通过抑制唾液酸酶4(neu4)的天然反义转录物而治疗neu4相关疾病的制作方法
专利名称：通过抑制唾液酸酶4(neu4)的天然反义转录物而治疗neu4相关疾病的制作方法
技术领域：
本申请要求2010年10月6日提交的美国临时专利申请N0.61/390216的优先权，其通过引用整体并入本文。本发明的实施方案包括调节NEU4和相关分子的表达和/或功能的寡核苷酸。背景DNA-RNA和RNA-RNA杂交对于核酸功能的许多方面是重要的，包括DNA复制、转录和翻译。杂交对于检测特定核酸或改变其表达的多种技术也是关键的。反义核苷酸，例如通过与靶RNA杂交从而干扰RNA剪接、转录、翻译和复制来破坏基因表达。反义DNA具有额外的特性，即DNA-RNA杂交物作被核糖核酸酶H消化的底物，这是在大多数细胞类型中存在的活性。反义分子可被递送到细胞中，如寡脱氧核苷酸(ODN)的情形，或反义分子可从内源基因表达为RNA分子。FDA最近批准了一种反义药物VITRAVENE (用于治疗巨细胞病毒视网膜炎)，反映了反义药物具有治疗效用。概述提供本概述以展示本发明的概述，以简要地指出本发明的性质和实质。提交本概述应理解的是，其不会用来解释或限制权利要求书的范围或含义。在一个实施方案中，本发明提供通过利用靶向天然反义转录物任何区域的反义寡核苷酸而导致相应有义基因的上调来抑制天然反义转录物作用的方法。本文还预期，天然反义转录物的抑制可由siRNA、核酶和小分子实现，认为这些在本发明的范围中。—个实施方案提供调节生物系统(包括但不限于体内或体外患者细胞或组织)中NEU4多核苷酸的功能和/或表达的方法，包括将所述生物系统或所述细胞或组织与长度为约5至约30个核苷酸的反义寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸与包括SEQ ID NO: 2的核苷酸I至2119或SEQ ID NO:3的核苷酸I至1245或SEQ ID NO:4的核苷酸I至490或SEQID NO:5的核苷酸I至527或SEQ ID NO:6的核苷酸I至946或SEQ ID NO:7的核苷酸I至703中的5至30个连续核苷酸的多核苷酸的反向互补序列具有至少50%序列同一'丨生,从而体内或体外调节所述生物系统(包括体内或体外所述患者细胞或组织)中NEU4多核苷酸的功能和/或表达。在实施方案中，寡核苷酸靶向存在于生物系统中的NEU4多核苷酸的天然反义序列，例如，SEQ ID NO: 2至7所列的核苷酸及其任何变体、等位基因、同系物、突变体、衍生物、片段及其互补序列。反义寡核苷酸的实例如SEQ ID N0:8至11所列。另一实施方案提供体内或体外调节患者细胞或组织中NEU4多核苷酸的功能和/或表达的方法，包括将所述细胞或组织与长度为5至30个核苷酸的反义寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸与NEU4多核苷酸的反义的反向互补序列具有至少50%序列同一'丨生；从而体内或体外调节患者细胞或组织中NEU4多核苷酸的功能和/或表达。另一实施方案提供体内或体外调节患者细胞或组织中NEU4多核苷酸的功能和/或表达的方法， 包括将所述细胞或组织与长度为5至30个核苷酸的反义寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸与NEU4反义多核苷酸的反义寡核苷酸具有至少50%序列同一性；从而体内或体外调节患者细胞或组织中NEU4多核苷酸的功能和/或表达。在另一个实施方案中，本发明包括调节生物系统中NEU4多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括将所述生物系统与靶向NEU4多核苷酸的天然反义转录物的至少一个反义寡核苷酸相接触，由此调节所述生物系统中NEU4多核苷酸的功能和/或表达。在另一个实施方案中，本发明包括调节生物系统中NEU4多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括将所述生物系统与靶向NEU4多核苷酸的天然反义转录物的区域的至少一个反义寡核苷酸相接触，由此调节所述生物系统中NEU4多核苷酸的功能和/或表达。在实施方案中，本发明包括增加生物系统中的具有SEQ ID N0:1的NEU4多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括将所述生物系统与靶向所述NEU4多核苷酸的天然反义转录物的至少一个反义寡核苷酸相接触，由此增加所述NEU4多核苷酸或其表达产物的功能和/或表达。在另一个实施方案中，本发明包括增加生物系统中的具有SEQ ID N0:1的NEU4多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括将所述生物系统与靶向所述NEU4多核苷酸的天然反义转录物的至少一个反义寡核苷酸相接触，由此增加所述NEU4多核苷酸或其表达产物的功能和/或表达 ，其中所述天然反义转录物选自SEQ ID N0:2至7。在另一个实施方案中，本发明包括增加生物系统中的具有SEQ ID N0:1的NEU4多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括将所述生物系统与靶向所述NEU4多核苷酸的天然反义转录物的至少一个反义寡核苷酸相接触，由此增加所述NEU4多核苷酸或其表达产物的功能和/或表达，其中所述天然反义转录物选自SEQ ID N0:2至7并且其中所述反义寡核苷酸选自SEQ ID NO:8至11中的至少一个。在实施方案中，组合物包括一种或多种结合有义和/或反义NEU4多核苷酸的反义寡核苷酸。在实施方案中，寡核苷酸包括一种或多种修饰或取代的核苷酸。在实施方案中，寡核苷酸包括一种或多种修饰的键。在又一实施方案中，修饰的核苷酸包括包含硫代磷酸酯、膦酸甲酯、肽核酸、2’ -O-甲基、氟-或碳、亚甲基或其它锁核酸(LNA)分子的修饰的碱基。优选地，修饰的核苷酸是锁核酸分子，包括a-L-LNA。 在实施方案中，将寡核苷酸皮下、肌内、静脉内或腹膜内施用给患者。在实施方案中，寡核苷酸以药物组合物施用。治疗方案包括向患者施用反义化合物至少一次；然而，可修改该治疗以包括经一段时间的多个剂量。该治疗可与一种或多种其它类型的治疗联合。在实施方案中，将寡核苷酸封装在脂质体中或连接于载体分子(例如，胆固醇、TAT 肽)。其它方面在以下描述。附图简述
图1是实时PCR结果的图,其显示利用Lipofectamine2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸处理H印G2细胞后，与对照相比，NEMmRNA的倍数变化+标准差。实时PCR结果显示，用针对Neu4反义Hs.678184设计的反义寡核苷酸中的一种处理后48h，HepG2细胞中Neu4mRNA的水平显著增加。标为CUR-1789至CUR-1792的条柱分别对应用SEQ ID NO:8至11处理的样品。序列表描述-SEQ ID NO:1:智人唾液酸酶4 (NEU4)，转录变体3，mRNA(NCBI登记号:NM_001167600) ；SEQ ID NO:2:天然 NEU4 反义序列(HS.678184) ；SEQ ID N0:3:天然NEU4 反义序列(BC038567) ；SEQ ID NO:4:天然 NEU4 反义序列(CR747539) ；SEQ ID NO:5:天然 NEU4 反义序列(BF527387) ；SEQ ID NO:6:天然 NEU4 反义序列(BF528789) ；SEQ IDNO: 7:天然NEU4反义序列(BG913694)和SEQ ID N0:8至11:反义寡核苷酸。*指示硫代磷酸酯键。详述下面参考用于示例的实例应用来描述本发明的多个方面。应理解的是，列出许多具体细节、关联和方法以提供对本发明的完全理解。然而，相关领域普通技术人员将容易认识到，可没有一种或多种具体细节地实践本发明或以其它方法实践本发明。本发明不限于行为或事件的顺序，因为一些行为可以不同顺序进行和/或与其它行为或事件同时进行。而且，并非所有列举的行为或事件都是实施根据本发明的方法所需的。本文公开的所有基因、基因名称和基因产物预期对应来自本文公开的组合物和方法可适用的任何物种的同系物。因此，这些术语包括但不限于来自人和小鼠的基因和基因产物。应理解的是，当公开来自具体物种的基因或基因产物时，这一公开仅旨在示例，不应解释为限制，除非在其存在的上下文清楚地指明。因此，例如，对于本文公开的基因，其在一些实施方案中涉及哺乳动物核酸和氨基酸序列，预期涵盖来自其它动物的同源和/或直系同源基因和基因产物，所述其它动物包括但不限于其它哺乳动物、鱼、两栖类、爬行动物和鸟类。在实施方案中，基因或核酸序列是人的。定义
本文所用的术语仅是为了描述具体实施方案的目的，并不旨在限制本发明。除非上下文另外清楚地指明，否则本文所用的单数形式〃一个/ 一种(a)〃、〃一个/ 一种(an)〃和〃该(the)"预期包括复数形式。而且，就详述和/或权利要求书中使用术语〃包括(including) 〃、〃 包括(includes) 〃、〃 具有(having) 〃、〃 具有(has)"、〃带有(with) 〃或其变化形式来说，这些术语预期以类似于术语〃包含(comprising) 〃的方式被包括。术语〃约〃或〃大约〃是指在由本领域普通技术人员确定的特定数值的可接受误差范围内，其将部分地取决于如何测量或确定该数值，即，测量系统的限度。例如，按照本领域中的实践，〃约〃可表示在I个或多于I个标准差内。可选地，〃约〃可表示给定数值的达20%、优选地达10%、更优选地达5%、仍更优选地达1%的范围。可选地，尤其是有关生物系统或方法，术语可表示在数值的数量级内，优选地在5倍内，更优选地在2倍内。当在本申请和权利要求书中描述特定数值时，除非另外指明，否则应假设术语"约"表示在特定数值可接受的误差范围内。本文所用的术语〃mRNA〃是指靶基因的目前已知的mRNA转录物和可能说明的任何进一步的转录物。〃反义寡核苷酸〃或〃反义化合物〃是指结合另一 RNA或DNA (靶RNA、DNA)的RNA或DNA分子。例如，如果其是RNA寡核苷酸，其借助于RNA-RNA相互作用结合另一 RNA靶并且改变靶RNA的活性。反义寡核苷酸可上调或下调特定多核苷酸的表达和/或功能。该定义意为包括从治疗、诊断或其它观点来说有用的任何外来RNA或DNA分子。这种分子包括，例如，反义RNA或DNA分子、干扰RNA(RNAi)、微RNA、诱饵RNA分子、siRNA、酶促RNA、治疗性编辑RNA和激动剂与拮抗剂RNA、反义寡聚化合物、反义寡核苷酸、外部指导序列(EGS)寡核苷酸、可选剪接体、引物、探针以及与靶核酸的至少一部分杂交的其它寡聚化合物。因此，这些化合物可以单链、双链、部分单链或环状寡聚化合物的形式引入。在本发明的范畴中，术语"寡核苷酸"是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或其模拟物的寡聚物或聚合物。术语"寡核苷酸"还包括天然和/或修饰的单体或键合的线性或环状寡聚物，包括脱氧核糖核苷、核糖核苷、其取代形式和其α -异头形式、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、硫代磷酸酯、膦酸甲酯和类似物。寡核苷酸能够经由规则方式的单体与单体间的相互作用，例如Watson-Crick型碱基配对、Ho6gsteei或逆Hodgsteen型碱基配对或类似物特异性结合靶多核苷酸。寡核苷酸可以是〃嵌合的"，即，包括不同区域。在本发明的范畴中，"嵌合〃化合物是寡核苷酸，其包含两个或更多个化学区域，例如，DNA区域、RNA区域、PNA区域等等。每个化学区域由至少一个单体单位构成，在寡核苷酸化合物的情形中所述单体单位即为核苷酸。这些寡核苷酸通常包括至少一个区域，其中寡核苷酸经修饰以表现一种或多种期望特性。寡核苷酸的期望特性包括但不限于，例如，对核酸酶降解增加的耐受性、增加的细胞摄取和/或对靶核酸增加的结合亲和力。因此，寡核苷酸的不同区域可具有不同特性。如上所述，本发明的嵌合寡核苷酸可形成为两种或更多种寡核苷酸的混合结构、修饰的寡核苷酸、寡核苷和/或寡核苷酸类似物。寡核苷酸可由可被〃成行〃地连接(即当单体被连续地连接时，如在天然DNA中)的区域或经由间隔物连接的区域构成。预期间隔物构成区域之间的共价"桥"，在优选情形中具有不超过约100个碳原子的长度。间隔物可携带不同功能性，例如，具有正电荷或负电荷，携带特殊的核酸结合特性(嵌入剂、槽沟结合物、毒素、荧光团等等)，为亲脂性的，诱导特殊的二级结构，如例如，诱导α -螺旋的含丙氨酸的肽。本文所用的"NEU4"和〃唾液酸酶4〃包括所有家族成员、同种型、突变体、等位基因、片段、种类(species)、编码和非编码序列、有义和反义多核苷酸链等等。本文所用的词语LP5125、MGC102757、MGC18222、N-乙酰基-α -神经氨酸酶4和唾液酸酶-4被认为在文献中是相同的，且在本申请中可交换地使用。本文所用的术语〃对…有特异性的寡核苷酸〃或〃靶向…的寡核苷酸〃是指具有
(i)能够与靶基因的一部分形成稳定复合体，或(ii)能够与靶基因的mRNA转录物的一部分形成稳定双链体的序列的寡核苷酸。复合体和双链体的稳定性可通过理论计算和/或体外测定来确定。用于确定杂交复合体和双链体的稳定性的示例性测定在以下实施例中描述。本文所用的术语〃靶核酸〃涵盖DNA、从这种DNA转录的RNA (包括前体mRNA和mRNA)、还有从这种RNA衍生的cDNA、编码序列、非编码序列、有义或反义多核苷酸。寡聚化合物与其靶核酸的特异性杂交干扰核酸的正常功能。特异性地与靶核酸杂交的化合物对靶核酸功能的这一调节通常称为〃反义〃。待干扰的DNA功能包括，例如复制和转录。待干扰的RNA功能包括所有重要功能，例如，RNA向蛋白翻译位置的移位，从RNA翻译为蛋白，剪接RNA以产生一种或多种mRNA种类以及可能由RNA参与或促进的催化活性。这种干扰靶核酸功能的总效果是调节编码的产物或寡核苷酸的表达。RNA干扰"RNAi "由对其〃靶〃核酸序列具有序列特异性的同源性的双链RNA(dsRNA)分子介导。在本发明的某些实施方案中，介导物是5-25个核苷酸的〃小干扰"RNA双链体(siRNA)。siRNA来源于称为Dicer的RNA酶对dsRNA的加工。siRNA双链体产物被募集到称为RISC (RNA诱导沉默复合体)的多蛋白siRNA复合体中。不希望受任何特定理论束缚，认为随后RISC被引导至靶核酸(适当地为mRNA)，在那里siRNA双链体以序列特异性方式相互作用来以催化方式介导裂解。根据本发明可使用的小干扰RNA可根据本领域公知并且本领域普通技术人员熟悉的方案合成和使用。用于本发明方法的小干扰RNA适当地包括约I至约50个核苷酸(nt)。在非限制性实施方案的实例中，siRNA可包括约5至约40nt、约5至约30nt、约10至约30nt、约15至约25nt或约20-25个核苷酸。通过利用自动比对核酸序列并指明同一性或同源性的区域的计算机程序来便于选择适当的寡核苷酸。这种程序用来比较获得的核酸序列，例如通过搜寻数据库例如GenBank或通过对PCR产物测序。比较来自一系列物种的核酸序列允许选择在物种之间展示适当的同一性程度 的核酸序列。在未被测序的基因的情形中，进行DNA印迹以允许确定靶物种与其它物种的基因之间的同一性程度。如本领域所熟知的，通过以不同的严格性程度进行DNA印迹，可能获得近似的同一性测量。这些方案允许选择展现与待控制的受治疗者中的靶核酸序列的高程度互补性和与其它物种中的相应核酸序列的较低程度互补性的寡核苷酸。本领域技术人员将认识到，在选择用于本发明的基因的适当区域方面存在相当大的自由。〃 酶促 RNA"是指具有酶促活性的 RNA 分子(Cech, (1988) J.American.Med.Assoc.260，3030-3035)。酶促核酸(核酶)通过首先结合靶RNA来作用。这种结合经由被保持在邻近用于裂解靶RNA的分子的酶促部分处的酶促核酸的靶结合部分来进行。因此，酶促核酸首先识别靶RNA然后经由碱基配对结合靶RNA，结合到正确位置时，酶促地作用以切割靶RNA。〃诱饵RNA〃是指模拟配体的天然结合结构域的RNA分子。因此，诱饵RNA与天然结合靶竞争结合特定配体。例如，已经显示HIV反式激活响应(TAR)RNA的过表达可作为〃诱饵〃起作用并有效地结合HIV tat蛋白，从而阻止其结合HIV RNA中编码的TAR序列。这表示一个特定的实例。本领域技术人员将认识到，这仅是一个实例，利用本领域通常已知的技术可容易地产生其它实施方案。本文所用的术语〃单体〃通常是指由磷酸二酯键或其类似物连接以形成大小从数个单体单位例如约3-4个至约数百个单体单位范围的寡核苷酸的单体。磷酸二酯键合的类似物包括:硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、硒代磷酸酯、氨基磷酸酯和类似物，如以下更充分地描述。术语“核苷酸”涵盖天然存在的核苷酸以及非天然存在的核苷酸。本领域技术人员应清楚的是，此前被认为是"非天然存在的"各种核苷酸后来已在自然界中发现。因此，"核苷酸"不仅包括已知的含嘌呤和嘧啶杂环的分子，还包括其杂环类似物和互变异构体。其它类型的核苷酸的示例性实例是含腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黄嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-脱氮杂黄嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤、N4，N4-桥亚乙基胞嘧啶、邮，邮-桥亚乙基-2，6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-(C3-C6)_炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假异胞嘧啶、2-羟基-5-甲基-4-三唑并吡啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、肌苷的分子以及Benner等，美国专利N0.5，432，272中描述的〃非天然存在的〃核苷酸。术语"核苷酸"预期涵盖这些实例的每一种和所有以及其类似物和互变异构体。尤其关注的核苷酸是包含腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶的那些，它们被认为是与在人的治疗和诊断应用有关的天然存在的核苷酸。核苷酸包括天然2’ -脱氧糖和2’ -羟基糖，例如在 Kornberg 和 Baker, DNA Replication,第2版.(Freeman, San Francisco, 1992)中描述的，以及它们的类似物。提及核苷酸的"类似物"包括具有修饰的碱基部分和/或修饰的糖部分的合成的核苷酸(参见例如，通常描述于Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York, 1980 ；Freier&Altmann, (1997) Nucl.Acid.Res.，25 (22)，4429-4443, Toulme, J.J., (2001)Nature Biotechnologyl9:17-18 ；Manoharan M., (1999)Biochemica et BiophysicaActal489:117-139 ；Freier S.M., (1997)Nucleic Acid Research,25:4429-4443，Uhlman,E., (2000)Drug Discovery&Development,3:203-213, Herdewin P., (2000)Antisense&Nucleic Acid Drug Dev., 10:297-310) ;2’-0，3'-C-连接的[3.2.0] 二环阿拉伯糖核苷。这种类似物包括经设计以增强结合特性，例如，双链体或三链体稳定性、特异性或类似特性的合成的核苷酸。本文所用的〃杂交〃是指寡聚化合物的大致互补链的配对。配对的一种机制包括寡聚化合物的链的互补核苷或核苷酸碱基(核苷酸)之间的氢键合，其可以是Watson-Crick、Ho6gsteen或逆HoGgsteen氢键合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是经由氢键形成而配对的互补核苷酸。杂交可在不同情况下发生。当反义化合物与靶核酸的结合干扰靶核酸的正常功能以导致功能和/或活性的调节时，该化合物是"可特异性杂交的"，且在期望特异性结合的条件下(即，在体内测定或治疗性治疗的情形中的生理条件下和在体外测定的情形中进行测定的条件下)存在足够程度的互补性以避免反 义化合物与非靶核酸序列的非特异性结合。本文所用的短语"严格杂交条件"或"严格条件"是指本发明化合物将与其靶序列杂交，但与最小数目的其它序列杂交的条件。严格条件是序列依赖性的且在不同情况中将是不同的，并且在本发明范畴中，寡聚化合物与靶序列杂交的"严格条件"由寡聚化合物的性质和组成以及研究它们的测定决定。通常，严格杂交条件包括低浓度(〈0.15M)的带有无机阳离子例如Na+或K+的盐(即，低离子强度)、高于20°C _25°C低于寡聚化合物:靶序列复合体的Tm的温度、和存在变性剂例如甲酰胺、二甲基甲酰胺、二甲亚砜或去垢剂十二烷基硫酸钠(SDS)。例如，对于每种1%甲酰胺，杂交率降低1.1%。高严格杂交条件的实例是在60°C下0.1 X氯化钠-柠檬酸钠缓冲液(SSC) /0.l%(w/v) SDS进行30分钟。本文所用的〃互补〃是指一条或两条寡聚链上的两个核苷酸之间准确配对的能力。例如，如果在反义化合物某一位置的核碱基能够与在靶核酸某一位置的核碱基氢键结合，所述靶核酸为DNA、RNA或寡核苷酸分子，则认为寡核苷酸与靶核酸之间的氢键结合位置是互补位置。当每个分子的足够数目的互补位置由可彼此成氢键的核苷酸占据时，寡聚化合物和另外的DNA、RNA或寡核苷酸分子是彼此互补的。因此，〃可特异性杂交〃和〃互补"是用来表示经足够数目的核苷酸足够程度的准确配对或互补性，从而在寡聚化合物和靶核酸之间发生稳定和特异性结合的术语。
本领域应理解的是，寡聚化合物的序列不必与待可特异性杂交的其靶核酸的序列100%互补。而且，寡核苷酸可经一个或多个区段杂交，从而其间的或相邻区段不牵涉在杂交事件中(例如，环结构、错配或发夹结构)。本发明的寡聚化合物包括与其所靶向的靶核酸序列中靶区域具有至少约70%、或至少约75%、或至少约80%、或至少约85%、或至少约90%、或至少约95%、或至少约99%序列互补性。例如,其中反义化合物的20个核苷酸中的18个与靶区域互补从而将特异性杂交的反义化合物将表示90%互补性。在这一实例中，其余非互补核苷酸可成串或散布于互补核苷酸，不必彼此连续或与互补核苷酸连续。因此，具有侧翼为与靶核酸具有完全互补性的两个区域的4 (四)个非互补核苷酸的长度为18个核苷酸的反义化合物将与靶核酸具有77.8%总互补性，因此属于本发明的范围中。反义化合物与靶核酸的区域的互补性百分比可常规地利用本领域已知的BLAST程序(基本局部比对搜索工具)和PowerBLAST程序来确定。同源性、序列同一性或互补性的百分比可通过例如使用Smith 和 Waterman 的算法(Adv.Appl.Math., (1981)2，482-489)的 Gap 程序(Wisconsin序列分析软件包，用于 Unix 的版本 8，Genetics Computer Group, University ResearchPark, Madison ffis.)确定，并使用默认设置。本文所用的术语"热熔点(Tm)"是指在指定的离子强度、pH和核酸浓度下，与靶序列互补的寡核苷酸的50%平衡地与靶序列杂交的温度。通常，严格条件将是其中盐浓度为至少约0.01至1.0M Na离子浓度(或其它盐)、ρΗ7.0至8.3，且对于短寡核苷酸(例如，10至50个核苷酸)温度为至少约30°C的条件。严格条件还可通过加入去稳定剂例如甲酰胺来实现。本文所用的〃调节〃是 指基因表达的增加(刺激)或减少(抑制)。术语〃变体〃当在多核苷酸序列的上下文中使用时，可涵盖与野生型基因相关的多核苷酸序列。这一定义还可包括，例如，〃等位〃、〃剪接〃、〃物种〃或〃多态〃变体。剪接变体可与参考分子具有显著的同一性，但由于在mRNA加工期间外显子的可选剪接通常将具有更大数目或更小数目的多核苷酸。相应的多肽可具有另外的功能结构域或缺少结构域。物种变体是在物种之间不同的多核苷酸序列。本发明中特别有用的是野生型基因产物的变体。变体可来源于核酸序列中至少一种突变，并可产生改变的mRNA或产生结构或功能可能改变或可能不改变的多肽。任何给定的天然或重组基因可具有O种、一种或多种等位基因形式。产生变体的常见突变改变通常归因于核苷酸的天然缺失、添加或取代。在给定序列中，这些类型改变的每一种可单独发生，或组合其它类型改变发生一次或多次。所得的多肽通常将具有相对于彼此显著的氨基酸同一性。多态变体是给定物种的个体之间特定基因的多核苷酸序列的变化。多态变体还可涵盖"单核苷酸多态性"(SNP)或其中多核苷酸序列差异为一个碱基的单碱基突变。SNP的存在可指示，例如，具有疾病状态的倾向的某一群体，所述倾向相比于耐受性为易感性。衍生的多核苷酸包括经受化学修饰(例如以烷基、酰基或氨基代替氢)的核酸。衍生物例如，衍生物寡核苷酸，可包括非天然存在的部分，例如改变的糖部分或糖间键合。其中示例的有硫代磷酸酯和本领域已知的其它含硫物质。衍生的核酸还可包含标记，包括放射性核苷酸、酶、荧光剂、化学发光剂、显色剂、底物、辅因子、抑制剂、磁性粒子和类似物。〃衍生物〃多肽或肽是例如通过糖基化、聚乙二醇化、磷酸化、硫酸化、还原/烷基化、酰化、化学偶合或适度福尔马林处理修饰的多肽或肽。还可修饰衍生物以直接或间接包含可检测的标记，包括但不限于，放射性同位素、荧光和酶标记。本文所用的术语〃动物〃或〃患者〃意为包括，例如人、绵羊、麋鹿、鹿、长耳鹿、貂、哺乳动物、猴、马、牛、猪、山羊、犬、猫、大鼠、小鼠、鸟类、鸡、爬行动物、鱼、昆虫和蛛形纲动物。〃哺乳动物〃涵盖通常处于医疗护理下的温血哺乳动物(例如，人和驯养的动物)。实例包括猫科动物、犬科动物、马科动物、牛科动物和人，以及仅仅人。
〃治疗(Treating) 〃或〃治疗(treatment) 〃涵盖治疗哺乳动物的疾病状态,并包括:(a)防止疾病状态在哺乳动物中发生，尤其是当所述哺乳动物倾向于疾病状态但还未被诊断为患有其的时候；(b)抑制疾病状态，例如阻止其发展；和/或(C)缓解疾病状态，例如导致疾病状态消退，直到达到期望端点。治疗还包括疾病症状的改善(例如，减轻疼痛或不适)，其中所述改善可或不可直接影响疾病(例如起因、传染、表达等等)。本文所用的〃癌症〃是指在哺乳动物中发现的所有类型的癌症或赘生物或恶性肿瘤，包括但不限于:白血病、淋巴瘤、黑素瘤、癌和肉瘤。癌症本身表现为〃肿瘤〃或包括癌症恶性细胞的组织。肿瘤的实例包括肉瘤和癌，例如但不限于:纤维肉瘤、粘液肉瘤、月旨肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮源性癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。可用根据本发明公开的组合物治疗的其它癌症包括但不限于，例如霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、小细胞肺肿瘤、原发性脑瘤、胃癌(stomach cancer)、结肠癌、恶性胰岛肿瘤、恶性类癌瘤、膀胱癌、胃癌(gastric cancer)、恶变前皮肤损伤、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食管癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、宫颈癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌和前列腺癌。本文所用的〃神经病学疾病或病症〃是指神经系统和/或视觉系统的任何疾病或病症。〃神经病学疾病或病症〃包括牵涉中枢神经系统(脑、脑干和小脑)、外周神经系统(包括颅神经)和自主神经系统(其部分位于中枢神经系统和外周神经系统两者中)的疾病或病症。神经病学病症包括但不限于，获得性癫痫样失语症；急性播散性脑脊髓炎；脑白质肾上腺萎缩症；年龄相关的黄斑变性；胼胝体发育不全；失认症；艾卡迪综合征；亚力山大病；阿尔佩斯病；交替性偏瘫；阿尔茨海默氏病；血管性痴呆；肌萎缩性侧索硬化；无脑；Angelman综合征；血管瘤病；缺氧症；失语症；失用症；蛛网膜囊肿；蛛网膜炎；阿-基氏脑畸形；动静脉畸形；阿斯佩各综合征；共济失调毛细血管扩张；注意力缺乏过动症；孤独症；自主神经失调；背痛；巴藤病；白塞病；贝耳麻痹；良性自发性睑痉挛；良性局灶性肌萎缩；良性卢页内高压；宾斯旺格氏病；睑疫挛；Bloch Sulzberger综合征；臂丛损伤；脑脓肿；脑损伤；脑肿瘤(包括多形性胶质母细胞瘤)；脊髓肿瘤；布朗-塞卡尔综合征；卡纳万病；腕管综合症；灼痛；中枢性疼痛综合症；脑桥中部髓鞘溶解；头部障碍；脑动脉瘤；脑动脉硬化；脑萎缩；大脑性巨人症；大脑性麻痹；夏-马-图三氏病；化疗引起的神经病和神经性疼痛；基氏脑畸形；舞蹈症；慢性炎症性脱髓鞘多神经病；慢性痛；慢性局部疼痛综合征；科-勒二氏综合征；昏迷，包括持续性植物人状态；先天性面瘫；皮质基底节变性；颅动脉炎；颅缝早闭；克雅氏病；积累性损伤错乱；柯兴综合征；巨细胞包涵体病；巨细胞病毒感染；眼舞蹈-足舞蹈综合征；丹-沃二氏综合征；DaWSon病；德摩西埃氏综合征；下臂丛麻痹；痴呆；皮肌炎；糖尿病性神经病；弥漫性硬化症；家族性自主神经异常；书写困难；阅读困难；张力障碍；早期幼儿癫痫性脑病；空蝶鞍综合征；脑炎；脑膨出；脑三叉神经血管瘤病；癫痫；欧勃氏麻痹；特发性震颤；法布里氏病；法尔氏综合征；昏厥；家族性痉挛麻痹症；热性癫痫发作；菲希尔综合征；弗里德赖希氏共济失调；额颞痴呆和其它"tau病变〃；高歇病；格斯特曼氏综合征；巨细胞性动脉炎；巨细胞性包涵体病；球样细胞脑白质营养不良；格_巴二氏综合征；HTLV-1相关的骨髓病；哈-斯二氏病；头部损伤；头痛；半面痉挛；遗传性痉挛性截瘫；多神经炎型遗传性共济失调；耳部带状疱疹；带状疱疹；Hirayama综合征；HIV相关的痴呆和神经病(也是AIDS的神经病学表现)；前脑无裂畸形；亨延顿氏舞蹈病和其它多谷氨酰胺重复序列病；积水性无脑畸形；脑积水；皮质醇过多症；低氧；免疫介导的脑脊髓炎；包涵体肌炎；色素失调症；婴儿植烷酸贮积病；婴儿雷夫叙姆病；婴儿疫挛；炎性肌病；卢页内囊肿；卢页内高压Joubert综合征；卡恩斯-塞尔综合征；Kennedy病；金斯布林纳综合征；克-费二氏综合征；克拉贝病；库-韦二氏病；库鲁病；拉福拉病；Lambert-Eaton肌无力综合征；Landau_Kleffner综合征；侧髓(瓦伦伯格氏)综合征；学习障碍；利氏病；Lennox-Gustaut综合征；莱_萘二氏综合征；脑白质病变；路易体痴呆；无脑回症；闭锁综合征；Lou Gehrig病(即，运动神经元病或肌萎缩性侧索硬化)；椎间盘退变；莱姆病-神经病学后遗症；Machado-Jos印h病；巨头；巨脑；梅_罗二氏综合征；美尼尔症；脑膜炎；门克斯病；异染性脑白质营养不良；头小畸形；偏头痛;Miller Fisher综合征；小中风；线粒体肌病；默比厄斯氏综合征；单肢肌萎缩；运动神经元病；Moyamoya病；粘多糖贮积症；多发梗塞性痴呆；多灶性运动神经病；多发性硬化和其它脱髓鞘病症；伴有体位性低血压的多系统萎缩症；肌肉萎缩症；重症肌无力；脑脱髓鞘弥散性硬化；婴儿肌阵挛性脑病；肌阵挛；肌病；先天性肌强直；嗜睡病；神经纤维瘤病；抗精神病药的恶性综合征；AIDS的神经病学表现；狼疮的神经病学后遗症；神经性肌强直；神经元蜡样脂褐质沉积症；神经元移行异常；尼-皮二氏病；0’ Sullivan-McLeod综合征；枕神经痛；隐性脊柱神经管闭合不全序列征；大田原综合征；橄榄体脑桥小脑萎缩；眼阵挛-肌阵挛；视神经炎；直立性低血压；过度使用综合征；感觉异常；神经变性疾病或病症(帕金森病、亨延顿氏舞蹈病、阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、痴呆、多发性硬化和与神经元细胞死亡相关的其它疾病和病症)；先天性肌强直病；副肿瘤性疾病；突发性癫痫；帕_罗二氏综合征；佩-梅氏病；周期性麻痹；外周神经病；痛性神经病和神经性疼痛；持续性植物人状态；全身性发育迟缓；光喷嚏反射；植烷酸贮积病；皮克氏病；神经挟捏；垂体肿瘤；多肌炎；孔洞脑；小儿麻痹症后期综合症；带状疱疹后神经痛；感染后脑脊髓炎；体位性低血压；帕-魏二氏综合征；原发性脊髓侧索硬化；朊病毒病；进行性面偏侧萎缩症；进行性多灶性白质脑病；进行性硬化性灰质萎缩；进行性核上性麻痹；假性脑瘤；Ramsay-Hunt综合征(I型和II型)；
Rasmussen脑炎；反射性交感神经营养不良综合征；雷夫叙姆病；重复性运动损伤；重复性压力损伤；多动腿综合征；逆转录病毒相关的脊髓病；Rett综合征；雷依氏综合征；圣维特斯舞蹈病；桑德霍夫病；谢耳德氏病；脑裂；视隔发育不全；摇晃婴儿综合症；带状疱疹；希-德二氏综合征；斯耶格伦氏综合征；睡眠窒息；Soto综合征；僵直；脊柱裂；脊髓损伤；脊髓肿瘤；脊髓性肌萎缩；僵人综合征；中风；斯特奇-韦伯综合征；亚急性硬化全脑炎 ’动脉硬化性皮层下脑病；西德纳姆舞蹈；晕厥；脊髓空洞症；迟发性运动障碍；泰-萨二氏病；颞动脉炎；脊髓拴系综合征；肌强直性白内障；胸部出口综合征；三叉神经痛；托德氏麻痹；图雷特综合症；暂时性缺血性发作；传染性海绵状脑病；横贯性脊髓炎；外伤性脑损伤；震颤；三叉神经痛；热带痉挛性轻截瘫；结节性脑硬化；血管性痴呆(多发梗塞性痴呆)；血管炎(包括颞动脉炎)；希-林二氏病；瓦伦伯格氏综合征；韦-霍二氏病；韦斯特综合征；鞭抽式损伤(whiplash);威廉斯综合征；Wildon病和泽韦格综合征。“增殖性疾病或病症”包括但不限于造血赘生性病症，其牵涉由髓细胞系、淋巴细胞系/红细胞系或其前驱细胞产生的造血源的增生性细胞/赘生性细胞。这些包括但不限于成红细胞性白血病、急性早幼粒细胞白血病(APML)、慢性骨髓性白血病(CML)、淋巴细胞恶性肿瘤(包括但不限于急性成淋巴细胞性白血病(ALL)，其包括B系ALL和T系ALL ;慢性淋巴细胞性白血病(CLL);幼淋巴细胞性白血病(PLL)、毛细胞性白血病(HLL)和瓦氏巨球蛋白血症(WM)。恶性淋巴瘤的其它形式包括但不限于非霍奇金淋巴瘤及其变体、周围T细胞淋巴瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)、皮肤T-细胞淋巴瘤(CTCL)、大颗粒性淋巴细胞性白血病(LGF)、霍奇金病和李特-斯顿伯格病。〃炎症〃是指系统性炎症疾患和局部地伴有单核细胞、粒细胞和/或中性白细胞的迁移和吸引的疾患。炎症的实例包括但不限于，病原生物体(包括革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、病毒、真菌和寄生虫例如原生动物和蠕虫)感染引起的炎症、移植排斥(包括排斥实体器官例如肾脏、肝脏、心脏、肺或角膜以及排斥骨髓移植物，包括移植物抗宿主病(GVHD))，或局部的慢性或急性自身免疫或变应性反应引起的炎症。自身免疫疾病包括急性肾小球性肾炎；类风湿性关节炎或反应性关节炎；慢性肾小球性肾炎；炎性肠病例如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎和坏死性小肠结肠炎；粒细胞输血相关的综合征；炎症性皮肤病例如接触性皮炎、特应性皮炎、银屑病；全身性红斑狼疮(SLE)、自身免疫性甲状腺炎、多发性硬化，和一些形式的糖尿病，或其中受治疗者自身免疫系统的攻击导致病理学组织破坏的任何其它自身免疫状态。变应性反应包括变应性哮喘、慢性支气管炎、急性和延迟的过敏症。系统性炎症疾病状态包括外伤、烧伤、缺血事件后再灌注(例如，心脏、脑、肠或外周脉管系统中的血栓形成事件，包括心肌梗塞和中风)相关的炎症、败血症、ARDS或多器官功能障碍综合征。炎性细胞募集也发生在动脉粥样硬化斑块中。炎症包括但不限于，非霍奇金淋巴瘤、韦格纳氏肉芽肿、桥本氏甲状腺炎、肝细胞癌、胸腺萎缩、慢性胰腺炎、类风湿性关节炎、反应性淋巴样增生、骨关节炎、溃疡性结肠炎、乳头状癌、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、急性胆囊炎、慢性胆囊炎、肝硬化、慢性涎腺炎、腹膜炎、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、慢性胃炎、内在性子宫内膜异位症、子宫内膜异位症、急性宫颈炎、慢性宫颈炎、淋巴样增生、多发性硬化、特发性血小板减少性紫癜继发性的肥大、原发性IgA肾病、全身性红斑狼疮、银屑病、肺气肿、慢性肾盂肾炎和慢性膀胱炎。多核苷酸和寡核苷酸组合物和分子靶:在一个实施方案中，靶包括唾液酸酶4 (NEU4)及其同种型的核酸序列，包括但不限于NEU4相关的有义和/或反义的非编码和/或编码序列。唾液酸酶是一种存在于活体内的水 解糖类的酶，其消除糖蛋白或糖脂的糖链的非还原性末端的唾液酸残基。已知，当唾液酸从糖链分子移除时，不仅这些分子的降解开始，而且分子构象以及很多重要的细胞功能例如被受体识别的机理、细胞粘着和免疫机理可以发生变化。同时已变得明显的是:唾液酸酶显示与细胞的增殖和癌化相关的快速活性变化，并且其与癌细胞的代谢能力有关。然而，对如何在体内消除唾液酸的知识了解很少。这是因为对哺乳动物唾液酸酶在分子水平上的研究是落后的，并且因此关于其结构和表达机理存在很多未知的方面。因为哺乳动物唾液酸酶仅显示低活性，并且极其不稳定，所以酶的分离和纯化变得很困难。唾液酸酶长期以来往往被认为是一种仅仅牵涉异化和降解的溶酶体酶。在这种情形下，我们通过主要将大鼠组织用作酶源来分离并纯化酶，并且发现，存在与自然状态的细菌、病毒、原生动物等的唾液酸酶不同的四种类型的唾液酸酶。这些酶各自分别定位于细胞内的溶酶体基质、溶酶体膜、质膜(细胞表面膜)和细胞质，并且它们不仅在酶学特征例如底物特异性方面彼此不同，而且在免疫学性质方面彼此不同。在那些唾液酸酶中，定位于细胞质的唾液酸酶可作为来自大鼠骨骼肌的同源纯化产物获得。其cDNA克隆作为动物唾液酸酶首次在世界中取得成功，并且其一级结构已被测定。同时已进行其基因组结构分析，以及关于其功能，已阐明酶通过将cDNA用作探针而参与骨骼肌细胞的分化和生长。这些研究可被认为是世界范围唾液酸酶研究中的开拓性研究工作的一部分。通过先前研究，已变得明显的是:定位于质膜的唾液酸酶在细胞的增殖和癌化之后可能显示活性提高，并且其与神经细胞分化和细胞信号转导深切相关。然而，迄今为止，关于该酶的结构、引起活性变化的机理等根本仍未被理解。为了答复这些问题，本领域很多研究人员长久以来所想得到的是其cDNA的克隆。例如，如果可能阐明由于该酶导致的癌性变化的机理，那么在诊断和 治疗癌症中利用该结果是可能的。此外，因为神经节苷脂存在于很多细胞的表面膜中并且参与重要细胞功能例如细胞粘着和信息交流，以及它们同时为主要的大脑组分，所以估计利用它们作为特异性底物的唾液酸酶与某些重要的脑神经功能有关。在实施方案中，反义寡核苷酸用来预防或治疗NEU4家族成员相关的疾病或病症。可用本发明的反义寡核苷酸和/或用从利用反义化合物获得的和/或具有反义化合物的干细胞再生的细胞/组织治疗的示例性唾液酸酶4 (NEU4)介导的疾病和病症包括:与唾液酸酶的异常功能和/或表达相关的疾病或病症、癌症、增殖性疾病或病症、细胞凋亡、与细胞凋亡调节受损相关的疾病或病症、糖尿病、心血管疾病或病症、Tay Sachs病、溶酶体贮积症、炎性疾病或病症(例如炎性肠病，包括克罗恩病、溃疡性结肠炎；银屑病；关节炎等)、炎症；代谢疾病或病症、代谢综合征、胰岛素抵抗综合征、糖尿病、高血脂症、脂肪肝疾病、恶病质、肥胖症、动脉粥样硬化症、动脉硬化症、与胆固醇代谢改变相关的疾病病症或疾患、血压升高、神经病学疾病或病症；与神经元细胞分化受损相关的疾病或病症；与神经突形成受损相关的疾病或病症；与糖蛋白脱唾液酸化受损相关的疾病或病症和感染(例如病毒感染、全身性感染等)。在实施方案中，将一种或多种反义寡核苷酸对NEU4调节向需要其的患者施用以预防或治疗与正常对照相比的NEU4异常表达、功能、活性相关的任何疾病或病症。在实施方案中，寡核苷酸是对NEU4多核苷酸有特异性,该多核苷酸包括但不限于非编码区。NEU4靶包括NEU4的变体；NEU4的突变体，包括SNP ；NEU4的非编码序列；等位基因、片段和类似物。优选地寡核苷酸是反义RNA分子。根据本发明的实施方案,祀核酸分子不限于仅NEU4多核苷酸,还延伸到NEU4的任何同种型、受体、同系物、非编码区和类似物。在实施方案中，寡核苷酸靶向NEU4靶的天然反义序列(与编码区和非编码区天然反义)，包括但不限于，其变体、等位基因、同系物、突变体、衍生物、片段及其互补序列。优选地寡核苷酸是反义RNA或DNA分子。在实施方案中，本发明的寡聚化合物还包括变体，其中在化合物中一个或多个核苷酸位置存在不同碱基。例如，如果第一个核苷酸是腺嘌呤，可产生在这一位置包含胸苷、鸟苷、胞苷或其它天然或非天然核苷酸的变体。这可在反义化合物的任何位置进行。随后利用本文所述的方法测定这些化合物以确定它们抑制靶核酸表达的能力。在一些实施方案中，反义化合物与靶之间的同源性、序列同一性或互补性是从约50%至约60%。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性是从约60%至约70%。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性是从约70%至约80%。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性是从约80%至约90%。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性是约90%、约92%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100%。当反义化合物与靶核酸的结合干扰靶核酸的正常功能以导致活性的丧失时，该化合物是可特异性杂交的，且在期望特异性结合的条件下存在足够程度的互补性以避免反义化合物与非靶核酸序列的非特异性结合。这种条件包括，即，在体内测定或治疗性治疗的情形中的生理条件以及在体外测定的情形中进行测定的条件。当反义化合物(无论是DNA、RNA、嵌合、取代的等等)与靶DNA或RNA分子的结合干扰靶DNA或RNA的正常功能以导致效用的丧失时，该化合物是可特异性杂交的，且在期望特异性结合的条件下(即，在体内测定或治疗性治疗的情形中的生理条件下以及在体外测定的情形中进行测定 的条件下)存在足够程度的互补性以避免反义化合物与非靶序列的非特异性结合。在实施方案中，NEU4的靶向包括但不限于，利用例如PCR、杂交等鉴定和扩展的反义序列、一种或多种如SEQ ID N0:2至7所列的序列和调节NEU4表达或功能的类似物。在一个实施方案中，与对照相比表达或功能被上调。在实施方案中，与对照相比表达或功能被下调。在实施方案中，寡核苷酸包括如SEQ ID N0:8至11所列的核酸序列，包括利用例如PCR、杂交等鉴定和扩展的反义序列。这些寡核苷酸可包括一种或多种修饰的核苷酸、更短或更长的片段、修饰的键和类似物。修饰的键或核苷酸间键合的实例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或类似物。在实施方案中，核苷酸包括磷衍生物。可附加于本发明的修饰的寡核苷酸中的糖或糖类似物部分的磷衍生物(或修饰的磷酸酯基团)可以是单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、磷酸烷基酯、磷酸烷烃酯、硫代磷酸酯和类似物。上述磷酸酯类似物的制备和将其向核苷酸、修饰的核苷酸和寡核苷酸的并入本身是已知的，不必在此描述。反义的特异性和灵敏性还由本领域技术人员利用以用于治疗用途。反义寡核苷酸已在动物和人的疾病状态的治疗中用作治疗部分。反义寡核苷酸已经安全且有效地施用于人，目前正在进行许多临床试验。因此已经确定，寡核苷酸可以是有用的治疗形态，可被配置以用于治疗细胞、组织和动物(尤其是人)的治疗方案。
在本发明的实施方案中，寡聚反义化合物，尤其是寡核苷酸，结合靶核酸分子并调节靶基因编码的分子的表达和/或功能。待干扰的DNA的功能包括，例如复制和转录。待干扰的RNA功能包括所有重要功能，例如RNA向蛋白翻译位置的移位，从RNA翻译为蛋白，剪接RNA以产生一种或多种mRNA种类以及可由RNA参与或促进的催化活性。取决于期望的功能，功能可被上调或抑制。反义化合物包括反义寡聚化合物、反义寡核苷酸、外部指导序列(EGS)寡核苷酸、可选剪接体、引物、探针以及与靶核酸的至少一部分杂交的其它寡聚化合物。因此，这些化合物可以单链、双链、部分单链或环状寡聚化合物的形式引入。在本发明范畴中，将反义化合物靶向特定核酸分子可以是多步骤的过程。该过程通常开始于鉴定待调节其功能的靶核酸。这一靶核酸可以是，例如，其表达与特定病症或疾病状态相关的细胞基因(或从基因转录的mRNA)或来自感染物的核酸分子。在本发明中，靶核酸编码唾液酸酶4 (NEU4)。靶向过程通常还包括确定靶核酸中发生反义相互作用从而产生期望作用例如调节表达的至少一个靶区域、区段或位置。在本发明范畴中，术语〃区域〃定义为具有至少一种可鉴定结构、功能或特征的靶核酸的一部分。靶核酸区域中是区段。"区段"定义为靶核酸中较小区域或区域的亚部分。本发明中使用的"位置"定义为靶核酸中的位置。在实施方案中，反义寡核苷酸结合唾液酸酶4(NEU4)的天然反义序列并调节NEU4(SEQ ID NO:1)的表达和/或功能。反义序列的实例包括SEQ ID N0:2至11。在实施方案中，反义寡核苷酸结合唾液酸酶4 (NEU4)多核苷酸的一个或多个区并调节NEU4的表达和/或功能 。区段包括NEU4的有义或反义多核苷酸的至少五个连续核苷酸。在实施方案中，反义寡核苷酸是对NEU4的天然反义序列有特异性，其中寡核苷酸对NEU4的天然反义序列的结合调节NEU4的表达和/或功能。在实施方案中，寡核苷酸化合物包括如SEQ ID N0:8至11所列的序列、利用例如PCR、杂交等鉴定和扩展的反义序列。这些寡核苷酸可包括一种或多种修饰的核苷酸、更短或更长的片段、修饰的键和类似物。修饰的键或核苷酸间键合的实例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或类似物。在实施方案中，核苷酸包括磷衍生物。可附加于本发明的修饰的寡核苷酸中的糖或糖类似物部分的磷衍生物(或修饰的磷酸酯基团)可以是单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、磷酸烷基酯、磷酸烷烃酯、硫代磷酸酯和类似物。上述磷酸酯类似物的制备和将其向核苷酸、修饰的核苷酸和寡核苷酸的并入本身是已知的，不必在此描述。如本领域已知的，因为翻译起始密码子通常是5’ -AUG(在转录的mRNA分子中；在相应DNA分子中是5’ -ATG)，翻译起始密码子也称为"AUG密码子〃、〃起始密码子〃或"AUG起始密码子"。少数基因具有具有RNA序列5’ -GUG、5’ -UUG或5’ -CUG的翻译起始密码子；且5’ -AUA、5’ -ACG和5’ -CUG已显示在体内起作用。因此，术语〃翻译起始密码子〃和〃起始密码子"可涵盖许多密码子序列，尽管每种情形中的起始氨基酸通常是甲硫氨酸(真核细胞中)或甲酰甲硫氨酸(原核细胞中)。真核基因和原核基因可具有两个或更多个替代性起始密码子，其中的任何一个可在特定细胞类型或组织中或在特定条件设置下优先地用于翻译起始。在本发明范畴中，"起始密码子"和"翻译起始密码子"是指体内用于起始从编码唾液酸酶4 (NEU4)的基因转录的mRNA的翻译的一种或多种密码子，而不论这种密码子的序列。基因的翻译终止密码子(或〃终止密码子〃)可具有三种序列即5’ -UAA、5’ -UAG和5’ -UGA之一(相应的DNA序列分别是5’ _TAA、5’ -TAG和5’ -TGA)。术语〃起始密码子区〃和〃翻译起始密码子区〃是指这种mRNA或基因的一部分，涵盖以任一方向(即，5’或3’)从翻译起始密码子的约25至约50个连续核苷酸。类似地，术语〃终止密码子区〃和〃翻译终止密码子区〃是指这种mRNA或基因的一部分，涵盖以任一方向(即，5’或3’)从翻译终止密码子的约25至约50个连续核苷酸。因此，〃起始密码子区〃(或"翻译起始密码子区〃)和"终止密码子区〃(或"翻译终止密码子区〃)都是可用本发明的反义化合物有效地靶向的区域。本领域已知开放读码框(ORF)或〃编码区〃是指翻译起始密码子与翻译终止密码子之间的区域，也是可被有效地靶向的区域。在本发明范畴中，靶向的区域是涵盖基因开放读码框(ORF)的翻译起始或终止密码子的基因内区域。另一靶区域包括5’非翻译区(5’ UTR)，本领域已知是指mRNA以5’方向从翻译起始密码子的部分，因此包括mRNA的5’帽位置与翻译起始密码子之间的核苷酸(或基因上相应的核苷酸)。又一靶区域包括3’非翻译区(3’UTR)，本领域已知是指mRNA以3’方向从翻译终止密码子的部分，因此包括mRNA的翻译终止密码子与3’端之间的核苷酸(或基因上相应的核苷酸)。mRNA的5’帽位置包括经由5’-5’三磷酸酯键合与mRNA的最5’残基连接的N7-甲基化鸟苷残基。认为mRNA的5’帽区域包括5’帽结构本身以及与帽位置相邻的前50个核苷酸。本发明的另一靶区域是5’帽区域。尽管一些真核mRNA转录物被直接翻译，但是许多包含一个或多个称为〃内含子〃的区域，在翻译前从转录物切除。其余(因此被翻译的)区域称为"外显子"，被剪接在一起以形成连续的mRNA序列。在一个实施方案中，靶向剪接位置，即，内含子-外显子结点或外显子-内含子结点在其中疾病中牵涉异常剪接的情形或其中疾病中牵涉特定剪接产物的过度产生的情形尤其有用。由于重排或缺失的异常融合结点是靶位置的另一形式。由剪接来自不同基因来源的两个(或更多个)mRNA的过程产生的mRNA转录物称为"融合转录物"。利用靶向例如DNA 或前体mRNA的反义化合物可有效地靶向内含子。在实施方案中，反义寡核苷酸结合靶多核苷酸的编码区和/或非编码区并调节靶分子的表达和/或功能。在实施方案中，反义寡核苷酸结合天然反义多核苷酸并调节靶分子的表达和/或功能。在实施方案中，反义寡核苷酸结合有义多核苷酸并调节靶分子的表达和/或功倉泛。可从DNA的相同基因组区域产生可选RNA转录物。这些可选转录物通常称为〃变体〃。更具体地，〃前体mRNA变体〃是从相同基因组DNA产生的转录物，在其起始或终止位置与从相同基因组DNA产生的其它转录物不同，并包含内含子序列和外显子序列两者。在剪接期间切除一个或多个外显子或内含子区域或其部分后，前体mRNA变体产生更小的"mRNA变体〃。因此，mRNA变体是加工的前体mRNA变体，且每个独特的前体mRNA变体必定因为剪接而产生独特的mRNA变体。这些mRNA变体还称为〃可选剪接变体〃。如果不进行前体mRNA变体的剪接，则前体mRNA变体与mRNA变体相同。变体可经由使用可选信号产生以起始或终止转录。前体mRNA和mRNA可具有多于一个起始密码子或终止密码子。来源于使用可选起始密码子的前体mRNA或mRNA的变体称为该前体mRNA或mRNA的"可选起始变体"。使用可选终止密码子的那些转录物称为该前体mRNA或mRNA的〃可选终止变体"。一种特定类型的可选终止变体是〃聚腺苷酸变体"，其中产生的多个转录物由"聚腺苷酸终止信号"之一被转录机制可选选择所致，从而产生在独特聚腺苷酸位点终止的转录物。在本发明范畴中，本文所述的变体类型也是靶核酸的实施方案。靶核酸上与反义化合物杂交的位置定义为活性反义化合物靶向的靶区域的至少5-核苷酸长的部分。尽管本文列出了某些示例性靶区段的具体序列，但是本领域技术人员将理解这些用于阐释和描述于本发明范围中的具体实施方案。本领域普通技术人员考虑到本公开内容可容易地鉴定另外的靶区段。认为包括选自示例性优选的靶区段中的至少五(5)个连续核苷酸的段的长度为5-100个核苷酸的靶区段也适合于靶向。靶区段可包括包括从示例性优选的靶区段之一的5’ -末端的至少5个连续核苷酸的DNA或RNA序列(其余核苷酸为从靶区段5’ -末端的紧邻上游开始的相同DNA或RNA的连续段并延伸直到DNA或RNA包含约5至约100个核苷酸)。类似地优选的靶区段由包括从示例性优选的靶区段之一的3’ -末端的至少5个连续核苷酸的DNA或RNA序列代表(其余核苷酸为从靶区段3’ -末端的紧邻下游开始的相同DNA或RNA的连续段并延伸直到DNA或RNA包含约5至约100个核苷酸)。借助本文所示例的靶区段的本领域技术人员将能够鉴定另外的优选的靶区段而不需过度试验。已经鉴定出一种或多种靶区域、区段或位置后，选择与靶足够地互补，S卩，充分良好并以足够特异性杂交的反义化合物以获得期望作用。在本发明的实施方 案中，寡核苷酸结合特定靶的反义链。寡核苷酸长度为至少5个核苷酸并可合成以使每个寡核苷酸靶向重叠序列，从而寡核苷酸被合成以覆盖靶多核苷酸的整个长度。靶还包括编码区以及非编码区。在一个实施方案中，将反义寡核苷酸靶向特定核酸是优选的。将反义化合物靶向特定核酸是多步骤的过程。该过程通常开始于鉴定待调节其功能的核酸序列。这一核酸序列可以是，例如，其表达与特定病症或疾病状态相关的细胞基因(或从基因转录的mRNA)、或非编码多核苷酸，例如非编码RNA(ncRNA)。RNA可分为⑴信使RNA (mRNA)，其被翻译为蛋白，和⑵非蛋白编码RNA (ncRNA)。ncRNA包括微RNA、反义转录物和包含高密度终止密码子和缺少任何广泛的〃开放读码框〃的其它转录单位(TU)。许多ncRNA表现为从蛋白-编码基因座的3’非翻译区(3’UTR)中的起始位点开始。ncRNA通常是罕见的，已被FANTOM财团测序的ncRNA的至少一半似乎不是多腺苷酸化的。出于明显的原因，大多数研究者集中于被加工并输出到细胞质的多腺苷酸化mRNA。最近，显示非多腺苷酸化的核RNA的组可能是非常大的，且许多这样的转录物来源于所谓的基因间区。ncRNA可调节基因表达的机制是通过与靶转录物的碱基配对。通过碱基配对起作用的RNA可分为(I)顺式编码的RNA，其在它们所作用的RNA的相同遗传位置但在相对链上被编码，因此与其靶展示极佳的互补性，和(2)反式编码的RNA，其在不同于它们所作用的RNA的染色体位置被编码，通常不与其靶展示极佳的碱基-配对可能。
不希望受限于理论，反义多核苷酸被本文所述的反义寡核苷酸的扰动可改变相应有义信使RNA的表达。然而，这一调节可以是不一致的(反义敲低导致信使RNA升高)或一致的(反义敲低导致相伴的信使RNA减少)。在这些情形中，反义寡核苷酸可靶向于反义转录物的重叠或非重叠部分，导致其敲低或隔离。编码以及非编码反义可以相同方式靶向，任一种类能够调节相应的有义转录物-以一致的或不一致的方式。鉴定针对靶使用的新寡核苷酸中采用的策略可基于反义RNA转录物被反义寡核苷酸的敲低或调节期望靶的任何其它手段。策略1:在不一致调节的情形下，敲低反义转录物升高常规(有义)基因的表达。如果后者基因编码已知或推测的药物靶，则其反义对应物的敲低能够可设想地模拟受体激动剂或酶刺激剂的作用。策略2:在一致调节的情形下，人们可以协同地敲低反义转录物和有义转录物两者，从而实现常 规(有义)基因表达的协同减少。例如，如果反义寡核苷酸用来实现敲低，则这一策略可用来施加靶向有义转录物的一种反义寡核苷酸和靶向相应反义转录物的另一反义寡核苷酸，或同时靶向重叠的有义转录物和反义转录物的单个有力地对称的反义寡核苷酸。根据本发明，反义化合物包括反义寡核苷酸、核酶、外部指导序列(EGS)寡核苷酸、siRNA化合物、单链或双链RNA干扰(RNAi)化合物例如siRNA化合物以及杂交于靶核酸的至少一部分并调节其功能的其它寡聚化合物。因此，它们可以是DNA、RNA、DNA-样、RNA-样或其混合物，或可以是一种或多种这些的模拟物。这些化合物可以是单链、双链、环状或发夹寡聚化合物，并可包含结构元件，例如内部凸出或末端凸出、错配或环。常规线性地制备反义化合物，但可被连接或以其它方式制备为环状和/或分支的。反义化合物可包括构建体，例如，两条链杂交以形成完全或部分双链的化合物或者具有足够自互补性的单链以允许杂交和形成完全或部分双链的化合物。两条链可在内部被连接，留下游离的3’或5’末端，或可被连接以形成连续的发夹结构或环。发夹结构可包含在5’或3’末端的突出，产生单链特征的延伸段。双链化合物任选地可包括在末端的突出。进一步的修饰可包括附加于末端之一、所选的核苷酸位置、糖位置或核苷间键合之一的缀合物基团。可选地，两条链可经由非核酸部分或接头基团连接。当仅由一条链形成时，dsRNA可采取自互补发夹型分子的形式，其与自身对折以形成双链体。因此，dsRNA可以是完全或部分双链的。基因表达的特异性调节可通过在转基因细胞系中稳定表达dsRNA发夹来实现,然而,在一些实施方案中，基因表达或功能被上调。当由两条链或采取与自身对折以形成双链体的自互补发夹型分子形式的单链形成时，两条链(或单链的双链体形成区)是以Watson-Crick方式碱基配对的互补RNA链。被引入系统中后，本发明的化合物可引发一种或多种酶或结构蛋白的作用以实现靶核酸的裂解或其它修饰，或可经由基于占位性的机制作用。通常，核酸(包括寡核苷酸)可描述为"DNA-样〃(S卩，通常具有一个或多个2’ -脱氧糖，且通常具有T而不是U碱基)或〃RNA-样〃(即，通常具有一个或多个2’ -羟基或2’ -修饰的糖，且通常具有U而不是T碱基)。核酸螺旋可采用多于一种类型的结构，最通常是A-和B-形式。通常认为，具有B-形式-样结构的寡核苷酸是"DNA-样〃，且具有A-形式样结构的是"RNA-样〃。在一些(嵌合)实施方案中，反义化合物可包含A-形式区域和B-形式区域两者。
在实施方案中，期望寡核苷酸或反义化合物包括以下至少一种:反义RNA、反义DNA、嵌合反义寡核苷酸、包括修饰的键合的反义寡核苷酸、干扰RNA(RNAi)、短干扰RNA (siRNA)、微干扰 RNA (miRNA)、时序调节小 RNA (stRNA)或短发夹 RNA (shRNA)、小 RNA-诱导的基因活化(RNAa)、小活化RNA(saRNA)或其组合。dsRNA还可活化基因表达，这是已被称为〃小RNA-诱导的基因活化〃或RNAa的机制。dsRNA靶向基因启动子诱导相关基因的有效的转录活化。RNAa在人细胞中利用合成的dsRNA证实，称为〃小活化RNA〃 (saRNA)。目前未知RNAa在其它生物体中是否是保守的。已发现小双链RNA (dsRNA)，例如小干扰RNA (siRNA)和微RNA (miRNA)是称为RNA干扰(RNAi)的进化保守机制的触发物。RNAi不变性经由重建染色质导致基因沉默，从而阻遏转录、降解互补mRNA或阻断蛋白翻译。然而在以下实施例部分详细描述的情况中，寡核苷酸显示增加唾液酸酶4 (NEU4)多核苷酸和其编码的产物的表达和/或功能。dsRNA还可作为小活化RNA(saRNA)作用。不希望受理论束缚，通过靶向基因启动子中的序列，saRNA将以称为dsRNA-诱导的转录活化(RNAa)的现象诱导靶基因表达。在进一步的实施方案中，本文鉴定的〃优选的靶区段〃可用于筛选调节唾液酸酶4(NEU4)多核苷酸表达的另外的化合物。"调节剂"是减少或增加编码NEU4的核酸分子表达的那些化合物，且包括与优选的靶区段互补的至少5-核苷酸部分。筛选方法包括以下步骤:将编码NEU4的有义或天然反义多核苷酸的核酸分子的优选的靶区段与一种或多种候选调节剂接触，并选择减少或增加编码NEU4多核苷酸的核酸分子(例如SEQ ID N0:8至11)的表达的一种或多种候选调节剂。显示一种或多种候选调节剂能够调节(例如，减少或增加)编码NEU4多核苷酸的核酸分子的表达后，随后调节剂可用于NEU4多核苷酸功能的进一步研究性研究，或用作根据本发明的研究剂、诊断剂或治疗剂。靶向天然反义序列优选地调节靶基因的功能。例如，NEU4基因(例如，登录号ΝΜ_001167600)。在实施方案中，靶是NEU4基`因的反义多核苷酸。在实施方案中，反义寡核苷酸靶向NEU4多核苷酸(例如，登录号NM_001167600)的有义和/或天然反义序列、变体、等位基因、同种型、同系物、突变体、衍生物、片段及其互补序列。优选地寡核苷酸是反义分子且靶包括反义和/或有义NEU4多核苷酸的编码区和非编码区。本发明优选的靶区段还可与本发明的其各自的互补反义化合物组合以形成稳定的双链(双链体)寡核苷酸。在本领域中，这种双链寡核苷酸部分已显示经由反义机制调节靶表达和调节翻译以及RNA加工。而且，可对双链部分进行化学修饰。例如，这种双链部分已经显示通过双链体的反义链与靶经典杂交，从而触发靶的酶促降解来抑制靶。在实施方案中，反义寡核苷酸靶向唾液酸酶4(NEU4)多核苷酸(例如，登录号ΝΜ_001167600)、变体、等位基因、同系物、突变体、衍生物、片段及其互补序列。优选地寡核苷酸是反义分子。根据本发明的实施方案，靶核酸分子不限于仅NEU4，还延伸到其任何多核苷酸变体和产生、影响、冲击或导致或涉及NEU4表达产物和/或其任何同种型的任何多核苷酸。在实施方案中，寡核苷酸靶向NEU4多核苷酸的天然反义序列，例如，如SEQ IDN0:2至7所列的多核苷酸，和任何变体、等位基因、同系物、突变体、衍生物、片段及其互补序列。反义寡核苷酸的实例列在SEQ ID N0:8至11。
在一个实施方案中，寡核苷酸与NEU4反义的核酸序列互补或结合,包括但不限于NEU4多核苷酸相关的非编码有义和/或反义序列，并调节NEU4分子的表达和/或功能。在实施方案中，寡核苷酸与如SEQ ID NO: 2至7所列的NEU4天然反义的核酸序列互补或结合，并调节NEU4分子的表达和/或功能。在实施方案中，寡核苷酸包括SEQ ID N0:8至11的至少5个连续核苷酸的序列，并调节NEU4分子的表达和/或功能。多核苷酸靶包括NEU4，包括其家族成员、NEU4的变体；NEU4的突变体，包括SNP ；NEU4的非编码序列；NEU4的等位基因；物种变体、片段和类似物。优选地寡核苷酸是反义分子。在实施方案中，靶向NEU4多核苷酸的寡核苷酸包括:反义RNA、干扰RNA(RNAi)JS干扰RNA(siRNA);微干扰RNA(miRNA);时序调节小RNA (stRNA);或短发夹RNA (shRNA);小RNA诱导的基因活化(RNAa);或小活化RNA(saRNA)。在实施方案中，用寡核苷酸靶向唾液酸酶4(NEU4)多核苷酸(例如SEQ ID NO:2至11)调节这些靶的表达或功能。在一个实施方案中，与对照相比表达或功能被上调。在实施方案中，与对照相比表达或功能被下调。在实施方案中，反义化合物或调节剂包括如SEQ ID NO:8至11所列的序列。这些寡核苷酸可包括一种或多种修饰的核苷酸、更短或更长片段、修饰的键和类似物。在实施方案中，SEQ ID N0:8至11包括一种或多种LNA核苷酸。表I不出可用于本发明方法中的示例性反义寡核苷酸。表1:
权利要求
1.一种调节生物系统中唾液酸酶4 (NEU4)多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括:将所述系统与长度为5至30个核苷酸的至少一种反义寡核苷酸接触，其中所述至少一种寡核苷酸与唾液酸酶4 (NEU4)多核苷酸的天然反义的反向互补序列具有至少50%序列同一性；从而调节唾液酸酶4(NEU4)多核苷酸的功能和/或表达。
2.根据权利要求1所述的调节生物系统中唾液酸酶4(NEU4)多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括:将所述生物系统与长度为5至30个核苷酸的至少一种反义寡核苷酸接触，其中所述至少一种寡核苷酸与包括SEQ ID NO:2的天然反义转录物核苷酸I至2119或SEQ ID NO:3的天然反义转录物核苷酸I至1245或SEQ ID NO:4的天然反义转录物核苷酸I至490或SEQ ID NO: 5的天然反义转录物核苷酸I至527或SEQ ID NO:6的天然反义转录物核苷酸I至946或SEQ ID NO:7的天然反义转录物核苷酸I至703中的5至30个连续核苷酸的多核苷酸的反向互补 序列具有至少50%序列同一性；从而调节唾液酸酶4(NEU4)多核苷酸的功能和/或表达。
3.一种体内或体外调节患者细胞或组织中唾液酸酶4(NEU4)多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括:将所述细胞或组织与长度为5至30个核苷酸的至少一种反义寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸与唾液酸酶4 (NEU4)多核苷酸的反义寡核苷酸具有至少50%序列同一1丨生；从而体内或体外调节患者细胞或组织中唾液酸酶4(NEU4)多核苷酸的功能和/或表达。
4.根据权利要求3所述的调节患者细胞或组织中唾液酸酶4(NEU4)多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括:将所述生物系统与长度为5至30个核苷酸的至少一种反义寡核苷酸接触，其中所述至少一种寡核苷酸与包括SEQ ID NO:2的天然反义转录物核苷酸I至2119或SEQ ID NO:3的天然反义转录物核苷酸I至1245或SEQ ID NO:4的天然反义转录物核苷酸I至490或SEQ ID NO:5的天然反义转录物核苷酸I至527或SEQ IDNO:6的天然反义转录物核苷酸I至946或SEQ ID NO: 7的天然反义转录物核苷酸I至703中的5至30个连续核苷酸的多核苷酸的反向互补序列具有至少50%序列同一性；从而调节唾液酸酶4(NEU4)多核苷酸的功能和/或表达。
5.一种调节生物系统中唾液酸酶4 (NEU4)多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括:将所述系统与靶向唾液酸酶4(NEU4)多核苷酸的天然反义寡核苷酸的区域的至少一种反义寡核苷酸接触；从而调节唾液酸酶4(NEU4)多核苷酸的功能和/或表达。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述唾液酸酶4(NEU4)的功能和/或表达相对于对照体内或体外增加。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述至少一种反义寡核苷酸靶向唾液酸酶4(NEU4)多核苷酸的天然反义序列。
8.如权利要求5所述的方法，其中所述至少一种反义寡核苷酸靶向包括唾液酸酶4(NEU4)多核苷酸的编码核酸序列和/或非编码核酸序列的核酸序列。
9.如权利要求5所述的方法，其中所述至少一种反义寡核苷酸靶向唾液酸酶4(NEU4)多核苷酸的重叠序列和/或非重叠序列。
10.如权利要求5所述的方法，其中所述至少一种反义寡核苷酸包括选自以下的一种或多种修饰:至少一种修饰的糖部分、至少一种修饰的核苷间键合、至少一种修饰的核苷酸及其组合。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述一种或多种修饰包括选自以下的至少一种修饰的糖部分:2’ -O-甲氧基乙基修饰的糖部分、2’ -甲氧基修饰的糖部分、2’ -O-烷基修饰的糖部分、二环的糖部分及其组合。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述一种或多种修饰包括选自以下的至少一种修饰的核苷酸间键合:硫代磷酸酯、2’ -O甲氧基乙基(MOE)、2’ -氟、膦酸烷基酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、乙酰胺酯、羧甲基酯及其组合。
13.如权利要求10所述的方法，其中所述一种或多种修饰包括选自以下的至少一种修饰的核苷酸:肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、阿拉伯糖-核酸(FANA)、类似物、衍生物及其组口 ο
14.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种寡核苷酸包括如SEQID N0:8至11所列的至少一种寡核苷酸序列。
15.一种体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中唾液酸酶4(NEU4)基因的功能和/或表达的方法，所述方法包括:将所述细胞或组织与长度为5至30个核苷酸的至少一种短干扰RNA (siRNA)寡核苷酸接触，所述至少一种siRNA寡核苷酸对唾液酸酶4 (NEU4)多核苷酸的反义多核苷酸有特异性，其中所述至少一种siRNA寡核苷酸与唾液酸酶4 (NEU4)多核苷酸的反义核酸分子和/或有义核酸分子的至少约五个连续核酸的互补序列具有至少50%序列同一性；以及体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中唾液酸酶4(NEU4)的功能和/或表达。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述寡核苷酸与唾液酸酶4(NEU4)多核苷酸的反义核酸分子和/或有义核酸分子互补的至少约五个连续核酸的序列具有至少80%序列同一性。
17.一种体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中唾液酸酶4 (NEU4)的功能和/或表达的方法，所述方法包括:将所述细胞或组织与长度为约5至30个核苷酸的至少一种反义寡核苷酸接触，所述至少一种反义寡核苷酸对唾液酸酶4 (NEU4)多核苷酸的有义和/或天然反义链的非编码序列和/或编码序列有特异性，其中所述至少一种反义寡核苷酸与如SEQID NO:1至7所列的至少一种核酸序列具有至少50%序列同一性；以及体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中唾液酸酶4(NEU4)的功能和/或表达。
18.一种合成的、修饰的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括至少一种修饰，其中所述至少一种修饰选自:至少一种修饰的糖部分；至少一种修饰的核苷酸间键合；至少一种修饰的核苷酸及其组合；其中所述寡核苷酸是与唾液酸酶4(NEU4)基因杂交并与正常对照相比体内或体外调节其功能和/或表达的反义化合物并且所述寡核苷酸与互补于唾液酸酶4 (NEU4)多核苷酸和等位基因、同系物、同种型、变体、衍生物、突变体、片段或其组合的反义和/或有义核酸分子的至少约5个连续核酸的序列具有至少50%序列同一性。
19.如权利要求18所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的长度为5至30个核苷酸且与NEU4基因的天然反义转录物中5至30个连续核苷酸的反向互补序列具有至少50%序列同一性。
20.如权利要求19所述的寡核苷酸， 其中所述至少一种修饰包括选自以下组成的组的核苷酸间键合:硫代磷酸酯、膦酸烷基酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、乙酰胺酯、羧甲基酯及其组合。
21.如权利要求19所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括至少一种硫代磷酸酯核苷酸间键合。
22.如权利要求19所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括硫代磷酸酯核苷酸间键合的主链。
23.如权利要求19所述的寡核苷酸,其中所述寡核苷酸包括至少一种修饰的核苷酸，所述修饰的核苷酸选自:肽核酸、锁核酸(LNA)、类似物、衍生物及其组合。
24.如权利要求19所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括多种修饰，其中所述修饰包括选自以下的修饰的核苷酸:硫代磷酸酯、膦酸烷基酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、乙酰胺酯、羧甲基酯及其组合。
25.如权利要求19所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括多种修饰，其中所述修饰包括选自以下的修饰的核苷酸:肽核酸、锁核酸(LNA)、类似物、衍生物及其组合。
26.如权利要求19所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括选自以下的至少一种修饰的糖部分:2’ -O-甲氧基乙基修饰的糖部分、2’ -甲氧基修饰的糖部分、2’ -O-烷基修饰的糖部分、二环的糖部分及其组合。
27.如权利要求19所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括多种修饰，其中所述修饰包括选自以下的修饰的糖部分:2’-0_甲氧基乙基修饰的糖部分、2’-甲氧基修饰的糖部分、2’ -O-烷基修饰的糖部分、二环的糖部分及其组合。
28.如权利要求19所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸长度为至少约5至30个核苷酸并与唾液酸酶4(NEU4)多核苷酸的反义和/或有义链杂交，其中所述寡核苷酸与唾液酸酶4(NEU4)多核苷酸的反义和/或有义编码和/或非编码核酸序列的至少约五个连续核酸的互补序列具有至少约60%序列同一性。
29.如权利要求19所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与唾液酸酶4(NEU4)多核苷酸的反义和/或有义编码和/或非编码核酸序列的至少约五个连续核酸的互补序列具有至少约80%序列同一性。
30.如权利要求19所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与至少一种唾液酸酶4(NEU4)多核苷酸杂交并与正常对照相比体内或体外调节其表达和/或功能。
31.如权利要求19所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括如SEQID NO:8至11所列的序列。
32.—种药物组合物，所述药物组合物包括对根据权利要求18的一种或多种唾液酸酶4(NEU4)多核苷酸有特异性的一种或多种寡核苷酸和药学上可接受的赋形剂。
33.如权利要求32所述的组合物，其中所述寡核苷酸与如SEQID NO:8至11所列的任一种核苷酸序列相比具有至少约40%序列同一性。
34.如权利要求32所述的组合物，其中所述寡核苷酸包括如SEQID NO:8至11所列的核苷酸序列。
35.如权利要求34所述的组合物，其中如SEQID NO:8至11所列的寡核苷酸包括一种或多种修饰或取代。
36.如权利 要求35所述的组合物，其中所述一种或多种修饰选自:硫代磷酸酯、膦酸甲酯、肽核酸、锁核酸(LNA)分子及其组合。
37.一种预防或治疗至少一种唾液酸酶4 (NEU4)多核苷酸和/或至少一种其编码的产物相关的疾病的方法，所述方法包括:向患者施用治疗有效剂量的结合所述至少一种唾液酸酶4(NEU4)多核苷酸的天然反义序列并调节所述至少一种唾液酸酶4 (NEU4)多核苷酸的表达的至少一种反义寡核苷酸；从而预防或治疗至少一种唾液酸酶4 (NEU4)多核苷酸和/或至少一种其编码的产物相关的疾病。
38.如权利要求37所述的方法，其中至少一种唾液酸酶4(NEU4)多核苷酸相关的疾病选自:与唾液酸酶的异常功能和/或表达相关的疾病或病症、癌症、增殖性疾病或病症、细胞凋亡、与细胞凋亡调节受损相关的疾病或病症、糖尿病、心血管疾病或病症、Tay Sachs病、溶酶体贮积症、炎性疾病或病症(例如炎性肠病，包括克罗恩病、溃疡性结肠炎、银屑病、关节炎等)、炎症；代谢疾病或病症、代谢综合征、胰岛素抵抗综合征、糖尿病、高血脂症、脂肪肝疾病、恶病质、肥胖症、动脉粥样硬化症、动脉硬化症、与胆固醇代谢改变相关的疾病病症或疾患、血压升高、神经病学疾病或病症、与神经元细胞分化受损相关的疾病或病症；与神经突形成受损相关的疾病或病症；与糖蛋白脱唾液酸化受损相关的疾病或病症和感染(例如病毒感染、全身性感染或任何其他类型的感染)。
39.一种诱导生物系统中的细胞凋亡的方法，其包括向所述系统施用长度为5至30个核苷酸的寡核苷酸，所述寡核苷酸与NEU4多核苷酸的天然反义转录物的反向互补序列中的5至30个连续核苷酸具有至少50%同一性。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述天然反义转录物具有SEQID NO:2至7。
41.根据权利要求39所述的方法，其中所述生物系统为患者细胞或组织。
42.一种诱导生物系统中的细胞凋亡的方法，其包括向所述系统施用长度为约5至30个核苷酸的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸通过靶向基因的天然反义转录物而上调所述靶基因并且其中所述寡核苷酸与所述经上调的基因的天然反义转录物的反向互补序列具有至少50%同一性。
43.一种鉴定和选择对于NEU4基因的天然反义转录物具有选择性的至少一种寡核苷酸作为用于体内施用的所选靶多核苷酸的的方法，所述方法包括:鉴定包括与所选靶多核苷酸或与所选靶多核苷酸的反义多核苷酸至少部分互补的至少五个连续核苷酸的至少一种寡核苷酸；测量反义寡核苷酸和所述靶多核苷酸或与所选靶多核苷酸反义的多核苷酸在严格杂交条件下的杂合体的热熔点；和基于所获得的信息选择用于体内施用的至少一种寡核苷酸。
全文摘要
本发明涉及调节唾液酸酶4(NEU4)的表达和/或功能的反义寡核苷酸，尤其是通过靶向唾液酸酶4(NEU4)的天然反义多核苷酸。本发明还涉及这些反义寡核苷酸的鉴定和它们在治疗NEU4表达相关的疾病和病症中的用途。
文档编号C12N15/113GK103210086SQ201180050023
公开日2013年7月17日 申请日期2011年10月5日 优先权日2010年10月6日
发明者J·克拉德, O·霍克瓦舍曼 申请人:库尔纳公司
技术领域：
本申请要求2010年10月6日提交的美国临时专利申请N0.61/390216的优先权，其通过引用整体并入本文。本发明的实施方案包括调节NEU4和相关分子的表达和/或功能的寡核苷酸。背景DNA-RNA和RNA-RNA杂交对于核酸功能的许多方面是重要的，包括DNA复制、转录和翻译。杂交对于检测特定核酸或改变其表达的多种技术也是关键的。反义核苷酸，例如通过与靶RNA杂交从而干扰RNA剪接、转录、翻译和复制来破坏基因表达。反义DNA具有额外的特性，即DNA-RNA杂交物作被核糖核酸酶H消化的底物，这是在大多数细胞类型中存在的活性。反义分子可被递送到细胞中，如寡脱氧核苷酸(ODN)的情形，或反义分子可从内源基因表达为RNA分子。FDA最近批准了一种反义药物VITRAVENE (用于治疗巨细胞病毒视网膜炎)，反映了反义药物具有治疗效用。概述提供本概述以展示本发明的概述，以简要地指出本发明的性质和实质。提交本概述应理解的是，其不会用来解释或限制权利要求书的范围或含义。在一个实施方案中，本发明提供通过利用靶向天然反义转录物任何区域的反义寡核苷酸而导致相应有义基因的上调来抑制天然反义转录物作用的方法。本文还预期，天然反义转录物的抑制可由siRNA、核酶和小分子实现，认为这些在本发明的范围中。—个实施方案提供调节生物系统(包括但不限于体内或体外患者细胞或组织)中NEU4多核苷酸的功能和/或表达的方法，包括将所述生物系统或所述细胞或组织与长度为约5至约30个核苷酸的反义寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸与包括SEQ ID NO: 2的核苷酸I至2119或SEQ ID NO:3的核苷酸I至1245或SEQ ID NO:4的核苷酸I至490或SEQID NO:5的核苷酸I至527或SEQ ID NO:6的核苷酸I至946或SEQ ID NO:7的核苷酸I至703中的5至30个连续核苷酸的多核苷酸的反向互补序列具有至少50%序列同一'丨生,从而体内或体外调节所述生物系统(包括体内或体外所述患者细胞或组织)中NEU4多核苷酸的功能和/或表达。在实施方案中，寡核苷酸靶向存在于生物系统中的NEU4多核苷酸的天然反义序列，例如，SEQ ID NO: 2至7所列的核苷酸及其任何变体、等位基因、同系物、突变体、衍生物、片段及其互补序列。反义寡核苷酸的实例如SEQ ID N0:8至11所列。另一实施方案提供体内或体外调节患者细胞或组织中NEU4多核苷酸的功能和/或表达的方法，包括将所述细胞或组织与长度为5至30个核苷酸的反义寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸与NEU4多核苷酸的反义的反向互补序列具有至少50%序列同一'丨生；从而体内或体外调节患者细胞或组织中NEU4多核苷酸的功能和/或表达。另一实施方案提供体内或体外调节患者细胞或组织中NEU4多核苷酸的功能和/或表达的方法， 包括将所述细胞或组织与长度为5至30个核苷酸的反义寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸与NEU4反义多核苷酸的反义寡核苷酸具有至少50%序列同一性；从而体内或体外调节患者细胞或组织中NEU4多核苷酸的功能和/或表达。在另一个实施方案中，本发明包括调节生物系统中NEU4多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括将所述生物系统与靶向NEU4多核苷酸的天然反义转录物的至少一个反义寡核苷酸相接触，由此调节所述生物系统中NEU4多核苷酸的功能和/或表达。在另一个实施方案中，本发明包括调节生物系统中NEU4多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括将所述生物系统与靶向NEU4多核苷酸的天然反义转录物的区域的至少一个反义寡核苷酸相接触，由此调节所述生物系统中NEU4多核苷酸的功能和/或表达。在实施方案中，本发明包括增加生物系统中的具有SEQ ID N0:1的NEU4多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括将所述生物系统与靶向所述NEU4多核苷酸的天然反义转录物的至少一个反义寡核苷酸相接触，由此增加所述NEU4多核苷酸或其表达产物的功能和/或表达。在另一个实施方案中，本发明包括增加生物系统中的具有SEQ ID N0:1的NEU4多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括将所述生物系统与靶向所述NEU4多核苷酸的天然反义转录物的至少一个反义寡核苷酸相接触，由此增加所述NEU4多核苷酸或其表达产物的功能和/或表达 ，其中所述天然反义转录物选自SEQ ID N0:2至7。在另一个实施方案中，本发明包括增加生物系统中的具有SEQ ID N0:1的NEU4多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括将所述生物系统与靶向所述NEU4多核苷酸的天然反义转录物的至少一个反义寡核苷酸相接触，由此增加所述NEU4多核苷酸或其表达产物的功能和/或表达，其中所述天然反义转录物选自SEQ ID N0:2至7并且其中所述反义寡核苷酸选自SEQ ID NO:8至11中的至少一个。在实施方案中，组合物包括一种或多种结合有义和/或反义NEU4多核苷酸的反义寡核苷酸。在实施方案中，寡核苷酸包括一种或多种修饰或取代的核苷酸。在实施方案中，寡核苷酸包括一种或多种修饰的键。在又一实施方案中，修饰的核苷酸包括包含硫代磷酸酯、膦酸甲酯、肽核酸、2’ -O-甲基、氟-或碳、亚甲基或其它锁核酸(LNA)分子的修饰的碱基。优选地，修饰的核苷酸是锁核酸分子，包括a-L-LNA。 在实施方案中，将寡核苷酸皮下、肌内、静脉内或腹膜内施用给患者。在实施方案中，寡核苷酸以药物组合物施用。治疗方案包括向患者施用反义化合物至少一次；然而，可修改该治疗以包括经一段时间的多个剂量。该治疗可与一种或多种其它类型的治疗联合。在实施方案中，将寡核苷酸封装在脂质体中或连接于载体分子(例如，胆固醇、TAT 肽)。其它方面在以下描述。附图简述
图1是实时PCR结果的图,其显示利用Lipofectamine2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸处理H印G2细胞后，与对照相比，NEMmRNA的倍数变化+标准差。实时PCR结果显示，用针对Neu4反义Hs.678184设计的反义寡核苷酸中的一种处理后48h，HepG2细胞中Neu4mRNA的水平显著增加。标为CUR-1789至CUR-1792的条柱分别对应用SEQ ID NO:8至11处理的样品。序列表描述-SEQ ID NO:1:智人唾液酸酶4 (NEU4)，转录变体3，mRNA(NCBI登记号:NM_001167600) ；SEQ ID NO:2:天然 NEU4 反义序列(HS.678184) ；SEQ ID N0:3:天然NEU4 反义序列(BC038567) ；SEQ ID NO:4:天然 NEU4 反义序列(CR747539) ；SEQ ID NO:5:天然 NEU4 反义序列(BF527387) ；SEQ ID NO:6:天然 NEU4 反义序列(BF528789) ；SEQ IDNO: 7:天然NEU4反义序列(BG913694)和SEQ ID N0:8至11:反义寡核苷酸。*指示硫代磷酸酯键。详述下面参考用于示例的实例应用来描述本发明的多个方面。应理解的是，列出许多具体细节、关联和方法以提供对本发明的完全理解。然而，相关领域普通技术人员将容易认识到，可没有一种或多种具体细节地实践本发明或以其它方法实践本发明。本发明不限于行为或事件的顺序，因为一些行为可以不同顺序进行和/或与其它行为或事件同时进行。而且，并非所有列举的行为或事件都是实施根据本发明的方法所需的。本文公开的所有基因、基因名称和基因产物预期对应来自本文公开的组合物和方法可适用的任何物种的同系物。因此，这些术语包括但不限于来自人和小鼠的基因和基因产物。应理解的是，当公开来自具体物种的基因或基因产物时，这一公开仅旨在示例，不应解释为限制，除非在其存在的上下文清楚地指明。因此，例如，对于本文公开的基因，其在一些实施方案中涉及哺乳动物核酸和氨基酸序列，预期涵盖来自其它动物的同源和/或直系同源基因和基因产物，所述其它动物包括但不限于其它哺乳动物、鱼、两栖类、爬行动物和鸟类。在实施方案中，基因或核酸序列是人的。定义
本文所用的术语仅是为了描述具体实施方案的目的，并不旨在限制本发明。除非上下文另外清楚地指明，否则本文所用的单数形式〃一个/ 一种(a)〃、〃一个/ 一种(an)〃和〃该(the)"预期包括复数形式。而且，就详述和/或权利要求书中使用术语〃包括(including) 〃、〃 包括(includes) 〃、〃 具有(having) 〃、〃 具有(has)"、〃带有(with) 〃或其变化形式来说，这些术语预期以类似于术语〃包含(comprising) 〃的方式被包括。术语〃约〃或〃大约〃是指在由本领域普通技术人员确定的特定数值的可接受误差范围内，其将部分地取决于如何测量或确定该数值，即，测量系统的限度。例如，按照本领域中的实践，〃约〃可表示在I个或多于I个标准差内。可选地，〃约〃可表示给定数值的达20%、优选地达10%、更优选地达5%、仍更优选地达1%的范围。可选地，尤其是有关生物系统或方法，术语可表示在数值的数量级内，优选地在5倍内，更优选地在2倍内。当在本申请和权利要求书中描述特定数值时，除非另外指明，否则应假设术语"约"表示在特定数值可接受的误差范围内。本文所用的术语〃mRNA〃是指靶基因的目前已知的mRNA转录物和可能说明的任何进一步的转录物。〃反义寡核苷酸〃或〃反义化合物〃是指结合另一 RNA或DNA (靶RNA、DNA)的RNA或DNA分子。例如，如果其是RNA寡核苷酸，其借助于RNA-RNA相互作用结合另一 RNA靶并且改变靶RNA的活性。反义寡核苷酸可上调或下调特定多核苷酸的表达和/或功能。该定义意为包括从治疗、诊断或其它观点来说有用的任何外来RNA或DNA分子。这种分子包括，例如，反义RNA或DNA分子、干扰RNA(RNAi)、微RNA、诱饵RNA分子、siRNA、酶促RNA、治疗性编辑RNA和激动剂与拮抗剂RNA、反义寡聚化合物、反义寡核苷酸、外部指导序列(EGS)寡核苷酸、可选剪接体、引物、探针以及与靶核酸的至少一部分杂交的其它寡聚化合物。因此，这些化合物可以单链、双链、部分单链或环状寡聚化合物的形式引入。在本发明的范畴中，术语"寡核苷酸"是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或其模拟物的寡聚物或聚合物。术语"寡核苷酸"还包括天然和/或修饰的单体或键合的线性或环状寡聚物，包括脱氧核糖核苷、核糖核苷、其取代形式和其α -异头形式、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、硫代磷酸酯、膦酸甲酯和类似物。寡核苷酸能够经由规则方式的单体与单体间的相互作用，例如Watson-Crick型碱基配对、Ho6gsteei或逆Hodgsteen型碱基配对或类似物特异性结合靶多核苷酸。寡核苷酸可以是〃嵌合的"，即，包括不同区域。在本发明的范畴中，"嵌合〃化合物是寡核苷酸，其包含两个或更多个化学区域，例如，DNA区域、RNA区域、PNA区域等等。每个化学区域由至少一个单体单位构成，在寡核苷酸化合物的情形中所述单体单位即为核苷酸。这些寡核苷酸通常包括至少一个区域，其中寡核苷酸经修饰以表现一种或多种期望特性。寡核苷酸的期望特性包括但不限于，例如，对核酸酶降解增加的耐受性、增加的细胞摄取和/或对靶核酸增加的结合亲和力。因此，寡核苷酸的不同区域可具有不同特性。如上所述，本发明的嵌合寡核苷酸可形成为两种或更多种寡核苷酸的混合结构、修饰的寡核苷酸、寡核苷和/或寡核苷酸类似物。寡核苷酸可由可被〃成行〃地连接(即当单体被连续地连接时，如在天然DNA中)的区域或经由间隔物连接的区域构成。预期间隔物构成区域之间的共价"桥"，在优选情形中具有不超过约100个碳原子的长度。间隔物可携带不同功能性，例如，具有正电荷或负电荷，携带特殊的核酸结合特性(嵌入剂、槽沟结合物、毒素、荧光团等等)，为亲脂性的，诱导特殊的二级结构，如例如，诱导α -螺旋的含丙氨酸的肽。本文所用的"NEU4"和〃唾液酸酶4〃包括所有家族成员、同种型、突变体、等位基因、片段、种类(species)、编码和非编码序列、有义和反义多核苷酸链等等。本文所用的词语LP5125、MGC102757、MGC18222、N-乙酰基-α -神经氨酸酶4和唾液酸酶-4被认为在文献中是相同的，且在本申请中可交换地使用。本文所用的术语〃对…有特异性的寡核苷酸〃或〃靶向…的寡核苷酸〃是指具有
(i)能够与靶基因的一部分形成稳定复合体，或(ii)能够与靶基因的mRNA转录物的一部分形成稳定双链体的序列的寡核苷酸。复合体和双链体的稳定性可通过理论计算和/或体外测定来确定。用于确定杂交复合体和双链体的稳定性的示例性测定在以下实施例中描述。本文所用的术语〃靶核酸〃涵盖DNA、从这种DNA转录的RNA (包括前体mRNA和mRNA)、还有从这种RNA衍生的cDNA、编码序列、非编码序列、有义或反义多核苷酸。寡聚化合物与其靶核酸的特异性杂交干扰核酸的正常功能。特异性地与靶核酸杂交的化合物对靶核酸功能的这一调节通常称为〃反义〃。待干扰的DNA功能包括，例如复制和转录。待干扰的RNA功能包括所有重要功能，例如，RNA向蛋白翻译位置的移位，从RNA翻译为蛋白，剪接RNA以产生一种或多种mRNA种类以及可能由RNA参与或促进的催化活性。这种干扰靶核酸功能的总效果是调节编码的产物或寡核苷酸的表达。RNA干扰"RNAi "由对其〃靶〃核酸序列具有序列特异性的同源性的双链RNA(dsRNA)分子介导。在本发明的某些实施方案中，介导物是5-25个核苷酸的〃小干扰"RNA双链体(siRNA)。siRNA来源于称为Dicer的RNA酶对dsRNA的加工。siRNA双链体产物被募集到称为RISC (RNA诱导沉默复合体)的多蛋白siRNA复合体中。不希望受任何特定理论束缚，认为随后RISC被引导至靶核酸(适当地为mRNA)，在那里siRNA双链体以序列特异性方式相互作用来以催化方式介导裂解。根据本发明可使用的小干扰RNA可根据本领域公知并且本领域普通技术人员熟悉的方案合成和使用。用于本发明方法的小干扰RNA适当地包括约I至约50个核苷酸(nt)。在非限制性实施方案的实例中，siRNA可包括约5至约40nt、约5至约30nt、约10至约30nt、约15至约25nt或约20-25个核苷酸。通过利用自动比对核酸序列并指明同一性或同源性的区域的计算机程序来便于选择适当的寡核苷酸。这种程序用来比较获得的核酸序列，例如通过搜寻数据库例如GenBank或通过对PCR产物测序。比较来自一系列物种的核酸序列允许选择在物种之间展示适当的同一性程度 的核酸序列。在未被测序的基因的情形中，进行DNA印迹以允许确定靶物种与其它物种的基因之间的同一性程度。如本领域所熟知的，通过以不同的严格性程度进行DNA印迹，可能获得近似的同一性测量。这些方案允许选择展现与待控制的受治疗者中的靶核酸序列的高程度互补性和与其它物种中的相应核酸序列的较低程度互补性的寡核苷酸。本领域技术人员将认识到，在选择用于本发明的基因的适当区域方面存在相当大的自由。〃 酶促 RNA"是指具有酶促活性的 RNA 分子(Cech, (1988) J.American.Med.Assoc.260，3030-3035)。酶促核酸(核酶)通过首先结合靶RNA来作用。这种结合经由被保持在邻近用于裂解靶RNA的分子的酶促部分处的酶促核酸的靶结合部分来进行。因此，酶促核酸首先识别靶RNA然后经由碱基配对结合靶RNA，结合到正确位置时，酶促地作用以切割靶RNA。〃诱饵RNA〃是指模拟配体的天然结合结构域的RNA分子。因此，诱饵RNA与天然结合靶竞争结合特定配体。例如，已经显示HIV反式激活响应(TAR)RNA的过表达可作为〃诱饵〃起作用并有效地结合HIV tat蛋白，从而阻止其结合HIV RNA中编码的TAR序列。这表示一个特定的实例。本领域技术人员将认识到，这仅是一个实例，利用本领域通常已知的技术可容易地产生其它实施方案。本文所用的术语〃单体〃通常是指由磷酸二酯键或其类似物连接以形成大小从数个单体单位例如约3-4个至约数百个单体单位范围的寡核苷酸的单体。磷酸二酯键合的类似物包括:硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、硒代磷酸酯、氨基磷酸酯和类似物，如以下更充分地描述。术语“核苷酸”涵盖天然存在的核苷酸以及非天然存在的核苷酸。本领域技术人员应清楚的是，此前被认为是"非天然存在的"各种核苷酸后来已在自然界中发现。因此，"核苷酸"不仅包括已知的含嘌呤和嘧啶杂环的分子，还包括其杂环类似物和互变异构体。其它类型的核苷酸的示例性实例是含腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黄嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-脱氮杂黄嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤、N4，N4-桥亚乙基胞嘧啶、邮，邮-桥亚乙基-2，6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-(C3-C6)_炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假异胞嘧啶、2-羟基-5-甲基-4-三唑并吡啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、肌苷的分子以及Benner等，美国专利N0.5，432，272中描述的〃非天然存在的〃核苷酸。术语"核苷酸"预期涵盖这些实例的每一种和所有以及其类似物和互变异构体。尤其关注的核苷酸是包含腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶的那些，它们被认为是与在人的治疗和诊断应用有关的天然存在的核苷酸。核苷酸包括天然2’ -脱氧糖和2’ -羟基糖，例如在 Kornberg 和 Baker, DNA Replication,第2版.(Freeman, San Francisco, 1992)中描述的，以及它们的类似物。提及核苷酸的"类似物"包括具有修饰的碱基部分和/或修饰的糖部分的合成的核苷酸(参见例如，通常描述于Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York, 1980 ；Freier&Altmann, (1997) Nucl.Acid.Res.，25 (22)，4429-4443, Toulme, J.J., (2001)Nature Biotechnologyl9:17-18 ；Manoharan M., (1999)Biochemica et BiophysicaActal489:117-139 ；Freier S.M., (1997)Nucleic Acid Research,25:4429-4443，Uhlman,E., (2000)Drug Discovery&Development,3:203-213, Herdewin P., (2000)Antisense&Nucleic Acid Drug Dev., 10:297-310) ;2’-0，3'-C-连接的[3.2.0] 二环阿拉伯糖核苷。这种类似物包括经设计以增强结合特性，例如，双链体或三链体稳定性、特异性或类似特性的合成的核苷酸。本文所用的〃杂交〃是指寡聚化合物的大致互补链的配对。配对的一种机制包括寡聚化合物的链的互补核苷或核苷酸碱基(核苷酸)之间的氢键合，其可以是Watson-Crick、Ho6gsteen或逆HoGgsteen氢键合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是经由氢键形成而配对的互补核苷酸。杂交可在不同情况下发生。当反义化合物与靶核酸的结合干扰靶核酸的正常功能以导致功能和/或活性的调节时，该化合物是"可特异性杂交的"，且在期望特异性结合的条件下(即，在体内测定或治疗性治疗的情形中的生理条件下和在体外测定的情形中进行测定的条件下)存在足够程度的互补性以避免反 义化合物与非靶核酸序列的非特异性结合。本文所用的短语"严格杂交条件"或"严格条件"是指本发明化合物将与其靶序列杂交，但与最小数目的其它序列杂交的条件。严格条件是序列依赖性的且在不同情况中将是不同的，并且在本发明范畴中，寡聚化合物与靶序列杂交的"严格条件"由寡聚化合物的性质和组成以及研究它们的测定决定。通常，严格杂交条件包括低浓度(〈0.15M)的带有无机阳离子例如Na+或K+的盐(即，低离子强度)、高于20°C _25°C低于寡聚化合物:靶序列复合体的Tm的温度、和存在变性剂例如甲酰胺、二甲基甲酰胺、二甲亚砜或去垢剂十二烷基硫酸钠(SDS)。例如，对于每种1%甲酰胺，杂交率降低1.1%。高严格杂交条件的实例是在60°C下0.1 X氯化钠-柠檬酸钠缓冲液(SSC) /0.l%(w/v) SDS进行30分钟。本文所用的〃互补〃是指一条或两条寡聚链上的两个核苷酸之间准确配对的能力。例如，如果在反义化合物某一位置的核碱基能够与在靶核酸某一位置的核碱基氢键结合，所述靶核酸为DNA、RNA或寡核苷酸分子，则认为寡核苷酸与靶核酸之间的氢键结合位置是互补位置。当每个分子的足够数目的互补位置由可彼此成氢键的核苷酸占据时，寡聚化合物和另外的DNA、RNA或寡核苷酸分子是彼此互补的。因此，〃可特异性杂交〃和〃互补"是用来表示经足够数目的核苷酸足够程度的准确配对或互补性，从而在寡聚化合物和靶核酸之间发生稳定和特异性结合的术语。
本领域应理解的是，寡聚化合物的序列不必与待可特异性杂交的其靶核酸的序列100%互补。而且，寡核苷酸可经一个或多个区段杂交，从而其间的或相邻区段不牵涉在杂交事件中(例如，环结构、错配或发夹结构)。本发明的寡聚化合物包括与其所靶向的靶核酸序列中靶区域具有至少约70%、或至少约75%、或至少约80%、或至少约85%、或至少约90%、或至少约95%、或至少约99%序列互补性。例如,其中反义化合物的20个核苷酸中的18个与靶区域互补从而将特异性杂交的反义化合物将表示90%互补性。在这一实例中，其余非互补核苷酸可成串或散布于互补核苷酸，不必彼此连续或与互补核苷酸连续。因此，具有侧翼为与靶核酸具有完全互补性的两个区域的4 (四)个非互补核苷酸的长度为18个核苷酸的反义化合物将与靶核酸具有77.8%总互补性，因此属于本发明的范围中。反义化合物与靶核酸的区域的互补性百分比可常规地利用本领域已知的BLAST程序(基本局部比对搜索工具)和PowerBLAST程序来确定。同源性、序列同一性或互补性的百分比可通过例如使用Smith 和 Waterman 的算法(Adv.Appl.Math., (1981)2，482-489)的 Gap 程序(Wisconsin序列分析软件包，用于 Unix 的版本 8，Genetics Computer Group, University ResearchPark, Madison ffis.)确定，并使用默认设置。本文所用的术语"热熔点(Tm)"是指在指定的离子强度、pH和核酸浓度下，与靶序列互补的寡核苷酸的50%平衡地与靶序列杂交的温度。通常，严格条件将是其中盐浓度为至少约0.01至1.0M Na离子浓度(或其它盐)、ρΗ7.0至8.3，且对于短寡核苷酸(例如，10至50个核苷酸)温度为至少约30°C的条件。严格条件还可通过加入去稳定剂例如甲酰胺来实现。本文所用的〃调节〃是 指基因表达的增加(刺激)或减少(抑制)。术语〃变体〃当在多核苷酸序列的上下文中使用时，可涵盖与野生型基因相关的多核苷酸序列。这一定义还可包括，例如，〃等位〃、〃剪接〃、〃物种〃或〃多态〃变体。剪接变体可与参考分子具有显著的同一性，但由于在mRNA加工期间外显子的可选剪接通常将具有更大数目或更小数目的多核苷酸。相应的多肽可具有另外的功能结构域或缺少结构域。物种变体是在物种之间不同的多核苷酸序列。本发明中特别有用的是野生型基因产物的变体。变体可来源于核酸序列中至少一种突变，并可产生改变的mRNA或产生结构或功能可能改变或可能不改变的多肽。任何给定的天然或重组基因可具有O种、一种或多种等位基因形式。产生变体的常见突变改变通常归因于核苷酸的天然缺失、添加或取代。在给定序列中，这些类型改变的每一种可单独发生，或组合其它类型改变发生一次或多次。所得的多肽通常将具有相对于彼此显著的氨基酸同一性。多态变体是给定物种的个体之间特定基因的多核苷酸序列的变化。多态变体还可涵盖"单核苷酸多态性"(SNP)或其中多核苷酸序列差异为一个碱基的单碱基突变。SNP的存在可指示，例如，具有疾病状态的倾向的某一群体，所述倾向相比于耐受性为易感性。衍生的多核苷酸包括经受化学修饰(例如以烷基、酰基或氨基代替氢)的核酸。衍生物例如，衍生物寡核苷酸，可包括非天然存在的部分，例如改变的糖部分或糖间键合。其中示例的有硫代磷酸酯和本领域已知的其它含硫物质。衍生的核酸还可包含标记，包括放射性核苷酸、酶、荧光剂、化学发光剂、显色剂、底物、辅因子、抑制剂、磁性粒子和类似物。〃衍生物〃多肽或肽是例如通过糖基化、聚乙二醇化、磷酸化、硫酸化、还原/烷基化、酰化、化学偶合或适度福尔马林处理修饰的多肽或肽。还可修饰衍生物以直接或间接包含可检测的标记，包括但不限于，放射性同位素、荧光和酶标记。本文所用的术语〃动物〃或〃患者〃意为包括，例如人、绵羊、麋鹿、鹿、长耳鹿、貂、哺乳动物、猴、马、牛、猪、山羊、犬、猫、大鼠、小鼠、鸟类、鸡、爬行动物、鱼、昆虫和蛛形纲动物。〃哺乳动物〃涵盖通常处于医疗护理下的温血哺乳动物(例如，人和驯养的动物)。实例包括猫科动物、犬科动物、马科动物、牛科动物和人，以及仅仅人。
〃治疗(Treating) 〃或〃治疗(treatment) 〃涵盖治疗哺乳动物的疾病状态,并包括:(a)防止疾病状态在哺乳动物中发生，尤其是当所述哺乳动物倾向于疾病状态但还未被诊断为患有其的时候；(b)抑制疾病状态，例如阻止其发展；和/或(C)缓解疾病状态，例如导致疾病状态消退，直到达到期望端点。治疗还包括疾病症状的改善(例如，减轻疼痛或不适)，其中所述改善可或不可直接影响疾病(例如起因、传染、表达等等)。本文所用的〃癌症〃是指在哺乳动物中发现的所有类型的癌症或赘生物或恶性肿瘤，包括但不限于:白血病、淋巴瘤、黑素瘤、癌和肉瘤。癌症本身表现为〃肿瘤〃或包括癌症恶性细胞的组织。肿瘤的实例包括肉瘤和癌，例如但不限于:纤维肉瘤、粘液肉瘤、月旨肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮源性癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。可用根据本发明公开的组合物治疗的其它癌症包括但不限于，例如霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、小细胞肺肿瘤、原发性脑瘤、胃癌(stomach cancer)、结肠癌、恶性胰岛肿瘤、恶性类癌瘤、膀胱癌、胃癌(gastric cancer)、恶变前皮肤损伤、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食管癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、宫颈癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌和前列腺癌。本文所用的〃神经病学疾病或病症〃是指神经系统和/或视觉系统的任何疾病或病症。〃神经病学疾病或病症〃包括牵涉中枢神经系统(脑、脑干和小脑)、外周神经系统(包括颅神经)和自主神经系统(其部分位于中枢神经系统和外周神经系统两者中)的疾病或病症。神经病学病症包括但不限于，获得性癫痫样失语症；急性播散性脑脊髓炎；脑白质肾上腺萎缩症；年龄相关的黄斑变性；胼胝体发育不全；失认症；艾卡迪综合征；亚力山大病；阿尔佩斯病；交替性偏瘫；阿尔茨海默氏病；血管性痴呆；肌萎缩性侧索硬化；无脑；Angelman综合征；血管瘤病；缺氧症；失语症；失用症；蛛网膜囊肿；蛛网膜炎；阿-基氏脑畸形；动静脉畸形；阿斯佩各综合征；共济失调毛细血管扩张；注意力缺乏过动症；孤独症；自主神经失调；背痛；巴藤病；白塞病；贝耳麻痹；良性自发性睑痉挛；良性局灶性肌萎缩；良性卢页内高压；宾斯旺格氏病；睑疫挛；Bloch Sulzberger综合征；臂丛损伤；脑脓肿；脑损伤；脑肿瘤(包括多形性胶质母细胞瘤)；脊髓肿瘤；布朗-塞卡尔综合征；卡纳万病；腕管综合症；灼痛；中枢性疼痛综合症；脑桥中部髓鞘溶解；头部障碍；脑动脉瘤；脑动脉硬化；脑萎缩；大脑性巨人症；大脑性麻痹；夏-马-图三氏病；化疗引起的神经病和神经性疼痛；基氏脑畸形；舞蹈症；慢性炎症性脱髓鞘多神经病；慢性痛；慢性局部疼痛综合征；科-勒二氏综合征；昏迷，包括持续性植物人状态；先天性面瘫；皮质基底节变性；颅动脉炎；颅缝早闭；克雅氏病；积累性损伤错乱；柯兴综合征；巨细胞包涵体病；巨细胞病毒感染；眼舞蹈-足舞蹈综合征；丹-沃二氏综合征；DaWSon病；德摩西埃氏综合征；下臂丛麻痹；痴呆；皮肌炎；糖尿病性神经病；弥漫性硬化症；家族性自主神经异常；书写困难；阅读困难；张力障碍；早期幼儿癫痫性脑病；空蝶鞍综合征；脑炎；脑膨出；脑三叉神经血管瘤病；癫痫；欧勃氏麻痹；特发性震颤；法布里氏病；法尔氏综合征；昏厥；家族性痉挛麻痹症；热性癫痫发作；菲希尔综合征；弗里德赖希氏共济失调；额颞痴呆和其它"tau病变〃；高歇病；格斯特曼氏综合征；巨细胞性动脉炎；巨细胞性包涵体病；球样细胞脑白质营养不良；格_巴二氏综合征；HTLV-1相关的骨髓病；哈-斯二氏病；头部损伤；头痛；半面痉挛；遗传性痉挛性截瘫；多神经炎型遗传性共济失调；耳部带状疱疹；带状疱疹；Hirayama综合征；HIV相关的痴呆和神经病(也是AIDS的神经病学表现)；前脑无裂畸形；亨延顿氏舞蹈病和其它多谷氨酰胺重复序列病；积水性无脑畸形；脑积水；皮质醇过多症；低氧；免疫介导的脑脊髓炎；包涵体肌炎；色素失调症；婴儿植烷酸贮积病；婴儿雷夫叙姆病；婴儿疫挛；炎性肌病；卢页内囊肿；卢页内高压Joubert综合征；卡恩斯-塞尔综合征；Kennedy病；金斯布林纳综合征；克-费二氏综合征；克拉贝病；库-韦二氏病；库鲁病；拉福拉病；Lambert-Eaton肌无力综合征；Landau_Kleffner综合征；侧髓(瓦伦伯格氏)综合征；学习障碍；利氏病；Lennox-Gustaut综合征；莱_萘二氏综合征；脑白质病变；路易体痴呆；无脑回症；闭锁综合征；Lou Gehrig病(即，运动神经元病或肌萎缩性侧索硬化)；椎间盘退变；莱姆病-神经病学后遗症；Machado-Jos印h病；巨头；巨脑；梅_罗二氏综合征；美尼尔症；脑膜炎；门克斯病；异染性脑白质营养不良；头小畸形；偏头痛;Miller Fisher综合征；小中风；线粒体肌病；默比厄斯氏综合征；单肢肌萎缩；运动神经元病；Moyamoya病；粘多糖贮积症；多发梗塞性痴呆；多灶性运动神经病；多发性硬化和其它脱髓鞘病症；伴有体位性低血压的多系统萎缩症；肌肉萎缩症；重症肌无力；脑脱髓鞘弥散性硬化；婴儿肌阵挛性脑病；肌阵挛；肌病；先天性肌强直；嗜睡病；神经纤维瘤病；抗精神病药的恶性综合征；AIDS的神经病学表现；狼疮的神经病学后遗症；神经性肌强直；神经元蜡样脂褐质沉积症；神经元移行异常；尼-皮二氏病；0’ Sullivan-McLeod综合征；枕神经痛；隐性脊柱神经管闭合不全序列征；大田原综合征；橄榄体脑桥小脑萎缩；眼阵挛-肌阵挛；视神经炎；直立性低血压；过度使用综合征；感觉异常；神经变性疾病或病症(帕金森病、亨延顿氏舞蹈病、阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、痴呆、多发性硬化和与神经元细胞死亡相关的其它疾病和病症)；先天性肌强直病；副肿瘤性疾病；突发性癫痫；帕_罗二氏综合征；佩-梅氏病；周期性麻痹；外周神经病；痛性神经病和神经性疼痛；持续性植物人状态；全身性发育迟缓；光喷嚏反射；植烷酸贮积病；皮克氏病；神经挟捏；垂体肿瘤；多肌炎；孔洞脑；小儿麻痹症后期综合症；带状疱疹后神经痛；感染后脑脊髓炎；体位性低血压；帕-魏二氏综合征；原发性脊髓侧索硬化；朊病毒病；进行性面偏侧萎缩症；进行性多灶性白质脑病；进行性硬化性灰质萎缩；进行性核上性麻痹；假性脑瘤；Ramsay-Hunt综合征(I型和II型)；
Rasmussen脑炎；反射性交感神经营养不良综合征；雷夫叙姆病；重复性运动损伤；重复性压力损伤；多动腿综合征；逆转录病毒相关的脊髓病；Rett综合征；雷依氏综合征；圣维特斯舞蹈病；桑德霍夫病；谢耳德氏病；脑裂；视隔发育不全；摇晃婴儿综合症；带状疱疹；希-德二氏综合征；斯耶格伦氏综合征；睡眠窒息；Soto综合征；僵直；脊柱裂；脊髓损伤；脊髓肿瘤；脊髓性肌萎缩；僵人综合征；中风；斯特奇-韦伯综合征；亚急性硬化全脑炎 ’动脉硬化性皮层下脑病；西德纳姆舞蹈；晕厥；脊髓空洞症；迟发性运动障碍；泰-萨二氏病；颞动脉炎；脊髓拴系综合征；肌强直性白内障；胸部出口综合征；三叉神经痛；托德氏麻痹；图雷特综合症；暂时性缺血性发作；传染性海绵状脑病；横贯性脊髓炎；外伤性脑损伤；震颤；三叉神经痛；热带痉挛性轻截瘫；结节性脑硬化；血管性痴呆(多发梗塞性痴呆)；血管炎(包括颞动脉炎)；希-林二氏病；瓦伦伯格氏综合征；韦-霍二氏病；韦斯特综合征；鞭抽式损伤(whiplash);威廉斯综合征；Wildon病和泽韦格综合征。“增殖性疾病或病症”包括但不限于造血赘生性病症，其牵涉由髓细胞系、淋巴细胞系/红细胞系或其前驱细胞产生的造血源的增生性细胞/赘生性细胞。这些包括但不限于成红细胞性白血病、急性早幼粒细胞白血病(APML)、慢性骨髓性白血病(CML)、淋巴细胞恶性肿瘤(包括但不限于急性成淋巴细胞性白血病(ALL)，其包括B系ALL和T系ALL ;慢性淋巴细胞性白血病(CLL);幼淋巴细胞性白血病(PLL)、毛细胞性白血病(HLL)和瓦氏巨球蛋白血症(WM)。恶性淋巴瘤的其它形式包括但不限于非霍奇金淋巴瘤及其变体、周围T细胞淋巴瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)、皮肤T-细胞淋巴瘤(CTCL)、大颗粒性淋巴细胞性白血病(LGF)、霍奇金病和李特-斯顿伯格病。〃炎症〃是指系统性炎症疾患和局部地伴有单核细胞、粒细胞和/或中性白细胞的迁移和吸引的疾患。炎症的实例包括但不限于，病原生物体(包括革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、病毒、真菌和寄生虫例如原生动物和蠕虫)感染引起的炎症、移植排斥(包括排斥实体器官例如肾脏、肝脏、心脏、肺或角膜以及排斥骨髓移植物，包括移植物抗宿主病(GVHD))，或局部的慢性或急性自身免疫或变应性反应引起的炎症。自身免疫疾病包括急性肾小球性肾炎；类风湿性关节炎或反应性关节炎；慢性肾小球性肾炎；炎性肠病例如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎和坏死性小肠结肠炎；粒细胞输血相关的综合征；炎症性皮肤病例如接触性皮炎、特应性皮炎、银屑病；全身性红斑狼疮(SLE)、自身免疫性甲状腺炎、多发性硬化，和一些形式的糖尿病，或其中受治疗者自身免疫系统的攻击导致病理学组织破坏的任何其它自身免疫状态。变应性反应包括变应性哮喘、慢性支气管炎、急性和延迟的过敏症。系统性炎症疾病状态包括外伤、烧伤、缺血事件后再灌注(例如，心脏、脑、肠或外周脉管系统中的血栓形成事件，包括心肌梗塞和中风)相关的炎症、败血症、ARDS或多器官功能障碍综合征。炎性细胞募集也发生在动脉粥样硬化斑块中。炎症包括但不限于，非霍奇金淋巴瘤、韦格纳氏肉芽肿、桥本氏甲状腺炎、肝细胞癌、胸腺萎缩、慢性胰腺炎、类风湿性关节炎、反应性淋巴样增生、骨关节炎、溃疡性结肠炎、乳头状癌、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、急性胆囊炎、慢性胆囊炎、肝硬化、慢性涎腺炎、腹膜炎、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、慢性胃炎、内在性子宫内膜异位症、子宫内膜异位症、急性宫颈炎、慢性宫颈炎、淋巴样增生、多发性硬化、特发性血小板减少性紫癜继发性的肥大、原发性IgA肾病、全身性红斑狼疮、银屑病、肺气肿、慢性肾盂肾炎和慢性膀胱炎。多核苷酸和寡核苷酸组合物和分子靶:在一个实施方案中，靶包括唾液酸酶4 (NEU4)及其同种型的核酸序列，包括但不限于NEU4相关的有义和/或反义的非编码和/或编码序列。唾液酸酶是一种存在于活体内的水 解糖类的酶，其消除糖蛋白或糖脂的糖链的非还原性末端的唾液酸残基。已知，当唾液酸从糖链分子移除时，不仅这些分子的降解开始，而且分子构象以及很多重要的细胞功能例如被受体识别的机理、细胞粘着和免疫机理可以发生变化。同时已变得明显的是:唾液酸酶显示与细胞的增殖和癌化相关的快速活性变化，并且其与癌细胞的代谢能力有关。然而，对如何在体内消除唾液酸的知识了解很少。这是因为对哺乳动物唾液酸酶在分子水平上的研究是落后的，并且因此关于其结构和表达机理存在很多未知的方面。因为哺乳动物唾液酸酶仅显示低活性，并且极其不稳定，所以酶的分离和纯化变得很困难。唾液酸酶长期以来往往被认为是一种仅仅牵涉异化和降解的溶酶体酶。在这种情形下，我们通过主要将大鼠组织用作酶源来分离并纯化酶，并且发现，存在与自然状态的细菌、病毒、原生动物等的唾液酸酶不同的四种类型的唾液酸酶。这些酶各自分别定位于细胞内的溶酶体基质、溶酶体膜、质膜(细胞表面膜)和细胞质，并且它们不仅在酶学特征例如底物特异性方面彼此不同，而且在免疫学性质方面彼此不同。在那些唾液酸酶中，定位于细胞质的唾液酸酶可作为来自大鼠骨骼肌的同源纯化产物获得。其cDNA克隆作为动物唾液酸酶首次在世界中取得成功，并且其一级结构已被测定。同时已进行其基因组结构分析，以及关于其功能，已阐明酶通过将cDNA用作探针而参与骨骼肌细胞的分化和生长。这些研究可被认为是世界范围唾液酸酶研究中的开拓性研究工作的一部分。通过先前研究，已变得明显的是:定位于质膜的唾液酸酶在细胞的增殖和癌化之后可能显示活性提高，并且其与神经细胞分化和细胞信号转导深切相关。然而，迄今为止，关于该酶的结构、引起活性变化的机理等根本仍未被理解。为了答复这些问题，本领域很多研究人员长久以来所想得到的是其cDNA的克隆。例如，如果可能阐明由于该酶导致的癌性变化的机理，那么在诊断和 治疗癌症中利用该结果是可能的。此外，因为神经节苷脂存在于很多细胞的表面膜中并且参与重要细胞功能例如细胞粘着和信息交流，以及它们同时为主要的大脑组分，所以估计利用它们作为特异性底物的唾液酸酶与某些重要的脑神经功能有关。在实施方案中，反义寡核苷酸用来预防或治疗NEU4家族成员相关的疾病或病症。可用本发明的反义寡核苷酸和/或用从利用反义化合物获得的和/或具有反义化合物的干细胞再生的细胞/组织治疗的示例性唾液酸酶4 (NEU4)介导的疾病和病症包括:与唾液酸酶的异常功能和/或表达相关的疾病或病症、癌症、增殖性疾病或病症、细胞凋亡、与细胞凋亡调节受损相关的疾病或病症、糖尿病、心血管疾病或病症、Tay Sachs病、溶酶体贮积症、炎性疾病或病症(例如炎性肠病，包括克罗恩病、溃疡性结肠炎；银屑病；关节炎等)、炎症；代谢疾病或病症、代谢综合征、胰岛素抵抗综合征、糖尿病、高血脂症、脂肪肝疾病、恶病质、肥胖症、动脉粥样硬化症、动脉硬化症、与胆固醇代谢改变相关的疾病病症或疾患、血压升高、神经病学疾病或病症；与神经元细胞分化受损相关的疾病或病症；与神经突形成受损相关的疾病或病症；与糖蛋白脱唾液酸化受损相关的疾病或病症和感染(例如病毒感染、全身性感染等)。在实施方案中，将一种或多种反义寡核苷酸对NEU4调节向需要其的患者施用以预防或治疗与正常对照相比的NEU4异常表达、功能、活性相关的任何疾病或病症。在实施方案中，寡核苷酸是对NEU4多核苷酸有特异性,该多核苷酸包括但不限于非编码区。NEU4靶包括NEU4的变体；NEU4的突变体，包括SNP ；NEU4的非编码序列；等位基因、片段和类似物。优选地寡核苷酸是反义RNA分子。根据本发明的实施方案,祀核酸分子不限于仅NEU4多核苷酸,还延伸到NEU4的任何同种型、受体、同系物、非编码区和类似物。在实施方案中，寡核苷酸靶向NEU4靶的天然反义序列(与编码区和非编码区天然反义)，包括但不限于，其变体、等位基因、同系物、突变体、衍生物、片段及其互补序列。优选地寡核苷酸是反义RNA或DNA分子。在实施方案中，本发明的寡聚化合物还包括变体，其中在化合物中一个或多个核苷酸位置存在不同碱基。例如，如果第一个核苷酸是腺嘌呤，可产生在这一位置包含胸苷、鸟苷、胞苷或其它天然或非天然核苷酸的变体。这可在反义化合物的任何位置进行。随后利用本文所述的方法测定这些化合物以确定它们抑制靶核酸表达的能力。在一些实施方案中，反义化合物与靶之间的同源性、序列同一性或互补性是从约50%至约60%。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性是从约60%至约70%。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性是从约70%至约80%。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性是从约80%至约90%。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性是约90%、约92%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100%。当反义化合物与靶核酸的结合干扰靶核酸的正常功能以导致活性的丧失时，该化合物是可特异性杂交的，且在期望特异性结合的条件下存在足够程度的互补性以避免反义化合物与非靶核酸序列的非特异性结合。这种条件包括，即，在体内测定或治疗性治疗的情形中的生理条件以及在体外测定的情形中进行测定的条件。当反义化合物(无论是DNA、RNA、嵌合、取代的等等)与靶DNA或RNA分子的结合干扰靶DNA或RNA的正常功能以导致效用的丧失时，该化合物是可特异性杂交的，且在期望特异性结合的条件下(即，在体内测定或治疗性治疗的情形中的生理条件下以及在体外测定的情形中进行测定 的条件下)存在足够程度的互补性以避免反义化合物与非靶序列的非特异性结合。在实施方案中，NEU4的靶向包括但不限于，利用例如PCR、杂交等鉴定和扩展的反义序列、一种或多种如SEQ ID N0:2至7所列的序列和调节NEU4表达或功能的类似物。在一个实施方案中，与对照相比表达或功能被上调。在实施方案中，与对照相比表达或功能被下调。在实施方案中，寡核苷酸包括如SEQ ID N0:8至11所列的核酸序列，包括利用例如PCR、杂交等鉴定和扩展的反义序列。这些寡核苷酸可包括一种或多种修饰的核苷酸、更短或更长的片段、修饰的键和类似物。修饰的键或核苷酸间键合的实例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或类似物。在实施方案中，核苷酸包括磷衍生物。可附加于本发明的修饰的寡核苷酸中的糖或糖类似物部分的磷衍生物(或修饰的磷酸酯基团)可以是单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、磷酸烷基酯、磷酸烷烃酯、硫代磷酸酯和类似物。上述磷酸酯类似物的制备和将其向核苷酸、修饰的核苷酸和寡核苷酸的并入本身是已知的，不必在此描述。反义的特异性和灵敏性还由本领域技术人员利用以用于治疗用途。反义寡核苷酸已在动物和人的疾病状态的治疗中用作治疗部分。反义寡核苷酸已经安全且有效地施用于人，目前正在进行许多临床试验。因此已经确定，寡核苷酸可以是有用的治疗形态，可被配置以用于治疗细胞、组织和动物(尤其是人)的治疗方案。
在本发明的实施方案中，寡聚反义化合物，尤其是寡核苷酸，结合靶核酸分子并调节靶基因编码的分子的表达和/或功能。待干扰的DNA的功能包括，例如复制和转录。待干扰的RNA功能包括所有重要功能，例如RNA向蛋白翻译位置的移位，从RNA翻译为蛋白，剪接RNA以产生一种或多种mRNA种类以及可由RNA参与或促进的催化活性。取决于期望的功能，功能可被上调或抑制。反义化合物包括反义寡聚化合物、反义寡核苷酸、外部指导序列(EGS)寡核苷酸、可选剪接体、引物、探针以及与靶核酸的至少一部分杂交的其它寡聚化合物。因此，这些化合物可以单链、双链、部分单链或环状寡聚化合物的形式引入。在本发明范畴中，将反义化合物靶向特定核酸分子可以是多步骤的过程。该过程通常开始于鉴定待调节其功能的靶核酸。这一靶核酸可以是，例如，其表达与特定病症或疾病状态相关的细胞基因(或从基因转录的mRNA)或来自感染物的核酸分子。在本发明中，靶核酸编码唾液酸酶4 (NEU4)。靶向过程通常还包括确定靶核酸中发生反义相互作用从而产生期望作用例如调节表达的至少一个靶区域、区段或位置。在本发明范畴中，术语〃区域〃定义为具有至少一种可鉴定结构、功能或特征的靶核酸的一部分。靶核酸区域中是区段。"区段"定义为靶核酸中较小区域或区域的亚部分。本发明中使用的"位置"定义为靶核酸中的位置。在实施方案中，反义寡核苷酸结合唾液酸酶4(NEU4)的天然反义序列并调节NEU4(SEQ ID NO:1)的表达和/或功能。反义序列的实例包括SEQ ID N0:2至11。在实施方案中，反义寡核苷酸结合唾液酸酶4 (NEU4)多核苷酸的一个或多个区并调节NEU4的表达和/或功能 。区段包括NEU4的有义或反义多核苷酸的至少五个连续核苷酸。在实施方案中，反义寡核苷酸是对NEU4的天然反义序列有特异性，其中寡核苷酸对NEU4的天然反义序列的结合调节NEU4的表达和/或功能。在实施方案中，寡核苷酸化合物包括如SEQ ID N0:8至11所列的序列、利用例如PCR、杂交等鉴定和扩展的反义序列。这些寡核苷酸可包括一种或多种修饰的核苷酸、更短或更长的片段、修饰的键和类似物。修饰的键或核苷酸间键合的实例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或类似物。在实施方案中，核苷酸包括磷衍生物。可附加于本发明的修饰的寡核苷酸中的糖或糖类似物部分的磷衍生物(或修饰的磷酸酯基团)可以是单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、磷酸烷基酯、磷酸烷烃酯、硫代磷酸酯和类似物。上述磷酸酯类似物的制备和将其向核苷酸、修饰的核苷酸和寡核苷酸的并入本身是已知的，不必在此描述。如本领域已知的，因为翻译起始密码子通常是5’ -AUG(在转录的mRNA分子中；在相应DNA分子中是5’ -ATG)，翻译起始密码子也称为"AUG密码子〃、〃起始密码子〃或"AUG起始密码子"。少数基因具有具有RNA序列5’ -GUG、5’ -UUG或5’ -CUG的翻译起始密码子；且5’ -AUA、5’ -ACG和5’ -CUG已显示在体内起作用。因此，术语〃翻译起始密码子〃和〃起始密码子"可涵盖许多密码子序列，尽管每种情形中的起始氨基酸通常是甲硫氨酸(真核细胞中)或甲酰甲硫氨酸(原核细胞中)。真核基因和原核基因可具有两个或更多个替代性起始密码子，其中的任何一个可在特定细胞类型或组织中或在特定条件设置下优先地用于翻译起始。在本发明范畴中，"起始密码子"和"翻译起始密码子"是指体内用于起始从编码唾液酸酶4 (NEU4)的基因转录的mRNA的翻译的一种或多种密码子，而不论这种密码子的序列。基因的翻译终止密码子(或〃终止密码子〃)可具有三种序列即5’ -UAA、5’ -UAG和5’ -UGA之一(相应的DNA序列分别是5’ _TAA、5’ -TAG和5’ -TGA)。术语〃起始密码子区〃和〃翻译起始密码子区〃是指这种mRNA或基因的一部分，涵盖以任一方向(即，5’或3’)从翻译起始密码子的约25至约50个连续核苷酸。类似地，术语〃终止密码子区〃和〃翻译终止密码子区〃是指这种mRNA或基因的一部分，涵盖以任一方向(即，5’或3’)从翻译终止密码子的约25至约50个连续核苷酸。因此，〃起始密码子区〃(或"翻译起始密码子区〃)和"终止密码子区〃(或"翻译终止密码子区〃)都是可用本发明的反义化合物有效地靶向的区域。本领域已知开放读码框(ORF)或〃编码区〃是指翻译起始密码子与翻译终止密码子之间的区域，也是可被有效地靶向的区域。在本发明范畴中，靶向的区域是涵盖基因开放读码框(ORF)的翻译起始或终止密码子的基因内区域。另一靶区域包括5’非翻译区(5’ UTR)，本领域已知是指mRNA以5’方向从翻译起始密码子的部分，因此包括mRNA的5’帽位置与翻译起始密码子之间的核苷酸(或基因上相应的核苷酸)。又一靶区域包括3’非翻译区(3’UTR)，本领域已知是指mRNA以3’方向从翻译终止密码子的部分，因此包括mRNA的翻译终止密码子与3’端之间的核苷酸(或基因上相应的核苷酸)。mRNA的5’帽位置包括经由5’-5’三磷酸酯键合与mRNA的最5’残基连接的N7-甲基化鸟苷残基。认为mRNA的5’帽区域包括5’帽结构本身以及与帽位置相邻的前50个核苷酸。本发明的另一靶区域是5’帽区域。尽管一些真核mRNA转录物被直接翻译，但是许多包含一个或多个称为〃内含子〃的区域，在翻译前从转录物切除。其余(因此被翻译的)区域称为"外显子"，被剪接在一起以形成连续的mRNA序列。在一个实施方案中，靶向剪接位置，即，内含子-外显子结点或外显子-内含子结点在其中疾病中牵涉异常剪接的情形或其中疾病中牵涉特定剪接产物的过度产生的情形尤其有用。由于重排或缺失的异常融合结点是靶位置的另一形式。由剪接来自不同基因来源的两个(或更多个)mRNA的过程产生的mRNA转录物称为"融合转录物"。利用靶向例如DNA 或前体mRNA的反义化合物可有效地靶向内含子。在实施方案中，反义寡核苷酸结合靶多核苷酸的编码区和/或非编码区并调节靶分子的表达和/或功能。在实施方案中，反义寡核苷酸结合天然反义多核苷酸并调节靶分子的表达和/或功能。在实施方案中，反义寡核苷酸结合有义多核苷酸并调节靶分子的表达和/或功倉泛。可从DNA的相同基因组区域产生可选RNA转录物。这些可选转录物通常称为〃变体〃。更具体地，〃前体mRNA变体〃是从相同基因组DNA产生的转录物，在其起始或终止位置与从相同基因组DNA产生的其它转录物不同，并包含内含子序列和外显子序列两者。在剪接期间切除一个或多个外显子或内含子区域或其部分后，前体mRNA变体产生更小的"mRNA变体〃。因此，mRNA变体是加工的前体mRNA变体，且每个独特的前体mRNA变体必定因为剪接而产生独特的mRNA变体。这些mRNA变体还称为〃可选剪接变体〃。如果不进行前体mRNA变体的剪接，则前体mRNA变体与mRNA变体相同。变体可经由使用可选信号产生以起始或终止转录。前体mRNA和mRNA可具有多于一个起始密码子或终止密码子。来源于使用可选起始密码子的前体mRNA或mRNA的变体称为该前体mRNA或mRNA的"可选起始变体"。使用可选终止密码子的那些转录物称为该前体mRNA或mRNA的〃可选终止变体"。一种特定类型的可选终止变体是〃聚腺苷酸变体"，其中产生的多个转录物由"聚腺苷酸终止信号"之一被转录机制可选选择所致，从而产生在独特聚腺苷酸位点终止的转录物。在本发明范畴中，本文所述的变体类型也是靶核酸的实施方案。靶核酸上与反义化合物杂交的位置定义为活性反义化合物靶向的靶区域的至少5-核苷酸长的部分。尽管本文列出了某些示例性靶区段的具体序列，但是本领域技术人员将理解这些用于阐释和描述于本发明范围中的具体实施方案。本领域普通技术人员考虑到本公开内容可容易地鉴定另外的靶区段。认为包括选自示例性优选的靶区段中的至少五(5)个连续核苷酸的段的长度为5-100个核苷酸的靶区段也适合于靶向。靶区段可包括包括从示例性优选的靶区段之一的5’ -末端的至少5个连续核苷酸的DNA或RNA序列(其余核苷酸为从靶区段5’ -末端的紧邻上游开始的相同DNA或RNA的连续段并延伸直到DNA或RNA包含约5至约100个核苷酸)。类似地优选的靶区段由包括从示例性优选的靶区段之一的3’ -末端的至少5个连续核苷酸的DNA或RNA序列代表(其余核苷酸为从靶区段3’ -末端的紧邻下游开始的相同DNA或RNA的连续段并延伸直到DNA或RNA包含约5至约100个核苷酸)。借助本文所示例的靶区段的本领域技术人员将能够鉴定另外的优选的靶区段而不需过度试验。已经鉴定出一种或多种靶区域、区段或位置后，选择与靶足够地互补，S卩，充分良好并以足够特异性杂交的反义化合物以获得期望作用。在本发明的实施方 案中，寡核苷酸结合特定靶的反义链。寡核苷酸长度为至少5个核苷酸并可合成以使每个寡核苷酸靶向重叠序列，从而寡核苷酸被合成以覆盖靶多核苷酸的整个长度。靶还包括编码区以及非编码区。在一个实施方案中，将反义寡核苷酸靶向特定核酸是优选的。将反义化合物靶向特定核酸是多步骤的过程。该过程通常开始于鉴定待调节其功能的核酸序列。这一核酸序列可以是，例如，其表达与特定病症或疾病状态相关的细胞基因(或从基因转录的mRNA)、或非编码多核苷酸，例如非编码RNA(ncRNA)。RNA可分为⑴信使RNA (mRNA)，其被翻译为蛋白，和⑵非蛋白编码RNA (ncRNA)。ncRNA包括微RNA、反义转录物和包含高密度终止密码子和缺少任何广泛的〃开放读码框〃的其它转录单位(TU)。许多ncRNA表现为从蛋白-编码基因座的3’非翻译区(3’UTR)中的起始位点开始。ncRNA通常是罕见的，已被FANTOM财团测序的ncRNA的至少一半似乎不是多腺苷酸化的。出于明显的原因，大多数研究者集中于被加工并输出到细胞质的多腺苷酸化mRNA。最近，显示非多腺苷酸化的核RNA的组可能是非常大的，且许多这样的转录物来源于所谓的基因间区。ncRNA可调节基因表达的机制是通过与靶转录物的碱基配对。通过碱基配对起作用的RNA可分为(I)顺式编码的RNA，其在它们所作用的RNA的相同遗传位置但在相对链上被编码，因此与其靶展示极佳的互补性，和(2)反式编码的RNA，其在不同于它们所作用的RNA的染色体位置被编码，通常不与其靶展示极佳的碱基-配对可能。
不希望受限于理论，反义多核苷酸被本文所述的反义寡核苷酸的扰动可改变相应有义信使RNA的表达。然而，这一调节可以是不一致的(反义敲低导致信使RNA升高)或一致的(反义敲低导致相伴的信使RNA减少)。在这些情形中，反义寡核苷酸可靶向于反义转录物的重叠或非重叠部分，导致其敲低或隔离。编码以及非编码反义可以相同方式靶向，任一种类能够调节相应的有义转录物-以一致的或不一致的方式。鉴定针对靶使用的新寡核苷酸中采用的策略可基于反义RNA转录物被反义寡核苷酸的敲低或调节期望靶的任何其它手段。策略1:在不一致调节的情形下，敲低反义转录物升高常规(有义)基因的表达。如果后者基因编码已知或推测的药物靶，则其反义对应物的敲低能够可设想地模拟受体激动剂或酶刺激剂的作用。策略2:在一致调节的情形下，人们可以协同地敲低反义转录物和有义转录物两者，从而实现常 规(有义)基因表达的协同减少。例如，如果反义寡核苷酸用来实现敲低，则这一策略可用来施加靶向有义转录物的一种反义寡核苷酸和靶向相应反义转录物的另一反义寡核苷酸，或同时靶向重叠的有义转录物和反义转录物的单个有力地对称的反义寡核苷酸。根据本发明，反义化合物包括反义寡核苷酸、核酶、外部指导序列(EGS)寡核苷酸、siRNA化合物、单链或双链RNA干扰(RNAi)化合物例如siRNA化合物以及杂交于靶核酸的至少一部分并调节其功能的其它寡聚化合物。因此，它们可以是DNA、RNA、DNA-样、RNA-样或其混合物，或可以是一种或多种这些的模拟物。这些化合物可以是单链、双链、环状或发夹寡聚化合物，并可包含结构元件，例如内部凸出或末端凸出、错配或环。常规线性地制备反义化合物，但可被连接或以其它方式制备为环状和/或分支的。反义化合物可包括构建体，例如，两条链杂交以形成完全或部分双链的化合物或者具有足够自互补性的单链以允许杂交和形成完全或部分双链的化合物。两条链可在内部被连接，留下游离的3’或5’末端，或可被连接以形成连续的发夹结构或环。发夹结构可包含在5’或3’末端的突出，产生单链特征的延伸段。双链化合物任选地可包括在末端的突出。进一步的修饰可包括附加于末端之一、所选的核苷酸位置、糖位置或核苷间键合之一的缀合物基团。可选地，两条链可经由非核酸部分或接头基团连接。当仅由一条链形成时，dsRNA可采取自互补发夹型分子的形式，其与自身对折以形成双链体。因此，dsRNA可以是完全或部分双链的。基因表达的特异性调节可通过在转基因细胞系中稳定表达dsRNA发夹来实现,然而,在一些实施方案中，基因表达或功能被上调。当由两条链或采取与自身对折以形成双链体的自互补发夹型分子形式的单链形成时，两条链(或单链的双链体形成区)是以Watson-Crick方式碱基配对的互补RNA链。被引入系统中后，本发明的化合物可引发一种或多种酶或结构蛋白的作用以实现靶核酸的裂解或其它修饰，或可经由基于占位性的机制作用。通常，核酸(包括寡核苷酸)可描述为"DNA-样〃(S卩，通常具有一个或多个2’ -脱氧糖，且通常具有T而不是U碱基)或〃RNA-样〃(即，通常具有一个或多个2’ -羟基或2’ -修饰的糖，且通常具有U而不是T碱基)。核酸螺旋可采用多于一种类型的结构，最通常是A-和B-形式。通常认为，具有B-形式-样结构的寡核苷酸是"DNA-样〃，且具有A-形式样结构的是"RNA-样〃。在一些(嵌合)实施方案中，反义化合物可包含A-形式区域和B-形式区域两者。
在实施方案中，期望寡核苷酸或反义化合物包括以下至少一种:反义RNA、反义DNA、嵌合反义寡核苷酸、包括修饰的键合的反义寡核苷酸、干扰RNA(RNAi)、短干扰RNA (siRNA)、微干扰 RNA (miRNA)、时序调节小 RNA (stRNA)或短发夹 RNA (shRNA)、小 RNA-诱导的基因活化(RNAa)、小活化RNA(saRNA)或其组合。dsRNA还可活化基因表达，这是已被称为〃小RNA-诱导的基因活化〃或RNAa的机制。dsRNA靶向基因启动子诱导相关基因的有效的转录活化。RNAa在人细胞中利用合成的dsRNA证实，称为〃小活化RNA〃 (saRNA)。目前未知RNAa在其它生物体中是否是保守的。已发现小双链RNA (dsRNA)，例如小干扰RNA (siRNA)和微RNA (miRNA)是称为RNA干扰(RNAi)的进化保守机制的触发物。RNAi不变性经由重建染色质导致基因沉默，从而阻遏转录、降解互补mRNA或阻断蛋白翻译。然而在以下实施例部分详细描述的情况中，寡核苷酸显示增加唾液酸酶4 (NEU4)多核苷酸和其编码的产物的表达和/或功能。dsRNA还可作为小活化RNA(saRNA)作用。不希望受理论束缚，通过靶向基因启动子中的序列，saRNA将以称为dsRNA-诱导的转录活化(RNAa)的现象诱导靶基因表达。在进一步的实施方案中，本文鉴定的〃优选的靶区段〃可用于筛选调节唾液酸酶4(NEU4)多核苷酸表达的另外的化合物。"调节剂"是减少或增加编码NEU4的核酸分子表达的那些化合物，且包括与优选的靶区段互补的至少5-核苷酸部分。筛选方法包括以下步骤:将编码NEU4的有义或天然反义多核苷酸的核酸分子的优选的靶区段与一种或多种候选调节剂接触，并选择减少或增加编码NEU4多核苷酸的核酸分子(例如SEQ ID N0:8至11)的表达的一种或多种候选调节剂。显示一种或多种候选调节剂能够调节(例如，减少或增加)编码NEU4多核苷酸的核酸分子的表达后，随后调节剂可用于NEU4多核苷酸功能的进一步研究性研究，或用作根据本发明的研究剂、诊断剂或治疗剂。靶向天然反义序列优选地调节靶基因的功能。例如，NEU4基因(例如，登录号ΝΜ_001167600)。在实施方案中，靶是NEU4基`因的反义多核苷酸。在实施方案中，反义寡核苷酸靶向NEU4多核苷酸(例如，登录号NM_001167600)的有义和/或天然反义序列、变体、等位基因、同种型、同系物、突变体、衍生物、片段及其互补序列。优选地寡核苷酸是反义分子且靶包括反义和/或有义NEU4多核苷酸的编码区和非编码区。本发明优选的靶区段还可与本发明的其各自的互补反义化合物组合以形成稳定的双链(双链体)寡核苷酸。在本领域中，这种双链寡核苷酸部分已显示经由反义机制调节靶表达和调节翻译以及RNA加工。而且，可对双链部分进行化学修饰。例如，这种双链部分已经显示通过双链体的反义链与靶经典杂交，从而触发靶的酶促降解来抑制靶。在实施方案中，反义寡核苷酸靶向唾液酸酶4(NEU4)多核苷酸(例如，登录号ΝΜ_001167600)、变体、等位基因、同系物、突变体、衍生物、片段及其互补序列。优选地寡核苷酸是反义分子。根据本发明的实施方案，靶核酸分子不限于仅NEU4，还延伸到其任何多核苷酸变体和产生、影响、冲击或导致或涉及NEU4表达产物和/或其任何同种型的任何多核苷酸。在实施方案中，寡核苷酸靶向NEU4多核苷酸的天然反义序列，例如，如SEQ IDN0:2至7所列的多核苷酸，和任何变体、等位基因、同系物、突变体、衍生物、片段及其互补序列。反义寡核苷酸的实例列在SEQ ID N0:8至11。
在一个实施方案中，寡核苷酸与NEU4反义的核酸序列互补或结合,包括但不限于NEU4多核苷酸相关的非编码有义和/或反义序列，并调节NEU4分子的表达和/或功能。在实施方案中，寡核苷酸与如SEQ ID NO: 2至7所列的NEU4天然反义的核酸序列互补或结合，并调节NEU4分子的表达和/或功能。在实施方案中，寡核苷酸包括SEQ ID N0:8至11的至少5个连续核苷酸的序列，并调节NEU4分子的表达和/或功能。多核苷酸靶包括NEU4，包括其家族成员、NEU4的变体；NEU4的突变体，包括SNP ；NEU4的非编码序列；NEU4的等位基因；物种变体、片段和类似物。优选地寡核苷酸是反义分子。在实施方案中，靶向NEU4多核苷酸的寡核苷酸包括:反义RNA、干扰RNA(RNAi)JS干扰RNA(siRNA);微干扰RNA(miRNA);时序调节小RNA (stRNA);或短发夹RNA (shRNA);小RNA诱导的基因活化(RNAa);或小活化RNA(saRNA)。在实施方案中，用寡核苷酸靶向唾液酸酶4(NEU4)多核苷酸(例如SEQ ID NO:2至11)调节这些靶的表达或功能。在一个实施方案中，与对照相比表达或功能被上调。在实施方案中，与对照相比表达或功能被下调。在实施方案中，反义化合物或调节剂包括如SEQ ID NO:8至11所列的序列。这些寡核苷酸可包括一种或多种修饰的核苷酸、更短或更长片段、修饰的键和类似物。在实施方案中，SEQ ID N0:8至11包括一种或多种LNA核苷酸。表I不出可用于本发明方法中的示例性反义寡核苷酸。表1:
权利要求
1.一种调节生物系统中唾液酸酶4 (NEU4)多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括:将所述系统与长度为5至30个核苷酸的至少一种反义寡核苷酸接触，其中所述至少一种寡核苷酸与唾液酸酶4 (NEU4)多核苷酸的天然反义的反向互补序列具有至少50%序列同一性；从而调节唾液酸酶4(NEU4)多核苷酸的功能和/或表达。
2.根据权利要求1所述的调节生物系统中唾液酸酶4(NEU4)多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括:将所述生物系统与长度为5至30个核苷酸的至少一种反义寡核苷酸接触，其中所述至少一种寡核苷酸与包括SEQ ID NO:2的天然反义转录物核苷酸I至2119或SEQ ID NO:3的天然反义转录物核苷酸I至1245或SEQ ID NO:4的天然反义转录物核苷酸I至490或SEQ ID NO: 5的天然反义转录物核苷酸I至527或SEQ ID NO:6的天然反义转录物核苷酸I至946或SEQ ID NO:7的天然反义转录物核苷酸I至703中的5至30个连续核苷酸的多核苷酸的反向互补 序列具有至少50%序列同一性；从而调节唾液酸酶4(NEU4)多核苷酸的功能和/或表达。
3.一种体内或体外调节患者细胞或组织中唾液酸酶4(NEU4)多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括:将所述细胞或组织与长度为5至30个核苷酸的至少一种反义寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸与唾液酸酶4 (NEU4)多核苷酸的反义寡核苷酸具有至少50%序列同一1丨生；从而体内或体外调节患者细胞或组织中唾液酸酶4(NEU4)多核苷酸的功能和/或表达。
4.根据权利要求3所述的调节患者细胞或组织中唾液酸酶4(NEU4)多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括:将所述生物系统与长度为5至30个核苷酸的至少一种反义寡核苷酸接触，其中所述至少一种寡核苷酸与包括SEQ ID NO:2的天然反义转录物核苷酸I至2119或SEQ ID NO:3的天然反义转录物核苷酸I至1245或SEQ ID NO:4的天然反义转录物核苷酸I至490或SEQ ID NO:5的天然反义转录物核苷酸I至527或SEQ IDNO:6的天然反义转录物核苷酸I至946或SEQ ID NO: 7的天然反义转录物核苷酸I至703中的5至30个连续核苷酸的多核苷酸的反向互补序列具有至少50%序列同一性；从而调节唾液酸酶4(NEU4)多核苷酸的功能和/或表达。
5.一种调节生物系统中唾液酸酶4 (NEU4)多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括:将所述系统与靶向唾液酸酶4(NEU4)多核苷酸的天然反义寡核苷酸的区域的至少一种反义寡核苷酸接触；从而调节唾液酸酶4(NEU4)多核苷酸的功能和/或表达。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述唾液酸酶4(NEU4)的功能和/或表达相对于对照体内或体外增加。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述至少一种反义寡核苷酸靶向唾液酸酶4(NEU4)多核苷酸的天然反义序列。
8.如权利要求5所述的方法，其中所述至少一种反义寡核苷酸靶向包括唾液酸酶4(NEU4)多核苷酸的编码核酸序列和/或非编码核酸序列的核酸序列。
9.如权利要求5所述的方法，其中所述至少一种反义寡核苷酸靶向唾液酸酶4(NEU4)多核苷酸的重叠序列和/或非重叠序列。
10.如权利要求5所述的方法，其中所述至少一种反义寡核苷酸包括选自以下的一种或多种修饰:至少一种修饰的糖部分、至少一种修饰的核苷间键合、至少一种修饰的核苷酸及其组合。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述一种或多种修饰包括选自以下的至少一种修饰的糖部分:2’ -O-甲氧基乙基修饰的糖部分、2’ -甲氧基修饰的糖部分、2’ -O-烷基修饰的糖部分、二环的糖部分及其组合。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述一种或多种修饰包括选自以下的至少一种修饰的核苷酸间键合:硫代磷酸酯、2’ -O甲氧基乙基(MOE)、2’ -氟、膦酸烷基酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、乙酰胺酯、羧甲基酯及其组合。
13.如权利要求10所述的方法，其中所述一种或多种修饰包括选自以下的至少一种修饰的核苷酸:肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、阿拉伯糖-核酸(FANA)、类似物、衍生物及其组口 ο
14.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种寡核苷酸包括如SEQID N0:8至11所列的至少一种寡核苷酸序列。
15.一种体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中唾液酸酶4(NEU4)基因的功能和/或表达的方法，所述方法包括:将所述细胞或组织与长度为5至30个核苷酸的至少一种短干扰RNA (siRNA)寡核苷酸接触，所述至少一种siRNA寡核苷酸对唾液酸酶4 (NEU4)多核苷酸的反义多核苷酸有特异性，其中所述至少一种siRNA寡核苷酸与唾液酸酶4 (NEU4)多核苷酸的反义核酸分子和/或有义核酸分子的至少约五个连续核酸的互补序列具有至少50%序列同一性；以及体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中唾液酸酶4(NEU4)的功能和/或表达。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述寡核苷酸与唾液酸酶4(NEU4)多核苷酸的反义核酸分子和/或有义核酸分子互补的至少约五个连续核酸的序列具有至少80%序列同一性。
17.一种体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中唾液酸酶4 (NEU4)的功能和/或表达的方法，所述方法包括:将所述细胞或组织与长度为约5至30个核苷酸的至少一种反义寡核苷酸接触，所述至少一种反义寡核苷酸对唾液酸酶4 (NEU4)多核苷酸的有义和/或天然反义链的非编码序列和/或编码序列有特异性，其中所述至少一种反义寡核苷酸与如SEQID NO:1至7所列的至少一种核酸序列具有至少50%序列同一性；以及体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中唾液酸酶4(NEU4)的功能和/或表达。
18.一种合成的、修饰的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括至少一种修饰，其中所述至少一种修饰选自:至少一种修饰的糖部分；至少一种修饰的核苷酸间键合；至少一种修饰的核苷酸及其组合；其中所述寡核苷酸是与唾液酸酶4(NEU4)基因杂交并与正常对照相比体内或体外调节其功能和/或表达的反义化合物并且所述寡核苷酸与互补于唾液酸酶4 (NEU4)多核苷酸和等位基因、同系物、同种型、变体、衍生物、突变体、片段或其组合的反义和/或有义核酸分子的至少约5个连续核酸的序列具有至少50%序列同一性。
19.如权利要求18所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的长度为5至30个核苷酸且与NEU4基因的天然反义转录物中5至30个连续核苷酸的反向互补序列具有至少50%序列同一性。
20.如权利要求19所述的寡核苷酸， 其中所述至少一种修饰包括选自以下组成的组的核苷酸间键合:硫代磷酸酯、膦酸烷基酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、乙酰胺酯、羧甲基酯及其组合。
21.如权利要求19所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括至少一种硫代磷酸酯核苷酸间键合。
22.如权利要求19所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括硫代磷酸酯核苷酸间键合的主链。
23.如权利要求19所述的寡核苷酸,其中所述寡核苷酸包括至少一种修饰的核苷酸，所述修饰的核苷酸选自:肽核酸、锁核酸(LNA)、类似物、衍生物及其组合。
24.如权利要求19所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括多种修饰，其中所述修饰包括选自以下的修饰的核苷酸:硫代磷酸酯、膦酸烷基酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、乙酰胺酯、羧甲基酯及其组合。
25.如权利要求19所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括多种修饰，其中所述修饰包括选自以下的修饰的核苷酸:肽核酸、锁核酸(LNA)、类似物、衍生物及其组合。
26.如权利要求19所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括选自以下的至少一种修饰的糖部分:2’ -O-甲氧基乙基修饰的糖部分、2’ -甲氧基修饰的糖部分、2’ -O-烷基修饰的糖部分、二环的糖部分及其组合。
27.如权利要求19所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括多种修饰，其中所述修饰包括选自以下的修饰的糖部分:2’-0_甲氧基乙基修饰的糖部分、2’-甲氧基修饰的糖部分、2’ -O-烷基修饰的糖部分、二环的糖部分及其组合。
28.如权利要求19所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸长度为至少约5至30个核苷酸并与唾液酸酶4(NEU4)多核苷酸的反义和/或有义链杂交，其中所述寡核苷酸与唾液酸酶4(NEU4)多核苷酸的反义和/或有义编码和/或非编码核酸序列的至少约五个连续核酸的互补序列具有至少约60%序列同一性。
29.如权利要求19所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与唾液酸酶4(NEU4)多核苷酸的反义和/或有义编码和/或非编码核酸序列的至少约五个连续核酸的互补序列具有至少约80%序列同一性。
30.如权利要求19所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与至少一种唾液酸酶4(NEU4)多核苷酸杂交并与正常对照相比体内或体外调节其表达和/或功能。
31.如权利要求19所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括如SEQID NO:8至11所列的序列。
32.—种药物组合物，所述药物组合物包括对根据权利要求18的一种或多种唾液酸酶4(NEU4)多核苷酸有特异性的一种或多种寡核苷酸和药学上可接受的赋形剂。
33.如权利要求32所述的组合物，其中所述寡核苷酸与如SEQID NO:8至11所列的任一种核苷酸序列相比具有至少约40%序列同一性。
34.如权利要求32所述的组合物，其中所述寡核苷酸包括如SEQID NO:8至11所列的核苷酸序列。
35.如权利要求34所述的组合物，其中如SEQID NO:8至11所列的寡核苷酸包括一种或多种修饰或取代。
36.如权利 要求35所述的组合物，其中所述一种或多种修饰选自:硫代磷酸酯、膦酸甲酯、肽核酸、锁核酸(LNA)分子及其组合。
37.一种预防或治疗至少一种唾液酸酶4 (NEU4)多核苷酸和/或至少一种其编码的产物相关的疾病的方法，所述方法包括:向患者施用治疗有效剂量的结合所述至少一种唾液酸酶4(NEU4)多核苷酸的天然反义序列并调节所述至少一种唾液酸酶4 (NEU4)多核苷酸的表达的至少一种反义寡核苷酸；从而预防或治疗至少一种唾液酸酶4 (NEU4)多核苷酸和/或至少一种其编码的产物相关的疾病。
38.如权利要求37所述的方法，其中至少一种唾液酸酶4(NEU4)多核苷酸相关的疾病选自:与唾液酸酶的异常功能和/或表达相关的疾病或病症、癌症、增殖性疾病或病症、细胞凋亡、与细胞凋亡调节受损相关的疾病或病症、糖尿病、心血管疾病或病症、Tay Sachs病、溶酶体贮积症、炎性疾病或病症(例如炎性肠病，包括克罗恩病、溃疡性结肠炎、银屑病、关节炎等)、炎症；代谢疾病或病症、代谢综合征、胰岛素抵抗综合征、糖尿病、高血脂症、脂肪肝疾病、恶病质、肥胖症、动脉粥样硬化症、动脉硬化症、与胆固醇代谢改变相关的疾病病症或疾患、血压升高、神经病学疾病或病症、与神经元细胞分化受损相关的疾病或病症；与神经突形成受损相关的疾病或病症；与糖蛋白脱唾液酸化受损相关的疾病或病症和感染(例如病毒感染、全身性感染或任何其他类型的感染)。
39.一种诱导生物系统中的细胞凋亡的方法，其包括向所述系统施用长度为5至30个核苷酸的寡核苷酸，所述寡核苷酸与NEU4多核苷酸的天然反义转录物的反向互补序列中的5至30个连续核苷酸具有至少50%同一性。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述天然反义转录物具有SEQID NO:2至7。
41.根据权利要求39所述的方法，其中所述生物系统为患者细胞或组织。
42.一种诱导生物系统中的细胞凋亡的方法，其包括向所述系统施用长度为约5至30个核苷酸的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸通过靶向基因的天然反义转录物而上调所述靶基因并且其中所述寡核苷酸与所述经上调的基因的天然反义转录物的反向互补序列具有至少50%同一性。
43.一种鉴定和选择对于NEU4基因的天然反义转录物具有选择性的至少一种寡核苷酸作为用于体内施用的所选靶多核苷酸的的方法，所述方法包括:鉴定包括与所选靶多核苷酸或与所选靶多核苷酸的反义多核苷酸至少部分互补的至少五个连续核苷酸的至少一种寡核苷酸；测量反义寡核苷酸和所述靶多核苷酸或与所选靶多核苷酸反义的多核苷酸在严格杂交条件下的杂合体的热熔点；和基于所获得的信息选择用于体内施用的至少一种寡核苷酸。
全文摘要
本发明涉及调节唾液酸酶4(NEU4)的表达和/或功能的反义寡核苷酸，尤其是通过靶向唾液酸酶4(NEU4)的天然反义多核苷酸。本发明还涉及这些反义寡核苷酸的鉴定和它们在治疗NEU4表达相关的疾病和病症中的用途。
文档编号C12N15/113GK103210086SQ201180050023
公开日2013年7月17日 申请日期2011年10月5日 优先权日2010年10月6日
发明者J·克拉德, O·霍克瓦舍曼 申请人:库尔纳公司
最新回复(0)