SI核酸酶的消化，SI核酸酶(250U)被加入反应液，并且反应液在30° C下混合温育lh。该产物通过电泳在非变性20%聚丙烯酰胺凝胶中分离并通过溴化乙锭染色观察。例2:通过杯状病毒RNA聚合酶实现的微波驱动RNA合成所需的微波功率和辐照时间沙波病毒RNA 聚合酶(SEQ ID NO: 11)与 RNA 模板(5 ’ -AUACCUAGAAUCUGACCAACCCCC-3’ ;SEQ ID NO: 15)—起温育。该反应以25 μ I总体积在常规微波炉中分别在80W，I60W, 240W, 320W, 400W, 480W, 560W, 640W, 720W 和 800W 下辐照 60s。在另一实验中，该反应物在同一微波炉中80W下辐照60s，30s, 15s,或5s (如图2B，泳道1_4)，或在800W下进行60s, 30s, 15s,或5s(如图2B，泳道5_8)。所有反应中均产生了预期尺寸的产物(图2A，2B)。
该反应物混合含有I μ g模板，7.5 μ M RNA聚合酶，各为0.4mM的ATP, CTP, UTP,以及 2mM GTP，5y I 反应缓冲液(HEPES 250mM, MnCl2 25mM, DTT 5mM, pH 7.6)，以及去RNAse-DNAse水补足至25 μ I总体积。该产物通过电泳在非变性20%聚丙烯酰胺凝胶中分离并通过溴化乙锭染色观察。例3:杯状病毒RNA聚合酶在微波辐照下以DNA为模板以引物非依赖的方式从头引发RNA合成，并将2’ -氟代-GMP合并引入双链DNA/RNA产物沙波病毒RNA 聚合酶(SEQ ID NO: 11)与 ssDNA 模板(5 ’ -ATACCTAGAATCTGACCAACCCCC-3’ ；SEQ ID NO: 16)—起温育或具有相同序列但是在3’端具有(rC)5基序的DNA模板(5’_ATACCTAGAATCTGACCAArCrCrCrCrC-3’；SEQ ID NO: 17)。作为对照，将沙波病毒 RNA 聚合酶与单链 RNA (5’ -AUACCUAGAAUCUGACCAACCCCC-3’ ; SEQ ID NO: 15) —起温育，该单链 RNA 具有与上述单链DNA相同的序列。所有的反应以25 μ I总体积在常规微波炉里800W下进行辐照60s。该反应物混合含有I μ g模板，7.5 μΜ RNA聚合酶，各为0.4mM的ATP，CTP，UTP，以及GTP (使用ssRNA模板作为对照反应；如图3，泳道3)或2’ -氟代-GTP (使用ssDNA模板进行反应；如图 3，泳道 I和2)，5μ I 反应缓冲液(HEPES 250mM, MnCl2 25mM, DTT 5mM, pH7.6),以及去RNAse-DNAse水补足至25 μ I总体积。该产物通过电泳在非变性20%聚丙烯酰胺凝胶中分离并通过溴化乙锭染色观察。图3 (参见泳道I和2)证明了通过沙波病毒RNA聚合酶实现了以ssDNA为模板进行的微波驱动的RNA合成以及对2’ -氟代-GMP的引入。例4:杯状病毒RNA聚合酶在微波辐照下以DNA为模板以引物非依赖的方式从头引发RNA合成，并将α -硫代-GMP合并引入双链DNA/RNA产物将沙波病毒RNA 聚合酶(SEQ ID NO: 11)与 ssDNA 模板(5 ’ -ATACCTAGAATCTGACCAACCCCC-3’；SEQ ID NO: 16)或具有相同序列但是在3’端具有(rC) 5基序的DNA模板(5，-ATACCTAGAATCTGACCAArCrCrCrCrC-3’；SEQ ID NO: 17)—起温育。作为对照，将沙波病毒 RNA 聚合酶与单链 RNA(5’-AUACCUAGAAUCU`GACCAACCCCC-3’ ; SEQ ID NO: 15)—起温育，该单链 RNA 具有与上述单链DNA相同的序列。所有的反应以25 μ I总体积在常规微波炉里800W下进行辐照60s。该反应物混合含有I μ g模板，7.5 μ M RNA聚合酶，各为0.4mM的ATP, CTP, UTP,以及GTP (使用ssRNA模板作为对照反应；如图4，泳道3)或α -硫代-GTP (使用ssDNA模板进行反应；如图4，泳道 I和2)，5μ I 反应缓冲液(HEPES 250mM, MnCl2 25mM, DTT 5mM，pH7.6)，以及去RNAse-DNAse水补足至25 μ I总体积。该产物通过电泳在非变性20%聚丙烯酰胺凝胶中分离并通过溴化乙锭染色观察。图4 (参见泳道I和2)证明了通过沙波病毒RNA聚合酶实现了以ssDNA为模板进行的微波驱动的RNA合成以及对α -硫代-GMP的引入。例5:采用杯状病毒科的不同RNA聚合酶进行的微波驱动的引物非依赖的从头引发RNA合成以及双链RNA的形成将沙波病毒RNA聚合酶(SEQ ID NO: 11)，诺瓦克病毒RNA聚合酶(SEQ ID NO:9)，水泡病毒RNA聚合酶(SEQ ID NO: 13)，兔病毒RNA聚合酶(SEQ ID NO: 14)在微波辐照下与RNA 模板(5，-AUACCUAGAAUCUGACCAACCCCC-3’ ; SEQ ID NO: 15)—起温育。所有的杯状病毒RNA聚合酶以单链RNA为模板生成双链RNA (如图5，泳道1-4)。此外，本实施例还研究了是否其他病毒(脊髓灰质炎病毒，丙型肝炎病毒)来源的RNA聚合酶同样能够在微波辐照下进行相同的反应。因此，将该脊髓灰质炎病毒RNA聚合酶和丙型肝炎病毒RNA聚合酶与相同的ssRNA模板在微波辐照下进行温育。但是，该脊髓灰质炎病毒和丙型肝炎病毒的RNA聚合酶在与用于杯状病毒RNA聚合酶的相同的条件下并不产生双链RNA (如图5，泳道5和6)。所有的反应以25 μ I总体积在常规微波炉里800W下进行辐照60s。该反应物混合含有I μ g模板，7.5 μ M RNA聚合酶，各为0.4mM的ATP, CTP, UTP,以及2mM GTP, 5 μ I反应缓冲液(HEPES 250mM, MnCl2 25mM, DTT 5mM, ρΗ7.6)，以及去 RNAse-DNAse 水补足至 25 μ I 总体积。该产物通过电泳在非变性20%聚丙烯酰胺凝胶中分离并通过溴化乙锭染色观察。例6:通过沙波病毒RNA聚合酶实现以微波驱动的引物非依赖的方式从头引发RNA合成以及DNA-RNA-双链的形成将沙波病毒RNA聚合酶(SEQ ID NO: 11)与3 ’末端具有(dC) 5基序的DNA模板(5 ’-ATACCTAGAATCTGACCAACCCCC-3’ ; SEQ ID NO: 16)，或具有相同序列但是 3’端具有(1*05基序的 DNA 模板(5，-ATACCTAGAATCTGACCAArCrCrCrCrC-3，; SEQ ID NO: 17) 一起温育。作为对照，将该沙波病毒 RNA 聚合酶与单链 RNA (5’ -AUACCUAGAAUCUGACCAACCCCC-3’ ; SEQ IDNO: 15) 一起温育，该单链RNA具有与单链DNA模板相同的序列。该沙波病毒RNA聚合酶以单链DNA为模板形成了 DNA/RNA双链(如图6，泳道2和3)，该DNA模板的3’端具有C核糖核苷酸。所有的反应以25 μ I总 体积在常规微波炉里800W下进行辐照60s。该反应物混合含有I μ g模板，7.5 μ M RNA聚合酶，各为0.4mM的ATP, CTP, UTP,以及2mM GTP, 5 μ I反应缓冲液(HEPES 250mM, MnCl2 25mM, DTT 5mM, ρΗ7.6)，以及去 RNAse-DNAse 水补足至 25 μ I总体积。该产物通过电泳在非变性20%聚丙烯酰胺凝胶中分离并通过溴化乙锭染色观察。对照例:采用T7DNA依赖的RNA聚合酶(DdRp)分别在等温条件下与微波辐照下进行RNA合成的效率对比该T7DdRp以双链DNA为模板(含有116bp的18S rRNA序列的线性化质粒，I μ g/次)，在推荐的等温温育条件37° C下温育2h或使用微波辐照(800W，60s)来进行RNA合成。所使用的试剂为T7-Megaschortscritp Kit (Ambion, Inc)。所有的反应根据操作指南进行。在等温条件下温育的产物如图7中泳道I所示。相比之下，当反应混合物采用微波辐照时则没有产物生成(800W，60s ;如图7，泳道2)。反应产物通过电泳在非变性20%聚丙烯酰胺凝胶中分离并通过溴化乙锭染色观察。上述例子和对照例证明了杯状病毒科病毒家族(杯状病毒)的RNA聚合酶在微波辐照下能够以RNA，DNA或混合RNA/DNA为模板合成互补的RNA链，而结构相关的其他病毒(脊髓灰质炎病毒，HCV)的RNA依赖的RNA聚合酶或DNA-依赖的RNA聚合酶(T7DdRp)则无法实现。例7:沙波病毒RdRp在使用微波能量时具有与通过加热管所产生的热量相比增强的RNA合成催化效率为了测量反应动力学，将该沙波病毒RdRp (SEQ ID NO: 11)与RNA模板(5，-AUACCUAGAAUCUGACCAACCCCC-3’;SEQ ID NO: 15)—起温育。所有反应均以 25 μ I 总体积进行，或在加热管中37° C下，或在微波炉中160瓦特下进行。该反应物混合含有1μ g模板，7.5μΜ RdRp，各为 0.4mM 的 ATP，CTP，UTP，以及 2mM GTP，5 μ I 反应缓冲液(HEPES250mM, MnCl2 25mM, DTT 5mM, pH 7.6)，以及去 RNAse-DNAse 水补足至 25 μ I 总体积。图 8Α示出了采用由加热管产生的热量进行的反应的动力学。图8Β示出了使用微波能量进行的反应的动力学。还示出了四次独立测量的平均值+/-SEM (误差线)。 该沙波病毒RdRp在以微波为能量来源时具有与采用加热管所产生的热量相比增强的催化效率(Keat高达5倍 ，Kcat/KM高达1.6倍)。
权利要求
1.一种以单链多核苷酸为模板合成互补RNA链的方法，所述方法包括以下步骤: 米用有效量的微波能量对含有所述模板以及一种杯状病毒科家族病毒的RNA聚合酶的混合物在RNA聚合反应条件下并在引物存在或缺席的条件下进行辐照，所述引物与所述模板杂交，其附加条件为，如果所述模板含有脱氧核糖核苷酸，该辐照在修饰的GTP，优选2’_氟代-GTP或α -硫代-GTP存在的条件下进行，以及，如果所述模板含有的脱氧核糖核苷酸在其3’端具有非脱氧-C核苷酸时，该辐照步骤在引物存在的条件下进行，所述引物与所述模板杂交，另一附加条件为，如果所述模板分别是聚腺苷酸，聚鸟苷酸或聚尿苷酸RNA或分别是polyA, polyG或polyU RNA,该福照步骤在引物存在的条件下进行,所述引物与所述模板杂交，以及如果所述模板是聚胞苷酸，所述辐照步骤在引物缺席的条件下进行，所述混合物含有的GTP分别相对ATP，CTP和UTP过量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA聚合酶是一种诺瓦克病毒，沙波病毒，水泡病毒或兔病毒的RNA聚合酶。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述RNA聚合酶是一种诺瓦克病毒HuCV/NL/Dresdenl74/1997/GE 株(GenBank Acc.No AY741811)的 RNA 聚合酶，或沙波病毒pJG-SapOl 株(GenBank Acc.No AY694184)的 RNA 聚合酶，或水泡病毒 FCV/Dresden/2006/GE 株(GenBank Acc.No DQ424892)的 RNA 聚合酶，或兔病毒 pJG-RHDV_DD06 株(GenBankAcc.N0.EF363035.1)的 RNA 聚合酶。
4.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其特征在于，所述RNA聚合酶具有选自由 SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:8, SEQ ID N0:9, SEQ ID NO: 10, SEQ IDNO: 11，SEQ ID NO: 12，SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14 组成的组中的氨基酸序列。
5.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其特征在于，所述混合物采用频率为1500MHz-3500MHz以及功率为50-1000W的微波进行辐照。
6.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其特征在于，所述混合物采用微波辐照 3s-120s。
7.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其特征在于，所述混合物含有至少一种修饰的或标记的核糖核苷酸，可选地除了修饰GTP，优选2’-氟代-GTP或α -硫代-GTP。
8.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其特征在于，所述模板是单链RNA，单链DNA，混合单链DNA/RNA或其混合剂。
9.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其特征在于，所述模板具有15-30个核苷酸的长度，优选为21-28个核苷酸，更优选为21-23个核苷酸，并且所述辐照步骤在引物缺席的条件下进行。
10.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其特征在于，所述模板的3’端具有至少一个C核苷酸,优选1-5个C核苷酸。
11.根据权利要求1-9中的任意一项所述的方法，其特征在于，在RNA聚合反应条件下进行辐照步骤之前，所述含有模板和杯状病毒科家族病毒的RNA聚合酶的混合物首先采用有效量的微波能量在rCTP作为唯一核苷酸存在的条件下进行辐照。
12.根据前述权利要求中的任意 一项所述的方法，其特征在于，所述RNA聚合酶在微波辐照下将所述双链产物分离成单链，合成与各单链互补的RNA链，可选地在引物存在的条件下，并重复分离互补链和RNA合成步骤一次或多次，可选地在引物存在的条件下。
13.—种将 一个或多个核糖核苷酸转移至单链多核苷酸模板的3’端的方法，所述方法包括:采用有效量的微波能量对含有杯状病毒科家族病毒的RNA聚合酶的混合物在rATP或rGTP或rUTP或rCTP或其修饰的或标记的类似物存在的条件下进行辐照。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述模板是单链RNA，单链DNA，混合单链DNA/RNA或其混合剂。
全文摘要
本发明涉及一种以单链多核苷酸为模板合成互补RNA链的方法，该方法包括以下步骤采用有效量的微波能量对含有所述模板以及一种杯状病毒科家族病毒的RNA聚合酶的混合物在RNA聚合反应条件下并在引物存在或缺席的条件下进行辐照，所述引物与模板杂交。本发明的另一主题涉及一种将一个或多个核苷酸转移至单链多核苷酸模板的3’端上的方法，该方法包括以下步骤采用有效量的微波能量对含有杯状病毒科家族病毒的RNA聚合酶的混合物在rATP或rGTP或rUTP或rCTP或其修饰的或标记的类似物存在的条件下进行辐照。
文档编号C12Q1/68GK103119177SQ201180045060
公开日2013年5月22日 申请日期2011年9月20日 优先权日2010年9月21日
发明者贾克斯·洛哈耶姆 申请人:里博克斯艾克斯有限公司
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