利用生物物质的2-吡咯烷酮的制备方法
专利名称：利用生物物质的2-吡咯烷酮的制备方法
利用生物物质的2-吡咯烷酮的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种2-卩比咯烧酮(2-pyrrolidone)的制备方法,涉及利用生物物质(biomass)来从谷氨酸(glutamic acid)或者谷氨酸盐(glutamate)制备2_批咯烧酮的方法。
背景技术：
2-吡咯烷酮是在聚合物的制备、化学反应的溶剂、特殊墨水等多种领域作为工业用原材料使用的有用的化学物质。作为以往广泛熟知的代表性的2-吡咯烷酮制备方法，是记载于巴斯夫公司(BASF)的专利申请(W003 /022811)的方法，是将作为石油化学物质的丁内酯(gammabutyrolactone)与氨水(ammonia)在液相中以高温高压反应条件下连续制备的方法。并且，公知的有将琥珀酸或琥珀酸酐作为起始物质(美国专利第4904804号)，或者将顺丁烯二酸(maleic acid)(美国专利第5912358号)或琥拍腈(Succinonitrile)(美国专利第4325872号、第4193925号、第4181662号及第4123438号)作为起始物质来制备2-吡咯烷酮的方法等，这些原料为原油依赖型，价格变动严重，且由于石油资源的不足而预想到持续性的价格上升。因这种预想，最近活跃展开要从低价的生物物质获得化学物质的研究，作为其实例，通过发酵从生物物质获得谷氨酸(glutamic acid),并通过酶反应制备作为一种氨基酸(amino acid)且作为健康功能食品原材料的4-氨基丁酸(4_aminobutyricacid)(或者‘ Y -氨基丁酸’、‘GABA, gamma-aminobutyric acid’ )的方法,并且,还公开一些从4-氨基丁酸制备2-吡咯烷酮的方法。作为从4-氨基丁酸制备2-吡咯烷酮的公知的方法，于1990年Pathak等(Tetrahedron46 (5):1733-1744 (1990))报告出在致癌性物质的前驱体合成的中间过程中，在4-氨基丁酸和过量的中性氧化铝(alumina)存在下，将甲苯(toluene)作为反应溶剂在回流温度下反应约10小时来合成2-吡咯烷酮的方法，并且，在2009年韩国化学研究院(韩国专利申请公开第2009-0128767号)中，在4-氨基丁酸添加催化剂或者脱水剂，并将甲苯作为反应溶剂，以与上述Pathak相同的方法制备了 2-吡咯烷酮。但是，这样的方法具有如下缺点:反应后需要除去催化剂的过滤工序；需要追加原材料费用；需要从反应溶剂分离提纯2-吡咯烷酮。另一方面，日本专利申请公开第2002-121183号中公开一种在200°C -300°C的高温、高压水(15兆帕斯卡-30 (megapascal))中使4_氨基丁酸和水进行反应来制备2_批咯烷酮的方法。但是，该方法也由于高温高压反应而产生不必要的应用费用的上升和在大量生产伴随着莫大的设备投资的缺点。日本专利申请公开第2009-159840号在利用4-氨基丁酸来制备吡咯烷酮(pyrrolidone)的方法中揭示了多种反应溶剂条件，尤其主张，若在4-氨基丁酸混合吡咯烷酮则可以降低反应温度，此时，揭示的反应温度优选为180°C。但是，该专利也未能提出针对过高的反应温度带来的费用问题和由于在180°C的反应温度下爆发性的生成的水(水蒸气)而产生的工序运转的困难等，大量生产时可能产生的问题的解决方案。并且，虽然熟知4-氨基丁酸在作为熔点的温度(202°C)下分解成2-吡咯烷酮和水的公知的事实(默克索引(Merck indeX)430)，然而将该方法利用于大量生产不可能一次性搅拌多量的4-氨基丁酸的同时在作为熔点的温度(202°C)下熔化而生成2-吡咯烷酮和水，并且由于在此时产生的多量的水(水蒸气)爆发性生成的同时工作液体溢出等工序运转上相当困难。另一方面，当前处于利用生物物质从谷氨酸或者谷氨酸盐最终制备吡咯烷酮的整体工序的相关现有技术完全未出现的实情。假如，开发利用生物物质可以从谷氨酸或者谷氨酸盐制备吡咯烷酮的有效的工序，这将在吡咯烷酮生产领域中可以大大提高经济性。在本说明书全文中参考多篇论文及专利文献，并标记了其引用部分。引用的论文及专利文献的公开内容，作为参照全部插入到本说明书中，而将更加明确说明本发明所属技术领域的水准及本发明的内容。·
发明内容发明要解决的技术课题本发明人为了开发能够以高收获率及低生产费用大量制备2-吡咯烷酮的方法而努力。其结果，本发明人开发出直接利用生物物质能够以高收获率及低生产费用从谷氨酸或者谷氨酸盐大量制备2-吡咯烷酮的工序方案(protocol )，从而完成了本发明。因此，本发明的目的在于，提供2-吡咯烷酮的制备方法。本发明的其他目的和优点，由发明内容、权利要求书及附图将变得更加明确。解决课题的技术方案根据本发明的实施方式，本发明提供2-吡咯烷酮的制备方法，该2-吡咯烷酮的制备方法包括以下步骤:步骤(a)，在包含谷氨酸或者谷氨酸盐的培养基培养作为全细胞催化剂具有谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase)的微生物来制备4_氨基丁酸；步骤(b)，通过过滤从上述培养基获得上述4-氨基丁酸；以及步骤(C)，将上述4-氨基丁酸转换为2-吡咯烷酮。本发明人为了开发能够以高收获率及低生产费用大量制备2-吡咯烷酮的方法而努力。其结果，本发明人开发出直接利用生物物质从谷氨酸或者谷氨酸盐能够以高收获率及低生产费用制备大量2-吡咯烷酮的工序方案。按各个不同的步骤，对本发明的方法进行详细说明，如下:步骤(a):利用生物物质制备4-氨基丁酸根据本发明，不破碎微生物，将微生物本身作为全细胞催化剂而利用，来制备
4-氨基丁酸。作为全细胞催化剂的微生物可以利用未进行任何物理/化学变形的微生物。优选地，在本发明中具有作为全细胞催化剂利用的谷氨酸脱羧酶的微生物，是为了破坏细胞膜的选择透性而用有机溶剂(优选为疏水性有机溶剂)预处理的微生物。在本发明中利用的微生物是具有谷氨酸脱羧酶的微生物，优选地可以利用曲霉属(aspergillus)、梭菌属(clostridium)、埃希氏菌属(Escherichia)、乳杆菌属(lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)或者李斯特菌属(listeria)微生物，更加优选地可以利用埃希氏菌属、乳杆菌属或者乳球菌属，最为优选地可以利用肠埃希氏菌(Escherichia coli，俗称为大肠杆菌)。作为上述曲霉属微生物，优选地，可以使用棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、浅蓝灰曲霉(Aspergillus caesiellus)、亮白曲霉(Aspergillus candidus)、肉色曲霉(Aspergillus carneus)、棒曲霉(Aspergillus clavatus)、弯头曲霉(AspergillusdefIectus)、费氏曲霉(Aspergillus fischerianus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、灰绿曲霉(Aspergillusglaucus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)或者赫曲霉(Aspergillus ochraceus)，更加优选地，可以使用费氏曲霉、黄曲霉或者米曲霉，最为优选地，可以使用米曲霉。在上述梭菌属微生物，优选地，可以使用丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)、耐氧梭菌(C.aerotolerans)、巴氏梭菌(C.baratii )、拜氏梭菌(C.bei jerinckii )、双酶梭菌(C.bifermentans)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfingens)、肉毒梭菌(C.botulinum)、丁酸梭菌(C.butyricum)、尸毒梭菌(C.cadaveris)、气肿疽梭菌(C.chauvoei)、梭状梭菌(C.c lostri dioforme)、狗肠梭菌(C.colicanis)、艰难梭菌(C.difficile)、醋化梭菌(C.estertheticum)、谲诈梭菌(C.fallax)或者费塞氏梭菌(C.feseri)，更加优选地，可以使用拜氏梭菌(C.bei jerinckii)、双酶梭菌(C.bifermentans)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfingens)或者肉毒梭菌(C.botulinum)，最优选地，可以使用产气荚膜梭菌(Clostridium perfingens)。在上述埃希氏菌属微生物，可以使用阿尔伯蒂埃希氏菌(E.albertii)、蟑螂埃希氏菌(E.blattae)、肠埃希氏菌(E.coli)、费格森埃希氏菌(E.fergusonii)、赫氏埃希氏菌(E.hermannii)或者伤口埃希氏 菌(E.vulneris),更加优选地，可以使用蟑螂埃希氏菌、肠埃希氏菌或者费格森埃希氏菌，最优选地，可以使用肠埃希氏菌。上述肠埃希氏菌可以利用一般的肠埃希氏菌，优选地，利用以大量生产谷氨酸脱羧酶的方式进行基因操作的肠埃希氏国。在上述乳杆菌属微生物，优选地，可以使用耐酸乳杆菌(L.acetotolerans)、酸粉乳杆菌(L.acidifarinae)、马里乳杆菌(L.acidipiscis)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、能动乳杆菌(L.agilis)、阿氏乳杆菌(L.algidus)、消化乳杆菌(L.alimentarius)、降解淀粉类乳杆菌(L.amylolyticus)、嗜淀粉乳杆菌(L.amylophilus)、复合乳杆菌(L.composti)、面包乳杆菌(L.crustorum)、糊精乳杆菌(L.dextrinicus)、迪氏乳杆菌(L.diolivorans)、额氏乳杆菌(L.equigenerosi )、发酵乳杆菌(L.fermentum)、鸡乳杆菌(L.gal I inarum)、甘氏乳杆菌(L.ghanensis)、希氏乳杆菌(L.hi lgardi i)、惰性乳杆菌(L.1ners)、约氏乳杆菌(L.johnsonii)、莱士曼氏乳酸杆菌(L.1eichmannii)、纳氏乳杆菌(L.nagelii)、瑞士乳酸菌(L.helveticus)、短乳杆菌(L.brevis)、布氏乳杆菌(L.buchneri)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus Iactis)、干酷乳杆菌(L.casei)、辣白菜乳杆菌(L.kimchii)、胚芽乳杆菌(L.plantarum)、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)、旧金山乳杆菌(L.sanfranciscensis)或者清酒乳杆菌(L.sakei )，更加优选地，可以使用短乳杆菌、布氏乳杆菌、乳酸乳杆菌或者干酪乳杆菌，最优选地，可以使用乳酸乳杆菌。在上述乳球菌属微生物，可以使用格氏乳球菌(L.garvieae)、乳酸乳球菌(L.lactis)、鱼乳球菌(L.piscium)、植物乳球菌(L.plantarum)或者棉子糖乳球菌(L.raffinolactis),更加优选地,可以使用乳酸乳球菌或者鱼乳球菌,最优选地,可以使用乳酸乳球菌。在上述李斯特菌属微生物，可以使用格氏李斯特菌(L.grayi)、无害李斯特菌(L.1nnocua)、伊氏李斯特菌(L.1vanovii)、单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)、斯氏李斯特菌(L.seeligeri)、墨氏李斯特菌(L.muttayi)或者威氏李斯特菌(L.welshimeri),更加优选地,可以使用伊氏李斯特菌或者单核细胞增生李斯特菌,最优选地，可以使用单核细胞增生李斯特菌。微生物的选择透性(selective permeability)是指受到对于形成微生物的细胞膜的脂双层(Lipid bilayer)的水溶性基质的环境因素的影响的细胞内外部间的输送，细胞膜是不渗透分子较大的水溶性物质的半透性膜，但脂溶性物质被细胞膜的脂质部分溶解而渗透，从而具有与分子的大小无关的，越是对脂质的溶解度大的物质，越容易渗透的性质。在细胞膜与疏水性有机溶剂进行反应时，半透性膜会被破坏，而丧失细胞的选择透性。在本发明中重要的是，与微生物进行反应的疏水性有机溶剂的种类及浓度破坏微生物的选择透性，来提高2-氨基丁酸(2-aminobutyl acid)的含量，并且可以再利用全细胞催化剂。作为与上述微生物进行反应来破坏选择透性的有机溶剂，优选地可以使用疏水性有机溶剂，更加优选地，可以使用戊烷(Pentanes)、己烷(Hexane)、癸烷(Decane)、环己烧(Cyclohexane)、环戍烧(Cyclopentane)、1- 丁烯(l_Butylene)、2_ 丁烯(2-Butylene)、1-戍烯(l_Pentene)、2-戍烯(2-Pentene)、异丁烯(Isobutylene)、四氯化碳(Carbon tetrachloride)、1-氯丁烧(1-Chlorobutane)、1-氯戍烧(1-Chloropentane)>2-氯丙烧(2-Chloropropane)、1-氯丙烧(l-Chloropropane)、溴乙烧(Bromoethane)、氯仿(Chloroform)、二氯甲烧(Dichloromethane)、1-硝基丙烧(l-Nitropropane)、硝基甲烧(Nitromethane)、苯(Benzene)、甲苯(Toluene)、二甲苯(XyIene)、氣苯(Chlorobenzene)、苯胺(Aniline)、二乙醚(Diethyl ether)、二异丙醚(Diisopropyl ether)、四氢呋喃(Tetrahydrofuran)、乙酸乙酯(Ethyl acetate)、乙酸甲酯(Methyl acetate)、二硫化碳(Carbon disulfide)、二乙硫醚(Diethyl sulfide)、二甲基亚讽(Dimethyl sulfoxide)、二乙胺(Diethylamine)、乙腈(AcetonitriIe)、卩比唳(Pyridine),进而优选地,可以使用甲苯、氯仿、二甲苯、环己烷，最为优选地，可以使用甲苯。在本发明中，上述有机溶剂的浓度优选为0.01%-20% (v/v)，更加优选为0.01%_5%(v/v)，进而优选为0.1%-1% (v/v)，最优选为0.2%-0.5% (v/v)。上述‘(v/v)’表示疏水性有机溶剂的体积/微生物悬浮液的体积，在使用20% (v/v)以上的有机溶剂时，存在抑制催化剂活性且难以回收菌体的问题，在使用0.01% (v/v)以下的有机溶剂时，存在难以破坏细胞膜的选择透性的问题。搅拌具有上述谷氨酸脱羧酶的微生物和上述疏水性有机溶剂来对微生物进行预处理。在上述搅拌时，搅拌速度优选为100rpm-600rpm,更加优选为200rpm-400rpm,最优选为 200rpm-300rpm。
在上述搅拌时，搅拌时间优选为I分钟-60分钟，更加优选为3分钟-30分钟，最优选为5分钟-15分钟。并且，在上述搅拌时，搅拌温度优选为4°C _40°C，更加优选为15°C _35°C，最优选为 25 °C -30 °C。根据本发明的优选实例，通过上述过程来制备全细胞催化剂之后，还可以包括使上述全细胞催化剂悬浮于水或者缓冲溶液的步骤。因为，谷氨酸脱羧酶具有活性的PH的范围是3.5-6.0，在脱离上述范围时，活性急剧降低，在借助谷氨酸脱羧酶，谷氨酸转换为Y氨基丁酸的过程中，水溶液的质子被消耗的同时PH上升，因此有必要调节pH。更加具体地，着眼于在本发明中利用的谷氨酸的pKa值为2.2左右，将超过溶解度的量的谷氨酸添加于全细胞催化剂水溶液，此时使用缓冲溶液，以防止初期PH降到3.5以下。利用于本发明的缓冲溶液的PH优选为3.8-8.0，更加优选为4.0-8.0，进而优选为4.0-7.0，尤其优选为4.0-6.0。制备pH为4.5的缓冲溶液时使用醋酸，制备pH为6.0,7.0及8.0的缓冲溶液时使用磷酸，但并不局限于此。另一方面，在作为基质利用谷氨酸时，利用于本发明的缓冲溶液的pH优选为
4.0-8.0，更加优选为4.5-7.0，进而优选为5.0-6.0，最优选为6.0。在下述步骤(b)中作为基质利用谷氨酸钠时，利用于本发明的缓冲溶液的PH优选为3.8-6.5，更加优选为
3.8-6.0，进而优选为3.8-5.5，尤其优选为3.8-5.0，最优选为4.0。根据本发明，借助全细胞催化剂，谷氨酸或者谷氨酸盐(优选为谷氨酸钠)转换为4-氨基丁酸。利用于本发明的谷氨酸是20种蛋白质氨基酸之一，谷氨酸钠是结构式为HOOC(CH2)2CH (NH2)C0 0Na、分子量为169.11的谷氨酸的钠盐。本发明的最大的特征在于，除了为了制备4-氨基丁酸而使用谷氨酸钠以外，还可以利用谷氨酸。由于谷氨酸的价格低于谷氨酸钠，因此在利用谷氨酸来制备Y氨基丁酸时，可以降低产品的成本。全细胞催化剂的浓度，根据催化剂具有的谷氨酸脱羧酶的量来调节。根据本发明优选实例，就大肠杆菌而言，未进行人为的基因操作的菌株使用浓度优选为lg/L_30g/L的菌株，更加优选为5g/L-20g/L的菌株，最优选为10g/L-15g/L的菌株。并且，为了大量生产谷氨酸脱羧酶而进行基因操作的大肠杆菌菌株使用浓度优选为lg/L_30g/L的菌株，更加优选为lg/L-10g/L的菌株,最优选为lg/L-5g/L的菌株。与上述全细胞催化剂进行反应的谷氨酸或者谷氨酸钠，可通过生物学方式从生物物质制备而得，可以投入到以粉末形态或者水溶液状态包含全细胞催化剂的反应器。所添加的谷氨酸或者谷氨酸钠的量，相对于微生物悬浮液的重量％，优选为15重量％_55重量％,更加优选为30重量％-50重量％，最优选为35重量％-45重量％。如果小于15重量％，由于生成的Y氨基丁酸的浓度低，在浓缩费用等方面工业性价值降低，如果大于55重量％，会难以搅拌，存在转换率减少到90%以下的问题。所添加的谷氨酸或者谷氨酸钠能够以粉末或者悬浮液的形态注入，无需全部溶解所有的谷氨酸。根据本发明的优选实例，当反应全细胞催化剂与谷氨酸或者谷氨酸钠进行反应时，还可包含5-磷酸卩比唆醒(PLP, Pyridoxal 5-phosphate)来进行反应。这是因为5_磷酸批P多醒是在氨基酸的外消旋化(racemization)、转氨基反应、脱羧反应、脱氢反应、脱醒反应、从丝氨酸(serine)和卩引哚(indole)的色氨酸(tryptophan)的合成反应等生物体内的各种酶反应起作用的辅酶之一，用于执行促进反应的作用。步骤(b):培养基的过滤利用将谷氨酸或者谷氨酸盐作为基质包含的培养基及全细胞催化剂来制备4-氨基丁酸之后，通过过滤培养基，从培养基的微生物细胞及不溶性成分分离4-氨基丁酸。上述过滤用于从培养基除去微生物细胞及不溶性成分。上述过滤可以利用本发明所属技术领域公知的多种方法，例如，可以利用离心分离、压滤器、过滤膜或者过滤纸来实施。根据本发明优选实例，在步骤(a)及步骤(b)之间还包括在上述培养基处理活性炭来除去培养基的色素的步骤。活性炭处理可以通过本发明所属技术领域公知的多种方法来实施，大体上有如下两种方法:将活性炭直接在培养基进行处理的方法和利用填满活性炭的色谱柱的方法。考虑到生产费用及工序方便性，将活性炭直接在培养基进行处理的方法更加适合本发明。根据将活性炭直接在培养基进行处理的方法，相对于培养基内的4-氨基丁酸(4-aminobutyricacid)的重量％,在培养基进行处理的活性炭的量为I重量％_10重量％,优选为1.5重量％-4.0重量％,更加优选为2.0重量％-4.0重量％。如以下实施例所述,如果活性炭的处理量大于4.0重量％，则培养基内的4-氨基丁酸的损失率会增加，而存在最终制备的2-吡咯烷酮的收获率减少的问题，如果活性炭的处理量小于1.5重量％，则未能充分除去培养基内的色素杂质，而存在2-吡咯烷`酮的收获率减少的问题。选择性地，活性炭处理可以利用填满活性炭的色谱柱来实施。例如，在填满活性炭的色谱柱装载培养基，从色谱柱获得洗脱液(eluant)，则可以获得除去色素的4-氨基丁酸溶液。在利用色谱柱的情况下，可以同时进行色素的除去和培养基的过滤。根据本发明优选实例，本发明中，对步骤(a)的结果物进行离心分离来分离菌体，在分离的溶液处理活性炭来除去色素之后，过滤结果物来获得4-氨基丁酸。优选地，在处理活性炭之前，对分离出菌体的培养基进行加热处理。根据本发明优选实例，浓缩包含通过过滤而获得的4-氨基丁酸的溶液来利用于2-吡咯烷酮合成。根据本发明优选实例，在步骤(b)之后还包括对上述全细胞催化剂进行分离且再利用分离的全细胞催化剂的步骤。由于本发明中提供的方法不经过微生物的破碎过程而是使用微生物本身，可以通过离心分离来容易回收具有谷氨酸脱羧酶的微生物供重新使用。可以利用回收的微生物来反复上述步骤(a)，也可以在开始4-氨基丁酸制备反应的反应器还注入已回收的微生物来制备4-氨基丁酸。步骤(C):从4-氨基丁酸制备2-吡咯烷酮利用在上述过程中获得的4-氨基丁酸来获得2-吡咯烷酮。根据本发明优选实例，在步骤(C)中利用的4-氨基丁酸未进行预提纯(pre-purification)。本说明书中的“未进行预提纯的4-氨基丁酸”是指除了如上所述的过滤和/或活性炭处理以外，未进行其他提纯过程(例如，结晶化)的未加工的(crude)4_氨基丁酸。4-氨基丁酸转换到2-吡咯烷酮的过程基本上是内酰胺环化反应。就利用4-氨基丁酸来合成2-吡咯烷酮而言，可以通过本发明所属技术领域的公知的多种方法来实施。
根据本发明优选实例，4-氨基丁酸转换到2-吡咯烷酮的过程是由本发明人开发的方法，是命名为“DPSP”(大常卩比咯烧酮的合成方案(Daesang Pyrrolidone SynthesisProtocol))的方法。该DPSP方法是既有效、又经济(cost-effective)的方法。DPSP方法基本上包括以下步骤:步骤(c-1)，形成混合有4-氨基丁酸及2-吡咯烷酮的的反应组合物；步骤(c-2)，对上述反应组合物进行加热处理来实施内酰胺环化反应，来生成2-吡咯烷酮及水；以及步骤(c-3)，分离上述2-吡咯烷酮。更加具体地，DPSP方法包括如下两种:在如上所述的基本的步骤中，把重点放在温度调节上的DPSP-T方法和把重点放在压力调节上的DPSP-P方法。根据本发明优选实例，DPSP-T方法包括以下步骤:步骤(a)，形成混合有4-氨基丁酸及2-吡咯烷酮的反应组合物；步骤(b)，在118°C -148°C的温度下对上述反应组合物进行加热处理来实施内酰胺环化反应，来生成2-吡咯烷酮及水；以及步骤(C)，分离上述2-吡咯烷酮。根据本发明优选实例，DPSP-P方法包括以下步骤:步骤(a)，形成混合有4-氨基丁酸及2-吡咯烷酮的反应组合物；步骤(b)，在减压条件下对上述反应组合物进行加热处理来实施内酰胺环化反应，来生成2-吡咯烷酮及水，并除去上述水；以及步骤(C)，分离上述2-吡咯烷酮。首先，对DPSP-T方法进行详细说明如下。根据DPSP-T方法，首先，为了提供对于4-氨基丁酸的转换反应的适合的环境，而形成混合有4-氨基丁酸及2-吡咯烷酮的反应组合物。在提供4-氨基丁酸的反应物和2-吡咯烷酮共存的反应组合物的情况下，如以下实施例中所证明，在低于4-氨基丁酸的熔点(202°C)的温度，例如在118°C _120°C下，4-氨基丁酸转换为2-吡咯烷酮和水。通过多种方法可提供混合有4-氨基丁酸及2-吡咯烷酮的反应组合物。第一方式，步骤(a)中，可以在反应器搅拌4-氨基丁酸及2-吡咯烷酮。即，在反应器投入4-氨基丁酸及2-吡咯烷酮并对此进行搅拌，从而形成混合有4-氨基丁酸及2-吡咯烷酮的反应组合物。这种反应组合物，可以在比较低的温度，例如，可以在118°C -148°C下进行4-氨基丁酸的内酰胺环化反应。在第一方式中，与4-氨基丁酸混合的2-吡咯烷酮的量没有特别的限制。但是，如果与4-氨基丁酸混合的2-吡咯烷酮的量过少，则在为了反应进行搅拌时会存在问题，如果过多，则存在反应结束后对2-吡咯烷酮进行蒸馏的费用上涨的问题。因此，考虑到顺利的工序运转和制备费用时，按重量比来算，4-氨基丁酸和2-吡咯烷酮的混合量之比优选为1:0.1-1:10，更加优选为1:0.2-1:5，进而优选为1:0.5-1:2。第二方式，步骤(a)中，可以在反应器投入4-氨基丁酸，提高上述反应器的温度来将4-氨基丁酸转换为2-吡咯烷酮及水之后，接着将4-氨基丁 酸追加投入到上述反应器。例如，在反应器投入4-氨基丁酸，将反应器的温度上升至4-氨基丁酸的熔点(2020C )，来将4-氨基丁酸转换为2-吡咯烷酮及水。接着，自然冷却反应器的同时，追加地投入4-氨基丁酸并进行溶解。在需要的情况下，可以两次追加投入4-氨基丁酸。 第三方式，步骤(a)中，可以在反应器投入4-氨基丁酸，提高上述反应器的温度来将4-氨基丁酸的一部分转换为2-吡咯烷酮及水。与第二个方式不同之处为，初期开始使用要转换为2-吡咯烷酮的全部4-氨基丁酸。与在上述三个方式中采取哪一个方式无关地，通过这些过程提供混合有4-氨基丁酸及2-吡咯烷酮的反应组合物。接着，在118°C _148°C的温度下，对上述反应组合物进行加热处理来实施内酰胺环化反应，来生成2-吡咯烷酮及水。如果在适合的温度下维持步骤(a)的反应组合物，则产生内酰胺环化反应，4-氨基丁酸转换为2-吡咯烷酮及水。根据现有技术(例如，日本专利申请公开第2002-121183号及日本专利申请公开第2009-159840号)，在高温(例如，200°C _300°C或者180°C )下，将4-氨基丁酸转换为2-吡咯烷酮。本发明中，在相当低于现有技术中提出的反应温度的温度，即，在118°C _148°C的温度下，利用4 -氨基丁酸和2-吡咯烷酮的混合反应组合物来进行内酰胺环化反应，来生成2-吡咯烷酮及水。假如，反应温度小于118°C，几乎无法进行内酰胺环化反应，导致2-吡咯烷酮几乎未生成，在反应温度大于148°C时(例如，200°C _300°C或者180°C )，因爆发性地生成的水(水蒸气)而存在难以运转工序等问题，因此不适于2-吡咯烷酮的大量生产。本发明中提出的118°C -148°C的反应温度是有效进行4-氨基丁酸的转换反应的同时，不要求高温和/或高压的效益的条件，是适于大量生产的条件。选择性地，步骤(b)可以在减压下实施，可以借助这种减压来除去反应中生成的水。在本发明中，减压条件优选为750mmHg以下，更加优选为120mmHg以下，进而优选为10mmHg-120mmHg,尤其优选为 10mmHg-60mmHg,最优选为 20mmHg-60mmHg。最终，从步骤(b)的反应结果物分离2-吡咯烷酮，以适合的纯度及收获率获得2-吡咯烷酮。可利用本发明所属技术领域公知的多种方法分离2-吡咯烷酮。优选地，借助减压蒸馏实施2-吡咯烷酮的分离。用于分离2-吡咯烷酮的减压蒸馏条件优选为0.lmmHg-250mmHg,更加优选为lmmHg-90mmHg,进而优选为lmmHg-50mmHg,尤其优选为lmmHg-20mmHgo通过本发明的DPSP-T方法，最终以高收获率及高纯度获得2-吡咯烷酮。优选地，本发明的方法呈现出2-吡咯烷酮的最大99%的收获率及最大99.8%的纯度，更加优选地，呈现出90%-99%的收获率、99.0%-99.8%的纯度，进而优选地，呈现出96%_99%的收获率、99.5%-99.8% 的纯度。对DPSP-P方法进行说明，如下。根据DPSP-P方法，首先，为了提供适于4-氨基丁酸的转换反应的环境，形成混合有4-氨基丁酸及2-吡咯烷酮的反应组合物。可以参照记载于上述DPSP-T方法的内容对形成反应组合物的过程进行说明。接着，在减压条件下，对上述反应组合物进行加热处理来实施内酰胺环化反应，来生成2-吡咯烷酮及水，并除去上述水。在适合的温度及减压条件下，维持步骤(a)的反应组合物，则产生内酰胺环化反应，4-氨基丁酸转换为2-吡咯烷酮及水，从反应结果物除去水。DPSP-P工序的特征之一是，在4-氨基丁酸的转换反应赋予减压的条件，来除去反应中生成的水。由于这种水的除去不仅使反应速度大大增加，而且可以在更加低的温度下进行反应，整体上可以大大改善对于2-吡咯烷酮的生产率。就本发明而言，减压条件优选为750mmHg以下，更加优选为120mmHg以下，进而优选为IOmmHg-12OmmHg,尤其优选为10mmHg-60mmHg,最优选为20mmHg-60mmHg。步骤(b)中的反应温度优选为110°C以上(例如，110°C _150°C)，更加优选为118°C以上，进而优选为118°C -150°C。选择性地，在IlS0C _148°C的温度范围内，本发明也呈现2-吡咯烷酮的优秀的收获率及提纯率。根据本发明，例如，在118°C的低温下，4-氨基丁酸也可以转换为2-吡咯烷酮。在步骤(b)中除去水。根据本发明优选实例，步骤(b)中除去水的过程在实施步骤(b)的过程中同时进行。即，4-氨基丁酸转换为2-吡咯烷酮和水，水在生成的同时在减压条件下被除去。优选地，这种除去水的过程以连续的工序实施。选择性地，在步骤(b)中的除去水的过程可以在实施步骤(b)的过程当中进行。选择性地，在步骤(b)中的除去水的过程可以在实施步骤(b)之后进行。最终，从步骤(b)的反应结果物分离2-吡咯烷酮，以适合的纯度及收获率获得
2-吡咯烷酮。可以参照记载于上述DPSP-T方法的内容来对2-吡咯烷酮的分离进行说明。通过DPSP-P工序，最终以高收获率及高纯度获得2-吡咯烷酮。优选地，本发明的DPSP-P工序呈现出2-吡咯烷酮的最大99%的收获率及最大99.8%的纯度，更加优选为90%-99%的收获率、99.0%-99.8%的纯度，进而优选为96%_99%的收获率、99.5%-99.8%的纯度。发明效果概括本发明的特征及优点，如下。(a)本发明提供利用生物物质来从谷氨酸或者谷氨酸盐制备2-吡咯烷酮的一系列的工序。(b)根据本发明，作为全细胞利用微生物来制备4-氨基丁酸，优选地，直接利用未经结晶化等复杂的提纯过程的4-氨基丁酸来以高收获率经济地制备2-吡咯烷酮。(C)根据本发明，能够以高收获率及低生产费用大量制备2-吡咯烷酮。(d)根据本发明，没有高温/高压的效益地，能够以高收获率及高纯度从4-氨基丁酸获得2-吡咯烷酮。(e)本发明通过简化2-吡咯烷酮的制备工序，适合于工业性规模的大量生产。
图1表示根据有机溶剂处理的大肠杆菌及乳酸菌的Y氨基丁酸的生产速度比较结果。图2表示根据有机溶剂种类的微生物的Y氨基丁酸生产活性变化。图3表示根据pH的Y氨基丁酸生产速度的变化。在图4中条形图表示Y氨基丁酸的生产速度，实线图表表示初期pH。图4表示在使用处理了有机溶剂的菌体的高浓度Y-氨基丁酸生产中随着反应而发生的PH的变化。
实施方式以下，通过实施例，对本发明进行更详细的说明。这些实施例仅仅用于对本发明进行更加具体的说明，根据本发明的主旨，本发明的范围并不局限于这些实施例，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。
实施例在本说明书全文中，为了表示特征物质的浓度而使用的“％”在未另行提及的情况下，固体/固体为(重量/重量)％，固体/液体为(重量/体积)％，而且液体/液体为(体积/
体积)°/o o实施例1:从谷氨酸或者谷氨酸盐生产Y氨基丁酸1-1.从利用处理了有机溶剂的多种全细胞催化剂的谷氨酸生产Y氨基丁酸培养具有谷氨酸脱羧酶的菌体、大肠杆菌BL21 (DE3)、大肠杆菌JM101、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)及棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis) (KCTC)并回收之后，分为有机溶剂处理组和对照组。就有机溶剂处理组而言，在回收的菌体处理
0.5% (v/v)的甲苯,在30°C、200rpm的条件下搅拌10分钟,来破坏微生物的选择透性之后，将该微生物悬浮于灭菌水。对照组不进行特别的处理过程，直接悬浮于灭菌水。在上述准备的各个微生物悬浮液添加40 ii M的5-磷酸批卩多醒(PLP,Pyridoxal5_phosphate ;西格玛奥德里奇:Sigma Aldrich),并添加33wt%的谷氨酸(大常株式会社)来测定了、氨基丁酸的生产速度。 为了比较实验结果，处理了有机溶剂的实验组的生产速度值除以未处理有机溶剂的实验组的生产速度值。实验结果表明，如图1所示，就Y氨基丁酸的生产速度而言，处理了作为有机溶剂的甲苯的组比非处理组提高约1.2倍-5.5倍。1-2.从根据有机溶剂的全细胞催化剂的谷氨酸盐生产Y氨基丁酸培养具有谷氨酸脱羧酶的菌体(Escherichia coli)并回收之后,使用有机溶剂来破坏微生物的选择透性之后，通过谷氨酸钠(西格玛奥德里奇)分析了 Y氨基丁酸的生产速度。使用的有机溶剂都作为疏水性有机溶剂，是甲苯、氯仿、二甲苯及苯。就处理条件而言，在微生物悬浮液处理0.5%(v/v)的各有机溶剂，在30°C、200rpm的条件下搅拌10分钟。在上述准备的各个微生物悬浮液添加40 ii M的5-磷酸吡哆醛，并添加1% (v/v)的谷氨酸钠，来比较Y氨基丁酸的生产速度。其结果如图2所示，在处理疏水性有机溶剂后，y氨基丁酸的生产速度增加了约5倍-8倍。1-3.通过有机溶剂处理来增加菌体的Y氨基丁酸的生产活性培养具有谷氨酸脱羧酶的菌体之后回收了菌体。用蒸馏水清洗一次回收的菌体之后，与有机溶剂搅拌，来破坏选择透性。作为此时使用的有机溶剂，使用了在上述实施例
1-2呈现最快的Y氨基丁酸生产速度的甲苯。分为处理甲苯的实验组和未处理甲苯的对照组，就处理甲苯的实验组而言，在微生物悬浮液添加0.5% (v/v)的甲苯后，在37°C、150rpm下搅拌了 10分钟。在结束搅拌之后，用蒸馏水清洗一次菌体。将上述准备的菌体悬浮于醋酸盐缓冲溶液(pH4.6、200mM)之后，添加0.04mM的5-磷酸吡哆醛及1% (v/v)的谷氨酸钠来测定了 Y氨基丁酸生产速度。其结果表明，处理甲苯的菌体的Y氨基丁酸生产活性为5.72 u mo I GABA/mg dcw/min,未处理甲苯的菌体的活性为 0.75 u mol GABA/mg dcw/min。1-4.根据缓冲溶液的pH得到提高的Y氨基丁酸的生产速度
培养具有谷氨酸脱羧酶的菌体，使用与实施例3提出的方法相同的方法在培养的菌体处理作为有机溶剂的甲苯之后，将已处理的菌体悬浮于各个缓冲溶液和灭菌水。在这里使用的缓冲溶液的浓度均为lOOmM，pH分别是4.5,6.0,7.0及8.0。使用醋酸来制备pH为4.5的缓冲溶液，使用磷酸来制备pH为6.0、7.0及8.0的缓冲溶液。在如上准备的全细胞催化剂的悬浮溶液添加0.04mM添加量的5-磷酸吡哆醛，在这里添加10wt%的谷氨酸，开始进行反应。随后，测定、氨基丁酸的初期生产速度来分析了随着PH而发生的Y氨基丁酸的生产速度的变化。实验结果如图3所示，使用pH6的缓冲溶液，在初期pH为3.9时，呈现出最快的反应速度，其值为116g GABA/L/h。1-5.使用处理有机溶剂的菌体来生产Y氨基丁酸培养具有谷氨酸脱羧酶的菌体来回收菌体。此时，回收的干燥菌体的量为3.6g。将菌体悬浮于灭菌水之后，添加0.5% (v/v)的甲苯，在37°C下搅拌了 10分钟。一旦结束甲苯处理就进行离心分离来回收菌体，利用蒸馏水来再清洗一次。将回收的菌体悬浮于2L的磷酸缓冲溶液(pH为6.0UOOmM)之后，投入到反应器，在这里添加0.04mM的5-磷酸吡哆醒、Ikg的谷氨酸及50ppm的消泡剂(聚氧化烯乙二醇(Polyoxyalkylene Glycol)),开始进行反应。反应条件为30°C、200rpm。反应开始时pH为4.5，经过8hr，残留的谷氨酸的浓度减少为小于lwt%，此时pH为5.8。在此，添加盐酸溶液来将pH减少到5.5之后，继续反应lhr，从而将残余的谷氨酸都转换为Y氨基丁酸。生成的Y氨基丁酸的总重量为690g，摩尔转化率为98%，消耗时间总共为9hr。1-6.使用处理有机溶剂的菌体来生产高浓度Y氨基丁酸培养具有谷氨酸脱羧酶的菌体之后，在培养基投入0.25%(￥八)的甲苯，在30°〇下搅拌了 10分钟。搅拌后通过离心分离回收了微生物，此时回收的干燥菌体的重量约为50g。将微生物悬浮于缓冲溶液或者蒸馏水之后，投入到反应器，添加0.04mM的5-磷酸吡哆醛、8kg的谷氨酸及500ppm的消泡剂(聚氧 化烯乙二醇)，来开始进行反应。反应条件为30°C、200rpm,除此之外未对任何因素进行调节。反应开始时的pH为4.0，反应经过10hr，残留谷氨酸浓度减少为小于lwt%，此时pH为5.87。随后，添加盐酸溶液，将pH减少至5.6之后，还反应2hr，将残有的谷氨酸都转换为Y氨基丁酸(图4)。生成的Y氨基丁酸的浓度为34wt%，摩尔转化率为98%，消耗时间总共为12hr。1-7.利用反应结束后回收的菌体来生产Y氨基丁酸通过与上述实施例1-2相同的方法，在3.6g的微生物处理0.5% (v/v)的甲苯之后，实施了将0.5kg的谷氨酸作为基质的Y氨基丁酸的生成反应。在结束反应9小时后，在4000rpm、IOmin条件下执行离心分离来回收微生物，如同上述实施例1，利用蒸馏水清洗该微生物，使该微生物悬浮于醋酸盐缓冲溶液(pH4.6、200mM)之后，添加0.04mM的5-磷酸吡哆醛和1%( v/v)的谷氨酸钠来测定Y氨基丁酸生产活性时，其值为4.80 iimol GABA/mgdcw/min。分离而回收利用于上述Y氨基丁酸转换反应的菌体之后，将2g的回收菌体投入到具有新准备的菌体的反应器之后，重新进行与实施例1-2相同的反应时，转换率与上述第一次反应几乎相同，总反应时间缩短到6hr。实施例2:从培养基获得Y氨基丁酸除去上述实施例1的培养液的菌体，进行加热处理后执行脱色过程。通过离心分离来分离菌体之后，利用搅拌机，并用活性炭对分离后加热处理的培养液进行脱色处理。就脱色而言，在培养液添加了 1.0%_15.0% (活性炭重量/Y氨基丁酸重量)的活性炭。对加热处理后生成的改性蛋白质，与活性炭一起进行了过滤分离，并进行浓缩来使用于2-吡咯烷酮合成。其结果可见，如果活性炭量增加，则呈现出培养液的色也随之徐徐透明的倾向，表I表示，在初期浓度30.0% ( y氨基丁酸重量/培养液体积)的培养液，利用活性炭来进行脱色的情况下，随着所使用的活性炭的浓度而不同的吡咯烷酮合成回收获率，所使用的活性炭的浓度越增加，Y氨基丁酸的损失率也随之增加，从而导致回收获率减少，在活性炭不足时，由于未能充分除去色素杂质，因而导致合成回收获率减少。吡咯烷酮合成根据以下实施例3-1记载的方法来实施。表I
权利要求
1.一种2-吡咯烷酮的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤(a)，在包含谷氨酸或者谷氨酸盐的培养基培养作为全细胞催化剂具有谷氨酸脱羧酶的微生物来制备4-氨基丁酸； 步骤(b)，通过过滤从上述培养基获得上述4-氨基丁酸；以及 步骤(C)，将上述4-氨基丁酸转换为2-吡咯烷酮。
2.根据权利要求1所述的2-吡咯烷酮的制备方法，其特征在于，上述微生物是由疏水性有机溶剂进行预处理的微生物。
3.根据权利要求1所述的2-吡咯烷酮的制备方法，其特征在于，上述步骤(a)中的具有谷氨酸脱羧酶的微生物是大肠杆菌。
4.根据权利要求2所述的2-吡咯烷酮的制备方法，其特征在于，上述有机溶剂选自包含甲苯、氯仿、二甲苯、苯及环己烷的组。
5.根据权利要求1所述的2-吡咯烷酮的制 备方法，其特征在于，上述步骤(a)在缓冲区pH3.0-pH8.0的范围内实施。
6.根据权利要求1所述的2-吡咯烷酮的制备方法，其特征在于，在上述步骤(a)及步骤(b)之间还包括在上述培养基处理活性炭来除去培养基的色素的步骤。
7.根据权利要求6所述的2-吡咯烷酮的制备方法，其特征在于，相对于上述培养基内的4-氨基丁酸的重量％，添加1.5重量％ 4.0重量％的上述活性炭。
8.根据权利要求1所述的2-吡咯烷酮的制备方法，其特征在于，上述步骤(b)之后还包括分离上述全细胞催化剂，并且再利用已分离的全细胞催化剂的步骤。
9.根据权利要求1所述的2-吡咯烷酮的制备方法，其特征在于，在上述步骤(c)中利用的4-氨基丁酸未进行预提纯。
10.根据权利要求1所述的2-吡咯烷酮的制备方法，其特征在于，上述步骤(c)包括以下小步骤: 步骤(c-1)，形成混合有4-氨基丁酸及2-吡咯烷酮的反应组合物； 步骤(c-2)，对上述反应组合物进行加热处理来实施内酰胺环化反应，来生成2-吡咯烷酮及水；以及 步骤(c-3)，分离上述2-吡咯烷酮。
11.根据权利要求10所述的2-吡咯烷酮的制备方法，其特征在于，上述步骤(c-2)在减压条件下实施。
12.根据权利要求11所述的2-吡咯烷酮的制备方法，其特征在于，上述减压条件为IOOmmHg 以下。
13.根据权利要求12所述的2-吡咯烷酮的制备方法，其特征在于，上述减压条件为IOmmHg 50mmHgo
14.根据权利要求11所述的2-吡咯烷酮的制备方法，其特征在于，上述步骤(c-2)在IlO0C _150°C的温度条件下实施。
15.根据权利要求10所述的2-吡咯烷酮的制备方法，其特征在于，上述步骤(c-2)在118 0C -148 °C的温度条件下实施。
16.根据权利要求15所述的2-吡咯烷酮的制备方法，其特征在于，上述步骤(c)通过减压蒸馏来实施。
17.根据权利要求1所述的2-吡咯烷酮的制备方法，上述2-吡咯烷酮的制备方法呈现出2-吡咯烷酮 的最大99%的收获率及最大99.8%的纯度。
全文摘要
本发明涉及一种利用生物物质的2-吡咯烷酮的制备方法，上述利用生物物质的2-吡咯烷酮的制备方法包括以下步骤步骤(a)，在包含谷氨酸或者谷氨酸盐的培养基培养作为全细胞催化剂具有谷氨酸脱羧酶的微生物来制备4-氨基丁酸；步骤(b)，通过过滤从上述培养基获得上述4-氨基丁酸；以及步骤(c)，将上述4-氨基丁酸转换为2-吡咯烷酮。本发明提供利用生物物质来从谷氨酸或者谷氨酸盐制备2-吡咯烷酮的一系列的工序。根据本发明，作为全细胞利用微生物来制备4-氨基丁酸，优选地，能够直接利用未经如结晶化等复杂的提纯过程的4-氨基丁酸来以高收获率经济地制备2-吡咯烷酮。根据本发明，能够以高收获率及低生产费用大量制备2-吡咯烷酮。本发明通过简化2-吡咯烷酮的制备工序，适合于工业性规模的大量生产。
文档编号C12N1/20GK103189520SQ201180047545
公开日2013年7月3日 申请日期2011年9月30日 优先权日2010年9月30日
发明者朴东喆, 康基权, 朴贤贞, 金瑞亨, 吴载荣 申请人:大象株式会社
利用生物物质的2-吡咯烷酮的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种2-卩比咯烧酮(2-pyrrolidone)的制备方法,涉及利用生物物质(biomass)来从谷氨酸(glutamic acid)或者谷氨酸盐(glutamate)制备2_批咯烧酮的方法。
背景技术：
2-吡咯烷酮是在聚合物的制备、化学反应的溶剂、特殊墨水等多种领域作为工业用原材料使用的有用的化学物质。作为以往广泛熟知的代表性的2-吡咯烷酮制备方法，是记载于巴斯夫公司(BASF)的专利申请(W003 /022811)的方法，是将作为石油化学物质的丁内酯(gammabutyrolactone)与氨水(ammonia)在液相中以高温高压反应条件下连续制备的方法。并且，公知的有将琥珀酸或琥珀酸酐作为起始物质(美国专利第4904804号)，或者将顺丁烯二酸(maleic acid)(美国专利第5912358号)或琥拍腈(Succinonitrile)(美国专利第4325872号、第4193925号、第4181662号及第4123438号)作为起始物质来制备2-吡咯烷酮的方法等，这些原料为原油依赖型，价格变动严重，且由于石油资源的不足而预想到持续性的价格上升。因这种预想，最近活跃展开要从低价的生物物质获得化学物质的研究，作为其实例，通过发酵从生物物质获得谷氨酸(glutamic acid),并通过酶反应制备作为一种氨基酸(amino acid)且作为健康功能食品原材料的4-氨基丁酸(4_aminobutyricacid)(或者‘ Y -氨基丁酸’、‘GABA, gamma-aminobutyric acid’ )的方法,并且,还公开一些从4-氨基丁酸制备2-吡咯烷酮的方法。作为从4-氨基丁酸制备2-吡咯烷酮的公知的方法，于1990年Pathak等(Tetrahedron46 (5):1733-1744 (1990))报告出在致癌性物质的前驱体合成的中间过程中，在4-氨基丁酸和过量的中性氧化铝(alumina)存在下，将甲苯(toluene)作为反应溶剂在回流温度下反应约10小时来合成2-吡咯烷酮的方法，并且，在2009年韩国化学研究院(韩国专利申请公开第2009-0128767号)中，在4-氨基丁酸添加催化剂或者脱水剂，并将甲苯作为反应溶剂，以与上述Pathak相同的方法制备了 2-吡咯烷酮。但是，这样的方法具有如下缺点:反应后需要除去催化剂的过滤工序；需要追加原材料费用；需要从反应溶剂分离提纯2-吡咯烷酮。另一方面，日本专利申请公开第2002-121183号中公开一种在200°C -300°C的高温、高压水(15兆帕斯卡-30 (megapascal))中使4_氨基丁酸和水进行反应来制备2_批咯烷酮的方法。但是，该方法也由于高温高压反应而产生不必要的应用费用的上升和在大量生产伴随着莫大的设备投资的缺点。日本专利申请公开第2009-159840号在利用4-氨基丁酸来制备吡咯烷酮(pyrrolidone)的方法中揭示了多种反应溶剂条件，尤其主张，若在4-氨基丁酸混合吡咯烷酮则可以降低反应温度，此时，揭示的反应温度优选为180°C。但是，该专利也未能提出针对过高的反应温度带来的费用问题和由于在180°C的反应温度下爆发性的生成的水(水蒸气)而产生的工序运转的困难等，大量生产时可能产生的问题的解决方案。并且，虽然熟知4-氨基丁酸在作为熔点的温度(202°C)下分解成2-吡咯烷酮和水的公知的事实(默克索引(Merck indeX)430)，然而将该方法利用于大量生产不可能一次性搅拌多量的4-氨基丁酸的同时在作为熔点的温度(202°C)下熔化而生成2-吡咯烷酮和水，并且由于在此时产生的多量的水(水蒸气)爆发性生成的同时工作液体溢出等工序运转上相当困难。另一方面，当前处于利用生物物质从谷氨酸或者谷氨酸盐最终制备吡咯烷酮的整体工序的相关现有技术完全未出现的实情。假如，开发利用生物物质可以从谷氨酸或者谷氨酸盐制备吡咯烷酮的有效的工序，这将在吡咯烷酮生产领域中可以大大提高经济性。在本说明书全文中参考多篇论文及专利文献，并标记了其引用部分。引用的论文及专利文献的公开内容，作为参照全部插入到本说明书中，而将更加明确说明本发明所属技术领域的水准及本发明的内容。·
发明内容发明要解决的技术课题本发明人为了开发能够以高收获率及低生产费用大量制备2-吡咯烷酮的方法而努力。其结果，本发明人开发出直接利用生物物质能够以高收获率及低生产费用从谷氨酸或者谷氨酸盐大量制备2-吡咯烷酮的工序方案(protocol )，从而完成了本发明。因此，本发明的目的在于，提供2-吡咯烷酮的制备方法。本发明的其他目的和优点，由发明内容、权利要求书及附图将变得更加明确。解决课题的技术方案根据本发明的实施方式，本发明提供2-吡咯烷酮的制备方法，该2-吡咯烷酮的制备方法包括以下步骤:步骤(a)，在包含谷氨酸或者谷氨酸盐的培养基培养作为全细胞催化剂具有谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase)的微生物来制备4_氨基丁酸；步骤(b)，通过过滤从上述培养基获得上述4-氨基丁酸；以及步骤(C)，将上述4-氨基丁酸转换为2-吡咯烷酮。本发明人为了开发能够以高收获率及低生产费用大量制备2-吡咯烷酮的方法而努力。其结果，本发明人开发出直接利用生物物质从谷氨酸或者谷氨酸盐能够以高收获率及低生产费用制备大量2-吡咯烷酮的工序方案。按各个不同的步骤，对本发明的方法进行详细说明，如下:步骤(a):利用生物物质制备4-氨基丁酸根据本发明，不破碎微生物，将微生物本身作为全细胞催化剂而利用，来制备
4-氨基丁酸。作为全细胞催化剂的微生物可以利用未进行任何物理/化学变形的微生物。优选地，在本发明中具有作为全细胞催化剂利用的谷氨酸脱羧酶的微生物，是为了破坏细胞膜的选择透性而用有机溶剂(优选为疏水性有机溶剂)预处理的微生物。在本发明中利用的微生物是具有谷氨酸脱羧酶的微生物，优选地可以利用曲霉属(aspergillus)、梭菌属(clostridium)、埃希氏菌属(Escherichia)、乳杆菌属(lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)或者李斯特菌属(listeria)微生物，更加优选地可以利用埃希氏菌属、乳杆菌属或者乳球菌属，最为优选地可以利用肠埃希氏菌(Escherichia coli，俗称为大肠杆菌)。作为上述曲霉属微生物，优选地，可以使用棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、浅蓝灰曲霉(Aspergillus caesiellus)、亮白曲霉(Aspergillus candidus)、肉色曲霉(Aspergillus carneus)、棒曲霉(Aspergillus clavatus)、弯头曲霉(AspergillusdefIectus)、费氏曲霉(Aspergillus fischerianus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、灰绿曲霉(Aspergillusglaucus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)或者赫曲霉(Aspergillus ochraceus)，更加优选地，可以使用费氏曲霉、黄曲霉或者米曲霉，最为优选地，可以使用米曲霉。在上述梭菌属微生物，优选地，可以使用丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)、耐氧梭菌(C.aerotolerans)、巴氏梭菌(C.baratii )、拜氏梭菌(C.bei jerinckii )、双酶梭菌(C.bifermentans)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfingens)、肉毒梭菌(C.botulinum)、丁酸梭菌(C.butyricum)、尸毒梭菌(C.cadaveris)、气肿疽梭菌(C.chauvoei)、梭状梭菌(C.c lostri dioforme)、狗肠梭菌(C.colicanis)、艰难梭菌(C.difficile)、醋化梭菌(C.estertheticum)、谲诈梭菌(C.fallax)或者费塞氏梭菌(C.feseri)，更加优选地，可以使用拜氏梭菌(C.bei jerinckii)、双酶梭菌(C.bifermentans)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfingens)或者肉毒梭菌(C.botulinum)，最优选地，可以使用产气荚膜梭菌(Clostridium perfingens)。在上述埃希氏菌属微生物，可以使用阿尔伯蒂埃希氏菌(E.albertii)、蟑螂埃希氏菌(E.blattae)、肠埃希氏菌(E.coli)、费格森埃希氏菌(E.fergusonii)、赫氏埃希氏菌(E.hermannii)或者伤口埃希氏 菌(E.vulneris),更加优选地，可以使用蟑螂埃希氏菌、肠埃希氏菌或者费格森埃希氏菌，最优选地，可以使用肠埃希氏菌。上述肠埃希氏菌可以利用一般的肠埃希氏菌，优选地，利用以大量生产谷氨酸脱羧酶的方式进行基因操作的肠埃希氏国。在上述乳杆菌属微生物，优选地，可以使用耐酸乳杆菌(L.acetotolerans)、酸粉乳杆菌(L.acidifarinae)、马里乳杆菌(L.acidipiscis)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、能动乳杆菌(L.agilis)、阿氏乳杆菌(L.algidus)、消化乳杆菌(L.alimentarius)、降解淀粉类乳杆菌(L.amylolyticus)、嗜淀粉乳杆菌(L.amylophilus)、复合乳杆菌(L.composti)、面包乳杆菌(L.crustorum)、糊精乳杆菌(L.dextrinicus)、迪氏乳杆菌(L.diolivorans)、额氏乳杆菌(L.equigenerosi )、发酵乳杆菌(L.fermentum)、鸡乳杆菌(L.gal I inarum)、甘氏乳杆菌(L.ghanensis)、希氏乳杆菌(L.hi lgardi i)、惰性乳杆菌(L.1ners)、约氏乳杆菌(L.johnsonii)、莱士曼氏乳酸杆菌(L.1eichmannii)、纳氏乳杆菌(L.nagelii)、瑞士乳酸菌(L.helveticus)、短乳杆菌(L.brevis)、布氏乳杆菌(L.buchneri)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus Iactis)、干酷乳杆菌(L.casei)、辣白菜乳杆菌(L.kimchii)、胚芽乳杆菌(L.plantarum)、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)、旧金山乳杆菌(L.sanfranciscensis)或者清酒乳杆菌(L.sakei )，更加优选地，可以使用短乳杆菌、布氏乳杆菌、乳酸乳杆菌或者干酪乳杆菌，最优选地，可以使用乳酸乳杆菌。在上述乳球菌属微生物，可以使用格氏乳球菌(L.garvieae)、乳酸乳球菌(L.lactis)、鱼乳球菌(L.piscium)、植物乳球菌(L.plantarum)或者棉子糖乳球菌(L.raffinolactis),更加优选地,可以使用乳酸乳球菌或者鱼乳球菌,最优选地,可以使用乳酸乳球菌。在上述李斯特菌属微生物，可以使用格氏李斯特菌(L.grayi)、无害李斯特菌(L.1nnocua)、伊氏李斯特菌(L.1vanovii)、单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)、斯氏李斯特菌(L.seeligeri)、墨氏李斯特菌(L.muttayi)或者威氏李斯特菌(L.welshimeri),更加优选地,可以使用伊氏李斯特菌或者单核细胞增生李斯特菌,最优选地，可以使用单核细胞增生李斯特菌。微生物的选择透性(selective permeability)是指受到对于形成微生物的细胞膜的脂双层(Lipid bilayer)的水溶性基质的环境因素的影响的细胞内外部间的输送，细胞膜是不渗透分子较大的水溶性物质的半透性膜，但脂溶性物质被细胞膜的脂质部分溶解而渗透，从而具有与分子的大小无关的，越是对脂质的溶解度大的物质，越容易渗透的性质。在细胞膜与疏水性有机溶剂进行反应时，半透性膜会被破坏，而丧失细胞的选择透性。在本发明中重要的是，与微生物进行反应的疏水性有机溶剂的种类及浓度破坏微生物的选择透性，来提高2-氨基丁酸(2-aminobutyl acid)的含量，并且可以再利用全细胞催化剂。作为与上述微生物进行反应来破坏选择透性的有机溶剂，优选地可以使用疏水性有机溶剂，更加优选地，可以使用戊烷(Pentanes)、己烷(Hexane)、癸烷(Decane)、环己烧(Cyclohexane)、环戍烧(Cyclopentane)、1- 丁烯(l_Butylene)、2_ 丁烯(2-Butylene)、1-戍烯(l_Pentene)、2-戍烯(2-Pentene)、异丁烯(Isobutylene)、四氯化碳(Carbon tetrachloride)、1-氯丁烧(1-Chlorobutane)、1-氯戍烧(1-Chloropentane)>2-氯丙烧(2-Chloropropane)、1-氯丙烧(l-Chloropropane)、溴乙烧(Bromoethane)、氯仿(Chloroform)、二氯甲烧(Dichloromethane)、1-硝基丙烧(l-Nitropropane)、硝基甲烧(Nitromethane)、苯(Benzene)、甲苯(Toluene)、二甲苯(XyIene)、氣苯(Chlorobenzene)、苯胺(Aniline)、二乙醚(Diethyl ether)、二异丙醚(Diisopropyl ether)、四氢呋喃(Tetrahydrofuran)、乙酸乙酯(Ethyl acetate)、乙酸甲酯(Methyl acetate)、二硫化碳(Carbon disulfide)、二乙硫醚(Diethyl sulfide)、二甲基亚讽(Dimethyl sulfoxide)、二乙胺(Diethylamine)、乙腈(AcetonitriIe)、卩比唳(Pyridine),进而优选地,可以使用甲苯、氯仿、二甲苯、环己烷，最为优选地，可以使用甲苯。在本发明中，上述有机溶剂的浓度优选为0.01%-20% (v/v)，更加优选为0.01%_5%(v/v)，进而优选为0.1%-1% (v/v)，最优选为0.2%-0.5% (v/v)。上述‘(v/v)’表示疏水性有机溶剂的体积/微生物悬浮液的体积，在使用20% (v/v)以上的有机溶剂时，存在抑制催化剂活性且难以回收菌体的问题，在使用0.01% (v/v)以下的有机溶剂时，存在难以破坏细胞膜的选择透性的问题。搅拌具有上述谷氨酸脱羧酶的微生物和上述疏水性有机溶剂来对微生物进行预处理。在上述搅拌时，搅拌速度优选为100rpm-600rpm,更加优选为200rpm-400rpm,最优选为 200rpm-300rpm。
在上述搅拌时，搅拌时间优选为I分钟-60分钟，更加优选为3分钟-30分钟，最优选为5分钟-15分钟。并且，在上述搅拌时，搅拌温度优选为4°C _40°C，更加优选为15°C _35°C，最优选为 25 °C -30 °C。根据本发明的优选实例，通过上述过程来制备全细胞催化剂之后，还可以包括使上述全细胞催化剂悬浮于水或者缓冲溶液的步骤。因为，谷氨酸脱羧酶具有活性的PH的范围是3.5-6.0，在脱离上述范围时，活性急剧降低，在借助谷氨酸脱羧酶，谷氨酸转换为Y氨基丁酸的过程中，水溶液的质子被消耗的同时PH上升，因此有必要调节pH。更加具体地，着眼于在本发明中利用的谷氨酸的pKa值为2.2左右，将超过溶解度的量的谷氨酸添加于全细胞催化剂水溶液，此时使用缓冲溶液，以防止初期PH降到3.5以下。利用于本发明的缓冲溶液的PH优选为3.8-8.0，更加优选为4.0-8.0，进而优选为4.0-7.0，尤其优选为4.0-6.0。制备pH为4.5的缓冲溶液时使用醋酸，制备pH为6.0,7.0及8.0的缓冲溶液时使用磷酸，但并不局限于此。另一方面，在作为基质利用谷氨酸时，利用于本发明的缓冲溶液的pH优选为
4.0-8.0，更加优选为4.5-7.0，进而优选为5.0-6.0，最优选为6.0。在下述步骤(b)中作为基质利用谷氨酸钠时，利用于本发明的缓冲溶液的PH优选为3.8-6.5，更加优选为
3.8-6.0，进而优选为3.8-5.5，尤其优选为3.8-5.0，最优选为4.0。根据本发明，借助全细胞催化剂，谷氨酸或者谷氨酸盐(优选为谷氨酸钠)转换为4-氨基丁酸。利用于本发明的谷氨酸是20种蛋白质氨基酸之一，谷氨酸钠是结构式为HOOC(CH2)2CH (NH2)C0 0Na、分子量为169.11的谷氨酸的钠盐。本发明的最大的特征在于，除了为了制备4-氨基丁酸而使用谷氨酸钠以外，还可以利用谷氨酸。由于谷氨酸的价格低于谷氨酸钠，因此在利用谷氨酸来制备Y氨基丁酸时，可以降低产品的成本。全细胞催化剂的浓度，根据催化剂具有的谷氨酸脱羧酶的量来调节。根据本发明优选实例，就大肠杆菌而言，未进行人为的基因操作的菌株使用浓度优选为lg/L_30g/L的菌株，更加优选为5g/L-20g/L的菌株，最优选为10g/L-15g/L的菌株。并且，为了大量生产谷氨酸脱羧酶而进行基因操作的大肠杆菌菌株使用浓度优选为lg/L_30g/L的菌株，更加优选为lg/L-10g/L的菌株,最优选为lg/L-5g/L的菌株。与上述全细胞催化剂进行反应的谷氨酸或者谷氨酸钠，可通过生物学方式从生物物质制备而得，可以投入到以粉末形态或者水溶液状态包含全细胞催化剂的反应器。所添加的谷氨酸或者谷氨酸钠的量，相对于微生物悬浮液的重量％，优选为15重量％_55重量％,更加优选为30重量％-50重量％，最优选为35重量％-45重量％。如果小于15重量％，由于生成的Y氨基丁酸的浓度低，在浓缩费用等方面工业性价值降低，如果大于55重量％，会难以搅拌，存在转换率减少到90%以下的问题。所添加的谷氨酸或者谷氨酸钠能够以粉末或者悬浮液的形态注入，无需全部溶解所有的谷氨酸。根据本发明的优选实例，当反应全细胞催化剂与谷氨酸或者谷氨酸钠进行反应时，还可包含5-磷酸卩比唆醒(PLP, Pyridoxal 5-phosphate)来进行反应。这是因为5_磷酸批P多醒是在氨基酸的外消旋化(racemization)、转氨基反应、脱羧反应、脱氢反应、脱醒反应、从丝氨酸(serine)和卩引哚(indole)的色氨酸(tryptophan)的合成反应等生物体内的各种酶反应起作用的辅酶之一，用于执行促进反应的作用。步骤(b):培养基的过滤利用将谷氨酸或者谷氨酸盐作为基质包含的培养基及全细胞催化剂来制备4-氨基丁酸之后，通过过滤培养基，从培养基的微生物细胞及不溶性成分分离4-氨基丁酸。上述过滤用于从培养基除去微生物细胞及不溶性成分。上述过滤可以利用本发明所属技术领域公知的多种方法，例如，可以利用离心分离、压滤器、过滤膜或者过滤纸来实施。根据本发明优选实例，在步骤(a)及步骤(b)之间还包括在上述培养基处理活性炭来除去培养基的色素的步骤。活性炭处理可以通过本发明所属技术领域公知的多种方法来实施，大体上有如下两种方法:将活性炭直接在培养基进行处理的方法和利用填满活性炭的色谱柱的方法。考虑到生产费用及工序方便性，将活性炭直接在培养基进行处理的方法更加适合本发明。根据将活性炭直接在培养基进行处理的方法，相对于培养基内的4-氨基丁酸(4-aminobutyricacid)的重量％,在培养基进行处理的活性炭的量为I重量％_10重量％,优选为1.5重量％-4.0重量％,更加优选为2.0重量％-4.0重量％。如以下实施例所述,如果活性炭的处理量大于4.0重量％，则培养基内的4-氨基丁酸的损失率会增加，而存在最终制备的2-吡咯烷酮的收获率减少的问题，如果活性炭的处理量小于1.5重量％，则未能充分除去培养基内的色素杂质，而存在2-吡咯烷`酮的收获率减少的问题。选择性地，活性炭处理可以利用填满活性炭的色谱柱来实施。例如，在填满活性炭的色谱柱装载培养基，从色谱柱获得洗脱液(eluant)，则可以获得除去色素的4-氨基丁酸溶液。在利用色谱柱的情况下，可以同时进行色素的除去和培养基的过滤。根据本发明优选实例，本发明中，对步骤(a)的结果物进行离心分离来分离菌体，在分离的溶液处理活性炭来除去色素之后，过滤结果物来获得4-氨基丁酸。优选地，在处理活性炭之前，对分离出菌体的培养基进行加热处理。根据本发明优选实例，浓缩包含通过过滤而获得的4-氨基丁酸的溶液来利用于2-吡咯烷酮合成。根据本发明优选实例，在步骤(b)之后还包括对上述全细胞催化剂进行分离且再利用分离的全细胞催化剂的步骤。由于本发明中提供的方法不经过微生物的破碎过程而是使用微生物本身，可以通过离心分离来容易回收具有谷氨酸脱羧酶的微生物供重新使用。可以利用回收的微生物来反复上述步骤(a)，也可以在开始4-氨基丁酸制备反应的反应器还注入已回收的微生物来制备4-氨基丁酸。步骤(C):从4-氨基丁酸制备2-吡咯烷酮利用在上述过程中获得的4-氨基丁酸来获得2-吡咯烷酮。根据本发明优选实例，在步骤(C)中利用的4-氨基丁酸未进行预提纯(pre-purification)。本说明书中的“未进行预提纯的4-氨基丁酸”是指除了如上所述的过滤和/或活性炭处理以外，未进行其他提纯过程(例如，结晶化)的未加工的(crude)4_氨基丁酸。4-氨基丁酸转换到2-吡咯烷酮的过程基本上是内酰胺环化反应。就利用4-氨基丁酸来合成2-吡咯烷酮而言，可以通过本发明所属技术领域的公知的多种方法来实施。
根据本发明优选实例，4-氨基丁酸转换到2-吡咯烷酮的过程是由本发明人开发的方法，是命名为“DPSP”(大常卩比咯烧酮的合成方案(Daesang Pyrrolidone SynthesisProtocol))的方法。该DPSP方法是既有效、又经济(cost-effective)的方法。DPSP方法基本上包括以下步骤:步骤(c-1)，形成混合有4-氨基丁酸及2-吡咯烷酮的的反应组合物；步骤(c-2)，对上述反应组合物进行加热处理来实施内酰胺环化反应，来生成2-吡咯烷酮及水；以及步骤(c-3)，分离上述2-吡咯烷酮。更加具体地，DPSP方法包括如下两种:在如上所述的基本的步骤中，把重点放在温度调节上的DPSP-T方法和把重点放在压力调节上的DPSP-P方法。根据本发明优选实例，DPSP-T方法包括以下步骤:步骤(a)，形成混合有4-氨基丁酸及2-吡咯烷酮的反应组合物；步骤(b)，在118°C -148°C的温度下对上述反应组合物进行加热处理来实施内酰胺环化反应，来生成2-吡咯烷酮及水；以及步骤(C)，分离上述2-吡咯烷酮。根据本发明优选实例，DPSP-P方法包括以下步骤:步骤(a)，形成混合有4-氨基丁酸及2-吡咯烷酮的反应组合物；步骤(b)，在减压条件下对上述反应组合物进行加热处理来实施内酰胺环化反应，来生成2-吡咯烷酮及水，并除去上述水；以及步骤(C)，分离上述2-吡咯烷酮。首先，对DPSP-T方法进行详细说明如下。根据DPSP-T方法，首先，为了提供对于4-氨基丁酸的转换反应的适合的环境，而形成混合有4-氨基丁酸及2-吡咯烷酮的反应组合物。在提供4-氨基丁酸的反应物和2-吡咯烷酮共存的反应组合物的情况下，如以下实施例中所证明，在低于4-氨基丁酸的熔点(202°C)的温度，例如在118°C _120°C下，4-氨基丁酸转换为2-吡咯烷酮和水。通过多种方法可提供混合有4-氨基丁酸及2-吡咯烷酮的反应组合物。第一方式，步骤(a)中，可以在反应器搅拌4-氨基丁酸及2-吡咯烷酮。即，在反应器投入4-氨基丁酸及2-吡咯烷酮并对此进行搅拌，从而形成混合有4-氨基丁酸及2-吡咯烷酮的反应组合物。这种反应组合物，可以在比较低的温度，例如，可以在118°C -148°C下进行4-氨基丁酸的内酰胺环化反应。在第一方式中，与4-氨基丁酸混合的2-吡咯烷酮的量没有特别的限制。但是，如果与4-氨基丁酸混合的2-吡咯烷酮的量过少，则在为了反应进行搅拌时会存在问题，如果过多，则存在反应结束后对2-吡咯烷酮进行蒸馏的费用上涨的问题。因此，考虑到顺利的工序运转和制备费用时，按重量比来算，4-氨基丁酸和2-吡咯烷酮的混合量之比优选为1:0.1-1:10，更加优选为1:0.2-1:5，进而优选为1:0.5-1:2。第二方式，步骤(a)中，可以在反应器投入4-氨基丁酸，提高上述反应器的温度来将4-氨基丁酸转换为2-吡咯烷酮及水之后，接着将4-氨基丁 酸追加投入到上述反应器。例如，在反应器投入4-氨基丁酸，将反应器的温度上升至4-氨基丁酸的熔点(2020C )，来将4-氨基丁酸转换为2-吡咯烷酮及水。接着，自然冷却反应器的同时，追加地投入4-氨基丁酸并进行溶解。在需要的情况下，可以两次追加投入4-氨基丁酸。 第三方式，步骤(a)中，可以在反应器投入4-氨基丁酸，提高上述反应器的温度来将4-氨基丁酸的一部分转换为2-吡咯烷酮及水。与第二个方式不同之处为，初期开始使用要转换为2-吡咯烷酮的全部4-氨基丁酸。与在上述三个方式中采取哪一个方式无关地，通过这些过程提供混合有4-氨基丁酸及2-吡咯烷酮的反应组合物。接着，在118°C _148°C的温度下，对上述反应组合物进行加热处理来实施内酰胺环化反应，来生成2-吡咯烷酮及水。如果在适合的温度下维持步骤(a)的反应组合物，则产生内酰胺环化反应，4-氨基丁酸转换为2-吡咯烷酮及水。根据现有技术(例如，日本专利申请公开第2002-121183号及日本专利申请公开第2009-159840号)，在高温(例如，200°C _300°C或者180°C )下，将4-氨基丁酸转换为2-吡咯烷酮。本发明中，在相当低于现有技术中提出的反应温度的温度，即，在118°C _148°C的温度下，利用4 -氨基丁酸和2-吡咯烷酮的混合反应组合物来进行内酰胺环化反应，来生成2-吡咯烷酮及水。假如，反应温度小于118°C，几乎无法进行内酰胺环化反应，导致2-吡咯烷酮几乎未生成，在反应温度大于148°C时(例如，200°C _300°C或者180°C )，因爆发性地生成的水(水蒸气)而存在难以运转工序等问题，因此不适于2-吡咯烷酮的大量生产。本发明中提出的118°C -148°C的反应温度是有效进行4-氨基丁酸的转换反应的同时，不要求高温和/或高压的效益的条件，是适于大量生产的条件。选择性地，步骤(b)可以在减压下实施，可以借助这种减压来除去反应中生成的水。在本发明中，减压条件优选为750mmHg以下，更加优选为120mmHg以下，进而优选为10mmHg-120mmHg,尤其优选为 10mmHg-60mmHg,最优选为 20mmHg-60mmHg。最终，从步骤(b)的反应结果物分离2-吡咯烷酮，以适合的纯度及收获率获得2-吡咯烷酮。可利用本发明所属技术领域公知的多种方法分离2-吡咯烷酮。优选地，借助减压蒸馏实施2-吡咯烷酮的分离。用于分离2-吡咯烷酮的减压蒸馏条件优选为0.lmmHg-250mmHg,更加优选为lmmHg-90mmHg,进而优选为lmmHg-50mmHg,尤其优选为lmmHg-20mmHgo通过本发明的DPSP-T方法，最终以高收获率及高纯度获得2-吡咯烷酮。优选地，本发明的方法呈现出2-吡咯烷酮的最大99%的收获率及最大99.8%的纯度，更加优选地，呈现出90%-99%的收获率、99.0%-99.8%的纯度，进而优选地，呈现出96%_99%的收获率、99.5%-99.8% 的纯度。对DPSP-P方法进行说明，如下。根据DPSP-P方法，首先，为了提供适于4-氨基丁酸的转换反应的环境，形成混合有4-氨基丁酸及2-吡咯烷酮的反应组合物。可以参照记载于上述DPSP-T方法的内容对形成反应组合物的过程进行说明。接着，在减压条件下，对上述反应组合物进行加热处理来实施内酰胺环化反应，来生成2-吡咯烷酮及水，并除去上述水。在适合的温度及减压条件下，维持步骤(a)的反应组合物，则产生内酰胺环化反应，4-氨基丁酸转换为2-吡咯烷酮及水，从反应结果物除去水。DPSP-P工序的特征之一是，在4-氨基丁酸的转换反应赋予减压的条件，来除去反应中生成的水。由于这种水的除去不仅使反应速度大大增加，而且可以在更加低的温度下进行反应，整体上可以大大改善对于2-吡咯烷酮的生产率。就本发明而言，减压条件优选为750mmHg以下，更加优选为120mmHg以下，进而优选为IOmmHg-12OmmHg,尤其优选为10mmHg-60mmHg,最优选为20mmHg-60mmHg。步骤(b)中的反应温度优选为110°C以上(例如，110°C _150°C)，更加优选为118°C以上，进而优选为118°C -150°C。选择性地，在IlS0C _148°C的温度范围内，本发明也呈现2-吡咯烷酮的优秀的收获率及提纯率。根据本发明，例如，在118°C的低温下，4-氨基丁酸也可以转换为2-吡咯烷酮。在步骤(b)中除去水。根据本发明优选实例，步骤(b)中除去水的过程在实施步骤(b)的过程中同时进行。即，4-氨基丁酸转换为2-吡咯烷酮和水，水在生成的同时在减压条件下被除去。优选地，这种除去水的过程以连续的工序实施。选择性地，在步骤(b)中的除去水的过程可以在实施步骤(b)的过程当中进行。选择性地，在步骤(b)中的除去水的过程可以在实施步骤(b)之后进行。最终，从步骤(b)的反应结果物分离2-吡咯烷酮，以适合的纯度及收获率获得
2-吡咯烷酮。可以参照记载于上述DPSP-T方法的内容来对2-吡咯烷酮的分离进行说明。通过DPSP-P工序，最终以高收获率及高纯度获得2-吡咯烷酮。优选地，本发明的DPSP-P工序呈现出2-吡咯烷酮的最大99%的收获率及最大99.8%的纯度，更加优选为90%-99%的收获率、99.0%-99.8%的纯度，进而优选为96%_99%的收获率、99.5%-99.8%的纯度。发明效果概括本发明的特征及优点，如下。(a)本发明提供利用生物物质来从谷氨酸或者谷氨酸盐制备2-吡咯烷酮的一系列的工序。(b)根据本发明，作为全细胞利用微生物来制备4-氨基丁酸，优选地，直接利用未经结晶化等复杂的提纯过程的4-氨基丁酸来以高收获率经济地制备2-吡咯烷酮。(C)根据本发明，能够以高收获率及低生产费用大量制备2-吡咯烷酮。(d)根据本发明，没有高温/高压的效益地，能够以高收获率及高纯度从4-氨基丁酸获得2-吡咯烷酮。(e)本发明通过简化2-吡咯烷酮的制备工序，适合于工业性规模的大量生产。
图1表示根据有机溶剂处理的大肠杆菌及乳酸菌的Y氨基丁酸的生产速度比较结果。图2表示根据有机溶剂种类的微生物的Y氨基丁酸生产活性变化。图3表示根据pH的Y氨基丁酸生产速度的变化。在图4中条形图表示Y氨基丁酸的生产速度，实线图表表示初期pH。图4表示在使用处理了有机溶剂的菌体的高浓度Y-氨基丁酸生产中随着反应而发生的PH的变化。
实施方式以下，通过实施例，对本发明进行更详细的说明。这些实施例仅仅用于对本发明进行更加具体的说明，根据本发明的主旨，本发明的范围并不局限于这些实施例，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。
实施例在本说明书全文中，为了表示特征物质的浓度而使用的“％”在未另行提及的情况下，固体/固体为(重量/重量)％，固体/液体为(重量/体积)％，而且液体/液体为(体积/
体积)°/o o实施例1:从谷氨酸或者谷氨酸盐生产Y氨基丁酸1-1.从利用处理了有机溶剂的多种全细胞催化剂的谷氨酸生产Y氨基丁酸培养具有谷氨酸脱羧酶的菌体、大肠杆菌BL21 (DE3)、大肠杆菌JM101、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)及棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis) (KCTC)并回收之后，分为有机溶剂处理组和对照组。就有机溶剂处理组而言，在回收的菌体处理
0.5% (v/v)的甲苯,在30°C、200rpm的条件下搅拌10分钟,来破坏微生物的选择透性之后，将该微生物悬浮于灭菌水。对照组不进行特别的处理过程，直接悬浮于灭菌水。在上述准备的各个微生物悬浮液添加40 ii M的5-磷酸批卩多醒(PLP,Pyridoxal5_phosphate ;西格玛奥德里奇:Sigma Aldrich),并添加33wt%的谷氨酸(大常株式会社)来测定了、氨基丁酸的生产速度。 为了比较实验结果，处理了有机溶剂的实验组的生产速度值除以未处理有机溶剂的实验组的生产速度值。实验结果表明，如图1所示，就Y氨基丁酸的生产速度而言，处理了作为有机溶剂的甲苯的组比非处理组提高约1.2倍-5.5倍。1-2.从根据有机溶剂的全细胞催化剂的谷氨酸盐生产Y氨基丁酸培养具有谷氨酸脱羧酶的菌体(Escherichia coli)并回收之后,使用有机溶剂来破坏微生物的选择透性之后，通过谷氨酸钠(西格玛奥德里奇)分析了 Y氨基丁酸的生产速度。使用的有机溶剂都作为疏水性有机溶剂，是甲苯、氯仿、二甲苯及苯。就处理条件而言，在微生物悬浮液处理0.5%(v/v)的各有机溶剂，在30°C、200rpm的条件下搅拌10分钟。在上述准备的各个微生物悬浮液添加40 ii M的5-磷酸吡哆醛，并添加1% (v/v)的谷氨酸钠，来比较Y氨基丁酸的生产速度。其结果如图2所示，在处理疏水性有机溶剂后，y氨基丁酸的生产速度增加了约5倍-8倍。1-3.通过有机溶剂处理来增加菌体的Y氨基丁酸的生产活性培养具有谷氨酸脱羧酶的菌体之后回收了菌体。用蒸馏水清洗一次回收的菌体之后，与有机溶剂搅拌，来破坏选择透性。作为此时使用的有机溶剂，使用了在上述实施例
1-2呈现最快的Y氨基丁酸生产速度的甲苯。分为处理甲苯的实验组和未处理甲苯的对照组，就处理甲苯的实验组而言，在微生物悬浮液添加0.5% (v/v)的甲苯后，在37°C、150rpm下搅拌了 10分钟。在结束搅拌之后，用蒸馏水清洗一次菌体。将上述准备的菌体悬浮于醋酸盐缓冲溶液(pH4.6、200mM)之后，添加0.04mM的5-磷酸吡哆醛及1% (v/v)的谷氨酸钠来测定了 Y氨基丁酸生产速度。其结果表明，处理甲苯的菌体的Y氨基丁酸生产活性为5.72 u mo I GABA/mg dcw/min,未处理甲苯的菌体的活性为 0.75 u mol GABA/mg dcw/min。1-4.根据缓冲溶液的pH得到提高的Y氨基丁酸的生产速度
培养具有谷氨酸脱羧酶的菌体，使用与实施例3提出的方法相同的方法在培养的菌体处理作为有机溶剂的甲苯之后，将已处理的菌体悬浮于各个缓冲溶液和灭菌水。在这里使用的缓冲溶液的浓度均为lOOmM，pH分别是4.5,6.0,7.0及8.0。使用醋酸来制备pH为4.5的缓冲溶液，使用磷酸来制备pH为6.0、7.0及8.0的缓冲溶液。在如上准备的全细胞催化剂的悬浮溶液添加0.04mM添加量的5-磷酸吡哆醛，在这里添加10wt%的谷氨酸，开始进行反应。随后，测定、氨基丁酸的初期生产速度来分析了随着PH而发生的Y氨基丁酸的生产速度的变化。实验结果如图3所示，使用pH6的缓冲溶液，在初期pH为3.9时，呈现出最快的反应速度，其值为116g GABA/L/h。1-5.使用处理有机溶剂的菌体来生产Y氨基丁酸培养具有谷氨酸脱羧酶的菌体来回收菌体。此时，回收的干燥菌体的量为3.6g。将菌体悬浮于灭菌水之后，添加0.5% (v/v)的甲苯，在37°C下搅拌了 10分钟。一旦结束甲苯处理就进行离心分离来回收菌体，利用蒸馏水来再清洗一次。将回收的菌体悬浮于2L的磷酸缓冲溶液(pH为6.0UOOmM)之后，投入到反应器，在这里添加0.04mM的5-磷酸吡哆醒、Ikg的谷氨酸及50ppm的消泡剂(聚氧化烯乙二醇(Polyoxyalkylene Glycol)),开始进行反应。反应条件为30°C、200rpm。反应开始时pH为4.5，经过8hr，残留的谷氨酸的浓度减少为小于lwt%，此时pH为5.8。在此，添加盐酸溶液来将pH减少到5.5之后，继续反应lhr，从而将残余的谷氨酸都转换为Y氨基丁酸。生成的Y氨基丁酸的总重量为690g，摩尔转化率为98%，消耗时间总共为9hr。1-6.使用处理有机溶剂的菌体来生产高浓度Y氨基丁酸培养具有谷氨酸脱羧酶的菌体之后，在培养基投入0.25%(￥八)的甲苯，在30°〇下搅拌了 10分钟。搅拌后通过离心分离回收了微生物，此时回收的干燥菌体的重量约为50g。将微生物悬浮于缓冲溶液或者蒸馏水之后，投入到反应器，添加0.04mM的5-磷酸吡哆醛、8kg的谷氨酸及500ppm的消泡剂(聚氧 化烯乙二醇)，来开始进行反应。反应条件为30°C、200rpm,除此之外未对任何因素进行调节。反应开始时的pH为4.0，反应经过10hr，残留谷氨酸浓度减少为小于lwt%，此时pH为5.87。随后，添加盐酸溶液，将pH减少至5.6之后，还反应2hr，将残有的谷氨酸都转换为Y氨基丁酸(图4)。生成的Y氨基丁酸的浓度为34wt%，摩尔转化率为98%，消耗时间总共为12hr。1-7.利用反应结束后回收的菌体来生产Y氨基丁酸通过与上述实施例1-2相同的方法，在3.6g的微生物处理0.5% (v/v)的甲苯之后，实施了将0.5kg的谷氨酸作为基质的Y氨基丁酸的生成反应。在结束反应9小时后，在4000rpm、IOmin条件下执行离心分离来回收微生物，如同上述实施例1，利用蒸馏水清洗该微生物，使该微生物悬浮于醋酸盐缓冲溶液(pH4.6、200mM)之后，添加0.04mM的5-磷酸吡哆醛和1%( v/v)的谷氨酸钠来测定Y氨基丁酸生产活性时，其值为4.80 iimol GABA/mgdcw/min。分离而回收利用于上述Y氨基丁酸转换反应的菌体之后，将2g的回收菌体投入到具有新准备的菌体的反应器之后，重新进行与实施例1-2相同的反应时，转换率与上述第一次反应几乎相同，总反应时间缩短到6hr。实施例2:从培养基获得Y氨基丁酸除去上述实施例1的培养液的菌体，进行加热处理后执行脱色过程。通过离心分离来分离菌体之后，利用搅拌机，并用活性炭对分离后加热处理的培养液进行脱色处理。就脱色而言，在培养液添加了 1.0%_15.0% (活性炭重量/Y氨基丁酸重量)的活性炭。对加热处理后生成的改性蛋白质，与活性炭一起进行了过滤分离，并进行浓缩来使用于2-吡咯烷酮合成。其结果可见，如果活性炭量增加，则呈现出培养液的色也随之徐徐透明的倾向，表I表示，在初期浓度30.0% ( y氨基丁酸重量/培养液体积)的培养液，利用活性炭来进行脱色的情况下，随着所使用的活性炭的浓度而不同的吡咯烷酮合成回收获率，所使用的活性炭的浓度越增加，Y氨基丁酸的损失率也随之增加，从而导致回收获率减少，在活性炭不足时，由于未能充分除去色素杂质，因而导致合成回收获率减少。吡咯烷酮合成根据以下实施例3-1记载的方法来实施。表I
权利要求
1.一种2-吡咯烷酮的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤(a)，在包含谷氨酸或者谷氨酸盐的培养基培养作为全细胞催化剂具有谷氨酸脱羧酶的微生物来制备4-氨基丁酸； 步骤(b)，通过过滤从上述培养基获得上述4-氨基丁酸；以及 步骤(C)，将上述4-氨基丁酸转换为2-吡咯烷酮。
2.根据权利要求1所述的2-吡咯烷酮的制备方法，其特征在于，上述微生物是由疏水性有机溶剂进行预处理的微生物。
3.根据权利要求1所述的2-吡咯烷酮的制备方法，其特征在于，上述步骤(a)中的具有谷氨酸脱羧酶的微生物是大肠杆菌。
4.根据权利要求2所述的2-吡咯烷酮的制备方法，其特征在于，上述有机溶剂选自包含甲苯、氯仿、二甲苯、苯及环己烷的组。
5.根据权利要求1所述的2-吡咯烷酮的制 备方法，其特征在于，上述步骤(a)在缓冲区pH3.0-pH8.0的范围内实施。
6.根据权利要求1所述的2-吡咯烷酮的制备方法，其特征在于，在上述步骤(a)及步骤(b)之间还包括在上述培养基处理活性炭来除去培养基的色素的步骤。
7.根据权利要求6所述的2-吡咯烷酮的制备方法，其特征在于，相对于上述培养基内的4-氨基丁酸的重量％，添加1.5重量％ 4.0重量％的上述活性炭。
8.根据权利要求1所述的2-吡咯烷酮的制备方法，其特征在于，上述步骤(b)之后还包括分离上述全细胞催化剂，并且再利用已分离的全细胞催化剂的步骤。
9.根据权利要求1所述的2-吡咯烷酮的制备方法，其特征在于，在上述步骤(c)中利用的4-氨基丁酸未进行预提纯。
10.根据权利要求1所述的2-吡咯烷酮的制备方法，其特征在于，上述步骤(c)包括以下小步骤: 步骤(c-1)，形成混合有4-氨基丁酸及2-吡咯烷酮的反应组合物； 步骤(c-2)，对上述反应组合物进行加热处理来实施内酰胺环化反应，来生成2-吡咯烷酮及水；以及 步骤(c-3)，分离上述2-吡咯烷酮。
11.根据权利要求10所述的2-吡咯烷酮的制备方法，其特征在于，上述步骤(c-2)在减压条件下实施。
12.根据权利要求11所述的2-吡咯烷酮的制备方法，其特征在于，上述减压条件为IOOmmHg 以下。
13.根据权利要求12所述的2-吡咯烷酮的制备方法，其特征在于，上述减压条件为IOmmHg 50mmHgo
14.根据权利要求11所述的2-吡咯烷酮的制备方法，其特征在于，上述步骤(c-2)在IlO0C _150°C的温度条件下实施。
15.根据权利要求10所述的2-吡咯烷酮的制备方法，其特征在于，上述步骤(c-2)在118 0C -148 °C的温度条件下实施。
16.根据权利要求15所述的2-吡咯烷酮的制备方法，其特征在于，上述步骤(c)通过减压蒸馏来实施。
17.根据权利要求1所述的2-吡咯烷酮的制备方法，上述2-吡咯烷酮的制备方法呈现出2-吡咯烷酮 的最大99%的收获率及最大99.8%的纯度。
全文摘要
本发明涉及一种利用生物物质的2-吡咯烷酮的制备方法，上述利用生物物质的2-吡咯烷酮的制备方法包括以下步骤步骤(a)，在包含谷氨酸或者谷氨酸盐的培养基培养作为全细胞催化剂具有谷氨酸脱羧酶的微生物来制备4-氨基丁酸；步骤(b)，通过过滤从上述培养基获得上述4-氨基丁酸；以及步骤(c)，将上述4-氨基丁酸转换为2-吡咯烷酮。本发明提供利用生物物质来从谷氨酸或者谷氨酸盐制备2-吡咯烷酮的一系列的工序。根据本发明，作为全细胞利用微生物来制备4-氨基丁酸，优选地，能够直接利用未经如结晶化等复杂的提纯过程的4-氨基丁酸来以高收获率经济地制备2-吡咯烷酮。根据本发明，能够以高收获率及低生产费用大量制备2-吡咯烷酮。本发明通过简化2-吡咯烷酮的制备工序，适合于工业性规模的大量生产。
文档编号C12N1/20GK103189520SQ201180047545
公开日2013年7月3日 申请日期2011年9月30日 优先权日2010年9月30日
发明者朴东喆, 康基权, 朴贤贞, 金瑞亨, 吴载荣 申请人:大象株式会社
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