粘附细胞用培养容器以及粘附细胞用培养容器的制造方法

xiaoxiao2020-6-24  6

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专利名称:粘附细胞用培养容器以及粘附细胞用培养容器的制造方法
技术领域
本发明涉及细胞的培养技术,特别是涉及用于在培养时培养需要以容器壁等作为基点的粘附细胞的粘附细胞用培养容器以及粘附细胞用培养容器的制造方法。
背景技术
近年来,在医药品的生产、基因治疗、再生医疗、免疫疗法等领域中,要求在人工环境下高效地大量培养细胞和组织、微生物等。这样的状況下,在培养容器(培养袋)中填充细胞和培养液,在封闭系统中自动地大量培养细胞。对于这样的培养容器,需要细胞培养所必需的透气性和耐久性、制袋所必需的热密封强度等,因此,在该材料中优选使用具备这些性质的聚烯烃类树脂。但是,在使用由聚烯烃类树脂构成的培养容器的情况下,可以适合培养浮游类的细胞,但在培养时需要以容器壁等作为基点的粘附细胞,以往存在不能高效地培养的问题。即,由于粘附细胞粘附在培养容器的壁上,因此,通常在培养面上需要适度的润湿性,需要为亲水性。但是,由聚烯烃类树脂构成的培养容器的表面为疏水性,因此,粘附细胞无法充分地粘附在培养面上,无法得到高增殖效率。为了解决这样的问题,提出了:在进行培养容器的制袋前,对于构成培养容器的膜的培养面,进行通过电晕放电(参照专利文献I)和UV-臭氧法(参照专利文献2,3)的亲水化处理。专利文献1:日本特开平6-98756号公报专利文献2:日本特开2009-27944号公报专利文献3:日本特开2009-27945号公报

发明内容
发明所要解决的问题但是,进行这样的亲水化处理时,膜的热密封强度大幅降低,因此,产生不能适当地进行培养容器的制袋这样的新问题。而且,为了解决这样的问题,在专利文献3中提出了如下的方案:遮盖膜中的要进行热密封的部分,实施UV-臭氧法。但是,该方法中,存在制造工序变烦杂的问题。另外,如上所述对膜的培养面进行亲水化处理的情况下,在表面处理时露出培养面,因此,难以无菌地制造培养容器,也存在需要洁净度高的制造环境的问题。本发明人进行了深入的研究,通过对构成培养容器的树脂照射一定的紫外线,不会使培养面亲水化,并且成功地使在培养容器中进入培养液的状态下的粘附细胞相对于培养面的细胞粘附率显著地提高,从而完成了本发明。 即,本发明的目的在于,提供一种粘附细胞用培养容器以及粘附细胞用培养容器的制造方法,其中,所述粘附细胞用培养容器中,在将由聚烯烃构成的培养容器的一部分内面或整个内面中的静态水接触角维持在高状态下保持疏水性,在该状态下,使滞后(水滑落时的前进接触角-后退接触角)大于一定值,由此,使细胞粘附率提高,能够适当地培养粘附细胞。用于解决问题的方法为了实现上述目的,本发明的粘附细胞用培养容器是由至少在最内层具有聚烯烃的层的单层或多层的膜或片构成的粘附细胞用培养容器,得到如下构成:培养容器的一部分内面或整个内面中的静态水接触角为95 °以上,并且水滑落时的前进接触角以及后退接触角满足下述式(I)。另外,本发明的粘附细胞用培养容器的制造方法为如下方法:对至少在最内层具有聚烯烃的层的单层或多层的膜或片实施除去了臭氧发生波长的紫外线照射,以静态水接触角为95°以上、并且水滑落时的前进接触角以及后退接触角满足下述式(I)的方式形成由该膜或片构成的培养容器的一部分内面或整个内面。另外,本发 明的粘附细胞用培养容器的制造方法为如下方法:对聚烯烃的颗粒实施除去了臭氧发生波长的紫外线照射,形成至少在最内层具有聚烯烃的层的单层或多层的膜或片,以静态水接触角为95°以上、并且水滑落时的前进接触角以及后退接触角满足下述式(I)的方式形成由膜或片构成的培养容器的一部分内面或整个内面。前进接触角-后退接触角> 25。...(式I)发明效果根据本发明,不需要必要以上的洁净度高的制造环境和遮盖这样的复杂的制造工序,可以制造能高效地培养粘附细胞的培养容器。


图1是表示利用本发明的粘附细胞用培养容器的细胞粘附率的提高以及热密封强度降低的抑制的图。图2是表示本发明中的通过紫外线照射产生的构成粘附细胞用培养容器的膜的特性(接触角)的变化的图。图3是表示本发明中的通过紫外线照射产生的构成粘附细胞用培养容器的膜的特性(滞后)的变化的图。图4是表示本发明的粘附细胞用培养容器的制造工序的图。图5是表示本发明的粘附细胞用培养容器的制造工序中的紫外线照射的对象(膜、培养容器、制膜中的膜)的图。图6是表示使用本发明的粘附细胞用培养容器的细胞培养中的细胞粘附机理的图。图7是表示实施例以及比较例中的接触角的测定方法以及滞后的测定方法的图。图8是表示实施例以及比较例中的实验条件、和细胞粘附率、滞后以及热密封强度的图。图9是表示实施例以及比较例中的滞后与细胞粘附率的关系的图。
具体实施方式
以下,对本发明的粘附细胞用培养容器以及粘附细胞用培养容器的制造方法的一个实施方式详细地进行说明。(培养容器)1.材料本实施方式的粘附细胞用培养容器是以软包材料作为材料将膜进行制膜、使用该膜形成袋状(袋型)的培养容器。在该培养容器中封入培养液和细胞,进行细胞培养。另夕卜,培养容器在细胞培养时,通过按压板按压,或每隔一定时间通过显微镜进行培养细胞的拍摄等。由此,对该材料要求用于培养细胞所需要的透气性和耐久性、高热密封强度,另外,为了能够确认内容物,要求具有透明性。因此,作为满足这样的条件的材料,可以优选使用聚乙烯和聚丙烯等聚烯烃类树脂。另外,膜可以为单层,也可以由二层以上的多层构成,由多层构成的情况下,也可以层叠不同的树脂种类和品种的聚烯烃类树脂来构成。如果至少在最内层具有聚烯烃的层,则也可以在其他层使用其他树脂。需要说明的是,膜也可以以片的形式构成。另外,作为本实施方式的粘附细胞用培养容器的材料,优选使用在聚烯烃类树脂中含有抗氧化剂的材料。这是由于,通过含有抗氧化剂,进行一定的紫外线照射,如后所述可以使构成粘附细胞用培养容器的膜的滞后增大,在封入培养液时,提高培养面的亲水性,能够使细胞的粘附性提闻。作为这样的抗氧化剂,没有特别的限定,例如,酚类抗氧化剂、和磷类抗氧化剂由于细胞毒性低,能够适当地提高滞后,因此优选。2.紫外线照射处理另外,本实施方式的粘附细胞用培养容器中,通过对这样的聚烯烃类树脂照射一定的紫外线,使其性质改性,使构成培养容器的膜的特性发生变化。此时,使用由聚烯烃类树脂构成的膜,将培养容器进行制袋后,从培养容器的外侧实施紫外线照射处理,由此,能够使容器内部的培养面的特性发生变化。在该膜特性的变化中,如后所述,培养面的接触角未见大变化,因此,没有进行培养面的亲水化。另一方面,对于本实施方式的粘附细胞用培养容器而言,通过照射一定的紫外线,培养面的滞后(接触角滞后)增大。其结果,将培养液封入培养容器中时,培养面的亲水性增高,细胞粘附率提高。本实施方式的紫外线照射中,使用没有照射臭氧发生波长(185nm)的紫外线源。例如,可以优选使用能够通过石英管等截断臭氧发生波长的、主波长254nm的低压水银灯等ο这样,本实施方式的粘附细胞用培养容器中,通过对聚烯烃类树脂照射除去了臭氧发生波长的紫外线,因此,几乎不会使照射后的培养面的接触角发生变化,能够使细胞粘附率提闻。即,本实施方式的粘附细胞用培养容器中,没有使培养面亲水化,因此,可以不使培养面露出来而制造粘附细胞用培养容器。另外,由于这样没有使培养面亲水化,因此,膜的热密封强度的降低少。因此,在培养容器的制袋前,即使对膜进行紫外线照射,也能够没有问题地进行培养容器的制造。另一方面,专利文献2中记载的UV-臭氧法中,通过包含臭氧发生波长的紫外线照射,进行培养面的亲水化(实施例中,接触角从104°降低至71° )。即可以认为,通过使用包含臭氧发生波长的紫外线,引起由于空气中的氧气而产生的臭氧与材料表面的直接反应,进行培养面的亲水化。另外,专利文献2中,作为容器材料使用容易亲水化、并且容易得到稳定性的易亲水化树脂,特别是使用玻璃化转变温度高的树脂。这些材料由于常温下分子链不会运动,因此认为,进行表面的亲水化后,亲水基难以潜入树脂内部,得到亲水化的稳定性。相对于此,本实施方式的粘附细胞用培养容器中,使用聚乙烯或聚丙烯作为材料,但它们在常温下分子链能够运动,与空气中亲水基在表面上存在相比,在树脂的内侧存在的方式在热力学上更稳定,因此认为,即使含有亲水性官能团,如果是少量也难以在表面上露出,其结果,表面难以发生亲水化。3.细胞粘附率根据本实施方式的粘附细胞用培养容器,相对于培养容器的内面的细胞粘附率显著提高。图1(a)示出了本实施方式中的进行了紫外线照射的粘附细胞用培养容器、和在除了没有进行本实施方式中的紫外线照射之外的其他方面与本实施方式的粘附细胞用培养容器在同一条件下制造的培养容器的细胞粘附率。该图中的细胞粘附率示出了后述的实施例I以及比较例I的细胞粘附率,为培养粘附细胞28小时后的粘附细胞数相对于浮游的细胞与粘附的细胞的总数的百分率。如该图所示,通过本实施方式的紫外线照射,细胞粘附率从3.2%增加至80.8%。这样,根 据本实施方式的粘附细胞用培养容器,能够显著增加细胞粘附率,因此,可以大幅提高粘附细胞的培养效率。4.热密封强度根据本实施方式的粘附细胞用培养容器,与以往相比能够抑制由提高相对于培养容器的内面的细胞粘附率而引起的热密封强度的降低。图1(b)示出了本实施方式中的进行紫外线照射的粘附细胞用培养容器、除没有进行本实施方式中的紫外线照射外其他方面与本实施方式的粘附细胞用培养容器在同一条件下制造的培养容器、除没有进行本实施方式中的紫外线照射而是进行电晕放电处理外其他方面与本实施方式的粘附细胞用培养容器在同一条件下制造的培养容器的热密封强度。这些热密封强度基于最大试验力,分别示出了后述的实施例1、2、5(该图的UV处理)、比较例1、2、7(该图的未处理)、比较例14、15、16(该图的电晕处理)的热密封强度。如该图所示可知,以往方法的电晕放电处理中,与未处理的培养容器比较,热密封强度大幅降低,相对于此,本实施方式的进行紫外线照射处理的粘附细胞用培养容器中,抑制热密封强度的降低。这样,根据本实施方式的粘附细胞用培养容器,能够抑制热密封强度降低,因此,在制袋前,即使进行紫外线照射,也能够适当地制造粘附细胞用培养容器。5.接触角接着,参照图2,对接触角进行说明。细胞培养容器中的培养面的亲水性与培养面的接触角相关。本实施方式中的接触角是在静止的液体的表面与固体壁相接触的部位的液面与固体面所成的角(图2的Θ s),是指静态水接触角。存在接触角大的情况下表面的疏水性强、接触角小的情况下表面的亲水性强的关系。通常已知,适合粘附细胞的培养的培养面的接触角据称约60° 80° (Jurnal ofBiomedical Materials Research, Vol.28,783-789 (1994)),接触角如果在该范围内,则培养面的亲水性高,粘附细胞适当地粘附在培养面上。图2中示出了,本实施方式中的进行紫外线照射的粘附细胞用培养容器、除没有进行本实施方式中的紫外线照射外其他方面与本实施方式的粘附细胞用培养容器在同一条件下制造的培养容器中的培养面的接触角,分别与后述的实施例1和比较例I的接触角(分别 101.9±1.7°、102.7±1° )相对应。由此可知,通过本实施方式中的紫外线照射,培养面的接触角几乎没有变化,没有进行培养面的亲水化。因此,本实施方式的粘附细胞用培养容器尽管进行紫外线照射,热密封强度的降低也得到抑制。另外,这样如果培养面没有被亲水化,则以往粘附细胞不能充分地粘附于培养面上,但本实施方式的粘附细胞用培养容器,没有使培养面亲水化,却能够使粘附细胞在培养面上的粘附率提闻。另外,本实施方式的粘附细胞用培养容器的接触角优选为95°以上。这是由于,接触角小于95°时,培养面的亲水性增高,热密封强度大幅降低。这样,通过本实施方式中的紫外线照射,粘附细胞用培养容器的一部分内面或整个内面的区域中的接触角达到95°以上,能够抑制热密封强度的降低。6.滞后根据本实施方式中的紫外线照射,能够使构成细胞培养容器的膜的滞后增大。在此所谓的滞后为接触角滞后,表示水滴滑落培养面时的前进接触角(0a)与后退接触角(Θ r)之差(滑落时滞后(Θ a- Θ r))。即,将水滴滴加到水平地支撑的表面上,缓慢地倾斜表面,基于液滴开始掉下时的前进接触角和后退接触角进行计算。该滞后作为表示表面的动态润湿性的指标使用。图3示出了本实施方式中的进行紫外线照射的粘附细胞用培养容器、和除没有进行本实施方式的紫外线照射外其他方面与本实施方式的粘附细胞用培养容器在同一条件下制造的培养容器的滞后,分别与后述的实施例1和比较例I的滞后(分别27.8°、
16.1° )对应。由此可知,通过本实施方式中的紫外线照射,培养面的滞后大幅增大,培养面的动态润湿性提闻。因此,本实施方式的粘附细胞用培养容器通过紫外线照射,尽管培养面没有被亲水化,但其动态润湿性也提高,其结果,能够使细胞粘附率提高。本实施方式的粘附细胞用培养容器中的滞后,优选水滑落时的前进接触角以及后退接触角显示出满足下 述式(I)的值。前进接触角-后退接触角> 25。...(式I)这是由于,由后述的实施例可知,滞后在25。以下的情况下,无法得到充分的细胞粘附率,相对于此,滞后大于25°时,细胞粘附率显著提高。
另外,滞后大于25°的区域可以为粘附细胞用培养容器整体,也可以为粘附细胞用培养容器的一部分内面或整个内面。这是由于,即使为粘附细胞用培养容器的一部分内面,如果滞后大于25。,则也能够使该区域的细胞粘附率提高,细胞增殖效率提高。(粘附细胞用培养容器的制造方法)本实施方式的粘附细胞用培养容器的制造方法中,以聚烯烃类树脂作为材料,进行除去臭氧发生波长的紫外线照射,除此以外,可以通过通常的方法进行,例如,如图4所示,可以包括以下的工序。首先,通过挤出成形和热压将聚烯烃类树脂构成的树脂颗粒进行制膜,形成膜(或片)。该树脂颗粒的制造时,优选使聚烯烃类树脂中含有酚类或磷类的抗氧化剂。这是由于,通过这样使聚烯烃类树脂中含有抗氧化剂,能够适当地增大进行紫外线照射时的聚烯烃类树脂的滞后。接着,将该膜制袋,制造粘附细胞用培养容器。对于本实施方式中的紫外线照射而言,如图5(a)所示,可以在将膜制袋形成培养容器后进行。即,对于本实施方式中的紫外线照射而言,由于没有使培养面亲水化,因此,也可以不对培养面直接照射,从由膜或片形成的封闭区域的外侧实施,由此,能够使培养面的滞后增大。另外,通过这样从封闭区域的外侧实施紫外线照射,可以得到容易保证培养面的无菌性的效果。另外,对于本实施方式中的紫外线照射而言,如图5(b)所示,也可以对制袋前的膜或片进行。另外,如图5 (C)所示,也可以从吹胀膜开始卷绕膜的期间进行紫外线照射。另夕卜,如图4所示,也可以对树脂颗粒进行紫外线照射。

S卩,本实施方式中的紫外线照射不包含臭氧发生波长,因此,被照射的膜的表面没有被亲水化,膜的热密封强度没有大幅降低。因此,在制袋前,即使对膜或片进行紫外线照射,也能够适当地制袋,可以不包含像以往方法那样的将进行热密封的部分遮盖的烦杂的工序,来制造粘附细胞用培养容器。(粘附机理)接着,对在本实施方式的粘附细胞用培养容器上粘附粘附细胞的机理进行说明。已知粘附细胞通常如下所示在培养容器等的基材上粘附。首先,在培养液中包含的粘附蛋白(例如,纤维连结蛋白和玻璃粘连蛋白)吸附到基材。接着,在粘附细胞的表面的整合蛋白等与粘附蛋白相互作用而进行粘附。由此,粘附细胞在基材上粘附并伸展。这样可以认为,粘附蛋白具有细胞粘附的部位,但基材为疏水性的情况下,该部位与基材表面相互作用,与细胞的相互作用受到了抑制。需要说明的是,基材的表面为过量地亲水性的情况下,最初粘附蛋白不能吸附到基材上,粘附细胞也不能吸附。通过本实施方式中的紫外线照射,粘附细胞用培养容器的培养面的接触角不发生变化,滞后增高,结果推定,细胞粘附率提高是由于以下的理由。首先,如图6所示,通过紫外线照射,从构成本实施方式的粘附细胞用培养容器的聚烯烃类树脂产生来自树脂的RO0.。另外,来自树脂的RO0.与聚烯烃类树脂中含有的抗氧化剂反应,该抗氧化剂中的自由度增加的酯键部分根据材料表面的环境发生移动。
其结果,将培养液封入粘附细胞用培养容器中,培养面在水中润湿时,亲水基在培养面上露出,从而能够吸附水。其结果,滞后增高,细胞粘附率提高。另一方面,本实施方式的粘附细胞用培养容器的培养面与空气接触的情况为亲水基藏入树脂中的状态,因此认为,培养面成为疏水性,接触角不发生变化。如以上所说明,根据本实施方式的粘附细胞用培养容器及其制造方法,对于由聚烯烃类树脂构成的培养容器进行除去臭氧发生波长的紫外线照射,由此,使培养面的接触角和滞后为规定的范围,能够在不使培养面亲水化的情况下,使细胞粘附率提高。因此,可以不需要必要以上的洁净度高的制造环境和遮盖这样的复杂的制造工序,提供显示出优良的细胞粘附率的粘附细胞用培养容器。实施例

以下,对于用于评价本实施方式的粘附细胞用培养容器的性能以及特性而进行的实施例以及比较例,参照图7 图9进行说明。首先,对实施例以及比较例中所使用的培养容器涉及的、1.制膜、紫外线照射以及电晕处理的方法、2.细胞粘附性能的评价方法、3.接触角以及滞后的测定方法、以及4.热密封强度的测定方法依次进行说明。〈1.制膜、紫外线照射以及电晕处理的方法〉制膜使用LABO PLAST MILL(东洋精机制作所制)通过挤出成形进行。另外,在一部分的实施例以及比较例中,使用热压(庄司铁钢制)进行制膜。紫外线照射中使用UV灯(主波长254nm、臭氧发生波长185nm通过石英管截断,商品名TUV15W/G15T8,飞利浦公司制)。需要说明的是,实施例或比较例中,在制袋后进行紫外线照射的情况以及在制袋前进行紫外线照射情况(对于膜直接紫外线照射),以累积光量5J/cm2进行。其是将膜距离灯12cm照射2小时。另外,对树脂颗粒进行紫外线照射以累积光量lOJ/cm2进行。其是在灯附近放置膜照射2小时。累积光量用紫外线累积光量计UIT-150 (Ushio电机株式会公司制)测定。电晕处理中使用高频电源装置CG_102(春日电机株式会公司制)。另外,此时,将施加电流设为3.5A、将膜与电极之间的距离设为5mm、将膜移动速度设为5m/分钟,进行电晕放电处理。〈2.细胞粘附性能的评价方法〉首先,如下进行操作来准备培养的粘附细胞。作为使用培养基,使用在Nutrient mixture F/12Ham(西格玛奥德里奇公司制)中添加10%胎牛血清(Invitrogen公司制)后的培养基,作为粘附细胞,使用CHO-Kl (中国仓鼠卵巢)细胞株,在细胞培养皿(Cp6cm,Becton-Dickinson公司制)中培养,从底面剥离回收所得到的粘附细胞,进行计数。接着,在培养皿(Cp6cm, Becton.Dickinson公司制)中预先贴合实施例以及比较例中的各膜。此时,也切割贴合在制袋后进行了紫外线照射的膜。另外,在各个膜上,将新鲜的培养基150μ I与从细胞培养皿底面剥离回收的细胞悬浮液150 μ I (液的总量:300 μ I)混合,接种成点状。此时,由于上述回收的细胞数每次实验发生变化,因此,接种的细胞数在各实施例以及比较例中不同,大约7.2 8.9 X IO4细胞/点。另外,培养面积为2cm2。
经过I日后(24或28小时后),计数浮游的细胞数和粘附的细胞数,基于以下式子,计算细胞粘附率。(粘附的细胞数)/(浮游的细胞数+粘附的细胞数)=细胞粘附率〈3.接触角以及滞后的测定方法〉接触角以及滞后的测定中,使用固液界面分析系统DropMaSter700(协和界面科学株式会公司制)。如图7所示,接触角(θ8)在膜上滴加纯水3μ I进行测定。另外,对于滑落时滞后(Θ a- Θ r)而言,在膜上滴加纯水30 μ 1,每I秒倾斜测定台1° ,滑落时的前进接触角(Θ a)和后退接触角(Θ r)通过切线法计算得到。〈4.热密封强度的测定方法〉热密封强度的测定中使用热密封试验装置(Tester产业株式会公司制)。关于密封条件,将密封宽设为10mm,仅上侧密封条加热至140°C,将压力设为3kgf/cm2,将密封时间设为2秒。拉伸试验中使用精密万能试验机自动绘图仪AG-1S(岛津制作所株式会公司制),将试验片宽设为15mm,在M.D.方向上以300mm/分钟的速度拉伸,根据最大试验力(N/15mm)评价密封强度。接着,参照图8,对实施例以及比较例进行说明。该图中,EPPE表示EasyProcessing PolyEthylene (易加工性聚乙烯),LLDPE 表不 Linear Low-DensityPolyEthylene (直链状低密度聚乙烯),PP表示Polypropylene (聚丙烯),LDPE表示Low-Density PolyEthylene (低密度聚乙烯)。另外,处理内容的“制袋后UV”表示:在贴合膜、密封四周后,照射254nm波长的UV。在该紫外线照射中,以累积光量达到5J/cm2的方式进行照射。另外,处理内容的“直接UV”表示:使膜在露出的状态下照射254nm波长的UV。该紫外线照射中,以累积光量达到5J/cm2的方式进行照射。另外,处理内容的“preUV”表示:对树脂颗粒照射254nm波长的UV。该紫外线照射中,以累积光量达到lOJ/cm2的方式进行照射。另外,处理内容的“电晕处理”表示:使用高频电源装置CG_102(春日电机株式会公司制),将施加电流设为3.5A,将膜与电极之间的距离设为5_,将膜移动速度设为5m/分钟,进行电晕放电处理。(实施例1)作为细胞培养容器的内层,使用预先含有抗氧化剂的Excellen FX CX3007(EPPE、住友化学株式会公司制),通过挤出成形制膜。需要说明的是,在外层使用Excellen GMHCB2001 (EPPE、住友化学株式会公司制),形成由二层构成的膜。接着,将该膜贴合成袋状,密封四周,照射254nm波长的紫外线照射。在所得到的培养容器中,接种如上所述准备的粘附细胞CHO-Kl (中国仓鼠卵巢)细胞株,进行培养。初期接种细胞数为7.8X IO4细胞/点,培养面积为2cm2。经过28小时后,计数浮游的细胞数和粘附的细胞数,计算细胞粘附率。其结果,细胞粘附率为80.8%。另外,测定该培养容器的培养面的接触角 、滞后以及热密封强度。其结果,接触角为101.9°,滞后为27.8°,热密封强度为15.8(N/15mm)。(实施例2)作为细胞培养容器的内层,使用预先含有抗氧化剂的Excellen FX CX3502(EPPE、住友化学株式会公司制),通过挤出成形制膜。其他方面,与实施例1同样操作,进行实验。其结果,细胞粘附率为87.5%,接触角为103.8°,滞后为35.9°,热密封强度为
18.9(N/15mm)。(实施例3)作为细胞培养容器的内层,使用预先含有抗氧化剂的Excellen GMHCB2001(EPPE、住友化学株式会公司制),通过挤出成形制膜。需要说明的是,在外层使用Kernel KS240T (LLDPE、日本聚乙烯株式会公司制),形成由二层构成的膜。其他方面,与实施例I同样操作,进行实验。需要说明的是,没有进行热密封强度的测定。其结果,细胞粘附率为86.1%,接触角为100.0°,滞后为26.5°。(实施例4)作为细胞培养容器的内层,使用预先含有抗氧化剂的Kernel KS240T(LLDPE、日本聚乙烯株式会公司制),通过挤出成形制膜。其他方面,与实施例1同样操作,进行实验。需要说明的是,没有进行热密封强度的测定。其结果,细胞粘附率为82.0%,接触角为105.V,滞后为 35.0°。(实施例5)作为细胞培养容器的内层,使用预先含有抗氧化剂的Kernel KS340T(LLDPE、日本聚乙烯株式会公司制),通过挤出成形制膜。其他方面,与实施例1同样操作,进行实验。其结果,细胞粘附率为87.1 %,接触角为104.3°,滞后为40.9°、热密封强度为17.3(N/15mm)。(实施例6)作为由单层构成的细胞培养容器的层,使用预先含有抗氧化剂的KernelKF283 (LLDPE、日本聚乙烯株式会公司制),通过挤出成形制膜。另外,将初期接种细胞数设定为8.9X104细胞/点,在该方面与实施例1同样操作,进行实验。需要说明的是,没有进行热密封强度的测定。其结果,细胞粘附率为81.0%,接触角为95.6°,滞后为30.0°。(实施例7)作为由单层构成的细胞培养容器的层,使用预先含有抗氧化剂的 Novatec PPMG3F(PP、日本聚丙烯株式会公司制),通过热压形成膜。接着,将该膜在露出的状态下照射254nm波长的紫外线照射。在所得到的培养容器中,接种如上所述准备的粘附细胞CHO-Kl (中国仓鼠卵巢)细胞株,进行培养。初期接种细胞数为7.2X IO4细胞/点,培养面积为2cm2。经过24时间 后,计数浮游的细胞数和粘附的细胞数,计算细胞粘附率。其结果,细胞粘附率为82.7%。另外,测定该培养容器的培养面的接触角以及滞后。其结果,接触角为97.3°,滞后为25.9°。(实施例8)作为由单层构成的细胞培养容器的层,使用预先含有抗氧化剂的Excellen FXCX3007 (EPPE、住友化学株式会公司制),对该树脂颗粒照射254nm波长的紫外线照射。之后,通过热压制膜,制造培养容器。使用所得到的培养容器,与实施例7同样地进行细胞培养,计算细胞粘附率。其结果,细胞粘附率为91.9%。另外,测定该培养容器的培养面的接触角以及滞后。其结果,接触角为102.2°,滞后为29.2°。(比较例I)作为细胞培养容器的内层,使用与实施例1相同的树脂,除了没有进行紫外线照射之外,其他方面,与实施例1同样操作,进行实验。其结果,细胞粘附率为3.2%,接触角为102.7。,滞后为16.1°、热密封强度为18.5(N/15mm)。(比较例2)作为细胞培养容器的内层,使用与实施例2相同的树脂,除了没有进行紫外线照射之外,其他方面,与实施例2同样地进行 实验。其结果,细胞粘附率为1.9%,接触角为103.2。,滞后为17.0°,热密封强度为20.5(N/15mm)。(比较例3)作为细胞培养容器的内层,使用与实施例3相同的树脂,除了没有进行紫外线照射之外,其他方面,与实施例3同样操作,进行实验。其结果,细胞粘附率为20.7%,接触角为 100.1。,滞后为 17.8°。(比较例4)作为细胞培养容器的内层,使用不含有抗氧化剂的Excellen GMH CB5002(EPPE、住友化学株式会公司制),通过挤出成形制膜。需要说明的是,外层中使用KernelKM262 (LLDPE、日本聚乙烯株式会公司制),形成由二层构成的膜。另外,除了没有进行紫外线照射之外,其他方面,与实施例3同样操作,进行实验。其结果,细胞粘附率为18.6%,接触角为101.0°,滞后为15.6°。(比较例5)作为细胞培养容器的内层,使用与比较例4相同的树脂,通过挤出成形制膜。需要说明的是,外层中也使用与比较例4相同的树脂,形成由二层构成的膜。接着,将该膜贴合成袋状,密封四周,照射254nm波长的紫外线照射。这样,除了进行紫外线照射以外,其他方面,与比较例4与同样地操作,进行实验。其结果,细胞粘附率为12.5%,接触角为100.4°,滞后为17.1°。(比较例6)作为细胞培养容器的内层,使用与实施例4相同的树脂,除了没有进行紫外线照射之外,其他方面,与实施例4同样地操作,进行实验。其结果,细胞粘附率为13.5%,接触角为106.0。,滞后为21.9°。(比较例7)作为细胞培养容器的内层,使用与实施例5相同的树脂,除了没有进行紫外线照射之外,其他方面,与实施例5同样地操作,进行实验。其结果,细胞粘附率为17.6%,接触角为103.6°,滞后为25.0°,热密封强度为17.5(N/15mm)。(比较例8)
作为由单层构成的细胞培养容器的层,使用与实施例6相同的树脂,除了没有进行紫外线照射之外,其他方面,与实施例6同样地操作,进行实验。其结果,细胞粘附率为39.0%,接触角为96.8°,滞后为15.0°。(比较例9)作为细胞培养容器的内层,使用不含有抗氧化剂的Kernel KM262 (LLDPE、日本聚乙烯株式会公司制),通过挤出成形制膜。需要说明的是,外层中使用Excellen GMHCB5002(EPPE、住友化学株式会公司制),形成由二层构成的膜。另外,除了没有进行紫外线照射之外,其他方面,与实施例3同样操作,进行实验。其结果,细胞粘附率为16.0%,接触角为100.9°,滞后为15.6°。(比较例10)
作为细胞培养容器的内层,使用与比较例9相同的树脂,通过挤出成形制膜。需要说明的是,外层中也使用与比较例9相同的树脂,形成由二层构成的膜。接着,将该膜贴合成袋状,密封四周,照射254nm波长的紫外线照射。这样,除了进行紫外线照射以外,其他方面,与比较例9同样地操作,进行实验。其结果,细胞粘附率为
17.3%,接触角为100.8°,滞后为16.2°。(比较例11)作为由单层构成的细胞培养容器的层,使用不含有抗氧化剂的UBE聚乙烯L719(LDPE、宇部丸善聚乙烯株式会公司制),通过挤出成形制膜。另外,除了没有进行紫外线照射之外,其他方面,与实施例3同样操作,进行实验。其结果,细胞粘附率为53.0%,接触角为102.4°,滞后为15.0°。(比较例12)作为由单层构成的细胞培养容器的层,使用与比较例11相同的树脂,通过挤出成形制膜。接着,将该膜贴合成袋状,密封四周,照射254nm波长的紫外线照射。这样,除了进行紫外线照射以外,其他方面,与比较例11同样地操作,进行实验。其结果,细胞粘附率为47.9%,接触角为102.3°,滞后为17.8°。(比较例13)作为由单层构成的细胞培养容器的层,使用与实施例7相同的树脂,除了没有进行紫外线照射之外,其他方面,与实施例7同样地操作,进行实验。其结果,细胞粘附率为21.1%,接触角为99.5°,滞后为16.1°。(比较例14)作为细胞培养容器的内层,使用与实施例1相同的树脂,通过挤出成形制膜。需要说明的是,外层中也使用与实施例1相同的树脂,形成由二层构成的膜。将该膜露出的状态下进行电晕放电处理,测定该接触角和热密封强度。其结果,接触角为87.6°,热密封强度为11.3(N/15mm)。(比较例15)作为细胞培养容器的内层,使用与实施例2相同的树脂,通过挤出成形制膜。需要说明的是,外层中也使用与实施例2相同的树脂,形成由二层构成的膜。将该膜露出的状态下进行电晕放电处理,测定该接触角和热密封强度。其结果,接触角为91.5°,热密封强度为10.6(N/15mm)。(比较例16)作为细胞培养容器的内层,使用与实施例5相同的树脂,通过挤出成形制膜。需要说明的是,外层中也使用与实施例5相同的树脂,形成由二层构成的膜。将该膜露出的状态下进行电晕放电处理,测定该接触角和热密封强度。其结果,接触角为85.8°,热密封强度为9.2(N/15mm)。将以上的实施例以及比较例中的细胞粘附率与滞后的关系示于图9。该图中,实心 表示实施例中得到的培养容器的结果,使用含有抗氧化剂的树脂,照射254nm波长的紫外线。空心〇表示比较例中得到的培养容器的结果,使用含有抗氧化剂的树脂,没有进行紫外线的照射。实心■表示比较例中得到的培养容器的结果,使用不含有抗氧化剂的树脂,照射254nm波长的紫外线,空心□表示比较例中得到的培养容器的结果,使用不含有抗氧化剂的树脂,没有进行紫外线的照射。这些培养容器的内面的接触角均为95°以上,没有被亲水化(参照图8的实施例1-8、比较例 1-13)。另一方面,滞后超过25°时,细胞粘附率急剧增大。这样,由上述实施例以及比较例的结果可知,在粘附细胞用培养容器的制造中,优选使用含有抗氧化剂的聚乙烯或聚丙烯等聚烯烃类树脂,进行除去臭氧发生波长的紫外线照射。由此,可以制造具备接触角为95°以上、并且滞后大于25°的培养面的培养容器。另外,使用该培养容器,培养粘附细胞,由此,能够得到高细胞粘附率。

本发明不限定于以上的实施方式和实施例,在本发明的范围内,当然可以进行各种变更。例如,在上述实施例中作为粘附细胞使用CHO-Kl细胞株,但不限于此,只要是粘附细胞,则也可以使用其他细胞。另外,关于培养液的种类、制膜、制袋方法等,也能够适当变更。另外,在上述实施方式和实施例中,作为紫外线源,使用除去了臭氧发生波长的低压水银灯,但只要是形成接触角为95°以上、并且滞后大于25°的培养面的紫外线源,则不限于此,例如,也可以使用能够照射254nm波长的UV的高压水银灯等。产业上的可利用性本发明在使用细胞培养容器大量培养粘附细胞的情况下,能够适当利用。
权利要求
1.一种粘附细胞用培养容器,是包含至少在最内层具有聚烯烃的层的单层或多层的膜或片的粘附细胞用培养容器,其特征在于,所述培养容器的一部分内面或整个内面中的静态水接触角为95°以上,并且水滑落时的前进接触角以及后退接触角满足下述式(1), 前进接触角-后退接触角> 25°...(式I)。
2.根据权利要求1所述的粘附细胞用培养容器,其中,所述聚烯烃含有抗氧化剂。
3.根据权利要求1或2所述的粘附细胞培养容器,其中,所述抗氧化剂为酚类抗氧化剂。
4.根据权利要求1 3中任一项所述的粘附细胞用培养容器,其特征在于,对所述聚烯烃照射除去了臭氧发生波长的紫外线,由此,以静态水接触角为95°以上、并且水滑落时的前进接触角以及后退接触角满足所述式(I)的方式形成所述培养容器的一部分内面或整个内面。
5.一种粘附细胞用培养容器的制造方法,其特征在于,对至少在最内层具有聚烯烃的层的单层或多层的膜或片实施除去了臭氧发生波长的紫外线照射,以静态水接触角为95°以上、并且水滑落时的前进接触角以及后退接触角满足式(I)的方式形成由该膜或片构成的培养容器的一部分内面或整个内面, 前进接触角-后退接触 角> 25°...(式I)。
6.根据权利要求5所述的粘附细胞用培养容器的制造方法,其中,所述紫外线照射从通过所述膜或片形成的封闭区域的外侧实施。
7.一种粘附细胞用培养容器的制造方法,其特征在于,对聚烯烃的颗粒实施除去了臭氧发生波长的紫外线照射,形成至少在最内层具有聚烯烃的层的单层或多层的膜或片,以静态水接触角为95°以上、并且水滑落时的前进接触角以及后退接触角满足下述式(I)的方式形成由膜或片构成的培养容器的一部分内面或整个内面, 前进接触角-后退接触角> 25°...(式I)。
8.根据权利要求5 7中任一项所述的粘附细胞用培养容器的制造方法,其中,所述聚烯烃含有抗氧化剂。
全文摘要
可以不需要必要以上的洁净度高的制造环境和遮盖这样的复杂的制造工序,提供能培养粘附细胞的培养袋。形成由聚烯烃构成的粘附细胞用培养容器,培养容器的一部分内面或整个内面中的静态水接触角为95°以上,并且水滑落时的前进接触角以及后退接触角满足前进接触角-后退接触角>25°。优选该聚烯烃中含有抗氧化剂。特别优选为酚类抗氧化剂。具备显示这样的接触角以及滞后的培养面的粘附细胞用培养容器,可以通过对聚烯烃照射除去臭氧波长的紫外线来得到。
文档编号C12M3/00GK103180430SQ20118004900
公开日2013年6月26日 申请日期2011年10月4日 优先权日2010年10月13日
发明者户谷贵彦, 石崎庸一, 田中乡史, 末永亮, 太田恭平, 国则正弘 申请人:东洋制罐株式会社

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