灭活的水痘带状疱疹病毒疫苗、其生产方法及用途的制作方法
专利名称：灭活的水痘带状疱疹病毒疫苗、其生产方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于预防和治疗带状疱疹的组合物和方法。更具体地，本发明涉及包含灭活水痘病毒疫苗(VZV)的疫苗组合物和用于生产所述组合物的方法。
背景技术：
水痘带状疱疹病毒(VZV)的初始感染通常在儿童和年轻成年人中引起水痘。尽管水痘的临床表现通常在没有医疗干预的情况下在一个短时间期间内解决，但是VZV可以在感染后在感觉神经元中保持潜伏持续多年。潜伏VZV的再活化和复制，经常在几十年后，可以导致带状疱疹(HZ)，通常被称为带状疱疹，通常限于单一皮片的疼痛性皮疹。这样的VZV再活化与细胞介导的免疫下降相关，其发生在老年人或免疫功能低下的那些人中(Weinbergk, Jourrml of Infectious Diseases (2009) 200:1068-77)。在一些患者中，与 HZ 相关的疼痛可以在HZ皮疹已经痊愈后持续数月甚至数年，被称为疱疹后神经痛(PHN)的并发症。活减毒疫苗(ZOSTAVAX ,Merck & C0.，Inc.，Whitehouse Station, NJ)目前可用于在健康老年患者中预防带状疱疹(美国专利号6，214，354和5，997，880)。该疫苗已经显著降低了 HZ在免疫活性的患者群体中的不利影响(Oxman,丽，Clin InfectDis.(2010) 51 (2) :197-213; Sanford和Keating, Drugs Aging (2010) 27(2):159-76;Oxman等人，N.Engl.J.Med.(2005) 352:2271-83)。然而，活减毒疫苗可能不适用于免疫功能低下的患者。免疫功能低下的个体，包括患有血液恶性肿瘤的患者、经历免疫抑制治疗的患者、接受造血干细胞移植(HCT)或实体器官移植(SOT)的患者、HIV感染的患者和具有自身免疫性疾病的患者，具有相对于一般群体更高的发展HZ的发病率。此外，这些患者群体处于发展严重和威胁生命的并发症的增加的风险中(Gourishankar等人.(2004)Am J.Transplant 4: 108—115， Ragozzin0.(1982) Medicine (Baltimore) 61:310-316, Wung 等人.(2005) Am J Med 118: 1416.e9-1416.el8, Dworkin & Schmader(2003) Clinical Infectious Diseases 36: 877-882，Gebo 等人.(2005) J AcquirTmmune Defic Syndr 40: 169-174，Mattiuzzi 等人.(2003) Clinical Cancer Research9: 976-980, Dworkin 等人.(2003) Neurology 60: 1274-1283.)如脑膜脑炎(Tauro 等人.(2000) Bone Marrow Transplant 26: 795-796)、横贯性脊髓炎、视力损伤(Walton等人.(1999) Bone Marrow Transplant 23: 1317-1320)、肺炎(Wacker等人.(1989) BoneMarrow Transplant 4: 191-194)、肝炎(Rogers等人.(1995) Bone Marrow Transplant15: 805-807; Schiller等人.(1991) Bone Marrow Transplant 7: 489-491)、细菌重复感染、皮肤疤痕和缺陷(Schuchter等人.(1989) Blood 74: 1424-1427)。尽管在免疫功能低下的个体中存在与HZ相关的发病率和死亡率的较高风险，该群体不适合用针对HZ的活减毒疫苗如ZOSTAVAX 接种疫苗。因此，对于在免疫功能低下的患者群体中对于防止HZ或降低HZ或相关并发症的严重度和持续时间安全且有效的疫苗有重大的需要。关于免疫功能低下患者的安全担忧已经导致研究人员研究使用针对病毒病原体的非复制型疫苗如亚单位疫苗、病毒样颗粒疫苗和灭活的完整疫苗。许多批准的灭活疫苗含有用福尔马林灭活的病毒，包括甲型肝炎、脊髓灰质炎和日本脑炎疫苗。对于HZ，已经提示，通过热灭活VZV或通过使用亚单位疫苗可以开发对于免疫功能低下受试者的更安全的疫苗(Cohen, J.1., (2008) J.1nfect.Dis.197(Suppl 2): S237-S241)。Redman 等人(J.1nfectious Diseases (1997) 176:578-85)描述了通过在 50°C加热而灭活的并导致
≤1.2 pfu/0.5 mL的感染性病毒含量的灭活VZV疫苗。对于待施用于免疫功能低下的患者的产品，该感染性水平是不希望的。美国专利号6，214，354和5，997，880还提到了使用灭活VZV疫苗的潜能并公开了生产并测试热处理的疫苗的例子。如果开发了灭活VZV的方法，所述方法导致在免疫功能低下的患者中安全并有效(即缺乏剩余感染性但保留非灭活样品的免疫原性和抗原性)的VZV样品，这将满足重大的医疗需要。发明概述
本文已经显示，可以用Y辐射灭活VZV样品，使得样品中的VZV感染性在检测不到的水平；然而，相对于没有灭活VZV样品，通过本文描述的方法灭活后的VZV的免疫原性和/或抗原性没有显著的损失并且结构没有显著的变化。在一个方面，本发明提供了灭活的水痘带状疱疹病毒(VZV)，其中所述VZV的感染性是检测不到的，其中当施用于患者时灭活VZV诱导针对VZV的免疫应答。还提供了药物组合物/疫苗，其包含治疗有效量的灭活VZV和药学上可接受的载体。本发明的组合物是液体或在冷冻状态，例如，冻干的。在本文描述的组合物的一些实施方案中，用Y辐射灭活VZV。在另一个方面，本发明提供了制备灭活VZV疫苗的方法，所述方法包括用约5kGy-约50kGy的Y辐射来Y辐射包含VZV的样品。在优选的实施方案中，Y辐射源是6°Co，虽然本领域中已知的其他同位素也可以用于这方面。在本文所公开的制备方法的一些实施方案中，在辐射前将样品冻干。在可替代的实施方案中，液体容积物暴露于Y辐射，而不首先冻干。本发明还提供了治疗HZ或与VZV再活化相关的其他疾病或针对其免疫的方法，所述方法包括将疫苗或药物组合物施用于受试者，所述组合物包含治疗有效量的灭活VZV和药学上可接受的载体，其中所述VZV是通过Y辐射灭活的。在本文描述的治疗方法的一些实施方案中，所述组合物/疫苗的施用途径是皮下的或肌肉内的。在本发明的这个方面的特定实施方案中，患者是50岁或更大的和/或免疫功能低下的。如说明书通篇和随附的权利要求中所使用的，单数形式“一 (a) ”，“一 (an) ”和“该(the) ”包括复数参考，除非上下文另有清楚指明。如说明书通篇和随附的权利要求中所使用的，下列定义和缩写适用:
术语“治疗”是指治疗性处理和预防或防止措施。需要治疗的个体包括已经患有病症的那些个体，以及易于患有病症的那些个体或其中病症待防止的那些个体。用本发明的灭活VZV治疗患者包括下列中的一个或多个:在患者中诱导/增加针对VZV的免疫应答，在已经感染水痘或接受活VZV疫苗的患者中降低VZV再活化的可能性，防止或降低发生HZ和/或与VZV再活化相关的其他疾病或并发症如PHN的可能性，降低HZ和/或与VZV再活化相关的其他疾病或并发症如PHN的严重性或持续时间。
术语“治疗有效量”是指足以产生所需效果的足够的疫苗组合物，所述效果包括但不限于:在患者中诱导/增加针对VZV的免疫应答，在已经感染水痘或接受活VZV疫苗的患者中防止、改善或消除VZV再活化，防止HZ和/或PHN，降低HZ和/或PHN的严重性或持续时间。本领域技术人员认识到，这种水平可能变化。术语“免疫应答”是指细胞介导的(T细胞)免疫应答和/或抗体(B细胞)应答。术语“患者”是指待接受本文描述的灭活VZV疫苗或药物组合物的任何人,包括有免疫能力的和免疫功能低下的个体。如本文所定义的，“患者”包括已经感染水痘(通过自然感染或接种疫苗)的那些患者。术语“容积物”是指包含多于一个剂量的疫苗的液体制剂或组合物。关于特定疫苗制剂或组合物的感染性的术语“检测不到的水平”是指该制剂或组合物包含每mL样品的050感染单位或噬斑形成单位(“PFU”)的感染性VZV病毒，优选<0.040 PFU/mL,<0.030 PFU/mL,<0.020 PFU/mL,<0.015 PFU/mL,<0.010 PFU/mL,< 0.009PFU/mL,或 I 0.008 PFU/mL,更优选 I 0.007 PFU/mL, < 0.006 PFU/mL, < 0.005 PFU/mL,
<0.004 PFU/mL, < 0.003 PFU/mL，更优选 I 0.002 PFU/mL，或 10.001 PFU/mL。可以使用，例如，如 水痘噬斑测定如实施例1中描述和Krah等人ij.Virol.Methods (1990)27:319-26)中进一步描述的测定来确定特定样品的PFU。也可以通过如实施例1中描述的免疫染色法确认样品的感染性。附图简述
图1显示了 Y福射的冻干VZV的灭活动力学(log PFU/ml v.福射剂量,参见实施例4)。使用6tlCo Gammacell 辐射器用不同水平的6tlCo射线辐射VZV小瓶。在MRC-5细胞中使用水痘噬斑测定确定每辐射剂量(Gy)的每小瓶的剩余的PFU/mL。观察到的数据点显示为黑色菱形(“观察值”)，通过测定可测量的最大数据显示为灰色菱形(“〈=值”)。图2显示了 Y辐射的VZV容积物的灭活动力学(针对辐射时间的log pfu/mL滴度，参见实施例4)。使用不同水平的6tlCo射线辐射VZV容积物。使用MRC-5细胞在水痘噬斑测定中分析辐射的容积物的剩余感染性。图3A-3F显示了如通过VZV IFNy ELI SPOT测定测量的在不同的条件下灭活VZV后的VZV应答(SFC/106 PBMC)(参见实施例5)。显示的数据是对于5份热处理的VZV容积物制剂和2份Y -辐射的VZV容积物制剂的6份供体PBMC样品(图A-F)。还显示了对于来自与上文使用的那些相同的容积物制剂的活(未处理)VZV样品和通过用UV光处理灭活VZV批次(VZV批号96.07)的VZV应答。图4A-4C显示了如通过冷冻EM评价的VZV病毒颗粒的图(参见实施例6)。显示了未处理的(图4A)、用25 kGy辐射的(图4B)和用50 kGy辐射的(图4C)冻干样品。图5显示了小鼠免疫原性研究的结果，在该研究中，在VZV ELISA测定中评价对于一组使用各种灭活方法(参见实施例8)生成的灭活VZV制剂的VZV滴度(IgG应答)。显示了对于每只小鼠的调整的VZV滴度(VZV滴度减去MRC-5滴度)连同几何平均滴度。还显示了被认为是异常值的来自热处理冻干组中2只小鼠的结果。图6显示了如实施例9中描述的在接受热处理VZV疫苗(N = 65)或Y-辐射VZV疫苗(N = 63)的人疫苗受体中通过时间点的VZV gpELISA抗体应答的统计学分析。图7显示了如实施例10中描述的在接受Y辐射的VZV疫苗B (16-25 kGy, N =64)或Y辐射的疫苗C(25-50 kGy, N=65)的人疫苗受体中通过时间点的VZV gpELISA抗体应答的统计学分析。发明详述
本文已经显示，可以用Y辐射灭活大量或冻干的VZV样品，使得样品中的VZV感染性在检测不到的水平(例如，本文描述的灭活VZV样品的感染性是10.001 PFU/mL)。可以将本文描述的方法生产的灭活VZV与药学上可接受的载体配制，以产生用于本发明的治疗/免疫方法中的药物组合物或疫苗。相对于没有灭活的VZV样品，在通过本文描述的方法灭活后，VZV的免疫原性和/或抗原性没有显著损失并且结构也没有显著变化。因此，当本发明的药物组合物施用于患者时，与包含相同量的没有灭活的VZV的对照样品引发的免疫应答相比，组合物引发的免疫应答没有显著不同。如本文所使用的，与未灭活的对照样品“没有显著不同的”灭活样品引发的免疫应答与对照样品的差异为约50%或更小，更优选约40 %或更小，约30 %或更小，甚至更优选约20 %或更小，15 %或更小，10 %或更小，或5 %或更小。可以在临床试验中在适当的动物模型或人群体中，例如，通过测量以下参数中的一个或多个而测量灭活和对照样品引发的免疫应答= (I)VZV特异性应答细胞频率(如Calandra等人，WO 94/002596中描述，(2)抗VZV细胞毒性T细胞(CTL)，或VZV特异性⑶8+细胞，(3)抗VZV辅助T细胞，或VZV特异性⑶4+细胞，(4)抗VZV特异性抗体的水平，或(5)淋巴因子如干扰素或白介素的水平。用于测量免疫应答的技术是本领域中是已知的，包括但不限于:T细胞应答测定法，效价测定法，VZV IFN Y ELISP0T测定法，和ELISA测定法。为了确定本发明的和本文描述的方法制备的疫苗/药物组合物引发的免疫应答的足够性、并且还有灭活疫苗的效力，测量人志愿者/受试者的临床试验中的临床结果以测量，例如，个体中HZ的持续时间或严重性的降低和/或PHN的持续时间的降低至发展带状疱疹后少于I个月的期间，在患者群体中带状疱疹的发病率的降低，在统计水平上，低于在一般群体中发现的或同样在危险中或免疫功能低下的个体的发病率可能是有用的。如上所述，本发明显示可以将VZV制剂灭活至检测不到的水平，同时仍保留相似非灭活VZV的抗原性和免疫原性。因此，本发明的一个方面提供了灭活VZV，其中所述VZV的感染性是检测不到的，其中当施用于患者时灭活VZV诱导针对VZV的免疫应答。本领域技术人员可以容易地确定用作治疗有效量的VZV的适当量的VZV抗原。这样的量将根据预期用途或其他因素如特定患者群体而变化。在本文描述的方法和组合物的一些实施方案中，VZV的量是约I至约10 VZV抗原单位/剂量，I VZV抗原单元粗略等同于I μ g纯化的VZV蛋白。在特定实施方案中，组合物中存在的VZV抗原的量是约2至约8 VZV Ag单位/剂量，或约3至约6 VZV Ag单位/剂量。可以用适当的抗原测定法，例如，本文实施例2中描述的竞争性ELISA来确定抗原的量。本领域技术人员可以确定其他适当的测定法以测量样品中抗原的量。
本文还提供了药物组合物，其包含治疗有效量的上述灭活VZV和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。用于本发明的组合物中的药学上可接受的载体包括在采用的剂量和浓度对患者无毒的任何相容试剂，如水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇、缓冲剂等及其组合。载体还可以含有额外组分，如稳定剂、增溶剂、等渗调节剂，如NaCl、MgCl2或CaCl2等，表面活性剂及其混合物。本发明还提供了多剂量组合物，其含有多于一个剂量的灭活VZV、抗微生物防腐剂和药学上可接受的载体，所述防腐剂防止在引入注射器后对包含组合物的小瓶的无意的微生物污染。可以将这样的多剂量组合物在预定量的时间已经经过后多于一次提供给一位患者，或提供给多于一位患者。在本发明的一些实施方案中，组合物是液体容积物，其含有多于一个剂量的灭活VZV0在可替代的实施方案中，组合物是冻干的。冻干方法是本领域已知的。本发明还涵盖的是用适当稀释剂如注射用无菌水或注射用抑菌水重构的冻干制剂。Y辐射通常用于对用于医疗应用中的装置和设备消毒。它也可以用于杀死生物制品如血液产品和抗体制剂中任何潜在的病原体。对于这些用途，灭活生物体而不考虑维持生物体的功能。描述通过Y 辐射灭活病毒的文献来源是有限的。Rosen 等人(7/ .J.Racliat.Biol.52:795-804 (1987))评价了在 6ciCo 射线处理后单纯疱疹病毒完整病毒颗粒的噬斑形成能力的存留和纯化的基因组的DNA分子的损伤。该研究没有评价辐射后病毒的抗原性或免疫原性。由Elliott等人的另一项研究(J.Clin.Micobiol.16:704-708 (1982))评价了用 6ciCo 射线对拉沙热病毒(Lassa)、马尔堡病毒(Marburg)和埃博拉病毒(Ebola)的灭活。对于拉沙热病毒、埃博拉病毒和马尔堡病毒观察到灭活的线性动力学，并且通过使用6tlCo射线的Y辐射实现了病毒灭活。Elliott等人观察到，与液体状态相比，对于在冷冻状态下灭活病毒需要更大剂量的辐射。如Rosen等人，该研究未能确定Y辐射后病毒的抗原性或免疫原性。Alsharifi等人(W02010/012045)描述了使用Y辐射来灭活流感病毒(来自正粘病毒科的RNA病毒)来作为疫苗。在本文描述的发明中显示，Y辐射可以将VZV病毒制剂的感染性降低到检测不到的水平，同时保留了未灭活对照的抗原性、免疫原性和结构特征。因此，在本发明的优选实施方案中，通过Y辐射将VZV灭活，可以通过暴露于适当同位素，如6°Co、137铯、99锝或99mTc而将Y辐射递送至VZV。在优选的实施方案中，通过暴露于6tlCo射线而将Y辐射递送至VZV。用于灭活VZV的Y辐射的量是约5至约50千戈瑞(kGy)的Y辐射。戈瑞(Gy)是吸收剂量的标准单位，I戈瑞等于I焦耳/千克(100拉德)的吸收剂量。本领域技术人员将意识到，应改变暴露于样品的辐射量和时间量以达到期望的辐射吸收剂量(剂量=积分通量(Huence)X时间)。本领域技术人员也能够根据样品存储于其中的容器的大小改变样品暴露的辐射量，使得将适当的辐射剂量递送至整个样品，而不过度暴露样品部分，例如，最接近放射性源的部分。在本文描述的本发明的方法和组合物中的一些实施方案中，用于灭活VZV的Y辐射量是约25kGy或更低。在可替代的实施方案中，Y辐射量的范围是约5 kGy至约40 kGy,约 5 kGy 至约 35 kGy,约 5 kGy 至约 30 kGy,约 5 kGy 至约 25 kGy,约 5 kGy 至约 20 kGy,约 5 kGy 至约 10 kGy,约 10 kGy 至约 50 kGy, 10 kGy 至约 40 kGy,约 10 kGy 至约 35 kGy,约 10 kGy 至约 30 kGy,约 10 kGy 至约 25 kGy,约 10 kGy 至约 20 kGy,约 15 kGy 至约 50kGy,约 15 kGy 至约 40 kGy,约 15 kGy 至约 35 kGy,约 15 kGy 至约 30 kGy,约 15 kGy 至约25 kGy，约 15 kGy 至约 20 kGy。
本发明还提供了如上所述的药物组合物和产生所述组合物的方法，其中所述组合物是液体容积物，用于灭活VZV的Y辐射量是约5kGy至约IOkGy,或约5kGy约12.5kGy。在其他特定实施方案中，组合物在Y辐射前是冻干的，在这样的实施方案中，Y辐射量是约5kGy至约25kGy或约15kGy至约25kGy。本文显示,对于用Y福射灭活的VZV观察到线性灭活动力学,这对于允许构建灭活模型，即可靠地估计包含灭活VZV的样品中的剩余感染性的水平具有显著益处。对于热处理灭活VZV没有观察到这样的线性灭活动力学。kieb等:K ^iologicals (2002)30:207-216和沿OfflaieriaJ1S (2005) 26:2033-2042)描述了通过Y辐射灭活病毒的两种特定机制，其支持对于VZV观察到的线性灭活动力学。第一种机制是“光子将能量沉淀进目标的直接结果”。这种直接能量转移导致“外层电子从分子的错位和共价键断裂”。第二种“间接”机制是通常通过辐射与水分子和氧的相互作用产生的对自由基和活性氧种类的化学攻击的结果。在本文描述的组合物和方法的特定实施方案中，在用Y辐射灭活前冻干VZV;因此，不可能与水分子有太多相互作用，因为水在冻干过程中已从产物中除去。Redman 等人 ij.1nfectious Diseases (1997) 176:578-85)描述了通过加热至50°C而灭活的并导致 1.2 pfu/0.5 mL的感染性病毒含量的灭活VZV疫苗。显示Redman及其同事们描述的热处理疫苗在安排经历自体BMT或外周血干细胞输注或其他BMT的24位患者中降低了与VZV再活化相关的疾病严重性。该感染性水平不适合于所有患者，如免疫功能低下的那些患者。此外，使用热处理灭活VZV的方法需要很长时间期间以达到低水平的感染性，这是低效的并且不是成本合算的。为此，本发明提供了灭活VZV和包含所述灭活VZV的药物组合物/疫苗，其中所述VZV的感染性是检测不到的水平，即 ο.050 PFU/mL，与以前公开的疫苗相比，所述灭活VZV组合物对于治疗和/或预防HZ或与VZV再活化相关的疾病更安全，且适合于更高效的生产过程。本发明的灭活VZV在灭活后保留了未灭活VZV对照的结构物理特征、免疫原性和抗原性。在一些实施方案中，感染性为 0.040 PFU/mL,<0.030 PFU/mL或020 PFU/mL。本发明还提供了实施方案，其中感染性单位数为 Ο.015 PFU/mL, <0.010 PFU/mL,< 0.009 PFU/mL或￡ 0.008 PFU/mL。在可替代的实施方案中，VZV感染性为￡ 0.007 PFU/mL, < 0.006PFU/mL, < 0.005 PFU/mL, < 0.004 PFU/mL 或 I 0.003 PFU/mL。在另外可替代的实施方案中，感染性为 <0.002 PFU/mL 或 <0.001 PFU/mL。在本文提供的组合物和方法的一些实施方案中，使用水痘噬斑测定如实施例1中描述和Krah等人(J.Virol.Methods (1990) 27:319-26)中进一步描述的测定来确定样品的感染性(PFU)。本领域技术人员将意识到，其他方法也用于确定VZV样品或组合物的感染性，并且可用于代替水痘噬斑测定。任何VZV株可以用于本文描述的组合物和方法中，包括野生型水痘株，或减毒株如Oka毒株，如美国专利3，985，615中描述并且可从美国典型培养物保藏中心(保藏号VR-795 , ATCC, Manassas, VA)获得的。Oka毒株最初从一位具有自然水痘感染的健康男孩获得并在人胚肺细胞中传代。 它适应于在豚鼠胚细胞培养物和人二倍体肺成纤维细胞培养物(例如MRC-5细胞)中生长。在本文描述的组合物和方法的优选实施方案中，VZV是Oka毒株或Oka毒株衍生物,如Oka/Merck VZV毒株。如本文使用的,“Oka毒株衍生物”是通过以下过程获得的毒株:将Oka毒株在适合细胞类型中进一步传代以充分使毒株减毒，以便可用作，例如，活减毒疫苗。在本文描述的本发明的方法和组合物中，在施用于患者前用Y辐射灭活活或减毒的VZV如Oka毒株及其衍生物。本文还提供了制备灭活VZV的方法,所述方法包括用约5kGy至约50kGy的Y福射来Y辐射包含VZV的样品。在本发明的该方面的优选实施方案中，通过将样品暴露于6tlCo射线而将Y辐射提供给样品。在本发明的该方面的特定实施方案中，Y辐射量是如上讨论的。本发明还提供了通过本文描述的方法产生或获得的灭活VZV。另外提供了疫苗，其包含治疗有效量的通过本文描述的方法产生的灭活VZV和药学上可接受的载体。在一个方面，本发明还提供了用于在患者中治疗、预防带状疱疹和/或与VZV再活化相关的其他疾病或并发症(例如疱疹后神经痛)、针对其免疫或降低其可能性的方法，所述方法包括将治疗有效量的疫苗或药物组合物施用于患者，所述组合物包含灭活VZV和药学上可接受的载体，其中所述VZV是通过Y辐射灭活的。由于VZV再活化与细胞介导的免疫力下降相关，本文的治疗方法可用于在患者中加强细胞介导的免疫应答，所述患者以前通过自然感染或接种疫苗暴露于水痘，但其免疫应答由于年龄渐增和/或免疫系统功能障碍而已经降低。在上述的治疗/免疫方法中，可以通过任何合适途径，包括但不限于下列方式，将包含灭活VZV的药物组合物施用于患者:皮下注射、皮内引入、通过皮肤压入(impressionthough the skin)或其他施用方式如静脉内、肌肉内或吸入递送。在本文描述方法的优选实施方案中，施用模式 是皮下或肌肉内。上面描述的方法和组合物可用于在免疫活性和免疫功能低下的患者群体中预防HZ和/或PHN，或减少其严重性或持续时间，所述免疫活性和免疫功能低下的患者群体包括但不限于已经经历造血干细胞移植(HCT)或实体器官移植(SOT)的健康患者和免疫功能低下的患者，HIV感染的患者，患有自身免疫性疾病的患者，患有血液癌症的个体；接受跨越广泛范围的实体肿瘤恶性肿瘤的化疗的个体；接受跨越广泛范围的病状(包括类风湿关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)、克罗恩氏病、牛皮癣和多发性硬化症)的长期免疫抑制治疗的患者。在本文描述方法的一些实施方案中，将灭活VZV疫苗施用于患者,所述患者处于由于疾病(例如，上文提到的疾病)导致的HZ的更高风险，或疾病(如血液恶性肿瘤、实体肿瘤恶性肿瘤或化疗、自身免疫性疾病)的治疗中。在上面描述的任何方法和组合物的一些实施方案中，患者是50岁大或50岁以上，并且可以是健康或免疫功能低下的。在其他实施方案中，患者是55岁大或55岁以上，60岁大或60岁以上，65岁大或65岁以上，70岁大或70岁以上，或75岁大或75岁以上。在可替代的实施方案中，患者是约50至约55岁大，约55至约60岁大，约60至约65岁大，或约65至70岁大。在本文描述方法的另外实施方案中，疫苗或药物组合物与其他通常施用的“护理标准”疗法；或与其他用于靶向患者群体的疫苗(包括，例如，肺炎球菌疫苗如PNEUM0VAX 23 (PN23, Merck & C0., Inc.)、乙型肝炎(HBV)疫苗如 RECOMBIVAX HB 或 ENGERIX-B (GlaxoSmithKline Biologicals)和流感疫苗)伴随地施用。在本文提供的治疗/预防方法的特定实施方案中，所述方法进一步包括允许适当预定量的时间经过，并将一个或多个额外剂量的药物组合物施用于患者。在所述实施方案中，可以在已经经过适当量的时间后将一个额外剂量施用于患者，可替代地，两个、三个或四个额外剂量，每个在已经经过适当量的时间后施用。在一个示例性实施方案中，将3或4个剂量作为给药方案的部分施用于患者，所述给药方案在一段时间正确分开。本领域技术人员将意识到，剂量之间的时间量可能根据患者群体、疫苗剂量和/或患者依从性而变化。在一个示例性实施方案中，在将每个剂量施用于患者之间允许经过约3周、约I个月、约6周、约2个月或约3个月或更长的时间期间。在一个特定实施方案中，将疫苗施用于患者，所述患者在移植前(例如，移植前3周、I个月或2个月)经历移植，并且将额外一个或多个剂量在移植后适当时间(例如，移植后3周、I个月或2个月)给予患者，每个剂量之间经过预定量的时间。本文提到的所有出版物通过引用并入，其目的为描述并公开可以与本发明关联使用的方法和材料。本文任何内容均不被解释为承认本发明无权凭借先前发明早于这样的公开内容。已经参照附图描述了本发明的优选实施方案，应当理解的是，本发明不限于那些精确实施方案，并且在不背离如随附权利要求定义的范围或精神的情况下，本领域技术人员可以在其中影响各种变化和修改。下列实施例说明但非限制本发明。材料和方法 实施例1 水痘噬斑测定
用Krah等人(7； Virol Methods (1990) 27:319-326)描述的液体覆盖操作测量水痘带状疱疹病毒(VZV)制剂的感染性滴度。如下进行测定:以600，000细胞/5 mL体积的具有100 mg/L半乳糖、50 ug/mL新霉素、2 mM L-谷氨酰胺的BME (具有Hank氏平衡盐溶液的基础培养基Eagle)将MRC-5 (人二倍体肺成纤维细胞)细胞接种在60_mm组织培养板中，并在5% 土 1% CO2潮湿气体中在35土 1°C孵育。孵育24-56小时后，细胞达到50-80%汇合，并用于噬斑测定。通过抽吸除去细胞生长培养基，用在适当稀释剂如PGS稳定剂(具有蔗糖和水解明胶的PBS)中稀释的VZV溶液的100 μ L等分试样感染细胞。允许细胞在5% 土 1% CO2潮湿气体中在35土 1°C贴壁彡I小时。然后将用5mL体积的维持培养基(具有Earle氏盐的最低必需培养基(MEM)，2 %热灭活的胎牛血清，50Pg/mL新霉素和2 mML-谷氨酰胺)覆盖培养物，并返回在5% 土 1% CO2潮湿气体中在35土I °C孵育6-7天用于噬斑产生。然后从板抽吸培养基，通过用在乙醇、I %乙酸中0.2% (w/v)考马斯亮蓝R-250的溶液染色细胞而使噬斑可视化。噬斑计数为3-5块重复板的平均值，并乘以稀释系数(测试病毒的相应稀释度的倒数)和接种体积校正因子(10，从0.1mL调整至I mL),以提供曬斑形成单位/mL(PFU/mL)。鉴于迫切需要确信不存在灭活样品的假阳性PFU结果(其中由于单层的无意刮伤或由于存在细胞聚丛，噬斑样点可能出现在用于噬斑测定的细胞单层中)，开发免疫染色方法并应用以验证计数为斑块的灶(foci)确实是VZV感染的细胞灶(VZV噬斑)。简而言之，在标准噬斑测定中用考马斯亮蓝染色后，具有可见噬斑的培养物用在PBS，0.05% Tween20中稀释的多克隆抗VZV血清孵育，并在35°C孵育I小时。细胞用PBS，0.05% Tween 20洗涤以去除未结合抗体，使 用过氧化物酶缀合的山羊抗人IgG抗体和当与过氧化物酶反应时发生沉淀物的过氧化物酶底物(二氨基联苯胺溶液)检测结合的抗体。在含有VZV的灶周围发生棕色沉淀物，除了用考马斯亮蓝染料观察到的那些之外没有检测到任何额外噬斑。因此,使用抗VZV —级血清、过氧化物酶缀合的抗一级种类抗体和过氧化物酶底物的组合的这种免疫染色方法提供了验证灭活样品中疑似噬斑是否确实代表剩余的感染性VZV的方法。实施例2
竞争性VZV抗原ELISA和直接结合VZV抗原ELISA测定
使用两种抗原测定形式表征并定量VZV抗原。在选择研究中使用竞争性抗原ELISA，其模拟用于估计VZV商业化产品中的VZV抗原的测试并利用单一多克隆血清来检测VZV抗原。为了提供Y辐射或其他灭活处理后VZV抗原的反应性的额外表征，开发并应用直接结合ELISA，其中将测试样品直接吸附至微量滴定ELISA板，然后使用单克隆或多克隆抗体检测。用于VZV抗原定量的竞争性ELISA
简而言之，通过将来自测试样品的VZV抗原与固定量的多克隆抗VZV血清在溶液中孵育而进行该测定。允许剩余的游离抗体(未结合抗原)结合至在ELISA微量滴定板上固定的标准VZV抗原。能够结合板的抗体的量与测试样品中的抗原量成反比。通过与酶联抗人抗体和适当底物反应以提供分光光度法定量的有色产物而定量结合板的抗体。测试程序包括以下步骤:(I)用来自VZV感染或未感染的MRC-5细胞的糖蛋白(gps)包被ELISA板，并用1% (w/v)牛血清白蛋白过量包被以降低抗体非特异性吸附至板。
(2)测试VZV抗原 稀释在聚丙烯微管中的PGS稳定剂中。包括已知抗原滴度的VZV抗原制剂作为对照。样品通常通过系列1: 1.25倍稀释而稀释以包括范围为2.6至0.9抗原单位/mL的抗原浓度。使用VZV标准品的稀释系列来生成用于测量测试样品中抗原的标准曲线。
(3)人抗VZV血清稀释在PGS稳定剂中至期望的最终稀释度的2倍。(4)将300μ 体积的稀释抗原分配进聚丙烯微管中，与300 PL稀释的抗VZV血清混合，并在35-37°C孵育15-30分钟。使用抗VZV血清加稀释剂(无抗原)作为对照。(5)将来自每份血清-抗原混合物(和对照)的100 μ 整分试样加入2个一式两份的VZV gp包被孔和2个MRC-5 gp包被孔中。(6)板在35-37°C孵育15-30 min以允许游离抗体(未与溶液中的测试抗原复合)结合在板上固定的gp抗原。(7)通过洗涤除去未结合抗体，并且孔接受碱性磷酸酶缀合的山羊抗人IgG抗体溶液以检测结合的人抗体。(8)在35-37°C孵育15-30 min后，通过洗涤除去未结合的缀合物。通过在35-37°C与对硝基苯基磷酸盐底物孵育10-15 min而检测结合的缀合物。(9)通过加入50 μ 3 M NaOH而终止底物反应后，用微孔板分光光度计定量显色(在405nm处的0D)。测试计算和解释包括以下步骤:(I)对重复的VZV和MRC-5 gp包被孔的各自重复的OD值取平均值。根据经验已知，MRC-5 OD在不同的样品和稀释物之间是一致的。因此，通常对测试的整个组的MRC-5 gp OD值取平均值，并用来校正一级抗体的非特异性结合(抗VZV血清)。从各自平均的VZV gp OD减去平均的MRV-5 gp OD以提供VZV特定(Λ 0D)值。(2)产生用于测量抗原量的标准曲线:将标准曲线△( 值针对已知抗原浓度(VZV抗原单位/mL)作图。将数据输入适当的图形程序中，鉴定该曲线的线性部分，获得对于该线性曲线的“线性拟合公式”(y=a+bx)。(3)计算测试样品的抗原量:因为由线性拟合公式给出了 a和b的值并且y (AOD)是已知的，然后可以计算代表单位/mL抗原的未知值X，并通过样品稀释度校正以获得原始(未稀释)测试样品的抗原浓度。报道的抗原浓度是用提供标准曲线的线性部分内的AOD值的最低稀释样品获得的值。直接结合VZV抗原ELISA
简而言之，通过在96孔微量滴定板中孵育来自测试样品的VZV抗原的稀释液以固定抗原并随后用单克隆或多克隆抗VZV抗体检测结合的抗原而进行该测定。通过与酶联的抗适当种类抗体和适当底物反应以提供分光光度法定量的有色产物而定量结合的抗VZV抗体。然后比较样品的OD与稀释度相比的滴定曲线(定量为滴定曲线之间的倍数稀释差异(“曲线移位”)。测试程序包括以下步骤:(I)用200 μ I在PBS中1:20至1:2560的系列2倍稀释的稀释的抗原(疫苗)包被高结合ELISA板。覆盖所述板，并在2-8°C存储过夜。(2)倒出来自步骤#1的液体，并且板用PBS + 0.05% Tween 20冲洗3次。除去最后冲洗液并加入稀释的抗体(100 μ /孔)。板在35 °C孵育I小时。(3)倒出来自步骤#2的液体，并且所述板用PBS + 0.05% Tween 20冲洗3次。除去最后冲洗液并加入稀释的缀合物(100 μ I/孔)。板在35°C孵育I小时。(4)倒出来自 步骤#3的液体，并且所述板用PBS + 0.05%Tween 20冲洗3次。除去最后冲洗液并加入底物(未稀释)。然后板在35°C孵育30min。
(5)用NaOH终止反应。(6)通过在405nm处读板测定光密度(OD)。用于该实验的抗体如下:针对gE (Biodesign目录# mab8612)、gB (Chemicon目录 #C05102M, Millipore Corp., Billerica, MA)和 gH (Biodesign 目录 #C05104M和 Virusys 目录 #VA033_100, Virusys Corp., Taneytown, MD)的 EPP 血清和纯化的单克隆抗体。使用的缀合物是抗人IgG(BioSource目录# AH10305, Invitrogen Corp.,Carlsbad, CA)或山羊抗小鼠 IgG (Pierce 目录 # 31322, Pierce Biotechnology Inc.,Rockford, IL)。使用喊性憐酸酶 pNPP (Sigma 目录 #p7988, Sigma-Aldrich C0., St.Louis, MO) IOOmL 作为底物。实施例3
VZV IFNy ELISP0T 测定
简而言之，范围为I至0.125 VZV抗原单位/mL的测试抗原的连续稀释液与来自6位供体的PBMC在一式两份孔中孵育。孵育后，通过其产生干扰素Y的能力鉴定对VZV抗原应答的细胞。使用在微量滴定板上包被的小鼠抗干扰素Y和匹配的二级抗小鼠IgG酶缀合的抗体和底物，导致干扰素Y产生细胞(“斑点”)周围的沉淀底物的检测，从而检测干扰素Y产生。通过自动ELISP0T读数器定量斑点形成细胞(SFC:形成表明干扰素Y分泌的斑点的那些)的数量，并且结果表示为SFC/106 PBMC。结果 实施例4
Y辐射的VZV的灭活动力学。我们以前已经测试了热处理作为灭活用作用于免疫功能低下患者的疫苗的冻干VZV的方法，但是发现，该方法导致病毒制剂的剩余感染性(见下文)。据认为，该剩余感染性不是“灭活”疫苗的最佳特征。实现了液体容积物疫苗相对于冻干疫苗更广泛的灭活，但是测定容积物疫苗的热处理无法提供最佳的制造过程。因此，研究使用Y辐射6tlCo的用于冻干的水痘带状疱疹病毒疫苗(Oka/Merck)的可替代的灭活方法，以观察是否可以鉴定比热处理更广泛的感染性灭活(产生更有利更安全的特征)方法。本评价的目标首先是确定是否可以通过6tlCo辐射实现更广泛的感染性灭活，并且然后其次，Y辐射后实现的抗原特性是否不同于热处理材料的抗原特性，并且对于临床应用研究是否是接受的。使用 1、2、3、
4、5、6、7、8 kGy (2007)或 0.45、1.35 和 2.7 kGy 辐射 VZV 小瓶。使用 60Co Gammacell 辐射器(Best Theratronics Ltd.Corporation, Ottawa, Ontario, Canada)进行福射。使用在MRC-5细胞中的水痘噬斑测定确定每辐射剂量(Gy)的每小瓶的剩余PFU/mL。将log PFU/mL针对辐射剂量作图，并且数据点显示灭活的线性回归(图1)。动力学研究后，我们测试了 IOOmL用达12kGy的6tlCo射线辐射的灭活VZV疫苗(灭活且冻干的)以允许进一步确认灭活程度(通过测试更大的总体积)。在IOOmL样品中检测到零个噬斑。此外，使用6tlCo射线辐射VZV容积物。解冻容积物并等分在PETG瓶中用于在0.5、
1、2、3、4、5、6 kGy辐射(图2)。使用MRC-5细胞在水痘噬斑测定中分析辐射的容积物的剩余感染性。在IOOmL福射的容积物中检测到零个曬斑。通过将log pfu/mL针对福射时间作图而观察到线性灭活动力学。实施例5
通过VZV IFNy ELISP0T测定评价免疫原性
为了评价不同灭活方法对免疫原性的影响，使用6份供体外周血单核细胞(PBMC)样品如实施例3中描述进行VZV IFNy ELISP0T测定。进行该研究以确定VZV在不同条件下灭活后IFN- Y应答是否减弱。测试5份热处理的VZV容积物制剂连同2份Y -辐射的VZV容积物制剂。热处理的VZV制剂由在下列条件下处理的样品组成:(I) 40°C持续24小时，
(2)451:持续3. 5小时，(3) 451:持续4.5小时，(4) 56°C持续30分钟，和(5) 56°C持续90分钟。Y辐射的样品由在5.92 kGy Y辐射3或4个小时的VZV容积物组成。还测试来自与上文用于产生灭活样品的那些相同的容积物制剂的活(未处理)VZV样品用于比较。还包括通过用UV光处理而灭活的大量VZV，以ELISP0T抗原(VZV批号# 96.07)作为测定运行对照，连同PHA(阳性对照)和媒介物(阴性对照)。跨越1:40至1:320的系列2倍稀释评价所有抗原。进行测试6份PBMC样品的一次测定运行，所述6份PBMC样品被选择以代表一定范围的VZV应答水平。获得的VZV斑点计数(SFC/106 PBMC)显示于图3A_F中。没有任何证据提示在测试的供体中灭活的抗原制剂与未处理的抗原制剂相比的VZV应答的差异。也没有在特定稀释水平在制剂(处理)和应答之间的显著相互作用的证据。相对于活VZV制剂，在ELISP0T计数中对于8份灭活VZV制剂(包括原始VZV批次#96.07)的倍数差异的范围为相对于活VZV制剂的1.15倍更低(56°C持续90分钟)至1.14倍更高(40°C持续24小时；批次#96.07)。相对于活VZV制剂，在测试的供体中，8份灭活VZV制剂都没有产生统计学显著更低的ELISP0T计数。因此，人ELISP0T测试显示，使用来自一组供体的PBMC，对于通过不同程序(容积物的401:、451:、561:热处理或Y射线)灭活的VZV制剂，在应答中没有显著性差异。实施例6
灭活VZV疫苗的电子显微镜分析
进行热处理和Y辐射的容积物和冻干疫苗的EM分析以提供灭活对灭活VZV制剂的影响的额外表征。选择的分析方法是在玻璃冰中的冷冻透射电子显微镜(冷冻TEM)，所述玻璃冰用于在EM分析期间最佳保持病毒完整性。通过NanoImaging Services, Inc (SanDiego, CA)进行冷冻 TEM。制备灭活VZV样品用于EM分析以评价灭活对颗粒完整性/外观的影响。用700 μ L灭菌蒸馏水使冻干样品再水化，并在成像前没有进一步稀释。样品保存在400目铜网上
2.0x0.5 um C-平面多洞碳膜(Protochips, Inc., Raleigh, NC)上支持的玻璃冰的薄膜中。临使用前在Solarus等离子体清洗器(10秒，25% O2, 75% Ar)中清洗网格。通过将一滴Γ3 μ L)样品悬浮液施加到等离子体清洗的网格，用滤纸吸去，并立即用FEI Vitrobot (4C, 95% RH)在液态乙烷中玻璃化处理而制备所有样品。网格存储在液氮下，直到被转移至电子显微镜用于成像。使用配备FEI Eagle 4K x 4K CC相机(FEI公司)在120 KeV操作的FEI Tecnai T12电子显微镜(FEI公司，Hillsboro, OR)进行电子显微镜分析。以多标尺获得每个网格图像以评价样品的总体分布。在鉴定用于以低放大率成像的目标区域后，获得更高放大率图像对。使用Nanolmaging系统仪器(21K-52K放大率)评价样品。比较未处理的冻干VZV、在56°C热处理77天的冻干VZV和使用6ciCo源辐射至25或50 kGy的冻干VZV。
冷冻M结果表明在高Y辐射剂量的潜在的颗粒影响，具有电子密度的降低(也许反映了病毒DNA的降解)，但对于冻干样品的整体颗粒和蛋白外观没有显著影响。然而，冻干可以保护免于这些变化，因为冻干灭活样品显示出电子密度的损失，但在更高剂量时颗粒保持完整。(参见图4)。实施例7 抗原反应性的测定
使用针对VZV gB、gH、gE的人多克隆血清和单克隆抗体(mAb)作为检测抗体进行VZVAg ELISA测定以确定热或Y辐射灭活的容积物样品或Y辐射的冻干VZV的抗原(Ag)含量。Y辐射的容积物或冻干样品显示抗原反应性没有变化。然而，在56°C热处理90分钟的样品显示与多克隆、gE和gH单克隆抗体的抗原反应性的变化。在25kGy和50kGy Y辐射额外的VZV容积物样品以支持使用50kGy作为用于最终灭菌的暴露上限。在与针对gpE、gB和gH的多克隆抗VZV血清和mAb的直接结合抗原ELISA测定中测试这些样品。y辐射冻干VZV疫苗至灭菌条件(25_50kGy)没有可检测地影响抗原与多克隆血清或gE或gB单克隆抗体的ELISA反应性。由于高背景染色，使用gH mAb的结果是不确定的。使用可替代的ELISA板(MaxiSorp)也观察到用这种单克隆抗体(而不是针对gE或gB的那些)的增加的背景信号。实施例8 小鼠免疫原性
进行小鼠免疫原性研究以评价一组使用各种灭活方法产生的灭活VZV(iVZV)制剂。在VZV ELISA测定中评价从研究产生的血清样品以确定针对通过不同灭活VZV制剂产生的VZV的抗体的相对滴度。产生并评价两种不同VZV容积物制剂:(I)在56°C热处理90分钟的VZV容积物，和(2)用5，924.7戈瑞(Gy) Y辐射3小时的VZV容积物。还产生并评价两种不同VZV冻干疫苗制剂:(I)在56°C热处理50天的冻干的VZV疫苗，和(2)用25，000Gy Y辐射的冻干的VZV疫苗。评价活(未处理)VZV容积物和活(未处理)VZV冻干疫苗用于和iVZV容积物制剂比较。在第O、14和29天用4.5 VZV抗原单位(U) /小鼠(9U/mL)腹膜内(1.p.)免疫BALB/c小鼠(对于每组n=16)。在第-1天(采血前)和第13、28和43天采集血液(血清)。在VZV ELISA中评价第28天血清(剂量2后14天)的IgG应答。调整的VZV滴度(VZV滴度减去MRC-5滴度)显示于图5中。用来自第28天的相应组测试采血前血清以确定对于MRC-5和VZV的滴度截止值。用UV处理的VZV或MRC-5提取物包被ELISA板的孔，然后与测试小鼠血清的稀释液孵育以定量小鼠血清中对于VZV特异性的抗体的相对量。结果表明，相 对于未处理的容积物，热处理容积物的IgG滴度平均为5.57倍更低(95% Cl =(3.45,8.99))，并且Y -辐射容积物的IgG滴度平均为2.43倍更低(95% Cl= (1.51,3.93))。与未处理的冻干病毒相比，热处理的冻干滴度平均为1.38倍更低(95% Cl=(1.00, 1.90)), Y-辐射的冻干滴度平均为1.66倍更低(95% Cl =(1.22,2.26)) 0与用热处理容积物免疫后获得的滴度相比，用Y辐射容积物的抗体滴度平均为2.29倍更高(95% Cl = (1.54，3.41))。与用热处理冻干制剂免疫后获得的滴度相比，用Y辐射冻干病毒的抗体滴度平均为1.20倍更高(95% Cl = (0.89, 1.61))。总体数据支持在这个模型中冻干病毒的Y辐射对免疫原性具有最少的影响。结果显示，与未处理的容积物相比，用2个剂量的灭活制剂免疫后在小鼠中的抗体(IgG)应答降低。实施例9
将灭活VZV疫苗施用于50至59岁的健康患者。在随机双盲2部分多中心研究中将Y辐射VZV疫苗施用于50至59岁大的健康成人，其设计用于评价疫苗的安全性、耐受性和免疫原性。本研究的目的是研究通过Y辐射或热处理方法灭活的疫苗批次的安全性、耐受性和免疫原性。将总共161位50岁至59岁大的健康个体2:2:1随机化以接受作为4剂量方案给予的16至25 kGy灭活的、辐射的VZV疫苗“A” (n=65)、热处理VZV疫苗(n=63)或安慰剂(n=33)。相隔约30天施用每个剂量。热处理疫苗和Y-辐射疫苗“A”源自独立的容积物批次，但通过针对相似的抗原含量而控制。主要假设是，在16至25kGy的水平灭活的Y辐射VZV疫苗(A)可以引发可接受的VZV特异性免疫应答，正如在剂量4后28天通过gpELISA所测量的。第二个假设是，热处理VZV疫苗可以引发可接受的VZV特异性免疫应答，正如在剂量4后28天通过gpELISA所测量的。成功的统计学标准对应于在热处理VZV疫苗受体中几何平均倍数的上升(GMFR)上两侧95%置信区间的下限为〉1.0。在该研究中疫苗受体中的免疫原性结果提供在图6中。结果表明，满足对于测试主要和第二假设的成功标准，即当施用于健康个体时，Y辐射的VZV疫苗A和热处理VZV疫苗是免疫原性的。两种疫苗都具有与安慰剂组的安全性特征类似的安全性特征。实施例10
将用不同水平Y辐射灭活的VZV疫苗批次施用于50至59岁的健康志愿者。
进行第二项研究以提供关于用更广范围的Y辐射灭活的疫苗批次的临床数据。在本研究中，将总共129位50岁至59岁大的健康个体1:1随机化以接受作为4剂量方案给予的16至25 kGy辐射的、辐射的VZV疫苗“B”(n=65)或25至50 kGy辐射的、辐射的VZV疫苗“C” (n=65)，相隔约30天施用每个剂量。本研究中使用的疫苗批次B & C源自具有相同VZV抗原含量的相同容积物批次和相同填充物/制剂，但在不同Y辐射水平被灭活。本研究的第一个主要假设是，在25至50kGy的水平灭活的Y辐射的VZV疫苗(C)可以引发可接受的VZV特异性免疫应答，正如在剂量4后28天通过gpELISA所测量的。第二个主要假设是，在16至25kGy的水平灭活并且对于抗原含量与在25至50kGy灭活的疫苗匹配的Y辐射的VZV疫苗(B)将引发可接受的VZV特异性免疫应答，正如在剂量4后28天通过gpELISA所测量的。对于每个假设的成功的统计学标准对应于在Y辐射疫苗受体中GMFR上两侧95%置信区间的下限为> 1.0。在该研究中疫苗受体中的免疫原性结果提供在图7中。本研究的结果表明，满足对于测试主要假设的成功标准，即当施用于健康个体时，Y辐射的VZV疫苗B (16-25 kGy Y辐射)和、辐射的VZV疫苗C (25-50 kGy Y辐射)是免疫原性的。两个疫苗组具有相似的安全性特征。本研究的结果还表明，存在基线几何平均滴度(GMT)的不平衡；B组基线GMT为 313，C组基线(GMT)为 429。尽管倍数上升差异不显著，但是基线滴度的差异可能是测试中观察到的倍数上升差异的原因。此外，分析数据表明，更高的Y辐射剂量(>25 kGy)导致更高的抗原降解。`
权利要求
1.灭活的水痘带状疱疹病毒(VZV)，其中所述VZV的感染性是检测不到的，并且其中所述灭活的VZV当施用于患者时诱导针对VZV的免疫应答。
2.药物组合物，包含治疗有效量的权利要求1的VZV和药学上可接受的载体。
3.权利要求2的药物组合物，其中所述灭活VZV的感染性是 Ο.040噬斑形成单位(PFU)/mL。
4.权利要求3的药物组合物，其中所述灭活VZV的感染性是i0.0lO噬斑形成单位(PFU)/mL。
5.权利要求4的药物组合物，其中所述灭活VZV的感染性是 Ο.002噬斑形成单位(PFU)/mL。
6.权利要求2-5中任一项的药物组合物，其中所述VZV毒株是Oka毒株或Oka毒株衍生物。
7.权利要求6的药物组合物，其中所述组合物是冻干的。
8.权利要求7的药物组合物，其中所述VZV是通过Y辐射灭活的。
9.权利要求8的药物组合物，其中与包含相同量的没有灭活VZV的对照样品引发的免疫应答相比，所述组合物弓I发的免疫应答没有显著不同。
10.权利要求9的药物组合物，其中所述灭活VZV引发的免疫应答与所述对照样品引发的免疫应答的差异为约25%或更小。
11.权利要求2- 5中任一项的药物组合物，其中通过水痘噬斑测定来确定所述VZV的感染性。
12.制备灭活的水痘带状疱疹病毒(VZV)的方法，所述方法包括用约5至约50kGy的Y辐射来Y辐射包含VZV的样品。
13.权利要求12的方法，其中通过将所述样品暴露于6tlCo射线而将所述Y辐射提供给所述样品。
14.权利要求13的方法，其中所述VZV是Oka毒株或Oka毒株衍生物。
15.权利要求13的方法，其中所述样品在被辐射前冻干。
16.权利要求14或权利要求15的方法，其中使用的Y辐射量是约25kGy或更低。
17.权利要求16的方法，其中所述疫苗是液体容积物制剂，并且使用的Y辐射量是约5kGy 至约 12.5 kGy。
18.权利要求15的方法，其中使用的Y辐射量是约10kGy至约25 kGy。
19.通过权利要求12-18中任一项的方法产生或获得的灭活VZV。
20.疫苗，包含治疗有效量的权利要求19的灭活VZV和药学上可接受的载体。
21.用于治疗受试者中带状疱疹的方法，所述方法包括将药物组合物施用于受试者，所述药物组合物包含治疗有效量的灭活的水痘带状疱疹病毒(VZV)和药学上可接受的载体，其中所述VZV是使用Y辐射灭活的。
22.权利要求21的方法，其中所述药物组合物的施用途径是皮下的或肌肉内的。
23.权利要求22的方法，其中所述受试者是50岁大或更大的。
24.权利要求22或23的方法，其中所述受试者是免疫功能低下的。
25.权利要求24的方法，其中所述受试者具有至少一种选自下述的状况:患有血液恶性肿瘤、经历免疫抑制治疗、接受造血干细胞移植、接受实体器官移植、HIV感染和患有自身免疫性疾病。
26.权利要求22或23的方法，其中所述方法进一步包括允许预定量的时间经过，并将一个或多个剂量的所 述药物组合物施用于所述受试者。
全文摘要
本发明提供了灭活的水痘带状疱疹病毒(VZV)和包含所述灭活VZV的组合物和疫苗，其中所述灭活VZV的感染性是检测不到的，并且其中所述灭活VZV当施用于患者时诱导针对VZV的免疫应答。在本文描述的组合物的实施方案中，所述VZV是用γ辐射灭活的。本发明还提供了制备灭活VZV疫苗的方法，所述方法包括用约5kGy至约50kGy的γ辐射来γ辐射包含VZV的样品。本发明还提供了治疗HZ或与VZV再活化相关的其他疾病或针对其免疫的方法，所述方法包括将疫苗或药物组合物施用于受试者，所述疫苗或组合物包含治疗有效量的灭活VZV和药学上可接受的载体，其中所述VZV是通过γ辐射灭活的。
文档编号C12N7/04GK103167880SQ201180046512
公开日2013年6月19日 申请日期2011年8月4日 优先权日2010年8月5日
发明者D.L.克拉, J.德黑文, J.A.克里斯, C.M.巴, M.亚戈迪奇 申请人:默沙东公司
技术领域：
本发明涉及用于预防和治疗带状疱疹的组合物和方法。更具体地，本发明涉及包含灭活水痘病毒疫苗(VZV)的疫苗组合物和用于生产所述组合物的方法。
背景技术：
水痘带状疱疹病毒(VZV)的初始感染通常在儿童和年轻成年人中引起水痘。尽管水痘的临床表现通常在没有医疗干预的情况下在一个短时间期间内解决，但是VZV可以在感染后在感觉神经元中保持潜伏持续多年。潜伏VZV的再活化和复制，经常在几十年后，可以导致带状疱疹(HZ)，通常被称为带状疱疹，通常限于单一皮片的疼痛性皮疹。这样的VZV再活化与细胞介导的免疫下降相关，其发生在老年人或免疫功能低下的那些人中(Weinbergk, Jourrml of Infectious Diseases (2009) 200:1068-77)。在一些患者中，与 HZ 相关的疼痛可以在HZ皮疹已经痊愈后持续数月甚至数年，被称为疱疹后神经痛(PHN)的并发症。活减毒疫苗(ZOSTAVAX ,Merck & C0.，Inc.，Whitehouse Station, NJ)目前可用于在健康老年患者中预防带状疱疹(美国专利号6，214，354和5，997，880)。该疫苗已经显著降低了 HZ在免疫活性的患者群体中的不利影响(Oxman,丽，Clin InfectDis.(2010) 51 (2) :197-213; Sanford和Keating, Drugs Aging (2010) 27(2):159-76;Oxman等人，N.Engl.J.Med.(2005) 352:2271-83)。然而，活减毒疫苗可能不适用于免疫功能低下的患者。免疫功能低下的个体，包括患有血液恶性肿瘤的患者、经历免疫抑制治疗的患者、接受造血干细胞移植(HCT)或实体器官移植(SOT)的患者、HIV感染的患者和具有自身免疫性疾病的患者，具有相对于一般群体更高的发展HZ的发病率。此外，这些患者群体处于发展严重和威胁生命的并发症的增加的风险中(Gourishankar等人.(2004)Am J.Transplant 4: 108—115， Ragozzin0.(1982) Medicine (Baltimore) 61:310-316, Wung 等人.(2005) Am J Med 118: 1416.e9-1416.el8, Dworkin & Schmader(2003) Clinical Infectious Diseases 36: 877-882，Gebo 等人.(2005) J AcquirTmmune Defic Syndr 40: 169-174，Mattiuzzi 等人.(2003) Clinical Cancer Research9: 976-980, Dworkin 等人.(2003) Neurology 60: 1274-1283.)如脑膜脑炎(Tauro 等人.(2000) Bone Marrow Transplant 26: 795-796)、横贯性脊髓炎、视力损伤(Walton等人.(1999) Bone Marrow Transplant 23: 1317-1320)、肺炎(Wacker等人.(1989) BoneMarrow Transplant 4: 191-194)、肝炎(Rogers等人.(1995) Bone Marrow Transplant15: 805-807; Schiller等人.(1991) Bone Marrow Transplant 7: 489-491)、细菌重复感染、皮肤疤痕和缺陷(Schuchter等人.(1989) Blood 74: 1424-1427)。尽管在免疫功能低下的个体中存在与HZ相关的发病率和死亡率的较高风险，该群体不适合用针对HZ的活减毒疫苗如ZOSTAVAX 接种疫苗。因此，对于在免疫功能低下的患者群体中对于防止HZ或降低HZ或相关并发症的严重度和持续时间安全且有效的疫苗有重大的需要。关于免疫功能低下患者的安全担忧已经导致研究人员研究使用针对病毒病原体的非复制型疫苗如亚单位疫苗、病毒样颗粒疫苗和灭活的完整疫苗。许多批准的灭活疫苗含有用福尔马林灭活的病毒，包括甲型肝炎、脊髓灰质炎和日本脑炎疫苗。对于HZ，已经提示，通过热灭活VZV或通过使用亚单位疫苗可以开发对于免疫功能低下受试者的更安全的疫苗(Cohen, J.1., (2008) J.1nfect.Dis.197(Suppl 2): S237-S241)。Redman 等人(J.1nfectious Diseases (1997) 176:578-85)描述了通过在 50°C加热而灭活的并导致
≤1.2 pfu/0.5 mL的感染性病毒含量的灭活VZV疫苗。对于待施用于免疫功能低下的患者的产品，该感染性水平是不希望的。美国专利号6，214，354和5，997，880还提到了使用灭活VZV疫苗的潜能并公开了生产并测试热处理的疫苗的例子。如果开发了灭活VZV的方法，所述方法导致在免疫功能低下的患者中安全并有效(即缺乏剩余感染性但保留非灭活样品的免疫原性和抗原性)的VZV样品，这将满足重大的医疗需要。发明概述
本文已经显示，可以用Y辐射灭活VZV样品，使得样品中的VZV感染性在检测不到的水平；然而，相对于没有灭活VZV样品，通过本文描述的方法灭活后的VZV的免疫原性和/或抗原性没有显著的损失并且结构没有显著的变化。在一个方面，本发明提供了灭活的水痘带状疱疹病毒(VZV)，其中所述VZV的感染性是检测不到的，其中当施用于患者时灭活VZV诱导针对VZV的免疫应答。还提供了药物组合物/疫苗，其包含治疗有效量的灭活VZV和药学上可接受的载体。本发明的组合物是液体或在冷冻状态，例如，冻干的。在本文描述的组合物的一些实施方案中，用Y辐射灭活VZV。在另一个方面，本发明提供了制备灭活VZV疫苗的方法，所述方法包括用约5kGy-约50kGy的Y辐射来Y辐射包含VZV的样品。在优选的实施方案中，Y辐射源是6°Co，虽然本领域中已知的其他同位素也可以用于这方面。在本文所公开的制备方法的一些实施方案中，在辐射前将样品冻干。在可替代的实施方案中，液体容积物暴露于Y辐射，而不首先冻干。本发明还提供了治疗HZ或与VZV再活化相关的其他疾病或针对其免疫的方法，所述方法包括将疫苗或药物组合物施用于受试者，所述组合物包含治疗有效量的灭活VZV和药学上可接受的载体，其中所述VZV是通过Y辐射灭活的。在本文描述的治疗方法的一些实施方案中，所述组合物/疫苗的施用途径是皮下的或肌肉内的。在本发明的这个方面的特定实施方案中，患者是50岁或更大的和/或免疫功能低下的。如说明书通篇和随附的权利要求中所使用的，单数形式“一 (a) ”，“一 (an) ”和“该(the) ”包括复数参考，除非上下文另有清楚指明。如说明书通篇和随附的权利要求中所使用的，下列定义和缩写适用:
术语“治疗”是指治疗性处理和预防或防止措施。需要治疗的个体包括已经患有病症的那些个体，以及易于患有病症的那些个体或其中病症待防止的那些个体。用本发明的灭活VZV治疗患者包括下列中的一个或多个:在患者中诱导/增加针对VZV的免疫应答，在已经感染水痘或接受活VZV疫苗的患者中降低VZV再活化的可能性，防止或降低发生HZ和/或与VZV再活化相关的其他疾病或并发症如PHN的可能性，降低HZ和/或与VZV再活化相关的其他疾病或并发症如PHN的严重性或持续时间。
术语“治疗有效量”是指足以产生所需效果的足够的疫苗组合物，所述效果包括但不限于:在患者中诱导/增加针对VZV的免疫应答，在已经感染水痘或接受活VZV疫苗的患者中防止、改善或消除VZV再活化，防止HZ和/或PHN，降低HZ和/或PHN的严重性或持续时间。本领域技术人员认识到，这种水平可能变化。术语“免疫应答”是指细胞介导的(T细胞)免疫应答和/或抗体(B细胞)应答。术语“患者”是指待接受本文描述的灭活VZV疫苗或药物组合物的任何人,包括有免疫能力的和免疫功能低下的个体。如本文所定义的，“患者”包括已经感染水痘(通过自然感染或接种疫苗)的那些患者。术语“容积物”是指包含多于一个剂量的疫苗的液体制剂或组合物。关于特定疫苗制剂或组合物的感染性的术语“检测不到的水平”是指该制剂或组合物包含每mL样品的050感染单位或噬斑形成单位(“PFU”)的感染性VZV病毒，优选<0.040 PFU/mL,<0.030 PFU/mL,<0.020 PFU/mL,<0.015 PFU/mL,<0.010 PFU/mL,< 0.009PFU/mL,或 I 0.008 PFU/mL,更优选 I 0.007 PFU/mL, < 0.006 PFU/mL, < 0.005 PFU/mL,
<0.004 PFU/mL, < 0.003 PFU/mL，更优选 I 0.002 PFU/mL，或 10.001 PFU/mL。可以使用，例如，如 水痘噬斑测定如实施例1中描述和Krah等人ij.Virol.Methods (1990)27:319-26)中进一步描述的测定来确定特定样品的PFU。也可以通过如实施例1中描述的免疫染色法确认样品的感染性。附图简述
图1显示了 Y福射的冻干VZV的灭活动力学(log PFU/ml v.福射剂量,参见实施例4)。使用6tlCo Gammacell 辐射器用不同水平的6tlCo射线辐射VZV小瓶。在MRC-5细胞中使用水痘噬斑测定确定每辐射剂量(Gy)的每小瓶的剩余的PFU/mL。观察到的数据点显示为黑色菱形(“观察值”)，通过测定可测量的最大数据显示为灰色菱形(“〈=值”)。图2显示了 Y辐射的VZV容积物的灭活动力学(针对辐射时间的log pfu/mL滴度，参见实施例4)。使用不同水平的6tlCo射线辐射VZV容积物。使用MRC-5细胞在水痘噬斑测定中分析辐射的容积物的剩余感染性。图3A-3F显示了如通过VZV IFNy ELI SPOT测定测量的在不同的条件下灭活VZV后的VZV应答(SFC/106 PBMC)(参见实施例5)。显示的数据是对于5份热处理的VZV容积物制剂和2份Y -辐射的VZV容积物制剂的6份供体PBMC样品(图A-F)。还显示了对于来自与上文使用的那些相同的容积物制剂的活(未处理)VZV样品和通过用UV光处理灭活VZV批次(VZV批号96.07)的VZV应答。图4A-4C显示了如通过冷冻EM评价的VZV病毒颗粒的图(参见实施例6)。显示了未处理的(图4A)、用25 kGy辐射的(图4B)和用50 kGy辐射的(图4C)冻干样品。图5显示了小鼠免疫原性研究的结果，在该研究中，在VZV ELISA测定中评价对于一组使用各种灭活方法(参见实施例8)生成的灭活VZV制剂的VZV滴度(IgG应答)。显示了对于每只小鼠的调整的VZV滴度(VZV滴度减去MRC-5滴度)连同几何平均滴度。还显示了被认为是异常值的来自热处理冻干组中2只小鼠的结果。图6显示了如实施例9中描述的在接受热处理VZV疫苗(N = 65)或Y-辐射VZV疫苗(N = 63)的人疫苗受体中通过时间点的VZV gpELISA抗体应答的统计学分析。图7显示了如实施例10中描述的在接受Y辐射的VZV疫苗B (16-25 kGy, N =64)或Y辐射的疫苗C(25-50 kGy, N=65)的人疫苗受体中通过时间点的VZV gpELISA抗体应答的统计学分析。发明详述
本文已经显示，可以用Y辐射灭活大量或冻干的VZV样品，使得样品中的VZV感染性在检测不到的水平(例如，本文描述的灭活VZV样品的感染性是10.001 PFU/mL)。可以将本文描述的方法生产的灭活VZV与药学上可接受的载体配制，以产生用于本发明的治疗/免疫方法中的药物组合物或疫苗。相对于没有灭活的VZV样品，在通过本文描述的方法灭活后，VZV的免疫原性和/或抗原性没有显著损失并且结构也没有显著变化。因此，当本发明的药物组合物施用于患者时，与包含相同量的没有灭活的VZV的对照样品引发的免疫应答相比，组合物引发的免疫应答没有显著不同。如本文所使用的，与未灭活的对照样品“没有显著不同的”灭活样品引发的免疫应答与对照样品的差异为约50%或更小，更优选约40 %或更小，约30 %或更小，甚至更优选约20 %或更小，15 %或更小，10 %或更小，或5 %或更小。可以在临床试验中在适当的动物模型或人群体中，例如，通过测量以下参数中的一个或多个而测量灭活和对照样品引发的免疫应答= (I)VZV特异性应答细胞频率(如Calandra等人，WO 94/002596中描述，(2)抗VZV细胞毒性T细胞(CTL)，或VZV特异性⑶8+细胞，(3)抗VZV辅助T细胞，或VZV特异性⑶4+细胞，(4)抗VZV特异性抗体的水平，或(5)淋巴因子如干扰素或白介素的水平。用于测量免疫应答的技术是本领域中是已知的，包括但不限于:T细胞应答测定法，效价测定法，VZV IFN Y ELISP0T测定法，和ELISA测定法。为了确定本发明的和本文描述的方法制备的疫苗/药物组合物引发的免疫应答的足够性、并且还有灭活疫苗的效力，测量人志愿者/受试者的临床试验中的临床结果以测量，例如，个体中HZ的持续时间或严重性的降低和/或PHN的持续时间的降低至发展带状疱疹后少于I个月的期间，在患者群体中带状疱疹的发病率的降低，在统计水平上，低于在一般群体中发现的或同样在危险中或免疫功能低下的个体的发病率可能是有用的。如上所述，本发明显示可以将VZV制剂灭活至检测不到的水平，同时仍保留相似非灭活VZV的抗原性和免疫原性。因此，本发明的一个方面提供了灭活VZV，其中所述VZV的感染性是检测不到的，其中当施用于患者时灭活VZV诱导针对VZV的免疫应答。本领域技术人员可以容易地确定用作治疗有效量的VZV的适当量的VZV抗原。这样的量将根据预期用途或其他因素如特定患者群体而变化。在本文描述的方法和组合物的一些实施方案中，VZV的量是约I至约10 VZV抗原单位/剂量，I VZV抗原单元粗略等同于I μ g纯化的VZV蛋白。在特定实施方案中，组合物中存在的VZV抗原的量是约2至约8 VZV Ag单位/剂量，或约3至约6 VZV Ag单位/剂量。可以用适当的抗原测定法，例如，本文实施例2中描述的竞争性ELISA来确定抗原的量。本领域技术人员可以确定其他适当的测定法以测量样品中抗原的量。
本文还提供了药物组合物，其包含治疗有效量的上述灭活VZV和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。用于本发明的组合物中的药学上可接受的载体包括在采用的剂量和浓度对患者无毒的任何相容试剂，如水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇、缓冲剂等及其组合。载体还可以含有额外组分，如稳定剂、增溶剂、等渗调节剂，如NaCl、MgCl2或CaCl2等，表面活性剂及其混合物。本发明还提供了多剂量组合物，其含有多于一个剂量的灭活VZV、抗微生物防腐剂和药学上可接受的载体，所述防腐剂防止在引入注射器后对包含组合物的小瓶的无意的微生物污染。可以将这样的多剂量组合物在预定量的时间已经经过后多于一次提供给一位患者，或提供给多于一位患者。在本发明的一些实施方案中，组合物是液体容积物，其含有多于一个剂量的灭活VZV0在可替代的实施方案中，组合物是冻干的。冻干方法是本领域已知的。本发明还涵盖的是用适当稀释剂如注射用无菌水或注射用抑菌水重构的冻干制剂。Y辐射通常用于对用于医疗应用中的装置和设备消毒。它也可以用于杀死生物制品如血液产品和抗体制剂中任何潜在的病原体。对于这些用途，灭活生物体而不考虑维持生物体的功能。描述通过Y 辐射灭活病毒的文献来源是有限的。Rosen 等人(7/ .J.Racliat.Biol.52:795-804 (1987))评价了在 6ciCo 射线处理后单纯疱疹病毒完整病毒颗粒的噬斑形成能力的存留和纯化的基因组的DNA分子的损伤。该研究没有评价辐射后病毒的抗原性或免疫原性。由Elliott等人的另一项研究(J.Clin.Micobiol.16:704-708 (1982))评价了用 6ciCo 射线对拉沙热病毒(Lassa)、马尔堡病毒(Marburg)和埃博拉病毒(Ebola)的灭活。对于拉沙热病毒、埃博拉病毒和马尔堡病毒观察到灭活的线性动力学，并且通过使用6tlCo射线的Y辐射实现了病毒灭活。Elliott等人观察到，与液体状态相比，对于在冷冻状态下灭活病毒需要更大剂量的辐射。如Rosen等人，该研究未能确定Y辐射后病毒的抗原性或免疫原性。Alsharifi等人(W02010/012045)描述了使用Y辐射来灭活流感病毒(来自正粘病毒科的RNA病毒)来作为疫苗。在本文描述的发明中显示，Y辐射可以将VZV病毒制剂的感染性降低到检测不到的水平，同时保留了未灭活对照的抗原性、免疫原性和结构特征。因此，在本发明的优选实施方案中，通过Y辐射将VZV灭活，可以通过暴露于适当同位素，如6°Co、137铯、99锝或99mTc而将Y辐射递送至VZV。在优选的实施方案中，通过暴露于6tlCo射线而将Y辐射递送至VZV。用于灭活VZV的Y辐射的量是约5至约50千戈瑞(kGy)的Y辐射。戈瑞(Gy)是吸收剂量的标准单位，I戈瑞等于I焦耳/千克(100拉德)的吸收剂量。本领域技术人员将意识到，应改变暴露于样品的辐射量和时间量以达到期望的辐射吸收剂量(剂量=积分通量(Huence)X时间)。本领域技术人员也能够根据样品存储于其中的容器的大小改变样品暴露的辐射量，使得将适当的辐射剂量递送至整个样品，而不过度暴露样品部分，例如，最接近放射性源的部分。在本文描述的本发明的方法和组合物中的一些实施方案中，用于灭活VZV的Y辐射量是约25kGy或更低。在可替代的实施方案中，Y辐射量的范围是约5 kGy至约40 kGy,约 5 kGy 至约 35 kGy,约 5 kGy 至约 30 kGy,约 5 kGy 至约 25 kGy,约 5 kGy 至约 20 kGy,约 5 kGy 至约 10 kGy,约 10 kGy 至约 50 kGy, 10 kGy 至约 40 kGy,约 10 kGy 至约 35 kGy,约 10 kGy 至约 30 kGy,约 10 kGy 至约 25 kGy,约 10 kGy 至约 20 kGy,约 15 kGy 至约 50kGy,约 15 kGy 至约 40 kGy,约 15 kGy 至约 35 kGy,约 15 kGy 至约 30 kGy,约 15 kGy 至约25 kGy，约 15 kGy 至约 20 kGy。
本发明还提供了如上所述的药物组合物和产生所述组合物的方法，其中所述组合物是液体容积物，用于灭活VZV的Y辐射量是约5kGy至约IOkGy,或约5kGy约12.5kGy。在其他特定实施方案中，组合物在Y辐射前是冻干的，在这样的实施方案中，Y辐射量是约5kGy至约25kGy或约15kGy至约25kGy。本文显示,对于用Y福射灭活的VZV观察到线性灭活动力学,这对于允许构建灭活模型，即可靠地估计包含灭活VZV的样品中的剩余感染性的水平具有显著益处。对于热处理灭活VZV没有观察到这样的线性灭活动力学。kieb等:K ^iologicals (2002)30:207-216和沿OfflaieriaJ1S (2005) 26:2033-2042)描述了通过Y辐射灭活病毒的两种特定机制，其支持对于VZV观察到的线性灭活动力学。第一种机制是“光子将能量沉淀进目标的直接结果”。这种直接能量转移导致“外层电子从分子的错位和共价键断裂”。第二种“间接”机制是通常通过辐射与水分子和氧的相互作用产生的对自由基和活性氧种类的化学攻击的结果。在本文描述的组合物和方法的特定实施方案中，在用Y辐射灭活前冻干VZV;因此，不可能与水分子有太多相互作用，因为水在冻干过程中已从产物中除去。Redman 等人 ij.1nfectious Diseases (1997) 176:578-85)描述了通过加热至50°C而灭活的并导致 1.2 pfu/0.5 mL的感染性病毒含量的灭活VZV疫苗。显示Redman及其同事们描述的热处理疫苗在安排经历自体BMT或外周血干细胞输注或其他BMT的24位患者中降低了与VZV再活化相关的疾病严重性。该感染性水平不适合于所有患者，如免疫功能低下的那些患者。此外，使用热处理灭活VZV的方法需要很长时间期间以达到低水平的感染性，这是低效的并且不是成本合算的。为此，本发明提供了灭活VZV和包含所述灭活VZV的药物组合物/疫苗，其中所述VZV的感染性是检测不到的水平，即 ο.050 PFU/mL，与以前公开的疫苗相比，所述灭活VZV组合物对于治疗和/或预防HZ或与VZV再活化相关的疾病更安全，且适合于更高效的生产过程。本发明的灭活VZV在灭活后保留了未灭活VZV对照的结构物理特征、免疫原性和抗原性。在一些实施方案中，感染性为 0.040 PFU/mL,<0.030 PFU/mL或020 PFU/mL。本发明还提供了实施方案，其中感染性单位数为 Ο.015 PFU/mL, <0.010 PFU/mL,< 0.009 PFU/mL或￡ 0.008 PFU/mL。在可替代的实施方案中，VZV感染性为￡ 0.007 PFU/mL, < 0.006PFU/mL, < 0.005 PFU/mL, < 0.004 PFU/mL 或 I 0.003 PFU/mL。在另外可替代的实施方案中，感染性为 <0.002 PFU/mL 或 <0.001 PFU/mL。在本文提供的组合物和方法的一些实施方案中，使用水痘噬斑测定如实施例1中描述和Krah等人(J.Virol.Methods (1990) 27:319-26)中进一步描述的测定来确定样品的感染性(PFU)。本领域技术人员将意识到，其他方法也用于确定VZV样品或组合物的感染性，并且可用于代替水痘噬斑测定。任何VZV株可以用于本文描述的组合物和方法中，包括野生型水痘株，或减毒株如Oka毒株，如美国专利3，985，615中描述并且可从美国典型培养物保藏中心(保藏号VR-795 , ATCC, Manassas, VA)获得的。Oka毒株最初从一位具有自然水痘感染的健康男孩获得并在人胚肺细胞中传代。 它适应于在豚鼠胚细胞培养物和人二倍体肺成纤维细胞培养物(例如MRC-5细胞)中生长。在本文描述的组合物和方法的优选实施方案中，VZV是Oka毒株或Oka毒株衍生物,如Oka/Merck VZV毒株。如本文使用的,“Oka毒株衍生物”是通过以下过程获得的毒株:将Oka毒株在适合细胞类型中进一步传代以充分使毒株减毒，以便可用作，例如，活减毒疫苗。在本文描述的本发明的方法和组合物中，在施用于患者前用Y辐射灭活活或减毒的VZV如Oka毒株及其衍生物。本文还提供了制备灭活VZV的方法,所述方法包括用约5kGy至约50kGy的Y福射来Y辐射包含VZV的样品。在本发明的该方面的优选实施方案中，通过将样品暴露于6tlCo射线而将Y辐射提供给样品。在本发明的该方面的特定实施方案中，Y辐射量是如上讨论的。本发明还提供了通过本文描述的方法产生或获得的灭活VZV。另外提供了疫苗，其包含治疗有效量的通过本文描述的方法产生的灭活VZV和药学上可接受的载体。在一个方面，本发明还提供了用于在患者中治疗、预防带状疱疹和/或与VZV再活化相关的其他疾病或并发症(例如疱疹后神经痛)、针对其免疫或降低其可能性的方法，所述方法包括将治疗有效量的疫苗或药物组合物施用于患者，所述组合物包含灭活VZV和药学上可接受的载体，其中所述VZV是通过Y辐射灭活的。由于VZV再活化与细胞介导的免疫力下降相关，本文的治疗方法可用于在患者中加强细胞介导的免疫应答，所述患者以前通过自然感染或接种疫苗暴露于水痘，但其免疫应答由于年龄渐增和/或免疫系统功能障碍而已经降低。在上述的治疗/免疫方法中，可以通过任何合适途径，包括但不限于下列方式，将包含灭活VZV的药物组合物施用于患者:皮下注射、皮内引入、通过皮肤压入(impressionthough the skin)或其他施用方式如静脉内、肌肉内或吸入递送。在本文描述方法的优选实施方案中，施用模式 是皮下或肌肉内。上面描述的方法和组合物可用于在免疫活性和免疫功能低下的患者群体中预防HZ和/或PHN，或减少其严重性或持续时间，所述免疫活性和免疫功能低下的患者群体包括但不限于已经经历造血干细胞移植(HCT)或实体器官移植(SOT)的健康患者和免疫功能低下的患者，HIV感染的患者，患有自身免疫性疾病的患者，患有血液癌症的个体；接受跨越广泛范围的实体肿瘤恶性肿瘤的化疗的个体；接受跨越广泛范围的病状(包括类风湿关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)、克罗恩氏病、牛皮癣和多发性硬化症)的长期免疫抑制治疗的患者。在本文描述方法的一些实施方案中，将灭活VZV疫苗施用于患者,所述患者处于由于疾病(例如，上文提到的疾病)导致的HZ的更高风险，或疾病(如血液恶性肿瘤、实体肿瘤恶性肿瘤或化疗、自身免疫性疾病)的治疗中。在上面描述的任何方法和组合物的一些实施方案中，患者是50岁大或50岁以上，并且可以是健康或免疫功能低下的。在其他实施方案中，患者是55岁大或55岁以上，60岁大或60岁以上，65岁大或65岁以上，70岁大或70岁以上，或75岁大或75岁以上。在可替代的实施方案中，患者是约50至约55岁大，约55至约60岁大，约60至约65岁大，或约65至70岁大。在本文描述方法的另外实施方案中，疫苗或药物组合物与其他通常施用的“护理标准”疗法；或与其他用于靶向患者群体的疫苗(包括，例如，肺炎球菌疫苗如PNEUM0VAX 23 (PN23, Merck & C0., Inc.)、乙型肝炎(HBV)疫苗如 RECOMBIVAX HB 或 ENGERIX-B (GlaxoSmithKline Biologicals)和流感疫苗)伴随地施用。在本文提供的治疗/预防方法的特定实施方案中，所述方法进一步包括允许适当预定量的时间经过，并将一个或多个额外剂量的药物组合物施用于患者。在所述实施方案中，可以在已经经过适当量的时间后将一个额外剂量施用于患者，可替代地，两个、三个或四个额外剂量，每个在已经经过适当量的时间后施用。在一个示例性实施方案中，将3或4个剂量作为给药方案的部分施用于患者，所述给药方案在一段时间正确分开。本领域技术人员将意识到，剂量之间的时间量可能根据患者群体、疫苗剂量和/或患者依从性而变化。在一个示例性实施方案中，在将每个剂量施用于患者之间允许经过约3周、约I个月、约6周、约2个月或约3个月或更长的时间期间。在一个特定实施方案中，将疫苗施用于患者，所述患者在移植前(例如，移植前3周、I个月或2个月)经历移植，并且将额外一个或多个剂量在移植后适当时间(例如，移植后3周、I个月或2个月)给予患者，每个剂量之间经过预定量的时间。本文提到的所有出版物通过引用并入，其目的为描述并公开可以与本发明关联使用的方法和材料。本文任何内容均不被解释为承认本发明无权凭借先前发明早于这样的公开内容。已经参照附图描述了本发明的优选实施方案，应当理解的是，本发明不限于那些精确实施方案，并且在不背离如随附权利要求定义的范围或精神的情况下，本领域技术人员可以在其中影响各种变化和修改。下列实施例说明但非限制本发明。材料和方法 实施例1 水痘噬斑测定
用Krah等人(7； Virol Methods (1990) 27:319-326)描述的液体覆盖操作测量水痘带状疱疹病毒(VZV)制剂的感染性滴度。如下进行测定:以600，000细胞/5 mL体积的具有100 mg/L半乳糖、50 ug/mL新霉素、2 mM L-谷氨酰胺的BME (具有Hank氏平衡盐溶液的基础培养基Eagle)将MRC-5 (人二倍体肺成纤维细胞)细胞接种在60_mm组织培养板中，并在5% 土 1% CO2潮湿气体中在35土 1°C孵育。孵育24-56小时后，细胞达到50-80%汇合，并用于噬斑测定。通过抽吸除去细胞生长培养基，用在适当稀释剂如PGS稳定剂(具有蔗糖和水解明胶的PBS)中稀释的VZV溶液的100 μ L等分试样感染细胞。允许细胞在5% 土 1% CO2潮湿气体中在35土 1°C贴壁彡I小时。然后将用5mL体积的维持培养基(具有Earle氏盐的最低必需培养基(MEM)，2 %热灭活的胎牛血清，50Pg/mL新霉素和2 mML-谷氨酰胺)覆盖培养物，并返回在5% 土 1% CO2潮湿气体中在35土I °C孵育6-7天用于噬斑产生。然后从板抽吸培养基，通过用在乙醇、I %乙酸中0.2% (w/v)考马斯亮蓝R-250的溶液染色细胞而使噬斑可视化。噬斑计数为3-5块重复板的平均值，并乘以稀释系数(测试病毒的相应稀释度的倒数)和接种体积校正因子(10，从0.1mL调整至I mL),以提供曬斑形成单位/mL(PFU/mL)。鉴于迫切需要确信不存在灭活样品的假阳性PFU结果(其中由于单层的无意刮伤或由于存在细胞聚丛，噬斑样点可能出现在用于噬斑测定的细胞单层中)，开发免疫染色方法并应用以验证计数为斑块的灶(foci)确实是VZV感染的细胞灶(VZV噬斑)。简而言之，在标准噬斑测定中用考马斯亮蓝染色后，具有可见噬斑的培养物用在PBS，0.05% Tween20中稀释的多克隆抗VZV血清孵育，并在35°C孵育I小时。细胞用PBS，0.05% Tween 20洗涤以去除未结合抗体，使 用过氧化物酶缀合的山羊抗人IgG抗体和当与过氧化物酶反应时发生沉淀物的过氧化物酶底物(二氨基联苯胺溶液)检测结合的抗体。在含有VZV的灶周围发生棕色沉淀物，除了用考马斯亮蓝染料观察到的那些之外没有检测到任何额外噬斑。因此,使用抗VZV —级血清、过氧化物酶缀合的抗一级种类抗体和过氧化物酶底物的组合的这种免疫染色方法提供了验证灭活样品中疑似噬斑是否确实代表剩余的感染性VZV的方法。实施例2
竞争性VZV抗原ELISA和直接结合VZV抗原ELISA测定
使用两种抗原测定形式表征并定量VZV抗原。在选择研究中使用竞争性抗原ELISA，其模拟用于估计VZV商业化产品中的VZV抗原的测试并利用单一多克隆血清来检测VZV抗原。为了提供Y辐射或其他灭活处理后VZV抗原的反应性的额外表征，开发并应用直接结合ELISA，其中将测试样品直接吸附至微量滴定ELISA板，然后使用单克隆或多克隆抗体检测。用于VZV抗原定量的竞争性ELISA
简而言之，通过将来自测试样品的VZV抗原与固定量的多克隆抗VZV血清在溶液中孵育而进行该测定。允许剩余的游离抗体(未结合抗原)结合至在ELISA微量滴定板上固定的标准VZV抗原。能够结合板的抗体的量与测试样品中的抗原量成反比。通过与酶联抗人抗体和适当底物反应以提供分光光度法定量的有色产物而定量结合板的抗体。测试程序包括以下步骤:(I)用来自VZV感染或未感染的MRC-5细胞的糖蛋白(gps)包被ELISA板，并用1% (w/v)牛血清白蛋白过量包被以降低抗体非特异性吸附至板。
(2)测试VZV抗原 稀释在聚丙烯微管中的PGS稳定剂中。包括已知抗原滴度的VZV抗原制剂作为对照。样品通常通过系列1: 1.25倍稀释而稀释以包括范围为2.6至0.9抗原单位/mL的抗原浓度。使用VZV标准品的稀释系列来生成用于测量测试样品中抗原的标准曲线。
(3)人抗VZV血清稀释在PGS稳定剂中至期望的最终稀释度的2倍。(4)将300μ 体积的稀释抗原分配进聚丙烯微管中，与300 PL稀释的抗VZV血清混合，并在35-37°C孵育15-30分钟。使用抗VZV血清加稀释剂(无抗原)作为对照。(5)将来自每份血清-抗原混合物(和对照)的100 μ 整分试样加入2个一式两份的VZV gp包被孔和2个MRC-5 gp包被孔中。(6)板在35-37°C孵育15-30 min以允许游离抗体(未与溶液中的测试抗原复合)结合在板上固定的gp抗原。(7)通过洗涤除去未结合抗体，并且孔接受碱性磷酸酶缀合的山羊抗人IgG抗体溶液以检测结合的人抗体。(8)在35-37°C孵育15-30 min后，通过洗涤除去未结合的缀合物。通过在35-37°C与对硝基苯基磷酸盐底物孵育10-15 min而检测结合的缀合物。(9)通过加入50 μ 3 M NaOH而终止底物反应后，用微孔板分光光度计定量显色(在405nm处的0D)。测试计算和解释包括以下步骤:(I)对重复的VZV和MRC-5 gp包被孔的各自重复的OD值取平均值。根据经验已知，MRC-5 OD在不同的样品和稀释物之间是一致的。因此，通常对测试的整个组的MRC-5 gp OD值取平均值，并用来校正一级抗体的非特异性结合(抗VZV血清)。从各自平均的VZV gp OD减去平均的MRV-5 gp OD以提供VZV特定(Λ 0D)值。(2)产生用于测量抗原量的标准曲线:将标准曲线△( 值针对已知抗原浓度(VZV抗原单位/mL)作图。将数据输入适当的图形程序中，鉴定该曲线的线性部分，获得对于该线性曲线的“线性拟合公式”(y=a+bx)。(3)计算测试样品的抗原量:因为由线性拟合公式给出了 a和b的值并且y (AOD)是已知的，然后可以计算代表单位/mL抗原的未知值X，并通过样品稀释度校正以获得原始(未稀释)测试样品的抗原浓度。报道的抗原浓度是用提供标准曲线的线性部分内的AOD值的最低稀释样品获得的值。直接结合VZV抗原ELISA
简而言之，通过在96孔微量滴定板中孵育来自测试样品的VZV抗原的稀释液以固定抗原并随后用单克隆或多克隆抗VZV抗体检测结合的抗原而进行该测定。通过与酶联的抗适当种类抗体和适当底物反应以提供分光光度法定量的有色产物而定量结合的抗VZV抗体。然后比较样品的OD与稀释度相比的滴定曲线(定量为滴定曲线之间的倍数稀释差异(“曲线移位”)。测试程序包括以下步骤:(I)用200 μ I在PBS中1:20至1:2560的系列2倍稀释的稀释的抗原(疫苗)包被高结合ELISA板。覆盖所述板，并在2-8°C存储过夜。(2)倒出来自步骤#1的液体，并且板用PBS + 0.05% Tween 20冲洗3次。除去最后冲洗液并加入稀释的抗体(100 μ /孔)。板在35 °C孵育I小时。(3)倒出来自步骤#2的液体，并且所述板用PBS + 0.05% Tween 20冲洗3次。除去最后冲洗液并加入稀释的缀合物(100 μ I/孔)。板在35°C孵育I小时。(4)倒出来自 步骤#3的液体，并且所述板用PBS + 0.05%Tween 20冲洗3次。除去最后冲洗液并加入底物(未稀释)。然后板在35°C孵育30min。
(5)用NaOH终止反应。(6)通过在405nm处读板测定光密度(OD)。用于该实验的抗体如下:针对gE (Biodesign目录# mab8612)、gB (Chemicon目录 #C05102M, Millipore Corp., Billerica, MA)和 gH (Biodesign 目录 #C05104M和 Virusys 目录 #VA033_100, Virusys Corp., Taneytown, MD)的 EPP 血清和纯化的单克隆抗体。使用的缀合物是抗人IgG(BioSource目录# AH10305, Invitrogen Corp.,Carlsbad, CA)或山羊抗小鼠 IgG (Pierce 目录 # 31322, Pierce Biotechnology Inc.,Rockford, IL)。使用喊性憐酸酶 pNPP (Sigma 目录 #p7988, Sigma-Aldrich C0., St.Louis, MO) IOOmL 作为底物。实施例3
VZV IFNy ELISP0T 测定
简而言之，范围为I至0.125 VZV抗原单位/mL的测试抗原的连续稀释液与来自6位供体的PBMC在一式两份孔中孵育。孵育后，通过其产生干扰素Y的能力鉴定对VZV抗原应答的细胞。使用在微量滴定板上包被的小鼠抗干扰素Y和匹配的二级抗小鼠IgG酶缀合的抗体和底物，导致干扰素Y产生细胞(“斑点”)周围的沉淀底物的检测，从而检测干扰素Y产生。通过自动ELISP0T读数器定量斑点形成细胞(SFC:形成表明干扰素Y分泌的斑点的那些)的数量，并且结果表示为SFC/106 PBMC。结果 实施例4
Y辐射的VZV的灭活动力学。我们以前已经测试了热处理作为灭活用作用于免疫功能低下患者的疫苗的冻干VZV的方法，但是发现，该方法导致病毒制剂的剩余感染性(见下文)。据认为，该剩余感染性不是“灭活”疫苗的最佳特征。实现了液体容积物疫苗相对于冻干疫苗更广泛的灭活，但是测定容积物疫苗的热处理无法提供最佳的制造过程。因此，研究使用Y辐射6tlCo的用于冻干的水痘带状疱疹病毒疫苗(Oka/Merck)的可替代的灭活方法，以观察是否可以鉴定比热处理更广泛的感染性灭活(产生更有利更安全的特征)方法。本评价的目标首先是确定是否可以通过6tlCo辐射实现更广泛的感染性灭活，并且然后其次，Y辐射后实现的抗原特性是否不同于热处理材料的抗原特性，并且对于临床应用研究是否是接受的。使用 1、2、3、
4、5、6、7、8 kGy (2007)或 0.45、1.35 和 2.7 kGy 辐射 VZV 小瓶。使用 60Co Gammacell 辐射器(Best Theratronics Ltd.Corporation, Ottawa, Ontario, Canada)进行福射。使用在MRC-5细胞中的水痘噬斑测定确定每辐射剂量(Gy)的每小瓶的剩余PFU/mL。将log PFU/mL针对辐射剂量作图，并且数据点显示灭活的线性回归(图1)。动力学研究后，我们测试了 IOOmL用达12kGy的6tlCo射线辐射的灭活VZV疫苗(灭活且冻干的)以允许进一步确认灭活程度(通过测试更大的总体积)。在IOOmL样品中检测到零个噬斑。此外，使用6tlCo射线辐射VZV容积物。解冻容积物并等分在PETG瓶中用于在0.5、
1、2、3、4、5、6 kGy辐射(图2)。使用MRC-5细胞在水痘噬斑测定中分析辐射的容积物的剩余感染性。在IOOmL福射的容积物中检测到零个曬斑。通过将log pfu/mL针对福射时间作图而观察到线性灭活动力学。实施例5
通过VZV IFNy ELISP0T测定评价免疫原性
为了评价不同灭活方法对免疫原性的影响，使用6份供体外周血单核细胞(PBMC)样品如实施例3中描述进行VZV IFNy ELISP0T测定。进行该研究以确定VZV在不同条件下灭活后IFN- Y应答是否减弱。测试5份热处理的VZV容积物制剂连同2份Y -辐射的VZV容积物制剂。热处理的VZV制剂由在下列条件下处理的样品组成:(I) 40°C持续24小时，
(2)451:持续3. 5小时，(3) 451:持续4.5小时，(4) 56°C持续30分钟，和(5) 56°C持续90分钟。Y辐射的样品由在5.92 kGy Y辐射3或4个小时的VZV容积物组成。还测试来自与上文用于产生灭活样品的那些相同的容积物制剂的活(未处理)VZV样品用于比较。还包括通过用UV光处理而灭活的大量VZV，以ELISP0T抗原(VZV批号# 96.07)作为测定运行对照，连同PHA(阳性对照)和媒介物(阴性对照)。跨越1:40至1:320的系列2倍稀释评价所有抗原。进行测试6份PBMC样品的一次测定运行，所述6份PBMC样品被选择以代表一定范围的VZV应答水平。获得的VZV斑点计数(SFC/106 PBMC)显示于图3A_F中。没有任何证据提示在测试的供体中灭活的抗原制剂与未处理的抗原制剂相比的VZV应答的差异。也没有在特定稀释水平在制剂(处理)和应答之间的显著相互作用的证据。相对于活VZV制剂，在ELISP0T计数中对于8份灭活VZV制剂(包括原始VZV批次#96.07)的倍数差异的范围为相对于活VZV制剂的1.15倍更低(56°C持续90分钟)至1.14倍更高(40°C持续24小时；批次#96.07)。相对于活VZV制剂，在测试的供体中，8份灭活VZV制剂都没有产生统计学显著更低的ELISP0T计数。因此，人ELISP0T测试显示，使用来自一组供体的PBMC，对于通过不同程序(容积物的401:、451:、561:热处理或Y射线)灭活的VZV制剂，在应答中没有显著性差异。实施例6
灭活VZV疫苗的电子显微镜分析
进行热处理和Y辐射的容积物和冻干疫苗的EM分析以提供灭活对灭活VZV制剂的影响的额外表征。选择的分析方法是在玻璃冰中的冷冻透射电子显微镜(冷冻TEM)，所述玻璃冰用于在EM分析期间最佳保持病毒完整性。通过NanoImaging Services, Inc (SanDiego, CA)进行冷冻 TEM。制备灭活VZV样品用于EM分析以评价灭活对颗粒完整性/外观的影响。用700 μ L灭菌蒸馏水使冻干样品再水化，并在成像前没有进一步稀释。样品保存在400目铜网上
2.0x0.5 um C-平面多洞碳膜(Protochips, Inc., Raleigh, NC)上支持的玻璃冰的薄膜中。临使用前在Solarus等离子体清洗器(10秒，25% O2, 75% Ar)中清洗网格。通过将一滴Γ3 μ L)样品悬浮液施加到等离子体清洗的网格，用滤纸吸去，并立即用FEI Vitrobot (4C, 95% RH)在液态乙烷中玻璃化处理而制备所有样品。网格存储在液氮下，直到被转移至电子显微镜用于成像。使用配备FEI Eagle 4K x 4K CC相机(FEI公司)在120 KeV操作的FEI Tecnai T12电子显微镜(FEI公司，Hillsboro, OR)进行电子显微镜分析。以多标尺获得每个网格图像以评价样品的总体分布。在鉴定用于以低放大率成像的目标区域后，获得更高放大率图像对。使用Nanolmaging系统仪器(21K-52K放大率)评价样品。比较未处理的冻干VZV、在56°C热处理77天的冻干VZV和使用6ciCo源辐射至25或50 kGy的冻干VZV。
冷冻M结果表明在高Y辐射剂量的潜在的颗粒影响，具有电子密度的降低(也许反映了病毒DNA的降解)，但对于冻干样品的整体颗粒和蛋白外观没有显著影响。然而，冻干可以保护免于这些变化，因为冻干灭活样品显示出电子密度的损失，但在更高剂量时颗粒保持完整。(参见图4)。实施例7 抗原反应性的测定
使用针对VZV gB、gH、gE的人多克隆血清和单克隆抗体(mAb)作为检测抗体进行VZVAg ELISA测定以确定热或Y辐射灭活的容积物样品或Y辐射的冻干VZV的抗原(Ag)含量。Y辐射的容积物或冻干样品显示抗原反应性没有变化。然而，在56°C热处理90分钟的样品显示与多克隆、gE和gH单克隆抗体的抗原反应性的变化。在25kGy和50kGy Y辐射额外的VZV容积物样品以支持使用50kGy作为用于最终灭菌的暴露上限。在与针对gpE、gB和gH的多克隆抗VZV血清和mAb的直接结合抗原ELISA测定中测试这些样品。y辐射冻干VZV疫苗至灭菌条件(25_50kGy)没有可检测地影响抗原与多克隆血清或gE或gB单克隆抗体的ELISA反应性。由于高背景染色，使用gH mAb的结果是不确定的。使用可替代的ELISA板(MaxiSorp)也观察到用这种单克隆抗体(而不是针对gE或gB的那些)的增加的背景信号。实施例8 小鼠免疫原性
进行小鼠免疫原性研究以评价一组使用各种灭活方法产生的灭活VZV(iVZV)制剂。在VZV ELISA测定中评价从研究产生的血清样品以确定针对通过不同灭活VZV制剂产生的VZV的抗体的相对滴度。产生并评价两种不同VZV容积物制剂:(I)在56°C热处理90分钟的VZV容积物，和(2)用5，924.7戈瑞(Gy) Y辐射3小时的VZV容积物。还产生并评价两种不同VZV冻干疫苗制剂:(I)在56°C热处理50天的冻干的VZV疫苗，和(2)用25，000Gy Y辐射的冻干的VZV疫苗。评价活(未处理)VZV容积物和活(未处理)VZV冻干疫苗用于和iVZV容积物制剂比较。在第O、14和29天用4.5 VZV抗原单位(U) /小鼠(9U/mL)腹膜内(1.p.)免疫BALB/c小鼠(对于每组n=16)。在第-1天(采血前)和第13、28和43天采集血液(血清)。在VZV ELISA中评价第28天血清(剂量2后14天)的IgG应答。调整的VZV滴度(VZV滴度减去MRC-5滴度)显示于图5中。用来自第28天的相应组测试采血前血清以确定对于MRC-5和VZV的滴度截止值。用UV处理的VZV或MRC-5提取物包被ELISA板的孔，然后与测试小鼠血清的稀释液孵育以定量小鼠血清中对于VZV特异性的抗体的相对量。结果表明，相 对于未处理的容积物，热处理容积物的IgG滴度平均为5.57倍更低(95% Cl =(3.45,8.99))，并且Y -辐射容积物的IgG滴度平均为2.43倍更低(95% Cl= (1.51,3.93))。与未处理的冻干病毒相比，热处理的冻干滴度平均为1.38倍更低(95% Cl=(1.00, 1.90)), Y-辐射的冻干滴度平均为1.66倍更低(95% Cl =(1.22,2.26)) 0与用热处理容积物免疫后获得的滴度相比，用Y辐射容积物的抗体滴度平均为2.29倍更高(95% Cl = (1.54，3.41))。与用热处理冻干制剂免疫后获得的滴度相比，用Y辐射冻干病毒的抗体滴度平均为1.20倍更高(95% Cl = (0.89, 1.61))。总体数据支持在这个模型中冻干病毒的Y辐射对免疫原性具有最少的影响。结果显示，与未处理的容积物相比，用2个剂量的灭活制剂免疫后在小鼠中的抗体(IgG)应答降低。实施例9
将灭活VZV疫苗施用于50至59岁的健康患者。在随机双盲2部分多中心研究中将Y辐射VZV疫苗施用于50至59岁大的健康成人，其设计用于评价疫苗的安全性、耐受性和免疫原性。本研究的目的是研究通过Y辐射或热处理方法灭活的疫苗批次的安全性、耐受性和免疫原性。将总共161位50岁至59岁大的健康个体2:2:1随机化以接受作为4剂量方案给予的16至25 kGy灭活的、辐射的VZV疫苗“A” (n=65)、热处理VZV疫苗(n=63)或安慰剂(n=33)。相隔约30天施用每个剂量。热处理疫苗和Y-辐射疫苗“A”源自独立的容积物批次，但通过针对相似的抗原含量而控制。主要假设是，在16至25kGy的水平灭活的Y辐射VZV疫苗(A)可以引发可接受的VZV特异性免疫应答，正如在剂量4后28天通过gpELISA所测量的。第二个假设是，热处理VZV疫苗可以引发可接受的VZV特异性免疫应答，正如在剂量4后28天通过gpELISA所测量的。成功的统计学标准对应于在热处理VZV疫苗受体中几何平均倍数的上升(GMFR)上两侧95%置信区间的下限为〉1.0。在该研究中疫苗受体中的免疫原性结果提供在图6中。结果表明，满足对于测试主要和第二假设的成功标准，即当施用于健康个体时，Y辐射的VZV疫苗A和热处理VZV疫苗是免疫原性的。两种疫苗都具有与安慰剂组的安全性特征类似的安全性特征。实施例10
将用不同水平Y辐射灭活的VZV疫苗批次施用于50至59岁的健康志愿者。
进行第二项研究以提供关于用更广范围的Y辐射灭活的疫苗批次的临床数据。在本研究中，将总共129位50岁至59岁大的健康个体1:1随机化以接受作为4剂量方案给予的16至25 kGy辐射的、辐射的VZV疫苗“B”(n=65)或25至50 kGy辐射的、辐射的VZV疫苗“C” (n=65)，相隔约30天施用每个剂量。本研究中使用的疫苗批次B & C源自具有相同VZV抗原含量的相同容积物批次和相同填充物/制剂，但在不同Y辐射水平被灭活。本研究的第一个主要假设是，在25至50kGy的水平灭活的Y辐射的VZV疫苗(C)可以引发可接受的VZV特异性免疫应答，正如在剂量4后28天通过gpELISA所测量的。第二个主要假设是，在16至25kGy的水平灭活并且对于抗原含量与在25至50kGy灭活的疫苗匹配的Y辐射的VZV疫苗(B)将引发可接受的VZV特异性免疫应答，正如在剂量4后28天通过gpELISA所测量的。对于每个假设的成功的统计学标准对应于在Y辐射疫苗受体中GMFR上两侧95%置信区间的下限为> 1.0。在该研究中疫苗受体中的免疫原性结果提供在图7中。本研究的结果表明，满足对于测试主要假设的成功标准，即当施用于健康个体时，Y辐射的VZV疫苗B (16-25 kGy Y辐射)和、辐射的VZV疫苗C (25-50 kGy Y辐射)是免疫原性的。两个疫苗组具有相似的安全性特征。本研究的结果还表明，存在基线几何平均滴度(GMT)的不平衡；B组基线GMT为 313，C组基线(GMT)为 429。尽管倍数上升差异不显著，但是基线滴度的差异可能是测试中观察到的倍数上升差异的原因。此外，分析数据表明，更高的Y辐射剂量(>25 kGy)导致更高的抗原降解。`
权利要求
1.灭活的水痘带状疱疹病毒(VZV)，其中所述VZV的感染性是检测不到的，并且其中所述灭活的VZV当施用于患者时诱导针对VZV的免疫应答。
2.药物组合物，包含治疗有效量的权利要求1的VZV和药学上可接受的载体。
3.权利要求2的药物组合物，其中所述灭活VZV的感染性是 Ο.040噬斑形成单位(PFU)/mL。
4.权利要求3的药物组合物，其中所述灭活VZV的感染性是i0.0lO噬斑形成单位(PFU)/mL。
5.权利要求4的药物组合物，其中所述灭活VZV的感染性是 Ο.002噬斑形成单位(PFU)/mL。
6.权利要求2-5中任一项的药物组合物，其中所述VZV毒株是Oka毒株或Oka毒株衍生物。
7.权利要求6的药物组合物，其中所述组合物是冻干的。
8.权利要求7的药物组合物，其中所述VZV是通过Y辐射灭活的。
9.权利要求8的药物组合物，其中与包含相同量的没有灭活VZV的对照样品引发的免疫应答相比，所述组合物弓I发的免疫应答没有显著不同。
10.权利要求9的药物组合物，其中所述灭活VZV引发的免疫应答与所述对照样品引发的免疫应答的差异为约25%或更小。
11.权利要求2- 5中任一项的药物组合物，其中通过水痘噬斑测定来确定所述VZV的感染性。
12.制备灭活的水痘带状疱疹病毒(VZV)的方法，所述方法包括用约5至约50kGy的Y辐射来Y辐射包含VZV的样品。
13.权利要求12的方法，其中通过将所述样品暴露于6tlCo射线而将所述Y辐射提供给所述样品。
14.权利要求13的方法，其中所述VZV是Oka毒株或Oka毒株衍生物。
15.权利要求13的方法，其中所述样品在被辐射前冻干。
16.权利要求14或权利要求15的方法，其中使用的Y辐射量是约25kGy或更低。
17.权利要求16的方法，其中所述疫苗是液体容积物制剂，并且使用的Y辐射量是约5kGy 至约 12.5 kGy。
18.权利要求15的方法，其中使用的Y辐射量是约10kGy至约25 kGy。
19.通过权利要求12-18中任一项的方法产生或获得的灭活VZV。
20.疫苗，包含治疗有效量的权利要求19的灭活VZV和药学上可接受的载体。
21.用于治疗受试者中带状疱疹的方法，所述方法包括将药物组合物施用于受试者，所述药物组合物包含治疗有效量的灭活的水痘带状疱疹病毒(VZV)和药学上可接受的载体，其中所述VZV是使用Y辐射灭活的。
22.权利要求21的方法，其中所述药物组合物的施用途径是皮下的或肌肉内的。
23.权利要求22的方法，其中所述受试者是50岁大或更大的。
24.权利要求22或23的方法，其中所述受试者是免疫功能低下的。
25.权利要求24的方法，其中所述受试者具有至少一种选自下述的状况:患有血液恶性肿瘤、经历免疫抑制治疗、接受造血干细胞移植、接受实体器官移植、HIV感染和患有自身免疫性疾病。
26.权利要求22或23的方法，其中所述方法进一步包括允许预定量的时间经过，并将一个或多个剂量的所 述药物组合物施用于所述受试者。
全文摘要
本发明提供了灭活的水痘带状疱疹病毒(VZV)和包含所述灭活VZV的组合物和疫苗，其中所述灭活VZV的感染性是检测不到的，并且其中所述灭活VZV当施用于患者时诱导针对VZV的免疫应答。在本文描述的组合物的实施方案中，所述VZV是用γ辐射灭活的。本发明还提供了制备灭活VZV疫苗的方法，所述方法包括用约5kGy至约50kGy的γ辐射来γ辐射包含VZV的样品。本发明还提供了治疗HZ或与VZV再活化相关的其他疾病或针对其免疫的方法，所述方法包括将疫苗或药物组合物施用于受试者，所述疫苗或组合物包含治疗有效量的灭活VZV和药学上可接受的载体，其中所述VZV是通过γ辐射灭活的。
文档编号C12N7/04GK103167880SQ201180046512
公开日2013年6月19日 申请日期2011年8月4日 优先权日2010年8月5日
发明者D.L.克拉, J.德黑文, J.A.克里斯, C.M.巴, M.亚戈迪奇 申请人:默沙东公司
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