离子信号增强的制作方法
专利名称：离子信号增强的制作方法
技术领域：
本发明涉及使来自于化学反应的可检测离子信号增强的方法，特别是并非专门针对DNA测序和SNP鉴定的方法。
背景技术：
核酸的测序能够通过在未知(靶)多核酸与每次添加一个的游离核苷酸dATP、dCTP、DGTP、DTTP之间的聚合反应中合成完整或部分的新生核酸链来实现。然后常规上通过利用凝胶电泳以及直接或间接的光学定量监测这种聚合反应的主要产物(即新合成的多核苷酸)进行鉴定。后来，在核酸的测序和鉴定领域中的工作已经研究了离子敏感场效应晶体管(ISFET)通过检测由反应引起的pH变化而检测掺入核酸链的核苷酸的能力。通常，在反应过程中释放氢离子(质子)。ISFET的电信号输出强度取决于所释放的氢离子的量，而所释放的氢离子的量主要取决于待检测样品中核酸(例如RNA或DNA)的数量。在某些情况下，由掺入反应直接释放的质子的数量可能太少，以至于无法通过ISFET进行精确的检测，也无法进行信号处理。此外，可能具有高水平的背景信号，这可能是由反应的副产物导致的。因而，由所述副产物产生的背景信号被认为是一种阻碍。在下面的讨论中，所提到的质子、氢离子和H+是同义的，均与液体的pH值有关。1992 年，Toshinari Sakurai ("Real-Time Monitoring of DNA PolymeraseReactions by a Micro ISFET pH sensor", 1992，64，1996-1997，Analytical Chemistry)描述了 ISFET是如何能够对DNA聚合酶反应的动力学进行监测的。他假设dNTP渗入到DNA链上消耗了氢离子，产生了生长的DNA链和焦磷酸盐。利用ISFET测量pH的变化。
9年之后，DNA Electronic公司开发了一种方法，此方法能够通过检测核苷酸掺入到生长的核酸链上时pH的变化而对DNA进行鉴定。观察结果显示释放了氢离子。VictOTova等(〃New Substrates of DNA polymerases", Federation of European BiochemicalSocieties Letters, 453，pp6_10, 1999)探讨了焦磷酸酶(PPase)如何在体内分解焦磷酸盐。然而，体液具有很强的缓冲作用，以至于在该反应中无法观察到任何PH的变化。一份相应的专利公开(W003/073088)中引用了 Victorova的见解，它显示了结合到聚合物酶上的焦磷酸酶会水解PPi，从而产生正磷酸盐和氢离子。然后，EP2304420 (1n Torrent)公开了一种具有chemFET阵列的设备，所述chemFET阵列包含附着于焦磷酸盐受体以检测PPi的钝化层。这些工作聚焦于检测由掺入反应直接释放的质子或者检测所述反应的副产物。然而，迄今为止，没有人考虑过添加酶以分解副产物，从而释放并检测除了核苷酸的掺入过程中产生的质子之外更多的质子。本发明的目的是提供一种方法，该方法通过对DNA反应的副产物进行解构来增加用于检测化学反应的靶分析物的浓度。化学反应优选为增加或移除特定的核酸/核苷酸/核苷(本文所使用的这些术语是可以互换的)。
发明内容
根据本发明的第一个方面，提供一种鉴定未知核酸的方法，包括:在反应室中合并未知多核酸与已知核酸试剂；当一种或多种未知核酸的碱基与已知试剂中含有的一种或多种已知核酸的碱基互补时，由聚合反应产生第一数量的质子；利用一种或多种酶使聚合反应的副产物发生水解反应，由此产生第二数量的质子;监测由暴露于反应室的ISFET得到的电输出信号；以及将输送信号的变化与未知多核苷酸和已知试剂之间的所述反应相关联，由此鉴定未知核酸。优选地是，该方法包括确定输出信号是否具有显著的变化并且只关联这种显著的变化。优先地是，所述已知核苷酸为dATP、dGTP、dTTP或dCTP中的一种，并且所述已知核酸为引物。根据任意前述权利要求的方法，其中，重复该方法的步骤以对未知核酸进行测序，每一次重复均使用dATP、dGTP、dTTP或dCTP中的一种作为已知核苷酸。还优选的是，所述已知核酸是等位基因特异性引物。优选地是，所述聚合反应为等位基因特异性扩增反应。优选所述副产物中的一种 为焦磷酸盐，并且一种或多种酶包括焦磷酸酶。可优选在聚合反应开始前将焦磷酸盐添加到反应室中，使得聚合反应和解构反应几乎同时发生。或者，优选所述副产物中的一种为DNA，并且所述一种或多种酶包括解构DNA的酶。优选所述一种或多种酶包括一种或多种的核酸外切酶，所述核酸外切酶优选自由T7核酸外切酶、Recjf、核酸外切酶1、核酸外切酶T以及BAL-31核酸外切酶、核酸外切酶III或λ核酸外切酶构成的组。可优选在聚合反应开始后将所述一种或多种酶添加到反应室中，由此使得解构反应在聚合反应之后发生。可优选在ISFET和另一个ISFET或MOSFET之间有差别地测量电输出信号。确定输出信号是否具有显著的变化可优选包括确定电输出信号变化的大小,或者更加优选地是将电输出信号的变化与阈值信号变化值进行比较。然而，确定输出信号是否具有显著的变化可优选包括:分别对来自于聚合反应的输出信号的变化和来自于解构反应的输出信号的变化进行评价。确定输出信号是否具有显著的变化还可优选包括将输出信号变化与没有发生聚合反应(因为未知核酸的一种或多种核苷酸与已知核苷酸和/或已知核酸没有互补)的输出信号变化进行比较。因此，本发明的优点是通过检测来自于聚合反应与解构反应这两者的质子而增强
信号强度。特别优选的是，所述酶水解焦磷酸盐而非三磷酸。因此，在它们的存在下，能检测到更大的PH变化(超过由dNTP水解导致的pH变化)。在DNA聚合过程中，用于SNP的等位基因特异性引物可以通过添加三磷酸核苷(dNTP或ddNTP)进行延伸。任选地将延伸/聚合的链扩增，然后可以添加核酸外切酶以逐个地移除新增加的核苷酸(或其扩增等价物)。在最简单的情况下，优选只添加一个NTP，然后只移除一个NTP。通过ISFET(s)对NTP增加和移除这两者所释放的H+离子进行检测。核酸外切酶对于非靶DNA (例如初始引物)的活性可优选通过帽化或修饰来进行改良。而在靶链扩增的情况下，核酸外切酶对于非靶DNA的活性基本上是无关紧要的，因为它被扩增目标物掩盖-这尤其适用于SNP的检测，因此对于该方面，扩增是特别优选的。在简单测序以确定一部分靶链的属性(identity)的情况下，扩增可能并不总是必须的，但是，若将核酸外切酶用于这种测序，则可优选对进行延伸而开始测序的引物进行帽化或修饰，以防止核酸外切酶对其的活性。因此本发明提供了一种鉴定核酸的方法。该方法涉及确定核酸的属性，例如核酸碱基的属性，即，其是C、G、T、A还是U。其可以优选为对DNA链或其它遗传物质进行测序的方法的一部分。其可以优选仅使用PPase来评价通过聚合作用将核苷添加到新生链上所产生的PPi的水平:可将其进行多次重复以对长的延伸链进行测序或是只将其进行一次。在后一种情况中，本发明因而也适用于在较大的测序工作中或在SNP的检测中确定单核苷酸的属性。当只考虑单核苷酸的添加时，引入核酸外切酶活性以移除添加的核苷酸从而进一步提高精确性也可能是有用的，但是本发明还能够适用于更长的序列。特别优选的是，当对模板或靶链进行测序时，在只有一种类型的三磷酸核苷(即胞嘧啶(C))的存在下完成测序。核苷的添加将引发用于ISFET检测的H+离子释放，并表明模板链上相应的位置为互补的核酸，此时为G。本发明同样适用于SNP检测。然而，在那种情况下，或者在需要对核酸在模板中更长延伸链的属性进行检测的情况下，也特别优选将模板或靶链暴露于引物。在SNP检测的情况下，所述引物为等位基因特异性引物。在适当的三磷酸核苷(即全部或至少为A、T (或U)、C和G)和聚合酶的存在下暴露于引物或与引物接触将导致引物在SNP (或者其它所需)位点对靶链的退火(“识别”)，接着由聚合反应进行链延伸。这种“配对”将导致氢离子释放，可通过ISEFT检测。最优选的是将核酸外切酶活性用于有关SNP的方面，特别是确认在引物末端的核苷的添加，其中，所述末端被极为精确地设计为SNP的位置，由此使得添加至引物:V端的第一个或者接下来的核苷为与SNP互补的核苷。此处，引物的帽化和修饰也可有助于防止作用于引物。附图简要说明下面将参考附图，举例对本发明的具体实施方案进行说明，其中
图1为根据本发明的采用了焦磷酸酶(PPase)的实施方案的示例性流程图；图2为在焦磷酸盐(PPi)和焦磷酸酶(PPase)存在和不存在这两种情况下的各种反应的pH经时变化图；图3为根据本发明的采用了核酸外切酶(例如λ核酸外切酶)的实施方案的各种反应的pH经时变化图；并且图4为根据本发明的采用了核酸外切酶(例如核酸外切酶III)的实施方案的各种反应的pH经时变化图。发明详述 本文公开的是一种监测与新合成核酸相关联的解构反应的检测方法。该解构反应的底物来自于核酸聚合反应(初级反应)，该核酸聚合反应本身在核苷添加至(即聚合而形成)延伸链上时释放氢离子。因此，所述解构反应被称为“次级反应”。可以单独对由次级反应释放出的额外氢离子进行检测，或者另外还检测由初级反应释放出的氢离子。次级反应的产生引发了对初级信号而言额外的次级信号，所述次级反应涉及初级反应的副产物的催化作用(主要是水解作用)。由与初级信号相同的检测器检测到的任何次级信号均被视为原位信号增强。由次级反应释放出的氢离子也可用另外的检测器进行检测。换言之，其目的是信号增强，因此能够相对于背景增加精确性。事实上，这是通过对背景进行抑制而实现的。由次级反应释放的氢离子优选使用与初级反应相同的(即单一的)ISFET传感器进行检测，但是也可以使用另外的传感器，例如，每个反应室使用两个传感器时，或者初级反应和次级反应发生在不同的时间或位置时。例如，解构反应优选为由本发明所述的酶进行催化的反应，该反应由底物产生一种或多种分解产物。例如，优选的酶为焦磷酸酶或核酸外切酶，它们都是催化磷酸酯键的水解反应的水解酶，因而解构磷酸酯键，最终生成更多的氢离子。因此特别优选的是，所述解构酶是那些能够水解磷酸酯键/磷酸二酯键的酶，在核酸(即核酸磷酸二酯键)的情况下尤其是如此。优选(初级)化学反应为新生多核苷酸链(具有两个或更多个核苷酸)的合成反应，其中RNA和DNA是特别优选的。优选的是，离子电荷的波动表明双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)和脱氧核苷三磷酸(dNTP)插入到新生多核苷酸链上。所述新生多核苷酸链可以是全新的多核苷酸链，或者是在优选测序的反应中添加的退火链(如引物)的新加片段。优选的是，新生多核苷酸链为模板链的互补链。在此参考DNA对本发明进行描述，但是本发明同样适用于其它核酸。
使用了本发明的实施方案的DNA测序按如下方式进行，其中参照DNA作为优选的多核苷酸。使用聚合酶链式反应或克隆或其它扩增技术将一定量的目标DNA扩增，并(例如)使用mRNA引物引发目标区域。DNA聚合酶通过将核苷酸碱基掺入成长的DNA链(例如本文所述的新生链)中(例如引物延伸)来催化DNA合成(聚合)。ISFET在本领域中是已知的。优选地是，本文所使用的ISFET具有诸如氮化硅等离子敏感层，在离子敏感层上可以设置聚合酶层。检测PH变化的大小以确切地检测核苷酸插入(新生多核苷酸链的延伸)。ISFET的电信号变化是DNA合成中核苷酸插入的指示。在将核苷三磷酸插入新生链后，释放焦磷酸盐(PPi或P2O74O离子。可以在细胞复制、基因表达或DNA修复等很多生物反应中发现核酸聚合作用。这些反应通常是在酶(例如聚合酶)的帮助下发生的。已经开发了在宿主细胞或生物体外进行核酸复制反应的技术。它们具有很多用途，如核酸的体外扩增、核酸的测序、基因分型和分子诊断。典型的核酸聚合作用可涉及如下所示的脱氧核苷三磷酸和DNA底物。xdNTP+DNAy — xPPi+DNA(x+y)+H+X个dNTP分子水解为X个焦磷酸盐分子，DNA由y个核苷酸延伸到x+y个核苷酸。反应还可涉及核苷酸和RNA，核酸底物可以是双链或单链。所释放的氢离子的实际数目取决于试剂的PK值等各种因素。该聚合反应发生时，核苷酸的5'端结合至与另一个(模板或靶)多核酸退火的多核酸的3'(延长)端，所述另一个(模板或靶)多核酸的序列或核酸属性是有待确定的。所述结合仅发生在所述核苷酸与所述另一个多核酸(即模板链)上与结合位点相对的碱基互补时(即，胸腺嘧啶/尿嘧啶与腺嘌呤互补，鸟嘌呤与胞嘧啶互补)。在该反应中，新合成的(即DNA)新生链和PPi被视为副产物，所关注的主要产物是氢离子。然而，我们出乎意料地发现这些经常被忽视的副产物可以被解构而产生另外的氢离子，从而增加传感反应的精确度。完整的化学体系是这样的:dNTP+DNA(y) — PPi+DNA(y+1)+H+ (pH 的初级变化)PPi+PPase — 2Pi+PPase+H+ (pH 的次级变化)DNA(y+1) +核酸外切酶一dMTP+核酸外切酶+H+ (根据另一个实施方案的pH的次级变化，所述另一个实施方案能够与PPi的解构共同或分别使用)初级反应依赖于DNA的成功聚合，其发生在所添加的核苷酸或引物与待测序(即，将一个或每个核苷酸鉴定(例如)为C、G、A、T*U)DNA的未知模板链互补时。次级反应依赖于由初级反应产生的副产物。因此，如果所添加的核苷酸或引物与未知模板DNA互补，则总反应产生质子(即，导致质子的净释放)。这些质子通过ISFET进行检测，并与特定核苷酸和引物的添加相关联，从而对样品中的初始DNA进行鉴定。由此，得知添加了哪种核苷酸或引物来延长新生链可以鉴定未知(模板)核酸的一部分。聚合反应可由未知核酸与等位基因特异性引物和混合的dNTP杂交来进行。或者，可以使用引物与未知核酸在目标位置退火，然后添加已知的dNTP。又或者，聚合反应可以是使用了 PCR或等温扩增的等位基因特异性扩增反应。等位基因特异性引物的使用可用于鉴定相关位置的核苷酸的属性(如SNP)，即，确定是否存在特定SNP，从而鉴定样品中的等位基因。在一定的pH范围 内以及二价金属离子(如镁或锰)的存在下，dNTP水解为PPi导致了质子浓度的变化。焦磷酸盐的水解产生两个磷酸盐。在一定的pH范围内以及二价金属离子(如镁或锰)的存在下，焦磷酸盐的水解导致了与dNTP水解类似的pH变化。如下所示，无机PPase可以用于催化无机PPi的水解，以形成正磷酸盐:P2O74- + H2O (PPase) 2HPO42'+ H焦磷酸盐在没有酶的辅助下通常会稳定得存在一天以上。优选的反应为聚合酶链式反应、测序或引物延伸。在这些反应中,焦磷酸盐在反应混合物中保持稳定。pH变化为反应和反应百分比的指示。通过添加水解焦磷酸盐而非三磷酸的一种酶或多种酶，能够赋予更大的PH变化(超过来自于dNTP水解的pH变化)。重要的是催化焦磷酸盐水解的酶不攻击三磷酸盐。在许多技术中，三磷酸盐的水解严格地与靶分子或特异性反应的存在相关联。焦磷酸酶为作用于二磷酸键的酸酐水解酶。诸如无机焦磷酸酶或热稳定无机焦磷酸酶等酶满足所述条件。焦磷酸酶广泛可得，并可在聚合反应中与聚合酶混合。在测序的情况下，焦磷酸酶与DNA聚合酶共同使用来提高pH变化。由于PPi以前被认为仅仅是DNA聚合反应的副产物，最好是移除或忽略以避免检测的复杂化，并且还能够导致背景噪音，因此，我们第一次确认了引入PPi对于检测精确性可具有有益效果(如果PPi得到利用的话)。在一个实施方案中，在PCR反应中将热稳定焦磷酸酶与热稳定DNA聚合酶混合。该焦磷酸酶催化作为聚合产物的PPi的水解。由此，焦磷酸盐(以前至多被认为是废产物)的水解提高了来自于单核苷酸添加的总PH变化(即氢离子的浓度)。因此，还提供了一种PCR扩增的方法，其包括在添加核苷酸后，使用PPase扩大或增强ISFET的信号检测。反应的效果如图2所示。对于4个反应进行了 350秒的pH变化测量。线4表示既没有焦磷酸盐也没有焦磷酸酶的反应:pH变化很少。线2表示没有焦磷酸盐但有一些焦磷酸酶的反应；对于添加的焦磷酸酶的缓冲液，PH最初在反应中发生变化，然而后来pH变化降低，直至平衡，偏移仅表示缓冲液的添加，而不是从反应中释放出质子。线I表示同时具有焦磷酸盐和焦磷酸酶的反应；PH变化增加，直至平衡。用于反应的试剂含有KCl、MgCl2、PPase。优选浓度如下所示。优选KCl的浓 度大于IOmM,更加优选大于40mM、50mM、80mM、IOOmM或120mM。优选所述浓度小于500mM，更加优选小于400mM、300mM或200mM。可以考虑这些上下限的任意组
合 ο优选MgCl2的浓度大于ImM,更加优选大于2mM、3mM或4mM。优选所述浓度小于IOOmM,更加优选小于8mM、7mM或5mM。可以考虑这些上下限的任意组合。优选50 μ L反应体积中PPase的量大于0.01U(其中，U被定义为制造商规定的条件下的酶活性单位)，更优选大于0.05U、0.1UUU或10U。建议的焦磷酸酶混合物含有由大肠杆菌(E.coli)或酵母菌制备的无机PPase和/或热稳定无机PPase,均可购自New EnglandBiolab (优选商品目录号为M0361S)。过量的市售PPase在氢离子的检测中可能导致不良的缓冲作用。理想地是，PPase不具有任何缓冲组分。反应通常可发生在体积为InL至100 μ L的微室中，然而体积可根据ISFET和可得样品体积的大小而变大。反应容积的温度可以是18_451:，优选大于251:、301:或351:，优选小于401:或38°C。可考虑这些上下限的任意组合。核苷酸掺入后，含有DNA样品和试剂的液体的pH优选在7和8.6之间；更优选大于PH7.5或大于pH7.9 ;优先小于pH8.4或pH8.1。可考虑这些上下限的任意组合。可视需要将NaOH添加到所述液体中，以实现上述pH设置。也可以考虑其它合适的缓冲液。也可与PPi解构的同时或分别进行副产物DNA的解构，以释放质子。该反应可表示为:DNA — dNMP+H+其中，dNMP为脱氧一磷酸盐，DNA为与未知DNA模板互补的新合成的(新生)多核酸。因此，本发明、的酶可以是DNA解构酶，优选为诸如核酸外切酶等水解酶，优选能够使用DNA和/或RNA作为其底物。除非另有说明，本文任何关于DNA的说明也适用于RNA和其它多核苷酸。由于DNA解构酶(即核酸外切酶)通常分解任何DNA，并且本发明的目的是鉴定DNA或DNA的一部分，因此在产生可鉴定的DNA后再添加DNA解构酶。通过此方式，由解构反应释放的质子表示来自于可鉴定DNA的解构(优选水解)的质子，而非反应混合物中的其它DNA片段。由等位基因特异性聚合反应产生的DNA是可鉴定的。若未知DNA不发生聚合，则仍具有一些解构活性，因此优选扩增可鉴定DNA的量。这可以使用等位基因特异性扩增技术来完成，由此使得可被鉴定的DNA的量为大于未扩增DNA的数量级。用于反应的试剂含有KCUMgCl2、牛血清白蛋白(BSA)和DNA解构酶。优选浓度如下所示。优选KCl的浓度大于10mM，更加优选大于10mM、20mM、30mM、40mM或50mM。优选所述浓度小于500mM，更加优选小于400mM、300mM或200mM。可以考虑这些上下限的任意组合。优选MgCl2的浓度大于ImM,更加优选大于2mM、3mM或4mM。优选所述浓度小于IOOmM,更加优选小于8mM、7mM或5mM。可以考虑这些上下限的任意组合。反应通常可发生在体积为InL至100 μ L的微室中，然而体积可根据ISFET和可得样品体积的大小而变大。反应容积的温度可以是18_50°C，优选大于25°C、30°C或35°C，优选小于40°C或38°C。可考虑这些上下限的任意组合。核苷酸掺入后，含有DNA样品和试剂的液体的pH优选在7和9之间；更优选大于PH7.5、大于pH8或大于pH8.3 ;优先小于pH9、pH8.6或pH8.5。可视需要将NaOH添加到所述液体中，以实现上述PH设置。可考虑这些上下限的任意组合。BSA 的浓度在 0.lmg/ml 和 10mg/ml 之间，优选大于 0.2mg/ml、0.5mg/ml 或 1.0mg/ml ;优选小于5mg/ml、2.0mg/ml或1.5mg/ml。可考虑这些上下限的任意组合。根据DNA解构酶的实 施方案，所使用的酶可以是任意解构DNA并释放质子的酶，优选通过磷酸酯/磷酸二酯键的水解而解构DNA的酶。这种酶的例子有核酸外切酶。核酸外切酶为通过水解反应从多核苷酸链的末端(外部)一次切掉一个核苷酸而作用的酶，其中所述水解反应切断3'或5'端的磷酸二酯键。T7核酸外切酶、Recjf、核酸外切酶1、核酸外切酶T以及BAL-31核酸外切酶。优选所述酶为核酸外切酶III或λ核酸外切酶，均可购自New England Biolab或Fermentas。优选例子为购自Fermentas的核酸外切酶III(ENO191)和购自Fermentas的λ核酸外切酶(ΕΝ0562)。优选每50 μ I中核酸外切酶的量为10U、50U或100U。优选每50 μ I中λ核酸外切酶的量为1U、2U、5U或10U。图4为存在和不存在核酸外切酶III的情况下反应室的pH图。在对于pH具有所示效果(由被消化的DNA表示-实线)的反应中，将lOng/μ L的dsDNA底物与核酸外切酶III混合，以产生质子。对照试验(由未被消化的DNA表示-虚线)含有除了酶之外的全部试剂。如图所示，PH最初由于将试剂添加到反应室而降低，然后变为相对于对照而言没有变化，或由于酶反应而进一步降低。图3显示λ核酸外切酶具有类似的效果。待检测样品中DNA的量可以改变或是未知的，但通常在50ng/y I至150ng/y I之间，优选大于IOng/ μ 1，大于20ng/ μ I或大于50ng/ μ I。可以使用核酸解构来增强含有纯化核酸或者含有来自于之前的酶反应的核酸的样品的PH信号。因此，此方法能容许背景混合物，如残留的引物/探针(至多ImM)、寡核苷酸(至多10mM)、DNA聚合酶及其它反应组分或副产物。尽管如上所述已经按照优选的实施方式描述了本发明，但是应当理解的是，这些实施方式仅是示意性的，权利要求并不限于这些实施方式。本领域技术人员能够根据公开内容做出修改和变型，这些修改和变型应考虑为落入随附的权利要求的范围。不论是以单独的形式还是以与本文中公开或示出的任何其他特征的任何适当组合的形式，可以将本说明书中公开或示出的每个特征并入本发明。例如，解构副产物的酶可同时含有焦磷酸酶和解构DNA的酶，以从初级聚合反应还有解构反应释放质子，由此使得信号变化更大。在本文中，术语核苷酸和核酸(无论是多核苷酸和多核酸还是单核苷酸和单核酸)可互换使用。任一个都是优选的。因此本发明提供了一种增强离子信号的方法，所述离子信号即为由氢离子的释放导致的PH变化，该释放表明了核酸链上核酸的添加和移除。通过由于与PPase或核酸外切酶活性相关联的氢离子释放增加而导致的信号增强，可以显著提高确定特定(未知)核酸的属性的精确性。来自于ISEFT的信号如何与特定(未知)核酸的属性相关联在本领域中是已知的。 ·
权利要求
1.一种鉴定未知核酸的方法，包括以下步骤: 在反应室中合并未知多核酸与已知核酸试剂； 当一种或多种的所述未知核酸的碱基与所述已知试剂中含有的一种或多种已知核酸的碱基互补时，由聚合反应产生第一数量的质子； 利用一种或多种酶使所述聚合反应的副产物发生水解反应，由此产生第二数量的质子; 监测由暴露于所述反应室的ISFET得到的电输出信号；以及 将所述输出信号的变化与所述未知多核酸和所述已知试剂之间的所述反应相关联，由此鉴定所述未知核酸。
2.根据权利要求1所述的方法，包括确定所述输出信号是否具有显著的变化并且只关联这种显著的变化。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述已知核苷酸为dATP、dGTP、dTTP或dCTP中的一种，并且所述已知核酸为引物。
4.根据任意前述权利要求所述的方法，其中，重复所述方法的步骤以对所述未知核酸进行测序，每一次重复均使用dATP、dGTP、dTTP或dCTP中的一种作为所述已知核苷酸。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述已知核酸是等位基因特异性引物。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述聚合反应为等位基因特异性扩增反应。
7.根据任意前述权利要求所述的方法，其中，所述副产物中的一种为焦磷酸盐，并且所述一种或多种酶包括焦磷酸酶。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，在所述聚合反应开始前将所述焦磷酸盐添加到所述反应室中，由此使得聚合反应和解构反应几乎同时发生。
9.根据任意前述权利要求所述的方法，其中，所述副产物中的一种为DNA，并且所述一种或多种酶包括解构DNA的酶。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述一种或多种酶包括一种或多种核酸外切酶，所述核酸外切酶优选自由T7核酸外切酶、RecJf、核酸外切酶1、核酸外切酶T以及BAL-31核酸外切酶、核酸外切酶III或λ核酸外切酶构成的组。
11.根据任意前述权利要求所述的方法，其中，在所述聚合反应开始后再将所述一种或多种酶添加到反应室中，由此使得解构反应发生在所述聚合反应后。
12.根据任意前述权利要求所述的方法，其中，在所述ISFET和另一个ISFET或MOSFET之间有差别地测量电输出信号。
13.根据权利要求2-12中任一项所述的方法，其中，确定所述输出信号是否具有显著的变化包括:确定电输出信号变化的大小。
14.根据权利要求2-13中任一项所述的方法，其中，确定所述输出信号是否具有显著的变化包括:将所述电输出信号的变化与阈值信号变化值进行比较。
15.根据权利要求2-14中任一项所述的方法，其中，确定所述输出信号是否具有显著的变化包括:分别对来自于所述聚合反应的输出信号的变化和来自于所述解构反应的输出信号的变化进行评价。
16.根据权利要求2-15中任一项所述的方法，其中，确定所述输出信号是否具有显著的变化包括:将所述输出信号变化与没有发生聚合反应的输出信号变化进行比较，没有发生聚合反应是因为所述未知核酸的一种或多种核苷酸与所述已知核苷酸和/或已知核酸不互 补。
全文摘要
本发明提供了一种鉴定未知核酸的方法，包括以下步骤在反应室中合并未知多核酸与已知核酸试剂；当一种或多种的所述未知核酸的碱基与所述已知试剂中含有的一种或多种已知核酸的碱基互补时，由聚合反应产生第一数量的质子；利用一种或多种酶使所述聚合反应的副产物发生水解反应，由此产生第二数量的质子；监测由暴露于所述反应室的ISFET得到的电输出信号；以及将所述输出信号的变化与所述未知多核酸和所述已知试剂之间的所述反应相关联，由此鉴定所述未知核酸。
文档编号C12Q1/68GK103201392SQ201180048485
公开日2013年7月10日 申请日期2011年10月10日 优先权日2010年10月8日
发明者欧昌沛, 汪展如, 丹尼尔·莫利, 萨姆·里德 申请人:Dna电子有限公司
技术领域：
本发明涉及使来自于化学反应的可检测离子信号增强的方法，特别是并非专门针对DNA测序和SNP鉴定的方法。
背景技术：
核酸的测序能够通过在未知(靶)多核酸与每次添加一个的游离核苷酸dATP、dCTP、DGTP、DTTP之间的聚合反应中合成完整或部分的新生核酸链来实现。然后常规上通过利用凝胶电泳以及直接或间接的光学定量监测这种聚合反应的主要产物(即新合成的多核苷酸)进行鉴定。后来，在核酸的测序和鉴定领域中的工作已经研究了离子敏感场效应晶体管(ISFET)通过检测由反应引起的pH变化而检测掺入核酸链的核苷酸的能力。通常，在反应过程中释放氢离子(质子)。ISFET的电信号输出强度取决于所释放的氢离子的量，而所释放的氢离子的量主要取决于待检测样品中核酸(例如RNA或DNA)的数量。在某些情况下，由掺入反应直接释放的质子的数量可能太少，以至于无法通过ISFET进行精确的检测，也无法进行信号处理。此外，可能具有高水平的背景信号，这可能是由反应的副产物导致的。因而，由所述副产物产生的背景信号被认为是一种阻碍。在下面的讨论中，所提到的质子、氢离子和H+是同义的，均与液体的pH值有关。1992 年，Toshinari Sakurai ("Real-Time Monitoring of DNA PolymeraseReactions by a Micro ISFET pH sensor", 1992，64，1996-1997，Analytical Chemistry)描述了 ISFET是如何能够对DNA聚合酶反应的动力学进行监测的。他假设dNTP渗入到DNA链上消耗了氢离子，产生了生长的DNA链和焦磷酸盐。利用ISFET测量pH的变化。
9年之后，DNA Electronic公司开发了一种方法，此方法能够通过检测核苷酸掺入到生长的核酸链上时pH的变化而对DNA进行鉴定。观察结果显示释放了氢离子。VictOTova等(〃New Substrates of DNA polymerases", Federation of European BiochemicalSocieties Letters, 453，pp6_10, 1999)探讨了焦磷酸酶(PPase)如何在体内分解焦磷酸盐。然而，体液具有很强的缓冲作用，以至于在该反应中无法观察到任何PH的变化。一份相应的专利公开(W003/073088)中引用了 Victorova的见解，它显示了结合到聚合物酶上的焦磷酸酶会水解PPi，从而产生正磷酸盐和氢离子。然后，EP2304420 (1n Torrent)公开了一种具有chemFET阵列的设备，所述chemFET阵列包含附着于焦磷酸盐受体以检测PPi的钝化层。这些工作聚焦于检测由掺入反应直接释放的质子或者检测所述反应的副产物。然而，迄今为止，没有人考虑过添加酶以分解副产物，从而释放并检测除了核苷酸的掺入过程中产生的质子之外更多的质子。本发明的目的是提供一种方法，该方法通过对DNA反应的副产物进行解构来增加用于检测化学反应的靶分析物的浓度。化学反应优选为增加或移除特定的核酸/核苷酸/核苷(本文所使用的这些术语是可以互换的)。
发明内容
根据本发明的第一个方面，提供一种鉴定未知核酸的方法，包括:在反应室中合并未知多核酸与已知核酸试剂；当一种或多种未知核酸的碱基与已知试剂中含有的一种或多种已知核酸的碱基互补时，由聚合反应产生第一数量的质子；利用一种或多种酶使聚合反应的副产物发生水解反应，由此产生第二数量的质子;监测由暴露于反应室的ISFET得到的电输出信号；以及将输送信号的变化与未知多核苷酸和已知试剂之间的所述反应相关联，由此鉴定未知核酸。优选地是，该方法包括确定输出信号是否具有显著的变化并且只关联这种显著的变化。优先地是，所述已知核苷酸为dATP、dGTP、dTTP或dCTP中的一种，并且所述已知核酸为引物。根据任意前述权利要求的方法，其中，重复该方法的步骤以对未知核酸进行测序，每一次重复均使用dATP、dGTP、dTTP或dCTP中的一种作为已知核苷酸。还优选的是，所述已知核酸是等位基因特异性引物。优选地是，所述聚合反应为等位基因特异性扩增反应。优选所述副产物中的一种 为焦磷酸盐，并且一种或多种酶包括焦磷酸酶。可优选在聚合反应开始前将焦磷酸盐添加到反应室中，使得聚合反应和解构反应几乎同时发生。或者，优选所述副产物中的一种为DNA，并且所述一种或多种酶包括解构DNA的酶。优选所述一种或多种酶包括一种或多种的核酸外切酶，所述核酸外切酶优选自由T7核酸外切酶、Recjf、核酸外切酶1、核酸外切酶T以及BAL-31核酸外切酶、核酸外切酶III或λ核酸外切酶构成的组。可优选在聚合反应开始后将所述一种或多种酶添加到反应室中，由此使得解构反应在聚合反应之后发生。可优选在ISFET和另一个ISFET或MOSFET之间有差别地测量电输出信号。确定输出信号是否具有显著的变化可优选包括确定电输出信号变化的大小,或者更加优选地是将电输出信号的变化与阈值信号变化值进行比较。然而，确定输出信号是否具有显著的变化可优选包括:分别对来自于聚合反应的输出信号的变化和来自于解构反应的输出信号的变化进行评价。确定输出信号是否具有显著的变化还可优选包括将输出信号变化与没有发生聚合反应(因为未知核酸的一种或多种核苷酸与已知核苷酸和/或已知核酸没有互补)的输出信号变化进行比较。因此，本发明的优点是通过检测来自于聚合反应与解构反应这两者的质子而增强
信号强度。特别优选的是，所述酶水解焦磷酸盐而非三磷酸。因此，在它们的存在下，能检测到更大的PH变化(超过由dNTP水解导致的pH变化)。在DNA聚合过程中，用于SNP的等位基因特异性引物可以通过添加三磷酸核苷(dNTP或ddNTP)进行延伸。任选地将延伸/聚合的链扩增，然后可以添加核酸外切酶以逐个地移除新增加的核苷酸(或其扩增等价物)。在最简单的情况下，优选只添加一个NTP，然后只移除一个NTP。通过ISFET(s)对NTP增加和移除这两者所释放的H+离子进行检测。核酸外切酶对于非靶DNA (例如初始引物)的活性可优选通过帽化或修饰来进行改良。而在靶链扩增的情况下，核酸外切酶对于非靶DNA的活性基本上是无关紧要的，因为它被扩增目标物掩盖-这尤其适用于SNP的检测，因此对于该方面，扩增是特别优选的。在简单测序以确定一部分靶链的属性(identity)的情况下，扩增可能并不总是必须的，但是，若将核酸外切酶用于这种测序，则可优选对进行延伸而开始测序的引物进行帽化或修饰，以防止核酸外切酶对其的活性。因此本发明提供了一种鉴定核酸的方法。该方法涉及确定核酸的属性，例如核酸碱基的属性，即，其是C、G、T、A还是U。其可以优选为对DNA链或其它遗传物质进行测序的方法的一部分。其可以优选仅使用PPase来评价通过聚合作用将核苷添加到新生链上所产生的PPi的水平:可将其进行多次重复以对长的延伸链进行测序或是只将其进行一次。在后一种情况中，本发明因而也适用于在较大的测序工作中或在SNP的检测中确定单核苷酸的属性。当只考虑单核苷酸的添加时，引入核酸外切酶活性以移除添加的核苷酸从而进一步提高精确性也可能是有用的，但是本发明还能够适用于更长的序列。特别优选的是，当对模板或靶链进行测序时，在只有一种类型的三磷酸核苷(即胞嘧啶(C))的存在下完成测序。核苷的添加将引发用于ISFET检测的H+离子释放，并表明模板链上相应的位置为互补的核酸，此时为G。本发明同样适用于SNP检测。然而，在那种情况下，或者在需要对核酸在模板中更长延伸链的属性进行检测的情况下，也特别优选将模板或靶链暴露于引物。在SNP检测的情况下，所述引物为等位基因特异性引物。在适当的三磷酸核苷(即全部或至少为A、T (或U)、C和G)和聚合酶的存在下暴露于引物或与引物接触将导致引物在SNP (或者其它所需)位点对靶链的退火(“识别”)，接着由聚合反应进行链延伸。这种“配对”将导致氢离子释放，可通过ISEFT检测。最优选的是将核酸外切酶活性用于有关SNP的方面，特别是确认在引物末端的核苷的添加，其中，所述末端被极为精确地设计为SNP的位置，由此使得添加至引物:V端的第一个或者接下来的核苷为与SNP互补的核苷。此处，引物的帽化和修饰也可有助于防止作用于引物。附图简要说明下面将参考附图，举例对本发明的具体实施方案进行说明，其中
图1为根据本发明的采用了焦磷酸酶(PPase)的实施方案的示例性流程图；图2为在焦磷酸盐(PPi)和焦磷酸酶(PPase)存在和不存在这两种情况下的各种反应的pH经时变化图；图3为根据本发明的采用了核酸外切酶(例如λ核酸外切酶)的实施方案的各种反应的pH经时变化图；并且图4为根据本发明的采用了核酸外切酶(例如核酸外切酶III)的实施方案的各种反应的pH经时变化图。发明详述 本文公开的是一种监测与新合成核酸相关联的解构反应的检测方法。该解构反应的底物来自于核酸聚合反应(初级反应)，该核酸聚合反应本身在核苷添加至(即聚合而形成)延伸链上时释放氢离子。因此，所述解构反应被称为“次级反应”。可以单独对由次级反应释放出的额外氢离子进行检测，或者另外还检测由初级反应释放出的氢离子。次级反应的产生引发了对初级信号而言额外的次级信号，所述次级反应涉及初级反应的副产物的催化作用(主要是水解作用)。由与初级信号相同的检测器检测到的任何次级信号均被视为原位信号增强。由次级反应释放出的氢离子也可用另外的检测器进行检测。换言之，其目的是信号增强，因此能够相对于背景增加精确性。事实上，这是通过对背景进行抑制而实现的。由次级反应释放的氢离子优选使用与初级反应相同的(即单一的)ISFET传感器进行检测，但是也可以使用另外的传感器，例如，每个反应室使用两个传感器时，或者初级反应和次级反应发生在不同的时间或位置时。例如，解构反应优选为由本发明所述的酶进行催化的反应，该反应由底物产生一种或多种分解产物。例如，优选的酶为焦磷酸酶或核酸外切酶，它们都是催化磷酸酯键的水解反应的水解酶，因而解构磷酸酯键，最终生成更多的氢离子。因此特别优选的是，所述解构酶是那些能够水解磷酸酯键/磷酸二酯键的酶，在核酸(即核酸磷酸二酯键)的情况下尤其是如此。优选(初级)化学反应为新生多核苷酸链(具有两个或更多个核苷酸)的合成反应，其中RNA和DNA是特别优选的。优选的是，离子电荷的波动表明双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)和脱氧核苷三磷酸(dNTP)插入到新生多核苷酸链上。所述新生多核苷酸链可以是全新的多核苷酸链，或者是在优选测序的反应中添加的退火链(如引物)的新加片段。优选的是，新生多核苷酸链为模板链的互补链。在此参考DNA对本发明进行描述，但是本发明同样适用于其它核酸。
使用了本发明的实施方案的DNA测序按如下方式进行，其中参照DNA作为优选的多核苷酸。使用聚合酶链式反应或克隆或其它扩增技术将一定量的目标DNA扩增，并(例如)使用mRNA引物引发目标区域。DNA聚合酶通过将核苷酸碱基掺入成长的DNA链(例如本文所述的新生链)中(例如引物延伸)来催化DNA合成(聚合)。ISFET在本领域中是已知的。优选地是，本文所使用的ISFET具有诸如氮化硅等离子敏感层，在离子敏感层上可以设置聚合酶层。检测PH变化的大小以确切地检测核苷酸插入(新生多核苷酸链的延伸)。ISFET的电信号变化是DNA合成中核苷酸插入的指示。在将核苷三磷酸插入新生链后，释放焦磷酸盐(PPi或P2O74O离子。可以在细胞复制、基因表达或DNA修复等很多生物反应中发现核酸聚合作用。这些反应通常是在酶(例如聚合酶)的帮助下发生的。已经开发了在宿主细胞或生物体外进行核酸复制反应的技术。它们具有很多用途，如核酸的体外扩增、核酸的测序、基因分型和分子诊断。典型的核酸聚合作用可涉及如下所示的脱氧核苷三磷酸和DNA底物。xdNTP+DNAy — xPPi+DNA(x+y)+H+X个dNTP分子水解为X个焦磷酸盐分子，DNA由y个核苷酸延伸到x+y个核苷酸。反应还可涉及核苷酸和RNA，核酸底物可以是双链或单链。所释放的氢离子的实际数目取决于试剂的PK值等各种因素。该聚合反应发生时，核苷酸的5'端结合至与另一个(模板或靶)多核酸退火的多核酸的3'(延长)端，所述另一个(模板或靶)多核酸的序列或核酸属性是有待确定的。所述结合仅发生在所述核苷酸与所述另一个多核酸(即模板链)上与结合位点相对的碱基互补时(即，胸腺嘧啶/尿嘧啶与腺嘌呤互补，鸟嘌呤与胞嘧啶互补)。在该反应中，新合成的(即DNA)新生链和PPi被视为副产物，所关注的主要产物是氢离子。然而，我们出乎意料地发现这些经常被忽视的副产物可以被解构而产生另外的氢离子，从而增加传感反应的精确度。完整的化学体系是这样的:dNTP+DNA(y) — PPi+DNA(y+1)+H+ (pH 的初级变化)PPi+PPase — 2Pi+PPase+H+ (pH 的次级变化)DNA(y+1) +核酸外切酶一dMTP+核酸外切酶+H+ (根据另一个实施方案的pH的次级变化，所述另一个实施方案能够与PPi的解构共同或分别使用)初级反应依赖于DNA的成功聚合，其发生在所添加的核苷酸或引物与待测序(即，将一个或每个核苷酸鉴定(例如)为C、G、A、T*U)DNA的未知模板链互补时。次级反应依赖于由初级反应产生的副产物。因此，如果所添加的核苷酸或引物与未知模板DNA互补，则总反应产生质子(即，导致质子的净释放)。这些质子通过ISFET进行检测，并与特定核苷酸和引物的添加相关联，从而对样品中的初始DNA进行鉴定。由此，得知添加了哪种核苷酸或引物来延长新生链可以鉴定未知(模板)核酸的一部分。聚合反应可由未知核酸与等位基因特异性引物和混合的dNTP杂交来进行。或者，可以使用引物与未知核酸在目标位置退火，然后添加已知的dNTP。又或者，聚合反应可以是使用了 PCR或等温扩增的等位基因特异性扩增反应。等位基因特异性引物的使用可用于鉴定相关位置的核苷酸的属性(如SNP)，即，确定是否存在特定SNP，从而鉴定样品中的等位基因。在一定的pH范围 内以及二价金属离子(如镁或锰)的存在下，dNTP水解为PPi导致了质子浓度的变化。焦磷酸盐的水解产生两个磷酸盐。在一定的pH范围内以及二价金属离子(如镁或锰)的存在下，焦磷酸盐的水解导致了与dNTP水解类似的pH变化。如下所示，无机PPase可以用于催化无机PPi的水解，以形成正磷酸盐:P2O74- + H2O (PPase) 2HPO42'+ H焦磷酸盐在没有酶的辅助下通常会稳定得存在一天以上。优选的反应为聚合酶链式反应、测序或引物延伸。在这些反应中,焦磷酸盐在反应混合物中保持稳定。pH变化为反应和反应百分比的指示。通过添加水解焦磷酸盐而非三磷酸的一种酶或多种酶，能够赋予更大的PH变化(超过来自于dNTP水解的pH变化)。重要的是催化焦磷酸盐水解的酶不攻击三磷酸盐。在许多技术中，三磷酸盐的水解严格地与靶分子或特异性反应的存在相关联。焦磷酸酶为作用于二磷酸键的酸酐水解酶。诸如无机焦磷酸酶或热稳定无机焦磷酸酶等酶满足所述条件。焦磷酸酶广泛可得，并可在聚合反应中与聚合酶混合。在测序的情况下，焦磷酸酶与DNA聚合酶共同使用来提高pH变化。由于PPi以前被认为仅仅是DNA聚合反应的副产物，最好是移除或忽略以避免检测的复杂化，并且还能够导致背景噪音，因此，我们第一次确认了引入PPi对于检测精确性可具有有益效果(如果PPi得到利用的话)。在一个实施方案中，在PCR反应中将热稳定焦磷酸酶与热稳定DNA聚合酶混合。该焦磷酸酶催化作为聚合产物的PPi的水解。由此，焦磷酸盐(以前至多被认为是废产物)的水解提高了来自于单核苷酸添加的总PH变化(即氢离子的浓度)。因此，还提供了一种PCR扩增的方法，其包括在添加核苷酸后，使用PPase扩大或增强ISFET的信号检测。反应的效果如图2所示。对于4个反应进行了 350秒的pH变化测量。线4表示既没有焦磷酸盐也没有焦磷酸酶的反应:pH变化很少。线2表示没有焦磷酸盐但有一些焦磷酸酶的反应；对于添加的焦磷酸酶的缓冲液，PH最初在反应中发生变化，然而后来pH变化降低，直至平衡，偏移仅表示缓冲液的添加，而不是从反应中释放出质子。线I表示同时具有焦磷酸盐和焦磷酸酶的反应；PH变化增加，直至平衡。用于反应的试剂含有KCl、MgCl2、PPase。优选浓度如下所示。优选KCl的浓 度大于IOmM,更加优选大于40mM、50mM、80mM、IOOmM或120mM。优选所述浓度小于500mM，更加优选小于400mM、300mM或200mM。可以考虑这些上下限的任意组
合 ο优选MgCl2的浓度大于ImM,更加优选大于2mM、3mM或4mM。优选所述浓度小于IOOmM,更加优选小于8mM、7mM或5mM。可以考虑这些上下限的任意组合。优选50 μ L反应体积中PPase的量大于0.01U(其中，U被定义为制造商规定的条件下的酶活性单位)，更优选大于0.05U、0.1UUU或10U。建议的焦磷酸酶混合物含有由大肠杆菌(E.coli)或酵母菌制备的无机PPase和/或热稳定无机PPase,均可购自New EnglandBiolab (优选商品目录号为M0361S)。过量的市售PPase在氢离子的检测中可能导致不良的缓冲作用。理想地是，PPase不具有任何缓冲组分。反应通常可发生在体积为InL至100 μ L的微室中，然而体积可根据ISFET和可得样品体积的大小而变大。反应容积的温度可以是18_451:，优选大于251:、301:或351:，优选小于401:或38°C。可考虑这些上下限的任意组合。核苷酸掺入后，含有DNA样品和试剂的液体的pH优选在7和8.6之间；更优选大于PH7.5或大于pH7.9 ;优先小于pH8.4或pH8.1。可考虑这些上下限的任意组合。可视需要将NaOH添加到所述液体中，以实现上述pH设置。也可以考虑其它合适的缓冲液。也可与PPi解构的同时或分别进行副产物DNA的解构，以释放质子。该反应可表示为:DNA — dNMP+H+其中，dNMP为脱氧一磷酸盐，DNA为与未知DNA模板互补的新合成的(新生)多核酸。因此，本发明、的酶可以是DNA解构酶，优选为诸如核酸外切酶等水解酶，优选能够使用DNA和/或RNA作为其底物。除非另有说明，本文任何关于DNA的说明也适用于RNA和其它多核苷酸。由于DNA解构酶(即核酸外切酶)通常分解任何DNA，并且本发明的目的是鉴定DNA或DNA的一部分，因此在产生可鉴定的DNA后再添加DNA解构酶。通过此方式，由解构反应释放的质子表示来自于可鉴定DNA的解构(优选水解)的质子，而非反应混合物中的其它DNA片段。由等位基因特异性聚合反应产生的DNA是可鉴定的。若未知DNA不发生聚合，则仍具有一些解构活性，因此优选扩增可鉴定DNA的量。这可以使用等位基因特异性扩增技术来完成，由此使得可被鉴定的DNA的量为大于未扩增DNA的数量级。用于反应的试剂含有KCUMgCl2、牛血清白蛋白(BSA)和DNA解构酶。优选浓度如下所示。优选KCl的浓度大于10mM，更加优选大于10mM、20mM、30mM、40mM或50mM。优选所述浓度小于500mM，更加优选小于400mM、300mM或200mM。可以考虑这些上下限的任意组合。优选MgCl2的浓度大于ImM,更加优选大于2mM、3mM或4mM。优选所述浓度小于IOOmM,更加优选小于8mM、7mM或5mM。可以考虑这些上下限的任意组合。反应通常可发生在体积为InL至100 μ L的微室中，然而体积可根据ISFET和可得样品体积的大小而变大。反应容积的温度可以是18_50°C，优选大于25°C、30°C或35°C，优选小于40°C或38°C。可考虑这些上下限的任意组合。核苷酸掺入后，含有DNA样品和试剂的液体的pH优选在7和9之间；更优选大于PH7.5、大于pH8或大于pH8.3 ;优先小于pH9、pH8.6或pH8.5。可视需要将NaOH添加到所述液体中，以实现上述PH设置。可考虑这些上下限的任意组合。BSA 的浓度在 0.lmg/ml 和 10mg/ml 之间，优选大于 0.2mg/ml、0.5mg/ml 或 1.0mg/ml ;优选小于5mg/ml、2.0mg/ml或1.5mg/ml。可考虑这些上下限的任意组合。根据DNA解构酶的实 施方案，所使用的酶可以是任意解构DNA并释放质子的酶，优选通过磷酸酯/磷酸二酯键的水解而解构DNA的酶。这种酶的例子有核酸外切酶。核酸外切酶为通过水解反应从多核苷酸链的末端(外部)一次切掉一个核苷酸而作用的酶，其中所述水解反应切断3'或5'端的磷酸二酯键。T7核酸外切酶、Recjf、核酸外切酶1、核酸外切酶T以及BAL-31核酸外切酶。优选所述酶为核酸外切酶III或λ核酸外切酶，均可购自New England Biolab或Fermentas。优选例子为购自Fermentas的核酸外切酶III(ENO191)和购自Fermentas的λ核酸外切酶(ΕΝ0562)。优选每50 μ I中核酸外切酶的量为10U、50U或100U。优选每50 μ I中λ核酸外切酶的量为1U、2U、5U或10U。图4为存在和不存在核酸外切酶III的情况下反应室的pH图。在对于pH具有所示效果(由被消化的DNA表示-实线)的反应中，将lOng/μ L的dsDNA底物与核酸外切酶III混合，以产生质子。对照试验(由未被消化的DNA表示-虚线)含有除了酶之外的全部试剂。如图所示，PH最初由于将试剂添加到反应室而降低，然后变为相对于对照而言没有变化，或由于酶反应而进一步降低。图3显示λ核酸外切酶具有类似的效果。待检测样品中DNA的量可以改变或是未知的，但通常在50ng/y I至150ng/y I之间，优选大于IOng/ μ 1，大于20ng/ μ I或大于50ng/ μ I。可以使用核酸解构来增强含有纯化核酸或者含有来自于之前的酶反应的核酸的样品的PH信号。因此，此方法能容许背景混合物，如残留的引物/探针(至多ImM)、寡核苷酸(至多10mM)、DNA聚合酶及其它反应组分或副产物。尽管如上所述已经按照优选的实施方式描述了本发明，但是应当理解的是，这些实施方式仅是示意性的，权利要求并不限于这些实施方式。本领域技术人员能够根据公开内容做出修改和变型，这些修改和变型应考虑为落入随附的权利要求的范围。不论是以单独的形式还是以与本文中公开或示出的任何其他特征的任何适当组合的形式，可以将本说明书中公开或示出的每个特征并入本发明。例如，解构副产物的酶可同时含有焦磷酸酶和解构DNA的酶，以从初级聚合反应还有解构反应释放质子，由此使得信号变化更大。在本文中，术语核苷酸和核酸(无论是多核苷酸和多核酸还是单核苷酸和单核酸)可互换使用。任一个都是优选的。因此本发明提供了一种增强离子信号的方法，所述离子信号即为由氢离子的释放导致的PH变化，该释放表明了核酸链上核酸的添加和移除。通过由于与PPase或核酸外切酶活性相关联的氢离子释放增加而导致的信号增强，可以显著提高确定特定(未知)核酸的属性的精确性。来自于ISEFT的信号如何与特定(未知)核酸的属性相关联在本领域中是已知的。 ·
权利要求
1.一种鉴定未知核酸的方法，包括以下步骤: 在反应室中合并未知多核酸与已知核酸试剂； 当一种或多种的所述未知核酸的碱基与所述已知试剂中含有的一种或多种已知核酸的碱基互补时，由聚合反应产生第一数量的质子； 利用一种或多种酶使所述聚合反应的副产物发生水解反应，由此产生第二数量的质子; 监测由暴露于所述反应室的ISFET得到的电输出信号；以及 将所述输出信号的变化与所述未知多核酸和所述已知试剂之间的所述反应相关联，由此鉴定所述未知核酸。
2.根据权利要求1所述的方法，包括确定所述输出信号是否具有显著的变化并且只关联这种显著的变化。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述已知核苷酸为dATP、dGTP、dTTP或dCTP中的一种，并且所述已知核酸为引物。
4.根据任意前述权利要求所述的方法，其中，重复所述方法的步骤以对所述未知核酸进行测序，每一次重复均使用dATP、dGTP、dTTP或dCTP中的一种作为所述已知核苷酸。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述已知核酸是等位基因特异性引物。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述聚合反应为等位基因特异性扩增反应。
7.根据任意前述权利要求所述的方法，其中，所述副产物中的一种为焦磷酸盐，并且所述一种或多种酶包括焦磷酸酶。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，在所述聚合反应开始前将所述焦磷酸盐添加到所述反应室中，由此使得聚合反应和解构反应几乎同时发生。
9.根据任意前述权利要求所述的方法，其中，所述副产物中的一种为DNA，并且所述一种或多种酶包括解构DNA的酶。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述一种或多种酶包括一种或多种核酸外切酶，所述核酸外切酶优选自由T7核酸外切酶、RecJf、核酸外切酶1、核酸外切酶T以及BAL-31核酸外切酶、核酸外切酶III或λ核酸外切酶构成的组。
11.根据任意前述权利要求所述的方法，其中，在所述聚合反应开始后再将所述一种或多种酶添加到反应室中，由此使得解构反应发生在所述聚合反应后。
12.根据任意前述权利要求所述的方法，其中，在所述ISFET和另一个ISFET或MOSFET之间有差别地测量电输出信号。
13.根据权利要求2-12中任一项所述的方法，其中，确定所述输出信号是否具有显著的变化包括:确定电输出信号变化的大小。
14.根据权利要求2-13中任一项所述的方法，其中，确定所述输出信号是否具有显著的变化包括:将所述电输出信号的变化与阈值信号变化值进行比较。
15.根据权利要求2-14中任一项所述的方法，其中，确定所述输出信号是否具有显著的变化包括:分别对来自于所述聚合反应的输出信号的变化和来自于所述解构反应的输出信号的变化进行评价。
16.根据权利要求2-15中任一项所述的方法，其中，确定所述输出信号是否具有显著的变化包括:将所述输出信号变化与没有发生聚合反应的输出信号变化进行比较，没有发生聚合反应是因为所述未知核酸的一种或多种核苷酸与所述已知核苷酸和/或已知核酸不互 补。
全文摘要
本发明提供了一种鉴定未知核酸的方法，包括以下步骤在反应室中合并未知多核酸与已知核酸试剂；当一种或多种的所述未知核酸的碱基与所述已知试剂中含有的一种或多种已知核酸的碱基互补时，由聚合反应产生第一数量的质子；利用一种或多种酶使所述聚合反应的副产物发生水解反应，由此产生第二数量的质子；监测由暴露于所述反应室的ISFET得到的电输出信号；以及将所述输出信号的变化与所述未知多核酸和所述已知试剂之间的所述反应相关联，由此鉴定所述未知核酸。
文档编号C12Q1/68GK103201392SQ201180048485
公开日2013年7月10日 申请日期2011年10月10日 优先权日2010年10月8日
发明者欧昌沛, 汪展如, 丹尼尔·莫利, 萨姆·里德 申请人:Dna电子有限公司
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