含有内部非核酸间隔子的单链RNAi试剂的制作方法

xiaoxiao2020-6-24  5

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专利名称:含有内部非核酸间隔子的单链RNAi试剂的制作方法
含有内部非核酸间隔子的单链RNAi试剂
相关申请的交叉引用 本申请要求2010年8月24日提交的美国临时申请号61/376,471 (此处通过引用并入本文)的权益。
发明背景 RNA干扰(RNAi)通路是基因调控的进化上保守的模式。RNAi过程是由从各种外源性或内源性来源(例如,实验引入,病毒感染)产生的双链RNA(dsRNA)起始的。dsRNA被Dicer切割以产生20-25核苷酸小干扰RNA(SiRNA)双链体。然后这些双链体被装载至RNA诱导的沉默复合物(RISC)上,在RISC被激活之前,双链体的过客/有义链被除去。单引导/反义链保持与RISC结合并引导目标mRNA的裂解。因此,双链siRNA已经变为研究和基于核酸的疗法的重要工具。
RNAi基因沉默可以经由单链或双链RNA分子发生。在最近十年中,已经报道,单链反义siRNA和siRNA双链体几乎是一样有效的(参见,例如Schwarz等人,2002,Mol.Cell.10:537-548 ;Martinez 等人,2002,Cell 110:563-574 ;Amarzguioui 等人,2003, Nucleic Acids Res.31:589-595 ;和 Holen 等人,2003,Nucleic Acids Res.31:2401-2407)。与双链的版本相比,利用单链RNA分子用于基因沉默有一些好处。它们更低的分子量可以使它们更容易穿过细胞膜。单链RNA分子也是双链siRNA的质量和体积的一半,这暗示了制造成本优势。因此,在制定适用于单链RNA干扰分子的新的且有利的设计特征中仍然具有高度的兴趣。
发明概述 本发明提供单链RNA分子,所述单链RNA分子包含:(a)核酸部分,其包含两个或更多个核苷酸部分,和(b)内部(与“末端”相比)间隔子部分,其包含一个或多个非核苷酸间隔子部分,其中非核苷酸间隔子部分共价连接所述分子的两个核苷酸部分。本发明的单链RNA分子的核苷酸部分不 是彼此互补的,因此,所述部分不形成碱基对。本发明的单链RNA分子起引导或反义链的作用,所述引导或反义链能够通过RNA干扰机制抑制基因表达,因此,代表单链RNAi试剂。
本发明的单链RNAi分子具有单链寡核苷酸结构,并且介导针对目标RNA的RNA干扰。单链RNAi分子包含:(a)核酸部分,包含第一核苷酸部分(NI)和第二核苷酸部分(N2),其中所述核酸部分包含可与目标RNA碱基配对的至少8个核苷酸,其中所述核酸部分内的核苷酸总数为8-26个核苷酸;和,(b)内部间隔子部分,包含至少一个第一非核苷酸间隔子部分(SI),所述第一非核苷酸间隔子部分(SI)共价连接第一和第二核苷酸部分。第一和第二核苷酸部不是自我互补的。本发明的单链RNAi分子的核苷酸总数(例如,8-26个)分布在分子的核苷酸部分之间,其中每个核苷酸部分包含至少一个核苷酸。
在一个实施方案中,本发明的单链RNAi分子的核酸部分包含两个核苷酸部分,被称为第一核苷酸部分(NI)和第二核苷酸部分(N2)。本发明的RNAi分子的第一和第二核苷酸部分共价连接至分子的非核苷酸间隔子部分。在另一个实施方案中,本发明的单链RNAi分子的核酸部分包含多于一个核苷酸部分(例如,3、4、或5个,分别被称为第三(N3),第四(N4)或第五(N5)核苷酸部分)。
在一个实施方案中,本发明的单链RNAi分子的内部间隔子部分仅仅包含一个非核苷酸间隔子部分,被称为第一非核苷酸间隔子部分(SI)。本发明的RNAi分子的第一非核苷酸间隔子部分(SI)共价连接至两个核苷酸和/或非核苷酸替代物,所述核苷酸和/或非核苷酸替代物每个位于单链分子的不同的核苷酸部分内。在另一个实施方案中,本发明的单链RNAi分子的内部间隔子部分包含多于一个非核苷酸间隔子部分(例如,2、3、或4个,分别被称为第二(S2)、第三(S3)或第四(S4)非核苷酸间隔子部分)。
本发明的单链RNAi分子包含与细胞中的RNA目标位点部分、基本上或完全互补的核苷酸序列。
在一个实施方案中,本发明的单链RNAi分子包含与天然存在的miRNA的引导链部分、基本上或完全同源的 核苷酸序列,因此起miRNA模拟物的作用。本发明的单链miRNA模拟物基于对应的天然存在的miRNA设计,其中至少一个非核苷酸间隔子部分或位于天然存在的miRNA引导链序列的两个相邻核苷酸之间,或将其取代天然存在的miRNA引导链序列的1-约12个内部(即,非末端的)核苷酸。
在另一个实施方案中,本发明的单链RNAi分子是单链siRNA或双链体siRNA的引导/反义链的类似物,其中所述单链RNAi分子包含与对应的单链siRNA或对应的双链体siRNA的引导链部分、基本上或完全同源的序列。可以已知对应的单链siRNA或双链体siRNA通过RNAi机制抑制基因表达。在该实施方案中,单链RNAi分子代表单链siRNA模拟物。本发明的单链siRNA模拟物基于对应的siRNA设计,其中至少一个非核苷酸间隔子部分或位于siRNA引导链序列的两个相邻核苷酸之间,或将其取代对应的siRNA引导链序列的1-约4个核苷酸。
本发明的单链RNAi分子可以包含取代、化学修饰的核苷酸和非核苷酸,包括骨架、糖、碱基或核苷的取代或修饰。在某些实施方案中,本发明的取代的或修饰的单链RNAi分子可以帮助在更低剂量实现给定的治疗效果,因为这些分子可以被设计为具有在受试者或生物样品(例如,血清)中增加的半衰期。此外,某些取代或修饰可用于通过针对特定细胞或组织或改进单链RNAi分子的细胞摄取而改进单链RNAi分子的生物利用度。
本发明的单链RNAi分子的内部间隔子部分可以包含一个或多个非核苷酸间隔子部分。非核苷酸间隔子部分可以包括可进一步取代的任何脂族或芳族化学基团,其中所述间隔子部分不包含核苷酸。可以用为单链RNAi分子提供额外功能的化学部分取代间隔子部分。例如,可以用特异性结合感兴趣的目标分子或促进/增强分子的细胞递送的部分取代非核苷酸间隔子部分。在本发明的一个实施方案中,非核苷酸间隔子部分包括优选1-20个碳并且可以任选被取代的烷基、烯基或炔基链。
本发明的单链RNAi分子是有用的试剂,其可用于多种治疗、诊断、目标验证、基因组发现、基因工程和药物基因组学应用的方法中。因此,本发明进一步包括包含本发明的单链RNAi分子的组合物和用于抑制一种或多种对应的目标mRNA在细胞或生物体中的表达的方法。本发明提供了用于治疗受试者,包括人细胞、组织或个体的方法和单链RNAi分子组合物。
附图简要说明

图1显示使用RT-qPCR测定的包含C3间隔子的单链miR-124类似物抑制VAMP3目标表达的程度。类似物的结构和序列具体描述在下述表2中。在miR-124类似物的示意图中,圆代表核苷酸,除了位于5’末端的黑色圆,其代表5’磷酸酯。空心圆代表2’-脱氧-2’-氟核苷酸。位于示意图3’末端的黑色圆代表2’ -O-甲基核苷酸,“3”代表C3间隔子的位置。在“ 124(21)-8p-16rrr”类似物的示意图中,三个内部黑色圆代表未修饰的核糖核苷酸。图中更长的条表明更大的敲低,一式两份的条表明生物学重复。
图2显示使用RT-qPCR测定的包含C6间隔子的单链miR-124类似物抑制VAMP3目标表达的程度。类似物的结构和序列具体描述在下述表2中。在miR-124类似物的示意图中,圆代表核苷酸,除了位于5’末端的黑色圆,其代表5’磷酸酯。空心圆代表2’-脱氧-2’-氟核苷酸。位于示意图3’末端的黑色圆代表2’-O-甲基核苷酸,“6”代表C6间隔子的位置。在“124(21)-8p-16rrr”类似物的示意图中,三个内部黑色圆代表未修饰的核糖核苷酸。图中更长的条表明更大的敲低,一式两份的条表明生物学重复。
图3显示对于图1和2中测试的类似物的亚组的VAMP3表达的剂量依赖性反应。VAMP3表达沿y轴表示。测试的miR-124类似物的剂量(对于结构和序列参见下述表2)沿X轴表示,范围从左侧的最低剂量至右侧的最高剂量。
图4显示使用报道分子测定的包含C3间隔子的单链miR-124类似物的抑制的程度,其测量共转染的荧光素酶报道分子的敲低,所述报道分子携带与miR-124的种子区域匹配的两个目标位点。类似物的结构和序列具体描述在下述表2中。在miR-124类似物的示意图中,圆代表核苷酸,除了位于5’末端的黑色圆,其代表5’磷酸酯。空心圆代表2’-脱氧-2’-氟核苷酸。位于示意图3’末端的黑色圆代表2’-O-甲基核苷酸,“3”代表C3间隔子的位置。在“124(21)-8p-16rrr”类似物的示意图中,三个内部黑色圆代表未修饰的核糖核苷酸。图表的一式两份的条表明生物学重复,更长的条表明更大的抑制。
图5显示使用报道分子测定的包含C6间隔子的单链miR-124类似物的抑制的程度,其测量共转染的荧光素酶报道分子的敲低,所述报道分子携带与miR-124的种子区域匹配的两个目标位点。类似物的结构和序列具体描述在下述表2中。在miR-124类似物的示意图中,圆代表核苷酸,除了位于5’末端的黑色圆,其代表5’磷酸酯。空心圆代表2’-脱氧-2’-氟核苷酸。位于示意图3’末端的黑色圆代表2’-O-甲基核苷酸,“6”代表C6间隔子的位置。在“124(21)-8p-16rrr”类似物的示意图中,三个内部黑色圆代表未修饰的核糖核苷酸。一式两份的条表明生物学重复,更长的条表明更大的抑制。
图6A和6B显示对于图3 中测试的单链miR-124类似物的亚组的两种不同的荧光素酶报道分子的目标表达抑制的剂量依赖性反应。在图6A中,显示的抑制活性针对具有与miR-124种子区域的两个匹配的荧光素酶报道分子,其代表测试的类似物的miRNA活性。在图6B中,显示的抑制活性针对具有与miR-124的两个全长匹配的荧光素酶报道分子,其代表测试的类似物的siRNA活性。
图7在两个不同的浓度(100 nM和10 nM)用具有在15 (〃485 [email protected]〃)、16("485 [email protected]")、17 ("485 [email protected]")、18 ("485 [email protected]〃)或 19 ("485 [email protected]")位(相对于寡核苷酸的5’)引入的C3间隔子的ApoB靶向的单链(引导链)寡核苷酸与相应的没有间隔子的单链寡核苷酸(“485”)比较ApoB mRNA的敲低。所有单链分子由在嘧啶和嘌呤核苷酸处的2’ -脱氧-2’ -氟核苷酸、5’磷酸酯和在3’末端处的两个2’ -O-甲基核苷酸构成。
图8和9在两个浓度(100 nM和10 nM)比较了在18位(图8)或19位(图9)具有C3间隔子的30个祀向ApoB的不同的单链序列的ApoB mRNA的敲低。单链由在x_轴上ApoB mRNA内它们靶向的位置表示。所有单链分子由在嘧啶和嘌呤核苷酸处的2’-脱氧_2’ -氟核苷酸、5’磷酸酯和在3’末端处的两个2’ -O-甲基核苷酸构成。
图10比较了使用靶向图8和图9中测试的30个不同的ApoB目标位点中每一个的单链分子在IOOnM浓度的ApoB mRNA敲低-无C3间隔子的单链(“all_flu-ρ”)、在18位具有C3间隔子的单链(〃all-flu-c3-18-p〃)和在19位具有C3间隔子的单链(〃all-f lu-c3-19-p〃)。所有单链分子由在嘧啶和嘌呤核苷酸处的2’ -脱氧-2’ -氟核苷酸、5’磷酸酯和在3’末端处的两个2’-O-甲基核苷酸构成。
发明详述 A.术语和定义 下述术语和定义如在本申请中使用地应用。
如本说明书中和随附的权利要求中所使用的,单数形式“(a) —”,“(an) —”和“(the)该”包括复数对象,除非上下文另有清楚指明。因此,例如,提到“一个细胞”包括两个或更多个细胞的组合等。
任何浓度范围、百分比范围、比值范围或整数范围应理解为包括在引用的范围内的任何整数的值,和在适当时的其分数(如整数的十分之一和百分之一),除非另有指明。
如本文所使用的,关于数的“约”或“近似”通常认为包括落在该数的任一方向(大于或小于)的5%的范围的数,除非另有指明,或否则从上下文是明显的(除了其中这个数将超过可能值的100%)。当规定范围时,端点包括在范围内,除非另有指明,或否则从上下文是明显的。
如本文所使用的,术语“包括”(及其任何形式,如“包括”和“包括”),“包含”(和其任何形式,如“包含”和“包含”),“具有“(和其任何形式,如“具有”或“具有”),或“含有”(和其任何形式,如“含有”或“含有”)是具有包括性的和开放式的,不排除额外的、未描述的元素或方法步骤。
如本文所使用的,术语“类似物”是指其如本领域公认的意义。该术语一般是指在结构上类似于母体化合物或分子(例如,核苷酸,天然存在的miRNA)但在组成上(例如,一个原子或官能团是不同的,添加的,或去除的)略有不同的化合物或分子。与初始的母体化合物或分子相比,类似物可能 具有或可能不具有不同的化学或物理特性,并且可能具有或可能不具有改进的生物或化学活性。例如,类似物可能亲水性更强,或者它可能已经改变母体化合物/分子的活性。类似物可以是初始母体化合物/分子的天然的或非天然存在的(例如,化学修饰的或重组的)变体。RNA类似物的一个实例是包含核苷酸类似物的RNA分子。核苷酸类似物是本领域公认的在糖、碱基或核苷处化学修饰的核苷酸。
如本文所使用的,术语“模拟物”是指其如本领域公认的意义。该术语一般是指结构上不同于参考分子的分子。例如,用于本发明的某些实施方案的目的的参考分子可以是不含有非核苷酸内部间隔子的天然存在的miRNA分子或单链siRNA分子。该模拟物能够行使参考分子的能力之内的生物学、生理学和/或化学功能的一种或多种或所有。模拟物和参考分子不必是功能等效物,但是模拟物应当能够行使一种或多种功能,并且如使用适合代表共有的一种或多种功能的测定或参数所测量并比较的,表现出至少5%或更多、10%或更多、20%或更多、30%或更多、40%或更多、50%或更多、60%或更多、70%或更多、80%或更多、或90%或更多的参考分子的活性。当描述结构上不同于参考RNAi分子的本发明的RNAi分子时,术语“类似物”和“模拟物”可以互换使用。
术语“核苷酸”是指其如本领域公认的意义。核苷酸一般包含核碱基、糖和核苷间键,例如磷酸酯。碱基可以是如本领域众所周知的天然碱基(标准)、修饰的碱基或碱基类似物。此类碱基一般位于核苷酸糖部分的I’位置处。另外,核苷酸可以是未修饰的或在糖、核苷间键和/或碱基部分处修饰的(也可互换地称为核苷酸类似物,修饰的核苷酸,非天然核苷酸,和非标准核苷酸等);参见例如,美国申请号12/064,014。
如本文所使用的,术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”是指其如本领域公认的意义。该术语一般是指核苷酸链。“核酸”和“核酸分子”是核苷酸的聚合物。因此,“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”在本文是互换的。本领域技术人员具有如下常识:核酸是可以水解成单体核苷酸的多核苷酸。单体核苷酸可以进一步水解成核苷。
“一段连续的核苷酸”是指至少2个核苷酸的连续系列。在该段内连接核苷酸的键是磷酸二酯键。
如本文所使用的,术语“RNA”是指其如本领域公认的意义。该术语一般是指包含至少一个呋喃核糖核苷(ribofuranoside)残基的分子,如核糖核苷酸。术语“核糖核苷酸”意指在β-D-呋喃核糖部分的2’位置处具有羟基的核苷酸。该术语是指双链RNA、单链RNA、分离的RNA如部分纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA、或通过其中一个或多个核苷酸的添加、缺失、取代和/或改变而不同于天然存在的RNA的改变的RNA。此类改变可以包括添加非核苷酸材料,例如在RNA分子的一个或多个非末端核苷酸处。因此,本发明的单链RNA分子中的核苷酸可以包含非标准核苷酸,如非天然存在的核苷酸、化学合成的核苷酸和/或修饰的核苷酸、或脱氧核苷酸。所述改变的RNA被称为“修饰的RNA”或“RNA类似物”。
如本文所使用的,术语“嘧啶”是指其如本领域公认的意义。该术语一般是指常规的嘧啶碱基,包括标准的嘧啶碱基尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶。此外,术语嘧啶被认为包括非标准嘧啶碱基或酸,如5-甲基尿嘧啶、2-硫代-5-甲基尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、假尿嘧啶、二氢尿嘧啶、乳清酸盐、5-甲基胞嘧啶等,以及化学修饰的碱基或“通用碱基”,其可以被用于取代本发明的核酸分子内的标准嘧啶。
如本文所使 用的,术语“嘌呤”是指其如本领域公认的意义。该术语一般是指常规的嘌呤碱基,包括标准的嘌呤碱基腺嘌呤和鸟嘌呤。此外,术语“嘌呤”被认为包括非标准嘌呤碱基或酸,如N2-甲基鸟嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤等,以及化学修饰的碱基或“通用碱基”,其可以被用于取代本文的标准嘌呤。
如本文所述,在两个核苷酸、核苷酸和修饰的核苷酸、两个修饰的核苷酸、核苷酸和核苷酸类似物、两个核苷酸类似物、核苷酸和非核苷酸取代部分或两个非核苷酸取代部分之间可以形成“碱基对”。在一个特定的实施方案中,非核苷酸取代物可以包含能够与细胞RNAi机制的组分结合的任何化学部分,如,例如,PAZ结构域、PIWI结构域和/或与RISC相关的其他Argonaute蛋白结构域。非常规沃森克里克碱基对也被理解为“非规范碱基对”,意指任何非沃森克里克碱基对,例如错配和/或摆动碱基对,包括翻转错配(flippedmismatches)、单氢键错配、反式类型错配、三碱基相互作用、和四碱基相互作用。此种非规范碱基对的非限制性实例包括但不限于,AC反Hoogsteen、AC摆动、AU反Hoogsteen、⑶摆动、AA N7氨基、CC 2-羰基-氨基(HI) -N3-氨基(H2)、GA剪切、UC 4-羰基-氨基、UU亚氨基-羰基、AC反摆动、AU Hoogsteen, AU反沃森克里克、CG反沃森克里克、GC N3-氨基-氨基N3、AA N1-氨基对称、AA N7-氨基对称、GA N7-N1氨基-羰基、GA+羰基-氨基N7-NUGG N1-羰基对称、GG N3-氨基对称、CC羰基-氨基对称、CC N3-氨基对称、UU 2-羰基-亚氨基对称、UU 4-羰基-亚氨基对称、AA氨基-N3、AA N1-氨基、AC氨基2-羰基、ACN3-氨基、AC N7-氨基、AU氨基-4-羰基、AU N1-亚氨基、AU N3-亚氨基、AU N7-亚氨基、CC羰基-氨基、GA氨基-N1、GA氨基-N7、GA羰基-氨基、GA N3-氨基、GC氨基-N3、GC羰基_氛基、GC N3-氛基、GC N7-氛基、GG氛基-N7、GG擬基_亚氛基、GG N7-氛基、⑶氛基-2-羰基、GU羰基-亚氨基、GU亚氨基-2-羰基、GUN7-亚氨基、psiU亚氨基-2-羰基、UC 4-羰基-氨基、UC亚氨基-羰基、UU亚氨基-4-羰基、AC C2-H-N3、GA羰基-C2-H、UU亚氨基-4-羰基2羰基-C5-H、AC氨基(A) N3 (C)-羰基、GC亚氨基氨基-羰基、Gpsi亚氨基-2-羰基氨基-2-羰基和GU亚氨基氨基-2-羰基碱基对。
如本文所使用的,术语“互补”(或“互补性”)是指其如本领域公认的意义。该术语一般是指通过常规沃森-克里克或如本文所述的其他非常规键的类型在一种核酸序列和另一种核酸序列之间形成或存在一个或多个氢键。关于本发明的示例性核酸分子,在本发明的单链RNAi和RNA目标分子之间可以发现互补性。关于核酸分子与其互补序列的结合自由能足以允许核酸的相关功能得以进行,例如RNAi活性。关于核酸分子的结合自由能的测定是本领域众所周知的(参见,例如,Turner等人,1987,CSH Symp.Quant.Biol.LII pp.123-133 ;Frier 等人,1986,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 83:9373-9377 ;Turner等人,1987,J.Am.Chem.Soc.109:3783-3785)。
如本文所用的,术语第一种核酸分子(例如,本发明的单链RNAi分子)与第二种核酸分子(例如,目标RNA分子)之间的“完全互补”(或“完全互补性”)意指第一种核酸序列的所有连续残基将与第二种核酸序列中相同数量的连续残基氢键合。例如,两条或更多的完全互补的核酸链可以具有相同数量的核苷酸(即,具有相同的长度并形成有或没有突出端的一个双链区域),或具有不同数量的核苷酸(例如,一条链可以更短,但完全包含在第二条链内)。作为实例,如果本发明的单链RNAi分子具有只有I个核苷酸的第一核苷酸部分和10个连续核苷酸的第二核苷酸部分,其中分子的第二核苷酸部分中的所有10个核苷酸都与RNA目标序列碱基配对,那么RNAi分子与RNA目标序列完全互补。当测定互补程度时,不包括第一核苷酸部分中包括的单核苷酸,因为它不在一条连续链的核苷酸内。然而,在这个实例中,如果第一核苷酸部分包含2个核苷酸,如果第一核苷酸部分的2个核苷酸和第二核苷酸部分的10个核苷酸与目标RNA序列碱基配对,那么RNAi分子与目标RNA序列完全互补。
互补核酸酸分子可能具有错误的配对碱基,即不能形成常规的沃森克里克碱基对(即,形成氢键)或其他非常规类型的碱基对(即,通过不是氢键的非常规力一起形成或结合的“错配”碱基)的碱基。术语第一种核酸分子(例如,本发明的单链RNAi分子)与第二种核酸分子(例如,目标RNA分子)之间的“部分互补”(或“部分互补性”)意指在核苷酸序列之间存在各种错配或或非碱基配对的核苷酸(例如,I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多错配或非碱基配对的核苷酸),其可以导致,例如,凸起或环。这种部分互补性可以通过由相对于涉及的核苷酸的总数的碱基配对的核苷酸的数量测定的百分比(%)互补性来代表,例如,约50%,60%,70%,80%,90%等。例如,第一种核酸分子可以具有10个核苷酸,第二种核酸分子可以具有10个核苷酸,然后第一种和第二种核酸分子之间5、6、7、8、9或10个核苷酸的碱基配对,其可能形成或可能不形成连续的双链区域,分别代表50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、或100 %的互补性。关于本发明,这样的部分互补性允许的程度是,本发明的单链RNAi分子保持其功能,例如介导序列特异性RNAi的能力。
第一种核酸分子可以与第二种核酸“基本上互补”。“基本上互补”是指,第一种核酸序列(例如,本发明的单链RNAi分子)与第二种核酸序列(例如,RNA目标序列)至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 互补。如本文所使用的,第一种核酸分子可以与第二种核酸分子既“部分互补”又“基本上互补”。
如本文所使用的,术语“同源的”(或“同源性”)是指其如本领域公认的意义。该术语通常是指已经与参考核酸序列的相同核苷酸匹配的主题核酸序列的核苷酸的数量,通常通过序列分析程序(例如,Karlin 和 Altschul, 1990, PNAS 87:2264-2268 ;Karlin 和Altschul, 1993,PNAS 90:5873-5877),或通过目视检查确定。如本文所使用的,术语“完全同源性”(或“完全同源的”)是指在参考序列和主题核酸序列之间的完全(100% )同源性或“同一性”。如本文所使用的,术语“基本上同源的”(或“基本上同源性”)是指,主题序列与参考序列中相同核苷酸位置的核苷酸共有至少50% (例如,至少55%、70%,75%,80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99% )的同源的核苷酸。
如本文所使用的,短语“化学修饰”是指其如本领域公认的意义。关于本发明的示例性核酸分子,该术语指与天然RNA的核苷酸不同的核苷酸的化学结构的任何修饰。术语“化学修饰”包含如本文所描述的或如本领域其他方面已知的天然RNA在糖、碱基或核苷酸间键上的添加、取代或修饰。在某些实施方案中,术语“化学修饰”可以是指在某些生物系统中天然存在的RNA的某些形式,例如2’ -O-甲基修饰或肌苷修饰。
如本文所使用的,短语“修饰的核苷酸”是指其如本领域公认的意义。该术语一般是指本领域一般已知的在未修饰的(或天然)核苷酸的碱基、糖和/或磷酸酯的化学结构中包含修饰的核苷酸。修饰的核苷酸的非限制性实例在本文和美国申请号12/064,014中描述。
“百分比修饰”是指其如本领域公认的意义。如本文所使用的,该术语通常是指本发明的单链RNA分子中已经被修饰的核苷酸的数量。化学修饰的程度将取决于本领域技术人员众所周知的各种因素(例如,目标RNA、脱靶沉默、核酸内切酶降解的程度)。
术语“硫代磷酸酯”是指其如本领域公认的意义。该术语一般是指包含一个或多个硫原子代替氧原子的核苷酸间磷酸键。因此,术语硫代磷酸酯是指硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯核苷酸间键。
如本文所使用的, 术语“锁定核酸”(LNA)具有通式I的结构:X:X和Y独立地选自-O-、-S-、-NO!)-、-N(R)-、-CH2-、或-CH-(如果是双键的部分)、-CH2-O-,CH2-S-, CH2-N(H) -、-CH2-N(R) -、-CH2-CH2-、和 CH2-CH-(如果是双键的部分),-CH=CH-,其中R选自氢和Q_4-烷基2和2*独立地选自核苷酸间键、末端基团或保护基团;B构成天然或非天然的核碱基;并且不对称基团可以以任一方向存在。
所示式I的四个手性中心是固定构型,但是它们构型不必是固定的。因此,手性中心可以以不同构型存在,如式11(下面)中代表的那些。因此,式I中的每个手性中心可以以R或S构型存在。R (直的(rectus))和S (左旋(sininster))的定义描述于IUPAC 1974 Recommendations, Section E, Fundamental Stereochemistry 中:该规则可以在 Pure Appl.Chem.45, 13-30 (1976)和在"Nomenclature of Organic Chemistry"Pergamon, New York, 1979 中发现。
末端基 团独立地选自氢、叠氮基、齒素、氰基、硝基、轻基、Prot-0-、Act_0_、巯基、Prot-S-、Act-S-、C卜6-烧硫基、氛基、Prot-N (Rh) -、Act-N (Rh)-、单-或双(C卜6-烧基)氛基、任选取代的CV6-烧氧基、任选取代的Ci_6-烧基、任选取代的C2_6-烯基、任选取代基的C2_6-烯基氧基、任选取代的C2.6-炔基、任选取代的C2_6-炔基氧基、单磷酸酯、单硫代磷酸酯、二磷酸酯、二硫代磷酸酯、三磷酸酯、三硫代磷酸酯、DNA嵌入剂、光化学活性基团、热化学活性基团、螯合基团、报道基团、配体、羧基、磺基(sulphono)、羟甲基、Prot- O-CH2-,Act-O-CH2'氨基甲基、Prot-N(Ra) -CH2-, Act-N(Rh) _CH2_、羧基甲基、磺基甲基,其中 Prot是-OH、-SH和-NH (Rh)分别的保护基团,Act是-OH、-SH和-NH (Rh)分别的活化基团,和Rh选自氢和C^6-烷基。
羟基取代基的保护基团包括取代的三苯甲基,如4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基(DMT)、4-单甲氧三苯甲基氧基(MMT)和三苯甲基氧基、任选取代的9-(9-苯基)咕吨基氧基(pixyl)、任选取代的甲氧基四氧_卩比喃基氧基(mthp)、甲娃烧基氧基如二甲基甲娃烧基氧基(TMS)、三异丙基甲硅烷基氧基(TIPS)7、叔丁基二甲基甲硅烷氧基(TBDMS)、三乙基甲硅烷基氧基、和苯基二甲基甲硅烷氧基、叔丁基醚、缩醛(包括两个羟基)、酰氧基如乙酰基或卤素取代的乙酰基。
“Act”指定-OH、-SH和-NH(Rh)分别的活化基团。这样的活化基团,例如,选自任选取代的O-亚磷酰胺、任选取代的O-磷酸三酯(phosphortriester)、任选取代的O-磷酸二酯(phosphordiester)、任选取代的H-膦酸酯和任选取代的0_膦酸酯。
B构成天然或非天然的核碱基,选自腺嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基-6-氟尿嘧啶、5-甲基噻唑尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤、7-丙炔-7-脱氮腺嘌呤、7-丙炔-7-脱氮鸟嘌呤、和2-氯-6-氨基嘌呤。
优选地,本发明的单链RNAi分子中使用的锁定核酸(LNA)包含式II中任一个的LNA结构:
权利要求
1.单链RNA分子,其介导针对目标RNA的RNA干扰,其中所述单链RNA包含: (a)核酸部分,包含不是自我互补的第一核苷酸部分(NI)和第二核苷酸部分(N2),其中所述核酸部分包含可以与所述目标RNA的目标位点碱基配对的至少8个核苷酸,并且其中所述核酸部分内的核苷酸总数为8-26个核苷酸;和 (i)内部间隔子部分,其中所述间隔子部分包含至少一个第一非核苷酸间隔子部分(SI),所述第一非核苷酸间隔子部分(SI)共价连接所述第一和第二核苷酸部分。
2.权利要求1的核苷酸,其包含下述结构:5, N1- S1-N2 3, 其中: (a)NI含有一个核苷酸或一段连续的核苷酸; (b)SI含有一个或多个共价连接NI和N2的非核苷酸间隔子;和 (c)N2含有一个核苷酸或一段连续的核苷酸。
3.权利要求1或2的分子,其中SI是脂族或芳族有机基团。
4.权利要求1-3中任一项的分子,其中SI是任选取代的C1-C12烷基链。
5.权利要求4的分子,其中所述烷基链任选地用胆固醇取代。
6.权利要求1-5中任一项的分子,其中SI选自C3烷基、C6烷基和聚乙二醇。
7.权利要求1-6中任一项的分子,其中NI是13至20个核苷酸长。
8.权利要求1-7中任一项的分子,其中所述核酸部分内的核苷酸总数为约19至约21个核苷酸。
9.权利要求1-8中任一项的分子,其中所述目标位点在所述目标RNA的非翻译区域内。
10.权利要求9的分子,其中所述可以与所述目标位点碱基配对的至少8个核苷酸是天然存在的内源miRNA核苷酸序列的种子序列的全部或部分。
11.权利要求10的分子,其中SI代替所述天然存在的内源miRNA核苷酸序列的I至4个内部核苷酸。
12.权利要求9-11中任一项的分子,其中所述分子的所述核酸部分与所述天然存在的内源miRNA核苷酸序列至少50%同源。
13.权利要求1-8中任一项的分子,其中所述目标位点在所述目标RNA的基因编码区域内。
14.权利要求1-13中任一项的分子,其中所述分子的所述核酸部分与所述目标位点至少90%互补。
15.权利要求1-14中任一项的分子,其中所述核酸部分包含可以与所述目标位点碱基配对的至少20个核苷酸。
16.权利要求1-15中任一项的分子,其中所述核酸部分进一步包含第三核苷酸部分(N3),并且所述内部间隔子部分进一步包含第二非核苷酸间隔子部分(S2)。
17.权利要求1-16中任一项的分子,其中至少一个核苷酸具有修饰的糖。
18.权利要求1-17中任一项的分子,其中至少一个核苷酸具有修饰的核苷间键。
19.权利要求1-18中任一项的分子,其在5’-末端、3’ -末端或5’ -和3’ -末端具有末端帽。
20.组合物,其包含权利要求1-19中任一项的单链RNA分子和药学上可接受的载体。
21.权利要求20的组合物,其进一步包含脂质体、水凝胶、环糊精、生物可降解的纳米胶囊、生物粘附性微球或蛋白性载体。
22.降低细胞中内源RNA目标基因的表达的方法,其包括施用权利要求20或权利要求21的组合 物。
全文摘要
提供了包含一个或多个内部非核苷酸间隔子的单链RNA分子,所述间隔子与所述分子的核苷酸部分共价连接。该单链RNAi分子起引导或反义链的作用,所述引导或反义链能够经由RNA干扰机制抑制基因表达,并且因此,代表单链RNAi试剂。该单链RNAi分子可用于多种治疗、诊断、目标验证、基因组发现、基因工程和药物基因组学应用的方法中。
文档编号C12P19/34GK103140582SQ201180047383
公开日2013年6月5日 申请日期2011年8月19日 优先权日2010年8月24日
发明者L.林, A.威林汉, L.赵, G.肖恩 申请人:默沙东公司

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