包含具有羟基苯丙酮酸双加氧酶(hppd)活性的序列的组合物和方法

xiaoxiao2020-6-24  6

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专利名称:包含具有羟基苯丙酮酸双加氧酶(hppd)活性的序列的组合物和方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域。更具体地,本发明涉及通过表达能赋予对4-羟基苯丙酮酸双加氧酶抑制剂(HPro)的耐受性的序列所提供的除草剂耐受性。通过EFS-WEB以文本文件提交的序列表的引用根据美国国家信息交换标准(AmericanStandard Code for InformationInterchange (ASCII)),与本说明书同时通过EFS-Web提交了文本文件形式的序列表的正式文本,文件名为408391SEQLIST.txt,创建时期为2011年8月11日,大小为1.58MB。通过EFS-Web提交的序列表是本说明书的一部分,并因此通过引用整体并入本文。
背景技术
在农作物的商业生产中,希望的是能从农作物田地容易且快速地去除不希望的植物(即,“杂草”)。理想的处理是能施加到整体田地中,但仅会去除不希望的植物,同时不会使农作物受到伤害。一种这样的处理系统涉及使用能耐受除草剂的农作物,从而当将除草剂喷洒到耐除草剂的农作物的田地中时,农作物会继续成长,同时会杀死或严重损伤不耐除草剂的杂草。理想情况下,这些处理系统会利用不同的除草剂性质,从而杂草控制能提供灵活性和经济性的最佳可能组合。例如,各种除草剂具有不同的田地中的寿命,并且某些除草剂在施加到田地中后能在相对长的时间中存留并有效,而其他除草剂则快速分解为其他化合物和/或无活性化合物。理想的处理系统能允许使用不同的除草剂,从而种植者能针对具体情况调整除草剂的选择。通过将编码合·适的除草剂代谢酶和/或不敏感除草剂靶标的基因工程化入农作物可以赋予对具体除草剂的农作物耐受性。在某些情况下,这些酶以及编码其的核酸源于植物。在其他情况下,它们来源于其他生物,例如微生物。参见,例如,Padgette etal.(1996)“New weed control opportunities:Development of soybeans with a Roundup
ReadyR gene”和 Vasil (1996)“Phosphinothricin-resistant crops, ”两篇文献都记载于Herbicide-Resistant Crops, ed.Duke (CRC Press, Boca Raton, Florida) 54-84页和 85-91页。事实上,已设计出能表达来自多种生物的多种除草剂耐受性基因的转基因植物。尽管目前可购到多种耐除草剂的农作物,仍不断需要在农作物生产、杂草控制选择、长期的残余杂草控制以及农作物产量的提高中的每个方面的改进。特别是,由于优势杂草种类以及优选农作物种类的局部性和地域性差异,不断需要能适合于具体地域、地理和/或地区的需求的定制化农作物保护和杂草管理系统。因此,不断需要农作物保护和杂草管理的组合物和方法。发明概述提供了包含多核苷酸和多肽的组合物和方法,所述多肽具有4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)活性并具有对至少一种HPro抑制剂的不敏感性。还提供了具有HPro序列的核酸构建体、植物、植物细胞、外植体、种子和谷类。提供了利用HPro序列的不同方法。所述方法包括产生对HPro抑制剂耐受的植物、植物细胞、外植体或种子的方法,以及利用本文公开的植物和/或种子来控制具有农作物的田地中的杂草的方法。还提供了鉴定其他HPro变体的方法。还提供了允许不同HPro多肽及其变体和片段在叶绿体中表达或被转运至叶绿体的不同方法和组合物。所述方法和组合物可用于产生对不同HPro抑制剂具有耐受性的植物细胞、植物和外植体。附图简要描述

图1提供了 4-羟基苯丙酮酸(HPP)转化为尿黑酸、再转化为马来酰乙酰乙酸的化学反应。HPro=4-羟基苯丙酮酸双加氧酶;HGD=尿黑酸双加氧酶。图2显示了玉米野生型HPro与改进的变体的接触反应速率,间隔为70-90秒。图2A显示了利用硝磺草酮抑制剂的玉米野生型HPro表征。图2B显示了具有提高的ON速率比的 HPPD 变体(D0223944)。图3显示了玉米野生型HPro和改进的变体从硝磺草酮解离的时间跨度的对比,这在加速反应速率中能反映出来。图3A代表玉米野生型HPro的反应。图3B显示了具有提高的OFF速率比的ΗΡΗ)变体(D0223944)的反应。图4提供了来自不同单子叶植物的HPro的氨基酸比对。来自大麦(Hordeumvulgare)的 HPPD 显示于 SEQ ID N0:328。来自燕麦(Avena sativa)的 HPPD 显示于 SEQID NO: 329。来自稻(Oryza sativa)的 HPPD 显示于 SEQ ID NO: 330。来自小麦(Triticumaestivum)的 HPPD 显示于 SEQ ID N0:331。来自玉米(Zea mays)的 HPPD 显示于 SEQ IDN0:392。下划线部分显示出享有同一性的氨基酸残基并且还显示了共有区。图5A-OT提供了来自不同双子`叶植物的HPro的氨基酸比对。来自玉米的HPro显示于 SEQ ID N0:1。来自胡萝卜(Daucus carota)的 HPPD 显示于 SEQ ID N0:332。来自彩叶草(Solenosteman sautellarioides)的 HPF1D 显不于 SEQ ID N0:333。来自北美云杉(Picea Sitchensis)的 HPF1D 显不于 SEQ ID N0:334。来自苘麻(Abutilon theophrasti)的 HPPD 显示于 SEQ ID N0:335。来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的 HPPD 显示于 SEQID NO: 336。来自芜菁(Brassica rapa)的HPPD显示于SEQ ID NO: 337。来自日本黄连(Coptis japonica)的 HPF1D 显不于 SEQ ID N0:338。来自葡萄(Vitis vinifera)的 HPF1D显示于SEQ ID NO: 339。来自大豆(Glycine max)的HPPD显示于SEQ ID NO: 2。来自蒺藜苜猜(Medicago truncatula)的HPF1D显示于SEQ ID N0:340。灰色底纹部分显示了共有区。图6提供了 HPro叶绿体转化载体的实例。图7A-C提供了用叶绿体靶向的或非靶向的DsRed转染的玉米叶组织的荧光显微镜检查。图7A显示了用ZmRCAl-Pro::RCA1CTP-Ds-Red2转染的玉米叶中观察到的荧光(1000X) ο图7B显示了用ZmRCAl-Pro::N-term-ZmHPPD_Ds-Red2转染的玉米叶中观察到的荧光(1000X)。图C显示了用非靶向的Ds-Red2转染的玉米叶中观察到的荧光(1000X)。图8A-D提供的比对显示了来自单子叶植物、双子叶植物、微生物和哺乳动物的HPro多肽的N末端氨基酸中发现的多样性。SEQ ID NO: 341提供了玉米的N末端氨基酸序列;SEQ ID NO:342提供了稻的N末端氨基酸序列;SEQ ID NO:343提供了燕麦的N末端氨基酸序列;SEQ ID NO:344提供了大麦的N末端氨基酸序列;SEQ ID NO:345提供了小麦的N末端氨基酸序列;SEQ ID NO:346提供了丁香假单胞菌(Pseudommonas syringae)的N末端氨基酸序列;SEQ ID N0:347提供了嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)的N末端氨基酸序列;SEQ ID NO: 348提供了青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)的N末端氨基酸序列;SEQ ID NO: 349提供了苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的N末端氨基酸序列;SEQ ID NO: 350提供了橙色绿曲挠菌(chloroflexus aurantiacus)的N末端氨基酸序列;SEQ ID NO:351提供了不动杆菌(Acinetobacter)的N末端氨基酸序列;SEQ ID NO:352提供Catenulispora acidphila的N末端氨基酸序列;SEQ ID NO:353提供了橙黄小单孢菌(Micromonospora aurantiaca)的 N末端氨基酸序列;SEQ ID N0:354 提供了 Calinisporatropica的N末端氨基酸序列;SEQ ID NO: 355提供了昏暗地嗜皮菌(Geodermatophilusobscurus)的N末端氨基酸序列;SEQ ID NO: 356提供了 Kibbella fIavida的N末端氨基酸序列;SEQ ID NO:357提供了阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)的N末端氨基酸序列;SEQ ID N0:358提供了 Ostreococcus tauri 的N末端氨基酸序列;SEQ ID N0:359提供了胡萝卜的N末端氨基酸序列;SEQ ID NO:360提供了彩叶草的N末端氨基酸序列;SEQID NO:361提供了芜菁的N末端氨基酸序列;SEQ ID NO: 362提供了日本黄连的N末端氨基酸序列;SEQ ID NO:363提供了大豆的N末端氨基酸序列;SEQ ID NO:364提供了葡萄的N末端氨基酸序列;SEQ ID NO: 365提供了蒺藜苜蓿的N末端氨基酸序列;SEQ ID NO:366提供了智人(Homo sapiens)的N末端氨基酸序列;SEQ ID N0:367提供了褐家鼠(Rattusnorvegicus)的N末端氨基酸序列;SEQ ID N0:368提供了小家鼠(Mus musculus)的N末端氨基酸序列;以及SEQ ID N0:369提供了家牛(Bos Taurus)的N末端氨基酸序列。图9A提供了高梁(Sorghum bicolor)天然 HPH^SEQ ID NO: 394);高梁变体HPPD (SEQ ID NO: 393),图 9B 提供了大豆天然 HPPD (SEQ ID NO: 396)和大豆变体 HPPD (SEQID NO: 395),其中变体序列是基于改进的玉米HPH)序列的独特基序。加粗的下划线序列代表改进的玉米HPro序列的独特HPro基序。图1OA-1提供了其他ΗΡΗ)序列的比对。玉米HPI3D序列显示于SEQ ID NO: 392 ;稻HPPD序列显示于SEQ ID NO: 3 30 ;燕麦HPPD序列显示于SEQ ID NO: 329 ;大麦HPPD序列显示于SEQ ID NO: 328 ;小麦HPPD序列显示于SEQ ID NO: 331 ;不动杆菌HPPD序列显示于SEQ ID NO:466 ;丁香假单胞菌ΗΡΗ)序列显示于SEQ ID NO:467 ;嗜肺军团菌HPI3D序列显不于SEQ ID NO:468 ;青枯雷尔氏菌HPF1D序列显不于SEQ ID NO:469 ;苏z 金芽抱杆菌HPPD序列显示于SEQ ID NO:470 ;橙色绿曲挠菌HPPD序列显示于SEQ ID N0:471 ;Catenulispora acidphila HPF1D序列显不于SEQ ID N0:472 ;澄黄小单抱菌HPF1D序列显不于 SEQ ID NO: 473 ;Salinispora tropica HPPD 序列显示于 SEQ ID NO: 474 ;昏暗地嗜皮菌HPPD序列显示于SEQ ID NO:475 ;Kribbella flavida HPPD序列显示于SEQ ID NO:476 M维链霉菌 HPF1D 序列显不于 SEQ ID NO: 477 ;Ostreococcus tauri HPF1D 序列显不于 SEQ IDNO: 478 ;胡萝卜HPPD序列显示于SEQ ID NO: 479 ;彩叶草HPPD序列显示于SEQ ID NO: 480 ;芜菁HPPD序列显示于SEQ ID NO:481 ;日本黄连HPPD序列显示于SEQ ID NO:482 ;大豆HPPD序列显示于SEQ ID NO: 483 ;葡萄HPPD序列显示于SEQ ID NO: 484 ;蒺藜苜蓿HPPD序列显示于SEQ ID NO:485 ;智人HPPD序列显示于SEQ ID NO:486 ;褐家鼠HPPD序列显示于SEQ ID NO: 487 ;小家鼠HPPD序列显示于SEQ ID NO: 488 ;以及,家牛HPPD序列显示于SEQID NO:489。
图11显示了携带H2B-NSF1盒的TO事件的分数,其显示了 2X硝磺草酮喷雾后的每个损伤评分。O指示无可见损伤,而100指示植物死亡。图12显示了携带单独的HPH)盒(H8891)或相同HPH)盒加NSFl盒(H+N8894)的TO事件,其显示了 2X硝磺草酮喷雾后的每个损伤评分。O指示无可见损伤,而100指示植物死亡。图13显示了携带单独的HPH)盒(H9426)或相同HPH)盒加NSFl盒(H+N9514)的TO事件的分数,其显示了 2X硝磺草酮喷雾后的每个损伤评分。O指示无可见损伤,而100指示植物死亡。图14提供了高粱天然HPPD(SEQ ID NO:394);高粱变体HPPD(SEQ ID NO:459);大豆天然HPro(SEQ ID NO:396)和大豆变体HPro(SEQ ID NO:458),其中变体序列是基于改进的玉米HPro序列的独特基序。加粗的下划线序列代表改进的玉米HPro序列的独特HPro基序。发明详细描述以下参考幅图更详细地描述本发明,其中显示了本发明的部分、但并非全部的实施方案。事实上,这些发明可以以不同的形式实施,并且不应当被解释为限制本文所述的实施方案;而是应当认为,提供这些实施方案是为了使本文满足适用的法律要求。在本文中,相似的数字指代相似的元件。在本发明相关领域的技术人员获益于上文描述和相关幅图中提供的教导之后,能够明白本文描述的本发明的很多改变和其他实施方案。因此,应当理解,本发明不限于所公开的具体实施方案,改变和其他实施方案意图包括在后附权利要求的范围内。尽管本文使用了特定术语,但是它们仅用于一般性和描述性含义,而不是限制的目的。1.组合物A.羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)多核苷酸和多肽羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)将来源于芳香氨基酸生物合成途径的羟基苯丙酮酸转化为尿黑酸。尿黑酸是生育酚和质体醌的前体,是类胡萝卜素生物合成中必需的电子载体。因此,当HPro受到除草剂抑制剂的抑制时,植物不能保护自身对抗叶绿素的光活化产生的自由基。更具体而言,HPro多肽的抑制导致植物组织中保护性色素的耗竭,从而导致组织的白化,这使得植物易受到光损伤的攻击。HPro抑制剂一类重要的除草剂,赋予农作物对HPro抑制剂的耐受性的转基因会特别有价值,特别是用于控制草甘膦的杂草抗性。本文所用的“羟基苯丙酮酸双加氧酶”、“ΗΡΗ)”、“4-羟基苯丙酮酸(或丙酮酸)双加氧酶(4-HPPD)”和“P-羟基苯丙酮酸(或丙酮酸)双加氧酶(P-OHPP) ”是同义的,是指非血基铁依赖性加氧酶,其催化4-羟基苯丙酮酸转变为尿黑酸。参见,图1。在降解酪氨酸的生物中,HPH)催化的反应是该途径的第二步骤。在植物中,尿黑酸的形成是合成质体醌(必需的氧化还原辅因子)以及生育酚所必需的。不同HPro多肽的结构是已知的。参见,例如,图4,其提供了数种单子叶植物HPro多肽的系统发生多样性,包括来自大麦、燕麦、稻、小麦以及玉米的序列。图5提供了数种双子叶植物HPro多肽的系统发生多样性,包括胡萝卜、彩叶草、北美云杉、苘麻、拟南芥、芜菁、日本黄连、葡萄、大豆以及蒺藜苜蓿。提供了利用多核苷酸和多肽的不同方法 和组合物,所述多肽具有HPro活性,并且与合适的对照相比,具有对至少一种HPro抑制剂的增加的不敏感性。所述HPro多肽包括以下所示中的任一个:SEQ ID N0:3、4、5、6、7、8、9、10、ll、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、74、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、61、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、212、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、383、384、385、386、387、388、389、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、
409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、 424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、452、453、454、455、456、457、458 或 549,以及以上的生物活性变体和片段。还提供了编码这些不同多肽及其活性变体和片段的多核苷酸。还提供了新类别的HPro多肽和编码其的多核苷酸。具体而言,提供了 HPro多肽以及编码其的多核苷酸,包括 SEQ ID N0:372、373、374、375、376、377、378、379、380、382、460、461、462和/或463所示的至少一个或多个基序。也可参见实施例16中的表18。在具体实施方案中,提供了 HPH)多肽以及编码其的多核苷酸,其中所述序列包含至少一个下述HPPD基序:SEQ ID NO:372、373、374、375、376、377、378、379、380、382、460、461、462、463、467,468-489中任一个或以上的任意组合,其中所述序列还包含或编码与天然HPTO多肽具有至少 60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列同一性的HPI3D序列,天然HPI3D多肽所述包括,例如,来自细菌、植物、真菌、昆虫或哺乳动物的天然HPPD,包括,例如,SEQ ID NO: 1、2、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、327、391、392、394、396、465、467-489 中的任一个。还提供了 HPro多肽以及编码其的多核苷酸,其中所述多肽具有HPro活性并表现出对HPro抑制剂的不敏感性,以及其中所述多肽中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置414的氨基酸残基包括赖氨酸、精氨酸、组氨酸或丙氨酸。在其他实施方案中,HPro多肽还包含与 SEQ ID N0:l、2、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、327、391、392、394、396 或 465 中的任一个至少 60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%。还提供了 HPro多肽以及编码其的多核苷酸,其中所述多肽具有HPro活性并表现出对HPro抑制剂的不敏感性,以及其中所述多肽中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置341的氨基酸残基包括半胱氨酸。在其他实施方案中,HPH)多肽还包含与SEQ ID NO: 1,2,328,329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、327、391、392、394、396 或 465 中的任一个至少 60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%。还提供了 HPro多肽以及编码其的多核苷酸,其中所述多肽具有HPro活性并表现出对HPro抑制剂的不敏感性,以及其中所述多肽中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置341的氨基酸残基包括半胱氨酸,并且编码的多肽包含以下氨基酸残基中的至少一个:对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置261的氨基酸残基包括丙氨酸,对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置301的氨基酸残基包括异亮氨酸,对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置327的氨基酸残基包括亮氨酸,对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置328的氨基酸残基包括脯氨酸,对应于SEQ IDNO:1的氨基酸位置360的氨基酸残基包括蛋氨酸,和/或对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置417的氨基酸残基包括甘氨酸。在其他实施方案中,HPH)多肽还包含与SEQ ID N0:l、2、
328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、327、391、392、394、396 或 465中的任一个至少 60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%。还提供了 HPro多肽以及编码其的多核苷酸,其中所述多肽具有HPro活性并表现出对HPro抑制剂的不敏感性,以及其中所述多肽中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置341的氨基酸残基包括谷氨酸,并且编码的多肽包含以下氨基酸残基中的至少一个:对应于SEQID NO:1的氨基酸位置328的氨基酸残基包括脯氨酸,对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置360的氨基酸残基包括蛋氨酸,和/或对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置417的氨基酸残基包括甘氨酸。在其他实施方案中,HPro多肽还包含与SEQ ID N0:l、2、328、329、330、331、
332、333、334、335、336、337、338、339、340、327、391、392、394、396 或 465 中的任一个至少60%、70%、75%、8 0%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%。还提供了 HPro多肽以及编码其的多核苷酸,其中所述多肽具有HPro活性并表现出对HPro抑制剂的不敏感性,以及其中所述多肽中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置417的氨基酸残基包括甘氨酸,并且所述多肽包含以下氨基酸残基中的至少一个:对应于SEQID NO:1的氨基酸327的氨基酸位置包括亮氨酸,对应于SEQ ID NO:1的氨基酸331的氨基酸位置包括脯氨酸,和/或对应于氨基酸SEQ ID NO:1的氨基酸360的氨基酸位置包括蛋氨酸。在其他实施方案中,ΗΡΗ)多肽还包含与SEQ ID N0:l、2、328、329、330、331、332、333、
334、335、336、337、338、339、340、327、391、392、394、396 或 465 中的任一个至少 60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%。还提供了 HPro多肽以及编码其的多核苷酸,其中所述多肽具有HPro活性并表现出对HPro抑制剂的不敏感性,以及其中所述多肽中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置261的氨基酸残基包括丙氨酸和/或对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置301的氨基酸残基包括异亮氨酸;以及对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置328的氨基酸残基包括脯氨酸,并且编码的多肽包含以下氨基酸残基中的至少一个:对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置360的氨基酸残基包括蛋氨酸或对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置417的氨基酸残基包括甘氨酸。在其他实施方案中,HPPD 多肽还包含与 SEQ ID NO: 1、2、328、329、330、331、332、333、334、
335、336、337、338、339、340、327、391、392、394、396 或 465 中的任一个至少 60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或99%。还提供了 HPro多肽以及编码其的多核苷酸,其中所述多肽具有HPro活性并表现出对HPro抑制剂的不敏感性,以及其中所述多肽中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置261的氨基酸残基包括丙氨酸和/或对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置327的氨基酸残基包括亮氨酸;以及对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置331的氨基酸包括脯氨酸和对应于SEQID NO:1的氨基酸位置341的氨基酸包括谷氨酸。在其他实施方案中,HPH)多肽还包含与 SEQ ID N0:l、2、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、327、391、392、394、396 或 465 中的任一个至少 60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%。还提供了 HPro多肽以及编码其的多核苷酸,其中所述多肽具有HPro活性并表现出对HPro抑制剂的不敏感性,以及其中所述多肽中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置209的氨基酸残基包括缬氨酸和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置233的氨基酸残基包括亮氨酸;以及编码的多肽包含以下氨基酸残基中的至少一个:对应于SEQ ID N0:1的氨基酸位置301的氨基酸残基包括异亮氨酸和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置327的氨基酸残基包括亮氨酸。在其他实施方案中,HPH)多肽还包含与SEQ ID N0:l、2、328、329、330、331、
332、333、334、335、336、337、338、339、340、327、391、392、394、396或 465 中的任一个至少60%、70%、75%、80%、 81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%。还提供了 HPro多肽以及编码其的多核苷酸,其中所述多肽具有HPro活性并表现出对HPro抑制剂的不敏感性,以及其中所述多肽中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置327的氨基酸残基包括亮氨酸和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置328的氨基酸残基包括脯氨酸;以及所述多肽包含以下氨基酸残基中的至少一个:对应于SEQ ID N0:1的氨基酸位置233的氨基酸残基包括亮氨酸和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置360的氨基酸残基包括蛋氨酸。在其他实施方案中,ΗΡΗ)多肽还包含与SEQ ID N0:l、2、328、329、330、331、332、
333、334、335、336、337、338、339、340、327、391、392、394、396或 465 中的任一个至少 60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或 99%。还提供了 HPro多肽以及编码其的多核苷酸,其中所述多肽具有HPro活性并表现出对HPro抑制剂的不敏感性,以及其中所述HPro多肽包含任何以下氨基酸中的至少1、2、
3、4、5或6个:编码的多肽中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置44的氨基酸残基包括谷氨酰胺、异亮氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、甘氨酸或缬氨酸;SEQ ID NO:1的氨基酸位置233包括蛋氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸;对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置316的氨基酸残基包括谷氨酰胺、赖氨酸或精氨酸;对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置331的氨基酸残基包括亮氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺或组氨酸;对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置341的氨基酸残基包括半胱氨酸、天冬氨酸或丙氨酸,和/或对应于SEQ ID N0:1的氨基酸位置360的氨基酸残基包括蛋氨酸或亮氨酸。在其他实施方案中,HPro多肽还包含与SEQ IDN0:l、2、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、327、391、392、394、396、465、3-164、383-389、165-326、397-457 中的任一个至少 60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%。在其他实施方案中,提供了 HPro多肽以及编码其的多核苷酸,其中所述多肽具有HPPD活性并表现出对HPro抑制剂的不敏感性,以及其中所述HPro多肽包含任何以下氨基酸中的至少1、2、3、4、5或6个:编码的多肽中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置44的氨基酸残基包括组氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、甘氨酸或缬氨酸;SEQ ID NO:1的氨基酸位置233包括苯丙氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸;对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置316的氨基酸残基包括谷氨酰胺、赖氨酸或精氨酸;对应于SEQID NO:1的氨基酸位置331的氨基酸残基包括苏氨酸、亮氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺或组氨酸;对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置341的氨基酸残基包括精氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸或丙氨酸,和/或对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置360的氨基酸残基包括蛋氨酸、赖氨酸或亮氨酸。在其他实施方案中,ΗΡΗ)多肽还包含与SEQ ID N0:l、2、328、329、330、331、332、333、
334、335、336、337、338、339、340、327、391、392、394、396、465、3-164、383-389、165-326、397-457 中的任一个至少 60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%。本文所用的〃分离的〃或〃纯化的〃多核苷酸或多肽或其生物活性部分基本上或本质上不含有在其天然存在的环境中存在的、通常伴随其或与其相互作用的组分。因此,分离的或纯化的多核苷酸或多肽当通过重组技术产生时基本上不含有其他细胞物质或培养基,或通过化学方式合成时基本上不含有化学前体或其他化学物质。最佳情况下,"分离的"多核苷酸不含有在所述多核苷酸来源于的生物的基因组DNA中天然位于所述多核苷酸侧翼的(即,位于所述多核苷酸的5’和3’端的序列)的序列(最佳是蛋白编码序列)。例如,在各实施方案中,分离的多核苷酸可含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、lkb、0.5kb或0.1kb的在所述多核苷酸来源于的细胞的基因组DNA中天然位于所述多核苷酸侧翼的核苷酸序列。基本上不含有细胞物质的多肽包括具有少于约30%、20%、10%、5%或1%(以重量计)杂质蛋白的多肽制备物。当本发明的多肽或其生物活性部分是重组产生时,最佳情况下,培养基提供少于约30%、20%、10%、5%或1%(以重量计)的化学前体或非目的蛋白的化学物质。当本文所用的多核苷酸或多肽是人工的或工程化的或来自人工的或工程化的蛋白或核酸时,所述多核苷酸或多肽是“重组”的。例如,当多核苷酸被插入载体或任何其他异源位置(例如,重组生物的基因组),使得其不与自然界中存在的天然位于所述多核苷酸侧翼的核苷酸序列相联时,所述多核苷酸是重组多核苷酸。从重组多核苷酸体外或体内表达的多肽是重组多肽的实例。同样地,自然界中不存在的多核苷酸序列(例如,天然存在的基因的变体)是重组的。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供了用于检测主题植物或植物细胞的表型改变的参考点,并且可以是任何合适的植物或植物细胞。对照植物或植物细胞可以包括,例如:(a)野生 型或天然植物或细胞,即,与作为用于带来主题植物或细胞的遗传改变的起始材料为相同基因型;(b)与起始材料为相同基因型,但用空构建体(即,对目的性状不具有已知影响的构建体,例如包含标记基因的构建体)转化的植物或植物细胞;(C)主题植物或植物细胞的后代中的未转化的分离体的植物或植物细胞;(d)在遗传学上与主题植物或植物细胞相同、当不暴露于与主题植物或植物细胞相同的处理(例如,除草剂处理)的植物或植物细胞;或(e)在目的基因不表达的条件下的主题植物或植物细胞本身。1.羟基苯丙酮酸双加氧酶活性本文所用的“羟基苯丙酮酸双加氧酶活性”或“HPH)活性”是指4-羟基苯丙酮酸转化为尿黑酸。本文所用的具有“HPPD活性”的多肽包括HPro多肽或其活性变体或片段,其保留足够的HPro活性,使得α)当在生存能力需要HPro活性的细胞中以足够的水平表达时,HPro多肽或活性变体或片段表现出足够的HPro活性,从而保持表达所述HPro多肽或活性变体或片段的细胞的生存能力;或出)当在生存能力需要HPro活性的细胞中表达时,所述HPro多肽或其活性变体或片段与一个或多个其他HPro多肽的联合表达为细胞带来存活能力。在一个实施方案中,HPPD多肽或其活性变体或片段的HPro活性为,在缺少HPro抑制剂的情况下,所述多肽或其活性变体或片段表现出天然HPro多肽(B卩,SEQ ID N0:2、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、327、391、392、394 或 396 中的任一个)所表现出的 HPPD 活性的至少约 5%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%或更高百分比。测定这些动力参数(SHkc^keatZKj的方法是已知的,并且在本文其他部分讨论。在其他实施方案中,HPPD多肽或其活性变体或片段具有的活性至少等同于天然HPPD多肽,或具有的活性高于天然HPPD多肽。“等同”HPH)活性是指通过任何酶学动力参数(包括例如,通过测定的,与对照无统计学显著差异的活性水平。增加的HPro活性包括通过任何酶学动力参数(例如,Km、keat、kcat/Km)测定的,任何统计学显著的HPPD活性增加。在具体实施方案中,HPro活性的增加包括与SEQ ID NO:1所示的玉米野生型HPPD序列或天然HPPD多肽相比,给定动力参数中至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍或更多倍的提高。测定这些动力参数的方法是已知的。简言之,HPro催化4-羟基苯丙酮酸(HPP)向尿黑酸的转化。底物和产物在任何有用的波长下没有光吸收值的差异。然而,尿黑酸双加氧酶(HGD`)催化尿黑酸向马来酰乙酰乙酸的转化,马来酰乙酰乙酸在320nm下具有强吸收。因此,通过在合适的反应条件下将4-羟基苯丙酮酸与HPH)和HGD相结合,可以测定HPH)活性。本文所用的“天然” HPro多肽包括任何野生型HPro序列。这些序列是本领域已知的,并且来自不同单子叶植物和双子叶植物的代表性的天然/野生型HPro序列显示于图
4、5 和 9 以及 SEQ ID NO: 1、2、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、327、391、392、394或396。在具体实施方案中,HPTO序列的生物活性片段和变体与玉米野生型HPH)多肽(SEQ ID NO:1)或天然HPTO多肽相比较。本文所用的“对应的天然” HPro多肽包括生物活性变体所来源于的天然或野生型序列。例如,对于大豆HPro多肽的生物活性变体或片段,对应的天然HPro多肽是SEQ IDN0:2所示的天然大豆序列。相似地,对于稻HPro多肽的生物活性变体或片段,对应的天然HPPD多肽是SEQID NO:330所示的天然稻序列。i1.对HPH)抑制剂的不敏感性为了向植物提供对商业用施用量的至少一种所需HPH)抑制剂的耐受性,使用编码HPro多肽的多核苷酸是有利的,所述HPro多肽具有足够的HPro活性并具有对至少一种或多种HPro抑制剂产生的抑制的不敏感性。因此,在具体实施方案中,本文提供的HPro多核苷酸和多肽以及它们的变体和片段与对应的天然HPro多肽相比,表现出对HPro抑制剂的增加的不敏感性,和/或与玉米天然HPro多肽(SEQ ID NO:1)相比,表现增加的不敏感性。本文所用的“HPro抑制剂”包括降低HPro催化4-羟基苯丙酮酸转化为尿黑酸的能力的任何化合物或化合物组合。在具体实施方案中,HPro抑制剂包含HPro的除草活性抑制剂。HPro抑制剂的非限制性实例包括三酮(例如,硝磺草酮、磺草酮、苯吡唑草酮以及环磺酮);异噁唑(例如,磺酰草吡唑和异噁唑草酮);吡唑(例如,吡草酮、苄草唑以及吡唑特);以及苯并双环酮。不同抑制剂的农业可接受的盐包括盐,用于形成农业或园艺用途的盐的阳离子或阴离子是本领域已知的且公认的。参见,例如,W02005/053407,通过引用将其并入本文。“增加的”或“提高的”不敏感性在本文中可互换使用。对HPro抑制剂的“增加的”或“提高的”不敏感性包括HPro多肽对抑制剂的不敏感性的任何统计学显著的增加,这可通过任何酶学动力参数测定,例如,酶-抑制剂复合物的解离常数(Kd)、抑制剂与酶的缔合速率0%),或抑制剂从酶的解离速率或比值。本发明还定义了新的参数,“0N速率比”、“OFF速率比”以及“不敏感性参数”,它们不是on和off速率的直接测量结果,而是当酶暴露于抑制剂时,具体HPro酶固有的on和off速率对其催化功能的影响的测量结果。不敏感性的提高不需要表现出所有动力参数的提高。单个动力参数或其任何组合的提高足以将改变划分为不敏感性的提高。在具体实施方案中,通过测量酶的这些新的不敏感性参数来确定对HPro抑制剂的增加的不敏感性。因此,在具体实施方案中,对HPro抑制剂的增加的不敏感性包括当与天然HPro多肽和/或SEQ ID NO:1所示的玉米野生型HPTO序列相比,给定动力参数的至少 0.2,0.3,0.5,0.7,0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70 倍或更大的提高。在具体实施方案中,对HPro抑制剂的提高的不敏感性包括(a)较慢的酶和抑制剂的缔合速率,其是例如通过高于天然HPro的ON速率比来定量的;(b)较快的抑制剂从酶的解离速率,其是例如通过高于天然HPro的OFF速率比来定量的;和/或(C)较慢的抑制剂与酶的缔合速率和较快的抑 制剂从酶的解离速率,其是例如通过高于天然HPro的ON速率比和OFF速率比的结果来定量的。为了测量HPro对抑制剂的不敏感性的测定动力参数的方法是已知的。还可参见,实施例1、4、5以及7-11。简言之,HPro的除草活性抑制剂与酶通过双重机制形成紧密复合物,所述双重机制为通过一对羰原子与活性位点铁原子的配位和一对活性位点苯丙氨酸之间的抑制剂芳香环的H堆砌(Pi Stack)。因此,常规I5tl测定不能区分不同形式的HPro和抑制剂之间的结合亲和力差异。所有值都会是相同的,即,酶浓度的50%。为了设计能用于检测抑制剂结合亲和力改变的参数(Kd),可以利用KD与抑制剂(I)与酶(E)的结合速率和抑制剂(I)从酶(E)的释放速率之间的关系。
权利要求
1.分离的或重组的多核苷酸,其包含编码HPro多肽的核苷酸序列,其中所述多核苷酸编码包括以下的多肽a.在SEQ ID NO:1、2、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、327、391、392、394、396中任一个的全长上具有至少60%、70%、80%或90%的序列同一性,并且具有 SEQ ID N0:377、372、373、374、375、376、378、379、380、381、382、460、461、462、463、467、468、469-488或489所示的氨基酸序列中至少一个的氨基酸序列,其中所述多肽具有4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)活性并表现出对HPH)抑制剂的不敏感性;或b.包含SEQID N0:377、372、373、374、375、376、378、379、380、381、382、460、461、462或463所示的氨基酸序列的HPro多肽,其中所述多肽具有HPro活性并表现出对HPro抑制剂的不敏感性。
2.分离的或重组的多核苷酸,其包含编码多肽的核苷酸序列,其中所述多肽具有4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)活性并具有对至少一种HPH)抑制剂的不敏感性,所述多肽包括如下所述的氨基酸序列 (a)与SEQID NO: 109具有至少1853的相似性评分; (b)与SEQID NO: 101具有至少1855的相似性评分; (c)与SEQID NO:50具有至少1862的相似性评分; (d)与SEQID NO:56或SEQ ID NO: 164具有至少1864的相似性评分; (e)与SEQID NO: 103具有至少2267的相似性评分; (f)与SEQID NO: 160具有至少2268的相似性评分; (g)与SEQID NO:412具有至少1855的相似性评分; 其中所述相似性评分是利用BLAST比对程序产生的,其中利用BLOSUM62替代矩阵,空位存在罚分为11,以及空位延伸罚分为I。
3.分离的或重组的多核苷酸,其包含编码多肽的核苷酸序列,其中所述多肽具有4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)活性并具有对至少一种HPro抑制剂的不敏感性,所述多肽包括如下所述的氨基酸序列 (a)与SEQID NO:263具有至少1830的相似性评分; (b)与SEQID NO:212具有至少1839的相似性评分; (c)与SEQID NO:218具有至少1840的相似性评分; (d)与SEQID NO:320具有至少2152的相似性评分; (e)与SEQID NO:275具有至少2176的相似性评分; (f)与SEQID NO:265具有至少2177的相似性评分;或, (j)与SEQ ID NO:433具有至少1825的相似性评分; 其中所述相似性评分是利用BLAST比对程序产生的,其中利用BLOSUM62替代矩阵,空位存在罚分为11,以及空位延伸罚分为I。
4.分离的或重组的多核苷酸,其包含编码HPH)多肽的核苷酸序列,其中所述多核苷酸编码与 SEQ ID N0:l、2、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、327、.391、392、394、396、466-489中任一个具有至少60%序列同一性的氨基酸序列,其中所述多肽具有HPro活性并表现出对HPro抑制剂的不敏感性,其中 a)编码的多肽中对应于SEQ ID NO: I的氨基酸位置414的氨基酸残基包括赖氨酸、精氨酸、组氨酸或丙氨酸; b)编码的多肽中对应于SEQID NO: I的氨基酸位置341的氨基酸残基包括半胱氨酸; c)编码的多肽中对应于SEQID NO: I氨基酸位置341的的氨基酸残基包括半胱氨酸,并且编码的多肽包含以下氨基酸残基中的至少一个对应于SEQ ID N0:1的氨基酸位置261的氨基酸残基包括丙氨酸,对应于SEQ ID NO: I的氨基酸位置301的氨基酸残基包括异亮氨酸,对应于SEQ ID NO: I的氨基酸位置327的氨基酸残基包括亮氨酸,对应于SEQ IDNO: I的氨基酸位置328的氨基酸残基包括脯氨酸,对应于SEQ ID NO: I的氨基酸位置360的氨基酸残基包含蛋氨酸,和/或对应于SEQ ID NO: I的氨基酸位置417的氨基酸残基包括甘氨酸; d)编码的多肽中对应于的氨基酸残基SEQID NO: I的氨基酸位置341包括谷氨酸,并且编码的多肽包含以下氨基酸残基中的至少一个对应于SEQ ID NO: I的氨基酸位置328的氨基酸残基包括脯氨酸,对应于SEQ ID NO: I的氨基酸位置360的氨基酸残基包括蛋氨酸,和/或对应于SEQ ID NO: I的氨基酸位置417的氨基酸残基包括甘氨酸; e)编码的多肽中对应于SEQID NO: I的氨基酸位置417的氨基酸残基包括甘氨酸,并且所述多肽包含以下氨基酸残基中的至少一个对应于SEQ ID NO: I的氨基酸327的氨基酸位置包括亮氨酸,对应于SEQ ID NO: I的氨基酸331的氨基酸位置包括脯氨酸,和/或对应于氨基酸SEQ ID NO: I的氨基酸360的氨基酸位置包括蛋氨酸; f)编码的多肽中对应于SEQID NO: I的氨基酸位置261的氨基酸残基包括丙氨酸和/或对应于SEQ ID NO: I的氨基酸位置301的氨基酸残基包括异亮氨酸;以及对应于SEQ IDNO: I的氨基酸位置328的氨基酸残基包括脯氨酸,并且编码的多肽包含以下氨基酸残基中的至少一个对应于SEQ ID NO: I的氨基酸位置360的氨基酸残基包括蛋氨酸或对应于SEQID NO: I的氨基酸位置417的氨基酸残基包括甘氨酸; g)编码的多肽中对应于SEQID NO: I的氨基酸位置261的氨基酸残基包括丙氨酸和/或SEQ ID NO: I的氨基酸位置327包括亮氨酸;以及对应于SEQ ID NO: I的氨基酸位置331的氨基酸包括脯氨酸,以及对应于SEQ ID NO: I的氨基酸位置341的氨基酸包括谷氨酸; h)编码的多肽中对应于SEQID NO: I的氨基酸位置209的氨基酸残基包括缬氨酸和SEQ ID NO: I的氨基酸位置233包括亮氨酸;以及编码的多肽包含以下氨基酸残基中的至少一个对应于SEQ ID NO: I的氨基酸位置301的氨基酸残基包括异亮氨酸和对应于SEQID NO: I的氨基酸位置327的氨基酸残基包括亮氨酸; i)编码的多肽中对应于SEQID NO: I的氨基酸位置327的氨基酸残基包括亮氨酸和SEQ ID ΝΟ:1的氨基酸位置328包括脯氨酸;以及所述多肽包含以下氨基酸残基中的至少一个对应于SEQ ID NO: I的氨基酸位置233的氨基酸残基包括亮氨酸和对应于SEQ IDNO: I的氨基酸位置360的氨基酸残基包括蛋氨酸;或, j)编码的多肽中具有任何以下氨基酸残基中的至少1、2、3、4、5或6个对应于SEQ IDNO: I的氨基酸位置44的氨基酸残基包括谷氨酰胺、异亮氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、甘氨酸或缬氨酸;SEQ ID NO: I的氨基酸位置233包括蛋氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸;对应于SEQ ID NO: I的氨基酸位置316的氨基酸残基包括谷氨酰胺、赖氨酸或精氨酸;对应于SEQ ID NO: I的氨基 酸位置331的氨基酸残基包括亮氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺或组氨酸;对应于SEQ ID NO: I的氨基酸位置341的氨基酸残基包括半胱氨酸、天冬氨酸或丙氨酸,和/或对应于SEQ ID NO: I的氨基酸位置360的氨基酸残基包括蛋氨酸或亮氨酸;或, k)编码的多肽中具有任何以下氨基酸残基中的至少1、2、3、4、5或6个对应于SEQ IDNO: I的氨基酸位置44的氨基酸残基包括组氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、甘氨酸或缬氨酸;SEQ ID NO: I的氨基酸位置233包括苯丙氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸;对应于SEQ ID NO: I的氨基酸位置316的氨基酸残基包括谷氨酰胺、赖氨酸或精氨酸;对应于SEQ ID NO: I的氨基酸位置331的氨基酸残基包括苏氨酸、亮氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺或组氨酸;对应于SEQ ID NO: I的氨基酸位置341的氨基酸残基包括精氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸或丙氨酸,和/或对应于SEQ ID NO: I的氨基酸位置360的氨基酸残基包括蛋氨酸、赖氨酸或亮氨酸。
5.如权利要求1、2、3或4中任一项所述的分离的或重组的多核苷酸,其中所述多肽与SEQ ID NO: I所示的多肽或天然HPro多肽相比,具有对HPro抑制剂提高的不敏感性。
6.如权利要求5所述的分离的或重组的多核苷酸,其中所述对HPro抑制剂提高的不敏感性包括 a.酶和抑制剂的较慢的缔合速率,其是通过高于SEQID NO: I所示的多肽或天然HPH)的ON速率比来定量的; b.抑制剂从酶的较快的解离速率,其是通过高于SEQID NO: I所示的多肽或天然HPH)的OFF速率比来定量的;和/或, c.抑制剂与酶的较慢的缔合速率和抑制剂从酶的较快的解离速率,其是通过高于SEQID NO: I所示的多肽或天然HPro的ON速率比和OFF速率比结果来定量的。
7.如权利要求1-6中任一项所述的分离的或重组的多核苷酸,其中所述多肽包含叶绿体转运肽序列,所述叶绿体转运肽序列包括 a.编码SEQID N0:490,371或464所示的氨基酸序列的核苷酸序列; b.编码与SEQID N0:490、371或464的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的多肽的核苷酸序列,其中所述多肽具有叶绿体转运肽活性;或, c.编码异源叶绿体转运肽序列的核苷酸序列。
8.包含权利要求1-7中任一项所述的分离的或重组的多核苷酸的核酸构建体。
9.如权利要求8所述的核酸构建体,还包含可操作地连接于所述多核苷酸的启动子。
10.如权利要求9所述的核酸构建体,其中所述启动子相对于所述多核苷酸是异源的,或所述启动子相对于所述多核苷酸是同源的。
11.包含权利要求1-7中任一项所述的至少一个多核苷酸或权利要求8-10中任一项所述的核酸构建体的细胞,其中所述多核苷酸对于所述细胞是异源的。
12.如权利要求11所述的细胞,其中所述细胞是植物细胞。
13.如权利要求12所述的细胞,其中所述多核苷酸或所述核酸构建体被稳定并入所述植物细胞的基因组。
14.如权利要求12所述的细胞,其中所述多核苷酸或所述核酸构建体被稳定并入所述植物细胞的叶绿体基因组。
15.如权利要求9-14中任一项所述的细胞,其中所述植物细胞来自单子叶植物。
16.如权利要求15所述的细胞,其中所述单子叶植物是玉米、小麦、稻、大麦、甘蔗、高粱或黑麦。
17.如权利要求12-14中任一项所述的细胞,其中所述植物细胞来自双子叶植物。
18.如权利要求17所述的细胞,其中所述双子叶植物是大豆、芸苔属植物、向日葵、棉花或苜蓿。
19.包含权利要求12-18中任一项所述的植物细胞的植物。
20.包含权利要求12-18中任一项所述的植物细胞的植物外植体。
21.如权利要求12-20中任一项所述的植物、外植体或植物细胞,其中所述植物、外植体或植物细胞与相同种类、品种或栽培品种的不包含权利要求1-7中任一项所述的至少一个多核苷酸的植物、外植体或植物细胞相比,表现出对HPH)除草剂的增加的不敏感性。
22.如权利要求12-21中任一项所述的植物、外植体或植物细胞,其中所述植物、外植体或植物细胞还包含至少一种赋予对其他除草剂的耐受性的多肽。
23.如权利要求22所述的植物、外植体或植物细胞,其中所述至少一种赋予对其他除草剂的耐受性的多肽包括 (a)耐磺酰脲的乙酰乳酸合酶; (b)耐咪唑啉酮的乙酰乳酸合酶; (c)耐草甘膦的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶; (d)耐草甘膦的草甘膦氧化还原酶; (e)草甘膦-N-乙酰基转移酶; (f)膦丝菌素乙酰基转移酶; (g)原卟啉原氧化酶。
(h)生长素酶; (i)P450多肽;或, (j)乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)。
24.如权利要求22所述的植物、外植体或植物细胞,其中所述至少一种赋予对其他除草剂的耐受性的多肽包括乙酰乳酸合酶(HRA)和/或草甘膦-N-乙酰基转移酶多肽的高抗性等位基因。
25.如权利要求12-24中任一项所述的植物、外植体或植物细胞,其中所述植物、外植体或植物细胞还包含至少一种赋予对HPro除草剂的耐受性的其他多肽。
26.如权利要求25所述的植物、外植体或植物细胞,其中所述至少一种多肽包括P450多肽或NSFl。
27.权利要求19或21-26中任一项所述的植物产生的转基因种子。
28.分离的或重组的多肽,其包含下述氨基酸序列 (a)与SEQID NO: 109具有至少1853的相似性评分; (b)与SEQID NO: 101具有至少1855的相似性评分; (c)与SEQID NO:50具有至少1862的相似性评分; (d)与SEQID NO:56或SEQ ID NO: 164具有至少1864的相似性评分; (e)与SEQID NO: 103具有至少2267的相似性评分; (f)与SEQID NO: 160具有至少2268的相似性评分;或, (j)与SEQ ID NO:412具有至少1855的相似性评分; 其中所述相似性评分是利用BLAST比对程序产生的,其中利用BLOSUM62替代矩阵,空位存在罚分为11,以及空位延伸罚分为1,其中所述多肽具有4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)活性并具有对HPH)除草剂的不敏感性。
29.分离的或重组的多肽,其包含下述氨基酸序列 (a)与SEQID NO:263具有至少1830的相似性评分; (b)与SEQID NO:212具有至少1839的相似性评分; (c)与SEQID NO:218具有至少1840的相似性评分; (d)与SEQID NO:320具有至少2152的相似性评分; (e)与SEQID NO:275具有至少2176的相似性评分; (f)与SEQID NO:265具有至少2177的相似性评分;或, (j)与SEQ ID NO:433具有至少1825的相似性评分; 其中所述相似性评分是利用BLAST比对程序产生的,其中利用BLOSUM62替代矩阵,空位存在罚分为11,以及空位延伸罚分为1,其中所述多肽具有4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)活性并具有对HPH)除草剂的不敏感性。
30.分离的或重组的多肽,其包含与SEQ ID N0:l、2、328、329、330、331、332、333、334、.335、336、337、338、339、340、327、391、392、394、396、466-489 中任一个具有至少 60%, 70%,.80%或90%序列同一性的氨基酸序列,其中所述多肽具有HPH)活性并表现出对HPH)抑制剂的不敏感性,其中 a)所述多肽中对应于SEQID NO: I的氨基酸位置414的氨基酸残基包括赖氨酸、精氨酸、组氨酸或丙氨酸; b)所述多肽中对应于SEQID NO: I的氨基酸位置341的氨基酸残基包括半胱氨酸; c)所述多肽中对应于SEQID NO: I的氨基酸位置341的氨基酸残基包括半胱氨酸,并且编码的多肽包含以下氨基酸残基中的至少一个对应于SEQ ID NO: I的氨基酸位置261的氨基酸残基包括丙氨酸,对应于SEQ ID NO: I的氨基酸位置301的氨基酸残基包括异亮氨酸,对应于SEQ ID NO: I的氨基酸位置327的氨基酸残基包括亮氨酸,对应于SEQ ID NO: I的氨基酸位置328的氨基酸残基包括脯氨酸,对应于SEQ ID NO: I的氨基酸位置360的氨基酸残基包括蛋氨酸,和/或对应于的氨基酸残基SEQ ID NO: I的氨基酸位置417包括甘氨酸。
d)所述多肽中对应于SEQID NO: I的氨基酸位置341的氨基酸残基包括谷氨酸,并且编码的多肽包含以下氨基酸残基中的至少一个对应于SEQ ID NO: I的氨基酸位置328的氨基酸残基包括脯氨酸,对应于SEQ ID NO: I的氨基酸位置360的氨基酸残基包括蛋氨酸,和/或对应于SEQ ID NO: I的氨基酸位置417的氨基酸残基包括甘氨酸; e)所述多肽中对应于SEQID NO: I的氨基酸位置417的氨基酸残基包括甘氨酸,并且所述多肽包含以下氨基酸残基中的至少一个对应于SEQ ID NO: I的氨基酸327的氨基酸位置包括亮氨酸,对应于SEQ ID NO: I的氨基酸331的氨基酸位置包括脯氨酸,和/或对应于氨基酸SEQ ID NO: I的氨基酸360的氨基酸位置包括蛋氨酸; f)所述多肽中对应于SEQID NO: I的氨基酸位置261的氨基酸残基包括丙氨酸和/或对应于SEQ ID NO: I的氨基酸位置301的氨基酸残基包括赖氨酸;以及对应于SEQ ID NO: I的氨基酸位置328的氨基酸残基包括脯氨酸,并且编码的多肽包含以下氨基酸残基中的至少一个对应于SEQ ID N O: I的氨基酸位置360的氨基酸残基包括蛋氨酸或对应于SEQ IDNO: 1的氨基酸位置417的氨基酸残基包括甘氨酸; g)所述多肽中对应于SEQID NO: I的氨基酸位置261的氨基酸残基包括丙氨酸和/或SEQ ID NO: I的氨基酸位置327包括亮氨酸;以及对应于SEQ ID NO: I的氨基酸位置331的氨基酸包括脯氨酸和对应于SEQ ID NO: I的氨基酸位置341的氨基酸包括谷氨酸; h)所述多肽中对应于SEQID NO: I的氨基酸位置209的氨基酸残基包括缬氨酸和SEQID NO: I的氨基酸位置233包括亮氨酸;以及编码的多肽包含以下氨基酸残基中的至少一个对应于SEQ ID NO: I的氨基酸位置301的氨基酸残基包括异亮氨酸和对应于SEQ IDNO: I的氨基酸位置327的氨基酸残基包括亮氨酸; i)所述多肽中对应于SEQID NO: I的氨基酸位置327的氨基酸残基包括亮氨酸和SEQID NO: I的氨基酸位置328包括脯氨酸;以及所述多肽包含以下氨基酸残基中的至少一个对应于SEQ ID NO: I的氨基酸位置233的氨基酸残基包括亮氨酸和对应于SEQ ID NO: I的氨基酸位置360的氨基酸残基包括蛋氨酸;或, j)编码的多肽中具有任何以下氨基酸残基中的至少1、2、3、4、5或6个对应于SEQ IDNO: I的氨基酸位置44的氨基酸残基包括谷氨酰胺、异亮氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、甘氨酸或缬氨酸;SEQ ID NO: I的氨基酸位置233包括蛋氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸;对应于SEQ ID NO: I的氨基酸位置316的氨基酸残基包括谷氨酰胺、赖氨酸或精氨酸;对应于SEQ ID NO: I的氨基酸位置331的氨基酸残基包括亮氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺或组氨酸;对应于SEQ ID NO: I的氨基酸位置341的氨基酸残基包括半胱氨酸、天冬氨酸或丙氨酸,或对应于SEQ ID NO: I的氨基酸位置360的氨基酸残基包括蛋氨酸或亮氨酸;或, k)编码的多肽中具有任何以下氨基酸残基中的至少1、2、3、4、5或6个对应于SEQ IDNO: I的氨基酸位置44的氨基酸残基包括组氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、甘氨酸或缬氨酸;SEQ ID NO: I的氨基酸位置233包括苯丙氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸;对应于SEQ ID NO: I的氨基酸位置316的氨基酸残基包括谷氨酰胺、赖氨酸或精氨酸;对应于SEQ ID NO: I的氨基酸位置331的氨基酸残基包括苏氨酸、亮氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺或组氨酸;对应于SEQ ID NO: I的氨基酸位置341的氨基酸残基包括精氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸或丙氨酸,或对应于SEQ ID NO: I的氨基酸位置360的氨基酸残基包括蛋氨酸、赖氨酸或亮氨酸。
31.分离的或重组的多肽,其包含(a)在 SEQ ID N0:l、2、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、327、391、392、394、396中任一个的全长上具有至少60%、70%、80%或90%序列同一性,并且具有 SEQ ID N0:377、372、373、374、375、376、378、379、380、381、382、460、461、462、463、467、468,469-488或489所示的氨基酸序列中至少一个的氨基酸序列,其中所述多肽具有4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)活性并表现出对HPH)抑制剂的不敏感性;或b.包含SEQ ID N0:377、372、373、374、375、376、378、379、380、381、382、460、461、462或463所示的氨基酸序列的HPro多肽,其中所述多肽具有HPro活性并表现出对HPro抑制剂的不敏感性。
32.如权利要求28-31中任一项所述的分离的或重组的多肽,其中所述多肽与SEQIDNO I所示的多肽或天然HPro多肽相比,具有对HPro除草剂的增加的不敏感性。
33.如权利要求32所述的分离的或重组的多肽,其中所述对HPI3D抑制剂的提高的不敏感性包括 a.酶和抑制剂的较慢的缔合速率,其是通过高于SEQID NO: I所示的多肽或天然HPH)的ON速率比来定量的; b.抑制剂从酶的较快的解离速率,其是通过高于SEQID NO: I所示的多肽或天然HPH)的OFF速率比来定量的;和/或, c.抑制剂与酶的较慢的缔合速率和抑制剂从酶的较快的解离速率,其是通过高于SEQID NO: I所示的多肽或天然HPro的ON速率比和OFF速率比结果来定量的。
34.如权利要求28-33中任一项所述的分离的或重组的多肽,其中所述多肽包含叶绿体转运肽序列,所述叶绿体转运肽序列包含 a.SEQ ID NO:490、371或464所示的氨基酸序列; b.编码与SEQID N0:490、371或464的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的多肽的核苷酸序列,其中所述多肽具有叶绿体转运肽活性;或, c.包含异源叶绿体转运肽序列的氨基酸序列。
35.产生能耐受4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)除草剂的植物细胞的方法,包括用权利要求1-7中任一项所述的多核苷酸或权利要求8、9、10或11中任一项所述的核酸构建体转化植物细胞。
36.如权利要求35所述的方法,还包括通过使植物细胞在一定浓度的HPH)除草剂的存在下生长来选择对HPro除草剂具有抗性的植物细胞,所述浓度的HPro除草剂能白化不包含权利要求1-7中任一项所述的多核苷酸或权利要求8、9、10或11中任一项所述的核酸构建体的植物细胞。
37.如权利要求36所述的方法,其中所述方法包括 a.在足够浓度的HPH)除草剂存在下培养所述植物细胞,使得所述植物细胞表现出白化; b.将权利要求1-7中任一项所述的多核苷酸或权利要求8、9、10或11中任一项所述的核酸构建体转化入步骤(a)中的所述植物细胞; c.使(b)中的所述植物细胞生长,其中转化的植物细胞不再表现出白化。
38.如权利要求35、36或37所述的方法,其中所述方法还包括从所述植物细胞再生出转基因植物。
39.如权利要求35-38中任一项所述的方法,其中所述转化植物细胞导致所述多核苷酸被稳定整合入所述植物细胞的基因组。
40.如权利要求35-38中任一项所述的方法,其中所述转化植物细胞导致所述多核苷酸被稳定整合入所述植物细胞中叶绿体的基因组。
41.控制具有农作物的田地中的杂草的方法,包括 (a)将权利要求27所述的转基因种子或权利要求19或21-26中任一项所述的植物种植在所述田地中;以及 (b)向田地中的任何农作物和杂草施用足够量的HPH)除草剂,从而控制杂草,而不会显著影响农作物。
42.如权利要求36、37或41中任一项所述的方法,其中所述HPI3D除草剂包括以下中的至少一个三酮、异噁唑、吡唑或苯并双环酮或以上的活性衍生物或农业可接受的盐。
43.如权利要求42所述的方法,其中所述ΗΡΗ)除草剂包括以下中的至少一个硝磺草酮、磺草酮、苯吡唑草酮、环磺酮、磺酰草吡唑、异噁唑草酮、吡草酮、苄草唑或吡唑特或以上的活性衍生物或农业可接受的盐。
44.如权利要求41所述的方法,还包括向田地中的农作物和杂草施用足够量的至少一种其他除草剂,包括草甘膦、双丙氨膦、膦丝菌素、唑啶草酮、氟丙嘧草酯、草硫膦、草铵膦、ALS抑制剂或原卟啉原氧化酶抑制剂。
45.检测HPH)多肽的方法,包括利用免疫测定分析植物组织,所述免疫测定包括一种或多种能特异性地识别权利要求28-34中任一项所述的多肽的抗体,其中所述一种抗体或多种抗体是由作为抗原的权利要求28-34中任一项所述的多肽引发的。
46.检测权利要求1-7中任一项所述的多核苷酸的存在的方法,包括利用PCR扩增分析植物组织和检测所述多核苷酸。
全文摘要
提供了包含多核苷酸和多肽的组合物和方法,所述多肽具有4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)活性并具有对HPPD抑制剂的不敏感性。还提供了具有HPPD序列的核酸构建体、植物、植物细胞、外植体、种子和谷类。提供了利用HPPD序列的不同方法。所述方法包括,例如,产生对HPPD抑制剂耐受的植物、植物细胞、外植体或种子的方法,以及利用本文公开的植物和/或种子来控制具有农作物的田地中的杂草的方法。还提供了鉴定其他HPPD变体的方法。还提供了允许不同HPPD多肽及其变体和片段在叶绿体中表达或被转运至叶绿体的不同方法和组合物。
文档编号C12Q1/68GK103237894SQ201180049180
公开日2013年8月7日 申请日期2011年8月12日 优先权日2010年8月13日
发明者亨里克·艾伯特, 艾瑞卡·R·波姆德兹, 琳达·A·卡索耳, 董玉霞, 马修·J·赫克特, 侯晶彤, 侯正林, 吕健, 丹尼尔·L·西赫尔, 陶余敏 申请人:先锋国际良种公司

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