制备胰腺激素产生细胞的方法
专利名称：制备胰腺激素产生细胞的方法
技术领域：
本发明涉及制备胰腺激素产生细胞的方法，和包含通过该制备方法获得的胰腺激素产生细胞的药物。
背景技术：
胰腺具有内分泌腺(内分泌细胞)和外分泌腺(外分泌细胞)，是通过两类细胞发挥重要作用的器官。外分泌细胞主要发挥分泌胰脂肪酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、胰淀粉酶等的消化酶的作用，例如。内分泌细胞发挥了分泌胰腺激素的作用，已知由胰腺a细胞分泌胰高血糖素，由胰腺P细胞分泌胰岛素，由胰腺S细胞分泌生长抑素，由PP细胞分泌胰腺多肽(在本说明书中有时缩写为PP)。而且，近年，报道了作为胃分泌激素的饥饿素(ghrelin)也是由胰腺分泌的。胰岛素在促进葡萄糖利用、蛋白质合成、中性脂肪的形成和储藏、降低血糖值，和维持正常的血糖浓度中发挥了重要的作用。胰腺的胰高血糖素作为通过肝糖原分解、糖异生作用等的血糖升高性激素，与胰岛素一起在糖代谢调控机制中发挥重要的作用。生长抑素通过与生长抑素受体结合产生作用，并抑制胰腺中的胰高血糖素、胰岛素等多种激素分泌。PP是由朗格汉斯(Lange·rhans)岛的细胞响应饮食而分泌的激素,被称为饱食因子,有降低食物摄入和体重增加的作用。饥饿素已知刺激食物摄入，通过降低脂肪氧化来增加体重。糖尿病是由胰岛素不足及其功能丧失而发病的疾病，是一旦发病则难以根治的疾病。糖尿病大部分可分为两类，I型糖尿病(胰岛素依赖型糖尿病)和II型糖尿病(非胰岛素依赖型糖尿病)。11型糖尿病是由于对胰岛素具有抵抗性而发病的慢性疾病，逐渐成为与由于过度进食或运动不足等导致的肥胖或应激状态等生活习惯相关的问题。II型糖尿病多在中老年发病，多数糖尿病患者患有该类型糖尿病。I型糖尿病是由于自身免疫病或病毒感染等破坏胰岛素产生细胞，使体内不分泌胰岛素而导致的慢性疾病。作为可以自动控制体内不断变化的血糖值并减轻患者负担的治疗方法，对I型糖尿病的患者实施胰腺移植或胰岛移植。虽然通过这些治疗方法可能达到正常的血糖值，但不能说移植技术已充分建立，并且目前可以移植的胰腺或胰岛是不足的。此外，为了避免对移植物的免疫排斥反应，患者需要终生服用免疫抑制剂，并且存在感染风险、由免疫抑制剂导致的副作用等问题。对于I型糖尿病可以尝试的一种治疗方法为，再生并移植患者的胰岛素产生细胞本身。根据该方法，患者自身可以在体内生产胰岛素。此外，由于细胞是来源于患者本身的细胞，可以解决排斥反应的问题等，在安全性方面也是有利的。作为获得胰岛素产生细胞的方法，已知:从ES细胞分化的方法、从患者的胰腺组织干细胞分化的方法、体外提取并分化源自患者的胰腺导管上皮的细胞的方法。例如，已知:使用活化素(activin)或视黄酸(RA)从人ES细胞诱导分化胰腺P细胞的方法(专利文献I，非专利文献I 4)或从人ES细胞诱导分化胰高血糖素产生细胞(a细胞)的方法(非专利文献8);从人iPS细胞诱导分化胰腺P细胞的方法(非专利文献5 7);通过向ES细胞中导入roxi—已知是与胰腺发生相关的重要转录因子并且负责胰岛素产生细胞的发生和功能维持，并培养所述细胞而有效诱导分化胰岛素产生细胞的方法(专利文献2)。然而，由于通过上述方法获得的胰岛素产生细胞与正常胰腺0细胞比较，胰岛素产生效率相当低，因此，仍然需要开发可适用于细胞治疗应用的有效获得胰岛素产生细胞的方法。此外，需要使可获得的细胞数量增加至用于治疗糖尿病等的实用化水平。现有技术文献专利文献专利文献I JP-A-2009-225661专利文献2:US-B-7534608非专利文献非专利文献1:E.Kroon 等人，“Pancreatic endoderm derived from humanembryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells inviv0.”，Nature Biotechnology (2008)，第 26 卷，第 4 期:443-452非专利文献2:K.A D，Amour 等人，“Production of pancreatichormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells.”，NatureBiotechnology (2006)，第 24 卷，第 11 期:1392-1401非专利文献3:W.Jiang，“In vitro derivation of functional膜岛素-producing cells from human embryonic stem ce 11 s.，，，Ce 11Research(2007)17:333-344非专利文献4:J.H.Shim等人，“Directed differentiation of human embryonicstem cells towards a pancreatic cell fate.”，Diabetologia(2007)50:1228-1238非专利文献5:R.Maehra 等人，“Generation of pluripotent stem cells frompatients with typeldiabetes.”，PNAS (2009)，第 106 卷，第 37 期:15768-15773非专利文献6:MC.Nostro 等人，“Stage-specific signaling through TGFbetafamily members and WNT regulates patterning and pancreatic specification ofhuman pluripotent stem cells.”，Development(2011)， 138:861-871非专利文献7 ；A.Rezania 等人，“Production of functionalglucagon-secreting alpha-cells from human embryonic stem cells.”，Diabetes(2011)，60:239-247非专利文献8:T.Thatava 等人，“ Indolactam V/GLP-1-mediateddifferentiation of human iPS cells into glucose-responsive insulin-secretingprogeny.”，Gene Ther (2011),18:283-293发明概述本发明要解决的问题本发明的目的是提供以更适合细胞疗法应用的胰腺激素产生细胞的制备方法，含有通过上述制备方法获得的胰腺激素产生细胞的药物，以及使用该细胞筛选糖尿病治疗药的方法。
解决问题的方法本发明人针对上述问题进行了深入的研究，发现通过依次改变分化诱导因子的种类或其组合，并在从内胚层细胞形成细胞团后以悬浮状态培养，可以从干细胞制备更接近胰腺生成(pancreatogenesis)形式(保持三维结构的形式)的胰腺激素产生细胞,从而完成本发明。S卩，本发明提供了以下方面。I制备胰腺激素产生细胞的方法，其中使干细胞经历下列步骤(I) (6):( I)在含有Rho激酶抑制剂的培养基中培养干细胞的步骤(2)在含有GSK3抑制剂的培养基中培养上述步骤(I)中获得的细胞的步骤(3)在含有GSK3抑制剂和活化素受体样激酶_4、7的激活剂的培养基中培养上述步骤(2)中获得的细胞的步骤(4)从上述(3)中获 得的细胞形成细胞团，然后将该细胞团置于培养基中以悬浮状态培养的步骤(5)在含有视黄酸受体激动剂、AMP活化蛋白激酶和/或活化素受体样激酶_2、3、6的抑制剂、活化素受体样激酶_4、5、7的抑制剂和细胞生长因子的培养基中培养上述步骤(4)中获得的细胞的步骤(6)在培养基中培养上述步骤(5)中获得的细胞的步骤；2上述I的制备方法，其中步骤(3)中的活化素受体样激酶_4、7的激活剂是活化素；3上述I或2的制备方法，其中步骤(I)中的Rho激酶抑制剂是(+)_(R)_反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环己烷甲酰胺二盐酸盐；4上述I至3的任一项的制备方法，其中步骤(2)和(3)中的GSK3抑制剂是(i) 6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]烟腈和/或(ii) (2，Z，3，E)-6-溴靛玉红-3’ -月亏；5上述I至4的任一项的制备方法，其中步骤(5)中的视黄酸受体激动剂是视黄酸；6上述I至5的任一项的制备方法，其中步骤(5)中的AMP活化蛋白激酶和/或活化素受体样激酶_2、3、6的抑制剂是dorsomorphin ；7上述I至6的任一项的制备方法，其中步骤(5)中的活化素受体样激酶_4、5、7的抑制剂是4-[4-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-(2-吡啶基)_1H_咪唑-2-基]-苯甲酰胺；8上述I至7的任一项的制备方法，其中步骤(5)中的细胞生长因子是碱性成纤维细胞生长因子；9上述I至8的任一项的制备方法，其中步骤(I) (6)中基本上不使用饲养细胞；10上述I至7的任一项的制备方法，其中步骤(I) (6)中的培养基基本上不含血清；11上述I至10的任一项的制备方法，其中干细胞是诱导性多能干细胞(iPS细胞)、胚胎干细胞(ES细胞)或人成体干细胞；
12上述I至11的任一项的制备方法，其中胰腺激素产生细胞是任何选自下列的细胞:选自胰岛素产生细胞、胰高血糖素产生细胞、生长抑素产生细胞、胰腺多肽(PP)产生细胞和饥饿素产生细胞；13制备胰腺激素产生细胞的方法，其特征在于使内胚层细胞经历下列步骤(4’)和(5，):(4’ )从内胚层细胞形成细胞团，并将该细胞团在培养基中以悬浮状态培养的步骤(5’)在含有视黄酸受体激动剂、AMP活化蛋白激酶和/或活化素受体样激酶_2、3、6的抑制剂、活化素受体样激酶_4、5、7的抑制剂和细胞生长因子的培养基中培养上述步骤(4)中获得的细胞的步骤。14包含通过上述I至13的任一项制备方法获得的胰腺激素产生细胞的药物；15筛选糖尿病治疗药物的方法，其特征在于使用通过选自下列步骤(I) (6)中的任意一种以上的步骤获得的细胞:( I)在含有Rho激酶抑制剂的培养基中培养干细胞的步骤(2)在含有GSK3抑制剂的培养基中培养上述步骤(I)中获得的细胞的步骤(3)在含有GSK3抑制剂和活化素受体样激酶_4、7的激活剂的培养基中培养上述步骤(2)中获得的细胞的步骤(4)使从上述(3)中获得的细胞形成细胞团后，将该细胞团置于培养基中以悬浮状态培养的步骤(5)在含有视黄酸受体激动剂、AMP活化蛋白激酶和/或活化素受体样激酶_2、3、6的抑制剂、活化素受体样激酶_4、5、7的抑制剂和细胞生长因子的培养基中培养上述步骤(4)中获得的细胞的步骤(6)在培养基中培养上述步骤(5)中获得的细胞的步骤。发明的效果根据本发明的制备方法，可以从干细胞制备更接近胰腺生成形式的胰腺激素产生细胞。此外，可以使用在上述步骤(I) (6)中的任意一种以上步骤中获得的细胞，来筛选可用于预防和/或治疗糖尿病等由胰腺激素产生和/或分泌异常导致的疾病的化合物。此夕卜，由于本发明的细胞可用于治疗上述疾病的细胞疗法，并维持了三维结构，因此，与常规制备方法获得的胰腺激素产生细胞相比，更适合应用于细胞疗法。
附图简介
图1显示了通过使用各种因子从人iPS细胞开始诱导分化，并在头4天每天通过定量RT-PCR测量原条标志物(Brachyury )和内胚层标志物(SOXl7)的表达的结果。各基因的表达量显示为与管家基因GAPDH的表达量的相对值。在培养第3天，Brachyury的表达量一过性增加，而S0X17的表达量在第4天显著增加。
图2显示了通过使用活化素A和CHIR99021诱导人iPS细胞分化4天，将细胞重新接种在用纤连蛋白包被的96孔板上，并培养细胞I天，使用抗人S0X17抗体进行免疫荧光染色的结果。S0X17阳性细胞的核用Alexa488显色为绿色(图中表示为S0X17)，而细胞核用Hoechst33342显色为蓝色(图中表示为Hoechst)。此外，将两种染色图像合并的图表示为Merge (合并)。观察到大部分细胞表达S0X17蛋白。图3显示了在含有CHIR99021的培养基中培养了 2天，然后使用活化素A和CHIR99021、以及活化素A和BIO进行培养的人iPS细胞的每天定量RT-PCR测量的S0X17表达的结果。基因的表达量显示为相对于管家基因GAPDH的表达量的相对值。不论使用CHIR99021或B10，从培养的第4天开始，S0X17表达随时间而增加，并表现出相似的表达模式。在仅添加DMSO的对照中，SOX17表达不增加。图4显示了通过使用活化素A和CHIR99021诱导人iPS细胞分化4天，将细胞接种在96孔球形板上，培养细胞I天后，在含有1%B27并添加了 dorsomorphin、视黄酸、SB431542和bFGF的Improved MEM Zinc Option培养基中培养细胞8天，然后将培养基更换为含有1%B27的Improved MEMZinc Option培养基，并进一步继续培养的细胞的胰岛素表达分析的结果(图中表示为胰岛素(insulin))。基因的表达量显示为相对于管家基因GAPDH的表达量的相对值。在含有1%B27的Improved MEM Zinc Option培养基中，自培养第13天交换后，至培养第23天，胰岛素表达随时间增加。图5显示了通过使用活化素A和CHIR99021诱导人iPS细胞分化4天，将细胞接种在96孔球形板上，培养细胞I天后，使用dorsomorphin、视黄酸，SB431542和bFGF的组合、或使用dorsomorphin、视黄酸和SB431542的组合培养细胞8天，之后在含有1%B27的Improved MEM Zinc Option培养基中培养第19天的细胞的胰岛素表达的分析结果(图中表示为胰岛素)。基因的表达量显示为相对于管家基因GAPDH的表达量的相对值。在培养的第19天,使用dorsomorphin、视黄酸，SB431542和bFGF的组合的胰岛素表达量高于dorsomorphin、视黄酸和 SB431542 的组合。图6显示了用与图4的方法相同的方式诱导分化获得的细胞培养第21天的细胞团(球形)制备冰冻切片，并使用抗胰岛素抗体和抗胰高血糖素抗体进行免疫荧光染色的结果。胰岛素阳性细胞用Alexa568显色为红色(图中表示为胰岛素)，而胰高血糖素阳性细胞用Alexa488显色为绿色(图中表示为胰高血糖素)，细胞核用Hoechst33342显色为蓝色(图中表示为Hoechst)。此外，将两种染色图`像合并的图表示为Merge。确认表达胰岛素的细胞大部分在细胞团(球形)内部，部分细胞表达胰高血糖素。图7显示了通过使用BD Matrigel或纤连蛋白作为底物，用活化素A和CHIR99021诱导人iPS细胞为内胚层后形成细胞团(球形)，之后再依次诱导分化为胰腺激素产生前体细胞和胰腺激素产生细胞时各种分化标志物的表达分析结果。各基因的表达量显示为相对于管家基因GAPDH的表达量的相对值。S0X17的表达随分化显著减少，PDXl和NGN3的表达逐渐增加直到培养的第17天。胰岛素的表达自培养第17天开始急剧增加。只要使用以BDMatrigel或纤连蛋白作为底物诱导的内胚层细胞，则这些各种分化标志物随时间的表达的变化几乎是相同的。图8显示了包含从内胚层形成细胞团(球形)的诱导分化步骤(步骤(4))的不使用饲养细胞或血清的胰腺激素产生细胞的制备方法的概况。发明详述下面解释本发明。本说明书中使用的术语意指本领域中一般使用的，除非特别说明。在本发明中，“胰腺激素产生细胞”意指具有产生胰腺激素的能力的细胞。胰腺激素产生细胞不需要持续产生胰腺激素，只要具有生产胰腺激素的能力即可。因此，对产生的胰腺激素的量没有特殊的限制。胰腺激素可以例举:胰岛素、胰高血糖素、生长抑素、胰腺多肽、饥饿素。胰腺激素产生细胞可以例举:胰岛素产生细胞(与胰腺0细胞同义)、胰高血糖素产生细胞(与胰腺a细胞同义)、生长抑素产生细胞(与胰腺S细胞同义)、胰腺多肽(PP)产生细胞、饥饿素产生细胞。其中，优选是胰岛素产生细胞。在本发明中，“干细胞”意指可以在体外培养并且可以分化成构成机体的多种细胞系的细胞。具体而言，可以例举:胚胎干细胞(ES细胞)、源自胚胎的原始生殖细胞的多能干细胞(EG 细胞:Proc Natl Acad Sci U S A.1998，95:13726-31 )、睾丸来源的多能干细胞(GS细胞:Nature.2008，456:344-9)、体细胞来源的诱导性多能干细胞(inducedpluripotent stem cells ;iPS细胞)和人成体干细胞(组织干细胞)。优选的是iPS细胞、ES细胞或人成体干细胞，更优选的是iPS细胞。ES细胞可以使用源自任何暖血动物优选哺乳动物的细胞。哺乳动物可以例举:小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、猫、狗、绵羊、猪、牛、马、山羊、猴子和人。优选使用源自人的细胞。ES细胞的具体例子可以例举:通过培养着床前的早期胚胎建立的哺乳动物等的ES细胞；通过培养由体细胞核移植制备的早期胚胎建立的ES细胞；和通过遗传工程的方法改变所述ES细胞的染色体上的基因获得的ES细胞。可以根据本领域总常规实施的方法或公知文献，制备各种ES细胞。小鼠的ES 细胞是由 Evans 等人(Evans 等人，1981, Nature292:154-6)、Martin 等人(Martin GR.等人，1981，Proc Natl Acad Sci78:7634_8)在 1981 年建系的，可购自例如大日本住友制药株式会社(大阪，日本)。人的ES 细胞是由 Thomson 等人(Thomson 等人，Science, 1998，282:1145-7)在1998 年建系的，可获得自例如 WiCell Research Institute (网址:http://www.wicell.0rg/, Madison, Wisconsin, USA)、美国国立卫生研究院、东京大学等,可购自例如CellartisAB (网址:http://www.cellartis.com/, Sweden)。iPS细胞可使用源自任何暖血动物优选哺乳动物的细胞。哺乳动物可以例举:小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、猫、狗、绵羊、猪、牛、马、山羊、猴子、人。优选使用源自人的细胞。iPS细胞可以例举:通过导入多种基因至皮肤细胞等的体细胞中获得的、获得了与ES细胞同样的多能性的细胞(例如，通过导入0ct3/4基因、Klf4基因、c -Myc基因和Sox2基因获得的iPS细胞(Nat Biotechnol2008 ;26:101-106))。除此之外，可提及进一步减少转基因的方法(Nature.2008Jul31 ；454(7204):646-50);利用低分子化合物的方法(Cell Stem Cell.2009Jan9 ；4(1):16-9 ；Cell Stem Cell.2009Nov6 ；5 (5):491-503);利用转录因子蛋白代替基因的方法(Cell Stem Cell.2009May8 ；4 (5):381-4)等。虽然对iPS细胞的制备方法已进行了深入的技术改良，但不论制备方法，所制备的iPS细胞的基本性质(即，具有多能性)是相同的，因此，所有此类方法可用于本发明的制备方法。成体干细胞可以使用源自人的。在本文中，成体干细胞指能够分化得到胰腺激素产生细胞的细胞，可以例举:例如，源自骨髓或脂肪的间叶干细胞或胰腺内存在的干细胞。使用本发明的方法，可以从制备方法不同的人iPS细胞系等各种干细胞系制备胰腺激素产生细胞。1、胰腺激素产牛细胞的制备方法
技术领域：
本发明的制备方法是从干细胞制备胰腺激素产生细胞的方法。本发明的制备方法还是将分化状态较低的细胞(干细胞)诱导分化为分化状态更高的细胞(胰腺激素产生细胞)的方法。本发明的制备方法包括下列步骤(I) (6)。( I)在含有Rho激酶抑制剂的培养基中培养干细胞的步骤(2)在含有GSK3抑制剂的培养基中培养上述步骤(I)中获得的细胞的步骤(3)在含有GSK3抑制剂和活化素受体样激酶_4、7的激活剂的培养基中培养上述步骤(2)中获得的细胞的步骤(4)使从上述(3)中获得的细胞形成细胞团后，将该细胞团置于培养基中以悬浮状态培养的步骤(5)在含有视黄酸受体激动剂、AMP活化蛋白激酶和/或活化素受体样激酶_2、3、6的抑制剂、活化素受体样激酶_4、5、7的抑制剂和细胞生长因子的培养基中培养上述步骤(4)中获得的细胞的步骤(6)在培养基中培养上述步骤(5)中获得的细胞的步骤。步骤(I):在含有Rho激酶抑制剂的培养基中培养干细胞的步骤该步骤相当于下述步骤(2)的开始诱导分化干细胞为胰腺激素产生细胞的步骤的前阶段，即，干细胞的预培养(接种)阶段。该步骤中的干细胞可 以通过与饲养细胞或饲养细胞提取物共培养来获得。在本文中，饲养细胞意指通过共培 养，提供可以增殖其他种类细胞的环境的细胞。该步骤中的干细胞可以是分散的细胞和不分散的细胞，分散的细胞是理想的。分散的细胞可以例举:单细胞，和由多个(典型的为约2-500、20-200或50-100个)细胞组成的细胞团(如下述步骤(4)中解释的，细胞团意指通过多个细胞彼此粘附而形成团块的状态)形成的细胞，该步骤中细胞团是理想的。可以通过本身已知的方法制备分散的细胞。此类方法的可以例举:用螯合剂(例如，EDTA)、酶(例如，胰蛋白酶、胶原酶)等处理、机械分散(例如，移液)等操作。分散的细胞可以是不贴壁的细胞(不贴壁的细胞意指处于不粘附至培养容器或底物上的状态中的细胞)或贴壁的细胞(贴壁的细胞意指处于粘附至培养容器或底物上的状态中的细胞)。在该步骤中，理想的是在去除饲养细胞或饲养细胞提取物后(例如，通过放在离心管中，静置2-10min，然后去除上清液来去除)，在下述含有Rho激酶抑制剂的培养基中培养细胞(即，自接种时不使用饲养细胞，开始诱导分化)。Rho激酶抑制剂意指抑制Rho激酶的活性的物质。Rho激酶是一种包含在GTP (鸟苷三磷酸酶)的降解酶的GTP酶类中的低分子量GTP结合蛋白(低分子量G蛋白)，在氨基末端具有丝氨酸/苏氨酸激酶结构域，在中心部分具有卷曲-卷曲区域，和在羧基末端具有Rho相互作用结构域(Amano等人，Exp.Cell.Res.,261,44-51(2000))。该步骤中使用的Rho激酶抑制剂可以例举:1-(5-异喹啉磺酰基)-2_甲基哌嗪(H-7)、1-(5_异喹啉磺酰基)-3-甲基哌嗪(异H-7)、N-2-(甲基氨基)乙基_5_异喹啉磺酰胺二盐酸盐(H-8)、N-(2-氨基乙基)-5-异喹啉磺酰胺二盐酸盐(H-9)、N-[2-p-溴肉桂基氨基)乙基]-5-异喹啉磺酰胺二盐酸盐(H-89)、N-(2-胍基乙基)-5-异喹啉磺酰胺盐酸盐(撤-1004)、1-(5-异喹啉磺酰基)高哌嗪二盐酸盐(Fasudil/HA-1077)、(S)-(+)-2-甲基-4-甘氨酰基-1-(4-甲基异喹啉-5-磺酰基)高哌啶二盐酸盐(H-1152)和(+)_(R)_反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环己烷甲酰胺二盐酸盐(Y-27632)。这些都是可商购的(例如，可购自SIGMA、和光纯药工业社)。其中特别优选的是Y-27632。在该步骤中，可以使用一种或两种以上Rho激酶抑制剂的组合。在该步骤中，干细胞在含有Rho激酶抑制剂的培养基中培养。培养基中的Rho激酶抑制剂的浓度没有特殊的限制，只要可以实现提高干细胞的存活率等所需的效果，一般是0.01-1000 u M，优选0.1-100 u M，特别优选1.0-50 u M。当使用Y-27632作为Rho激酶抑制剂时，优选使用约1.0-约30 u M，更优选约2.0-约20 ii M的浓度。当使用Fasudi 1/HA1077作为Rho激酶抑制剂时，可以使用上述Y-27632浓度约2倍的浓度。当组合使用多种Rho激酶抑制剂时，每种抑制剂使用的浓度基于上述浓度范围适当地增加或减少。在含有Rho激酶抑制剂的培养基中的培养时间没有特殊的限制，只要是可以达到提高干细胞的存活率等的所需的效果的长度的时间即可。例如，当干细胞是人iPS细胞时，如将人iPS细胞分散后在含有Rho激酶抑制剂的培养基中培养约12小时或更久(例如12 72小时)，可以充分获得所需效果。在含有Rho激酶抑制剂的培养基中的干细胞密度没有特殊的限制，只要是可以达到提高干细胞的存活率等的所需的效果的密度即可。优选是约1.0X IO1 1.0X IO7细胞/ml，更优选约1.0XlO2 1.0X IO7细胞/ml，更优选约1.0XlO3 1.0X IO7细胞/ml，最优选约3.0 X IO4 1.0 X IO6细胞/ml。
该步骤中使用的培养基没有特殊的限制，只要含有Rho激酶抑制剂，通常是在用于培养干细胞的培养基(在下文中出于方便还被称为基础培养基)中添加了 Rho激酶抑制剂。作为该步骤中使用的基础培养基，可以使用用于灵长类ES/iPS细胞的培养基(ReproCELL培养基)、BME培养基、BGJb培养基、CMRL1066培养基、Glasgow MEM培养基、Improved MEM Zinc Option 培养基、IMDM 培养基、Mediuml99 培养基、Eagle MEM 培养基、a MEM培养基、DMEM培养基、ham培养基、RPMI1640培养基、Fischer培养基，以及任意选自上述培养基的两种以上的培养基的混合培养基。培养基没有特殊的限制，只要可用于动物细胞培养即可。在该步骤中，特别理想的使用用于灵长类ES细胞的培养基(ReproCELL培养基)。这些培养基可购自IteproCELL Inc.、Invitrogen、SIGMA、COSMO BIO C0.,Ltd 等。该步骤使用的培养基优选是基本上不含血清和/或血清提取物的培养基，更优选是无血清的培养基。在本说明书中，基本上不含血清意指血清含量低于约I体积％，优选少于约0.1体积％，更优选少于约0.01体积％。无血清的培养基意指不含未调整的或未纯化的血清的培养基，混入纯化的血液来源成分或动物组织来源成分(例如，生长因子)的培养基被认为落入无血清的培养基的范围内。
该步骤中使用的培养基还包含血清替代物。血清替代物可以例举:白蛋白(例如，富含脂质的白蛋白)、转铁蛋白、脂肪酸、胶原前体、微量元素(例如，锌、硒)、B-27添加剂、N2添加剂、knockout血清替代物、2-巯基乙醇、3’ -硫代甘油及其等价物。knockout血清替代物可购自Invitrogen。其他血清替代物可购自Invitrogen、SIGMA、和光纯药工业社、大日本住友制药社等。血清替代物是B-27添加剂时，其在培养基中浓度是0.01 10wt%，优选0.1 2wt%0在该步骤中，优选基本上不使用饲养细胞和/或饲养细胞提取物。即，用于该步骤中的培养基优选是基本上不含饲养细胞和/或饲养细胞提取物的培养基，更优选完全不含饲养细胞和/或饲养细胞提取物的培养基。在本说明书中，基本上不含饲养细胞和/或饲养细胞提取物意指培养基中的饲养细胞和/或饲养细胞提取物的含量少于约5体积％，优选少于约I体积％，更优选少于约0.01体积％。当该步骤中基本上不使用饲 养细胞和/或饲养细胞提取物时，由本发明的制备方法制备的胰腺激素产生细胞较少混入致排斥反应的物质(例如，动物来源的细胞)。该步骤中的培养一般使用培养容器实施。此类培养容器没有特殊的限制，只要可以培养干细胞，实施贴壁培养时细胞粘附型培养容器是理想的，实施悬浮培养时细胞非粘附型培养容器是理想的。培养容器可以例举:瓶、组织培养瓶、培养皿、Petri培养皿、组织培养皿、多孔培养皿、微孔板(microplate)、微孔板(microwell plate)、多孔板(multiplate)、多孔板(multiwelIplate)、显微载玻片、腔室培养玻片、培养皿(schale)、管、盘、培养袋和旋转瓶。为了提高培养容器表面的与细胞的粘附性，细胞粘附型培养容器是用胞外基质(ECM)等任何细胞支持性底物包被的培养容器。用于贴壁培养的培养容器可以例举:培养皿、瓶、微孔板、细胞培养薄片等。为改善与细胞的粘附性，可以赋予这些培养容器亲水性，或者用胶原、明胶、多聚L-赖氨酸、多聚D-赖氨酸、层粘连蛋白、纤连蛋白等细胞支持性底物包被。细胞培养薄片指目的是将细胞培养成薄片状形态的支持物，可购自例如OptiCell(Nunc)。该步骤中的细胞支持性底物优选是I型胶原、BD Matrigel (Nippon BectonDickinson Company, Ltd.)、纤连蛋白(Invitrogen)等，更优选是 BD Matrigel 和纤连蛋白，更优选是纤连蛋白。用于悬浮培养的培养容器的可以例举:培养皿、瓶、微孔板、管、旋转瓶等。这些培养容器可以用疏水性材料生产，或者用水凝胶、脂质等防止细胞或蛋白质吸附的材料包被。为了有效形成细胞的凝集块，使用具有U字或V字形状的底面的培养容器是理想的。可以适当地确定其他培养条件。例如，对培养温度没有特殊的限制，只要是适合培养所使用的干细胞的温度即可，可以是约30 40° C，优选约37° C。C02浓度可以是约I 10%，优选约2 5%。氧分压可以是I 10%。步骤(2):在含有GSK3抑制剂的培养基中培养上述步骤(I)中获得的细胞的步骤该步骤是在上述步骤(I)之后实施的步骤，与下述步骤(3)—起对应于诱导干细胞分化为内胚层细胞的步骤。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶GSK3 (糖原合成酶激酶3)，参与涉及糖原产生、凋亡、干细胞维持等许多信号通路。GSK3包括GSK3a和GSK3 P亚型，由不同的基因编码，并在氨基酸水平具有高同源性。已知GSK3还涉及Wnt信号传递，抑制GSK3能激活Wnt信号。GSK3抑制剂可以例举GSK3a抑制剂和GSK3 P抑制剂。在该步骤中，GSK3 0抑制剂是理想的。GSK3抑制剂的具体例子包括CHIR98014(2-[[2-[(5-硝基-6-氨基吡啶_2_基)氨基]乙基]氨基]-4-(2，4- 二氯苯基)-5-(lH-咪唑-1-基)嘧啶)、CHIR99021、Kenpaullone, AR-A0144-18、TDZD-8 (4-苄基-2-甲基-1，2，4-噻二唑烷 _3，5- 二酮)、SB216763(3-(2, 4- 二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2，5- 二酮)、BIO、TffS-119 (3-[6-(3-氨基苯基)-7H_吡咯并[2，3-d]嘧啶_4_基氧基]苯酚)、SB415286 (2_ (3_氣_4_轻基苯基氛基)_3_ (2_硝基苯基)马来酸亚胺[2-[2，5-二氢_4-[ (3-氯-4-羟基苯基)氨基]_2，5- 二氧代-1H-吡咯-3-基]苯基]氧化亚铵(oxylatoiminium)等。可购自 Axon Medchem BV、和光纯药工业社、Enzo LifeSciences, Inc.、Merck Biosciences、Tocris bioscience、Stemgent、Sigma 等。此外，还可以使用针对GSK3mRNA的反义寡核苷酸、siRNA等作为GSK3抑制剂。所有这些都可商业获得，或者可以根据公开文献合成。使用Wnt_3A肽诱导干细胞分化为内胚层细胞的方法是已知的(非专利文献1、2和5)。在该步骤中，使用低分子化合物GSK3抑制剂可以提供优秀的操作性、再现性、选择性。GSK3 抑制剂优选是 CHIR99021 (6-[[2-[[4_(2，4- 二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]烟腈)或BIO ((2 ’ Z，3 ’ E) -6-溴靛玉红_3 ’ -肟)。在该步骤中，可以任意使用一种或两种以上的GSK3抑制剂的组合。根据所使用 的抑制剂的类型适当地确定培养基中的GSK3抑制剂的浓度，一般是
0.01 100 i! M,优选0.1 10 i! M。使用CHIR99021时，浓度一般是0.1 20 y M，优选I 5 PM,而使用BIO时，浓度一般是0.01 5 ii M，优选0.1 2 ii M。当组合使用多种GSK3抑制剂时，可以基于上述浓度范围适当地增加或减少每种抑制剂的量。该步骤对使用的培养基没有特殊的限制，只要含有GSK3抑制剂即可，一般是在用于培养干细胞的培养基(基础培养基)中添加GSK3抑制剂。该步骤使用的基础培养基可以例举:BME培养基、BGJb培养基、CMRL1066培养基、Glasgow MEM 培养基、Improved MEM Zinc Option 培养基、頂DM 培养基、Mediuml99 培养基、Eagle MHM培养基、a MHM培养基、DMHM培养基、无血清的DMEM/F12培养基、ham培养基、RPMI1640培养基、Fischer培养基，及其混合的培养基等。用于该步骤中的基础培养基没有特殊的限制，只要可用于培养动物细胞即可。这些基础培养基可购自Invitrogen、SIGMA、和光纯药工业社、大日本住友制药社等。用于该步骤中的基础培养基优选是无血清的DMEM/F12培养基、RPMI1640培养基和Improved MEM Zinc Option培养基，特别优选的是无血清的DMEM/F12培养基。用于该步骤中的培养基优选是基本上不含血清和/或血清提取物的培养基，更优选是无血清的培养基。在该步骤中，优选是基本上不使用饲养细胞和/或饲养细胞提取物，更优选是完全不使用饲养细胞和/或饲养细胞提取物。
当基本上不使用饲养细胞和饲养细胞提取物时，由本发明的制备方法制备的胰腺激素产生细胞较少混入致排斥反应的物质(例如，动物来源的细胞)。用于该步骤中的培养基还可以含有血清替代物。血清替代物可以例举:白蛋白、转铁蛋白、脂肪酸、胶原前体、微量元素(例如，锌、硒)、B-27添加剂、N2添加剂、knockout血清替代物、2-巯基乙醇、3’ -硫代甘油,及其等价物。用于该步骤中的血清替代物优选是B-27添加剂。血清替代物是B-27添加剂时，其在培养基中浓度是0.01 10wt%，优选0.1 2wt%0这些血清替代物可购自Invitrogen、SIGMA、和光纯药工业社、大日本住友制药社等。该步骤中对培养温度没有特殊的限制，只要是适合培养所使用的干细胞的培养温度即可，是约30 40° C，优选约37° C。在约37° C的培养温度，培养时间是6 144小时，优选12 72小时。该步骤中的培养一般在充有约1 10%，优选5%的CO2的温箱中进行。步骤(3):在含有GSK3抑制剂和活化素受体样激酶_4、7的激活剂的培养基中培养上述步骤(2)中获得的细胞的步骤该步骤是在上述步骤(2)之后实施的步骤，对应于完成干细胞诱导分化为内胚层细胞的步骤。用于该步骤中的活化素受体样激酶(ALK)_4、7的激活剂选自对ALK-4和/或ALK-7具有激活作用的物质。用于该步骤中的活化素受体样激酶(ALK)_4、7的激活剂可以例举:活化素、Nodal、Myostatin，所有这些激活剂都是可商业获得的。其中，优选用活化素作为用于该步骤中的活化素受体样激酶_4、7的激活剂。上述活化素是属于TGFP (转化生长因子￠)家族的24kD大小的肽性细胞增殖和分化因子，其中两个P亚基通过SS键构的二聚体(Ling，N.，等人，(1986)Nature321, 779-782 ；Vale, ff.,等人，(1986)Nature321, 776-779)。在本发明中，可以使用活化素A、B、C、D、AB中的任何活化素，还可人、小鼠等任何动物来源的活化素，这些是可商业获得的。其中，特别优选使用活化素A。优选采用与使用的干细胞的动物物种相同的动物物种来源的活化素。例如，使用源自人的干细胞作为起始材料时，则优选使用人活化素A。在该步骤中，根据活化素受体样激酶_4、7的激活剂的种类，适当地设定培养基中的活化素受体样激酶_4、7的激活剂的浓度，当使用活化素作为活化素受体样激酶_4、7的激活剂时，浓度一般是0.1 200ng/ml,优选5 150ng/ml,特别优选10 100ng/ml。在该步骤中，可以任意使用一种或两种以上的活化素受体样激酶_4、7的激活剂的组合，当组合使用多种激活剂时，基于上述浓度范围适当地增加或减少每种激活剂的量。而且，在该步骤中，特征在于活化素受体样激酶_4、7的激活剂与GSK3抑制剂一起包含在培养基中。当在活化素和GSK3抑制剂存在下培养干细胞时，可以更适合细胞分化为内胚层细胞。用于该步骤中的GSK3抑制剂可以例举:GSK3a抑制剂和GSK3 P抑制剂。用于该步骤中GSK3抑制剂优选是GSK33抑制剂。用于该步骤中的GSK3抑制剂的具体例子可以例举与上述步骤(2)中所示的与GSK3抑制剂同样的例子，在该步骤中，可优选使用GSK3抑制剂CHIR99021或B10。根据所使用的抑制剂的类型适当地设定培养基中的GSK3抑制剂的浓度，使用CHIR99021时，浓度一般是0.1 20 ii M，优选I 5 ii M，而使用BIO时，浓度一般是0.01 5 ii M，优选0.1 2 u M0在该步骤中，可以任意使用一种或两种以上的GSK3抑制剂的组合，当组合使用多种GSK3抑制剂时，可以基于上述浓度范围适当地增加或减少每种抑制剂的量。在该步骤中，活化素受体样激酶_4、7的激活剂和GSK3抑制剂可以同时添加到培养基中，另外，只要可以诱导干细胞分化为内胚层细胞，可以设定时间差分别添加到培养基中。将活化素受体样激酶_4、7的激活剂和GSK3抑制剂同时添加到培养基中是方便且优选的。通过向上述步骤(2)所述的基础培养基中添加活化素受体样激酶_4、7的激活剂和GSK3抑制剂，制备用于该步骤中的培养基。可以使用与上述 步骤(2 )中使用的培养基相同种类的基础培养基制备用于该步骤中的培养基，也可以使用不同种类的基础培养基制备，优选的是使用相同种类的基础培养基(例如，无血清的DMEM/F12培养基)制备的培养基。用于该步骤中的基础培养基优选是无血清的DMEM/F12培养基、RPMI1640培养基和Improved MEM Zinc Option培养基，特别优选无清的DMEM/F12培养基。在该步骤中，优选是基本上不使用饲养细胞和/或饲养细胞提取物，更优选是完全不使用饲养细胞和/或饲养细胞提取物。用于该步骤中的培养基优选是基本上不含血清和/或血清提取物的培养基，更优选是无血清的培养基。当基本上不使用饲养细胞和饲养细胞提取物时，由本发明的制备方法制备的胰腺激素产生细胞较少混入致排斥反应的物质(例如，动物来源的细胞)。用于该步骤中的培养基还可以含有血清替代物。血清替代物可以例举:白蛋白、转铁蛋白、脂肪酸、胶原前体、微量元素(例如，锌、硒)、B-27添加剂、N2添加剂、knockout血清替代物、2-巯基乙醇、3’ -硫代甘油，及其等价物等，优选B-27添加剂。用于培养基中的B-27添加剂的浓度是0.01 10wt%，优选0.1 2wt%。该步骤中的培养温度没有特殊的限制，只要适合培养所使用的细胞即可，是约30 40。C，优选约37。C。在约37° C的温度，培养时间是6 288小时，优选12 124小时。该步骤中的培养一般在充有约I 10%，优选5%的CO2的温箱中进行。在该步骤中，使用内胚叶标志物验证了诱导干细胞分化为内胚层细胞。具体而言，可以通过评估有无在内胚层细胞中特异性表达的蛋白质或基因(内胚叶标志物)的表达，来进行验证。可以通过利用抗原抗体反应的方法等，评估蛋白质表达，可以通过利用RT-PCR的方法等,评估基因的表达，标志物可以例举S0X17(性别决定域Y, sex determiningregion Y)、Goosecoid (goosecoid 同源框)、CXCR4 (趋化因子(C-X-C 基序)受:体 4)和 F0XA2(forkhead boxA2)。步骤(4):从上述(3)中获得的细胞中形成细胞团(球形)后，将该细胞团置于培养基中以悬浮状态培养的步骤在该步骤中，将上述步骤(3)中获得的已经分化为内胚层细胞状态的细胞(即，内胚层细胞)形成了细胞团后，将该细胞团在培养基中以悬浮状态培养的步骤(再接种的步骤)。在本说明书中，细胞团指多个细胞通过彼此粘附等形成单个团块的状态(例如，10个以上的细胞彼此粘附的状态)，是与分离的细胞和视作分离的细胞相对的概念。分离的细胞指处于不与其他细胞粘附的独立状态的一个细胞。视作分离的细胞指与I个或2个其他的细胞粘附，或通过微弱粘附力彼此容易分离的程度的聚集状态的几个细胞。在该步骤中，细胞团指上述步骤(3)中获得的多个(例如，10个以上)的细胞(内胚层细胞)，通过细胞间彼此粘附等形成一团的状态。可以通过聚集的细胞的数量(例如，3个以上的细胞聚集时为细胞团)，或者可以通过在光学显微镜等扩大观察细胞悬浮液的平面图像中的细胞形成的一个集合的区域的面积，区分细胞团、分离的细胞和视作分离的细胞。例如，当细胞的大小(半径)是约IOiim时，其切面积是约300 iim2。因此，例如，当形成一个细胞集合的区域面积少于300 y m2时，可认为是分离的细胞或视作分离的细胞，而当大于900 ii m2 (即，对应于3个细胞)时，可认为是细胞团。当10个以上的细胞彼此粘附形成细胞团时，可推定其切面积达到3000 ii m2以上。在本说明书中，以悬浮状态培养意指在培养基中不贴壁的条件下培养。在不贴壁的条件下的培养意指在不与培养容器或基材粘附的状态下培养(例如，使用非粘附性的多孔平板)。可以通过本身已知的方法实施不贴壁的条件下的培养。此类方法例如,包括在培养容器的表面用聚羟乙基甲基丙烯酸酯等亲水性物质蛋白聚糖包被抑制细胞与基材粘附的方法(Cell Struct Funct，13，179 (1988))、通过冷却，在培养容器的表面涂布溶解在培养基中的合成的高分子化合物，粘附细胞后，通过冷却培养容器以溶解合成的高分子化合物，形成细胞薄片的方法(Bio Technology, 8，854(1990)),必要时可以改良这些方法。例如，为了防止在更换培养基时损失细胞，可以使培养容器进行离心操作，强制细胞团贴附至培养容器的表面后，更换培养基，或者将包含细胞的培养基转移到离心管中，通过离心操作沉淀细胞后更换上清液中的培养基。在该步骤中，在形成细胞团之前，可以向上述步骤(3)中获得的细胞(内胚层细胞)中添加蛋白质消化酶，分离细胞为单个状态。蛋白质消化酶可使用胰蛋白酶、胶原酶、木瓜蛋白酶、分散酶、Accutase(Invitrogen,商标名)等。这些蛋白质消化酶通常通过添加EDTA来螯合消化酶的抑制剂Ca2+和Mg2+，以胰蛋白酶-EDTA溶液(例如，0.25%胰蛋白酶-1mM EDTA)的形式使用。在该步骤中，例如，可以从上述步骤(3)中获得的细胞如下制备细胞团。S卩，将上述步骤(3)中获得的细胞在培养容器的合适培养基中进行悬浮培养。例如，当使用96孔圆底培养皿作为低粘附性培养容器时，每个孔接种20，000-400，000个细胞，并将形成聚集物转移至低粘附性6cm培养皿等中，在合适的培养基中37° C培养约6小时 约10天，优选约6小时 约2天，更优选I天。低粘附性培养容器例如对通常该技术领域中使用的培养容 器进行低吸附性处理的培养容器。培养容器可以例举培养皿、培养瓶、旋转培养器具(旋转瓶等)等，具体是球形板。处理成低粘附性，可以使用通过使水凝胶形成共价键(包被)而抑制蛋白质和细胞粘附的处理。
具体而言，在该步骤中，将上述步骤(3)中获得的细胞例如以密度为每孔2X IO4个细胞接种在96孔球形板中，并在37° C和5%C02的条件下，在添加了 1%B_27添加剂的Improved MEM Zinc Option 培养基中培养 I 天。在该步骤中，将上述获得的细胞团以悬浮状态培养在培养基中。以悬浮状态培养意指如上所述，非贴壁性的条件下培养，即，以不与培养容器或基材粘附的状态培养(例如，使用非粘附性多孔板)。用于该步骤中的培养基(S卩，再接种的培养基)可以例举上述步骤(2)中例示的基础培养基。可以使用与上述步骤(2) (3)中的同种基础培养基，或者使用不同种基础培养基制备用于该步骤中的培养基。就更有效的进行胰腺激素产生细胞的诱导分化而言，优选使用Improved MEM Zinc Option培养基(Invitrogen)作为该步骤的基础培养基。还可以根据已知文献制备该培养基(Richter A.等人，National Cancer (1972)49，1705)。用于该步骤中的培养基还可以含有血清替代物。血清替代物可以例举白蛋白、转铁蛋白、脂肪酸、胶原前体、微量元素(例如，锌、硒)、B-27添加剂、N2添加剂、knockout血清替代物、2-巯基乙醇、3’-硫代甘油，及其等价物。用于该步骤中的血清替代物优选是B-27添加剂。在该步骤中，特别优选的使用添加了 B-27添加剂的Improved MEMZINC Option培养基(Invitrogen)。在培养基中，B-27添加剂的浓度是0.01 10wt%，优选0.1 2wt%。在该步骤中，优选是基本上不使用饲养细胞和/或饲养细胞提取物，更优选是完全不使用饲养细胞和/或饲养细胞提取物。当基本上不使用饲养细胞和饲养细胞提取物时，较少混入致排斥反应物质(例如，动物来源的细胞)。 用于该步骤中的培养基优选是基本上不含血清和/或血清提取物的培养基，更优选是无血清的培养基。培养温度没有特殊的限制，只要适合培养所使用的细胞的培养温度即可，是约30 40。C，优选约37。C。培养时间是6 360小时，优选约I天 约12天，更优选约8天。当形成悬浮状态的细胞团时，在细胞团形成后，也可以在不进行悬浮培养的条件下，使细胞团进行步骤(5)。在此情况下，可以在实施步骤(5)之前，以悬浮状态培养所形成的细胞团0 48小时，优选0 24小时。该步骤中的培养一般在通有约1_10%，优选5%的CO2的温箱中进行。具体而言，在该步骤中，将上述步骤(3)中获得的细胞例如以密度为每孔2X IO4个细胞接种在96孔球形板中，并在37° C和5%C02的条件下，在添加了 1%B_27添加剂的Improved MEM Zinc Option 培养基中培养 I 天。在该步骤(4)中，还可以使用除上述步骤(I) (3)获得的内胚层细胞之外的内胚层细胞作为起始材料，制备胰腺激素产生细胞。因此，通过该步骤(4)，本发明还提供了使用内胚层细胞作为起始材料的胰腺激素产生细胞的制备方法，即，特征在于从内胚层细胞形成细胞团，并将该细胞团在培养基中以悬浮状态培养的胰腺激素产生细胞的制备方法(在本说明书中，有时缩写为本发明的制备方法2)。还可以以与使用上述步骤(3)中获得的细胞作为起始材料，制备胰腺激素产生细胞的方法的步骤(4)相同的方式，使用除上述步骤(I) (3)获得的内胚层细胞之外的内胚层细胞作为起始材料，制备胰腺激素产生细胞的制备方法。具体而言，本发明的制备方法2的特征是使内胚层细胞进行下列步骤(4’)和(5，)。(4’)从内胚层细胞形成细胞团，并将该在培养基中以悬浮状态培养的步骤(5’)在含有视黄酸受体激动剂、AMP活化蛋白激酶和/或活化素受体样激酶_2、
3、6的抑制剂、活化素受体样激酶_4、5、7的抑制剂和细胞生长因子的培养基中培养上述步骤(4)中获得的细胞的步骤。可以与上述步骤(4)相同的方式实施步骤(4’)，可以与上述步骤(5)相同的方式实施步骤(5’)。可以通过该步骤，更优选的通过在上述步骤(1)-(3)后进行的步骤(4)制备生更接近胰腺产生的形式的胰腺激素产生细胞。由于该细胞具有成三维细胞团的结构，可认为与单层培养的细胞相比，接近生物体内的状态，功能更强。此外，由于该细胞的三维结构，可认为与常规制备方法获得的胰腺激素产生细胞相比，是更适合应用于细胞疗法的细胞。步骤(5):在含有视黄酸受体激动剂、AMP活化蛋白激酶和/或活化素受体样激酶_2、3、6的抑制剂、活化素受体样激酶_4、5、7的抑制剂和细胞生长因子的培养基中培养上述步骤(4)中获得的细胞的步骤该步骤对应于诱导上述步骤(4)中获得的细胞即以悬浮状态培养的内胚层细胞分化为胰腺激素产生细胞的前体细胞的步骤。
用于该步骤中的视黄酸受体(RAR)激动剂可以是天然存在的类视黄醇，或合成的类视黄醇、不含类视黄醇骨架的视黄酸受体激动剂，或具有同等活性的天然存在的物质。天然存在的类视黄醇可以例举视黄酸(已知全反式视黄酸(全反RA)的立体异构体和9-顺式-视黄酸(9-顺式-RA))。合成的类视黄醇是本领域已知的(美国专利号5，234，926、美国专利号4，326，055等)。不含类视黄醇骨架的视黄酸受体激动剂可以例举Am80、TTNPB和AC55649等。天然存在的物质可以例举和厚朴酌■、木兰醇等(Annual Report of ResearchInstitute for Biological Function9:55-61，2009)。用于该步骤中的 RAR激动剂优选是视黄酸。根据所使用的RAR激动剂的种类，适当地设定培养基中的RAR激动剂的浓度，所使用的视黄酸浓度一般是0.1 100 ii M，优选0.5 10 ii M。用于该步骤中的AMP活化蛋白激酶和/或活化素受体样激酶_2、3、6的抑制剂选自对AMP活化蛋白激酶(AMPK)具有抑制剂活性的化合物、对活化素受体样激酶(ALK)-2、3、6具有抑制剂活性的化合物、以及同时对AMP活化蛋白激酶具有抑制剂活性和对活化素受体样激酶_2、3、6具有抑制剂活性的化合物。具有AMPK抑制剂活性的化合物可以例举dorsomorphin (6-[4-(2-哌唳-1-基乙氧基)苯基]-3-吡啶-4-基吡唑并[1，5-a]嘧啶)、araA (腺嘌呤_9_ ^ -d_阿拉伯呋喃糖苷)、C75等。活化素受体样激酶(ALK)分为一些类型，已知ALK-2、3、6是I型BMP受体激酶，下述ALK-4、5、7已知为TGF-P超家族I型受体激酶。作为具有ALK_2、3、6抑制剂活性的化合物，可提及dorsomorphin、LDN-193189 (6-(4-喊嚷苯基)-3-(喧琳-4-基)卩比唑并[I, 5-a]嘧啶)等。Dorsomorphin同时具有AMPK抑制剂活性和ALK_2、3、6抑制剂活性两种活性。作为AMP活化蛋白激酶和/或活化素受体样激酶_2、3、6的抑制剂,dorsomorphin是优选的。这些化合物可购自SIGMA、Tocris bioscience>Stemgent>Merck Biosciences等。此外，还可以使用针对AMP活化蛋白激酶以及ALK-2、3、6等的mRNA的反义寡核苷酸或siRNA等作为AMP活化蛋白激酶和/或ALK-2、3、6的抑制剂。此外，在该步骤中，当确认了属于BMP家族的分化因子增加或培养中的细胞分泌这些分化因子到培养基中时，也可以使用中和这些分化因子的活性的抗体或已知结合BMP抑制其作用的Noggin、Chordin、Cerberus、Gremlin等作为AMP活化蛋白激酶和/或ALK_2、3、6的抑制剂。此外，在该步骤中，当确认了培养中的细胞向培养基中增加或分泌上述步骤(3)作为活化素受体样激酶_4、7的激活剂的活化素时，还可以使用已知中和活化素活性的抗体，或已知结合活化素抑制其作用的卵泡抑素作为AMP活化蛋白激酶和/或ALK-2、3、6的抑制剂。根据所使用的抑制剂种类，适当地设定培养基中的AMP活化蛋白激酶和/或活化素受体样激酶-2、3、6的抑制剂的浓度,所使用的dorsomorphin的浓度一般是0.1 2011] ，优选0.2 5iiM。用于该步骤中的活化素受体样激酶(ALK)_4、5、7的抑制剂可例举SB-431542、SB-505124(2-(5-苯并[1，3] 二氧杂环戊烷_5_基-2-叔丁基-3H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶盐酸盐)、SB-525334(6-[2-叔丁基-5-(6-甲基-吡啶-2-基)-1H-咪唑-4-基]-喹喔啉)、A-83-01 (3- (6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4- (4-喹啉基)-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺)、GW6604、LY-580276(2-(6-甲基 _2_ 吡啶基)-3-(4-氟苯基)_5，6- 二氢-4H-吡咯[I, 2-b]吡唑)和SD-208(2-(5-氯-2-氟苯基)-N-(吡啶-4-基)吡啶并[2, 3-d]嘧唳~4~胺)等。`这些可购自SIGMA、Tocris bioscience、和光纯药工业社等。此外,还可以使用ALK-4、5、7的mRNA的反义寡核苷酸和siRNA作为ALK_4、5、7抑制剂。用于该步骤中的ALK-4、5、7的抑制剂，优选是SB-431542(4-[4-(l，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]-苯甲酰胺，或其水合物。根据所使用的抑制剂种类，适当地设定培养基中的活化素受体样激酶_4、5、7的抑制剂的浓度，使用的SB-431542的浓度一般是0.1 50 ii M，优选I 20 y M。用于该步骤中的细胞生长因子可以例举血管内皮细胞生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、干细胞生长因子(SCF)、上皮细胞生长因子(EGF)、各种成纤维细胞生长因子(a/bFGF)等。其中特别优选的是碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。根据所使用的因子种类，适当地设定培养基中的细胞生长因子的浓度，bFGF的浓度一般是 I 200ng/ml,优选 20 100ng/ml。该步骤是在含有上述视黄酸受体激动剂、AMP活化蛋白激酶和/或活化素受体样激酶_2、3、6的抑制剂、活化素受体样激酶_4、5、7的抑制剂和细胞生长因子这所有4种组分的培养基中实施的。在该步骤中，可以将视黄酸受体激动剂、AMP活化蛋白激酶和/或活化素受体样激酶_2、3、6的抑制剂、活化素受体样激酶_4、5、7的抑制剂和细胞生长因子同时添加到培养基中，或者设定时间差分别添加到培养基中，只要可以诱导前体细胞分化为胰腺激素产生细胞。视黄酸受体激动剂、AMP活化蛋白激酶和/或活化素受体样激酶_2、3、6的抑制剂、活化素受体样激酶_4、5、7的抑制剂和细胞生长因子同时添加到培养基中是方便且优选的。用于该步骤中的培养基是通过向上述步骤(2)中所述的基础培养基添加视黄酸受体激动剂、AMP活化蛋白激酶和/或活化素受体样激酶_2、3、6的抑制剂、活化素受体样激酶_4、5、7的抑制剂和细胞生长因子制备的。可以使用与上述步骤(4)同种的基础培养基，或使用不同种的基础培养基，制备用于该步骤中的培养基。就更有效的进行胰腺激素产生前体细胞的诱导分化而言，该步骤优选使用Improved MEM Zinc Option培养基(Invitrogen)作为基础培养基。在该步骤中，优选是基本上不使用饲养细胞和/或饲养细胞提取物，更优选是完全不使用饲养细胞和/或饲养细胞提取物。在该步骤中，当基本上不使用饲养细胞和饲养细胞提取物时，较少混入致排斥反应物质(例如，动物来源的细胞)。用于该步骤中的培养基优选是基本上不含血清和/或血清提取物的培养基，更优选是无血清的培养基。用于该步骤中的培养基还可以含有血清替代物。血清替代物可以例举白蛋白、转铁蛋白、脂肪酸、胶原前体、微量元素(例如，锌、硒)、B-27添加剂、N2添加剂、knockout血清替代物、2-巯基乙醇、3’ -硫代甘油,及其等价物。用于该步骤中的血清替代物优选是B-27添加剂。
当使用B27时，培养基中的血清替代物的浓度是0.01 10wt%，优选0.1 2wt%。该步骤是通过在适合培养所使用的内胚层细胞的培养温度，一般是30 40° C，优选37° C，培养72 288小时，优选120 216小时，在充有I 10%，优选5%的二氧化碳的CO2温箱中培养来实施的。在该步骤中，可以通过评估胰腺激素产生前体细胞特异性表达的蛋白质或基因(胰腺激素产生前体细胞的标志物)的表达的有无，来验证内胚层细胞向胰腺激素产生前体细胞的诱导分化。可以通过利用抗原抗体反应的方法等评估蛋白质的表达，可以通过利用RT-PCR的方法等评估基因的表达。该标志物可以例举NGN3、HNF6 (肝细胞核因子6、别名:一切同源框i)、roxi (胰腺和十二指肠同源框I)等。步骤(6):在培养基中培养上述步骤(5)中获得的细胞的步骤该步骤对应于诱导胰腺激素产生前体细胞分化为胰腺激素产生细胞的步骤。用于该步骤中的基础培养基可以是上述步骤(2)中例示的培养基。可以使用上述步骤(5)中同种的基础培养基，或者使用不同种的基础培养基，制备用于该步骤中的培养基。就更有效的进行胰腺激素产生细胞的诱导分化而言，该步骤优选使用Improved MEMZinc Option培养基(Invitrogen)作为用于该步骤中的基础培养基。在该步骤中，优选是基本上不使用饲养细胞和/或饲养细胞提取物，更优选是完全不使用饲养细胞和/或饲养细胞提取物。当基本上不使用饲养细胞和饲养细胞提取物时，较少混入致排斥反应物质(例如，动物来源的细胞)。用于该步骤中的培养基优选是基本上不含血清和/或血清提取物的培养基，更优选是无血清的培养基。用于该步骤中的培养基还可以含有血清替代物。血清替代物可以例举白蛋白(例如，富含脂质的白蛋白)、转铁蛋白、脂肪酸、胶原前体、微量元素(例如，锌、硒)、B-27添加齐[|、N2添加剂、knockout血清替代物、2-巯基乙醇、3’-硫代甘油，或其等价物等。其中,B-27添加剂是优选的。特别的是，优选使用添加了 B-27添加剂的Improved MEM Zinc Option培养基(Invitrogen)。培养基中的B-27添加剂的浓度是0.01 10wt%，优选0.1 2wt%。此外，可以向Improved MEM Zinc Option培养基中添加提高细胞存活率的添加剂。此类添加剂可以例举血清替代物，例如knockout血清替代物、N2添加剂等。培养基中的上述添加剂的浓度是0.01 10wt%，优选0.1 2wt%。优选的，用于该步骤中的培养基不含视黄酸受体激动剂、AMP活化蛋白激酶和/或活化素受体样激酶_2、3、6的抑制剂、活化素受体样激酶_4、5、7的抑制剂和细胞生长因子。因此，优选在步骤(5)和步骤(6)之间更换培养基。该步骤是通过在适合培养所使用的胰腺激素产生前体细胞的培养温度，一般是30 40° C，优选约37° C，培养24 240小时，优选72 192小时，在充有I 10%，优选5%的二氧化碳的CO2温箱中培养来实施的。在该步骤中，可以通过评估胰腺激素产生细胞特异性表达的蛋白质或基因(胰腺激素产生细胞标志物)的表达的有无，或者通过测量分泌到培养基中的胰腺激素的量，来验证胰腺激素产生前体细胞向胰腺激素产生细胞的诱导分化。标志物可以例举胰岛素、胰高血糖素、胰腺多肽、生长抑素、PCSKl (前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexinl型)、SURl (磺酰脲类受体1、别名·=ATP结合盒、C亚家族(CFTR/MRP)，成员8)、NKX6.1 (NK6同源框I)、PAX6 (成对框6)、NEUR0D (神经源性分化因子I)、ARX (无芒相关同源框)等。如上所述，本发明提供了从干细胞制备胰腺激素产生细胞的方法。通过类似的方法，即，诱导诱导分化状态较低的细胞分化为分化状态更高的细胞的方法，可以诱导干细胞分化为各种分化状态的细胞(内胚层细胞、胰腺导管细胞、胰腺内分泌细胞、胰腺外分泌细胞、其共同的细胞前体等)。可以通过验证每种细胞特异性表达的蛋白质或基因的表达的有无，了解诱导分化的水平。使用本发明的制备方法，可以有效诱导干细胞分化为胰腺激素产生细胞，从而可以大量供给具有高的胰腺激素分泌能力的胰腺激素产生细胞。可以利用所述胰腺激素产生细胞作为研发药物(特别是用于细胞疗法的药物)或糖尿病治疗药物的工具。2、包括本发明的细胞的药物本发明提供了包含通过上述本发明的制备方法或本发明的制备方法2制备的胰腺激素产生细胞(本发明的细胞)的药物。此外，本发明提供了包含通过上述本发明的制备方法(优选步骤(I)至(5 ))或本发明的制备方法2制备的胰腺激素产生前体细胞的药物(在本说明书中，有时缩写为本发明的药物)。在本发明的药物中，可以直接使用胰腺激素产生细胞或胰腺激素产生前体细胞，或作为如通过滤纸过滤等浓缩的细胞沉淀等的细胞团使用。此外，在该药物中也可以使用添加了 DMSO(二甲基亚砜)等的保护剂的冻干保存物。为了更安全的利用药物，热处理、放射处理等，可以在维持作为胰腺激素产生细胞的功能或作为胰腺激素产生前体细胞的功能，同时使病原体的蛋白质变性的程度条件下进行的处理。此外，为了防止胰腺激素产生细胞或胰腺激素产生前体细胞超过必需量的增殖，可以将细胞进行与上述处理组合的处理，例如用丝裂霉素C预处理等的生长抑制，向细胞中导入哺乳动物中天然缺失的代谢酶基因，然后必要时施用非活性药物，使药物仅在导入了哺乳动物中天然缺失的代谢酶基因的细胞中变为毒素，导致细胞死亡(自杀基因疗法)等。本发明的药物是安全低毒的，可以给药(移植)给哺乳动物(例如，人、小鼠、大鼠、豚鼠、猪、猴子等，优选人)。本发明的药物的给药量(移植量)是例如IXlO5 IXlOici细胞/个体，优选5 X IO7 I X 101°细胞/个体，更优选I X IO9 I X 101°细胞/个体。对于本发明的药物，优选使用患者本身的细胞或表现出患者可耐受的细胞或组织相容性类型的供体细胞制备的胰腺激素产生细胞。当由于年龄、体格等不能获得充分的细胞时，也可以通过将细胞包埋到聚乙二醇或硅胶的胶囊、多孔容器等中以避免排斥反应的状态进行移植。在此情况下，也可以是腹膜内或皮下移植。此外，可以根据接受给药的患者的年龄、体重、症状等，适当地改变本发明的药物的给药量(移植量)。在本发明的药物中，含有胰腺激素产生细胞的药物能够通过其自身的给药(移植)在患者体内产生(分泌)胰腺激素，并可用于治疗由于胰腺激素产生(分泌)低下导致的疾病。例如，含有胰岛素产生细胞的药物可用于治疗糖尿病(I型和II型，优选I型或胰岛素产生低下的II型，特别优选I 型)。另一方面，在本发明的药物中，在向患者给药(移植)含有胰腺激素产生前体细胞的药物后，通过在合适的条件下被诱导分化为胰腺激素产生细胞，能够产生(分泌)胰腺激素。3、筛诜方法本发明提供了筛选药物(优选糖尿病治疗药物)的方法(本说明书中有时简称为本发明的筛选方法)，特征在于使用通过选自下列步骤(I) (6)的任何一种以上的步骤获得的细胞:( I)在含有Rho激酶抑制剂的培养基中培养干细胞的步骤(2)在含有GSK3抑制剂的培养基中培养上述步骤(I)中获得的细胞的步骤(3)在含有GSK3抑制剂和活化素受体样激酶_4、7的激活剂的培养基中培养上述步骤(2)中获得的细胞的步骤(4)从上述(3)中获得的细胞形成细胞团，然后将该细胞团在培养基中以悬浮状态培养的步骤(5)在含有视黄酸受体激动剂、AMP活化蛋白激酶和/或活化素受体样激酶_2、3、6的抑制剂、活化素受体样激酶_4、5、7的抑制剂和细胞生长因子的培养基中培养上述步骤
(4)中获得的细胞的步骤(6)在培养基中培养上述步骤(5)中获得的细胞的步骤。可以以与本发明的胰腺激素产生细胞的制备方法的上述步骤(I) (6)相同的方式实施上述步骤(I) (6)用于筛选的细胞可例举通过上述步骤(I) (6)获得的胰腺激素产生细胞；通过上述步骤(I) (5)获得的胰腺激素产生前体细胞；通过上述步骤(I) (4)或上述步骤(I) (3)获得的内胚层细胞；通过上述步骤(I) (2)获得的细胞；通过上述步骤(I)获得的细胞。具体如下实施本发明的筛选方法(实施方案I)。
(a)在测试化合物存在下培养胰腺激素产生细胞和(b)在不存在测试化合物的条件下培养胰腺激素产生细胞，分别测量和比较该细胞内的胰腺激素表达量或该细胞向外的胰腺激素分泌量。胰腺激素的表达量可例举胰腺激素蛋白的表达量、编码胰腺激素蛋白的多核苷酸(例如，mRNA等)的表达量等。胰腺激素的表达量和分泌量的测定可以通过已知的方法，例如，可以使用识别胰腺激素的抗体，根据Western印迹分析、ELISA方法等或与其类似的方法，测量细胞提取液中、培养基中等存在的上述胰腺激素的方法进行。mRNA量的测定可以通过已知的方法，例如，Northern杂交、SI绘图法、PCR法、DNA芯片或阵列法，或与其类似的方法进行。对胰腺激素产生细胞培养没有特殊的限制，只要在可以表达和/或分泌胰腺激素的条件下进行即可，可以根据已知的方法进行。可用的培养基可以例举含有约I 20%胎牛血清的MEM培养基(Science，第122卷，501 (1952)等)、DMEM培养基(Virology，第8卷，396 (1959) )、RPMI1640 培养基(The Journal of the American Medical Association,第 199 卷,519 (1967))和 199 培养基(Proceeding of the Society for the BiologicalMedicine，第73卷，I (1950))。培养基的pH优选是约6 8。培养一般在约30° C 40° C进行约15小时 5天，必要时进行相应的通气或搅拌。测试化合物可以例举肽、蛋白质、抗体、非肽类化合物、合成化合物、发酵产物、细胞提取物、植物提取物、动物组织提取物、血浆。在本文中，测试化合物可以形成盐。该盐可使用与生理学可接受的酸、碱(例如，碱金属盐、碱土金属盐、铵盐)等的盐，此类盐可以例举例如与无机酸(例如，盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸)的盐、与有机酸(例如，醋酸、甲酸、丙酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)的盐、钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、钡盐、铝盐。例如，可以选择与上述(b)的情况相比，抑制(阻滞)上述(a)中的胰腺激素的表达量或分泌量约20%以上，优选约30%以上，更优选约50%以上的测试化合物作为抑制(阻滞)胰腺激素产生细胞中的胰腺激素表达的化合物。可以选择与上述(b)的情况相比，促进上述(a)中的胰腺激素的表达量或分泌量约20%以上，优选约30%以上，更优选约50%以上的测试化合物作为增强胰腺激素产生细胞中的胰腺激素表达或分泌的化合物。当胰腺激素产生细胞是胰岛素产生细胞时，增强胰岛素表达的化合物可用作糖尿病的治疗药物。当胰腺激素产生细胞是胰高血糖素产生细胞时，抑制(阻滞)胰高血糖素表达的化合物可用作糖尿病的治疗药物。本发明的筛选方法的另一个实施方案可以例举，(a)在测试化合物存在下培养胰腺激素产生细胞和(b)在不存在试化合物的条件下培养胰腺激素产生细胞，分别测定并比较该细胞的增殖能力的方法(实施方案2)。所使用的测试化合物可以提及与上述实施方案I中使用的测试化合物同样的化合物。此外，可以以与上述实施方案I相同的方式实施该实施方案中的细胞培养。作为测定细胞增殖能力的方法，可使用通常用于该领域中的方法，例如，计数细胞数的方法、评估3H, 5-溴-2’ -脱氧-尿苷(BrdU)等的摄入、ATP量、四唑化合物转化为甲臜产物的 量等的方法。例如，当胰腺激素产生细胞是胰岛素产生细胞时，显著促进胰岛素产生细胞增殖的化合物可用作糖尿病的治疗药物。当胰腺激素产生细胞是胰高血糖素产生细胞时，显著抑制(阻滞)胰高血糖素产生细胞增殖的化合物可用作糖尿病的治疗药物。本发明的筛选方法的另一个实施方案可以例举，(a)在测试化合物存在下培养胰腺激素产生前体细胞和(b)在不存在测试化合物的条件下培养胰腺激素产生前体细胞，分别测定并比较该细胞的分化程度的方法(实施方案3)。所使用的测试化合物可以提及与上述实施方案I中使用的测试化合物同样的化合物。此外，可以以与上述实施方案I相同的方式实施该实施方案中的细胞培养。可以通过例如胰腺激素产生前体细胞和/或胰腺激素产生细胞特异性表达的标志物的有无，检验胰腺激素产生前体细胞的分化程度。胰腺激素产生前体细胞的特异性标志物可以例举NGN3 (神经元素3)、PAX4 (成对框4)，胰腺激素产生细胞的特异性标志物可以例举胰岛素、胰高血糖素、胰腺多肽、生长抑素、饥饿素、PCSKl (前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexinl型)、SUR1 (磺酰脲类受体1、别名:ATP结合框、C亚家族(CFTR/MRP)成员8)、葡萄糖激酶、MAFA (v_maf肌腱膜纤维肉瘤原癌基因同源物A)、IAPP(胰岛淀粉样多肽)等。例如，当胰腺激素产生前体细胞是胰岛素产生细胞的前体细胞时，显著促进胰岛素产生细胞的前体细胞分化的化合物可用作糖尿病的治疗药物。当胰腺激素产生前体细胞是胰高血糖素产生细胞的前体细胞时，显著抑制(阻滞)胰高血糖素产生细胞的前体细胞分化的化合物可用作糖尿病的治疗药物。本发明的筛选方法的另一个实施方案可以例举，(a)在测试化合物存在下培养内胚层细胞和(b)在不存在测试化合物的条件下培养内胚层细胞，分别测定并比较该细胞的增殖或分化能力的方法(实施方案4)。所使用的测试化合物可以提及与上述实施方案I中使用的测试化合物同样的化合物。此外 ，可以以与上述实施方案I相同的方式实施该实施方案中的细胞培养。作为测量细胞增殖能力的方法，可使用通常用于该领域中的方法，例如计数细胞数的方法、评估3H, 5-溴-2’ -脱氧-尿苷(BrdU)等的摄入、ATP量、四唑化合物转化为甲臜产物的量等的方法。可以通过例如内胚层细胞的特异性标志物表达的有无，检验内胚层细胞的分化水平。内胚层细胞的特异性标志物可以例举a-feto蛋白、白蛋白、胃蛋白酶、肺表面活性蛋白等。一般而言，内胚层细胞的分化诱导或培养在技术上比中胚层或外胚层细胞困难，根据本筛选方法获得的化合物制备的细胞自身和/或内胚叶分化诱导体系可用于新的药物筛选系统。可以通过根据本发明的筛选方法获得保护(维持)胰腺激素产生细胞功能的药物等。本发明的筛选方法的其他实施方案可以例举，(a)在测试化合物存在下培养胰腺激素产生细胞和(b)在不存在测试化合物的条件下培养胰腺激素产生细胞，分别测定并比较该细胞的存活数或功能的方法(实施方案5)。所使用的测试化合物可以提及与上述实施方案I中使用的测试化合物同样的化合物。此外，可以以与上述实施方案I相同的方式实施该实施方案中的细胞培养。作为测定细胞存活数的方法，可使用通常用于该领域中的方法，例如计数细胞数的方法、评估3H, 5-溴-2’ -脱氧-尿苷(BrdU)等的摄入、ATP量、四唑化合物转化为甲臜产物的量等的方法。此外，除计数表现出形态学特征(染色质凝聚、核片段化、细胞收缩等)的细胞之外，还可以通过TUNNEL (TdT-介导的dUTP缺口末端标记)方法检测片段化DNA或检测活性半胱天冬酶的有无，测定7-AAD (7-氨基-放线菌素D)等的活细胞不透过性染料的核染色，细胞表面的磷脂酰丝氨酸暴露，线粒体膜的去极化，特定胞内蛋白质的切割或降解，来定量诱导凋亡后的细胞数。此外，作为确定细胞功能的方法，可例举测量对应于葡萄糖浓度的胰岛素或C-肽的分泌量或细胞膜电位改变的方法等。在这一实施方案中，在细胞培养过程中加入已知导致胰腺激素产生细胞功能障碍的因子(例如，炎性细胞因子、活性氧及其产生的诱导物质、高浓度脂肪酸、葡萄糖等)，测定并比较细胞的存活数或功能的方法。当胰腺激素产生细胞是胰岛素产生细胞时，对抗已知导致胰腺激素产生细胞功能障碍的因子，显著促进胰岛素产生细胞的存活或功能维持的化合物可用作糖尿病的治疗药物。可以将使用本发明的筛选方法获得的药物，使用生理学可接受的添加剂(例如，载体、香味剂、赋形剂、防腐剂、稳定剂、粘合剂)，通过常规手段进行制剂。因此获得的制剂的剂型可以例举:例如，必要时包糖衣的片剂、胶囊、酏剂、微胶囊等口服制剂；注射等非经口服的试剂。这些制剂中的活性成分的含量是例如0.1 90wt%。上述添加剂可以例举:例如明胶、玉米淀粉、黄芪胶、阿拉伯胶等粘合剂；结晶纤维素等赋形剂；例如玉米淀粉、明胶、海藻酸等膨胀剂；硬脂酸镁等润滑剂；蔗糖、乳糖、糖精等甜味剂；薄荷油、白珠树(Gaultheria adenothrix)油、楼桃等香味剂；油脂、注射用水、植物油(例如，芝麻油、棕榈油、大豆油)、缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲液、醋酸钠缓冲液)等液体载体；助溶剂(例如，乙醇、丙二醇、聚乙二醇)；非离子型表面活性剂(例如，聚山梨醇酯80 、HC0-50);助溶剂(例如，苯甲酸苄酯、苯甲醇);安抚剂(例如，苯扎氯铵、盐酸普鲁卡因)；稳定剂(例如，人血清白蛋白、聚乙二醇)；防腐剂(例如，苯甲醇、苯酚)；和抗氧化剂。上述注射用水可以例举:生理盐水；和含有葡萄糖、D-山梨糖醇、D-甘露糖醇、氯化纳等的等渗溶液。由于通过本发明的筛选方法获得的药物(优选糖尿病的治疗药物)是安全低毒的，因此可以以口服或不经 胃肠道的给药于例如哺乳动物(例如，人、小鼠、大鼠、兔、绵羊、猪、牛、马、猫、狗、猴子、黑猩猩)。根据药物的作用、目标疾病、给药对象、给药途径等适当地设定药物的剂量。
实施例下面通过实施例详细解释本发明，而不应将本发明限于以下实施例。实施例1 (I):诱导人iPS细胞分化为内胚层细胞(步骤(I) (3))通过下列方法实施将人iPS细胞诱导分化为内胚层细胞。首先，将细胞团的状态与饲养细胞一起培养维持的人iPS细胞(通过导入0ct3/4基因、Klf4基因和Sox2基因获得的iPS细胞:参见Nat Biotechnol2008 ；26:101_106)，使用用于灵长类ES细胞的细胞解离溶液(Repix)CELL Inc.)在细胞团的状态解离，将这些细胞转移到15ml离心管中，静置5分钟，通过去除上清液，去除饲养细胞。向离心管中沉淀的人iPS细胞中，加入0.25%胰蛋白酶-1mM EDTA溶液(GIBC0)，直到解离形成单个细胞。然后，按每个IOOmm培养皿15 X IO4个细胞的密度，将分散在培养基中的人 iPS 细胞接种在包被了 BD MatrigelCNippon Becton Dickinson Company, Ltd.)的培养皿中，在37° C、5%C02中培养I天。所使用的IOOmm培养皿是用无血清的DMEM/F12培养基(Invitrogen)将BD Matrigel稀释40倍并在室温包被3小时以上。用于分散和接种的培养基是添加了 IOuM Y-27632 (和光纯药)的用于灵长类ES细胞的培养基(IteproCELLInc.)。接种I天后，将培养基更换为含有GSK3 ^抑制剂CHIR99021 (3 u M)和2%B_27添加齐[J(GIBCO)的DMEM/F12培养基，培养2天。然后，将培养基更换为含有活化素A(50ng/ml)和 CHIR99021 (I u M)的 DMEM/F12 培养基，培养 2 天。为了检验培养人iPS细胞时内胚层分化标志物的表达改变，随时间回收诱导分化后的细胞，使用RNeasy96 (Qiagen)纯化总RNA级分。使用PrimeScriptRT试剂盒(TakaraBio Inc.)合成cDNA后，实施定量RT-PCR,测定原条标志物Brachyury和内胚叶标志物SOX17的基因表达量。图1显示了表达分析的结果。在培养第3天,Brachyury的表达量一过性上升，SOX17的表达量在第4天显著增加。由此可见，通过分化为原条，有效诱导了内胚层标志物的表达。为了检验S0X17蛋白质的表达，使用抗S0X17抗体实施免疫荧光染色。使用Accutase (Invitrogen) (商品名)将在IOOmm培养皿中诱导分化获得的内胚层细胞解离成单个的细胞，按4X IO4个细胞的密度，接种在纤连蛋白包被的96孔板中，在37° (:、5%0)2中培养I天。通过用DMEM/F12将纤连蛋白(BD)稀释20倍并在室温静置3小时进行纤连蛋白包被。接种时的培养基，使用含有1%B_27添加剂的Improved MEM Zinc Option培养基(Invitrogen)。在培养后,添加4%多聚甲醒,在室温孵育30分钟进行细胞固定。培养后的细胞与作为一抗的抗人S0X17抗体(AF1924，R&D)，然后与作为二抗的Alexa488标记的二抗(Invitrogen)相继反应后，用Hoechst33342对细胞核染色，并用荧光显微镜观察。结果显示在图2中。结果观察到大部分细胞表达S0X17蛋白。根据上述研究可见，可以通过在添加了 CHIR99021和B-27添加剂的DMEM/F12培养基中培养2天，再在添加了活化素A和CHIR99021的DMEM/F12培养基中培养2天，不使用饲养细胞和血清，可有效诱导分化为内胚层细胞。实施例1(2):研究了在步骤(2)中除CHIR99021外的GSK3抑制剂(BIO)的内胚层诱导。接种人iPS细胞I天后，用含有CHIR99021(3iiM)和2%B_27添加剂(GIBCO)的DMEM/F12培养基更换培养基，培养2天。然后，一方面，更换为含有CHIR99021(3iiM)作为GSK3抑制剂并含有活化素A(100ng/ml)以及2%B_27添加剂(GIBCO)的DMEM/F12培养基，继续培养(图3中标为“活化素 A+CHIR99021”)。另一方面，更换为含有BIO (0.5 PM)作为GSK3抑制剂并含有活化素A (100ng/ml)以及2%B-27添加剂(GIBCO)的DMEM/F12培养基，继续培养(图3中标为“活化素A+B10”)。随时间测定人iPS细胞培养时的S0X17的基因表达量。表达分析的结果显示在图3中。不论使用CHIR99021或B10，SOX17的表达量都自培养第4天显著增加，并观察到同样的表达模式。结果说明通过使用除CHIR99021以外的GSK3抑制剂也可以诱导内胚层。实施例2:诱导内胚层细胞分化为胰腺激素产生细胞「步骤(4) (6) I从分化成内胚层细胞的细胞形成细胞团，之后进一步诱导分化成胰腺激素产生细胞的前体细胞，然后，诱导分化成胰腺激素产生细胞。
使用Accutase (Invitrogen)(商品名)解离在IOOmm培养皿中诱导分化的内胚层细胞，直到形成单个的细胞。然后，按每孔2X IO4个细胞的密度，将分散在培养基中的内胚层细胞接种在96孔球形板(SUMITOMO BAKELITE)中，在37° C、5%C02中培养I天，形成细胞团。用于分散和接种的培养基，使用含有1%B_27添加剂的Improved MEM ZincOption培养基。在内胚层细胞接种I天后，将培养基更换为含有1%B_27添加剂并添加了dorsomorphin (I u M)、视黄酸(2 u M)、SB431542 (10 u M)和 bFGF (50ng/ml)的 Improved MEMZinc Option培养基，在37° C、5%C02的条件下培养8天，在第4天进行一次培养基换液。在培养8天后，将培养基更换为含有1%B_27添加剂的Improved MEM Zinc Option培养基，进一步培养细胞。之后，每3 4天进行培养基换液。在内胚层接种I天后，用dorsomorphin、视黄酸、SB431542和bFGF的组合培养细胞8天后，将培养基更换为含有1%B_27添加剂的Improved MEMZinc Option培养基，继续培养，此时胰岛素表达的分析结果显示在图4中。在将培养基更换为含有1%B_27添加剂的Improved MEM Zinc Option培养基培养的第13天的时间点,很少观察到胰岛素表达,但从培养第15天开始显著增加。作为比较例，接种内胚层细胞，I天后，用dorsomorphin、视黄酸和SB431542的组合培养细胞8天后，将培养基更换为含有1%B_27添加剂的Improved MEM Zinc Option培养基，继续培养。培养第19天的表达分析结果显示在图5中。与使用dorsomorphin、视黄酸和SB431542的组合培养的情况相比，使用dorsomorphin、视黄酸、SB431542和bFGF的组合培养在第19天时，胰岛素表达显示出更高的值。然后，为了检验胰岛素和胰高血糖素的蛋白质表达，使用抗胰岛素抗体实施免疫荧光染色。在内胚层细胞接种I天后，添加dorsomorphin、视黄酸、SB431542和bFGF，培养细胞8天后，将培养基更换为含有1%B_27添加剂的Improved MEM Zinc Option培养基，进一步培养细胞8天。在培养后，使用4%多聚甲醛，在4° C固定细胞3小时，将培养细胞包埋在OCT化合物(Tissue-tek)中， 制备IOym厚的冷冻切片。然后，细胞相继与作为一抗的抗胰岛素抗体(A0564，DAK0)或抗胰高血糖素抗体(G2654，SIGMA)反应，然后与作为二抗的 Alexa568 标记的二抗(Invitrogen)或 Alexa488 标记的二抗(Invitrogen)反应,用H0echst33342染色细胞核，并用荧光显微镜观察。免疫荧光染色的结果显示在图6中。在球形内部发现了大量表达胰岛素的细胞，也发现了一部分表达胰高血糖素的细胞。实施例3:诱导人iPS细胞分化为胰腺激素产生细胞「步骤(I) (6);使用BD MatriRel或纤连蛋白诱导分化为内胚层细胞，和诱导分化为胰腺激素产生细胞I通过下列方法实施将人iPS细胞诱导分化为内胚层细胞。首先，按实施例1相同的方式，将维持在细胞团状态的人iPS细胞解离，直到形成单个的细胞。然后，一方面，按每个用纤连蛋白(Invitrogen)包被的IOOmm培养皿60X IO4个细胞的密度，接种分散在培养基中的人iPS细胞，在37° C、5%C02中培养I天。所使用的IOOmm培养皿是用无血清的DMEM/F12培养基(Invitrogen)将纤连蛋白稀释40倍并在室温包被3小时以上(图7中标为“纤连蛋白”)。另一方面，按每个用BD Matrigel (Nippon Becton Dickinson Company, Ltd.)包被的IOOmm培养皿15 X IO4个细胞的密度，接种分散在培养基中的人iPS细胞，在37° C、5%C02中培养I天。所使用的IOOmm培养皿是用无血清的DMEM/F12培养基(Invitrogen)将BD Matrigel稀释40倍并在室温下包被3小时以上(图7中标为“Matrigel”)。而且，用于分散和接种的培养基是添加了 IOyM Y-27632 (和光纯药)的用于灵长类ES细胞的培养基(IteproCELL Inc.)。在接种I天后，将培养基更换为含有GSK3 P抑制剂CHIR99021 (3 u M)和2%B_27添加剂(GIBCO)的DMEM/F12培养基，培养2天。然后，将培养基更换为含有活化素A(50ng/ml)和CHIR99021 (I u M)的DMEM/F12培养基，培养2天。按实施例2相同的方式，从分化为内胚层细胞的细胞形成细胞团，之后进一步分化诱导为胰腺激素产生细胞的前体细胞，然后分化诱导为胰腺激素产生细胞。按实施例2相同的方式，在内胚层细胞接种I天后，用dorsomorphin、视黄酸、SB431542和bFGF的组合培养细胞8天，将培养基更换为含有1%B_27添加剂的ImprovedMEM Zinc Option培养基,诱导分化,进行各种分化标志物随时间的表达分析。表达分析的结果显示在图7中。内胚层标志物S0X17的表达随分化显著减少，而胰腺前体细胞标志物(PDXl)和胰腺激素产生细胞的前体细胞的标志物(NGN3)的表达逐步增加至培养第17天。从培养第17天开始，胰岛素的表达显著增加。各种分化标志物的随时间的表达变化在使用BDMatrigel或纤连蛋白作为底物诱导的内胚层细胞之间是几乎相同的。BD Matrigel是从Engelbreth-HoIm-Swarm (EHS)小鼠肉瘤细胞提取的基底膜制品。另一方面，该实施例中使用的纤连蛋白是从人血衆中通过亲和色谱提取的。由此可见，与使用BD Matrigel(实施例1和2)的情况一样，使用纤连蛋白也可以诱导分化为胰腺激素产生细胞。通过研究上述实施例1-3可知，可以使用如下图8中显示的胰腺分化诱导体系诱导分化为胰腺激素产生细胞:用内胚层细胞形成球体，在含有1%B_27添加剂并添加了dorsomorphin、视黄酸、SB 431542 和 bFGF 的 Improved MEM Zinc Option 培养基中培养细胞8天，然后，将培养基更换为含有1%B_27添加剂的Improved MEM Zinc Option培养基，培养细胞。通过本发明的方法制备的胰腺激素产生细胞比其他方法制备的胰腺激素产生细胞具有更好的胰岛素产生量。工业实用性根据本发明的制备方法，可以从干细胞产生出更接近胰腺生成的形态的胰腺激素产生细胞。此外，本发明的细胞可用于筛选用于预防和/或治疗糖尿病等由胰腺激素生产和/或分泌异常导致的疾病(例如)的化合物。此外，由于本发明的细胞可用于治疗此类疾病的细胞疗法和保持了三维结构，因此与根据常规制备方法获得的胰腺激素产生细胞相比，更适合细胞疗法的应用。该申请基于在日本提交的专利申请号2010-178523，其内容全部包含在本申请中。
权利要求
1.制备胰腺激素产生细胞的方法，该方法包括使干细胞经历下列步骤(I) (6): (1)在含有Rho激酶抑制剂的培养基中培养干细胞的步骤 (2)在含有GSK3抑制剂的培养基中培养上述步骤(I)中获得的细胞的步骤 (3)在含有GSK3抑制剂和活化素受体样激酶_4、7的激活剂的培养基中培养上述步骤(2)中获得的细胞的步骤 (4)从上述(3)中获得的细胞形成细胞团，然后将该细胞团在培养基中以悬浮状态培养的步骤 (5)在含有视黄酸受体激动剂、AMP活化蛋白激酶和/或活化素受体样激酶_2、3、6的抑制剂、活化素受体 样激酶_4、5、7的抑制剂和细胞生长因子的培养基中培养上述步骤(4)中获得的细胞的步骤 (6)在培养基中培养上述步骤(5)中获得的细胞的步骤。
2.根据权利要求1的制备方法，其中步骤(3)中的活化素受体样激酶_4、7的激活剂是活化素。
3.根据权利要求1的制备方法，其中步骤(I)中的Rho激酶抑制剂是(+)_(R)_反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环己烷甲酰胺二盐酸盐。
4.根据权利要求1的制备方法，其中步骤(2)和(3)中的GSK3抑制剂是 (i ) 6-[ [2-[ [4- (2，4- 二氯苯基)-5- (4-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]烟腈和/或(ii)(2，Z, 3，E) _6_ 漠親玉红 _3’ -月亏。
5.根据权利要求1的制备方法，其中步骤(5)中的视黄酸受体激动剂是视黄酸。
6.根据权利要求1的制备方法，其中步骤(5)中的AMP活化蛋白激酶和/或活化素受体样激酶_2、3、6的抑制剂是6-[4-(2-哌啶-1-基乙氧基)苯基]-3-吡啶-4-基吡唑并[I, 5-a]嘧啶。
7.根据权利要求1的制备方法，其中步骤(5)中的活化素受体样激酶_4、5、7的抑制剂是4-[4-(1, 3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑_2_基]-苯甲酰胺。
8.根据权利要求1的制备方法，其中步骤(5)中的细胞生长因子是碱性成纤维细胞生长因子。
9.根据权利要求1的制备方法，其中步骤(I) (6)中基本上不使用饲养细胞。
10.根据权利要求1的制备方法，其中步骤(I) (6)中的培养基基本上不含血清。
11.根据权利要求1的制备方法，其中干细胞是诱导性多能干细胞(iPS细胞)、胚胎干细胞(ES细胞)或人成体干细胞。
12.根据权利要求1的制备方法，其中胰腺激素产生细胞是选自下列的任何细胞:胰岛素产生细胞、胰高血糖素产生细胞、生长抑素产生细胞、胰腺多肽(PP)产生细胞和饥饿素产生细胞。
13.制备胰腺激素产生细胞的方法，该方法包括使内胚层细胞经历下列步骤(4’)和(5，): (4’ )从内胚层细胞形成细胞团，并将该细胞团在培养基中以悬浮状态培养的步骤 (5’ )在含有视黄酸受体激动剂、AMP活化蛋白激酶和/或活化素受体样激酶_2、3、6的抑制剂、活化素受体样激酶_4、5、7的抑制剂和细胞生长因子的培养基中培养上述步骤(4’)中获得的细胞的步骤。
14.包含通过权利要求1或13的制备方法获得的胰腺激素产生细胞的药物。
15.筛选糖尿病治疗药物的方法，该方法包括使用通过选自下列步骤(I) (6)中的任何一个或多个步骤获得的细胞: (1)在含有Rho激酶抑制剂的培养基中培养干细胞的步骤 (2)在含有GSK3抑制剂的培养基中培养上述步骤(I)中获得的细胞的步骤 (3)在含有GSK3抑制剂和活化素受体样激酶_4、7的激活剂的培养基中培养上述步骤(2)中获得的细胞的步骤 (4)从上述(3)中获得的细胞形成细胞团，然后将该细胞团在培养基中以悬浮状态培养的步骤 (5)在含有视黄酸受体激动剂、AMP活化蛋白激酶和/或活化素受体样激酶_2、3、6的抑制剂、活化素受体样激酶_4、5、7的抑制剂和细胞生长因子的培养基中培养上述步骤(4)中获得的细胞的步骤 (6)在培养基中培养上述步骤(5)中获得的细胞的步骤。
全文摘要
本发明的目的是提供由干细胞制备胰腺激素产生细胞的方法，所述细胞更接近胰腺生成的形式。制备胰腺激素产生细胞的方法的特征在于使干细胞经历下列步骤(1)～(6)(1)在含有Rho激酶抑制剂的培养基中培养干细胞的步骤；(2)在含有GSK3抑制剂的培养基中培养上述步骤(1)中获得的细胞的步骤；(3)在含有GSK3抑制剂和活化素受体样激酶-4、7的激活剂的培养基中培养上述步骤(2)中获得的细胞的步骤；(4)从上述(3)中获得的细胞形成细胞团后，将该细胞团置于培养基中以悬浮状态培养的步骤；(5)将上述步骤(4)中获得的细胞在含有视黄酸受体激动剂、AMP活化蛋白激酶和/或活化素受体样激酶-2、3、6的抑制剂、活化素受体样激酶-4、5、7的抑制剂和细胞生长因子的培养基中培养的步骤；(6)在培养基中培养上述步骤(5)中获得的细胞的步骤。
文档编号C12Q1/02GK103154240SQ201180048849
公开日2013年6月12日 申请日期2011年8月8日 优先权日2010年8月9日
发明者细谷昌树, 庄司昌伸 申请人:武田药品工业株式会社
技术领域：
本发明涉及制备胰腺激素产生细胞的方法，和包含通过该制备方法获得的胰腺激素产生细胞的药物。
背景技术：
胰腺具有内分泌腺(内分泌细胞)和外分泌腺(外分泌细胞)，是通过两类细胞发挥重要作用的器官。外分泌细胞主要发挥分泌胰脂肪酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、胰淀粉酶等的消化酶的作用，例如。内分泌细胞发挥了分泌胰腺激素的作用，已知由胰腺a细胞分泌胰高血糖素，由胰腺P细胞分泌胰岛素，由胰腺S细胞分泌生长抑素，由PP细胞分泌胰腺多肽(在本说明书中有时缩写为PP)。而且，近年，报道了作为胃分泌激素的饥饿素(ghrelin)也是由胰腺分泌的。胰岛素在促进葡萄糖利用、蛋白质合成、中性脂肪的形成和储藏、降低血糖值，和维持正常的血糖浓度中发挥了重要的作用。胰腺的胰高血糖素作为通过肝糖原分解、糖异生作用等的血糖升高性激素，与胰岛素一起在糖代谢调控机制中发挥重要的作用。生长抑素通过与生长抑素受体结合产生作用，并抑制胰腺中的胰高血糖素、胰岛素等多种激素分泌。PP是由朗格汉斯(Lange·rhans)岛的细胞响应饮食而分泌的激素,被称为饱食因子,有降低食物摄入和体重增加的作用。饥饿素已知刺激食物摄入，通过降低脂肪氧化来增加体重。糖尿病是由胰岛素不足及其功能丧失而发病的疾病，是一旦发病则难以根治的疾病。糖尿病大部分可分为两类，I型糖尿病(胰岛素依赖型糖尿病)和II型糖尿病(非胰岛素依赖型糖尿病)。11型糖尿病是由于对胰岛素具有抵抗性而发病的慢性疾病，逐渐成为与由于过度进食或运动不足等导致的肥胖或应激状态等生活习惯相关的问题。II型糖尿病多在中老年发病，多数糖尿病患者患有该类型糖尿病。I型糖尿病是由于自身免疫病或病毒感染等破坏胰岛素产生细胞，使体内不分泌胰岛素而导致的慢性疾病。作为可以自动控制体内不断变化的血糖值并减轻患者负担的治疗方法，对I型糖尿病的患者实施胰腺移植或胰岛移植。虽然通过这些治疗方法可能达到正常的血糖值，但不能说移植技术已充分建立，并且目前可以移植的胰腺或胰岛是不足的。此外，为了避免对移植物的免疫排斥反应，患者需要终生服用免疫抑制剂，并且存在感染风险、由免疫抑制剂导致的副作用等问题。对于I型糖尿病可以尝试的一种治疗方法为，再生并移植患者的胰岛素产生细胞本身。根据该方法，患者自身可以在体内生产胰岛素。此外，由于细胞是来源于患者本身的细胞，可以解决排斥反应的问题等，在安全性方面也是有利的。作为获得胰岛素产生细胞的方法，已知:从ES细胞分化的方法、从患者的胰腺组织干细胞分化的方法、体外提取并分化源自患者的胰腺导管上皮的细胞的方法。例如，已知:使用活化素(activin)或视黄酸(RA)从人ES细胞诱导分化胰腺P细胞的方法(专利文献I，非专利文献I 4)或从人ES细胞诱导分化胰高血糖素产生细胞(a细胞)的方法(非专利文献8);从人iPS细胞诱导分化胰腺P细胞的方法(非专利文献5 7);通过向ES细胞中导入roxi—已知是与胰腺发生相关的重要转录因子并且负责胰岛素产生细胞的发生和功能维持，并培养所述细胞而有效诱导分化胰岛素产生细胞的方法(专利文献2)。然而，由于通过上述方法获得的胰岛素产生细胞与正常胰腺0细胞比较，胰岛素产生效率相当低，因此，仍然需要开发可适用于细胞治疗应用的有效获得胰岛素产生细胞的方法。此外，需要使可获得的细胞数量增加至用于治疗糖尿病等的实用化水平。现有技术文献专利文献专利文献I JP-A-2009-225661专利文献2:US-B-7534608非专利文献非专利文献1:E.Kroon 等人，“Pancreatic endoderm derived from humanembryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells inviv0.”，Nature Biotechnology (2008)，第 26 卷，第 4 期:443-452非专利文献2:K.A D，Amour 等人，“Production of pancreatichormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells.”，NatureBiotechnology (2006)，第 24 卷，第 11 期:1392-1401非专利文献3:W.Jiang，“In vitro derivation of functional膜岛素-producing cells from human embryonic stem ce 11 s.，，，Ce 11Research(2007)17:333-344非专利文献4:J.H.Shim等人，“Directed differentiation of human embryonicstem cells towards a pancreatic cell fate.”，Diabetologia(2007)50:1228-1238非专利文献5:R.Maehra 等人，“Generation of pluripotent stem cells frompatients with typeldiabetes.”，PNAS (2009)，第 106 卷，第 37 期:15768-15773非专利文献6:MC.Nostro 等人，“Stage-specific signaling through TGFbetafamily members and WNT regulates patterning and pancreatic specification ofhuman pluripotent stem cells.”，Development(2011)， 138:861-871非专利文献7 ；A.Rezania 等人，“Production of functionalglucagon-secreting alpha-cells from human embryonic stem cells.”，Diabetes(2011)，60:239-247非专利文献8:T.Thatava 等人，“ Indolactam V/GLP-1-mediateddifferentiation of human iPS cells into glucose-responsive insulin-secretingprogeny.”，Gene Ther (2011),18:283-293发明概述本发明要解决的问题本发明的目的是提供以更适合细胞疗法应用的胰腺激素产生细胞的制备方法，含有通过上述制备方法获得的胰腺激素产生细胞的药物，以及使用该细胞筛选糖尿病治疗药的方法。
解决问题的方法本发明人针对上述问题进行了深入的研究，发现通过依次改变分化诱导因子的种类或其组合，并在从内胚层细胞形成细胞团后以悬浮状态培养，可以从干细胞制备更接近胰腺生成(pancreatogenesis)形式(保持三维结构的形式)的胰腺激素产生细胞,从而完成本发明。S卩，本发明提供了以下方面。I制备胰腺激素产生细胞的方法，其中使干细胞经历下列步骤(I) (6):( I)在含有Rho激酶抑制剂的培养基中培养干细胞的步骤(2)在含有GSK3抑制剂的培养基中培养上述步骤(I)中获得的细胞的步骤(3)在含有GSK3抑制剂和活化素受体样激酶_4、7的激活剂的培养基中培养上述步骤(2)中获得的细胞的步骤(4)从上述(3)中获 得的细胞形成细胞团，然后将该细胞团置于培养基中以悬浮状态培养的步骤(5)在含有视黄酸受体激动剂、AMP活化蛋白激酶和/或活化素受体样激酶_2、3、6的抑制剂、活化素受体样激酶_4、5、7的抑制剂和细胞生长因子的培养基中培养上述步骤(4)中获得的细胞的步骤(6)在培养基中培养上述步骤(5)中获得的细胞的步骤；2上述I的制备方法，其中步骤(3)中的活化素受体样激酶_4、7的激活剂是活化素；3上述I或2的制备方法，其中步骤(I)中的Rho激酶抑制剂是(+)_(R)_反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环己烷甲酰胺二盐酸盐；4上述I至3的任一项的制备方法，其中步骤(2)和(3)中的GSK3抑制剂是(i) 6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]烟腈和/或(ii) (2，Z，3，E)-6-溴靛玉红-3’ -月亏；5上述I至4的任一项的制备方法，其中步骤(5)中的视黄酸受体激动剂是视黄酸；6上述I至5的任一项的制备方法，其中步骤(5)中的AMP活化蛋白激酶和/或活化素受体样激酶_2、3、6的抑制剂是dorsomorphin ；7上述I至6的任一项的制备方法，其中步骤(5)中的活化素受体样激酶_4、5、7的抑制剂是4-[4-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-(2-吡啶基)_1H_咪唑-2-基]-苯甲酰胺；8上述I至7的任一项的制备方法，其中步骤(5)中的细胞生长因子是碱性成纤维细胞生长因子；9上述I至8的任一项的制备方法，其中步骤(I) (6)中基本上不使用饲养细胞；10上述I至7的任一项的制备方法，其中步骤(I) (6)中的培养基基本上不含血清；11上述I至10的任一项的制备方法，其中干细胞是诱导性多能干细胞(iPS细胞)、胚胎干细胞(ES细胞)或人成体干细胞；
12上述I至11的任一项的制备方法，其中胰腺激素产生细胞是任何选自下列的细胞:选自胰岛素产生细胞、胰高血糖素产生细胞、生长抑素产生细胞、胰腺多肽(PP)产生细胞和饥饿素产生细胞；13制备胰腺激素产生细胞的方法，其特征在于使内胚层细胞经历下列步骤(4’)和(5，):(4’ )从内胚层细胞形成细胞团，并将该细胞团在培养基中以悬浮状态培养的步骤(5’)在含有视黄酸受体激动剂、AMP活化蛋白激酶和/或活化素受体样激酶_2、3、6的抑制剂、活化素受体样激酶_4、5、7的抑制剂和细胞生长因子的培养基中培养上述步骤(4)中获得的细胞的步骤。14包含通过上述I至13的任一项制备方法获得的胰腺激素产生细胞的药物；15筛选糖尿病治疗药物的方法，其特征在于使用通过选自下列步骤(I) (6)中的任意一种以上的步骤获得的细胞:( I)在含有Rho激酶抑制剂的培养基中培养干细胞的步骤(2)在含有GSK3抑制剂的培养基中培养上述步骤(I)中获得的细胞的步骤(3)在含有GSK3抑制剂和活化素受体样激酶_4、7的激活剂的培养基中培养上述步骤(2)中获得的细胞的步骤(4)使从上述(3)中获得的细胞形成细胞团后，将该细胞团置于培养基中以悬浮状态培养的步骤(5)在含有视黄酸受体激动剂、AMP活化蛋白激酶和/或活化素受体样激酶_2、3、6的抑制剂、活化素受体样激酶_4、5、7的抑制剂和细胞生长因子的培养基中培养上述步骤(4)中获得的细胞的步骤(6)在培养基中培养上述步骤(5)中获得的细胞的步骤。发明的效果根据本发明的制备方法，可以从干细胞制备更接近胰腺生成形式的胰腺激素产生细胞。此外，可以使用在上述步骤(I) (6)中的任意一种以上步骤中获得的细胞，来筛选可用于预防和/或治疗糖尿病等由胰腺激素产生和/或分泌异常导致的疾病的化合物。此夕卜，由于本发明的细胞可用于治疗上述疾病的细胞疗法，并维持了三维结构，因此，与常规制备方法获得的胰腺激素产生细胞相比，更适合应用于细胞疗法。
附图简介
图1显示了通过使用各种因子从人iPS细胞开始诱导分化，并在头4天每天通过定量RT-PCR测量原条标志物(Brachyury )和内胚层标志物(SOXl7)的表达的结果。各基因的表达量显示为与管家基因GAPDH的表达量的相对值。在培养第3天，Brachyury的表达量一过性增加，而S0X17的表达量在第4天显著增加。
图2显示了通过使用活化素A和CHIR99021诱导人iPS细胞分化4天，将细胞重新接种在用纤连蛋白包被的96孔板上，并培养细胞I天，使用抗人S0X17抗体进行免疫荧光染色的结果。S0X17阳性细胞的核用Alexa488显色为绿色(图中表示为S0X17)，而细胞核用Hoechst33342显色为蓝色(图中表示为Hoechst)。此外，将两种染色图像合并的图表示为Merge (合并)。观察到大部分细胞表达S0X17蛋白。图3显示了在含有CHIR99021的培养基中培养了 2天，然后使用活化素A和CHIR99021、以及活化素A和BIO进行培养的人iPS细胞的每天定量RT-PCR测量的S0X17表达的结果。基因的表达量显示为相对于管家基因GAPDH的表达量的相对值。不论使用CHIR99021或B10，从培养的第4天开始，S0X17表达随时间而增加，并表现出相似的表达模式。在仅添加DMSO的对照中，SOX17表达不增加。图4显示了通过使用活化素A和CHIR99021诱导人iPS细胞分化4天，将细胞接种在96孔球形板上，培养细胞I天后，在含有1%B27并添加了 dorsomorphin、视黄酸、SB431542和bFGF的Improved MEM Zinc Option培养基中培养细胞8天，然后将培养基更换为含有1%B27的Improved MEMZinc Option培养基，并进一步继续培养的细胞的胰岛素表达分析的结果(图中表示为胰岛素(insulin))。基因的表达量显示为相对于管家基因GAPDH的表达量的相对值。在含有1%B27的Improved MEM Zinc Option培养基中，自培养第13天交换后，至培养第23天，胰岛素表达随时间增加。图5显示了通过使用活化素A和CHIR99021诱导人iPS细胞分化4天，将细胞接种在96孔球形板上，培养细胞I天后，使用dorsomorphin、视黄酸，SB431542和bFGF的组合、或使用dorsomorphin、视黄酸和SB431542的组合培养细胞8天，之后在含有1%B27的Improved MEM Zinc Option培养基中培养第19天的细胞的胰岛素表达的分析结果(图中表示为胰岛素)。基因的表达量显示为相对于管家基因GAPDH的表达量的相对值。在培养的第19天,使用dorsomorphin、视黄酸，SB431542和bFGF的组合的胰岛素表达量高于dorsomorphin、视黄酸和 SB431542 的组合。图6显示了用与图4的方法相同的方式诱导分化获得的细胞培养第21天的细胞团(球形)制备冰冻切片，并使用抗胰岛素抗体和抗胰高血糖素抗体进行免疫荧光染色的结果。胰岛素阳性细胞用Alexa568显色为红色(图中表示为胰岛素)，而胰高血糖素阳性细胞用Alexa488显色为绿色(图中表示为胰高血糖素)，细胞核用Hoechst33342显色为蓝色(图中表示为Hoechst)。此外，将两种染色图`像合并的图表示为Merge。确认表达胰岛素的细胞大部分在细胞团(球形)内部，部分细胞表达胰高血糖素。图7显示了通过使用BD Matrigel或纤连蛋白作为底物，用活化素A和CHIR99021诱导人iPS细胞为内胚层后形成细胞团(球形)，之后再依次诱导分化为胰腺激素产生前体细胞和胰腺激素产生细胞时各种分化标志物的表达分析结果。各基因的表达量显示为相对于管家基因GAPDH的表达量的相对值。S0X17的表达随分化显著减少，PDXl和NGN3的表达逐渐增加直到培养的第17天。胰岛素的表达自培养第17天开始急剧增加。只要使用以BDMatrigel或纤连蛋白作为底物诱导的内胚层细胞，则这些各种分化标志物随时间的表达的变化几乎是相同的。图8显示了包含从内胚层形成细胞团(球形)的诱导分化步骤(步骤(4))的不使用饲养细胞或血清的胰腺激素产生细胞的制备方法的概况。发明详述下面解释本发明。本说明书中使用的术语意指本领域中一般使用的，除非特别说明。在本发明中，“胰腺激素产生细胞”意指具有产生胰腺激素的能力的细胞。胰腺激素产生细胞不需要持续产生胰腺激素，只要具有生产胰腺激素的能力即可。因此，对产生的胰腺激素的量没有特殊的限制。胰腺激素可以例举:胰岛素、胰高血糖素、生长抑素、胰腺多肽、饥饿素。胰腺激素产生细胞可以例举:胰岛素产生细胞(与胰腺0细胞同义)、胰高血糖素产生细胞(与胰腺a细胞同义)、生长抑素产生细胞(与胰腺S细胞同义)、胰腺多肽(PP)产生细胞、饥饿素产生细胞。其中，优选是胰岛素产生细胞。在本发明中，“干细胞”意指可以在体外培养并且可以分化成构成机体的多种细胞系的细胞。具体而言，可以例举:胚胎干细胞(ES细胞)、源自胚胎的原始生殖细胞的多能干细胞(EG 细胞:Proc Natl Acad Sci U S A.1998，95:13726-31 )、睾丸来源的多能干细胞(GS细胞:Nature.2008，456:344-9)、体细胞来源的诱导性多能干细胞(inducedpluripotent stem cells ;iPS细胞)和人成体干细胞(组织干细胞)。优选的是iPS细胞、ES细胞或人成体干细胞，更优选的是iPS细胞。ES细胞可以使用源自任何暖血动物优选哺乳动物的细胞。哺乳动物可以例举:小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、猫、狗、绵羊、猪、牛、马、山羊、猴子和人。优选使用源自人的细胞。ES细胞的具体例子可以例举:通过培养着床前的早期胚胎建立的哺乳动物等的ES细胞；通过培养由体细胞核移植制备的早期胚胎建立的ES细胞；和通过遗传工程的方法改变所述ES细胞的染色体上的基因获得的ES细胞。可以根据本领域总常规实施的方法或公知文献，制备各种ES细胞。小鼠的ES 细胞是由 Evans 等人(Evans 等人，1981, Nature292:154-6)、Martin 等人(Martin GR.等人，1981，Proc Natl Acad Sci78:7634_8)在 1981 年建系的，可购自例如大日本住友制药株式会社(大阪，日本)。人的ES 细胞是由 Thomson 等人(Thomson 等人，Science, 1998，282:1145-7)在1998 年建系的，可获得自例如 WiCell Research Institute (网址:http://www.wicell.0rg/, Madison, Wisconsin, USA)、美国国立卫生研究院、东京大学等,可购自例如CellartisAB (网址:http://www.cellartis.com/, Sweden)。iPS细胞可使用源自任何暖血动物优选哺乳动物的细胞。哺乳动物可以例举:小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、猫、狗、绵羊、猪、牛、马、山羊、猴子、人。优选使用源自人的细胞。iPS细胞可以例举:通过导入多种基因至皮肤细胞等的体细胞中获得的、获得了与ES细胞同样的多能性的细胞(例如，通过导入0ct3/4基因、Klf4基因、c -Myc基因和Sox2基因获得的iPS细胞(Nat Biotechnol2008 ;26:101-106))。除此之外，可提及进一步减少转基因的方法(Nature.2008Jul31 ；454(7204):646-50);利用低分子化合物的方法(Cell Stem Cell.2009Jan9 ；4(1):16-9 ；Cell Stem Cell.2009Nov6 ；5 (5):491-503);利用转录因子蛋白代替基因的方法(Cell Stem Cell.2009May8 ；4 (5):381-4)等。虽然对iPS细胞的制备方法已进行了深入的技术改良，但不论制备方法，所制备的iPS细胞的基本性质(即，具有多能性)是相同的，因此，所有此类方法可用于本发明的制备方法。成体干细胞可以使用源自人的。在本文中，成体干细胞指能够分化得到胰腺激素产生细胞的细胞，可以例举:例如，源自骨髓或脂肪的间叶干细胞或胰腺内存在的干细胞。使用本发明的方法，可以从制备方法不同的人iPS细胞系等各种干细胞系制备胰腺激素产生细胞。1、胰腺激素产牛细胞的制备方法
技术领域：
本发明的制备方法是从干细胞制备胰腺激素产生细胞的方法。本发明的制备方法还是将分化状态较低的细胞(干细胞)诱导分化为分化状态更高的细胞(胰腺激素产生细胞)的方法。本发明的制备方法包括下列步骤(I) (6)。( I)在含有Rho激酶抑制剂的培养基中培养干细胞的步骤(2)在含有GSK3抑制剂的培养基中培养上述步骤(I)中获得的细胞的步骤(3)在含有GSK3抑制剂和活化素受体样激酶_4、7的激活剂的培养基中培养上述步骤(2)中获得的细胞的步骤(4)使从上述(3)中获得的细胞形成细胞团后，将该细胞团置于培养基中以悬浮状态培养的步骤(5)在含有视黄酸受体激动剂、AMP活化蛋白激酶和/或活化素受体样激酶_2、3、6的抑制剂、活化素受体样激酶_4、5、7的抑制剂和细胞生长因子的培养基中培养上述步骤(4)中获得的细胞的步骤(6)在培养基中培养上述步骤(5)中获得的细胞的步骤。步骤(I):在含有Rho激酶抑制剂的培养基中培养干细胞的步骤该步骤相当于下述步骤(2)的开始诱导分化干细胞为胰腺激素产生细胞的步骤的前阶段，即，干细胞的预培养(接种)阶段。该步骤中的干细胞可 以通过与饲养细胞或饲养细胞提取物共培养来获得。在本文中，饲养细胞意指通过共培 养，提供可以增殖其他种类细胞的环境的细胞。该步骤中的干细胞可以是分散的细胞和不分散的细胞，分散的细胞是理想的。分散的细胞可以例举:单细胞，和由多个(典型的为约2-500、20-200或50-100个)细胞组成的细胞团(如下述步骤(4)中解释的，细胞团意指通过多个细胞彼此粘附而形成团块的状态)形成的细胞，该步骤中细胞团是理想的。可以通过本身已知的方法制备分散的细胞。此类方法的可以例举:用螯合剂(例如，EDTA)、酶(例如，胰蛋白酶、胶原酶)等处理、机械分散(例如，移液)等操作。分散的细胞可以是不贴壁的细胞(不贴壁的细胞意指处于不粘附至培养容器或底物上的状态中的细胞)或贴壁的细胞(贴壁的细胞意指处于粘附至培养容器或底物上的状态中的细胞)。在该步骤中，理想的是在去除饲养细胞或饲养细胞提取物后(例如，通过放在离心管中，静置2-10min，然后去除上清液来去除)，在下述含有Rho激酶抑制剂的培养基中培养细胞(即，自接种时不使用饲养细胞，开始诱导分化)。Rho激酶抑制剂意指抑制Rho激酶的活性的物质。Rho激酶是一种包含在GTP (鸟苷三磷酸酶)的降解酶的GTP酶类中的低分子量GTP结合蛋白(低分子量G蛋白)，在氨基末端具有丝氨酸/苏氨酸激酶结构域，在中心部分具有卷曲-卷曲区域，和在羧基末端具有Rho相互作用结构域(Amano等人，Exp.Cell.Res.,261,44-51(2000))。该步骤中使用的Rho激酶抑制剂可以例举:1-(5-异喹啉磺酰基)-2_甲基哌嗪(H-7)、1-(5_异喹啉磺酰基)-3-甲基哌嗪(异H-7)、N-2-(甲基氨基)乙基_5_异喹啉磺酰胺二盐酸盐(H-8)、N-(2-氨基乙基)-5-异喹啉磺酰胺二盐酸盐(H-9)、N-[2-p-溴肉桂基氨基)乙基]-5-异喹啉磺酰胺二盐酸盐(H-89)、N-(2-胍基乙基)-5-异喹啉磺酰胺盐酸盐(撤-1004)、1-(5-异喹啉磺酰基)高哌嗪二盐酸盐(Fasudil/HA-1077)、(S)-(+)-2-甲基-4-甘氨酰基-1-(4-甲基异喹啉-5-磺酰基)高哌啶二盐酸盐(H-1152)和(+)_(R)_反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环己烷甲酰胺二盐酸盐(Y-27632)。这些都是可商购的(例如，可购自SIGMA、和光纯药工业社)。其中特别优选的是Y-27632。在该步骤中，可以使用一种或两种以上Rho激酶抑制剂的组合。在该步骤中，干细胞在含有Rho激酶抑制剂的培养基中培养。培养基中的Rho激酶抑制剂的浓度没有特殊的限制，只要可以实现提高干细胞的存活率等所需的效果，一般是0.01-1000 u M，优选0.1-100 u M，特别优选1.0-50 u M。当使用Y-27632作为Rho激酶抑制剂时，优选使用约1.0-约30 u M，更优选约2.0-约20 ii M的浓度。当使用Fasudi 1/HA1077作为Rho激酶抑制剂时，可以使用上述Y-27632浓度约2倍的浓度。当组合使用多种Rho激酶抑制剂时，每种抑制剂使用的浓度基于上述浓度范围适当地增加或减少。在含有Rho激酶抑制剂的培养基中的培养时间没有特殊的限制，只要是可以达到提高干细胞的存活率等的所需的效果的长度的时间即可。例如，当干细胞是人iPS细胞时，如将人iPS细胞分散后在含有Rho激酶抑制剂的培养基中培养约12小时或更久(例如12 72小时)，可以充分获得所需效果。在含有Rho激酶抑制剂的培养基中的干细胞密度没有特殊的限制，只要是可以达到提高干细胞的存活率等的所需的效果的密度即可。优选是约1.0X IO1 1.0X IO7细胞/ml，更优选约1.0XlO2 1.0X IO7细胞/ml，更优选约1.0XlO3 1.0X IO7细胞/ml，最优选约3.0 X IO4 1.0 X IO6细胞/ml。
该步骤中使用的培养基没有特殊的限制，只要含有Rho激酶抑制剂，通常是在用于培养干细胞的培养基(在下文中出于方便还被称为基础培养基)中添加了 Rho激酶抑制剂。作为该步骤中使用的基础培养基，可以使用用于灵长类ES/iPS细胞的培养基(ReproCELL培养基)、BME培养基、BGJb培养基、CMRL1066培养基、Glasgow MEM培养基、Improved MEM Zinc Option 培养基、IMDM 培养基、Mediuml99 培养基、Eagle MEM 培养基、a MEM培养基、DMEM培养基、ham培养基、RPMI1640培养基、Fischer培养基，以及任意选自上述培养基的两种以上的培养基的混合培养基。培养基没有特殊的限制，只要可用于动物细胞培养即可。在该步骤中，特别理想的使用用于灵长类ES细胞的培养基(ReproCELL培养基)。这些培养基可购自IteproCELL Inc.、Invitrogen、SIGMA、COSMO BIO C0.,Ltd 等。该步骤使用的培养基优选是基本上不含血清和/或血清提取物的培养基，更优选是无血清的培养基。在本说明书中，基本上不含血清意指血清含量低于约I体积％，优选少于约0.1体积％，更优选少于约0.01体积％。无血清的培养基意指不含未调整的或未纯化的血清的培养基，混入纯化的血液来源成分或动物组织来源成分(例如，生长因子)的培养基被认为落入无血清的培养基的范围内。
该步骤中使用的培养基还包含血清替代物。血清替代物可以例举:白蛋白(例如，富含脂质的白蛋白)、转铁蛋白、脂肪酸、胶原前体、微量元素(例如，锌、硒)、B-27添加剂、N2添加剂、knockout血清替代物、2-巯基乙醇、3’ -硫代甘油及其等价物。knockout血清替代物可购自Invitrogen。其他血清替代物可购自Invitrogen、SIGMA、和光纯药工业社、大日本住友制药社等。血清替代物是B-27添加剂时，其在培养基中浓度是0.01 10wt%，优选0.1 2wt%0在该步骤中，优选基本上不使用饲养细胞和/或饲养细胞提取物。即，用于该步骤中的培养基优选是基本上不含饲养细胞和/或饲养细胞提取物的培养基，更优选完全不含饲养细胞和/或饲养细胞提取物的培养基。在本说明书中，基本上不含饲养细胞和/或饲养细胞提取物意指培养基中的饲养细胞和/或饲养细胞提取物的含量少于约5体积％，优选少于约I体积％，更优选少于约0.01体积％。当该步骤中基本上不使用饲 养细胞和/或饲养细胞提取物时，由本发明的制备方法制备的胰腺激素产生细胞较少混入致排斥反应的物质(例如，动物来源的细胞)。该步骤中的培养一般使用培养容器实施。此类培养容器没有特殊的限制，只要可以培养干细胞，实施贴壁培养时细胞粘附型培养容器是理想的，实施悬浮培养时细胞非粘附型培养容器是理想的。培养容器可以例举:瓶、组织培养瓶、培养皿、Petri培养皿、组织培养皿、多孔培养皿、微孔板(microplate)、微孔板(microwell plate)、多孔板(multiplate)、多孔板(multiwelIplate)、显微载玻片、腔室培养玻片、培养皿(schale)、管、盘、培养袋和旋转瓶。为了提高培养容器表面的与细胞的粘附性，细胞粘附型培养容器是用胞外基质(ECM)等任何细胞支持性底物包被的培养容器。用于贴壁培养的培养容器可以例举:培养皿、瓶、微孔板、细胞培养薄片等。为改善与细胞的粘附性，可以赋予这些培养容器亲水性，或者用胶原、明胶、多聚L-赖氨酸、多聚D-赖氨酸、层粘连蛋白、纤连蛋白等细胞支持性底物包被。细胞培养薄片指目的是将细胞培养成薄片状形态的支持物，可购自例如OptiCell(Nunc)。该步骤中的细胞支持性底物优选是I型胶原、BD Matrigel (Nippon BectonDickinson Company, Ltd.)、纤连蛋白(Invitrogen)等，更优选是 BD Matrigel 和纤连蛋白，更优选是纤连蛋白。用于悬浮培养的培养容器的可以例举:培养皿、瓶、微孔板、管、旋转瓶等。这些培养容器可以用疏水性材料生产，或者用水凝胶、脂质等防止细胞或蛋白质吸附的材料包被。为了有效形成细胞的凝集块，使用具有U字或V字形状的底面的培养容器是理想的。可以适当地确定其他培养条件。例如，对培养温度没有特殊的限制，只要是适合培养所使用的干细胞的温度即可，可以是约30 40° C，优选约37° C。C02浓度可以是约I 10%，优选约2 5%。氧分压可以是I 10%。步骤(2):在含有GSK3抑制剂的培养基中培养上述步骤(I)中获得的细胞的步骤该步骤是在上述步骤(I)之后实施的步骤，与下述步骤(3)—起对应于诱导干细胞分化为内胚层细胞的步骤。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶GSK3 (糖原合成酶激酶3)，参与涉及糖原产生、凋亡、干细胞维持等许多信号通路。GSK3包括GSK3a和GSK3 P亚型，由不同的基因编码，并在氨基酸水平具有高同源性。已知GSK3还涉及Wnt信号传递，抑制GSK3能激活Wnt信号。GSK3抑制剂可以例举GSK3a抑制剂和GSK3 P抑制剂。在该步骤中，GSK3 0抑制剂是理想的。GSK3抑制剂的具体例子包括CHIR98014(2-[[2-[(5-硝基-6-氨基吡啶_2_基)氨基]乙基]氨基]-4-(2，4- 二氯苯基)-5-(lH-咪唑-1-基)嘧啶)、CHIR99021、Kenpaullone, AR-A0144-18、TDZD-8 (4-苄基-2-甲基-1，2，4-噻二唑烷 _3，5- 二酮)、SB216763(3-(2, 4- 二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2，5- 二酮)、BIO、TffS-119 (3-[6-(3-氨基苯基)-7H_吡咯并[2，3-d]嘧啶_4_基氧基]苯酚)、SB415286 (2_ (3_氣_4_轻基苯基氛基)_3_ (2_硝基苯基)马来酸亚胺[2-[2，5-二氢_4-[ (3-氯-4-羟基苯基)氨基]_2，5- 二氧代-1H-吡咯-3-基]苯基]氧化亚铵(oxylatoiminium)等。可购自 Axon Medchem BV、和光纯药工业社、Enzo LifeSciences, Inc.、Merck Biosciences、Tocris bioscience、Stemgent、Sigma 等。此外，还可以使用针对GSK3mRNA的反义寡核苷酸、siRNA等作为GSK3抑制剂。所有这些都可商业获得，或者可以根据公开文献合成。使用Wnt_3A肽诱导干细胞分化为内胚层细胞的方法是已知的(非专利文献1、2和5)。在该步骤中，使用低分子化合物GSK3抑制剂可以提供优秀的操作性、再现性、选择性。GSK3 抑制剂优选是 CHIR99021 (6-[[2-[[4_(2，4- 二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]烟腈)或BIO ((2 ’ Z，3 ’ E) -6-溴靛玉红_3 ’ -肟)。在该步骤中，可以任意使用一种或两种以上的GSK3抑制剂的组合。根据所使用 的抑制剂的类型适当地确定培养基中的GSK3抑制剂的浓度，一般是
0.01 100 i! M,优选0.1 10 i! M。使用CHIR99021时，浓度一般是0.1 20 y M，优选I 5 PM,而使用BIO时，浓度一般是0.01 5 ii M，优选0.1 2 ii M。当组合使用多种GSK3抑制剂时，可以基于上述浓度范围适当地增加或减少每种抑制剂的量。该步骤对使用的培养基没有特殊的限制，只要含有GSK3抑制剂即可，一般是在用于培养干细胞的培养基(基础培养基)中添加GSK3抑制剂。该步骤使用的基础培养基可以例举:BME培养基、BGJb培养基、CMRL1066培养基、Glasgow MEM 培养基、Improved MEM Zinc Option 培养基、頂DM 培养基、Mediuml99 培养基、Eagle MHM培养基、a MHM培养基、DMHM培养基、无血清的DMEM/F12培养基、ham培养基、RPMI1640培养基、Fischer培养基，及其混合的培养基等。用于该步骤中的基础培养基没有特殊的限制，只要可用于培养动物细胞即可。这些基础培养基可购自Invitrogen、SIGMA、和光纯药工业社、大日本住友制药社等。用于该步骤中的基础培养基优选是无血清的DMEM/F12培养基、RPMI1640培养基和Improved MEM Zinc Option培养基，特别优选的是无血清的DMEM/F12培养基。用于该步骤中的培养基优选是基本上不含血清和/或血清提取物的培养基，更优选是无血清的培养基。在该步骤中，优选是基本上不使用饲养细胞和/或饲养细胞提取物，更优选是完全不使用饲养细胞和/或饲养细胞提取物。
当基本上不使用饲养细胞和饲养细胞提取物时，由本发明的制备方法制备的胰腺激素产生细胞较少混入致排斥反应的物质(例如，动物来源的细胞)。用于该步骤中的培养基还可以含有血清替代物。血清替代物可以例举:白蛋白、转铁蛋白、脂肪酸、胶原前体、微量元素(例如，锌、硒)、B-27添加剂、N2添加剂、knockout血清替代物、2-巯基乙醇、3’ -硫代甘油,及其等价物。用于该步骤中的血清替代物优选是B-27添加剂。血清替代物是B-27添加剂时，其在培养基中浓度是0.01 10wt%，优选0.1 2wt%0这些血清替代物可购自Invitrogen、SIGMA、和光纯药工业社、大日本住友制药社等。该步骤中对培养温度没有特殊的限制，只要是适合培养所使用的干细胞的培养温度即可，是约30 40° C，优选约37° C。在约37° C的培养温度，培养时间是6 144小时，优选12 72小时。该步骤中的培养一般在充有约1 10%，优选5%的CO2的温箱中进行。步骤(3):在含有GSK3抑制剂和活化素受体样激酶_4、7的激活剂的培养基中培养上述步骤(2)中获得的细胞的步骤该步骤是在上述步骤(2)之后实施的步骤，对应于完成干细胞诱导分化为内胚层细胞的步骤。用于该步骤中的活化素受体样激酶(ALK)_4、7的激活剂选自对ALK-4和/或ALK-7具有激活作用的物质。用于该步骤中的活化素受体样激酶(ALK)_4、7的激活剂可以例举:活化素、Nodal、Myostatin，所有这些激活剂都是可商业获得的。其中，优选用活化素作为用于该步骤中的活化素受体样激酶_4、7的激活剂。上述活化素是属于TGFP (转化生长因子￠)家族的24kD大小的肽性细胞增殖和分化因子，其中两个P亚基通过SS键构的二聚体(Ling，N.，等人，(1986)Nature321, 779-782 ；Vale, ff.,等人，(1986)Nature321, 776-779)。在本发明中，可以使用活化素A、B、C、D、AB中的任何活化素，还可人、小鼠等任何动物来源的活化素，这些是可商业获得的。其中，特别优选使用活化素A。优选采用与使用的干细胞的动物物种相同的动物物种来源的活化素。例如，使用源自人的干细胞作为起始材料时，则优选使用人活化素A。在该步骤中，根据活化素受体样激酶_4、7的激活剂的种类，适当地设定培养基中的活化素受体样激酶_4、7的激活剂的浓度，当使用活化素作为活化素受体样激酶_4、7的激活剂时，浓度一般是0.1 200ng/ml,优选5 150ng/ml,特别优选10 100ng/ml。在该步骤中，可以任意使用一种或两种以上的活化素受体样激酶_4、7的激活剂的组合，当组合使用多种激活剂时，基于上述浓度范围适当地增加或减少每种激活剂的量。而且，在该步骤中，特征在于活化素受体样激酶_4、7的激活剂与GSK3抑制剂一起包含在培养基中。当在活化素和GSK3抑制剂存在下培养干细胞时，可以更适合细胞分化为内胚层细胞。用于该步骤中的GSK3抑制剂可以例举:GSK3a抑制剂和GSK3 P抑制剂。用于该步骤中GSK3抑制剂优选是GSK33抑制剂。用于该步骤中的GSK3抑制剂的具体例子可以例举与上述步骤(2)中所示的与GSK3抑制剂同样的例子，在该步骤中，可优选使用GSK3抑制剂CHIR99021或B10。根据所使用的抑制剂的类型适当地设定培养基中的GSK3抑制剂的浓度，使用CHIR99021时，浓度一般是0.1 20 ii M，优选I 5 ii M，而使用BIO时，浓度一般是0.01 5 ii M，优选0.1 2 u M0在该步骤中，可以任意使用一种或两种以上的GSK3抑制剂的组合，当组合使用多种GSK3抑制剂时，可以基于上述浓度范围适当地增加或减少每种抑制剂的量。在该步骤中，活化素受体样激酶_4、7的激活剂和GSK3抑制剂可以同时添加到培养基中，另外，只要可以诱导干细胞分化为内胚层细胞，可以设定时间差分别添加到培养基中。将活化素受体样激酶_4、7的激活剂和GSK3抑制剂同时添加到培养基中是方便且优选的。通过向上述步骤(2)所述的基础培养基中添加活化素受体样激酶_4、7的激活剂和GSK3抑制剂，制备用于该步骤中的培养基。可以使用与上述 步骤(2 )中使用的培养基相同种类的基础培养基制备用于该步骤中的培养基，也可以使用不同种类的基础培养基制备，优选的是使用相同种类的基础培养基(例如，无血清的DMEM/F12培养基)制备的培养基。用于该步骤中的基础培养基优选是无血清的DMEM/F12培养基、RPMI1640培养基和Improved MEM Zinc Option培养基，特别优选无清的DMEM/F12培养基。在该步骤中，优选是基本上不使用饲养细胞和/或饲养细胞提取物，更优选是完全不使用饲养细胞和/或饲养细胞提取物。用于该步骤中的培养基优选是基本上不含血清和/或血清提取物的培养基，更优选是无血清的培养基。当基本上不使用饲养细胞和饲养细胞提取物时，由本发明的制备方法制备的胰腺激素产生细胞较少混入致排斥反应的物质(例如，动物来源的细胞)。用于该步骤中的培养基还可以含有血清替代物。血清替代物可以例举:白蛋白、转铁蛋白、脂肪酸、胶原前体、微量元素(例如，锌、硒)、B-27添加剂、N2添加剂、knockout血清替代物、2-巯基乙醇、3’ -硫代甘油，及其等价物等，优选B-27添加剂。用于培养基中的B-27添加剂的浓度是0.01 10wt%，优选0.1 2wt%。该步骤中的培养温度没有特殊的限制，只要适合培养所使用的细胞即可，是约30 40。C，优选约37。C。在约37° C的温度，培养时间是6 288小时，优选12 124小时。该步骤中的培养一般在充有约I 10%，优选5%的CO2的温箱中进行。在该步骤中，使用内胚叶标志物验证了诱导干细胞分化为内胚层细胞。具体而言，可以通过评估有无在内胚层细胞中特异性表达的蛋白质或基因(内胚叶标志物)的表达，来进行验证。可以通过利用抗原抗体反应的方法等，评估蛋白质表达，可以通过利用RT-PCR的方法等,评估基因的表达，标志物可以例举S0X17(性别决定域Y, sex determiningregion Y)、Goosecoid (goosecoid 同源框)、CXCR4 (趋化因子(C-X-C 基序)受:体 4)和 F0XA2(forkhead boxA2)。步骤(4):从上述(3)中获得的细胞中形成细胞团(球形)后，将该细胞团置于培养基中以悬浮状态培养的步骤在该步骤中，将上述步骤(3)中获得的已经分化为内胚层细胞状态的细胞(即，内胚层细胞)形成了细胞团后，将该细胞团在培养基中以悬浮状态培养的步骤(再接种的步骤)。在本说明书中，细胞团指多个细胞通过彼此粘附等形成单个团块的状态(例如，10个以上的细胞彼此粘附的状态)，是与分离的细胞和视作分离的细胞相对的概念。分离的细胞指处于不与其他细胞粘附的独立状态的一个细胞。视作分离的细胞指与I个或2个其他的细胞粘附，或通过微弱粘附力彼此容易分离的程度的聚集状态的几个细胞。在该步骤中，细胞团指上述步骤(3)中获得的多个(例如，10个以上)的细胞(内胚层细胞)，通过细胞间彼此粘附等形成一团的状态。可以通过聚集的细胞的数量(例如，3个以上的细胞聚集时为细胞团)，或者可以通过在光学显微镜等扩大观察细胞悬浮液的平面图像中的细胞形成的一个集合的区域的面积，区分细胞团、分离的细胞和视作分离的细胞。例如，当细胞的大小(半径)是约IOiim时，其切面积是约300 iim2。因此，例如，当形成一个细胞集合的区域面积少于300 y m2时，可认为是分离的细胞或视作分离的细胞，而当大于900 ii m2 (即，对应于3个细胞)时，可认为是细胞团。当10个以上的细胞彼此粘附形成细胞团时，可推定其切面积达到3000 ii m2以上。在本说明书中，以悬浮状态培养意指在培养基中不贴壁的条件下培养。在不贴壁的条件下的培养意指在不与培养容器或基材粘附的状态下培养(例如，使用非粘附性的多孔平板)。可以通过本身已知的方法实施不贴壁的条件下的培养。此类方法例如,包括在培养容器的表面用聚羟乙基甲基丙烯酸酯等亲水性物质蛋白聚糖包被抑制细胞与基材粘附的方法(Cell Struct Funct，13，179 (1988))、通过冷却，在培养容器的表面涂布溶解在培养基中的合成的高分子化合物，粘附细胞后，通过冷却培养容器以溶解合成的高分子化合物，形成细胞薄片的方法(Bio Technology, 8，854(1990)),必要时可以改良这些方法。例如，为了防止在更换培养基时损失细胞，可以使培养容器进行离心操作，强制细胞团贴附至培养容器的表面后，更换培养基，或者将包含细胞的培养基转移到离心管中，通过离心操作沉淀细胞后更换上清液中的培养基。在该步骤中，在形成细胞团之前，可以向上述步骤(3)中获得的细胞(内胚层细胞)中添加蛋白质消化酶，分离细胞为单个状态。蛋白质消化酶可使用胰蛋白酶、胶原酶、木瓜蛋白酶、分散酶、Accutase(Invitrogen,商标名)等。这些蛋白质消化酶通常通过添加EDTA来螯合消化酶的抑制剂Ca2+和Mg2+，以胰蛋白酶-EDTA溶液(例如，0.25%胰蛋白酶-1mM EDTA)的形式使用。在该步骤中，例如，可以从上述步骤(3)中获得的细胞如下制备细胞团。S卩，将上述步骤(3)中获得的细胞在培养容器的合适培养基中进行悬浮培养。例如，当使用96孔圆底培养皿作为低粘附性培养容器时，每个孔接种20，000-400，000个细胞，并将形成聚集物转移至低粘附性6cm培养皿等中，在合适的培养基中37° C培养约6小时 约10天，优选约6小时 约2天，更优选I天。低粘附性培养容器例如对通常该技术领域中使用的培养容 器进行低吸附性处理的培养容器。培养容器可以例举培养皿、培养瓶、旋转培养器具(旋转瓶等)等，具体是球形板。处理成低粘附性，可以使用通过使水凝胶形成共价键(包被)而抑制蛋白质和细胞粘附的处理。
具体而言，在该步骤中，将上述步骤(3)中获得的细胞例如以密度为每孔2X IO4个细胞接种在96孔球形板中，并在37° C和5%C02的条件下，在添加了 1%B_27添加剂的Improved MEM Zinc Option 培养基中培养 I 天。在该步骤中，将上述获得的细胞团以悬浮状态培养在培养基中。以悬浮状态培养意指如上所述，非贴壁性的条件下培养，即，以不与培养容器或基材粘附的状态培养(例如，使用非粘附性多孔板)。用于该步骤中的培养基(S卩，再接种的培养基)可以例举上述步骤(2)中例示的基础培养基。可以使用与上述步骤(2) (3)中的同种基础培养基，或者使用不同种基础培养基制备用于该步骤中的培养基。就更有效的进行胰腺激素产生细胞的诱导分化而言，优选使用Improved MEM Zinc Option培养基(Invitrogen)作为该步骤的基础培养基。还可以根据已知文献制备该培养基(Richter A.等人，National Cancer (1972)49，1705)。用于该步骤中的培养基还可以含有血清替代物。血清替代物可以例举白蛋白、转铁蛋白、脂肪酸、胶原前体、微量元素(例如，锌、硒)、B-27添加剂、N2添加剂、knockout血清替代物、2-巯基乙醇、3’-硫代甘油，及其等价物。用于该步骤中的血清替代物优选是B-27添加剂。在该步骤中，特别优选的使用添加了 B-27添加剂的Improved MEMZINC Option培养基(Invitrogen)。在培养基中，B-27添加剂的浓度是0.01 10wt%，优选0.1 2wt%。在该步骤中，优选是基本上不使用饲养细胞和/或饲养细胞提取物，更优选是完全不使用饲养细胞和/或饲养细胞提取物。当基本上不使用饲养细胞和饲养细胞提取物时，较少混入致排斥反应物质(例如，动物来源的细胞)。 用于该步骤中的培养基优选是基本上不含血清和/或血清提取物的培养基，更优选是无血清的培养基。培养温度没有特殊的限制，只要适合培养所使用的细胞的培养温度即可，是约30 40。C，优选约37。C。培养时间是6 360小时，优选约I天 约12天，更优选约8天。当形成悬浮状态的细胞团时，在细胞团形成后，也可以在不进行悬浮培养的条件下，使细胞团进行步骤(5)。在此情况下，可以在实施步骤(5)之前，以悬浮状态培养所形成的细胞团0 48小时，优选0 24小时。该步骤中的培养一般在通有约1_10%，优选5%的CO2的温箱中进行。具体而言，在该步骤中，将上述步骤(3)中获得的细胞例如以密度为每孔2X IO4个细胞接种在96孔球形板中，并在37° C和5%C02的条件下，在添加了 1%B_27添加剂的Improved MEM Zinc Option 培养基中培养 I 天。在该步骤(4)中，还可以使用除上述步骤(I) (3)获得的内胚层细胞之外的内胚层细胞作为起始材料，制备胰腺激素产生细胞。因此，通过该步骤(4)，本发明还提供了使用内胚层细胞作为起始材料的胰腺激素产生细胞的制备方法，即，特征在于从内胚层细胞形成细胞团，并将该细胞团在培养基中以悬浮状态培养的胰腺激素产生细胞的制备方法(在本说明书中，有时缩写为本发明的制备方法2)。还可以以与使用上述步骤(3)中获得的细胞作为起始材料，制备胰腺激素产生细胞的方法的步骤(4)相同的方式，使用除上述步骤(I) (3)获得的内胚层细胞之外的内胚层细胞作为起始材料，制备胰腺激素产生细胞的制备方法。具体而言，本发明的制备方法2的特征是使内胚层细胞进行下列步骤(4’)和(5，)。(4’)从内胚层细胞形成细胞团，并将该在培养基中以悬浮状态培养的步骤(5’)在含有视黄酸受体激动剂、AMP活化蛋白激酶和/或活化素受体样激酶_2、
3、6的抑制剂、活化素受体样激酶_4、5、7的抑制剂和细胞生长因子的培养基中培养上述步骤(4)中获得的细胞的步骤。可以与上述步骤(4)相同的方式实施步骤(4’)，可以与上述步骤(5)相同的方式实施步骤(5’)。可以通过该步骤，更优选的通过在上述步骤(1)-(3)后进行的步骤(4)制备生更接近胰腺产生的形式的胰腺激素产生细胞。由于该细胞具有成三维细胞团的结构，可认为与单层培养的细胞相比，接近生物体内的状态，功能更强。此外，由于该细胞的三维结构，可认为与常规制备方法获得的胰腺激素产生细胞相比，是更适合应用于细胞疗法的细胞。步骤(5):在含有视黄酸受体激动剂、AMP活化蛋白激酶和/或活化素受体样激酶_2、3、6的抑制剂、活化素受体样激酶_4、5、7的抑制剂和细胞生长因子的培养基中培养上述步骤(4)中获得的细胞的步骤该步骤对应于诱导上述步骤(4)中获得的细胞即以悬浮状态培养的内胚层细胞分化为胰腺激素产生细胞的前体细胞的步骤。
用于该步骤中的视黄酸受体(RAR)激动剂可以是天然存在的类视黄醇，或合成的类视黄醇、不含类视黄醇骨架的视黄酸受体激动剂，或具有同等活性的天然存在的物质。天然存在的类视黄醇可以例举视黄酸(已知全反式视黄酸(全反RA)的立体异构体和9-顺式-视黄酸(9-顺式-RA))。合成的类视黄醇是本领域已知的(美国专利号5，234，926、美国专利号4，326，055等)。不含类视黄醇骨架的视黄酸受体激动剂可以例举Am80、TTNPB和AC55649等。天然存在的物质可以例举和厚朴酌■、木兰醇等(Annual Report of ResearchInstitute for Biological Function9:55-61，2009)。用于该步骤中的 RAR激动剂优选是视黄酸。根据所使用的RAR激动剂的种类，适当地设定培养基中的RAR激动剂的浓度，所使用的视黄酸浓度一般是0.1 100 ii M，优选0.5 10 ii M。用于该步骤中的AMP活化蛋白激酶和/或活化素受体样激酶_2、3、6的抑制剂选自对AMP活化蛋白激酶(AMPK)具有抑制剂活性的化合物、对活化素受体样激酶(ALK)-2、3、6具有抑制剂活性的化合物、以及同时对AMP活化蛋白激酶具有抑制剂活性和对活化素受体样激酶_2、3、6具有抑制剂活性的化合物。具有AMPK抑制剂活性的化合物可以例举dorsomorphin (6-[4-(2-哌唳-1-基乙氧基)苯基]-3-吡啶-4-基吡唑并[1，5-a]嘧啶)、araA (腺嘌呤_9_ ^ -d_阿拉伯呋喃糖苷)、C75等。活化素受体样激酶(ALK)分为一些类型，已知ALK-2、3、6是I型BMP受体激酶，下述ALK-4、5、7已知为TGF-P超家族I型受体激酶。作为具有ALK_2、3、6抑制剂活性的化合物，可提及dorsomorphin、LDN-193189 (6-(4-喊嚷苯基)-3-(喧琳-4-基)卩比唑并[I, 5-a]嘧啶)等。Dorsomorphin同时具有AMPK抑制剂活性和ALK_2、3、6抑制剂活性两种活性。作为AMP活化蛋白激酶和/或活化素受体样激酶_2、3、6的抑制剂,dorsomorphin是优选的。这些化合物可购自SIGMA、Tocris bioscience>Stemgent>Merck Biosciences等。此外，还可以使用针对AMP活化蛋白激酶以及ALK-2、3、6等的mRNA的反义寡核苷酸或siRNA等作为AMP活化蛋白激酶和/或ALK-2、3、6的抑制剂。此外，在该步骤中，当确认了属于BMP家族的分化因子增加或培养中的细胞分泌这些分化因子到培养基中时，也可以使用中和这些分化因子的活性的抗体或已知结合BMP抑制其作用的Noggin、Chordin、Cerberus、Gremlin等作为AMP活化蛋白激酶和/或ALK_2、3、6的抑制剂。此外，在该步骤中，当确认了培养中的细胞向培养基中增加或分泌上述步骤(3)作为活化素受体样激酶_4、7的激活剂的活化素时，还可以使用已知中和活化素活性的抗体，或已知结合活化素抑制其作用的卵泡抑素作为AMP活化蛋白激酶和/或ALK-2、3、6的抑制剂。根据所使用的抑制剂种类，适当地设定培养基中的AMP活化蛋白激酶和/或活化素受体样激酶-2、3、6的抑制剂的浓度,所使用的dorsomorphin的浓度一般是0.1 2011] ，优选0.2 5iiM。用于该步骤中的活化素受体样激酶(ALK)_4、5、7的抑制剂可例举SB-431542、SB-505124(2-(5-苯并[1，3] 二氧杂环戊烷_5_基-2-叔丁基-3H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶盐酸盐)、SB-525334(6-[2-叔丁基-5-(6-甲基-吡啶-2-基)-1H-咪唑-4-基]-喹喔啉)、A-83-01 (3- (6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4- (4-喹啉基)-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺)、GW6604、LY-580276(2-(6-甲基 _2_ 吡啶基)-3-(4-氟苯基)_5，6- 二氢-4H-吡咯[I, 2-b]吡唑)和SD-208(2-(5-氯-2-氟苯基)-N-(吡啶-4-基)吡啶并[2, 3-d]嘧唳~4~胺)等。`这些可购自SIGMA、Tocris bioscience、和光纯药工业社等。此外,还可以使用ALK-4、5、7的mRNA的反义寡核苷酸和siRNA作为ALK_4、5、7抑制剂。用于该步骤中的ALK-4、5、7的抑制剂，优选是SB-431542(4-[4-(l，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]-苯甲酰胺，或其水合物。根据所使用的抑制剂种类，适当地设定培养基中的活化素受体样激酶_4、5、7的抑制剂的浓度，使用的SB-431542的浓度一般是0.1 50 ii M，优选I 20 y M。用于该步骤中的细胞生长因子可以例举血管内皮细胞生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、干细胞生长因子(SCF)、上皮细胞生长因子(EGF)、各种成纤维细胞生长因子(a/bFGF)等。其中特别优选的是碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。根据所使用的因子种类，适当地设定培养基中的细胞生长因子的浓度，bFGF的浓度一般是 I 200ng/ml,优选 20 100ng/ml。该步骤是在含有上述视黄酸受体激动剂、AMP活化蛋白激酶和/或活化素受体样激酶_2、3、6的抑制剂、活化素受体样激酶_4、5、7的抑制剂和细胞生长因子这所有4种组分的培养基中实施的。在该步骤中，可以将视黄酸受体激动剂、AMP活化蛋白激酶和/或活化素受体样激酶_2、3、6的抑制剂、活化素受体样激酶_4、5、7的抑制剂和细胞生长因子同时添加到培养基中，或者设定时间差分别添加到培养基中，只要可以诱导前体细胞分化为胰腺激素产生细胞。视黄酸受体激动剂、AMP活化蛋白激酶和/或活化素受体样激酶_2、3、6的抑制剂、活化素受体样激酶_4、5、7的抑制剂和细胞生长因子同时添加到培养基中是方便且优选的。用于该步骤中的培养基是通过向上述步骤(2)中所述的基础培养基添加视黄酸受体激动剂、AMP活化蛋白激酶和/或活化素受体样激酶_2、3、6的抑制剂、活化素受体样激酶_4、5、7的抑制剂和细胞生长因子制备的。可以使用与上述步骤(4)同种的基础培养基，或使用不同种的基础培养基，制备用于该步骤中的培养基。就更有效的进行胰腺激素产生前体细胞的诱导分化而言，该步骤优选使用Improved MEM Zinc Option培养基(Invitrogen)作为基础培养基。在该步骤中，优选是基本上不使用饲养细胞和/或饲养细胞提取物，更优选是完全不使用饲养细胞和/或饲养细胞提取物。在该步骤中，当基本上不使用饲养细胞和饲养细胞提取物时，较少混入致排斥反应物质(例如，动物来源的细胞)。用于该步骤中的培养基优选是基本上不含血清和/或血清提取物的培养基，更优选是无血清的培养基。用于该步骤中的培养基还可以含有血清替代物。血清替代物可以例举白蛋白、转铁蛋白、脂肪酸、胶原前体、微量元素(例如，锌、硒)、B-27添加剂、N2添加剂、knockout血清替代物、2-巯基乙醇、3’ -硫代甘油,及其等价物。用于该步骤中的血清替代物优选是B-27添加剂。
当使用B27时，培养基中的血清替代物的浓度是0.01 10wt%，优选0.1 2wt%。该步骤是通过在适合培养所使用的内胚层细胞的培养温度，一般是30 40° C，优选37° C，培养72 288小时，优选120 216小时，在充有I 10%，优选5%的二氧化碳的CO2温箱中培养来实施的。在该步骤中，可以通过评估胰腺激素产生前体细胞特异性表达的蛋白质或基因(胰腺激素产生前体细胞的标志物)的表达的有无，来验证内胚层细胞向胰腺激素产生前体细胞的诱导分化。可以通过利用抗原抗体反应的方法等评估蛋白质的表达，可以通过利用RT-PCR的方法等评估基因的表达。该标志物可以例举NGN3、HNF6 (肝细胞核因子6、别名:一切同源框i)、roxi (胰腺和十二指肠同源框I)等。步骤(6):在培养基中培养上述步骤(5)中获得的细胞的步骤该步骤对应于诱导胰腺激素产生前体细胞分化为胰腺激素产生细胞的步骤。用于该步骤中的基础培养基可以是上述步骤(2)中例示的培养基。可以使用上述步骤(5)中同种的基础培养基，或者使用不同种的基础培养基，制备用于该步骤中的培养基。就更有效的进行胰腺激素产生细胞的诱导分化而言，该步骤优选使用Improved MEMZinc Option培养基(Invitrogen)作为用于该步骤中的基础培养基。在该步骤中，优选是基本上不使用饲养细胞和/或饲养细胞提取物，更优选是完全不使用饲养细胞和/或饲养细胞提取物。当基本上不使用饲养细胞和饲养细胞提取物时，较少混入致排斥反应物质(例如，动物来源的细胞)。用于该步骤中的培养基优选是基本上不含血清和/或血清提取物的培养基，更优选是无血清的培养基。用于该步骤中的培养基还可以含有血清替代物。血清替代物可以例举白蛋白(例如，富含脂质的白蛋白)、转铁蛋白、脂肪酸、胶原前体、微量元素(例如，锌、硒)、B-27添加齐[|、N2添加剂、knockout血清替代物、2-巯基乙醇、3’-硫代甘油，或其等价物等。其中,B-27添加剂是优选的。特别的是，优选使用添加了 B-27添加剂的Improved MEM Zinc Option培养基(Invitrogen)。培养基中的B-27添加剂的浓度是0.01 10wt%，优选0.1 2wt%。此外，可以向Improved MEM Zinc Option培养基中添加提高细胞存活率的添加剂。此类添加剂可以例举血清替代物，例如knockout血清替代物、N2添加剂等。培养基中的上述添加剂的浓度是0.01 10wt%，优选0.1 2wt%。优选的，用于该步骤中的培养基不含视黄酸受体激动剂、AMP活化蛋白激酶和/或活化素受体样激酶_2、3、6的抑制剂、活化素受体样激酶_4、5、7的抑制剂和细胞生长因子。因此，优选在步骤(5)和步骤(6)之间更换培养基。该步骤是通过在适合培养所使用的胰腺激素产生前体细胞的培养温度，一般是30 40° C，优选约37° C，培养24 240小时，优选72 192小时，在充有I 10%，优选5%的二氧化碳的CO2温箱中培养来实施的。在该步骤中，可以通过评估胰腺激素产生细胞特异性表达的蛋白质或基因(胰腺激素产生细胞标志物)的表达的有无，或者通过测量分泌到培养基中的胰腺激素的量，来验证胰腺激素产生前体细胞向胰腺激素产生细胞的诱导分化。标志物可以例举胰岛素、胰高血糖素、胰腺多肽、生长抑素、PCSKl (前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexinl型)、SURl (磺酰脲类受体1、别名·=ATP结合盒、C亚家族(CFTR/MRP)，成员8)、NKX6.1 (NK6同源框I)、PAX6 (成对框6)、NEUR0D (神经源性分化因子I)、ARX (无芒相关同源框)等。如上所述，本发明提供了从干细胞制备胰腺激素产生细胞的方法。通过类似的方法，即，诱导诱导分化状态较低的细胞分化为分化状态更高的细胞的方法，可以诱导干细胞分化为各种分化状态的细胞(内胚层细胞、胰腺导管细胞、胰腺内分泌细胞、胰腺外分泌细胞、其共同的细胞前体等)。可以通过验证每种细胞特异性表达的蛋白质或基因的表达的有无，了解诱导分化的水平。使用本发明的制备方法，可以有效诱导干细胞分化为胰腺激素产生细胞，从而可以大量供给具有高的胰腺激素分泌能力的胰腺激素产生细胞。可以利用所述胰腺激素产生细胞作为研发药物(特别是用于细胞疗法的药物)或糖尿病治疗药物的工具。2、包括本发明的细胞的药物本发明提供了包含通过上述本发明的制备方法或本发明的制备方法2制备的胰腺激素产生细胞(本发明的细胞)的药物。此外，本发明提供了包含通过上述本发明的制备方法(优选步骤(I)至(5 ))或本发明的制备方法2制备的胰腺激素产生前体细胞的药物(在本说明书中，有时缩写为本发明的药物)。在本发明的药物中，可以直接使用胰腺激素产生细胞或胰腺激素产生前体细胞，或作为如通过滤纸过滤等浓缩的细胞沉淀等的细胞团使用。此外，在该药物中也可以使用添加了 DMSO(二甲基亚砜)等的保护剂的冻干保存物。为了更安全的利用药物，热处理、放射处理等，可以在维持作为胰腺激素产生细胞的功能或作为胰腺激素产生前体细胞的功能，同时使病原体的蛋白质变性的程度条件下进行的处理。此外，为了防止胰腺激素产生细胞或胰腺激素产生前体细胞超过必需量的增殖，可以将细胞进行与上述处理组合的处理，例如用丝裂霉素C预处理等的生长抑制，向细胞中导入哺乳动物中天然缺失的代谢酶基因，然后必要时施用非活性药物，使药物仅在导入了哺乳动物中天然缺失的代谢酶基因的细胞中变为毒素，导致细胞死亡(自杀基因疗法)等。本发明的药物是安全低毒的，可以给药(移植)给哺乳动物(例如，人、小鼠、大鼠、豚鼠、猪、猴子等，优选人)。本发明的药物的给药量(移植量)是例如IXlO5 IXlOici细胞/个体，优选5 X IO7 I X 101°细胞/个体，更优选I X IO9 I X 101°细胞/个体。对于本发明的药物，优选使用患者本身的细胞或表现出患者可耐受的细胞或组织相容性类型的供体细胞制备的胰腺激素产生细胞。当由于年龄、体格等不能获得充分的细胞时，也可以通过将细胞包埋到聚乙二醇或硅胶的胶囊、多孔容器等中以避免排斥反应的状态进行移植。在此情况下，也可以是腹膜内或皮下移植。此外，可以根据接受给药的患者的年龄、体重、症状等，适当地改变本发明的药物的给药量(移植量)。在本发明的药物中，含有胰腺激素产生细胞的药物能够通过其自身的给药(移植)在患者体内产生(分泌)胰腺激素，并可用于治疗由于胰腺激素产生(分泌)低下导致的疾病。例如，含有胰岛素产生细胞的药物可用于治疗糖尿病(I型和II型，优选I型或胰岛素产生低下的II型，特别优选I 型)。另一方面，在本发明的药物中，在向患者给药(移植)含有胰腺激素产生前体细胞的药物后，通过在合适的条件下被诱导分化为胰腺激素产生细胞，能够产生(分泌)胰腺激素。3、筛诜方法本发明提供了筛选药物(优选糖尿病治疗药物)的方法(本说明书中有时简称为本发明的筛选方法)，特征在于使用通过选自下列步骤(I) (6)的任何一种以上的步骤获得的细胞:( I)在含有Rho激酶抑制剂的培养基中培养干细胞的步骤(2)在含有GSK3抑制剂的培养基中培养上述步骤(I)中获得的细胞的步骤(3)在含有GSK3抑制剂和活化素受体样激酶_4、7的激活剂的培养基中培养上述步骤(2)中获得的细胞的步骤(4)从上述(3)中获得的细胞形成细胞团，然后将该细胞团在培养基中以悬浮状态培养的步骤(5)在含有视黄酸受体激动剂、AMP活化蛋白激酶和/或活化素受体样激酶_2、3、6的抑制剂、活化素受体样激酶_4、5、7的抑制剂和细胞生长因子的培养基中培养上述步骤
(4)中获得的细胞的步骤(6)在培养基中培养上述步骤(5)中获得的细胞的步骤。可以以与本发明的胰腺激素产生细胞的制备方法的上述步骤(I) (6)相同的方式实施上述步骤(I) (6)用于筛选的细胞可例举通过上述步骤(I) (6)获得的胰腺激素产生细胞；通过上述步骤(I) (5)获得的胰腺激素产生前体细胞；通过上述步骤(I) (4)或上述步骤(I) (3)获得的内胚层细胞；通过上述步骤(I) (2)获得的细胞；通过上述步骤(I)获得的细胞。具体如下实施本发明的筛选方法(实施方案I)。
(a)在测试化合物存在下培养胰腺激素产生细胞和(b)在不存在测试化合物的条件下培养胰腺激素产生细胞，分别测量和比较该细胞内的胰腺激素表达量或该细胞向外的胰腺激素分泌量。胰腺激素的表达量可例举胰腺激素蛋白的表达量、编码胰腺激素蛋白的多核苷酸(例如，mRNA等)的表达量等。胰腺激素的表达量和分泌量的测定可以通过已知的方法，例如，可以使用识别胰腺激素的抗体，根据Western印迹分析、ELISA方法等或与其类似的方法，测量细胞提取液中、培养基中等存在的上述胰腺激素的方法进行。mRNA量的测定可以通过已知的方法，例如，Northern杂交、SI绘图法、PCR法、DNA芯片或阵列法，或与其类似的方法进行。对胰腺激素产生细胞培养没有特殊的限制，只要在可以表达和/或分泌胰腺激素的条件下进行即可，可以根据已知的方法进行。可用的培养基可以例举含有约I 20%胎牛血清的MEM培养基(Science，第122卷，501 (1952)等)、DMEM培养基(Virology，第8卷，396 (1959) )、RPMI1640 培养基(The Journal of the American Medical Association,第 199 卷,519 (1967))和 199 培养基(Proceeding of the Society for the BiologicalMedicine，第73卷，I (1950))。培养基的pH优选是约6 8。培养一般在约30° C 40° C进行约15小时 5天，必要时进行相应的通气或搅拌。测试化合物可以例举肽、蛋白质、抗体、非肽类化合物、合成化合物、发酵产物、细胞提取物、植物提取物、动物组织提取物、血浆。在本文中，测试化合物可以形成盐。该盐可使用与生理学可接受的酸、碱(例如，碱金属盐、碱土金属盐、铵盐)等的盐，此类盐可以例举例如与无机酸(例如，盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸)的盐、与有机酸(例如，醋酸、甲酸、丙酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)的盐、钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、钡盐、铝盐。例如，可以选择与上述(b)的情况相比，抑制(阻滞)上述(a)中的胰腺激素的表达量或分泌量约20%以上，优选约30%以上，更优选约50%以上的测试化合物作为抑制(阻滞)胰腺激素产生细胞中的胰腺激素表达的化合物。可以选择与上述(b)的情况相比，促进上述(a)中的胰腺激素的表达量或分泌量约20%以上，优选约30%以上，更优选约50%以上的测试化合物作为增强胰腺激素产生细胞中的胰腺激素表达或分泌的化合物。当胰腺激素产生细胞是胰岛素产生细胞时，增强胰岛素表达的化合物可用作糖尿病的治疗药物。当胰腺激素产生细胞是胰高血糖素产生细胞时，抑制(阻滞)胰高血糖素表达的化合物可用作糖尿病的治疗药物。本发明的筛选方法的另一个实施方案可以例举，(a)在测试化合物存在下培养胰腺激素产生细胞和(b)在不存在试化合物的条件下培养胰腺激素产生细胞，分别测定并比较该细胞的增殖能力的方法(实施方案2)。所使用的测试化合物可以提及与上述实施方案I中使用的测试化合物同样的化合物。此外，可以以与上述实施方案I相同的方式实施该实施方案中的细胞培养。作为测定细胞增殖能力的方法，可使用通常用于该领域中的方法，例如，计数细胞数的方法、评估3H, 5-溴-2’ -脱氧-尿苷(BrdU)等的摄入、ATP量、四唑化合物转化为甲臜产物的 量等的方法。例如，当胰腺激素产生细胞是胰岛素产生细胞时，显著促进胰岛素产生细胞增殖的化合物可用作糖尿病的治疗药物。当胰腺激素产生细胞是胰高血糖素产生细胞时，显著抑制(阻滞)胰高血糖素产生细胞增殖的化合物可用作糖尿病的治疗药物。本发明的筛选方法的另一个实施方案可以例举，(a)在测试化合物存在下培养胰腺激素产生前体细胞和(b)在不存在测试化合物的条件下培养胰腺激素产生前体细胞，分别测定并比较该细胞的分化程度的方法(实施方案3)。所使用的测试化合物可以提及与上述实施方案I中使用的测试化合物同样的化合物。此外，可以以与上述实施方案I相同的方式实施该实施方案中的细胞培养。可以通过例如胰腺激素产生前体细胞和/或胰腺激素产生细胞特异性表达的标志物的有无，检验胰腺激素产生前体细胞的分化程度。胰腺激素产生前体细胞的特异性标志物可以例举NGN3 (神经元素3)、PAX4 (成对框4)，胰腺激素产生细胞的特异性标志物可以例举胰岛素、胰高血糖素、胰腺多肽、生长抑素、饥饿素、PCSKl (前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexinl型)、SUR1 (磺酰脲类受体1、别名:ATP结合框、C亚家族(CFTR/MRP)成员8)、葡萄糖激酶、MAFA (v_maf肌腱膜纤维肉瘤原癌基因同源物A)、IAPP(胰岛淀粉样多肽)等。例如，当胰腺激素产生前体细胞是胰岛素产生细胞的前体细胞时，显著促进胰岛素产生细胞的前体细胞分化的化合物可用作糖尿病的治疗药物。当胰腺激素产生前体细胞是胰高血糖素产生细胞的前体细胞时，显著抑制(阻滞)胰高血糖素产生细胞的前体细胞分化的化合物可用作糖尿病的治疗药物。本发明的筛选方法的另一个实施方案可以例举，(a)在测试化合物存在下培养内胚层细胞和(b)在不存在测试化合物的条件下培养内胚层细胞，分别测定并比较该细胞的增殖或分化能力的方法(实施方案4)。所使用的测试化合物可以提及与上述实施方案I中使用的测试化合物同样的化合物。此外 ，可以以与上述实施方案I相同的方式实施该实施方案中的细胞培养。作为测量细胞增殖能力的方法，可使用通常用于该领域中的方法，例如计数细胞数的方法、评估3H, 5-溴-2’ -脱氧-尿苷(BrdU)等的摄入、ATP量、四唑化合物转化为甲臜产物的量等的方法。可以通过例如内胚层细胞的特异性标志物表达的有无，检验内胚层细胞的分化水平。内胚层细胞的特异性标志物可以例举a-feto蛋白、白蛋白、胃蛋白酶、肺表面活性蛋白等。一般而言，内胚层细胞的分化诱导或培养在技术上比中胚层或外胚层细胞困难，根据本筛选方法获得的化合物制备的细胞自身和/或内胚叶分化诱导体系可用于新的药物筛选系统。可以通过根据本发明的筛选方法获得保护(维持)胰腺激素产生细胞功能的药物等。本发明的筛选方法的其他实施方案可以例举，(a)在测试化合物存在下培养胰腺激素产生细胞和(b)在不存在测试化合物的条件下培养胰腺激素产生细胞，分别测定并比较该细胞的存活数或功能的方法(实施方案5)。所使用的测试化合物可以提及与上述实施方案I中使用的测试化合物同样的化合物。此外，可以以与上述实施方案I相同的方式实施该实施方案中的细胞培养。作为测定细胞存活数的方法，可使用通常用于该领域中的方法，例如计数细胞数的方法、评估3H, 5-溴-2’ -脱氧-尿苷(BrdU)等的摄入、ATP量、四唑化合物转化为甲臜产物的量等的方法。此外，除计数表现出形态学特征(染色质凝聚、核片段化、细胞收缩等)的细胞之外，还可以通过TUNNEL (TdT-介导的dUTP缺口末端标记)方法检测片段化DNA或检测活性半胱天冬酶的有无，测定7-AAD (7-氨基-放线菌素D)等的活细胞不透过性染料的核染色，细胞表面的磷脂酰丝氨酸暴露，线粒体膜的去极化，特定胞内蛋白质的切割或降解，来定量诱导凋亡后的细胞数。此外，作为确定细胞功能的方法，可例举测量对应于葡萄糖浓度的胰岛素或C-肽的分泌量或细胞膜电位改变的方法等。在这一实施方案中，在细胞培养过程中加入已知导致胰腺激素产生细胞功能障碍的因子(例如，炎性细胞因子、活性氧及其产生的诱导物质、高浓度脂肪酸、葡萄糖等)，测定并比较细胞的存活数或功能的方法。当胰腺激素产生细胞是胰岛素产生细胞时，对抗已知导致胰腺激素产生细胞功能障碍的因子，显著促进胰岛素产生细胞的存活或功能维持的化合物可用作糖尿病的治疗药物。可以将使用本发明的筛选方法获得的药物，使用生理学可接受的添加剂(例如，载体、香味剂、赋形剂、防腐剂、稳定剂、粘合剂)，通过常规手段进行制剂。因此获得的制剂的剂型可以例举:例如，必要时包糖衣的片剂、胶囊、酏剂、微胶囊等口服制剂；注射等非经口服的试剂。这些制剂中的活性成分的含量是例如0.1 90wt%。上述添加剂可以例举:例如明胶、玉米淀粉、黄芪胶、阿拉伯胶等粘合剂；结晶纤维素等赋形剂；例如玉米淀粉、明胶、海藻酸等膨胀剂；硬脂酸镁等润滑剂；蔗糖、乳糖、糖精等甜味剂；薄荷油、白珠树(Gaultheria adenothrix)油、楼桃等香味剂；油脂、注射用水、植物油(例如，芝麻油、棕榈油、大豆油)、缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲液、醋酸钠缓冲液)等液体载体；助溶剂(例如，乙醇、丙二醇、聚乙二醇)；非离子型表面活性剂(例如，聚山梨醇酯80 、HC0-50);助溶剂(例如，苯甲酸苄酯、苯甲醇);安抚剂(例如，苯扎氯铵、盐酸普鲁卡因)；稳定剂(例如，人血清白蛋白、聚乙二醇)；防腐剂(例如，苯甲醇、苯酚)；和抗氧化剂。上述注射用水可以例举:生理盐水；和含有葡萄糖、D-山梨糖醇、D-甘露糖醇、氯化纳等的等渗溶液。由于通过本发明的筛选方法获得的药物(优选糖尿病的治疗药物)是安全低毒的，因此可以以口服或不经 胃肠道的给药于例如哺乳动物(例如，人、小鼠、大鼠、兔、绵羊、猪、牛、马、猫、狗、猴子、黑猩猩)。根据药物的作用、目标疾病、给药对象、给药途径等适当地设定药物的剂量。
实施例下面通过实施例详细解释本发明，而不应将本发明限于以下实施例。实施例1 (I):诱导人iPS细胞分化为内胚层细胞(步骤(I) (3))通过下列方法实施将人iPS细胞诱导分化为内胚层细胞。首先，将细胞团的状态与饲养细胞一起培养维持的人iPS细胞(通过导入0ct3/4基因、Klf4基因和Sox2基因获得的iPS细胞:参见Nat Biotechnol2008 ；26:101_106)，使用用于灵长类ES细胞的细胞解离溶液(Repix)CELL Inc.)在细胞团的状态解离，将这些细胞转移到15ml离心管中，静置5分钟，通过去除上清液，去除饲养细胞。向离心管中沉淀的人iPS细胞中，加入0.25%胰蛋白酶-1mM EDTA溶液(GIBC0)，直到解离形成单个细胞。然后，按每个IOOmm培养皿15 X IO4个细胞的密度，将分散在培养基中的人 iPS 细胞接种在包被了 BD MatrigelCNippon Becton Dickinson Company, Ltd.)的培养皿中，在37° C、5%C02中培养I天。所使用的IOOmm培养皿是用无血清的DMEM/F12培养基(Invitrogen)将BD Matrigel稀释40倍并在室温包被3小时以上。用于分散和接种的培养基是添加了 IOuM Y-27632 (和光纯药)的用于灵长类ES细胞的培养基(IteproCELLInc.)。接种I天后，将培养基更换为含有GSK3 ^抑制剂CHIR99021 (3 u M)和2%B_27添加齐[J(GIBCO)的DMEM/F12培养基，培养2天。然后，将培养基更换为含有活化素A(50ng/ml)和 CHIR99021 (I u M)的 DMEM/F12 培养基，培养 2 天。为了检验培养人iPS细胞时内胚层分化标志物的表达改变，随时间回收诱导分化后的细胞，使用RNeasy96 (Qiagen)纯化总RNA级分。使用PrimeScriptRT试剂盒(TakaraBio Inc.)合成cDNA后，实施定量RT-PCR,测定原条标志物Brachyury和内胚叶标志物SOX17的基因表达量。图1显示了表达分析的结果。在培养第3天,Brachyury的表达量一过性上升，SOX17的表达量在第4天显著增加。由此可见，通过分化为原条，有效诱导了内胚层标志物的表达。为了检验S0X17蛋白质的表达，使用抗S0X17抗体实施免疫荧光染色。使用Accutase (Invitrogen) (商品名)将在IOOmm培养皿中诱导分化获得的内胚层细胞解离成单个的细胞，按4X IO4个细胞的密度，接种在纤连蛋白包被的96孔板中，在37° (:、5%0)2中培养I天。通过用DMEM/F12将纤连蛋白(BD)稀释20倍并在室温静置3小时进行纤连蛋白包被。接种时的培养基，使用含有1%B_27添加剂的Improved MEM Zinc Option培养基(Invitrogen)。在培养后,添加4%多聚甲醒,在室温孵育30分钟进行细胞固定。培养后的细胞与作为一抗的抗人S0X17抗体(AF1924，R&D)，然后与作为二抗的Alexa488标记的二抗(Invitrogen)相继反应后，用Hoechst33342对细胞核染色，并用荧光显微镜观察。结果显示在图2中。结果观察到大部分细胞表达S0X17蛋白。根据上述研究可见，可以通过在添加了 CHIR99021和B-27添加剂的DMEM/F12培养基中培养2天，再在添加了活化素A和CHIR99021的DMEM/F12培养基中培养2天，不使用饲养细胞和血清，可有效诱导分化为内胚层细胞。实施例1(2):研究了在步骤(2)中除CHIR99021外的GSK3抑制剂(BIO)的内胚层诱导。接种人iPS细胞I天后，用含有CHIR99021(3iiM)和2%B_27添加剂(GIBCO)的DMEM/F12培养基更换培养基，培养2天。然后，一方面，更换为含有CHIR99021(3iiM)作为GSK3抑制剂并含有活化素A(100ng/ml)以及2%B_27添加剂(GIBCO)的DMEM/F12培养基，继续培养(图3中标为“活化素 A+CHIR99021”)。另一方面，更换为含有BIO (0.5 PM)作为GSK3抑制剂并含有活化素A (100ng/ml)以及2%B-27添加剂(GIBCO)的DMEM/F12培养基，继续培养(图3中标为“活化素A+B10”)。随时间测定人iPS细胞培养时的S0X17的基因表达量。表达分析的结果显示在图3中。不论使用CHIR99021或B10，SOX17的表达量都自培养第4天显著增加，并观察到同样的表达模式。结果说明通过使用除CHIR99021以外的GSK3抑制剂也可以诱导内胚层。实施例2:诱导内胚层细胞分化为胰腺激素产生细胞「步骤(4) (6) I从分化成内胚层细胞的细胞形成细胞团，之后进一步诱导分化成胰腺激素产生细胞的前体细胞，然后，诱导分化成胰腺激素产生细胞。
使用Accutase (Invitrogen)(商品名)解离在IOOmm培养皿中诱导分化的内胚层细胞，直到形成单个的细胞。然后，按每孔2X IO4个细胞的密度，将分散在培养基中的内胚层细胞接种在96孔球形板(SUMITOMO BAKELITE)中，在37° C、5%C02中培养I天，形成细胞团。用于分散和接种的培养基，使用含有1%B_27添加剂的Improved MEM ZincOption培养基。在内胚层细胞接种I天后，将培养基更换为含有1%B_27添加剂并添加了dorsomorphin (I u M)、视黄酸(2 u M)、SB431542 (10 u M)和 bFGF (50ng/ml)的 Improved MEMZinc Option培养基，在37° C、5%C02的条件下培养8天，在第4天进行一次培养基换液。在培养8天后，将培养基更换为含有1%B_27添加剂的Improved MEM Zinc Option培养基，进一步培养细胞。之后，每3 4天进行培养基换液。在内胚层接种I天后，用dorsomorphin、视黄酸、SB431542和bFGF的组合培养细胞8天后，将培养基更换为含有1%B_27添加剂的Improved MEMZinc Option培养基，继续培养，此时胰岛素表达的分析结果显示在图4中。在将培养基更换为含有1%B_27添加剂的Improved MEM Zinc Option培养基培养的第13天的时间点,很少观察到胰岛素表达,但从培养第15天开始显著增加。作为比较例，接种内胚层细胞，I天后，用dorsomorphin、视黄酸和SB431542的组合培养细胞8天后，将培养基更换为含有1%B_27添加剂的Improved MEM Zinc Option培养基，继续培养。培养第19天的表达分析结果显示在图5中。与使用dorsomorphin、视黄酸和SB431542的组合培养的情况相比，使用dorsomorphin、视黄酸、SB431542和bFGF的组合培养在第19天时，胰岛素表达显示出更高的值。然后，为了检验胰岛素和胰高血糖素的蛋白质表达，使用抗胰岛素抗体实施免疫荧光染色。在内胚层细胞接种I天后，添加dorsomorphin、视黄酸、SB431542和bFGF，培养细胞8天后，将培养基更换为含有1%B_27添加剂的Improved MEM Zinc Option培养基，进一步培养细胞8天。在培养后，使用4%多聚甲醛，在4° C固定细胞3小时，将培养细胞包埋在OCT化合物(Tissue-tek)中， 制备IOym厚的冷冻切片。然后，细胞相继与作为一抗的抗胰岛素抗体(A0564，DAK0)或抗胰高血糖素抗体(G2654，SIGMA)反应，然后与作为二抗的 Alexa568 标记的二抗(Invitrogen)或 Alexa488 标记的二抗(Invitrogen)反应,用H0echst33342染色细胞核，并用荧光显微镜观察。免疫荧光染色的结果显示在图6中。在球形内部发现了大量表达胰岛素的细胞，也发现了一部分表达胰高血糖素的细胞。实施例3:诱导人iPS细胞分化为胰腺激素产生细胞「步骤(I) (6);使用BD MatriRel或纤连蛋白诱导分化为内胚层细胞，和诱导分化为胰腺激素产生细胞I通过下列方法实施将人iPS细胞诱导分化为内胚层细胞。首先，按实施例1相同的方式，将维持在细胞团状态的人iPS细胞解离，直到形成单个的细胞。然后，一方面，按每个用纤连蛋白(Invitrogen)包被的IOOmm培养皿60X IO4个细胞的密度，接种分散在培养基中的人iPS细胞，在37° C、5%C02中培养I天。所使用的IOOmm培养皿是用无血清的DMEM/F12培养基(Invitrogen)将纤连蛋白稀释40倍并在室温包被3小时以上(图7中标为“纤连蛋白”)。另一方面，按每个用BD Matrigel (Nippon Becton Dickinson Company, Ltd.)包被的IOOmm培养皿15 X IO4个细胞的密度，接种分散在培养基中的人iPS细胞，在37° C、5%C02中培养I天。所使用的IOOmm培养皿是用无血清的DMEM/F12培养基(Invitrogen)将BD Matrigel稀释40倍并在室温下包被3小时以上(图7中标为“Matrigel”)。而且，用于分散和接种的培养基是添加了 IOyM Y-27632 (和光纯药)的用于灵长类ES细胞的培养基(IteproCELL Inc.)。在接种I天后，将培养基更换为含有GSK3 P抑制剂CHIR99021 (3 u M)和2%B_27添加剂(GIBCO)的DMEM/F12培养基，培养2天。然后，将培养基更换为含有活化素A(50ng/ml)和CHIR99021 (I u M)的DMEM/F12培养基，培养2天。按实施例2相同的方式，从分化为内胚层细胞的细胞形成细胞团，之后进一步分化诱导为胰腺激素产生细胞的前体细胞，然后分化诱导为胰腺激素产生细胞。按实施例2相同的方式，在内胚层细胞接种I天后，用dorsomorphin、视黄酸、SB431542和bFGF的组合培养细胞8天，将培养基更换为含有1%B_27添加剂的ImprovedMEM Zinc Option培养基,诱导分化,进行各种分化标志物随时间的表达分析。表达分析的结果显示在图7中。内胚层标志物S0X17的表达随分化显著减少，而胰腺前体细胞标志物(PDXl)和胰腺激素产生细胞的前体细胞的标志物(NGN3)的表达逐步增加至培养第17天。从培养第17天开始，胰岛素的表达显著增加。各种分化标志物的随时间的表达变化在使用BDMatrigel或纤连蛋白作为底物诱导的内胚层细胞之间是几乎相同的。BD Matrigel是从Engelbreth-HoIm-Swarm (EHS)小鼠肉瘤细胞提取的基底膜制品。另一方面，该实施例中使用的纤连蛋白是从人血衆中通过亲和色谱提取的。由此可见，与使用BD Matrigel(实施例1和2)的情况一样，使用纤连蛋白也可以诱导分化为胰腺激素产生细胞。通过研究上述实施例1-3可知，可以使用如下图8中显示的胰腺分化诱导体系诱导分化为胰腺激素产生细胞:用内胚层细胞形成球体，在含有1%B_27添加剂并添加了dorsomorphin、视黄酸、SB 431542 和 bFGF 的 Improved MEM Zinc Option 培养基中培养细胞8天，然后，将培养基更换为含有1%B_27添加剂的Improved MEM Zinc Option培养基，培养细胞。通过本发明的方法制备的胰腺激素产生细胞比其他方法制备的胰腺激素产生细胞具有更好的胰岛素产生量。工业实用性根据本发明的制备方法，可以从干细胞产生出更接近胰腺生成的形态的胰腺激素产生细胞。此外，本发明的细胞可用于筛选用于预防和/或治疗糖尿病等由胰腺激素生产和/或分泌异常导致的疾病(例如)的化合物。此外，由于本发明的细胞可用于治疗此类疾病的细胞疗法和保持了三维结构，因此与根据常规制备方法获得的胰腺激素产生细胞相比，更适合细胞疗法的应用。该申请基于在日本提交的专利申请号2010-178523，其内容全部包含在本申请中。
权利要求
1.制备胰腺激素产生细胞的方法，该方法包括使干细胞经历下列步骤(I) (6): (1)在含有Rho激酶抑制剂的培养基中培养干细胞的步骤 (2)在含有GSK3抑制剂的培养基中培养上述步骤(I)中获得的细胞的步骤 (3)在含有GSK3抑制剂和活化素受体样激酶_4、7的激活剂的培养基中培养上述步骤(2)中获得的细胞的步骤 (4)从上述(3)中获得的细胞形成细胞团，然后将该细胞团在培养基中以悬浮状态培养的步骤 (5)在含有视黄酸受体激动剂、AMP活化蛋白激酶和/或活化素受体样激酶_2、3、6的抑制剂、活化素受体 样激酶_4、5、7的抑制剂和细胞生长因子的培养基中培养上述步骤(4)中获得的细胞的步骤 (6)在培养基中培养上述步骤(5)中获得的细胞的步骤。
2.根据权利要求1的制备方法，其中步骤(3)中的活化素受体样激酶_4、7的激活剂是活化素。
3.根据权利要求1的制备方法，其中步骤(I)中的Rho激酶抑制剂是(+)_(R)_反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环己烷甲酰胺二盐酸盐。
4.根据权利要求1的制备方法，其中步骤(2)和(3)中的GSK3抑制剂是 (i ) 6-[ [2-[ [4- (2，4- 二氯苯基)-5- (4-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]烟腈和/或(ii)(2，Z, 3，E) _6_ 漠親玉红 _3’ -月亏。
5.根据权利要求1的制备方法，其中步骤(5)中的视黄酸受体激动剂是视黄酸。
6.根据权利要求1的制备方法，其中步骤(5)中的AMP活化蛋白激酶和/或活化素受体样激酶_2、3、6的抑制剂是6-[4-(2-哌啶-1-基乙氧基)苯基]-3-吡啶-4-基吡唑并[I, 5-a]嘧啶。
7.根据权利要求1的制备方法，其中步骤(5)中的活化素受体样激酶_4、5、7的抑制剂是4-[4-(1, 3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑_2_基]-苯甲酰胺。
8.根据权利要求1的制备方法，其中步骤(5)中的细胞生长因子是碱性成纤维细胞生长因子。
9.根据权利要求1的制备方法，其中步骤(I) (6)中基本上不使用饲养细胞。
10.根据权利要求1的制备方法，其中步骤(I) (6)中的培养基基本上不含血清。
11.根据权利要求1的制备方法，其中干细胞是诱导性多能干细胞(iPS细胞)、胚胎干细胞(ES细胞)或人成体干细胞。
12.根据权利要求1的制备方法，其中胰腺激素产生细胞是选自下列的任何细胞:胰岛素产生细胞、胰高血糖素产生细胞、生长抑素产生细胞、胰腺多肽(PP)产生细胞和饥饿素产生细胞。
13.制备胰腺激素产生细胞的方法，该方法包括使内胚层细胞经历下列步骤(4’)和(5，): (4’ )从内胚层细胞形成细胞团，并将该细胞团在培养基中以悬浮状态培养的步骤 (5’ )在含有视黄酸受体激动剂、AMP活化蛋白激酶和/或活化素受体样激酶_2、3、6的抑制剂、活化素受体样激酶_4、5、7的抑制剂和细胞生长因子的培养基中培养上述步骤(4’)中获得的细胞的步骤。
14.包含通过权利要求1或13的制备方法获得的胰腺激素产生细胞的药物。
15.筛选糖尿病治疗药物的方法，该方法包括使用通过选自下列步骤(I) (6)中的任何一个或多个步骤获得的细胞: (1)在含有Rho激酶抑制剂的培养基中培养干细胞的步骤 (2)在含有GSK3抑制剂的培养基中培养上述步骤(I)中获得的细胞的步骤 (3)在含有GSK3抑制剂和活化素受体样激酶_4、7的激活剂的培养基中培养上述步骤(2)中获得的细胞的步骤 (4)从上述(3)中获得的细胞形成细胞团，然后将该细胞团在培养基中以悬浮状态培养的步骤 (5)在含有视黄酸受体激动剂、AMP活化蛋白激酶和/或活化素受体样激酶_2、3、6的抑制剂、活化素受体样激酶_4、5、7的抑制剂和细胞生长因子的培养基中培养上述步骤(4)中获得的细胞的步骤 (6)在培养基中培养上述步骤(5)中获得的细胞的步骤。
全文摘要
本发明的目的是提供由干细胞制备胰腺激素产生细胞的方法，所述细胞更接近胰腺生成的形式。制备胰腺激素产生细胞的方法的特征在于使干细胞经历下列步骤(1)～(6)(1)在含有Rho激酶抑制剂的培养基中培养干细胞的步骤；(2)在含有GSK3抑制剂的培养基中培养上述步骤(1)中获得的细胞的步骤；(3)在含有GSK3抑制剂和活化素受体样激酶-4、7的激活剂的培养基中培养上述步骤(2)中获得的细胞的步骤；(4)从上述(3)中获得的细胞形成细胞团后，将该细胞团置于培养基中以悬浮状态培养的步骤；(5)将上述步骤(4)中获得的细胞在含有视黄酸受体激动剂、AMP活化蛋白激酶和/或活化素受体样激酶-2、3、6的抑制剂、活化素受体样激酶-4、5、7的抑制剂和细胞生长因子的培养基中培养的步骤；(6)在培养基中培养上述步骤(5)中获得的细胞的步骤。
文档编号C12Q1/02GK103154240SQ201180048849
公开日2013年6月12日 申请日期2011年8月8日 优先权日2010年8月9日
发明者细谷昌树, 庄司昌伸 申请人:武田药品工业株式会社
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