通过分子计数提高等位基因调用的置信度的制作方法
专利名称：通过分子计数提高等位基因调用的置信度的制作方法
通过分子计数提高等位基因调用的置信度
背景技术：
基因分型是遗传研究中用于对基因组作图以及对与遗传性状(如，遗传疾病)有关的基因进行定位的一项重要技术。受试者的基因分型通常包括基于从受试者DNA获得的测序数据确定一个或多个基因组座位的等位基因。二倍体基因组(例如人基因组)可归类为例如在基因组座位上纯合的或杂合的，具体取决于它们针对该基因座所具有的不同等位基因的数量，其中杂合个体具有针对该基因座的两个不同的等位基因，而纯合个体具有针对该基因座的相同等位基因的两个拷贝。当在需要以高统计置信度将基因型与表型相关联的大群中进行研究时，对样品作出正确的基因分型至关重要。在通过测序对二倍体基因组进行的基因分型分析中，将特定基因组座位的覆盖度(测序读段(sequencing reads)的数量)用于确定等位基因调用的置信度。然而，当在样品制备过程中引入偏差时，例如，当起始样品的量有限时和/或当将一个或多个扩增反应用于制备测序样品时，等位基因调用的置信度将显著降低。因此，在具有有限量DNA的样品中，由于扩增偏差(例如，仅从很少的或甚至一个多核苷酸分子扩增)，可以观察到一条染色体上等位基因的覆盖度高于(即，高测序读段数量)不同染色体上等位基因的覆盖度。在这种情况下，当度量等位基因调用中的置信度时，仅依靠覆盖度可能会有误导。本发明可基于核酸序列分 析用于提高等位基因调用以及其他应用中的置信度，尤其是在大群样品中研究基因型的背景下。发明概述本发明的方面包括用于确定个体多核苷酸分子的数量的方法和组合物，该个体多核苷酸分子来源于已在特定序列分析配置或过程中测序的相同原始样品的相同基因组区域。在本发明的这些方面，将简并碱基区域(DBR)附接到随后将进行测序(例如，在进行某些过程步骤后，例如扩增和/或富集步骤后)的起始多核苷酸分子。存在于测序运行中的不同DBR序列的数量可用于确定/估计个体多核苷酸分子的数量，该个体多核苷酸分子来源于已在特定序列分析配置或过程中测序的相同原始样品的相同基因组区域。DBR可用于改善许多不同核酸测序应用的分析。例如，DBR使得能够在基因分型测定法中确定无法单独通过读段数量获得的等位基因调用统计值。在某些实施方案中，本发明的方面涉及用于确定多个不同样品中所测序的起始多核苷酸分子的数量的方法。在某些实施方案中，该方法包括:(I)将衔接子附接到多个不同样品中的起始多核苷酸分子，其中每个样品的衔接子包含:该样品特定的单一 MID ;和简并碱基区域(DBR)(例如，具有选自以下的至少一个核苷酸碱基的DBR:R、Y、S、W、K、Μ、B、D、H、V、N及其修饰形式；(2)将多个不同的衔接子附接的样品混合以生成混合样品；(3)扩增混合样品中的衔接子附接的多核苷酸；(4)对多个扩增的衔接子附接的多核苷酸测序，其中获得该多个衔接子附接的多核苷酸的每一个的MID、DBR和多核苷酸至少一部分的序列；以及(5)确定存在于来自每个样品的该多个测序衔接子附接的多核苷酸中的不同DBR序列的数量，以确定或估计已在测序步骤中测序的每个样品中的起始多核苷酸的数量。附图简述
本发明通过以下详细说明在结合附图阅读时可以得到最好的理解。附图中包括以下各图:
图1显示了由指定量的起始材料(各图的顶部；以纳克为单位)制备的样品中各MID的等位基因比。图2显示了在合成多态性位置与每个等位基因相关的各MID的DBR序列的分数。样品由指定量的起始材料(各图的顶部；以纳克为单位)制备。图3显示了使用具有DBR序列的引物在PCR的前两个循环中产生的产物。定义除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。另外，为了清楚和方便参考起见，下文将定义某些要素。本文所用的核酸化学、生物化学、遗传学和分子生物学的术语和符号遵循本领域中的标准专著和文献中的那些术语和符号，例如:Kornberg和Baker, DNAReplication,第二版(W.H.Freeman, New York,1992) ；Lehninger, Biochemistry,第二版(Worth Publishers, New York, 1975) ；Strachan 和 Read, Human MolecularGenetics,第二版(Wiley-Liss, New York, 1999) ;Eckstein 编辑，Oligonucleotides andAnalogs:A Practical Approach(Oxford University Press, New York, 1991) ；Gait 编辑，Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach(IRL Press, Oxford, 1984)等等。“扩增子”是指多核苷酸扩增反应的产物。也就是说，其为一群从一个或多个起始序列复制的通常为双链的多核苷酸`。该一个或多个起始序列可以是相同序列的一个或多个拷贝，或者其可以是不同序列的混合物。扩增子可以通过多种扩增反应产生，这些反应的产物是一个或多个靶核酸的多个复制物。一般来讲，产生扩增子的扩增反应为“模板驱动的”，因为反应物(核苷酸或寡核苷酸)的碱基配对在形成反应产物所需的模板多核苷酸中具有互补序列。在一个方面，模板驱动的反应为通过核酸聚合酶进行的引物延伸或通过核酸连接酶进行的寡核苷酸连接。此类反应包括但不限于以下参考文献中所公开的聚合酶链反应(PCR)、线性聚合酶反应、核酸序列依赖性扩增(NASBA)、滚环扩增等等:Mullis等，美国专利 4,683，195,4, 965, 188,4, 683, 202,4, 800, 159 (PCR) ;GeIfand 等，美国专利5，210, 015(通过1么0獻#*1”探针进行的实时PCR);Wittwer等，美国专利6，174，670 ；Kacian等，美国专利5, 399, 491 (iiNASBAO ;Lizardi，美国专利5, 854, 033 ;Aono等，日本专利公告JP4-262799(滚环扩增)等，这些参考文献以弓I用方式并入本文。在一个方面，本发明的扩增子通过PCR产生。如果可以采用允许随着扩增反应的进行对反应产物进行测量的检测化学方法，则扩增反应可以是“实时”扩增，例如，如下所述的“实时PCR”，或Leone等，NucleicAcids Research, 26:2150-2155 (1998)以及相似参考文献中所述的“实时NASBA”。如本文所用，术语“扩增”是指进行扩增反应。“反应混合物”是指含有进行反应所需的所有反应物的溶液，这些反应物可包括但不限于在反应中将PH维持在所选水平的缓冲剂、盐、辅因子、清除剂等。术语“评估”包括任何形式的测量，并包括确定某要素是否存在。术语“确定”、“测量”、“评价”、“估计”、“评估”和“测定”可互换使用，并包括定量和定性确定。评估可以是相对的或绝对的。“评估...的存在”包括确定存在的某物的量，和/或确定其是否存在。
“不对称标记的”多核苷酸具有不同的左衔接子结构域和右衔接子结构域。该过程一般称为不对称地附接衔接子或不对称地标记多核苷酸，例如多核苷酸片段。具有不对称衔接子末端的多核苷酸的产生可以通过任何适宜的方式实现。示例性的不对称衔接子见述于:美国专利 5，712，126 和 6，372，434 ;美国专利公开 2007/0128624 和 2007/0172839 ；以及PCT公开W0/2009/032167 ;所有这些专利均以引用方式整体并入本文。在某些实施方案中，所用的不对称衔接子为2009年4月29日提交的美国专利申请系列第12/432，080号中所述的那些，该专利以引用方式整体并入本文。作为一个实例，本发明的使用者可以使用不对称衔接子来标记多核苷酸。“不对称衔接子”是指这样的衔接子，当连接到双链核酸片段的两端时，它将导致产生引物延伸或产生具有位于感兴趣基因组插入片段侧翼的不同序列的扩增产物。连接后通常为后续处理步骤，以便生成不同的末端衔接子序列。例如，不对称衔接子附接的片段的复制产生多核苷酸产物，其中在末端衔接子序列之间存在至少一个核酸序列差异或核苷酸/核苷修饰。将衔接子不对称地附接到多核苷酸(例如，多核苷酸片段)产生在一个末端具有一个或多个衔接子序列(如，一个或多个区域或结构域，例如引物结合位点)的多核苷酸，该衔接子序列不存在或与另一末端上的衔接子序列相比具有不同的核酸序列。应当注意，称为“不对称衔接子”的衔接子本身不必在结构上不对称，也不仅仅是将不对称衔接子附接到多核苷酸片段后就立即使其成为不对称的。相反，在每一末端具有相同的不对称衔接子的不对称衔接子附接的多核苷酸产生的复制产物(或分离的单链多核苷酸)相对于在相对两端上的衔接子序列为不对称的(例如，在至少一轮扩增/引物延伸后)。任何适宜的不对称衔接子或不对称附接衔接子的过程均可用于实践本发明。示例性的不对称衔接子见述于:美国专利5，712，126和6，372，434 ;美国专利公开2007/0128624和2007/0172839 ;以及PCT公开W0/2009/032167 ;所有这些参考文献均以引用方式整体并入本文。在某些实施方案中，所用的不对称衔接子为2009年4月29日提交的美国专利申请系列第12/432，080号中所述的那些，该专利以引用方式整体并入本文。
“互补的”或“实质上互补的”是指核苷酸或核酸之间的杂交或碱基配对或双链体形成，诸如在双链DNA分子的两条链之间或在寡核苷酸引物与单链核酸上的引物结合位点之间。互补的核苷酸通常为A和T(或A和U)，或C和G。两个单链RNA或DNA分子在以下情况中被称为实质上互补的:当一条链的核苷酸(最优比对和比较并具有合适的核苷酸插入或缺失)与另一条链的核苷酸的至少约80%、通常至少约90%至95%以及更优选地约98%至100%配对时。作为另外一种选择，当RNA或DNA链将在选择性杂交条件下与其互补序列杂交时存在实质互补性。通常，选择性杂交将在至少14至25个核苷酸的片段上存在至少约65%互补性、优选至少约75%互补性、更优选至少约90%互补性时发生。参见M.KanehisaNucleic Acids Res.12:203 (1984)，该文献以引用方式并入本文。
“双链体”是指完全或部分互补的至少两个寡核苷酸和/或多核苷酸在它们的所有或大部分核苷酸中发生Watson-Crick型碱基配对使得形成稳定的复合物。术语“退火”和“杂交”可互换使用以表示形成稳定的双链体。关于双链体的“完美匹配的”是指构成双链体的多核苷酸或寡核苷酸链彼此之间形成双链结构，使得每条链中的每个核苷酸与另一条链中的核苷酸发生Watson-Crick碱基配对。稳定的双链体可包括双链体链之间的Watson-Crick碱基配对和/或非Watson-Crick碱基配对(其中碱基配对是指形成氢键)。在某些实施方案中，非Watson-Crick碱基配对包括核苷类似物，诸如脱氧肌苷、2，6- 二氨基嘌呤、PNA、LNA等。在某些实施方案中，非Watson-Crick碱基配对包括“摆动碱基”，诸如脱氧肌苷、8-氧代-dA、8-氧代-dG等，其中所谓“摆动碱基”是指这样的核酸碱基，其可与互补核酸链中的第一核苷酸碱基进行碱基配对，但是当用作核酸合成的模板链时会导致将第二不同的核苷酸碱基并入合成链中(摆动碱基将在下文进一步详细描述)。在两个寡核苷酸或多核苷酸之间的双链体中的“错配”是指双链体中的一对核苷酸未能发生Watson-Crick键合。关于基因组或靶多核苷酸的“基因座位”、“基因座”或“感兴趣基因座”是指基因组或靶多核苷酸的连续亚区或片段。如本文所用，基因座位、基因座或感兴趣基因座可以指核苷酸、基因组中的基因或基因的一部分的位置，包括线粒体DNA或其他非染色体DNA(例如，细菌质粒)，或者其可以指基因组序列的任何连续部分，而无论其是否在基因内或与基因相关。基因座位、基因座或感兴趣基因座可以来自单个核苷酸至长度为几百个或几千个核苷酸或更长的片段。一般来讲，感兴趣基因座将具有与其相关的参考序列(参见下文的“参考序列”说明)。“试剂盒”是指用于递送材料或试剂以进行本发明方法的任何递送系统。在反应测定法的背景下，此类递送系统包括允许储存、运输、或从一个位置到另一位置递送反应试剂(如，合适容器中的探针、酶等)和/或辅助材料(如，缓冲剂、进行测定法的书面说明等)的系统。例如，试剂盒包括装有相关反应试剂和/或辅助材料的一个或多个封闭物(例如，盒子)。此类内容物可一起或单独地递送给预期的受体。例如，第一容器可装有用于测定法的酶，而第二容器则装有探针。“连接”是指在两个或更多个核酸例如寡核苷酸和/或多核苷酸的末端之间形成共价键或键合。键或键合的性质可差异巨大，并且连接可通过酶促或化学方式进行。如本文所用，连接通常通过酶促方式进行，以在一个寡核苷酸的末端核苷酸的5’碳与另一个寡核苷酸的3’碳之间形成磷酸二酯键合。多种模板驱动的连接反应在以下参考文献中有所描述，这些参考文献以引用方式并入:Whiteley等,美国专利4，883，750 ；Letsinger等,美国专利 5，476，930 ；Fung 等，美国专利 5，593，826 ;Kool，美国专利 5，426，180 ；Landegren 等，美国专利 5,871,921 ;Xu 和 Kool, Nucleic Acids Research, 27:875-881 (1999) ；Higgins等，Methods in Enzymology,68:50-71(1979) ;Engler 等，The Enzymes, 15:3-29(1982)；以及Namsaraev，美国专利公开2004/0110213。如本文所用的“多重标识”(Multiplex Identifier, MID)是指与多核苷酸相关的一个标记或标记组合，其同一'I"生(例如，标记DNA序列)可用于区分样品中的多核苷酸。在某些实施方案中，多核苷酸上的MID用于识别多核苷酸的来源。例如，核酸样品可以是源自不同来源的多核苷酸(例如，源自不同个体、不同组织或细胞的多核苷酸，或在不同时间点分离的多核苷酸)的库，其中将来自每个不同来源的多核苷酸用单一 MID标记。因此，MID提供多核苷酸与其来源之间的关联。在某些实施方案中，将MID用于单一标记样品中的每个个体多核苷酸。样品中单一MID的数量的确定可提供样品中存在多少个体多核苷酸的读出(或被操纵的多核苷酸样品源自多少原始多核苷酸，参见例如2009年5月26日公布的美国专利第7，537，897号，该专利以引用方式整体并入本文)。MID通常由核苷酸碱基构成，并且长度可在2至100个核苷酸碱基或更多个碱基的范围内，以及可以包含多个亚基，其中每个不同的MID具有不同的同一性和/或亚基顺序。可用作MID的示例性核酸标记在以下专利中有所描述:2009年6月6日公布的并且名称为"Nucleic Acid AnalysisUsing Sequence Tokens"的美国专利7，544，473，以及2008年7月I日公布的并且名称为“Methods and Compositions for Tagging and Identifying Polynucleotides，，的美国专利7，393，665，这两份专利中关于核酸标记及其在鉴定多核苷酸中的用途的说明以引用方式整体并入本文。在某些实施方案中，用于标记多个样品的MID集合不必具有任何特定的共同性质(例如，Tm、长度、碱基组成等)，因为本文所述的方法可适应多种单一 MID集合。这里应当强调，MID只需在给定的实验中是单一的。因此，相同的MID可用于标记在不同的实验中处理的不同样品。此外，在某些实验中，使用者可以使用相同的MID来标记同一实验内不同样品的子集。例如，源自具有特定表型的个体的所有样品可用相同的MID标记，例如，源自对照(或野生型)受试者的所有样品可用第一 MID标记，而患有病症的受试者可用第二MID(不同于第一 MID)标记。又如,可能有利的是,将源自相同来源的不同样品用不同的MID标记(例如，在不同时间得到的 样品，或源自组织内的不同位点的样品)。另外，MID可通过多种不同的方式生成，例如，通过组合标记方法，其中一个MID通过连接而附接，第二个MID通过引物延伸而附接。因此，可按多种不同的方式设计并实施MID以在处理和分析过程中跟踪多核苷酸片段，并因此就这一点而言不旨在进行限制。如本文所用的“下一代测序”(NGS)是指能够以常规测序方法(例如，标准Sanger或Maxam-Gilbert测序方法)无可比拟的速度对多核苷酸测序的测序技术。这些无可比拟的速度通过平行地进行并读出几千至几百万个测序反应而实现。NGS测序平台包括但不限于以下这些:大规模平行签名测序(Lynx Therapeutics) ;454焦磷酸测序(454 LifeSciences/Roche Diagnostics);固相可逆染料终止子测序(Solexa/Illumina) ;S0LiD 技术(Applied Biosystems);离子半导体测序(1n Torrent)和 DNA 纳米球测序(CompleteGenomics)。某些NGS平台的说明可见于以下参考文献:Shendure等，"Next-generationDNA sequencing, " Nature, 2008,第 26 卷，N0.10, 1135-1145 ；Mardis, " The impact ofnext-generation sequencing technology on genetics, " Trends in Genetics, 2007,第 24 卷，N0.3,第 133-141 页；Su 等，“Next-generation sequencing and itsapplications in molecular diagnostics，，Expert Rev Mol Diagn, 2011，11 (3):333-43 ;以及 Zhang 等，“The impact of next-generation sequencing on genomics，，，J GenetGenomics, 2011, 38(3): 95-109 如本文所用的“核苷”包括天然核苷，包括2 '-脱氧和2 '-羟基形式，例如，如 Kornberg 和 Baker, DNA Replication,第 2 版(Freeman, San Francisco, 1992)中所述。关于核苷的“类似物”包括具有修饰碱基部分和/或修饰糖部分的合成核苷，例如，如Scheit, Nucleotide Analogs(John Wiley, New York, 1980) ;Uhlman 和 Peyman, ChemicalReviews, 90:543-584(1990)等文献中所述，前提是它们能够特异性杂交。此类类似物包括被设计为增强结合性质、降低复杂性、提高特异性等的合成核苷。包括具有增强的杂交或核酸酶抗性性质的类似物的多核苷酸在以下参考文献中有所描述=Uhlman和Peyman (上文引用)；Crooke 等,Exp.0pin.Ther.Patents, 6:855-870 (1996) ；Mesmaeker 等,CurrentOpinion in Structual Biology, 5:343-355 (1995);等等。能够增强双链体稳定性的多核苷酸的示例性类型包括寡核苷酸N3' — P5'磷酰胺酯(本文称为“酰胺化物”)、肽核酸(本文称为"PNA")、寡-2' -O-烷基核糖核苷酸、含C-5丙炔基嘧啶的多核苷酸、锁核酸(“LNA”)以及类似化合物。此类寡核苷酸可商购获得或可使用参考文献中所述的方法合成。“聚合酶链反应”或“PCR”是指通过DNA互补链的同时引物延伸而体外扩增特定DNA序列的反应。换句话讲，PCR是制备侧翼为引物结合位点的靶核酸的多个拷贝或复制物的反应，此类反应包括以下步骤的一个或多个重复:(i)使靶核酸变性，( )使引物退火到引物结合位点，以及(iii)在三磷酸核苷存在下通过核酸聚合酶延伸引物。通常，使反应在热循环仪中通过针对每个步骤而优化的不同温度进行循环。特定的温度、每个步骤的持续时间以及步骤之间的变化速率取决于本领域普通技术人员熟知的许多因素，例如以下参考文献中不例性不出的因素:McPherson等编辑，PCR:A Practical Approach和PCR2:APractical ApproachC IRL Press, Oxford,分别为 1991 和 1995 年)。例如，在使用 Taq DNA聚合酶的常规PCR中，可使双链靶核酸在>90°C的温度下变性，使引物在50-75°C范围内的温度下退火，以及使引物在72-78°C范围内的温度下延伸。术语“PCR”涵盖反应的衍生形式，包括但不限于RT-PCR、实时PCR、巢式PCR、定量PCR、多重PCR等。反应体积可在几纳升(例如2nL)至几百UL (例如200yL)的范围内。“逆转录PCR”或“RT-PCR”是指其前是将靶RNA转化为互补单链DNA (然后进行扩增)的逆转录反应的PCR，例如Tecott等的美国专利5，168，038，该专利以引用方式并入本文。“实时PCR”是指随着反应的进行对反应产物即扩增子的量进行监测的PCR。存在许多形式的实时PCR，其主要区别在于用于监测反应产物的检测化学，例如Gelfand等，美国专利5,210,015( “TAQMAN ”) ；ffittwer等，美国专利6，174，670和6，569，627 (插入染料)；Tyagi等，美国专利5，925，517 (分子信标)；这些专利以引用方式并入本文。实时PCR的检测化学在Mackay等，NucleicAcids Research, 30:1292-1305 (2002)中进行了综述，该参考文献也以引用方式并入本文。“巢式PCR”是指两阶段PCR，其中第一 PCR的扩增子变成使用一个新的引物集合的第二 PCR的样品，这些引物中的至少一个结合到第一扩增子的内部位置。如本文所用，关于巢式扩增反应的“初始引物”是指用于生成第一扩增子的引物，而“第二引物”是指用于生成第二或巢式扩增子的一个或多个引物。“多重PCR”是指其中在同一反应混合物中同时进行多个靶序列(或单 个靶序列和一个或多个参考序列)的PCR，例如Bernard等，Anal.Biochem.,273:221-228(1999)(双色实时PCR)。通常，将不同的引物集合用于每个扩增的序列。“多核苷酸”或“寡核苷酸”可互换使用，每一个均为指核苷酸单体的线性聚合物。构成多核苷酸和寡核苷酸的单体能够通过正常模式的单体间相互作用特异性结合到天然多核苷酸，这些相互作用诸如为Watson-Crick型碱基配对、碱基堆积、Hoogsteen或反式Hoogsteen型碱基配对、摆动碱基配对等等。如下文将详细描述，所谓“摆动碱基”是指这样的核酸碱基，其可与互补核酸链中的第一核苷酸碱基进行碱基配对，但是当用作核酸合成的模板链时会导致将第二不同的核苷酸碱基并入合成链中。此类单体及其核苷酸间键合可天然存在，或可以为其类似物，例如天然存在的或非天然存在的类似物。非天然存在的类似物可包括肽核酸(PNA，例如，如以引用方式并入本文的美国专利5，539, 082中所述)、锁核酸(LNA，例如，如以弓丨用方式并入本文的美国专利6，670，461中所述)、硫代磷酸核苷酸间键合、含有允许附接标签(诸如荧光团或半抗原)的连接基团的碱基，等等。每当寡核苷酸或多核苷酸的使用需要酶法处理时(诸如通过聚合酶延伸、通过连接酶连接等等)，普通技术人员将会理解，在那些情况下的寡核苷酸或多核苷酸将不含核苷酸间键合、糖部分或者任何位置或一些位置的碱基的某些类似物。多核苷酸的大小通常在几个单体单元(例如5至40个，此时通常称之为“寡核苷酸”)至几千个单体单元的范围内。每当多核苷酸或寡核苷酸由一系列字母(大小或小写)诸如"ATGCCTG"表示时，应当理解，核苷酸从左至右处于5' —3'顺序，并且"A"表示脱氧腺苷、"C"表示脱氧胞苷、"G"表示脱氧鸟苷，以及"T"表示胸苷、“I”表示脱氧肌苷、“U”表示尿苷，除非另外指明或上下文显而易见。除非另有说明，否则术语和原子编号惯例将遵循Strachan和Read, Human MolecularGenetics2 (Wiley-Liss, New York, 1999)中所公开的那些。通常，多核苷酸包含通过磷酸二酯键合连接的四个天然核苷(例如对于DNA而言为脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷或对于RNA而言为其核糖对应物)；然而，它们还可包含非天然核苷酸类似物，例如包含修饰的碱基、糖或核苷酸间键合。对本领域的技术人员将显而易见的是，如果酶对于活性而言具有特定的寡核苷酸或多核苷酸底物要求，例如单链DNA、RNA/DNA双链体等，则选择寡核苷酸或多核苷酸底物的合适组成将在普通技术人员的知识范围内，尤其是通过专著中的指导原则，诸如 Sambrook 等，Molecular Cloning,第二版(Cold Spring HarborLaboratory, New York, 1989)等参考文献。“引物”是指天然的或合成的寡核苷酸，其在与多核苷酸模板形成双链体时能够作为核酸合成的引发点，并从其3’末端沿着模板延伸使得形成延伸的双链体。在延伸过程中添加的核苷酸的序列由模板多核苷酸的序列确定。通常，引物通过DNA聚合酶延伸。引物通常具有与其在引物延伸产物合成中的用途相容的长度，并通常在8至100个核苷酸长度的范围内，诸如10至75个、15至60个、15至40个、18至30个、20至40个、21至50个、22至45个、25至40个等等，更通常地在18至40个、20至35个、21至30个核苷酸长的范围内，以及所述范围之间的任何长度。典型的引物可在10至50个核苷酸长的范围内，诸如15至45个、18至40个、20至30个、21至25个等等以及所述范围之间的任何长度。在一些实施方案中，引物通常不超过约 10、12、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65或70个核苷酸长。引物通常为单链的以便获得最大的扩增效率，但作为另外一种选择也可以为双链的。如果为双链的，则通常在用于制备延伸产物前首先对引物进行处理，以将其链分离。该变性步骤通常受加热影响，但作为另外一种选择可使用碱然后进行中和而进行。因此，“引物”与模板互补，并通过氢键或杂交与模板复合以得到用于通过聚合酶弓I发合成的引物/模板复合物，该复合物在DNA合成过程中通过添加连接到其与模板互补的3 ^末端的共价键合碱基而延伸。如本文所用的“引物对”是指第一和第二引物，其具有适于基于核酸的靶核酸扩增的核酸序列。此类引物对通常包括具有与靶核酸第一部分的序列相同或相似的序列的第一引物，以及具有与靶核酸第二部分互补的序列的第二引物，以提供靶核酸或其片段的扩增。在本文提及“第一”和“第二”引物是任意的，除非另有具体指明。例如，第一引物可被设计为“正向引物”(其从靶核 酸的5’末端引发核酸合成)或设计为“反向引物”(其从通过正向引物引发的合成中产生的延伸产物的5’末端引发核酸合成)。同样，第二引物可被设计成正向引物或反向引物。
“读出”是指可转化成数字或数值的测量出和/或检测到的一个或多个参数。一些背景下，读出可以指此类采集或记录的数据的真实数字表示。例如，微阵列中荧光强度信号的读出是在微阵列每个杂交位点生成的信号的地址和荧光强度；因此，这样的读出可以按多种方式登记或存储，例如，作为微阵列的图像、作为数字表格等等。“反射位点”、“反射序列”和等同形式用于表示存在于多核苷酸中的一个或多个序列，它们用于在多核苷酸中将某结构域以分子内的方式从其初始位置移动到不同位置。反射序列的使用在名称为 “Compositions and Methods for Intramolecular Nucleic AcidRearrangement”、于2011年2月24日作为W0/2011/021102公开并且以引用方式并入本文的PCT专利申请系列第PCT/IB2010/02243号中有详细描述。在某些实施方案中，对反射序列进行选择，以便与多核苷酸中的其他序列不同(即，与可能存在于多核苷酸中的诸如待处理的基因组或亚基因组序列的其他序列具有很低的序列同源性)。因此，应当选择反射序列，以使得在反射过程中所用的条件下除了其互补序列外不与任何序列杂交。反射序列可以是合成的或人工生成的序列(例如，在衔接子结构域添加到多核苷酸)或通常存在于进行测定的多核苷酸中的序列(例如，存在于进行测定的多核苷酸的感兴趣区域内的序列)。在反射系统中，在与反射序列相同的多核苷酸链上(例如，双链多核苷酸的相同链上或相同的单链多核苷酸上)存在(例如，插入衔接子结构域)反射序列的互补序列，其中将该互补序列置于特定的位置以便促进此特定链上的分子内结合和聚合事件。用于本文所述的反射过程的反射序列因此可具有多种长度和序列。反射序列的长度可在5至200个核苷酸碱基的范围内。“固体载体”、“载体”和“固相载体”可互换使用并且是指具有一个或多个刚性或半刚性表面的一种材料或一组材料。在许多实施方案中，固体载体的至少一个表面将为实质上平坦的，但在一些实施方案中可能有利的是通过例如孔、凸起区域、柱、蚀刻槽等针对不同的化合物将合成区域在物理上分离。根据其他实施方案，固体载体将采取珠粒、树脂、凝胶、微球或其他几何构型的形式。微阵列通常包括至少一个平坦的固相载体，诸如玻璃显微镜载玻片。关于一个分子与另一个分子(诸如探针的标记靶序列)结合的“特异性的”或“特异性”是指两个分子之间的识别、接触以及形成稳定复合物，并且该分子与其他分子的识别、接触或复合物形成显著更低。在一个方面，关于第一分子与第二分子结合的“特异性的”是指就第一分子识别某反应中或样品中的另一分子并与其形成复合物而言，它与第二分子形成最大数量的复合物。优选地，该最大数量为至少百分之五十。一般来讲，在特异性结合事件中涉及的分子在其表面上或在腔体中具有引起彼此结合的分子之间发生特异性识别的区域。特异性结合的实例包括抗体-抗原相互作用、酶-底物相互作用、多核苷酸和/或寡核苷酸中双链体或三链体的形成、生物素-亲和素或生物素-链霉亲和素相互作用、受体-配体相互作用等等。如本文所用，关于特异性或特异性结合的“接触”是指两个分子足够近，使得弱非共价化学相互作用(诸如范德华力、氢键、碱基堆积相互作用、离子和疏水相互作用等)在分子相互作用中占主导地位。
如本文所用，术语“Tm”关于“熔融温度”而使用。熔融温度是一群双链核酸分子变为半解离成单链时的温度(例如，以。C度量)。计算核酸Tni的多个公式在本领域中是已知的(参见例如 Anderson 和 Young, Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic AcidHybridization (1985))。其他参考文献(例如 Allawi, H.T.和 SantaLucia, J., Jr., Biochemistry36, 10581-94(1997))包括可供选择的计算方法，这些方法在计算Tm时考虑了结构和环境以及序列特性。“样品”是指一定量的来自生物、环境、医疗或患者来源的材料，在其中寻求对靶核酸进行检测、测量或标记。在一方面，其旨在包括标本或培养物(例如，微生物培养物)。在另一方面，其旨在包括生物和环境样品两者。样品可包括合成来源的标本。生物样品可以是动物，包括人、液体、固体(如粪便)或组织，以及液体和固体食物和饲料产品及配料，诸如乳制品、蔬菜、肉类和肉类副产品，以及废弃物。生物样品可包括从患者采集的物质，包括但不限于培养物、血液、唾液、脑脊髓液、胸膜液、乳汁、淋巴液、痰、精液、针吸出物等等。生物样品可从家畜以及未驯服的或野生的动物的所有家族中获得，包括但不限于诸如有蹄类、熊、鱼、啮齿类等动物。环境样品包括诸如地表物质、土壤、水体和工业样品的环境材料，以及从食物和乳品加工仪器、装置、设备、器皿、一次性和非一次性物品获得的样品。这些样品不应视为限制适用于本发明的样品类型。在描述核酸分子取向和/或聚合反应时的术语“上游”和“下游”在本文以本领域技术人员所理解的含义使用。因此，“下游”通常是指向5'至3'方向进行，即其中核苷酸聚合酶延伸序列时通常所采取的方向，而“上游”通常具有相反的含义。例如，在相同靶核酸分子上杂交第二引物“上游”的第一引物位于第二引物的5,侧上(并因此而言从第一引物发生的核酸聚合反应向第二引物进行)。还应当注意，可以起草权利要求书以排除任何可选要素。因此，该陈述旨在作为在结合权利要求要素的详述使用诸如“单独”、“仅”等排他性术语时或使用“负面”限制时的前置基础。 发明详述在描述本发明前，应当理解本发明不限于所述的特定实施方案，因此当然可以发生变化。还应当理解，本文所用的术语只是为了描述特定实施方案，并非旨在进行限制，因为本发明的范围将只由所附权利要求书限定。如果提供了值的范围，则应当理解，介于该范围上限与下限之间的每个居间值直至下限单位的十分之一(除非上下文另有明确指出)也具体予以公开。介于所述范围中的任何所述值或居间值之间的每个更小的范围以及该所述范围中的任何其他所述或居间值被包括在本发明的范围内。这些较小范围的上限和下限可独立地被包括在所述范围内或被排除在所述范围外，并且其中两个限值之一包括在该较小范围内、两个限值均不包括在该较小范围内或者两个限值均包括在该较小范围内的每个范围也被包括在本发明的范围内，受所述范围内任何具体排除的限值的约束。如果所述范围包含所述限值的一个或两个，则排除这些所含限值一者或两者的范围也包括在本发明内。除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所述领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。虽然类似于或等同于本文所述的那些的任何方法和材料也可用于实践或检验本发明，但现在描述一些有潜力的和优选的方法和材料。本文提及的所有出版物以引用方式并入，以公开和描述与所引述的出版物相关的方法和/或材料。应当理解，当存在矛盾时，本公开将取代所并入的出版物的任何公开内容。必须注意，如本文和所附权利要求书中所用，单数形式“一”、“一个/种”和“该/所述”包括复数指代物，除非上下文另有明确指出。因此，例如，提及“一种核酸”包括多种这样的核酸，而提及“该化合物”包括提及本领域技术人员已知的一种或多种化合物及其等同物，等等。除非另外指明，否则本发明的实践均可采用在本领域技术范围内的有机化学、聚合物技术、分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术和说明。此类常规技术包括聚合物阵列合成(polymer array synthesis)、杂交、连接和使用标记检测杂交。合适技术的具体例证可参考下文的实例。然而，其他等同的常规程序当然也可以使用。此类常规技术和说明可见于标准实验室手册，诸如Genome AnalysisiALaboratory Manual Series (第 1-1V 卷)，Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cells:A Laboratory Manual, PCR Primer:A Laboratory Manual 以及 MolecularCloning:A Laboratory Manual (均得自 Cold Spring Harbor Laboratory Press),Stryer, L.(1995) Biochemistry (第 4 版)Freeman, New York, Gait, “OligonucleotideSynthesis:A Practical Approach，，1984, IRL Press, London, Nelson and Cox (2000), Lehninger, A., Principles of Biochemistry 第 3 版，W.H.Freeman Pub., New York, N.Y.以及Berg 等(2002) Biochemistry,第 5 版，W.H.Freeman Pub., New York, N.Y.,它们均以引用方式整体并入本文以用于所有目的。本文所述的出版物仅针对它们在本专利申请提交日之前的公开内容而提供。此处的任何信息均不应解释为承认本发明不能 因为是在先发明而先于这些出版物。另外，所提供的
公开日可能不同于实际的
公开日，这可能需要独立地进行确认。如上所概述，本发明的方面涉及添加到进行序列分析的多核苷酸的简并核苷酸碱基(例如，在简并碱基区域或DBR中)的用途，其可用于确定个体多核苷酸分子的数量，该个体多核苷酸分子来源于已在特定序列分析配置或过程中测序的相同原始样品的相同基因组区域。在进行测序分析的多核苷酸中包括DBR可用于多种遗传分析，包括通过提供确定等位基因调用统计值(该值无法单独通过读段数量而得出)的机制而提高等位基因调用的置信度。DBR可以通过任何适宜的方式添加到多核苷酸，包括作为附接到进行测序的多核苷酸的衔接子(或衔接子库)的一部分，例如，DBR可位于还包括测序引物位点的衔接子中，或者DBR可存在于核酸合成引物(例如PCR引物)中，使得当将引物用于聚合反应时将DBR添加到靶核苷酸。DBR还可用于对混合的多核苷酸样品进行遗传分析，其中该混合样品中的每个多核苷酸均包含其来源样品特定的MID (下文将详细描述)。这允许使用者确定经合并以生成混合样品的各来源样品中某一特定多核苷酸种类(或多个种类)的序列覆盖度。因此，本发明的实施方案包括对混合样品中的多核苷酸进行序列分析，其中每个多核苷酸均包含MID和 DBR。趁璧本发明(如下文详细描述)可用于操纵和分析来自几乎任何核酸来源的感兴趣核酸序列(或多核苷酸)，包括但不限于基因组DNA、互补DNA (cDNA)、RNA (如信使RNA、核糖体RNA、短干扰RNA、微RNA等)、质粒DNA、线粒体DNA、合成DNA等。此外，任何有机体、有机材料或含核酸的底物均可用作将要根据本发明处理的核酸的来源，包括但不限于植物、动物(如爬行动物、哺乳动物、昆虫、蠕虫、鱼等)、组织样品、细菌、真菌(如酵母)、噬菌体、病毒、尸体组织、考古学/远古样品等。在某些实施方案中，核酸样品中的核酸源自哺乳动物，其中在一些实施方案中该哺乳动物为人。在某些实施方案中，使核酸序列富集。所谓富集是指使核酸(例如，在多核苷酸样品中)接受降低核酸复杂性的过程，通常通过提高样品中特定核酸种类的相对浓度(例如，具有特定的感兴趣基因座、包含特定的核酸序列、不含某基因座或序列、在特定的大小范围内等等)。有多种方式可富集具有特定性质或序列的核酸，并且就这一点而言可以采用能实现该目的的任何适宜方法。富集(或降低复杂性)可在所述过程的多个步骤中的任何一个发生，并将由使用者的意愿决定。例如，富集可在个体亲本样品(例如，在连接衔接子前的未标记核酸)中或在多重化样品(例如，用编码MID的衔接子序列标记的核酸;MID将在下文进一步详细描述)中发生。·在某些实施方案中，在分析前扩增核酸样品中的核酸。在这些实施方案的一些中，扩增反应还起到针对感兴趣序列或基因座富集起始核酸样品的作用。例如，可使起始核酸样品接受扩增一个或多个感兴趣区域的聚合酶链反应(PCR)。在某些实施方案中，扩增反应为指数式扩增反应，而在某些其他实施方案中，扩增反应为线性扩增反应。对起始核酸样品进行扩增反应的任何适宜方法均可用于实践本发明。在某些实施方案中，用于扩增反应的核酸聚合酶为具有校正能力的聚合酶(例如，Phi29 DNA聚合酶、嗜热高温球菌(Thermococcus litoralis)DNA 聚合酶、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)DNA 聚合酶等)。在某些实施方案中，进行分析的核酸样品源自单个来源(例如，单个有机体、病毒、组织、细胞、受试者等)，而在其他实施方案中，核酸样品为从多个来源提取出的核酸的库(例如，来自多个有机体、组织、细胞、受试者等的核酸的库)，其中所谓“多个”是指两个或更多个。因此，在某些实施方案中，核酸样品可包含来自2个或更多个来源、3个或更多个来源、5个或更多个来源、10个或更多个来源、50个或更多个来源、100个或更多个来源、500个或更多个来源、1000个或更多个来源、5000个或更多个来源、10，000个或更多个来源、25，000个或更多个来源等的核酸。在某些实施方案中，待与核酸片段混合的核酸片段源自多个来源(例如，多个有机体、组织、细胞、受试者等)，其中所谓“多个”是指两个或更多个。在此类实施方案中，源自每个来源的核酸包含多重标识(MID)，使得可以确定每个标记核酸片段的来源。在此类实施方案中，将每个核酸样品来源与单一 MID相关联，其中所谓“单一 MID”是指所用的每个不同的MID在至少一个特性(例如MID的核酸序列)方面可区别于所用的每个其他MID。可以使用任何类型的MID，包括但不限于在以下专利中所述的那些:于2007年I月22日提交的并且名称为"Nucleic Acid Analysis Using Sequence Tokens"的共同未决的美国专利申请系列第11/656，746号，以及于2008年7月I日提交的并且名称为“Methods andCompositions for Tagging and Identifying Polynucleotides，，的美国专利 7，393，665,这两份专利中关于核酸标记的说明及其在鉴定多核苷酸中的用途的内容以引用方式整体并入本文。在某些实施方案中，用于标记多个样品的MID集合不必具有任何特定的共同性质(例如，Tm、长度、碱基组成等)，因为不对称标记方法(以及许多标记读出方法，包括但不限于标记测序或标记长度测量)可适应多种单一 MID集合。简并碱某区域(DBR)
本发明的方面包括用于确定或估计个体多核苷酸分子的数量的方法和组合物，该个体多核苷酸分子来源于已在特定序列分析配置或过程中测序的相同原始样品的相同基因组区域。在本发明的这些方面，将简并碱基区域(DBR)附接到随后将进行测序(例如，在进行某些过程步骤后，例如扩增和/或富集，例如PCR)的起始多核苷酸分子。如下详述，评价存在于测序运行中的不同DBR序列的数量(在一些情况下，为序列组合的数量)允许确定已针对特定多核苷酸(或感兴趣区域；R0I)测序的不同起始多核苷酸的数量(或最小数量)。该数量可用于例如给出等位基因基因调用中置信度的统计度量，并因此提高进行此类等位基因测定时的置信度(例如，当调用纯合等位基因时XDBR还允许识别如果未检出时会对遗传分析造成负面影响的潜在测序或扩增误差。DNA测序通常包括将衔接子附接到待测序的样品中的多核苷酸的步骤，其中衔接子包含测序引物位点(例如，通过连接)。如本文所用，“测序引物位点”是与测序引物(当为单链形式时)的序列相同或互补的多核苷酸区域或在测序引物序列与其互补序列之间形成的双链区域。测序引物位点的特定取向可由本领域普通技术人员从包含测序引物位点的特定多核苷酸的结构特征中推断出。除了测序引物位点外，还将简并碱基区域(DBR)作为含测序引物位点的衔接子的一部分或者独立地(例如，在附接到多核苷酸的第二衔接子中)附接到多核苷酸。任何适宜的将DBR附接或添加到多核苷酸的方法均可采用。DBR是与样品中的其他标记多核苷酸相比可具有可变碱基组成或序列(其可被视为“随机的”)的区域。在样品的一群多核苷酸中的不同DBR的数量将取决于DBR中碱基的数量以及可存在于每个位置的不同碱基的潜在数量。因此，一群附接有含2个碱基位置(其中每个位置可以为A、C、G和T中的任一者)的DBR的多核苷酸将可能具有16种不同的DBR (AA、AC、AG等)。DBR可因此包含1、2、3、4、5、6、7、
8、9、10个或更多个碱基，包括15个或更多个、20个或更多个等等。在某些实施方案中，DBR的长度为3至10个碱基。此外，DBR中的每个位置可具有不同的碱基组成。例如，4个碱基的DBR可具有以下任一种组成:NNNN、NRSN、SffSff,BDHV (有关IUPAC核苷酸编码，参见下表I)。还应当注意，在某些实施方案中，DBR中的碱基可因具有可检测的修饰或附接到其上的其他部分而不同。例如，某些下一代测序平台(例如，Pacific Biosciences )可用于在测序过程中检测碱基中的甲基化差异。因此，DBR中的非甲基化碱基可能不同于DBR中的甲基化碱基。因此，不旨在对DBR的长度或碱基组成进行限制。
权利要求
1.一种估计多个样品中所测序的起始多核苷酸分子的数量的方法，所述方法包括: 将衔接子附接到多个不同样品中的起始多核苷酸分子，其中每个样品对应的所述衔接子包含: 所述样品特定的单一 MID ;和 简并碱基区域(DBR)，其包含选自以下的至少一个核苷酸碱基:R、Y、S、W、K、Μ、B、D、H、V、N及其修饰形式； 将所述多个不同的衔接子附接的样品混合以生成混合样品； 扩增所述混合样品中的所述衔接子附接的多核苷酸； 对多个所述扩增的衔接子附接的多核苷酸测序，其中获得所述多个衔接子附接的多核苷酸的每一个的所述MID、所述DBR和所述多核苷酸至少一部分的序列；以及 确定存在于来自每个样品的所述多个测序衔接子附接的多核苷酸中的不同DBR序列的数量，以确定已在测序步骤中测序的每个样品中的起始多核苷酸的数量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述衔接子进一步包含测序引物位点。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述衔接子进一步包含以下一者或多者:反射序列和启动子位点。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述DBR包含至少2个核苷酸碱基，其中所述至少2个核苷酸碱基的每一个选自:R、Y、S、W、K、Μ、B、D、H、V和N。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述DBR包含3至20个核苷酸碱基，其中所述3至10个核苷酸碱基的每一个选自:R、Y、S、W、K、Μ、B、D、H、V和N。
6.根据权利要求1所述的方法，其中将已在测序步骤中测序的每个样品中的多核苷酸的确定数量用于等位基因调用方法。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述测序步骤包括进行下一代测序过程。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个样品中的每一个为基因组DNA样品。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述多个不同的基因组DNA样品中的每一个源自不同的受试者。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述受试者为人。
11.根据权利要求1所述的方法，而且其中在所述附接步骤前针对感兴趣区域富集所述样品。
12.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括针对感兴趣区域富集所述衔接子附接的多核苷酸。
13.根据权利要求4所述的方法，其中所述衔接子为不对称衔接子，其中第一衔接子结构域存在于所述多核苷酸的第一末端并且第二衔接子区域存在于所述多核苷酸的第二末端，其中所述DBR为包含所述第一衔接子结构域中的所述至少2个核苷酸碱基的一个或多个以及所述第二衔接子结构域中的所述至少2个核苷酸碱基的一个或多个的断裂DBR。
14.根据权利要求1所述的方法，其中将所述衔接子在扩增反应中附接到所述多核苷酸分子，其中所述DBR存在于用于所述扩增反应的合成引物中。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述扩增反应为PCR。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述方法进一步包括确定在所述PCR反应中扩增的起始多核苷酸的数量。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法涉及确定所述样品中所述多核苷酸的遗传异质性。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述样品包含源自肿瘤组织的多核苷酸。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述样品包含源自微生物和/或病毒的多核苷酸。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法涉及确定存在于所述多个不同样品中的所述多核苷酸的遗传异质性。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述多个不同的样品源自肿瘤的不同切片。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述多个不同的样品源自受试者的不同肿瘤。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述多个不同的样品源自在不同时间的受试者。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述受试者存在感染，其中确定一种或多种感染原在不同时间的遗传异质性。`
全文摘要
本发明的方面包括用于确定个体多核苷酸分子的数量的方法和组合物，所述个体多核苷酸分子来源于已在特定序列分析配置或过程中测序的相同原始样品的相同基因组区域。在本发明的这些方面，将简并碱基区域(DBR)附接到随后将进行测序(例如，在进行某些过程步骤后，例如扩增和/或富集步骤后)的起始多核苷酸分子。存在于测序运行中的不同DBR序列的数量可用于确定/估计已进行测序的不同起始多核苷酸的数量。DBR可用于增强许多不同的核酸序列分析应用，包括允许在基因分型应用中实现更高置信度的等位基因调用测定。
文档编号C12Q1/68GK103154273SQ201180049727
公开日2013年6月12日 申请日期2011年9月20日 优先权日2010年9月21日
发明者J·卡斯本, S·布伦那, R·奥斯本, C·利希藤斯坦, A·克拉斯 申请人:群体遗传学科技有限公司
通过分子计数提高等位基因调用的置信度
背景技术：
基因分型是遗传研究中用于对基因组作图以及对与遗传性状(如，遗传疾病)有关的基因进行定位的一项重要技术。受试者的基因分型通常包括基于从受试者DNA获得的测序数据确定一个或多个基因组座位的等位基因。二倍体基因组(例如人基因组)可归类为例如在基因组座位上纯合的或杂合的，具体取决于它们针对该基因座所具有的不同等位基因的数量，其中杂合个体具有针对该基因座的两个不同的等位基因，而纯合个体具有针对该基因座的相同等位基因的两个拷贝。当在需要以高统计置信度将基因型与表型相关联的大群中进行研究时，对样品作出正确的基因分型至关重要。在通过测序对二倍体基因组进行的基因分型分析中，将特定基因组座位的覆盖度(测序读段(sequencing reads)的数量)用于确定等位基因调用的置信度。然而，当在样品制备过程中引入偏差时，例如，当起始样品的量有限时和/或当将一个或多个扩增反应用于制备测序样品时，等位基因调用的置信度将显著降低。因此，在具有有限量DNA的样品中，由于扩增偏差(例如，仅从很少的或甚至一个多核苷酸分子扩增)，可以观察到一条染色体上等位基因的覆盖度高于(即，高测序读段数量)不同染色体上等位基因的覆盖度。在这种情况下，当度量等位基因调用中的置信度时，仅依靠覆盖度可能会有误导。本发明可基于核酸序列分 析用于提高等位基因调用以及其他应用中的置信度，尤其是在大群样品中研究基因型的背景下。发明概述本发明的方面包括用于确定个体多核苷酸分子的数量的方法和组合物，该个体多核苷酸分子来源于已在特定序列分析配置或过程中测序的相同原始样品的相同基因组区域。在本发明的这些方面，将简并碱基区域(DBR)附接到随后将进行测序(例如，在进行某些过程步骤后，例如扩增和/或富集步骤后)的起始多核苷酸分子。存在于测序运行中的不同DBR序列的数量可用于确定/估计个体多核苷酸分子的数量，该个体多核苷酸分子来源于已在特定序列分析配置或过程中测序的相同原始样品的相同基因组区域。DBR可用于改善许多不同核酸测序应用的分析。例如，DBR使得能够在基因分型测定法中确定无法单独通过读段数量获得的等位基因调用统计值。在某些实施方案中，本发明的方面涉及用于确定多个不同样品中所测序的起始多核苷酸分子的数量的方法。在某些实施方案中，该方法包括:(I)将衔接子附接到多个不同样品中的起始多核苷酸分子，其中每个样品的衔接子包含:该样品特定的单一 MID ;和简并碱基区域(DBR)(例如，具有选自以下的至少一个核苷酸碱基的DBR:R、Y、S、W、K、Μ、B、D、H、V、N及其修饰形式；(2)将多个不同的衔接子附接的样品混合以生成混合样品；(3)扩增混合样品中的衔接子附接的多核苷酸；(4)对多个扩增的衔接子附接的多核苷酸测序，其中获得该多个衔接子附接的多核苷酸的每一个的MID、DBR和多核苷酸至少一部分的序列；以及(5)确定存在于来自每个样品的该多个测序衔接子附接的多核苷酸中的不同DBR序列的数量，以确定或估计已在测序步骤中测序的每个样品中的起始多核苷酸的数量。附图简述
本发明通过以下详细说明在结合附图阅读时可以得到最好的理解。附图中包括以下各图:
图1显示了由指定量的起始材料(各图的顶部；以纳克为单位)制备的样品中各MID的等位基因比。图2显示了在合成多态性位置与每个等位基因相关的各MID的DBR序列的分数。样品由指定量的起始材料(各图的顶部；以纳克为单位)制备。图3显示了使用具有DBR序列的引物在PCR的前两个循环中产生的产物。定义除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。另外，为了清楚和方便参考起见，下文将定义某些要素。本文所用的核酸化学、生物化学、遗传学和分子生物学的术语和符号遵循本领域中的标准专著和文献中的那些术语和符号，例如:Kornberg和Baker, DNAReplication,第二版(W.H.Freeman, New York,1992) ；Lehninger, Biochemistry,第二版(Worth Publishers, New York, 1975) ；Strachan 和 Read, Human MolecularGenetics,第二版(Wiley-Liss, New York, 1999) ;Eckstein 编辑，Oligonucleotides andAnalogs:A Practical Approach(Oxford University Press, New York, 1991) ；Gait 编辑，Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach(IRL Press, Oxford, 1984)等等。“扩增子”是指多核苷酸扩增反应的产物。也就是说，其为一群从一个或多个起始序列复制的通常为双链的多核苷酸`。该一个或多个起始序列可以是相同序列的一个或多个拷贝，或者其可以是不同序列的混合物。扩增子可以通过多种扩增反应产生，这些反应的产物是一个或多个靶核酸的多个复制物。一般来讲，产生扩增子的扩增反应为“模板驱动的”，因为反应物(核苷酸或寡核苷酸)的碱基配对在形成反应产物所需的模板多核苷酸中具有互补序列。在一个方面，模板驱动的反应为通过核酸聚合酶进行的引物延伸或通过核酸连接酶进行的寡核苷酸连接。此类反应包括但不限于以下参考文献中所公开的聚合酶链反应(PCR)、线性聚合酶反应、核酸序列依赖性扩增(NASBA)、滚环扩增等等:Mullis等，美国专利 4,683，195,4, 965, 188,4, 683, 202,4, 800, 159 (PCR) ;GeIfand 等，美国专利5，210, 015(通过1么0獻#*1”探针进行的实时PCR);Wittwer等，美国专利6，174，670 ；Kacian等，美国专利5, 399, 491 (iiNASBAO ;Lizardi，美国专利5, 854, 033 ;Aono等，日本专利公告JP4-262799(滚环扩增)等，这些参考文献以弓I用方式并入本文。在一个方面，本发明的扩增子通过PCR产生。如果可以采用允许随着扩增反应的进行对反应产物进行测量的检测化学方法，则扩增反应可以是“实时”扩增，例如，如下所述的“实时PCR”，或Leone等，NucleicAcids Research, 26:2150-2155 (1998)以及相似参考文献中所述的“实时NASBA”。如本文所用，术语“扩增”是指进行扩增反应。“反应混合物”是指含有进行反应所需的所有反应物的溶液，这些反应物可包括但不限于在反应中将PH维持在所选水平的缓冲剂、盐、辅因子、清除剂等。术语“评估”包括任何形式的测量，并包括确定某要素是否存在。术语“确定”、“测量”、“评价”、“估计”、“评估”和“测定”可互换使用，并包括定量和定性确定。评估可以是相对的或绝对的。“评估...的存在”包括确定存在的某物的量，和/或确定其是否存在。
“不对称标记的”多核苷酸具有不同的左衔接子结构域和右衔接子结构域。该过程一般称为不对称地附接衔接子或不对称地标记多核苷酸，例如多核苷酸片段。具有不对称衔接子末端的多核苷酸的产生可以通过任何适宜的方式实现。示例性的不对称衔接子见述于:美国专利 5，712，126 和 6，372，434 ;美国专利公开 2007/0128624 和 2007/0172839 ；以及PCT公开W0/2009/032167 ;所有这些专利均以引用方式整体并入本文。在某些实施方案中，所用的不对称衔接子为2009年4月29日提交的美国专利申请系列第12/432，080号中所述的那些，该专利以引用方式整体并入本文。作为一个实例，本发明的使用者可以使用不对称衔接子来标记多核苷酸。“不对称衔接子”是指这样的衔接子，当连接到双链核酸片段的两端时，它将导致产生引物延伸或产生具有位于感兴趣基因组插入片段侧翼的不同序列的扩增产物。连接后通常为后续处理步骤，以便生成不同的末端衔接子序列。例如，不对称衔接子附接的片段的复制产生多核苷酸产物，其中在末端衔接子序列之间存在至少一个核酸序列差异或核苷酸/核苷修饰。将衔接子不对称地附接到多核苷酸(例如，多核苷酸片段)产生在一个末端具有一个或多个衔接子序列(如，一个或多个区域或结构域，例如引物结合位点)的多核苷酸，该衔接子序列不存在或与另一末端上的衔接子序列相比具有不同的核酸序列。应当注意，称为“不对称衔接子”的衔接子本身不必在结构上不对称，也不仅仅是将不对称衔接子附接到多核苷酸片段后就立即使其成为不对称的。相反，在每一末端具有相同的不对称衔接子的不对称衔接子附接的多核苷酸产生的复制产物(或分离的单链多核苷酸)相对于在相对两端上的衔接子序列为不对称的(例如，在至少一轮扩增/引物延伸后)。任何适宜的不对称衔接子或不对称附接衔接子的过程均可用于实践本发明。示例性的不对称衔接子见述于:美国专利5，712，126和6，372，434 ;美国专利公开2007/0128624和2007/0172839 ;以及PCT公开W0/2009/032167 ;所有这些参考文献均以引用方式整体并入本文。在某些实施方案中，所用的不对称衔接子为2009年4月29日提交的美国专利申请系列第12/432，080号中所述的那些，该专利以引用方式整体并入本文。
“互补的”或“实质上互补的”是指核苷酸或核酸之间的杂交或碱基配对或双链体形成，诸如在双链DNA分子的两条链之间或在寡核苷酸引物与单链核酸上的引物结合位点之间。互补的核苷酸通常为A和T(或A和U)，或C和G。两个单链RNA或DNA分子在以下情况中被称为实质上互补的:当一条链的核苷酸(最优比对和比较并具有合适的核苷酸插入或缺失)与另一条链的核苷酸的至少约80%、通常至少约90%至95%以及更优选地约98%至100%配对时。作为另外一种选择，当RNA或DNA链将在选择性杂交条件下与其互补序列杂交时存在实质互补性。通常，选择性杂交将在至少14至25个核苷酸的片段上存在至少约65%互补性、优选至少约75%互补性、更优选至少约90%互补性时发生。参见M.KanehisaNucleic Acids Res.12:203 (1984)，该文献以引用方式并入本文。
“双链体”是指完全或部分互补的至少两个寡核苷酸和/或多核苷酸在它们的所有或大部分核苷酸中发生Watson-Crick型碱基配对使得形成稳定的复合物。术语“退火”和“杂交”可互换使用以表示形成稳定的双链体。关于双链体的“完美匹配的”是指构成双链体的多核苷酸或寡核苷酸链彼此之间形成双链结构，使得每条链中的每个核苷酸与另一条链中的核苷酸发生Watson-Crick碱基配对。稳定的双链体可包括双链体链之间的Watson-Crick碱基配对和/或非Watson-Crick碱基配对(其中碱基配对是指形成氢键)。在某些实施方案中，非Watson-Crick碱基配对包括核苷类似物，诸如脱氧肌苷、2，6- 二氨基嘌呤、PNA、LNA等。在某些实施方案中，非Watson-Crick碱基配对包括“摆动碱基”，诸如脱氧肌苷、8-氧代-dA、8-氧代-dG等，其中所谓“摆动碱基”是指这样的核酸碱基，其可与互补核酸链中的第一核苷酸碱基进行碱基配对，但是当用作核酸合成的模板链时会导致将第二不同的核苷酸碱基并入合成链中(摆动碱基将在下文进一步详细描述)。在两个寡核苷酸或多核苷酸之间的双链体中的“错配”是指双链体中的一对核苷酸未能发生Watson-Crick键合。关于基因组或靶多核苷酸的“基因座位”、“基因座”或“感兴趣基因座”是指基因组或靶多核苷酸的连续亚区或片段。如本文所用，基因座位、基因座或感兴趣基因座可以指核苷酸、基因组中的基因或基因的一部分的位置，包括线粒体DNA或其他非染色体DNA(例如，细菌质粒)，或者其可以指基因组序列的任何连续部分，而无论其是否在基因内或与基因相关。基因座位、基因座或感兴趣基因座可以来自单个核苷酸至长度为几百个或几千个核苷酸或更长的片段。一般来讲，感兴趣基因座将具有与其相关的参考序列(参见下文的“参考序列”说明)。“试剂盒”是指用于递送材料或试剂以进行本发明方法的任何递送系统。在反应测定法的背景下，此类递送系统包括允许储存、运输、或从一个位置到另一位置递送反应试剂(如，合适容器中的探针、酶等)和/或辅助材料(如，缓冲剂、进行测定法的书面说明等)的系统。例如，试剂盒包括装有相关反应试剂和/或辅助材料的一个或多个封闭物(例如，盒子)。此类内容物可一起或单独地递送给预期的受体。例如，第一容器可装有用于测定法的酶，而第二容器则装有探针。“连接”是指在两个或更多个核酸例如寡核苷酸和/或多核苷酸的末端之间形成共价键或键合。键或键合的性质可差异巨大，并且连接可通过酶促或化学方式进行。如本文所用，连接通常通过酶促方式进行，以在一个寡核苷酸的末端核苷酸的5’碳与另一个寡核苷酸的3’碳之间形成磷酸二酯键合。多种模板驱动的连接反应在以下参考文献中有所描述，这些参考文献以引用方式并入:Whiteley等,美国专利4，883，750 ；Letsinger等,美国专利 5，476，930 ；Fung 等，美国专利 5，593，826 ;Kool，美国专利 5，426，180 ；Landegren 等，美国专利 5,871,921 ;Xu 和 Kool, Nucleic Acids Research, 27:875-881 (1999) ；Higgins等，Methods in Enzymology,68:50-71(1979) ;Engler 等，The Enzymes, 15:3-29(1982)；以及Namsaraev，美国专利公开2004/0110213。如本文所用的“多重标识”(Multiplex Identifier, MID)是指与多核苷酸相关的一个标记或标记组合，其同一'I"生(例如，标记DNA序列)可用于区分样品中的多核苷酸。在某些实施方案中，多核苷酸上的MID用于识别多核苷酸的来源。例如，核酸样品可以是源自不同来源的多核苷酸(例如，源自不同个体、不同组织或细胞的多核苷酸，或在不同时间点分离的多核苷酸)的库，其中将来自每个不同来源的多核苷酸用单一 MID标记。因此，MID提供多核苷酸与其来源之间的关联。在某些实施方案中，将MID用于单一标记样品中的每个个体多核苷酸。样品中单一MID的数量的确定可提供样品中存在多少个体多核苷酸的读出(或被操纵的多核苷酸样品源自多少原始多核苷酸，参见例如2009年5月26日公布的美国专利第7，537，897号，该专利以引用方式整体并入本文)。MID通常由核苷酸碱基构成，并且长度可在2至100个核苷酸碱基或更多个碱基的范围内，以及可以包含多个亚基，其中每个不同的MID具有不同的同一性和/或亚基顺序。可用作MID的示例性核酸标记在以下专利中有所描述:2009年6月6日公布的并且名称为"Nucleic Acid AnalysisUsing Sequence Tokens"的美国专利7，544，473，以及2008年7月I日公布的并且名称为“Methods and Compositions for Tagging and Identifying Polynucleotides，，的美国专利7，393，665，这两份专利中关于核酸标记及其在鉴定多核苷酸中的用途的说明以引用方式整体并入本文。在某些实施方案中，用于标记多个样品的MID集合不必具有任何特定的共同性质(例如，Tm、长度、碱基组成等)，因为本文所述的方法可适应多种单一 MID集合。这里应当强调，MID只需在给定的实验中是单一的。因此，相同的MID可用于标记在不同的实验中处理的不同样品。此外，在某些实验中，使用者可以使用相同的MID来标记同一实验内不同样品的子集。例如，源自具有特定表型的个体的所有样品可用相同的MID标记，例如，源自对照(或野生型)受试者的所有样品可用第一 MID标记，而患有病症的受试者可用第二MID(不同于第一 MID)标记。又如,可能有利的是,将源自相同来源的不同样品用不同的MID标记(例如，在不同时间得到的 样品，或源自组织内的不同位点的样品)。另外，MID可通过多种不同的方式生成，例如，通过组合标记方法，其中一个MID通过连接而附接，第二个MID通过引物延伸而附接。因此，可按多种不同的方式设计并实施MID以在处理和分析过程中跟踪多核苷酸片段，并因此就这一点而言不旨在进行限制。如本文所用的“下一代测序”(NGS)是指能够以常规测序方法(例如，标准Sanger或Maxam-Gilbert测序方法)无可比拟的速度对多核苷酸测序的测序技术。这些无可比拟的速度通过平行地进行并读出几千至几百万个测序反应而实现。NGS测序平台包括但不限于以下这些:大规模平行签名测序(Lynx Therapeutics) ;454焦磷酸测序(454 LifeSciences/Roche Diagnostics);固相可逆染料终止子测序(Solexa/Illumina) ;S0LiD 技术(Applied Biosystems);离子半导体测序(1n Torrent)和 DNA 纳米球测序(CompleteGenomics)。某些NGS平台的说明可见于以下参考文献:Shendure等，"Next-generationDNA sequencing, " Nature, 2008,第 26 卷，N0.10, 1135-1145 ；Mardis, " The impact ofnext-generation sequencing technology on genetics, " Trends in Genetics, 2007,第 24 卷，N0.3,第 133-141 页；Su 等，“Next-generation sequencing and itsapplications in molecular diagnostics，，Expert Rev Mol Diagn, 2011，11 (3):333-43 ;以及 Zhang 等，“The impact of next-generation sequencing on genomics，，，J GenetGenomics, 2011, 38(3): 95-109 如本文所用的“核苷”包括天然核苷，包括2 '-脱氧和2 '-羟基形式，例如，如 Kornberg 和 Baker, DNA Replication,第 2 版(Freeman, San Francisco, 1992)中所述。关于核苷的“类似物”包括具有修饰碱基部分和/或修饰糖部分的合成核苷，例如，如Scheit, Nucleotide Analogs(John Wiley, New York, 1980) ;Uhlman 和 Peyman, ChemicalReviews, 90:543-584(1990)等文献中所述，前提是它们能够特异性杂交。此类类似物包括被设计为增强结合性质、降低复杂性、提高特异性等的合成核苷。包括具有增强的杂交或核酸酶抗性性质的类似物的多核苷酸在以下参考文献中有所描述=Uhlman和Peyman (上文引用)；Crooke 等,Exp.0pin.Ther.Patents, 6:855-870 (1996) ；Mesmaeker 等,CurrentOpinion in Structual Biology, 5:343-355 (1995);等等。能够增强双链体稳定性的多核苷酸的示例性类型包括寡核苷酸N3' — P5'磷酰胺酯(本文称为“酰胺化物”)、肽核酸(本文称为"PNA")、寡-2' -O-烷基核糖核苷酸、含C-5丙炔基嘧啶的多核苷酸、锁核酸(“LNA”)以及类似化合物。此类寡核苷酸可商购获得或可使用参考文献中所述的方法合成。“聚合酶链反应”或“PCR”是指通过DNA互补链的同时引物延伸而体外扩增特定DNA序列的反应。换句话讲，PCR是制备侧翼为引物结合位点的靶核酸的多个拷贝或复制物的反应，此类反应包括以下步骤的一个或多个重复:(i)使靶核酸变性，( )使引物退火到引物结合位点，以及(iii)在三磷酸核苷存在下通过核酸聚合酶延伸引物。通常，使反应在热循环仪中通过针对每个步骤而优化的不同温度进行循环。特定的温度、每个步骤的持续时间以及步骤之间的变化速率取决于本领域普通技术人员熟知的许多因素，例如以下参考文献中不例性不出的因素:McPherson等编辑，PCR:A Practical Approach和PCR2:APractical ApproachC IRL Press, Oxford,分别为 1991 和 1995 年)。例如，在使用 Taq DNA聚合酶的常规PCR中，可使双链靶核酸在>90°C的温度下变性，使引物在50-75°C范围内的温度下退火，以及使引物在72-78°C范围内的温度下延伸。术语“PCR”涵盖反应的衍生形式，包括但不限于RT-PCR、实时PCR、巢式PCR、定量PCR、多重PCR等。反应体积可在几纳升(例如2nL)至几百UL (例如200yL)的范围内。“逆转录PCR”或“RT-PCR”是指其前是将靶RNA转化为互补单链DNA (然后进行扩增)的逆转录反应的PCR，例如Tecott等的美国专利5，168，038，该专利以引用方式并入本文。“实时PCR”是指随着反应的进行对反应产物即扩增子的量进行监测的PCR。存在许多形式的实时PCR，其主要区别在于用于监测反应产物的检测化学，例如Gelfand等，美国专利5,210,015( “TAQMAN ”) ；ffittwer等，美国专利6，174，670和6，569，627 (插入染料)；Tyagi等，美国专利5，925，517 (分子信标)；这些专利以引用方式并入本文。实时PCR的检测化学在Mackay等，NucleicAcids Research, 30:1292-1305 (2002)中进行了综述，该参考文献也以引用方式并入本文。“巢式PCR”是指两阶段PCR，其中第一 PCR的扩增子变成使用一个新的引物集合的第二 PCR的样品，这些引物中的至少一个结合到第一扩增子的内部位置。如本文所用，关于巢式扩增反应的“初始引物”是指用于生成第一扩增子的引物，而“第二引物”是指用于生成第二或巢式扩增子的一个或多个引物。“多重PCR”是指其中在同一反应混合物中同时进行多个靶序列(或单 个靶序列和一个或多个参考序列)的PCR，例如Bernard等，Anal.Biochem.,273:221-228(1999)(双色实时PCR)。通常，将不同的引物集合用于每个扩增的序列。“多核苷酸”或“寡核苷酸”可互换使用，每一个均为指核苷酸单体的线性聚合物。构成多核苷酸和寡核苷酸的单体能够通过正常模式的单体间相互作用特异性结合到天然多核苷酸，这些相互作用诸如为Watson-Crick型碱基配对、碱基堆积、Hoogsteen或反式Hoogsteen型碱基配对、摆动碱基配对等等。如下文将详细描述，所谓“摆动碱基”是指这样的核酸碱基，其可与互补核酸链中的第一核苷酸碱基进行碱基配对，但是当用作核酸合成的模板链时会导致将第二不同的核苷酸碱基并入合成链中。此类单体及其核苷酸间键合可天然存在，或可以为其类似物，例如天然存在的或非天然存在的类似物。非天然存在的类似物可包括肽核酸(PNA，例如，如以引用方式并入本文的美国专利5，539, 082中所述)、锁核酸(LNA，例如，如以弓丨用方式并入本文的美国专利6，670，461中所述)、硫代磷酸核苷酸间键合、含有允许附接标签(诸如荧光团或半抗原)的连接基团的碱基，等等。每当寡核苷酸或多核苷酸的使用需要酶法处理时(诸如通过聚合酶延伸、通过连接酶连接等等)，普通技术人员将会理解，在那些情况下的寡核苷酸或多核苷酸将不含核苷酸间键合、糖部分或者任何位置或一些位置的碱基的某些类似物。多核苷酸的大小通常在几个单体单元(例如5至40个，此时通常称之为“寡核苷酸”)至几千个单体单元的范围内。每当多核苷酸或寡核苷酸由一系列字母(大小或小写)诸如"ATGCCTG"表示时，应当理解，核苷酸从左至右处于5' —3'顺序，并且"A"表示脱氧腺苷、"C"表示脱氧胞苷、"G"表示脱氧鸟苷，以及"T"表示胸苷、“I”表示脱氧肌苷、“U”表示尿苷，除非另外指明或上下文显而易见。除非另有说明，否则术语和原子编号惯例将遵循Strachan和Read, Human MolecularGenetics2 (Wiley-Liss, New York, 1999)中所公开的那些。通常，多核苷酸包含通过磷酸二酯键合连接的四个天然核苷(例如对于DNA而言为脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷或对于RNA而言为其核糖对应物)；然而，它们还可包含非天然核苷酸类似物，例如包含修饰的碱基、糖或核苷酸间键合。对本领域的技术人员将显而易见的是，如果酶对于活性而言具有特定的寡核苷酸或多核苷酸底物要求，例如单链DNA、RNA/DNA双链体等，则选择寡核苷酸或多核苷酸底物的合适组成将在普通技术人员的知识范围内，尤其是通过专著中的指导原则，诸如 Sambrook 等，Molecular Cloning,第二版(Cold Spring HarborLaboratory, New York, 1989)等参考文献。“引物”是指天然的或合成的寡核苷酸，其在与多核苷酸模板形成双链体时能够作为核酸合成的引发点，并从其3’末端沿着模板延伸使得形成延伸的双链体。在延伸过程中添加的核苷酸的序列由模板多核苷酸的序列确定。通常，引物通过DNA聚合酶延伸。引物通常具有与其在引物延伸产物合成中的用途相容的长度，并通常在8至100个核苷酸长度的范围内，诸如10至75个、15至60个、15至40个、18至30个、20至40个、21至50个、22至45个、25至40个等等，更通常地在18至40个、20至35个、21至30个核苷酸长的范围内，以及所述范围之间的任何长度。典型的引物可在10至50个核苷酸长的范围内，诸如15至45个、18至40个、20至30个、21至25个等等以及所述范围之间的任何长度。在一些实施方案中，引物通常不超过约 10、12、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65或70个核苷酸长。引物通常为单链的以便获得最大的扩增效率，但作为另外一种选择也可以为双链的。如果为双链的，则通常在用于制备延伸产物前首先对引物进行处理，以将其链分离。该变性步骤通常受加热影响，但作为另外一种选择可使用碱然后进行中和而进行。因此，“引物”与模板互补，并通过氢键或杂交与模板复合以得到用于通过聚合酶弓I发合成的引物/模板复合物，该复合物在DNA合成过程中通过添加连接到其与模板互补的3 ^末端的共价键合碱基而延伸。如本文所用的“引物对”是指第一和第二引物，其具有适于基于核酸的靶核酸扩增的核酸序列。此类引物对通常包括具有与靶核酸第一部分的序列相同或相似的序列的第一引物，以及具有与靶核酸第二部分互补的序列的第二引物，以提供靶核酸或其片段的扩增。在本文提及“第一”和“第二”引物是任意的，除非另有具体指明。例如，第一引物可被设计为“正向引物”(其从靶核 酸的5’末端引发核酸合成)或设计为“反向引物”(其从通过正向引物引发的合成中产生的延伸产物的5’末端引发核酸合成)。同样，第二引物可被设计成正向引物或反向引物。
“读出”是指可转化成数字或数值的测量出和/或检测到的一个或多个参数。一些背景下，读出可以指此类采集或记录的数据的真实数字表示。例如，微阵列中荧光强度信号的读出是在微阵列每个杂交位点生成的信号的地址和荧光强度；因此，这样的读出可以按多种方式登记或存储，例如，作为微阵列的图像、作为数字表格等等。“反射位点”、“反射序列”和等同形式用于表示存在于多核苷酸中的一个或多个序列，它们用于在多核苷酸中将某结构域以分子内的方式从其初始位置移动到不同位置。反射序列的使用在名称为 “Compositions and Methods for Intramolecular Nucleic AcidRearrangement”、于2011年2月24日作为W0/2011/021102公开并且以引用方式并入本文的PCT专利申请系列第PCT/IB2010/02243号中有详细描述。在某些实施方案中，对反射序列进行选择，以便与多核苷酸中的其他序列不同(即，与可能存在于多核苷酸中的诸如待处理的基因组或亚基因组序列的其他序列具有很低的序列同源性)。因此，应当选择反射序列，以使得在反射过程中所用的条件下除了其互补序列外不与任何序列杂交。反射序列可以是合成的或人工生成的序列(例如，在衔接子结构域添加到多核苷酸)或通常存在于进行测定的多核苷酸中的序列(例如，存在于进行测定的多核苷酸的感兴趣区域内的序列)。在反射系统中，在与反射序列相同的多核苷酸链上(例如，双链多核苷酸的相同链上或相同的单链多核苷酸上)存在(例如，插入衔接子结构域)反射序列的互补序列，其中将该互补序列置于特定的位置以便促进此特定链上的分子内结合和聚合事件。用于本文所述的反射过程的反射序列因此可具有多种长度和序列。反射序列的长度可在5至200个核苷酸碱基的范围内。“固体载体”、“载体”和“固相载体”可互换使用并且是指具有一个或多个刚性或半刚性表面的一种材料或一组材料。在许多实施方案中，固体载体的至少一个表面将为实质上平坦的，但在一些实施方案中可能有利的是通过例如孔、凸起区域、柱、蚀刻槽等针对不同的化合物将合成区域在物理上分离。根据其他实施方案，固体载体将采取珠粒、树脂、凝胶、微球或其他几何构型的形式。微阵列通常包括至少一个平坦的固相载体，诸如玻璃显微镜载玻片。关于一个分子与另一个分子(诸如探针的标记靶序列)结合的“特异性的”或“特异性”是指两个分子之间的识别、接触以及形成稳定复合物，并且该分子与其他分子的识别、接触或复合物形成显著更低。在一个方面，关于第一分子与第二分子结合的“特异性的”是指就第一分子识别某反应中或样品中的另一分子并与其形成复合物而言，它与第二分子形成最大数量的复合物。优选地，该最大数量为至少百分之五十。一般来讲，在特异性结合事件中涉及的分子在其表面上或在腔体中具有引起彼此结合的分子之间发生特异性识别的区域。特异性结合的实例包括抗体-抗原相互作用、酶-底物相互作用、多核苷酸和/或寡核苷酸中双链体或三链体的形成、生物素-亲和素或生物素-链霉亲和素相互作用、受体-配体相互作用等等。如本文所用，关于特异性或特异性结合的“接触”是指两个分子足够近，使得弱非共价化学相互作用(诸如范德华力、氢键、碱基堆积相互作用、离子和疏水相互作用等)在分子相互作用中占主导地位。
如本文所用，术语“Tm”关于“熔融温度”而使用。熔融温度是一群双链核酸分子变为半解离成单链时的温度(例如，以。C度量)。计算核酸Tni的多个公式在本领域中是已知的(参见例如 Anderson 和 Young, Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic AcidHybridization (1985))。其他参考文献(例如 Allawi, H.T.和 SantaLucia, J., Jr., Biochemistry36, 10581-94(1997))包括可供选择的计算方法，这些方法在计算Tm时考虑了结构和环境以及序列特性。“样品”是指一定量的来自生物、环境、医疗或患者来源的材料，在其中寻求对靶核酸进行检测、测量或标记。在一方面，其旨在包括标本或培养物(例如，微生物培养物)。在另一方面，其旨在包括生物和环境样品两者。样品可包括合成来源的标本。生物样品可以是动物，包括人、液体、固体(如粪便)或组织，以及液体和固体食物和饲料产品及配料，诸如乳制品、蔬菜、肉类和肉类副产品，以及废弃物。生物样品可包括从患者采集的物质，包括但不限于培养物、血液、唾液、脑脊髓液、胸膜液、乳汁、淋巴液、痰、精液、针吸出物等等。生物样品可从家畜以及未驯服的或野生的动物的所有家族中获得，包括但不限于诸如有蹄类、熊、鱼、啮齿类等动物。环境样品包括诸如地表物质、土壤、水体和工业样品的环境材料，以及从食物和乳品加工仪器、装置、设备、器皿、一次性和非一次性物品获得的样品。这些样品不应视为限制适用于本发明的样品类型。在描述核酸分子取向和/或聚合反应时的术语“上游”和“下游”在本文以本领域技术人员所理解的含义使用。因此，“下游”通常是指向5'至3'方向进行，即其中核苷酸聚合酶延伸序列时通常所采取的方向，而“上游”通常具有相反的含义。例如，在相同靶核酸分子上杂交第二引物“上游”的第一引物位于第二引物的5,侧上(并因此而言从第一引物发生的核酸聚合反应向第二引物进行)。还应当注意，可以起草权利要求书以排除任何可选要素。因此，该陈述旨在作为在结合权利要求要素的详述使用诸如“单独”、“仅”等排他性术语时或使用“负面”限制时的前置基础。 发明详述在描述本发明前，应当理解本发明不限于所述的特定实施方案，因此当然可以发生变化。还应当理解，本文所用的术语只是为了描述特定实施方案，并非旨在进行限制，因为本发明的范围将只由所附权利要求书限定。如果提供了值的范围，则应当理解，介于该范围上限与下限之间的每个居间值直至下限单位的十分之一(除非上下文另有明确指出)也具体予以公开。介于所述范围中的任何所述值或居间值之间的每个更小的范围以及该所述范围中的任何其他所述或居间值被包括在本发明的范围内。这些较小范围的上限和下限可独立地被包括在所述范围内或被排除在所述范围外，并且其中两个限值之一包括在该较小范围内、两个限值均不包括在该较小范围内或者两个限值均包括在该较小范围内的每个范围也被包括在本发明的范围内，受所述范围内任何具体排除的限值的约束。如果所述范围包含所述限值的一个或两个，则排除这些所含限值一者或两者的范围也包括在本发明内。除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所述领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。虽然类似于或等同于本文所述的那些的任何方法和材料也可用于实践或检验本发明，但现在描述一些有潜力的和优选的方法和材料。本文提及的所有出版物以引用方式并入，以公开和描述与所引述的出版物相关的方法和/或材料。应当理解，当存在矛盾时，本公开将取代所并入的出版物的任何公开内容。必须注意，如本文和所附权利要求书中所用，单数形式“一”、“一个/种”和“该/所述”包括复数指代物，除非上下文另有明确指出。因此，例如，提及“一种核酸”包括多种这样的核酸，而提及“该化合物”包括提及本领域技术人员已知的一种或多种化合物及其等同物，等等。除非另外指明，否则本发明的实践均可采用在本领域技术范围内的有机化学、聚合物技术、分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术和说明。此类常规技术包括聚合物阵列合成(polymer array synthesis)、杂交、连接和使用标记检测杂交。合适技术的具体例证可参考下文的实例。然而，其他等同的常规程序当然也可以使用。此类常规技术和说明可见于标准实验室手册，诸如Genome AnalysisiALaboratory Manual Series (第 1-1V 卷)，Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cells:A Laboratory Manual, PCR Primer:A Laboratory Manual 以及 MolecularCloning:A Laboratory Manual (均得自 Cold Spring Harbor Laboratory Press),Stryer, L.(1995) Biochemistry (第 4 版)Freeman, New York, Gait, “OligonucleotideSynthesis:A Practical Approach，，1984, IRL Press, London, Nelson and Cox (2000), Lehninger, A., Principles of Biochemistry 第 3 版，W.H.Freeman Pub., New York, N.Y.以及Berg 等(2002) Biochemistry,第 5 版，W.H.Freeman Pub., New York, N.Y.,它们均以引用方式整体并入本文以用于所有目的。本文所述的出版物仅针对它们在本专利申请提交日之前的公开内容而提供。此处的任何信息均不应解释为承认本发明不能 因为是在先发明而先于这些出版物。另外，所提供的
公开日可能不同于实际的
公开日，这可能需要独立地进行确认。如上所概述，本发明的方面涉及添加到进行序列分析的多核苷酸的简并核苷酸碱基(例如，在简并碱基区域或DBR中)的用途，其可用于确定个体多核苷酸分子的数量，该个体多核苷酸分子来源于已在特定序列分析配置或过程中测序的相同原始样品的相同基因组区域。在进行测序分析的多核苷酸中包括DBR可用于多种遗传分析，包括通过提供确定等位基因调用统计值(该值无法单独通过读段数量而得出)的机制而提高等位基因调用的置信度。DBR可以通过任何适宜的方式添加到多核苷酸，包括作为附接到进行测序的多核苷酸的衔接子(或衔接子库)的一部分，例如，DBR可位于还包括测序引物位点的衔接子中，或者DBR可存在于核酸合成引物(例如PCR引物)中，使得当将引物用于聚合反应时将DBR添加到靶核苷酸。DBR还可用于对混合的多核苷酸样品进行遗传分析，其中该混合样品中的每个多核苷酸均包含其来源样品特定的MID (下文将详细描述)。这允许使用者确定经合并以生成混合样品的各来源样品中某一特定多核苷酸种类(或多个种类)的序列覆盖度。因此，本发明的实施方案包括对混合样品中的多核苷酸进行序列分析，其中每个多核苷酸均包含MID和 DBR。趁璧本发明(如下文详细描述)可用于操纵和分析来自几乎任何核酸来源的感兴趣核酸序列(或多核苷酸)，包括但不限于基因组DNA、互补DNA (cDNA)、RNA (如信使RNA、核糖体RNA、短干扰RNA、微RNA等)、质粒DNA、线粒体DNA、合成DNA等。此外，任何有机体、有机材料或含核酸的底物均可用作将要根据本发明处理的核酸的来源，包括但不限于植物、动物(如爬行动物、哺乳动物、昆虫、蠕虫、鱼等)、组织样品、细菌、真菌(如酵母)、噬菌体、病毒、尸体组织、考古学/远古样品等。在某些实施方案中，核酸样品中的核酸源自哺乳动物，其中在一些实施方案中该哺乳动物为人。在某些实施方案中，使核酸序列富集。所谓富集是指使核酸(例如，在多核苷酸样品中)接受降低核酸复杂性的过程，通常通过提高样品中特定核酸种类的相对浓度(例如，具有特定的感兴趣基因座、包含特定的核酸序列、不含某基因座或序列、在特定的大小范围内等等)。有多种方式可富集具有特定性质或序列的核酸，并且就这一点而言可以采用能实现该目的的任何适宜方法。富集(或降低复杂性)可在所述过程的多个步骤中的任何一个发生，并将由使用者的意愿决定。例如，富集可在个体亲本样品(例如，在连接衔接子前的未标记核酸)中或在多重化样品(例如，用编码MID的衔接子序列标记的核酸;MID将在下文进一步详细描述)中发生。·在某些实施方案中，在分析前扩增核酸样品中的核酸。在这些实施方案的一些中，扩增反应还起到针对感兴趣序列或基因座富集起始核酸样品的作用。例如，可使起始核酸样品接受扩增一个或多个感兴趣区域的聚合酶链反应(PCR)。在某些实施方案中，扩增反应为指数式扩增反应，而在某些其他实施方案中，扩增反应为线性扩增反应。对起始核酸样品进行扩增反应的任何适宜方法均可用于实践本发明。在某些实施方案中，用于扩增反应的核酸聚合酶为具有校正能力的聚合酶(例如，Phi29 DNA聚合酶、嗜热高温球菌(Thermococcus litoralis)DNA 聚合酶、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)DNA 聚合酶等)。在某些实施方案中，进行分析的核酸样品源自单个来源(例如，单个有机体、病毒、组织、细胞、受试者等)，而在其他实施方案中，核酸样品为从多个来源提取出的核酸的库(例如，来自多个有机体、组织、细胞、受试者等的核酸的库)，其中所谓“多个”是指两个或更多个。因此，在某些实施方案中，核酸样品可包含来自2个或更多个来源、3个或更多个来源、5个或更多个来源、10个或更多个来源、50个或更多个来源、100个或更多个来源、500个或更多个来源、1000个或更多个来源、5000个或更多个来源、10，000个或更多个来源、25，000个或更多个来源等的核酸。在某些实施方案中，待与核酸片段混合的核酸片段源自多个来源(例如，多个有机体、组织、细胞、受试者等)，其中所谓“多个”是指两个或更多个。在此类实施方案中，源自每个来源的核酸包含多重标识(MID)，使得可以确定每个标记核酸片段的来源。在此类实施方案中，将每个核酸样品来源与单一 MID相关联，其中所谓“单一 MID”是指所用的每个不同的MID在至少一个特性(例如MID的核酸序列)方面可区别于所用的每个其他MID。可以使用任何类型的MID，包括但不限于在以下专利中所述的那些:于2007年I月22日提交的并且名称为"Nucleic Acid Analysis Using Sequence Tokens"的共同未决的美国专利申请系列第11/656，746号，以及于2008年7月I日提交的并且名称为“Methods andCompositions for Tagging and Identifying Polynucleotides，，的美国专利 7，393，665,这两份专利中关于核酸标记的说明及其在鉴定多核苷酸中的用途的内容以引用方式整体并入本文。在某些实施方案中，用于标记多个样品的MID集合不必具有任何特定的共同性质(例如，Tm、长度、碱基组成等)，因为不对称标记方法(以及许多标记读出方法，包括但不限于标记测序或标记长度测量)可适应多种单一 MID集合。简并碱某区域(DBR)
本发明的方面包括用于确定或估计个体多核苷酸分子的数量的方法和组合物，该个体多核苷酸分子来源于已在特定序列分析配置或过程中测序的相同原始样品的相同基因组区域。在本发明的这些方面，将简并碱基区域(DBR)附接到随后将进行测序(例如，在进行某些过程步骤后，例如扩增和/或富集，例如PCR)的起始多核苷酸分子。如下详述，评价存在于测序运行中的不同DBR序列的数量(在一些情况下，为序列组合的数量)允许确定已针对特定多核苷酸(或感兴趣区域；R0I)测序的不同起始多核苷酸的数量(或最小数量)。该数量可用于例如给出等位基因基因调用中置信度的统计度量，并因此提高进行此类等位基因测定时的置信度(例如，当调用纯合等位基因时XDBR还允许识别如果未检出时会对遗传分析造成负面影响的潜在测序或扩增误差。DNA测序通常包括将衔接子附接到待测序的样品中的多核苷酸的步骤，其中衔接子包含测序引物位点(例如，通过连接)。如本文所用，“测序引物位点”是与测序引物(当为单链形式时)的序列相同或互补的多核苷酸区域或在测序引物序列与其互补序列之间形成的双链区域。测序引物位点的特定取向可由本领域普通技术人员从包含测序引物位点的特定多核苷酸的结构特征中推断出。除了测序引物位点外，还将简并碱基区域(DBR)作为含测序引物位点的衔接子的一部分或者独立地(例如，在附接到多核苷酸的第二衔接子中)附接到多核苷酸。任何适宜的将DBR附接或添加到多核苷酸的方法均可采用。DBR是与样品中的其他标记多核苷酸相比可具有可变碱基组成或序列(其可被视为“随机的”)的区域。在样品的一群多核苷酸中的不同DBR的数量将取决于DBR中碱基的数量以及可存在于每个位置的不同碱基的潜在数量。因此，一群附接有含2个碱基位置(其中每个位置可以为A、C、G和T中的任一者)的DBR的多核苷酸将可能具有16种不同的DBR (AA、AC、AG等)。DBR可因此包含1、2、3、4、5、6、7、
8、9、10个或更多个碱基，包括15个或更多个、20个或更多个等等。在某些实施方案中，DBR的长度为3至10个碱基。此外，DBR中的每个位置可具有不同的碱基组成。例如，4个碱基的DBR可具有以下任一种组成:NNNN、NRSN、SffSff,BDHV (有关IUPAC核苷酸编码，参见下表I)。还应当注意，在某些实施方案中，DBR中的碱基可因具有可检测的修饰或附接到其上的其他部分而不同。例如，某些下一代测序平台(例如，Pacific Biosciences )可用于在测序过程中检测碱基中的甲基化差异。因此，DBR中的非甲基化碱基可能不同于DBR中的甲基化碱基。因此，不旨在对DBR的长度或碱基组成进行限制。
权利要求
1.一种估计多个样品中所测序的起始多核苷酸分子的数量的方法，所述方法包括: 将衔接子附接到多个不同样品中的起始多核苷酸分子，其中每个样品对应的所述衔接子包含: 所述样品特定的单一 MID ;和 简并碱基区域(DBR)，其包含选自以下的至少一个核苷酸碱基:R、Y、S、W、K、Μ、B、D、H、V、N及其修饰形式； 将所述多个不同的衔接子附接的样品混合以生成混合样品； 扩增所述混合样品中的所述衔接子附接的多核苷酸； 对多个所述扩增的衔接子附接的多核苷酸测序，其中获得所述多个衔接子附接的多核苷酸的每一个的所述MID、所述DBR和所述多核苷酸至少一部分的序列；以及 确定存在于来自每个样品的所述多个测序衔接子附接的多核苷酸中的不同DBR序列的数量，以确定已在测序步骤中测序的每个样品中的起始多核苷酸的数量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述衔接子进一步包含测序引物位点。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述衔接子进一步包含以下一者或多者:反射序列和启动子位点。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述DBR包含至少2个核苷酸碱基，其中所述至少2个核苷酸碱基的每一个选自:R、Y、S、W、K、Μ、B、D、H、V和N。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述DBR包含3至20个核苷酸碱基，其中所述3至10个核苷酸碱基的每一个选自:R、Y、S、W、K、Μ、B、D、H、V和N。
6.根据权利要求1所述的方法，其中将已在测序步骤中测序的每个样品中的多核苷酸的确定数量用于等位基因调用方法。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述测序步骤包括进行下一代测序过程。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个样品中的每一个为基因组DNA样品。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述多个不同的基因组DNA样品中的每一个源自不同的受试者。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述受试者为人。
11.根据权利要求1所述的方法，而且其中在所述附接步骤前针对感兴趣区域富集所述样品。
12.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括针对感兴趣区域富集所述衔接子附接的多核苷酸。
13.根据权利要求4所述的方法，其中所述衔接子为不对称衔接子，其中第一衔接子结构域存在于所述多核苷酸的第一末端并且第二衔接子区域存在于所述多核苷酸的第二末端，其中所述DBR为包含所述第一衔接子结构域中的所述至少2个核苷酸碱基的一个或多个以及所述第二衔接子结构域中的所述至少2个核苷酸碱基的一个或多个的断裂DBR。
14.根据权利要求1所述的方法，其中将所述衔接子在扩增反应中附接到所述多核苷酸分子，其中所述DBR存在于用于所述扩增反应的合成引物中。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述扩增反应为PCR。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述方法进一步包括确定在所述PCR反应中扩增的起始多核苷酸的数量。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法涉及确定所述样品中所述多核苷酸的遗传异质性。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述样品包含源自肿瘤组织的多核苷酸。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述样品包含源自微生物和/或病毒的多核苷酸。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法涉及确定存在于所述多个不同样品中的所述多核苷酸的遗传异质性。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述多个不同的样品源自肿瘤的不同切片。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述多个不同的样品源自受试者的不同肿瘤。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述多个不同的样品源自在不同时间的受试者。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述受试者存在感染，其中确定一种或多种感染原在不同时间的遗传异质性。`
全文摘要
本发明的方面包括用于确定个体多核苷酸分子的数量的方法和组合物，所述个体多核苷酸分子来源于已在特定序列分析配置或过程中测序的相同原始样品的相同基因组区域。在本发明的这些方面，将简并碱基区域(DBR)附接到随后将进行测序(例如，在进行某些过程步骤后，例如扩增和/或富集步骤后)的起始多核苷酸分子。存在于测序运行中的不同DBR序列的数量可用于确定/估计已进行测序的不同起始多核苷酸的数量。DBR可用于增强许多不同的核酸序列分析应用，包括允许在基因分型应用中实现更高置信度的等位基因调用测定。
文档编号C12Q1/68GK103154273SQ201180049727
公开日2013年6月12日 申请日期2011年9月20日 优先权日2010年9月21日
发明者J·卡斯本, S·布伦那, R·奥斯本, C·利希藤斯坦, A·克拉斯 申请人:群体遗传学科技有限公司
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