热稳定性Persephonella碳酸酐酶及其用途的制作方法

xiaoxiao2020-6-24  4

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专利名称:热稳定性Persephonella碳酸酐酶及其用途的制作方法
技术领域
本发明涉及自Persephonella marina可获得的碳酸酐酶在例如从烟道气体、沼气、天然气(natural gas)或环境空气提取CO2中的用途。本发明还涉及用于提取二氧化碳的生物反应器和可用于此类提取工艺的组合物。
背景技术
二氧化碳(CO2)排放是全球变暖现象的一个主要贡献因素。CO2是一种燃烧副产物,并且它产生操作的、经济的、和环境的问题。CO2排放可以在排放到大气中前通过捕获CO2气体来控制。存在着几种控制CO2排放的化学办法(A.Kohl和R.Nielsen,GasPurification,第 5 版,Gulf Professional Publishing, Houston, TX, 1997)。然而,许多这些办法具有缺点,如高能量消耗、缓慢的过程、和使用生态学可疑的或有毒的化合物。使用碳酸酐酶以非常高的速率(周转率(turnover)是每秒多至IO5个CO2分子)催化CO2转化为碳酸氢盐的能力的基于酶的办法克服了与CO2捕获有关的反应速率和环境问题。使用碳酸酐酶从气体,如燃烧气体或呼吸气体提取CO2的技术方案已经记载于 W02006/089423、US6, 524,842、W02004/007058, W02004/028667, US2004/0029257,US7, 132, 090、W02005/114417, US6, 143, 556、W02004/104160, US2005/0214936、W02008/095057。一般地,这些技术通过使可溶性或固定化的碳酸酐酶与CO2接触来运行,所述CO2可以处于气相或液相。在存在水的情况下,碳酸酐酶催化CO2转化成碳酸氢盐离子,其可以根据介质的P H而进一步质子化或去质子化为碳酸和/或碳酸盐离子。离子可以用来促进利用碳酸氢盐/碳酸盐作为碳源的藻类或微生物的生长,诱导周围介质中的PH变化或供应缓冲能力,提供碳酸氢盐/碳酸盐作为活性剂用于随后的化学过程,或者作为盐碳酸盐沉淀,或者转化回到纯CO2,然后其可以使用(例如在增强的油回收中、用于尿素的生产、用于食物和饮料加工、或者为温室或养殖池供应CO2)、释放(例如自容纳式生命支持环境如潜水艇、航天器、或人工肺)、压缩(例如用于经由管道运输)、或贮存(如在地质学或深海构造或含盐含水层中)。一般地,哺乳动物、植物和原核碳酸酐酶(α和β类CA)在生理学温度(37°C )或更低的温度发挥功能。然而,燃烧气体或溶解它们的液体的温度可以容易超过碳酸酐酶用于捕获CO2的最适温度。使用基于酶的解决方案的缺点之一在于在使含有CO2的气体/具有碳酸酐酶的液体接触前在CO2提取过程中可能需要广泛的冷却,并且冷却是一个能量消耗过程。因此,在要在工业相关条件下使用酶时需要更加热稳定的碳酸酐酶。附图简述

图1是中空纤维膜生物反应器的示意图。数字代表下列特征:1.二氧化碳(CO2)罐;2.氮气(N2)罐;3.质量流控制器(Mass flow controller, MFC) ;4.载体液体忙液器;
5.液体泵;6.压力表;7.中空纤维膜模块;8.废物;9.进料气(Feed gas) ;10.洗涤气(Scrubbed gas) ;11.质量流表(MFM) ;12.气体取样阀;13.气相色谱仪;14.进料气入;15.洗涤气出;16.液体入;17.液体出。图2是用于从混合气体提取CO2的一般再循环吸收/解吸过程的示意图。在一般的过程中,富含CO2的进料气(I)进入吸收模块(2),优选气体进入一端(例如,底部),在那里它与CO2贫乏的载体液体(3)接触,所述载体液体(3)进入吸收模块,优选在与进料气相反的末端(例如,顶部)进入。已经除去CO2的洗涤气(4)离开吸收模块。富含0)2的载体液体(5)离开吸收模块,并且(任选地)通过温度调节器(例如,热交换器)(6),之后进入(优选在一端(例如,顶部))解吸模块(7)。对解吸模块应用的热(8)(如由再沸器或直接蒸汽供应)或真空(9),或这些的组合引起提取的CO2从载体液体释放,并离开(10)解吸模块,(任选地)通过冷凝器(11)以除去载体液体蒸汽,之后压缩和/或使用纯化的CO2气体(12)。CO2贫乏的载体液体离开解吸模块,并且(任选地)通过温度调节器(例如,热交换器),之后回到吸收模块。可以在工艺中的多个点处,如在指示的位置(13a和13b)处添加消耗的和/或辅助的载体液体组分。可以在工艺中的多个点处,如在指示的位置(14)处自循环液体除去不溶性污染物。图3是克隆质粒C6221的示意图。该图中的缩写在下文描述。“CA”是经密码子优化的碳酸酐酶编码基因。“SP”是来自地衣芽孢杆菌(B.1icheniformis)的α -淀粉酶信号肽。“term”是终止子序列。“Cam”是编码氯霉素乙酰基转移酶的基因。“pel”是用于对宿主细胞基因组的同源重组的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果胶酸裂合酶基因基因座。“Neo”是卡那霉素抗性基因。“Amp”是β-内酰胺酶基因。“crylllA区”是包含cryIIIA稳定化元件的三重启动子系统。发明概述本发明的一个方面是源自Persephonella属的细菌的或由Persephonella属的细菌可生成的碳酸酐酶用于自含有二氧化碳的介质提取二氧化碳的用途。本发明中使用的碳酸酐酶在55°C以上,优选60°C以上,优选65°C以上,更优选70°C、75°C、80°C、或85°C以上,甚至更优选90°C以上,且最优选高于100°C的温度在IM NaHC03缓冲液pH8.0中15分钟,优选2小时后维持至少30%,优选至少40%,更优选至少50%残余活性。热稳定性碳酸酐酶特别在能够提取从燃烧、或从粗天然气或合成气或沼气或环境空气排放的CO2的生物反应器中使用,此时提取过程中的条件需要酶暴露于高温。然而,酶也可以在不在高温发生的工艺中采用,因为它们于较低的温度,例如0°C、室温(20至25°C )和37°C也维持活性。热稳定性在制造、使用期间,或者在闲置期(例如热仓库中贮存)期间将碳酸酐酶暴露于高温环境(即,其中温度可以超过45°C、50°C或甚至55°C)时也是有用的。使用期间的热稳定性可以包括如下的情况,其中碳酸酐酶在一个温度(例如,451:、501:、551:、601:或651:)实施有用的催化,然后,由于使用过程中的不同阶段,暴露于更高的温度(例如,70°C、75°C、80°C、85°C、90°C、95°C或100°C ),其中它也实施有用的催化,或者保持闲置,直至暴露于工艺的下一阶段,如于更低的温度,其中碳酸酐酶再次实施有用的催化。在这些情况中,碳酸酐酶可能必须经受住在使用过程中重复暴露于较低和较高的温度,因此需要热稳定性碳酸酐酶。在又一个方面,本发明提供了一 种组合物,其包含适于固定化的基质和源自Persephonella属的细菌的或由Persephonella属的细菌可生成的碳酸酐酶。
在又一个方面,本发明提供了一种适于提取二氧化碳的生物反应器。发明详述本发明的一个方面关注从Persephonella属细菌菌株可获得的或由Persephonella属细菌菌株可生成的碳酸酐酶用于自含有CO2的介质,如气体、液体或多相混合物提取CO2的用途。本发明在含有CO2的介质的温度高于商业上可得到的碳酸酐酶,如自人或牛红细胞分离的CA-1或CA-1I的最适温度的情况中是特别有用的。定义术语“碳酸酐酶活性”或“CA活性”在本文中定义为催化二氧化碳和碳酸氢盐之间转化[CO2 + H2O达HCO3' + H+]的EC4.2.1.1活性。出于本发明的目的,依照实施例4中所描述的规程测定CA活性。一个单位的CA活性根据Wilbur [IU= (l/tJ-Q/tJxlOOO]定义,其中U是单位,而t。和tu分别代表催化和未催化反应以秒计的时间(Wilbur, 1948,J.Biol.Chem.176:147-154)。若本发明的多肽具有由与SEQ ID NO:2的氨基酸残基20至243或SEQ ID N0:4的氨基酸残基29至251对应的氨基酸序列组成的多肽的CA活性的至少20%,优选至少40%,甚至更优选至少50%,更优选至少60%,更优选至少70%,更优选至少80%,甚至更优选至少90%,最优选至少95%,且甚至最优选至少100%,则认为它们具有CA活性。术语“C02贫乏的”和“富含CO2的”载体液体是本发明中用于描述在载体液体遍及整个工艺循环时其中存在的碳(例如,以溶解的CO2、起化学反应的CO2、碳酸氢盐、碳酸和/或盐碳酸盐形式)相对量的术语。如本文中使用的,术语“co2贫乏的载体液体”一般指进入吸收模块的载体液体。术语“富含CO2的载体液体”一般指进入解吸模块的载体液体。应当理解,术语“co2贫乏的载体液体”也可以应用于离开解吸模块的载体液体,而术语“富含CO2的载体液体”也可以应用于离开吸收模块的载体液体。与给定时间点时系统内CO2贫乏的载体液体相比,富含CO2的载体液体含有更多碳。术语“含有CO2的介质”用于描述含有至少0.001%C02,优选至少0.01%,更优选至少
0.1%,更优选至少1%,更优选至少5%,最优选10%,甚至更优选至少20%,且甚至最优选至少50%C02的任何材料。优选含有CO2的介质具有任何压力下5°C -110°c,更优选10°C -100°C,更优选20 V -95 V,更优选30 V -90 V,更优选40 V -85 V,更优选50 V -80 V,更优选550C _75°C,且最优选60°C _70°C的温度。特别地,含有CO2的介质是气相(包括气体混合物)、液体或多相混合物,但是也可以是固体。例如,含有CO2的气相是自油井、气井、和凝析井(condensate well)可获得的粗天然气、通过将含碳燃料(例如,甲烧)气化为包含CO和H2的气体产物生成的合成气、或来自燃烧过程,例如来自基于碳的电力发电厂,或来自此类工厂、工业炉、炉、灶、或壁炉的烟道气体烟囱/烟道(stack)或来自飞机或汽车排气装置的排放流。或者,含有CO2的气相可以是环境空气(包括热(高于40°C )空气,例如,沙漠空气),或者来自哺乳动物(如人工肺中含有CO2的气相)、活的植物和其它排放CO2的物种中的呼吸过程,特别来自温室。含有CO2的气相也可以是来自需氧或厌氧发酵,如酿造、生成有用产物如乙醇的发酵、或沼气生成的废气(off-gas)。若此类发酵过程由嗜热微生物促进(例如这在沼气的生产中遇到),则它们可以在高温发生。或者,含有CO2的气相可以是出于使用或贮存目的而富含CO2的气相。上文所描述的气相也可以以多相混合物存在,其中气体与某种程度的流体(例如,水或其它溶剂)和/或固体材料(例如,灰分或其它颗粒)共存。含有CO2的液体是含有可测量量的CO2,优选在任何压力下以上文提及的水平之一含有可测量量的CO2的任何溶液或流体,特别是水性液体。可以通过将含有CO2的气体或固体(例如,干冰或含有可溶性碳酸盐的盐)通入液体中来获得含有CO2的液体。含有CO2的流体也可以是压缩的CO2液体(其含有污染物,如干洗流体)、超临界0)2、或CO2溶剂液体,如离子液体。含有CO2的液体也可以称为“载体液体”。含有CO2的液体也可以包括能够改善液体的含 CO2 能力的化合物。如 HCO3-(KHCO3 或 NaHCO3)、⑶/-(Na2CO3 或 K2CO3)、HPO42-(K2HPO4或 Na2HPO4)或 MDEA 或 Tris。术语“C02提取”应当理解为从含有CO2的介质降低碳。此类提取可以从一种介质至另一种,例如气体至液体、液体至气体、气体至液体至气体、液体至液体或液体至固体实施,但是提取液也可以是在同一介质内CO2转化成碳酸氢盐、碳酸盐或碳酸或者在同一介质内碳酸氢盐转化成co2。术语CO2捕获也用于指示CO2从一种介质到另一种的提取或者CO2转化成碳酸氢盐/碳酸盐或者碳酸氢盐/碳酸盐转化成CO2。在本文中使用时,术语“编码序列”意指直接规定产物多肽的氨基酸序列的多核苷酸序列。一般地,编码序列的边界由开读框决定,所述开读框通常以ATG起始密码子或者备选起始密码子如GTG和TTG开始,并且以终止密码子如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、mRNA、合成或重组多核苷酸。术语“多肽的功能性片段”或“具有碳酸酐酶活性的多肽片段”用于描述源自较长的多肽(亲本多肽),例如成熟多肽,而且已经在N端区或C端区中或者在这两个区中截短以生成亲本多肽片段的多肽。为了成为功能性多肽,片段必须维持亲本多肽的CA活性的至少20%,优选至少40%,更优选至少50%,更优选至少60%,更优选至少70%,更优选至少80%,甚至更优选至少90%,最优选至少95%,且甚至最优选至少100%。术语“同一性”用于描述两种氨基酸序列或两种核酸序列间的相关性。出于本发明的目的,使用 Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch, 1970, J.Mol.Biol.48:443-453)确定两种氨基酸序列间的序列同一性程度,如在EMBOSS包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice等,2000,TrendsGenet.16:276-277),优选版本3.0.0或更后的Needle程序中执行的。使用的任选参数是缺口打开罚分10、缺口延伸罚分0.5、和EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。标记为“最长同一性”(使用-nobrief选项获得)的Needle输出作为百分比同一性使用,并且如下计算:(相同的残基xlOO)/ (比对长度-比对中缺口总数)出于本发明的目的,使用Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch, 1970,见上文)测定两种脱氧核糖核苷酸序列间的序列同一性程度,如在EMBOSS包(EMBOSS: TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等,2000,见上文),优选版本
3.0.0或更后的Needle程序中执行的。使用的任选参数是缺口打开罚分10、缺口延伸罚分0.5、和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。标记为“最长同一性”(使用-nobrief选项获得)的Needle输出作为百分比同一'丨生使用,并且如下计算:(相同的脱氧核糖核苷酸XlOO)/(比对长度-比对中缺口总数)术语“热稳定性”在提及酶如碳酸酐酶使用时指示在升高的温度,S卩,高于45°C,优选地高于50°C,更优选地高于55°C,更优选地高于60°C,甚至更优选地高于65°C,最优选地闻于70 C,最优选地闻于75 C,最优选地闻于80 C,最优选地闻于85 C,最优选地闻于90°C,且甚至最优选地高于100°C为功能性或活性(即,可以实施催化)的酶。在一个优选的实施方案中,碳酸酐酶于上文指示的温度之一展示最佳活性,即酶的最适温度于上文指示的温度之一。可以经由配制,例如通过与稳定化化学品组合或者通过酶固定化或者通过化学修饰,例如交联以便以其活性三维形状保持酶以某种程度提高碳酸酐酶的温度稳定性。为了使酶视为热稳定性的,它于升高的温度在至少15分钟,优选至少2小时,更优选至少24小时,更优选至少7天,更优选至少10天,甚至更优选至少14天,最优选至少30天,甚至最优选至少50天后保持活性。一般地,在IM NaHCO3缓冲液中于pH8于给定的升高温度温育规定的时间后使用实施例3中描述的测定法测量活性水平。可以比较该活性与温度升高前的酶活性,由此获得热处理后的酶残余活性。优选残余活性于升高的温度在给定时间后是至少30%,更优选至少40%,更优选至少50%,更优选至少60%,甚至更优选至少70%,最优选至少80%,甚至最优选残余活性是至少90%,且绝对最优选残余活性的水平于升高的温度在给定的时间后至少是相等或不变的。术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的任何亲本细胞后代。术语“分离的多核苷酸”意指相对于如存在于自然界中的所述多核苷酸,人为修饰的多核苷酸。在一个方面,分离的多核苷酸是至少1%纯的,例如至少5%纯的,更优选至少10%纯的,至少20%纯的,至少40%纯的,至少60%纯的,至少80%纯的,至少90%纯的,及至少95%纯的,如通过琼脂糖电泳确定的。多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成起源的,或其任何组合。如本文中使用的,术语“分离的多肽”指如通过SDS-PAGE确定的,至少20%纯的,优选至少40%纯的,更优选至少60%纯的,甚至更优选至少80%纯的,最优选至少90%纯的,且甚至最优选至少95%纯的多肽。

术语“成熟多肽”意指翻译和任何翻译后修饰,如N端加工、C端截短、糖基化、磷酸化等后其最终形式的多肽。在一个方面,成熟多肽是SEQ ID NO: 2的20至243或SEQ IDNO:4的氨基酸残基29至251。本领域中已知的是,宿主细胞可以生成由同一多核苷酸表达的两种以上不同的成熟多肽(即,具有不同C端和/或N端氨基酸)的混合物。术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有碳酸酐酶活性的成熟多肽的多核苷酸。术语“可操作连接的”意指控制序列相对于多核苷酸的编码序列在合适的位置处放置,使得控制序列指导编码序列表达的构造。如本文中使用的,术语“分泌的多肽”应当理解为在细胞中表达后转运并释放至周围的胞外介质或者在细胞膜中结合/包埋,使得多肽的至少一部分暴露于周围的胞外介质的多肽。术语“亚序列”意指从成熟多肽编码序列的5’和/或3’端缺失一个或多个(几个)核苷酸的多核苷酸,其中该亚序列编码具有碳酸酐酶活性的片段。术语“基本上纯的多肽”在本文中意指含有至多10%、优选地至多8%、更优选地至多6%、更优选地至多5%、更优选地至多4%、至多3%、甚至更优选地至多2%、最优选至多1%,且甚至最优选至多0.5%(按重量计)与其天然关联的其它多肽材料的多肽制备物。因此,优选的是,基本上纯的多肽是至少92%纯的、优选至少94%纯的、更优选至少95%纯的、更优选至少96%纯的、更优选至少96%纯的、更优选至少97%纯的、更优选至少98%纯的、甚至更优选至少99%、最优选至少99.5%纯的、且甚至最优选地100%纯的(按重量计)在制备物中存在的总多肽材料。优选本发明的多肽为基本上纯的形式。特别地,优选的是多肽为“基本上纯的形式”,即,多肽制备物基本上不含与其天然关联的其它多肽材料。这可以例如通过依靠公知的重组方法制备多肽或者通过经典的纯化方法来实现。在本文中,术语“基本上纯的多肽”与术语“分离的多肽”和“分离形式的多肽”是同义的。术语“合成气”或“合成气体”用于描述含有不同量的通过将含碳燃料(例如甲烷或天然气)气化成具有热值的气体产物生成的一氧化碳和氢气的气体混合物。CO2在合成气反应中生成,并且必须除去以增加热值。术语“嗜热的”就生物体而言描述于相对较高的温度,即高于45°C茁壮生长(thrive)的生物体。超嗜热生物体在极端热的环境(也就是说,比60°C左右高,最佳温度高于80°C )中茁壮生长。自Persephonella可获得的碳酸酐酶及其用途目前,几种热稳定性碳酸酐酶是已知的,包括来自热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum) ΔH 的 β 类 CA(Cab)(已经报告了其对于高至 75 °C 是热稳定的(Smith 和 Ferry, 1999, J.Bacteriol.181:6247-6253))和来自嗜热甲烧八叠球菌(Methanosarcina thermophila)TM-1 的 Y 类碳酸酐酶(Cam)。在 1994年第一次分离出 Cam(Alber 和 Ferry, 1994, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA91:6909-1913),并且在1996年,显示了它对于于55 °C加热15分钟是稳定的(Alber和Ferry, 1996, J.Bacteriol.178:3270-3274)。Cam是唯一分离的Y类酶,并且自其发现起已经进行了许多表征研究。W02010/081007描述了 Cam的热稳定性变体。US2006/0257990描述了人碳酸酐酶II变体,其中最稳定的变体高至65°C显示活性。US2004/0259231披露了 Cab及非热稳定性人CA同等型IV在CO2溶解和 浓缩过程中的用途。W02008/095057描述了来自克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)和耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)的热稳定性α -碳酸酐酶及其用于提取CO2的用途。W02010/151787(申请n0.PCT/US2010/040022)描述了来自Caminibacter的热稳定性α -碳酸酐酶及其用于提取CO2的用途。本发明的一个方面是自Persephonella属细菌菌株分离的热稳定性碳酸酐酶、或落入本发明的Persephonella碳酸酐酶的给定序列同一'丨生内的碳酸酐酶在从含有CO2的介质,如气体、液体、或多相混合物提取CO2中的技术应用。优选Persephonella碳酸酐酶是α类碳酸酐酶。优选将CO2从一种介质,如气体提取到第二介质如液体,牵涉在第二介质内将CO2转化成碳酸氢盐,这又称作CO2的吸收。含有CO2的介质中碳酸氢盐转化成CO2,然后该CO2可以从第一介质释放到第二介质,如气体的相反提取过程也是期望的过程,其中可以应用本发明的碳酸酐酶。此过程又称作CO2的解吸。本发明在含有CO2的介质的温度和/或提取过程中存在碳酸酐酶的某些阶段的温度高于商业上可得到的碳酸酐酶,如自人或牛红细胞分离的CA-1或CA-1I (其具有约37°C的最适温度)的最适温度的情况中,或者在温度高于少数已知的热稳定性碳酸酐酶的最适温度的情况中是特别有用的。可以出现升高的温度的过程阶段的一个例子是在使热烟道气体与用于从烟道气体吸收CO2的含有碳酸酐酶的液体接触时。另一个例子是目前的CO2洗涤技术,如用碳酸盐(例如,热碳酸钾过程)、链烷醇胺(例如,单乙醇胺、甲基二乙醇胺等)或其它胺(例如,氨)的化学吸收,其在解吸过程中使用升高的温度(高至约120至130°C )。已经自深海热水出口分离出属于Persephonella属的几种细菌菌株。目前,已经鉴定出三种物种,即 Persephonella marina、Persephonella hydrogeniphila 和Persephonella guaymasensis ( G(”:Z等,2002,International Journal of Systematicand Evolutionary Microbiology, 52, 1349-1359 及 Nakagawa 等,2003, InternationalJournal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 53,863-869)。已经报告了所述菌株于70°C或70°C左右的温度生长。Persephonella marina已经进行了基因组测序(EMBL-EBI ID CP001230)。本申请中以SEQ ID NO:1鉴定的开读框自此工作获得,并且预测了以UniProt登录号C0QRB5 (SEQ ID NO: 2)发表的翻译多肽序列可以生成具有碳酸酐酶活性的蛋白质。似乎所述蛋白质从未表达或表征以确认此预测。本发明的实施例第一次描述了克隆、表达和分离来自P.marina DSM14350的成熟碳酸酐酶,而且确认氨基酸序列生成具有碳酸酐酶活性的酶。显示了所述酶在IM NaHCO3中于pH8于80°C温育15分钟及2小时后维持所有其碳酸酐酶活性。与具有UniProt登录号:C0QRB5的Persephonella碳酸酐酶最紧密相关的碳酸酐酶是 53% 相同的 Allochromatium vinosum 碳酸脱水酶(EC4.2.1.1, UNIPR0T 登录号:D3RV11)。在本发明的一个实施方案中,要在CO2提取中应用的碳酸酐酶源自选自如下的细菌菌株、可从选自如下的细菌菌株获得或可由选自如下的细菌菌株生成:菌种Persephonella marina, Persephonella hydrogeniphila或Persephonella guaymasensis之一,优选要在CO2提取中应用的碳酸酐酶源自Persephonella marina DSM14350、Persephonella hydrogeniphila DSM15103 或 Persephonella guaymasensis DSM14351保藏的菌株之一或可由其生成。在又一个实施方案中,要在CO2提取中应用的碳酸酐酶是a)源自Persephonellamarina DSM14350 的 、可从 Persephonella marina DSM14350 获得或可由 Persephonellamarina DSM14350生成的;或b)具有与SEQ ID NO:2的氨基酸残基20至243或SEQ IDNO:4的氨基酸残基29至251对应的氨基酸序列的多肽;或c)与SEQ ID NO:2的氨基酸残基 20 至 243 或 SEQ ID NO:4 的氨基酸残基 29 至 251 至少 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%,91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 或 99% 相同的多肽;或 d) (a)、(b)或(c)中具有碳酸酐酶活性的片段;或6)由在非常低的、低的、中等的、中等-高的或高的严格性条件下与如下杂交的核酸序列编码的多肽:i)编码SEQ ID NO:2的成熟多肽的多核苷酸序列;或ii)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3的多核苷酸序列;或iii)⑴或(ii)中至少100个连续核苷酸的亚序列,或 iv) (i)或(ii)的互补链(Sambrook, Fritsch 和 Maniatis, 1989, MolecularCloning, A Laboratory Manual,第 2版,Cold Spring Harbor, New York);或;0 由如下的核酸序列编码的多肽,所述核酸序列由于遗传密码简并性不与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3的多核苷酸序列杂交,但其编码具有依照b)或c)的氨基酸序列的多肽;或g)由如下的核酸序列编码的多肽,所述核酸序列与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3至少60%,65%, 70%, 75%,80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 或 100% 相同。c)、e)或 g)中的多肽可以是合成的或者源自与Persephonella不同的物种,只要多肽落入所要求保护的同一性内,并且维持碳酸酐酶活性。在使用术语Persephonella碳酸酐酶时,它还包括c)、e)和g)的碳酸酐酶。依照本发明,杂交条件如下定义。对于长度至少100个核苷酸的长探针,非常低的到非常高的严格性条件定义为于42°C在5X SSPE、0.3%SDS、200 μ g/ml剪切的且变性的鲑精DNA、和25%甲酰胺(对于非常低的和低的严格性)、35%甲酰胺(对于中等的和中等-高的严格性)、或50%甲酰胺(对于高的和非常高的严格性)中遵循标准的Southern印迹规程预杂交和杂交最佳地12至24小时。最终,使用2X SSC、0.2%SDS优选至少于45°C (非常低的严格性)、更优选至少于50°C (低严格性)、更优选至少于55°C (中等严格性)、更优选至少于60°C (中等-高严格性)、甚至更优选至少于65°C (高严格性)、且最优选至少于700C (非常高的严格性)将载体材料洗涤三次,各15分钟。在一个具体的实施方案中,使用
0.2X SSC、0.2%SDS优选至少于45°C (非常低的严格性)、更优选至少于50°C (低严格性)、更优选至少于55°C (中等严格性)、更优选至少于60°C (中等-高严格性)、甚至更优选至少于65°C (高严格性)、且最优选至少于70°C (非常高的严格性)进行洗涤。在另一个具体的实施方案中,使用0.1XSSC、0.2%SDS优选至少于45°C (非常低的严格性)、更优选至少于500C (低严格性)、更优选至少于55°C (中等严格性)、更优选至少于60°C (中等-高严格性)、甚至更优选至少于65°C (高严格性)、且最优选至少于70°C (非常高的严格性)进行洗涤。对于长度约15个核苷酸至约70个核苷酸的短探针,严格性条件定义为于低于计算的1'111约51:至约101:在0.91 NaCl、0.09M Tris-HCl ρΗ7.6、6mM EDTA、0.5%NP_40、IX 登哈特(Denhardt)氏溶液、ImM焦憐酸钠、ImM憐酸二氢钠、0.1mM ATP、和每ml0.2mg酵母RNA中遵循标准的Southern印迹规程的预杂交、杂交和杂交后洗漆,所述计算的Tm使用依照Bolton和McCarthy(1962,Proceedings of the National Academy of Sciences USA48:1390)的计算得到。将载体材料在加有0.1%SDS的6X SCC中洗涤一次达15分钟,并使用6X SSC于低于计算的Tm5°C至10°C洗涤两次,各15分钟。与SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4具有给定%同一性的多肽序列或与SEQID NO:1或SEQ ID N0:3具有给定%同一性的多核苷酸序列可以获自天然存在的来源,如其它细菌菌株。或者,通过在亲本序列(例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3 (对于多核苷酸)及SEQ IDNO: 2或SEQ ID NO:4 (对于多肽)的成熟序列)中取代、缺失、和/或插入一个或多个氨基酸或核酸获得多肽或多核苷酸序列。优选亲本序列或由亲本多核苷酸编码的多肽中改变的氨基酸数目是1-5、1-10、1-20、1-30或1_40个氨基酸。优选氨基酸变化是性质上较不重要的,其是不显著影响蛋白质折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入;通常I至约30个氨基酸的小缺失;小的氨基或羧基端延伸,如氨基端甲硫氨酸残基;多至约20-25个残基的小接头肽;或便于通过改变净电荷或另一种功能进行纯化的小延伸,如多组氨酸标签或多组氨酸-谷氨酸标签、抗原性表位或结合域。保守取代的例子在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)的组内。一般不改变比活的氨基酸取代是本领域中已知的,并且例如由Neurath和Hill, 1979,于The Proteins, AcademicPress, New York 描 述。最通常存在的交换是 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly,Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val,Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro,Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/He, Leu/Val,Ala/Glu,和Asp/Gly。在20种标准的氨基酸外,可以用非标准氨基酸(如4_羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸、和α -甲基丝氨酸)替换野生型多肽的氨基酸残基。可以用有限数目的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸、和非天然氨基酸替换氨基酸残基。“非天然氨基酸”在蛋白质合成后已经经过修饰,和/或在其侧链中具有与标准氨基酸不同的化学结构。非天然氨基酸可以是化学合成的,且优选是商业上可得到的,并且包括哌可酸(pipecolic acid)、噻唑烧羧酸(thiazolidine carboxylicacid)、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸、和3,3- 二甲基脯氨酸。可以依照本领域中已知的规程,如定点诱变或丙氨酸扫描诱变鉴定亲本多肽中的必需氨基酸(Cunningham和Wells, 1989,Science244:1081-1085)。在后来的技术中,在分子中的每个残基处引入单一丙氨酸突变,并且对所得的突变体分子测试生物学活性(即,碳酸酐酶活性)以鉴定对于分子活性至关重要的氨基酸残基。还可参见Hilton等,1996,J.Biol.Chem.271:4699-4708。也可以通过对结构的物理分析来确定酶或其它生物学相互作用的活性位点,如通过如核磁共振、晶体学、电子衍射、或光亲和标记等技术以及推定的接触位点氨基酸的突变确定的。参见例如de Vos等,1992,Science255:306-312; Smith等,1992,J.Mol.Biol.224:899-904;Wlodaver 等,1992,FEBS Lett.309:59-64。 已经对碳酸酐酶实施大量这些分析,最重要的分析综述于例如Tripp等,2001, J.Biol.Chem.276:48615-48618 及 Lindskog, 1997,Pharmacol.Ther.74:1-20。也可通过分析与多肽的同一性推断必需氨基酸的身份,所述多肽与依照本发明的多肽有关。α -碳酸酐酶根据其共有序列基序:S-E-[HN]-x-[LIVM]-x(4)-[FYH]-x(2)-E-[LIVMGAJ-H-[LIVMFA] (2)鉴定。相应的共有残基对应于SEQ ID NO:2中的第112位至第128位和SEQ ID N0:4中的第120位至第136位。在一个优选的实施方案中,所有共有位置存在于碳酸酐酶中。预测以下氨基酸残基H107、H109和H126(依照SEQ ID N0:2编号)形成对于催化重要的组氨酸三联体。在本发明的一个优选的实施方案中,碳酸酐酶在第107位、第109位、和第126位(使用SEQ ID NO:2编号)中含有组氨酸。

预测以下氨基酸残基H82、E113、Q105和T193(使用SEQ ID Ν0:2编号)参与质子穿梭机制,其对于酶的催化活性也是相关的(与人CAII类似,如由Smith和Ferry, 2000, FEMS Microbiol Rev.24:335-366描述的)。在又一个实施方案中,碳酸酐酶含有第82位(使用SEQ ID NO:2编号)中的组氨酸和/或第105位(使用SEQ ID NO:2编码)中的谷氨酰胺和/或第113位(使用SEQ ID NO:2编号)中的谷氨酸和/或第193位(使用SEQ ID N0:2编号)中的苏氨酸。优选碳酸酐酶中存在至少一个质子穿梭位置,更优选地存在至少两个质子穿梭位置,更优选地存在至少三个质子穿梭位置,且最优选地存在所有质子穿梭位置。预测以下半胱氨酸残基C44和C197(使用SEQ ID N0:2编号)参与半胱氨酸桥,并且因此对于碳酸酐酶的稳定性可以是重要的。先前在淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae) CA (Huanget 等,1998,J Mol Biol, 283:301-310)中鉴定出相应的半胱氨酸残基。在本发明的一个优选的实施方案中,碳酸酐酶含有第44位和第197位(使用SEQ IDNO:2编号)中的半胱氨酸。可以进行并测试单处或多处氨基酸取代,其使用诱变、重组、和/或改组的已知方法,接着是相关的筛选规程,如那些由Reidhaar-Olson和Sauer, 1988, Science241:53-57;Bowie 和 Sauer, 1989,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:2152-2156; W095/17413;或 W095/22625披露的筛选规程进行。可以使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如,Lowman等,1991, Biochem.30:10832-10837;美国专利 N0.5,223,409; W092/06204)、和区域指导的诱变(Derbyshire 等,1986, Gene46:145; Ner 等,1988, DNA7:127)。可以组合诱变/改组方法与高通量、自动化筛选方法以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性。可以使用本领域中的标准方法将编码活性多肽的诱变DNA分子自宿主细胞回收,并快速测序。这些方法容许快速测定感兴趣多肽中个别氨基酸残基的意义,并且可以应用于未知结构的多肽。上文所描述的Pers印honella碳酸酐酶可用于下文更为详细描述的一系列应用。在下文提及Persephonella碳酸酐酶或碳酸酐酶时,意图包括本发明中所描述的所有碳酸酐酶,特别若它们落入所要求保护的身份内。特别地,可以使用Persephonella碳酸酐酶来从CO2排放流,例如,从电力发电厂中基于碳的或基于碳氢化合物的燃烧,或者从此类工厂、工业炉、炉、灶、或壁炉的烟道气体烟囱/烟道或从飞机或汽车排气装置提取二氧化碳。也可以使用Persephonella碳酸酐酶来除去在工业用气如乙炔(C2H2)、一氧化碳(CO)、氯气(Cl2)、氢气(H2)、甲烷(CH4)、氧化亚氮(N2O)、丙烷(C3H8)、二氧化硫(SO2)、気(Ar)、氮(N2)、和氧气(O2)制备中的C02。也可以使用Persephonella碳酸酐酶在加工成天然气期间从粗天然气除去C02。从粗天然气除去CO2会用来富集天然气中的甲烷(CH4)含量,由此增加热单位/m3。一般地,粗天然气获自气油井、气井、和凝析井。天然气在通过常规方法自地质学天然气储层获得时含有1%至10%C02,但是根据天然来源或使用的回收方法,可以含有高至50%C02或甚至更高。也可以使用碳酸酐酶来纯化天然气,使得它基本上不含CO2,例如,使得CO2含量低于1%,优选地低于0.5%、0.2%、0.1%、0.05%,且最优选地低于0.02%。与天然气的甲烷富集类似,也可以使用碳酸酐酶来富集沼气中的甲烷含量。沼气总会含有相当程度的CO2,因为发酵过程中使用的细菌生成甲烷(60-70%)和CO2 (30-40%)。可以使用嗜温或嗜热微生物实施沼气生成。嗜热菌株容许于升高的温度,例如 40°C至80°C、或50°C至70°C、或55°C至60°C发生发酵。在此类过程中,热稳定性碳酸酐酶特别可用于自甲烷除去C02。本发明提供了 Persephonella碳酸酐酶降低沼气中二氧化碳含量的用途,优选地CO2含量降低为使得它构成小于25%、更优选地小于20%、15%、10%、5%、2%、1%、0.5%且最优选地小于0.1%。在一个优选的实施方案中,碳酸酐酶是热稳定的。此外,可以如下在合成气的生成中应用碳酸酐酶,即除去通过气化含碳燃料(例如,甲烷或天然气)生成的C02,由此富集合成气的CO、H2含量。在于升高的温度发生合成气生成的情况中,使用热稳定性碳酸酐酶是一项优点。本发明提供了碳酸酐酶降低合成气生成中二氧化碳含量的用途。优选CO2含量降低为使得它构成小于25%、更优选地小于20%、15%、10%、5%、2%、1%、0.5%且最优选地小于0.1%。在一个优选的实施方案中,碳酸酐酶是热稳定的。优选如上文所描述的要用于CO2提取的碳酸酐酶在IM NaHCO3缓冲液pH8中于高于45°C、优选高于50°C、高于55°C、高于60°C、高于65°C、更优选高于70V、最优选闻于80 C、最优选闻于90 C、最优选闻于100 C、最优选闻于105 C,且甚至最优选闻于110°C的温度于升高的温度温育至少15分钟、优选至少2小时、更优选至少24小时、更优选至少7天、更优选至少10天、甚至更优选至少14天、最优选至少30天、甚至最优选至少50天后维持至少30%、优选地高于40%、更优选地高于50%、更优选地高于60%、甚至更优选地高于70%、最优选地高于80%、最优选地高于85%、最优选地高于90%、最优选地高于95%的残余活性,且甚至最优选地残余活性不变。可以通过配制,例如,通过酶的固定化以某种程度提高碳酸酐酶的温度稳定性和/或寿命。在一个具体的实施方案中,本发明的碳酸酐酶(其可以用于CO2提取,如上文所描述的)在IM NaHCO3溶液(约pH8_10)中在温度范围25_90°C中温育15分钟时维持至少85%活性。于50°C,酶在pH范围4-11里维持完全活性达一天。于50°C在10天后,酶在pH范围4-11里维持超过50%活性。在本发明的一个方面,在基于酶的生物反应器中实施从含有CO2的介质提取C02。在生物反应器中加工含有二氧化碳的介质前,可以将其纯化至使其不含污染物,该污染物可以扰乱酶促反应或以其它方式(例如通过堵塞出口或膜)干扰生物反应器功能性。优选对自燃烧过程,例如,烟道气体或排气装置排放的气体/多相混合物清除灰分、颗粒、NOx和/或SO2,之后将气体/多相混合物通道生物反应器中。来自不同地区的粗天然气可以具有不同组成和分离需要。优选除去油、凝析油、水和天然气液体(若存在于粗天然气中的话),之后在基于酶的生物反应器中提取co2。自燃烧过程排放或存在于粗天然气的CO2可以在与脱硫相同的过程中提取,或者它可以在完全不同的过程中提取。若此点时的气体超过本发明碳酸酐酶的最适温度,则可以需要一定程度的冷却。在CO2提取过程期间碳酸酐酶暴露的温度(无论它是生物反应器中的工艺温度或是进料气温度)可为0°c-120°c。优选工艺温度是45°C -110°c,更优选50°C -100°c,更优选55°C _90°C,甚至更优选60°C -80°C,且最优选 65°C -75 °C。用于气体分离,包括CO2提取的反应器和工艺是本领域中公知的,并且在商业上用于各种目的(A.Kohl 和 R.Nielsen, Gas Purification,第 5 版,Gulf ProfessionalPublishing, Houston, TX, 1997)。存在着几种类型的反应器,其可以与本发明的碳酸酐酶组合以产生生物反应器 (包含生物学材料如酶的反应器),用于从气体,如燃烧气体或呼吸气体提取C02。因为碳酸酐酶改善CO2提取速率,所以与常规办法相比,组合碳酸酐酶与CO2提取反应器实现反应器和工艺改善,如较小的尺寸和较廉价的吸收模块(例如,较短的吸收柱)及使用低能量消耗和低挥发性载体液体以及总体较低的运行温度。一类反应器使用液膜。例如,这可以是包含含有液膜的中空纤维膜的反应器,如记载于 Majumdar 等,1988,AIChE34:1135-1145;US4, 750, 918;US6, 156,096;W004/104160的。此类基于中空纤维膜的设计有时又称作中空纤维液膜(HFLM),并且基于这些的CO2分离装置已经称作中空纤维纳入式液膜(HFCLM)渗透器。HFCLM渗透器的共同特征在于密封喂入和吹扫气流的中空纤维彼此接近(即,“紧密包装”或“直接相邻”),并且它们在单一刚性处理室中密封以形成一个完整的渗透器。在此类设计中,液体围绕紧密包装的喂入和吹扫中空纤维的壳侧。因为一个中空纤维的外侧壁间的距离与相邻中空纤维是非常接近的,所以它们间的液体层的厚度是与膜一样薄的,并且液体的组成仅容许某些组分通过,因此术语“液膜”已经用于描述中空纤维周围的液体。在本领域中也已经描述了纳入式液膜渗透器,其中液膜夹入两个结构支持膜间(Cowan等,2003,Ann.NY Acad.Sc1.984:453-469);此设计基本上以与HFCLM相同的方式发挥功能。纳入式液膜渗透器也已经与碳酸酐酶组合使用,如记载于US6,143,556,W02004/104160, Cowan等,2003, Ann.NY Acad.Sc1.984:453-469;及 Trachtenberg 等,2003,SAE international Conferenceon Environmental Systems Docket number2003_01-2499 的。在这些情况中,CO2 解吸步骤在与吸收步骤相同的密封处理室中发生。另一个例子描述了一种基于吸收塔/解吸塔(解吸塔)中空纤维膜模块的基于胺的CO2捕捉反应器(Kosaraju等,2005, Ind.Eng.Chem.Res.44:1250-1258)。另一类反应器使用直接气体-液体接触。例如,这可以是常规的基于溶剂的CO2捕捉反应器,其基于吸收塔/解吸塔柱反应器(US2008/0056972,Reddy等,SecondNational Conference on Carbon Sequestration, NETL/D0E, Alexandria, VA, 2003 年 5月 5-8 日)。在 A.Kohl 和 R.Nielsen, Gas Purification,第 5 版,Gulf ProfessionalPublishing, Houston, TX, 1997:57-62中显示了用于商业直接气体-流体接触器反应器的典型流程图,其使用链烷醇胺(如单乙醇胺、二乙醇胺、和甲基二乙醇胺)进行CO2提取。在A.Kohl和 R.Nielsen, Gas Purification,第 5版,Gulf Professional Publishing, Houston, TX, 1997:334-340中显示了用于商业直接气体-流体接触器反应器的典型流程图,其使用碱性盐溶液(如碳酸钾)进行CO2提取。使用碳酸酐酶的直接气体-液体接触反应器已经记载于 US6, 524,843;W02004/007058, W02004/056455, US7, 176,017,及 US2004/0059231。在此类反应器中,在如下的条件中使气相或多相混合物与液相接触,其中气相中的CO2被液相吸收,在那里通过碳酸酐酶将其转化成碳酸氢盐。通过连续流动从反应器取出富含碳酸氢盐的液体,以确保CO2和碳酸氢盐之间的平衡向CO2的连续转化转变。气相溶解于液相取决于气体与液体之间的表面接触面积。例如,可以通过将液体和含有CO2的气体通到高表面积填充的盘式或板式柱或塔,通过将液体小滴喷雾到含有CO2的气体(S卩,喷雾接触器),或者通过将含有CO2的气体鼓泡到液体(即,气泡罐或池),或者通过组合这些技术来实现大接触面积。填充柱可以包含填料如拉西环、弧鞍填料、勒辛(Iessing)环、英特洛克斯(intalox)金属、矩鞍填料、鲍尔环或工程填料如Q-PAC (Lantec Products, Inc., AgouraHills, CA91301)。填料材料可以由聚合物如尼龙、聚酯、聚乙烯、聚醚醚酮、聚丙烯、聚苯乙烯或含氟聚合物(例如聚四氟乙烯)、陶瓷如硅土、或金属如铝、碳钢、或不锈钢、或基于纤维素的材料如木纤维和棉纤维构成。在液体不断更换的反应器类型中或在期望阻止碳酸酐酶到反应器中的一个或多个位置时,可以通过各种手段将碳酸酐酶在反应器中保留。在填充柱中,碳酸酐酶可以在填料材料上固定化(用于固定化CA的方法,参见例如W02005/114417)。在“鼓泡”反应器中,碳酸酐酶可以在多孔基质,例如,不溶性凝胶颗粒如硅土、藻酸盐、藻酸盐/壳聚糖、藻酸盐/羧甲基纤维素中包埋,或碳酸酐酶可以在液体中在悬浮液中的固体填料(如在填充柱中)上固定化(通过共价键、离子电荷、包埋或包囊),或者碳酸酐酶可以在清蛋白或PEG网络中化学连接。也可以通过在聚合固定化材料中包埋来阻止碳酸酐酶到反应器中的特定位置,所述聚合固定化材料可以包含胶束或反胶束材料,如记载于W02010/037109。喷雾接触器可以包含垂直或水平喷雾室、逆流喷雾柱、文丘里洗涤器、喷射器或喷射洗涤器、旋风洗涤器、和喷雾干燥器(A.Kohl和R.Nielsen, GasPurification,第 5 版,Gulf Professional Publishing, Houston, TX, 1997:418-427 和604-616)。在避免压力下降和对气体(如在大气压的情况下,燃烧后排出气体)中固体微粒的耐受性是重要的时,使用喷雾接触器是期 望的。然而,为了最有效,喷雾接触器中的CO2吸收速率必须是快速的,并且碳酸酐酶可以提供需要的催化来实现这些快速的速率。
直接气体-液体接触反应器中的CO2提取可以牵涉第一吸收阶段,接着是任选地随后的解吸、沉淀、利用、收集、再生或释放阶段。吸收阶段的一般性描述如下。在吸收反应器运行时,含水液体在一端,优选地顶部进入反应器,并且流到另一端,优选地底部,而含有CO2的气体流(进料气)在一端,优选在与液体相反的末端(底部)逆流”)进入反应器,并且气体通到液体并离开,减去提取入液体中的CO2,到相反端(优选反应器顶部)的气体出口。离开吸收反应器的液体富含碳酸氢盐/碳酸盐(富含CO2的液体),并且与进料气相t匕,离开气体在CO2含量上降低。富含CO2的液体可以在随后的反应中加工,例如以通过通到解吸反应器来生成纯CO2,或者以生成碳酸盐沉淀物如CaC03。来自吸收反应器的富含CO2的液体也可以利用(例如,以增强藻类生成),收集(例如,通过将富含CO2的液体泵入纳入性地质学形成中进行),释放(例如,通过将富含CO2的液体泵入环境中,如从潜水艇生命支持系统将碳酸氢盐液体释放入海水中),蒸发或脱盐。含有碳酸氢盐阴离子的富含CO2的液体可以在工业方法中,如在碳酸铵和碳酸氢铵(其作为肥料是有用的)的制造方法中,或者在用于除去及中和酸性气体如二氧化硫的方法中使用。上文所描述的反应器可以仅牵涉吸收阶段、仅解吸阶段或吸收和接着的解吸阶段,其中碳酸酐酶可以催化CO2水合成碳酸氢盐或碳酸氢盐脱水成CO2或这两者。反应器可以彼此组合,其中每个反应器构成模块 。例如液膜反应器可以发挥吸收模块功能,而直接气体-液体接触反应器发挥解吸模块功能,或者反之亦然。不限制本发明的范围,提供图2以显示包含吸收和解吸模块两者的CO2提取反应器的一般性示意图,CO2吸收载体液体遍及所述CO2提取反应器循环,期间它在吸收塔中从含有CO2的气相(进料气)除去CO2,在解吸塔中释放纯化的CO2气体,然后再循环回到吸收塔。术语“进料气”经常与CO2提取反应器关联使用,其中它暗示通过与反应器中CO2贫乏的载体液体接触从含有CO2的气相除去co2。进料气可以处于大气压,或者处于高于或低于大气压的压力。CO2在载体液体中的选择性溶解度引起CO2从进料气提取入吸收塔中的载体液体中。在解吸塔中,通过引入降低载体液体中0)2溶解度的压力差(例如与进料气中的分压力相比解吸塔气相中CO2的分压力更低,如可以通过在解吸塔中应用真空来实现)和/或应用热(例如经由再沸器)、蒸汽或吹扫气体驱动CO2进入解吸塔中的气相中从载体液体释放C02。可以仅使用热能来驱动解吸,如在基于单乙醇胺的CO2提取过程中通常使用。例如,典型的基于单乙醇胺的CO2提取的解吸塔中的温度大于100°C (例如,120°C)。或者,可以组合热能与压力降低以驱动解吸,在此情况中,可以降低解吸塔中的温度。例如,连同降低的压力(例如,真空),与吸收塔中的压力(例如,大气压)相比,可以于70°c运行解吸塔。可以使用PH的差异来促进吸收和解吸,其中CO2吸收入水性介质中于更为碱性的pH是有利的,而自水性介质的CO2解吸于不太碱性的(更为酸性的)pH是有利的。吸收和解吸之间的相关PH差异(“摆动”)范围取决于特定的过程。例如,为了例示,CO2吸收入基于碳酸氢盐的载体液体中可以于PH9或之上发生,导致所述载体液体的pH降低到低于pH9。然后,从所述载体液体解吸CO2可以于低于pH9的pH发生。在通到吸收塔的进料气的压力高于解吸塔中的气相压力时可以建立/发生吸收塔和解吸塔之间的压力差。在一些情况中,如对于天然气升级,吸收塔中的气体压力高于在解吸塔中,并且吸收塔和解吸塔两者中的气体压力可以高于大气压。在其它情况中,吸收塔中的气体压力高于大气压,而解吸塔中的气体压力处于或低于大气压(即,等于或小于lOOkPa)。或者,以在通到吸收塔的进料气(如烧煤的燃烧后烟道气体)的压力近似处于大气压,而解吸塔中的气相压力低于大气压时建立/发生吸收塔和解吸塔之间的压力差。在本发明的一个实施方案中,吸收塔和解吸塔之间的总气体压力差是至少约35kPa。图2中示意性显示的吸收塔和解吸塔可以处于基本上相同(“等温”)温度或处于不同温度。Persephonella碳酸酐酶可以仅存在于吸收塔或解吸塔中或这两者中。在存在高温碳酸酐酶如Persephonella碳酸酐酶的解吸塔中使用真空(低压)于较低的温度(例如70°C )再生CO2是本发明的又一个实施方案。此类过程中的碳酸酐酶催化CO2吸收到吸收溶剂及从吸收溶剂解吸CO2两者。在吸收塔和解吸塔处于不同温度时,可以使用温度调节器(例如,热交换器)来保存过程中的能量。在进一步的例示中,用于H2S吸收的真空碳酸盐方法的修改(A.Kohl和R.Nielsen, Gas Purification,第 5版,Gulf Professional Publishing, Houston, TX, 1997:383-388)已经描述用于CO2提取(US2007/0256559),并且与碳酸酐酶组合披露(Lu等,DOEProject N0.DE-FC26-08NT0005498, NETL C02Capture Technology for Existing PlantsR&D Meeting, 2009年3月24-26日,Pittsburgh, PA)。在此例示中,大气压发电厂烟道气体在吸收塔柱中于范围40至60°C的温度接触水性碳酸钾和碳酸酐酶,其中碳酸酐酶被说成改善CO2水合载体液体中碳酸氢盐的速率。将富含CO2的载体液体泵到解吸塔柱(“汽提塔(stripper)”),其中通过低压(例如14_55KPa)和应用热(例如,50_70°C )的组合从载体液体释放CO2,所述组合通过直接注射来自发电厂低压汽轮机的低压、低质量废汽获得。来自本发明Pers印honella的碳酸酐酶特别适合于用于所描述的改良真空碳酸盐方法,因为Persephonella碳酸酐酶可以耐受吸收塔和解吸塔两者中的温度,这意味着与会被解吸塔中的温度灭活的其它已知碳酸酐酶不同,Persephonella碳酸酐酶可以耐受解吸塔中的温度,容许其与载体液体一起遍及方法的吸收和解吸阶段两者循环。Persephonella碳酸酐酶遍及整个反应器与载体液体一起遍及高和低温区域不断循环的能力给予添加的优点,即,可以使用开发的喷雾塔/室反应器构造,其消除对填充材料的需要。可以组合物理搅拌(包括超声搅拌)与真空和/或热以增强CO2从解吸塔中载体液体的释放。又一类反应器使用与碳酸酐酶的CO2水合催化及随后的沉淀组合的膜。在一种情况中,通过将气流通过气体扩散膜进入溶液中从气流除去CO2,其中通过在含有碳酸酐酶的基质上通过CO2溶液,并添加矿物离子以引起碳酸盐沉淀来加速转化(US7,132,090)。已经进一步显示了碳酸酐酶不仅可以催化CO2水合/脱水反应,而且还可以促进碳酸钙沉淀(Mirjafari 等,2007,Ind.Eng.Che.Res.,46:921-926)。又一类反应器从环境空气除去C02。已经报告了设计用于从环境空气除去CO2的反应器(Stolaroff 等 2008Environ.Sc1.Technol.,42:2728-2735),然而,此反应器并不利用碳酸酐酶。不限于报告的环境空气反应器的设计,如本发明中公开的与合适的载体液体组合的碳酸酐酶可以在此类反应器中或在其它反应器设计中使用,如本文中描述的。热稳定性碳酸酐酶是特别有用的,因为将反应器暴露于环境条件(如阳光)可以提高液体温度,超出已知碳酸酐酶的耐受性,而且避免对冷却反应器的需要。这例示了如下的情况,其中从含有CO2的介质提取CO2的过程可能需要碳酸酐酶于如下的温度发挥功能或耐受如下的温度,所述温度高于含有CO2的介质, 如环境空气的初始温度,其可以是夜间冷(低于10°C )而白天期间热的(高于45°C )。
上文所描述的不同膜反应器和直接气体-液体接触反应器及其它备选可以在二氧化碳提取过程中应用,其中吸收过程和解吸过程在至少两个步骤中发生。一般地,此类反应器包含下列元件:a)至少一个吸收模块,其可以包含气体入口区和/或气体出口区;b)至少一个解吸模块,其包含气体出口区;c)载体液体;和d)用于连接所述吸收模块和所述解吸模块,使得所述载体液体可以从所述吸收模块通到所述解吸模块的手段。任选地,用于连接吸收和解吸模块的手段是回路,容许一旦载体液体已经通过解吸模块,其返回到吸收模块。一种或者这两种模块可以包含至少一个分开气相与液相的CO2-渗透膜,如记载于W02010/014773和W02010/014774。此模块类型也称作气体-液膜(GLM)模块。例如,GLM模块可以为中空纤维膜、平板膜或螺捲式膜形式。GLM模块可以发挥吸收塔模块和/或解吸塔模块功能。或者,模块之一可以是GLM模块,而另一模块可以构成为使得气相和液相处于直接接触中或者换言之气体-液体界面未由膜分开。此模块类型也称作直接气体-液体接触(DGLC)模块或仅直接接触(DC)模块。例如,DGLC模块可以为用容许气体-液体接触的填充材料填充的柱,和/或装备有用于将气体暴露于液体的入口的含液体容器(如气泡柱)、和/或液体-喷雾(如喷雾塔)和/或充气器模块和/或降膜形式。DGLC模块可以发挥吸收塔模块或解吸塔模块功能。泡罩系统、筛板系统、圆盘-圆环柱(disk-and-doughnutcolumn)和填充柱是直接气体-液体接触模块(DGLC)的例子。上文所描述的反应器类型可以于任何期望的温度操作。在一个实施方案中,反应器以(TC -120°c或5°C -110°c、更优选地10°C -100°C、更优选地20°C -95°C、更优选地300C -90°C、更优选地40°C -85°C、更优选地50°C -80°C、更优选地55°C -75°C、且最优选地600C _70°C的与碳酸酐酶接触和/或含有碳酸酐酶的液体的温度操作。CO2的吸收和解吸速率依赖于载体液体中的pH。在就本发明而言描述的反应器类型中,CO2贫乏的载体液体的pH是PH4-12,优选地高于pH7 (如于室温,例如,20_25°C测量的),更优选地高于PH8,更优选地8-12,更优选地8-10.5,更优选地8.5-10,甚至更优选地9-9.5。由于吸收期间CO2水合为碳酸(其在水中立即解离成碳酸氢盐),载体液体的pH随着富含CO2的载体液体的碳含量增加而降低。pH的程度随载体液体的缓冲容量和吸收的CO2量而降低。在本发明的 一个优选的实施方案中,载体液体是碳酸氢盐缓冲液,如碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢铯、碳酸氢铵或碳酸氢盐的另一种合适的盐,其中根据pH,或多或少量的碳酸盐和/或碳酸会与碳酸氢盐一起存在。在本发明的一个实施方案中,富含CO2的载体液体通到解吸阶段,其中富含CO2的载体液体的PH会随CO2释放而升高。为了将载体液体再循环到此类吸收-解吸系统,优选的是载体液体的PH回到CO2贫乏的载体液体的pH,之后再次通到吸收阶段。在本发明的一个优选的实施方案中,给反应器装备用于调节载体液体中pH的手段。这可以以几种方式实施。一种方式是使用自动PH调节设备如自动滴定器将碱性物质添加至载体液体,例如,在图2中标示的辅助组分添加点之一(13a)处。优选碱性物质与在系统中循环载体液体具有相似的组成(例如,溶剂浓度、离子强度、碳酸酐酶量等),并且可以在吸收前的任何时间时添加以调节pH。类似地,可以在解吸前的任何时间将中性至酸性物质添加至载体液体,例如,在图2中标示的辅助组分添加点之一(13b)处。若需要的话,可以从系统除去额外的载体液体,例如,在图2中标示的除去点之一(14)处。在上文所描述的CO2捕获过程中,本发明的Pers印honella碳酸酐酶可以与一种或多种其它碳酸酐酶组合。整个CO2捕获过程中的不同工艺步骤可以需要不同运行条件,例如,温度、pH、载体液体组成、压力,等等。本发明的碳酸酐酶可以与其它碳酸酐酶组合,所述其它碳酸酐酶于CO2捕获过程中需要的不同最佳条件运行。例如,一种碳酸酐酶可以在载体液体中循环,而不同碳酸酐酶可以在反应器中的一个或多个位置处固定化。本发明的碳酸酐酶或包含本发明碳酸酐酶的上文所描述基于酶的生物反应器如在飞行员座舱、潜水艇舰、水生设备、安全和消防设备及宇航员太空服和人工肺装置中也得到更加非常规的应用以保持不含毒性CO2水平的呼吸用空气。其它应用是从有限空间除去C02,如从啤酒厂内和实施发酵的密闭建筑,以及从CO2敏感性环境如博物馆和图书馆降低危险CO2水平,阻止过多的CO2引起对书和艺术品的酸损害。又一种备选的应用是从热的环境空气(例如在沙漠中)除去C02。在此情况中,碳酸酐酶可以例如包含在适合于从环境空气提取 CO2 的反应器中,如记载于 Stolaroff 等 2008Environ.Sc1.Technol.,42,2728-2735的,此类反应器可以例如采取“人工树”或风车形式,如记载于W02008/041920的。Persephone I Ia碳酸酐酶可以作为独立的CO2提取催化剂使用或者它可以备选地与常规的CO2提取技术如经由基于胺的溶剂或氨水或物理溶剂如Selexol (UnionCarbide)或聚乙二醇醚的化学吸收组合。在本发明的又一个实施方案中,Persephonella碳酸酐酶is combined与二氧化碳吸收化合物如基于胺的化合物例如水性链烷醇胺,包括单乙醇胺(MEA)、二乙醇胺(DEA)、甲基二乙醇胺(MDEA)、2_氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇(Tris)、二甘醇胺(DGA)、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)、2_氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇(AHPD)、二异丙醇胺(DIPA)、N-甲基氨基丙酸或N,N-二甲基氨基乙酸的水性可溶性盐(例如钠或钾盐)或N-甲基丙氨酸、N-甲基甘氨酸、β -丙氨酸(3-氨基丙酸)或其它天然或经修饰的氨基酸(例如N-取代的氨基酸衍生物)、2_(2-氨乙基氨基)乙醇(AEE)、三乙醇胺(TEA)或其它基于伯、仲、叔或受阻胺的溶剂,包括那些在US4,112,052 (在此通过提述并入)的第7页至第9页上描述的,或甘氨酸的水性可溶性盐(例如甘氨酸钠或钾)和牛磺酸或其它液体吸收塔如水性Na0H、K0H、Li0H、不同离子强度、摩尔浓度(范围为稀释溶液至高度浓缩的溶液,高至盐的溶解度限度,其可以随温度而变化)的盐碳酸盐(例如钠、钾、或铵)或碳酸氢盐盐溶液,或水性电解质溶液和促进剂如哌嗪、或聚乙二醇醚、或它们的混合物或其类似物或混合物。水性可溶性盐和溶剂可以与PH缓冲和矿物螯合化合物,如磷酸盐盐、多磷酸盐盐和硼酸盐盐组合,以提供混合的盐溶液,如碳酸氢钾与磷酸钾。水性可溶性盐和溶剂可以与简单的电解质(例如碱卤化物,如NaCl、KC1、和金属卤化物,如ZnCl组合)。组合可以在上文所描述的生物反应器中应用或者它可以基于常规技术应用于已经存在的CO2洗涤设施。在常规的生物反应器中,链烷醇胺的浓度通常是15-30重量百分比。在本发明的一个实施方案中,链烷醇胺的浓度可以在常规的范围中或者优选地处于较低的浓度如优选地低于 15%(V/V),更优选地低于 12%, 10%, 8%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.2% 且最优选地低于0.1%(V/V)。
在常规方法中,添加腐蚀和氧化抑制剂(如Fluor Daniel的专有EconAmine FG溶剂中含有的)以提供增加胺浓度,同时降低腐蚀风险。无机腐蚀抑制剂包括钒(例如,偏钒酸钠)、锑、铜、钴、锡、和硫化合物。有机腐蚀抑制剂包括硫脲和水杨酸。其它辅助载体液体组分可以包括润湿剂、螯合剂(例如乙二胺四乙酸、多磷酸盐盐)、和减粘剂、及能够提高CO2进入或离开载体液体的流量的其它化合物。
在常规方法中,通常采用降低和/或避免泡沫形成的技术。这些包括在CO2提取前除去引起泡沫的杂质,并使用消泡剂和抑泡剂如硅酮化合物或高沸醇如油醇或辛基苯氧乙酉享(A.Kohl 和 R.Nielsen, Gas Purification,第 5 版,Gulf Professional Publishing,Houston, TX, 1997:224-230)。本发明的另一方面涉及沼气生成,其中在沼气发酵液中直接实施CO2提取,作为将沼气通到如上文所描述的生物反应器的备选。通过将Persephonella碳酸酐酶添加至厌氧培养基,可以将更多来自气相的CO2转化成碳酸氢盐,其是产甲烷古细菌生成甲烧的底物。特别地,甲烧八叠球菌属(Methanosarcina)经常存在于嗜热沼气池中(Mladenovska和 Ahring, 2000, FEMS Microbiol.Ecol.3:225-229)。已经对嗜热甲烷八叠球菌(Methanosarcina thermophila)TM-1显不了碳酸氢盐可以是甲烧生成的一项限制因素,例如低碳酸氢盐溶液(0.6mM)中培养的嗜热甲烷八叠球菌TM-1培养物在与含有高10倍的碳酸氢盐剂量(6mM)的培养物相比时显示相当长的延滞期(即,甲烷生成较晚开始)。另夕卜,甲烧的总产量在较低碳酸氢盐剂量时小25倍(Murray和Zinder, 1985, Appl.Environ.Microbiol.50:49-55)。因此,若使用一种或多种嗜热微生物,例如产甲烷菌,如可以使用CO2/碳酸氢盐作为生长和产甲烷碳源的甲烷八叠球菌物种于升高的温度实施沼气生成,则热稳定性碳酸酐酶会是特别有用的。本发明的又一个实施方案是本发明的Persephonella碳酸酐酶作为添加剂在沼气发酵液中的用途。本发明的又一个实施方案是Persephonella碳酸酐酶增强藻类和其它利用碳酸氢盐作为碳源的其它水生植物生长的用途,其通过在水生植物环境中或者为了递送至水生植物环境将CO2转化成碳酸氢盐来进行。例如,可以使用此办法来同时从燃烧排出气,如烟道气体除去CO2,并为转化成碳酸氢盐提供CO2,其通过使排出气与来自养殖池的液体接触来进行。培养藻类和水生植物的某些办法牵涉使用密闭管或浅槽或池,其中来自阳光的热提高水温。因此,热稳定性碳酸酐酶于升高的培养温度是特别有用的。

多核苷酸本发明还涉及编码具有碳酸酐酶活性的多肽的分离的或合成的多核苷酸。用于分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术是本领域中已知的,并且包括自基因组DNA分离、自cDNA制备、或其组合。可以例如如下实现自此类基因组DNA克隆多核苷酸,即使用公知的聚合酶链式反应(PCR)或者表达文库的抗体筛选以检测具有共享结构特征的克隆DNA片段。见例如Innis等,1990,PCR:A Guide to Methods andApplication, Academic Press, New York。可以使用其它核酸扩增规程如连接酶链式反应(LCR)、连接活化的转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。可以从Pers印honella菌株,或另一种或相关生物体克隆多核苷酸,并且如此,例如其可以是多核苷酸的多肽编码区的等位或物种变体。在一个优选的实施方案中,本发明的多核苷酸是合成的多核苷酸,其已经经过密码子优化以提高在选定宿主细胞中的表达。宿主细胞可以选自下文部分“宿主细胞”。在一个优选的实施方案中,宿主细胞是芽孢杆菌属的,更优选地它是物种枯草芽孢杆菌的。用于密码子优化编码多肽的多核苷酸的技术是本领域中已知的,并且记载于例如W02006/066595 及 Gustafsson 等,2004, Trends in Biotechnology22:346-353。
本发明还涉及编码具有碳酸酐酶活性的多肽的分离的或合成的多核苷酸,其中多核苷酸选自下组:a)通过SEQ ID NO:1密码子优化获得的多核苷酸,其中经密码子优化的多核苷酸的核苷酸序列与 SEQ ID NO:1 是至少 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 相同的;或 b)具有与 SEQ ID NO: 3 的核酸残基 88 至 653 对应的核苷酸序列的多核苷酸;或c)与SEQ ID NO: 3的核酸残基88至653至少85%,90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 或 100% 相同的多核苷酸;或 d) (a)或(b)中编码具有碳酸酐酶活性的多肽的片段。在一方面,多核苷酸包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 3的核酸残基88至653或SEQ ID NO:3中编码具有碳酸酐酶活性的SEQ ID NO:4片段的亚序列或由其组成。核酸构建体本发明还涉及包含与一个或多个(几个)控制序列可操作连接的本发明多核苷酸的核酸构建体,所述控制序列在与控制序列相容的条件下在适合的宿主细胞中指导编码序列的表达。可以以多种方式操作多核苷酸以提供多肽的表达。根据表达载体,多核苷酸在其插入载体中前的操作可以是期望的或必需的。利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域中公知的。控制序列可以是启动子序列,即由宿主细胞识别以表达编码本发明多肽的多核苷酸的多核苷酸。启动子序列含有介导多肽表达的转录控制序列。启动子可以是在选择的宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸,包括突变体、截短的、和杂合启动子,并且可以获自编码对于宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因。适合于指导本发明的核酸构建体在细菌宿主细胞中转录的启动子的例子是获自解淀粉芽孢杆菌(Bacillu s amyloliquefaciens) α -淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) α -淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)麦芽糖源性淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖鹿糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、大肠杆菌Iac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因(dagA)、和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff 等,1978, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA75:3727-3731),及 tac 启动子(DeBoer 等,1983,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA80:21-25)的启动子。其它启动子记载于“Useful proteins from recombinant bacteria,,于 Gilbert 等,1980,ScientificAmerican, 242:74-94 ;及于 Sambrook 等,1989,见上文。适合于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的启动子的例子是获自构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α -淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α -淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉(Aspergillus oryzae) TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(W096/00787)、镶片镰抱(Fusarium venenatum)淀粉葡萄糖苷酶(W000/56900)、壤片键抱 Daria (W000/56900)、镶片镰孢Quinn(W000/56900)、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉(Trichoderma reesei) β -糖苷酶、里氏木霉纤维素生物水解酶1、里氏木霉纤维素生物水解酶I1、里氏木霉内切葡聚糖酶1、里氏木霉内切葡聚糖酶I1、里氏木霉内切葡聚糖酶II1、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶1、里氏木霉木聚糖酶I1、里氏木霉β-木糖苷酶基因的启动子、及NA2-tpi启动子(一种经修饰的启动子,其包含编码曲霉中的中性α -淀粉酶的基因,其中非翻译前导物已经用来自编码曲霉中丙糖磷酸异构酶的基因的非翻译前导物替换;非限制性例子包括包含黑曲霉中中性α-淀粉酶的基因的经修饰的启动子,其中非翻译前导物已经用来自编码构巢曲霉或米曲霉中丙糖磷酸异构酶的基因的非翻译前导物替换);及其突变体、截短的、和杂合启动子。在酵母宿主中,有用的启动子获自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)烯醇化酶(EN0-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GALl)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1,ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUPl)JP酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因。其它对于酵母宿主细胞有用的启动子由Romanos等,1992,Yeast8:423-488 描述。控制序列也可以是合适的转录终止子序列,其由宿主细胞识别以终止转录。终止子序列与编码多肽的多核苷酸的3端可操作连接。在选择的宿主细胞中功能性的任何终止子可以在本发明中使用。丝状真菌宿主细胞的优选终止子获自构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α -糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、和尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶基因。用于酵母宿主细胞的优选终止子获自酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C (CYCl)、和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因。其它对于酵母宿主细胞有用的终止子由Romanos等,1992,见上文描述。控制序列也可以是合适的前导序列,其在转录时是对于宿主细胞翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列与编码多肽的多核苷酸的5’端可操作连接。可以使用在选择的宿主细胞中功能性的任何前导序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选前导物获自米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因。适合于酵母宿主细胞的前导物获自酿酒酵母烯醇化酶(EN0-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子、和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)的基因。控制序列也可以是多聚腺苷酸化序列,即与多核苷酸的3’端可操作连接的序列,并且在转录时被宿主细胞识别为对转录的mRNA添加多聚腺苷酸残基的信号。可以使用在选择的宿主细胞中功能性的任何多聚腺苷酸化序列。用于丝状真菌宿主细胞的优选多聚腺苷酸化序列获自米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、和黑曲霉α-葡萄糖苷酶的基因。对于酵母宿主细胞有用的多聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman, 1995, Mol.Cellular Biol.15:5983-5990 描述。控制序列也可以是信号肽编码区,其编码与多肽的N端连接的信号肽,并且指导多肽进入细胞分泌途径。多核苷酸编码序列的5’端可以固有含有在翻译阅读框中与编码多肽的编码序列段天然连接的信号肽编码序列。或者,编码序列的5’端可以含有对于编码序列而言外来的信号肽编码序列。在编码序列不天然含有信号肽编码序列的情况中可能需要外来的信号肽编码序列。或者,外来的信号肽编码序列可以简单替换天然的信号肽编码序列以增强多肽的分泌。然而,可以使用指导表达的多肽进入选择的宿主细胞的分泌途径中的任何信号肽编码序列。对于细菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是获自芽孢杆菌NCIB11837麦芽糖源性淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌ct -淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT, nprS, nprM)、和枯草芽孢杆菌prsA基因的信号妝编码序列。其它信号妝由Simonen和Palva, 1993, MicrobiologicalReviews57:109-137 描述。

对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是获自黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉(Humicola insolens)纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)脂肪酶、和曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶基因的信号肽编码序列。对于酵母宿主细胞有用的信号肽获自酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因。其它有用的信号肽编码序列由Romanos等,1992,见上文描述。控制序列也可以是前肽编码序列,其编码位于多肽N段的前肽。所得的多肽称为酶原或多肽原(或在一些情况中为酶原)。多肽原一般是无活性的,并且可以通过从多肽原催化或自身催化切割前肽而转化成活性多肽。前肽编码序列可以获自枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)漆酶(W095/33836)、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、和酿酒酵母α -因子的基因。在信号肽和前肽序列两者都存在于多肽N端的情况中,前肽序列紧邻多肽N端定位,而信号肽序列紧邻前肽序列N端定位。也可以期望添加调节序列,其容许调节相对于宿主细胞生长的多肽表达。调节系统的例子是那些引起基因表达响应化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的。原核系统中的调节系统包括lac、tac、和trp操纵基因系统。在酵母中,可以使用ADH2系统或GALl系统。在丝状真菌中,可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAa-淀粉酶启动子、和米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其它例子是那些容许基因扩增的。在真核系统中,这些调节序列包括在存在甲氨蝶呤的情况中扩增的二氢叶酸还原酶基因,和在重金属情况下扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中,编码多肽的多核苷酸会与调节序列可操作连接。表达载体本发明还涉及重组表达载体,其包含本发明的多核苷酸、启动子、和转录和翻译终止信号。可以将各种核苷酸和控制序列连接在一起以生成重组表达载体,其可以包含一个或多个(几个)方便的限制性位点以容许在此类位点处插入或取代编码多肽的多核苷酸。或者,可以通过将多核苷酸或包含该序列的核酸构建体插入适合于表达的载体中来表达多核苷酸。在创建表达载体中,编码序列位于载体中,使得编码序列与适合于表达的控制序列可操作连接。重组表达载体可以是任何载体(例如,质粒或病毒),其可以方便地进行重组DNA规程,而且可以引起多核苷酸的表达。载体的选择通常会依赖于载体与要接受载体导入的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭合环状质粒。载体可以是其复制不依赖于染色体复制的自主复制型载体,即以染色体外实体存在的载体,例如,质粒、染色体外元件、微型染色体、或人工染色体。载体可以含有用于确保自身复制的任何手段。或者,载体可以是在导入宿主细胞中时整合入基因组中,并且与已经接受其整合的染色体一起复制的载体。此外,可以使用单一载体或质粒或共同含有要引入宿主细胞基因组中的总DNA的两个以上载体或质粒,或转座子。优选载体含有一个或多个(几个)选择标志,其容许容易地选择经转化的、经转染的、经转导的细胞,等等。选择标志是一种如下的基因,其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对 营养缺陷型的原养性,等等。细菌选择标志的例子是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因、或赋予抗生素抗性如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、或四环素抗性的标志物。适合于酵母宿主细胞的标志物是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、和URA3。在丝状真菌宿主细胞中使用的选择标志包括但不限于amdS (乙酰胺酶)、argB (鸟氨酸氨甲酰转移酶)、bar (膦丝菌素乙酰转移酶)、hph (潮霉素磷酸转移酶)、niaD (硝酸还原酶)、pyrG (乳清苷-5’ -磷酸脱羧酶)、SC (硫酸腺嘌呤转移酶)、trpC (邻氨基苯甲酸合酶)、及其等同物。优选用于曲霉细胞的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。优选载体含有容许载体整合入宿主细胞基因组中或载体在细胞中不依赖于基因组的自主复制的元件。对于整合入宿主细胞基因组中,载体可以依赖于编码多肽的核苷酸序列或载体中通过同源或非同源重组来整合入基因组中的任何其它元件。或者,载体可以含有用于指导通过同源重组在染色体中的精确位置处整合入宿主细胞基因组中的其它核苷酸序列。其它核苷酸序列使载体能够在染色体中的精确位置处整合入宿主细胞基因组中。为了增加在精确位置处整合的可能性,整合元件应当含有足够数目的核酸,如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对和800至10,000个碱基对,其与相应的靶序列具有高度序列同一性,以增强同源重组的可能性。整合元件可以是与宿主细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。此外,整合元件可以是非编码或编码多核苷酸。另一方面,可以通过非同源重组将载体整合入宿主细胞基因组中。为了自主复制,载体可以进一步包含复制起点,其使载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制。复制起点可以是在细胞中发挥功能的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。细菌复制起点的例子是质粒pBR322、pUC19、pACYC177、和pACYC184 (容许在大肠杆菌中复制),和PUB110、pE194、pTA1060、和ρΑΜβ I (容许在芽孢杆菌中复制)的复制起点。用于酵母宿主细胞的复制起点的例子是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合、以及ARS4和CEN6的组合。可用于丝状真菌细胞的复制起点的例子是AMAl和ANSI(Gems 等,1991,Gene98:61_67;Cullen 等,1987,Nucleic AcidsRes.15:9163-9175 ;W000/24883)。可以依照W000/24883中披露的方法来实现AMAl基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。可以将超过一个拷贝的本发明多核苷酸插入宿主细胞中以提高多肽的生成。可以如下获得多核苷酸的拷贝数目增加,即将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组中或者与核苷酸序列一起纳入可扩增选择标志基因,其中可以通过在存在合适的选择剂的情况中培养细胞来选择含有选择标志基因的扩增拷贝,及由此额外拷贝的多核苷酸的细胞。用于连接上文所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的规程是本领域技术人员公知的(见例如Sambrook等,1989,见上文)。宿主细胞本发明还涉及重组宿主细胞,其包含与一个或多个(几个)控制序列可操作连接的本发明的多核苷酸,所述控制序列指导本发明的多肽生成。可以将包含多核苷酸的构建体或载体导入宿主细胞中,使得将构建体或载体作为染色体整合物或作为自身复制型染色体外载体维持,如较早描述的。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的任何亲本细胞后代。宿主细胞的选择在很大程度上会取决于编码多肽的基因及其来源。宿主细胞可以是可用于重组生成本发明多肽的任何细胞,例如,原核生物或真核生物。原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于芽孢杆菌属、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽抱杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、和链霉菌属(Streptomyces)。革兰氏阴性细菌包括但不限于弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌、黄杆菌属(Flavobact erium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、和服原体属(Ureaplasma)。细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌细胞,包括但不限于碱性杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、和苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)细胞。细菌宿主细胞也可以是任何链球菌细胞,包括但不限于似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿胺链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)、和马链球菌兽痕亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)细胞。细菌宿主细胞也可以是任何链霉菌细胞,包括但不限于不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、和浅青紫链霉菌(Streptomyces Iividans)细胞。可以例如通过原生质体转化(见例如Chang和Cohen, 1979, Mol.Gen.Genet.168:111-115)、通过使用感受态细胞(见例如 Young 和 Spizizen, 1961, J.Bacteriol.81:823-829,或 Dubnau和 Davidoff-Abelson, 1971, J.Mol.Biol.56:209-221)、通过电穿孔(见例如 Shigekawa 和 Dower, 1988, Biotechniques6:742-751)、或通过接合(见例如 Koehler 和 Thorne, 1987, J.Bacteriol.169:5271-5278)实现 DNA 对芽孢杆菌细胞的导入。例如,可以通过原生质体转化(见例如Hanahan,1983,J.Mol.Biol.166:557-580)或电穿孔(见例如Dower等,1988,Nucleic Acids Res.16:6127-6145)实现DNA对大肠杆菌细胞的导入。例如,可以通过原生质体转化和电穿孔(见例如Gong等,2004,Folia Microbiol.(Praha) 49:399-405),通过接合(见例如Mazodier 等,1989, J.Bacteriol.171:3583-3585),或者通过转导(见例如 Burke 等,2001, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA98:6289-6294)实现DNA对链霉菌细胞的导入。例如,可以通过电穿孔(见例如 Choi 等,2006, J.Microbiol.Methods64:391-397)或通过接合(见例如 Pinedo 和Smets, 2005, Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)实现DNA对假单胞菌细胞的导入。例如,可以通过天然感受态(见例如 Perry and Kuramitsu, 1981, Infect.Tmmun.32:1295-1297),通过原生质体转化(见例如Catt and Jollick, 1991,Microbios68:189-207,通过电穿孔(见例如 Buckley 等,1999, Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或通过接合(见例如Clewell, 1981, Microbiol.Rev.45:409-436)实现DNA对链球菌细胞的导入。然而,可以使用本领域中已知的用于将DNA导入宿主细胞中的任何方法。生成方法本发明还涉及生成本发明多肽的方法,包括:(a)在有益于多肽生成的条件下培养细胞,其在其野生型形式中生成多肽;并(b)回收多肽。在一个优选的方面,细胞是Persephonella属的。在一个更优选的方面,细胞是Persephonella marina、Persephonella hydr ogeniphila 或 Persephonella guaymasensis。在一个最优选的方面,细胞是 Persephonella marina DSM14350、Persephonella hydrogeniphila DSM15103 或Persephonella guaymasensis DSM14351。本发明还涉及生成本发明多肽的方法,包括:(a)在有益于多肽生成的条件下培养本发明的重组宿主细胞;并(b)回收多肽。使用本领域中公知的方法在适合于多肽生成的营养培养基中培养宿主细胞。例如,可以通过摇瓶培养培养细胞,并在合适培养基中且在容许多肽表达和/或分离的条件下实施实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料-分批、或固态发酵)。使用本领域中已知的规程在包含碳源和氮源及无机盐的合适营养培养基中发生培养。合适的培养基可购自商业供应商或者可以依照公开的组成制备(例如,在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中)。若多肽分泌到营养培养基中,则可以自培养基直接回收多肽。若多肽不是分泌性的,则可以自细胞裂解物将其回收。使用本领域中已知的对多肽特异性的方法来检测多肽。这些检测方法可以包括使用特异性抗体、形成酶产物、或者酶底物消失。例如,可以使用酶测定法来测定多肽的活性。
可以使用本领域中已知的方法来回收多肽。例如,可以通过常规的规程,包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾-干燥、蒸发、或沉淀自营养培养基回收多肽。可以通过本领域中已知的多种规程纯化多肽,所述规程包括但不限于层析(例如,离子交换、亲和、疏水性、色谱聚焦、和大小排阻)、电泳规程(例如,制备用等电聚焦)、差别溶解度(例如,硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或提取(见例如Protein Purification, J.-C.Janson 和 Lars Ryden 编,VCH Publishers, New York, 1989)以获得基本上纯的多妝。在一个备选的方面,可以自宿主细胞与其它多肽和/或发酵产物一起生成本发明的多肽以提供非纯化的或最小程度纯化的混合物,其生成可能没有基本上纯的多肽昂贵,同时仍提供期望的碳酸酐酶性能。在一个备选的方面,不回收多肽,而是使用表达多肽的本发明宿主细胞作为多肽的来源。包含多肽的组合物及其制备方法本发明提供了包含本发明Pers印honella碳酸酐酶和优选地赋形剂的组合物及用于制备所述组合物的方法,所述方法包括混合本发明的多肽与赋形剂。在一个具体的实施方案中,本发明的Pers印honella碳酸酐酶是组合物的主要(多肽)组分,例如,单组分组合物。在一种单组分组合物中,本发明的Persephonella碳酸酐酶优选地构成至少80%的碳酸酐酶活性,更优选至少90%,甚至更优选至少95%,且最优选地100%碳酸酐酶活性。此背景中的赋形剂应当理解为用于配制组合物的任何辅助剂或化合物,并且包括溶剂(例如,水、无机盐、 填充剂、色素、蜡)、载体、稳定剂、交联剂、粘合剂、防腐剂、缓冲剂,等等。组合物可以进一步包含一种或多种其它酶,如一种或多种其它碳酸酐酶、脱羧酶、漆酶、或氧化酶。组合物可以依照本领域中已知的方法来制备,并且可以为液体或固体组合物形式。例如,可以使用本领域已知的将技术酶和/或药用产品例如配制成包被或未包被的颗粒剂或微颗粒剂的方法来配制酶组合物。如此,本发明的多肽可以以颗粒剂,优选地非粉化颗粒剂、液体,特别是固定化液体、浆体或受保护的多肽形式提供。对于某些应用,多肽的固定化可以是优选的。固定化酶包含两种基本功能,即设计为帮助分离(例如自应用环境分离催化剂、再使用催化剂及控制过程)的非催化功能和设计为在期望的时间和空间里催化祀化合物(或底物)的催化功能(Cao, Carrier-boundImmobilized Enzymes!Principles,Applications and Design, Wiley-VCH VerlagGmbH&C0.KGaA, ffeinheim, Germany, 2005)。在酶被固定化时,使得它对于其帮助转化的革巴化合物(例如,底物)及对于使用的溶剂不可溶。可以分开固定化酶产物与应用环境以便于其再使用,或者以降低需要的酶量,或者以在底物连续递送并自酶附近不断取出产物的过程中使用酶,这例如降低酶成本。此外,经常通过固定化来使酶稳定化。牵涉固定化酶的方法经常是连续的,其便于容易的过程控制。可以通过机械手段作为异质催化剂,或者通过在明确空间中纳入保留固定化酶。后者可以通过微囊化(例如,在半透膜中)或者通过使用例如中空纤维模块等在UF系统中纳入来完成。通常也使用多孔载体上的固定化。这包括例如通过吸附、复合物/离子/共价结合来使酶结合至载体,或者仅将可溶性酶在载体上简单吸附及随后除去溶剂。也可以使用酶交联作为固定化的手段。在工业上也应用通过纳入载体中使酶固定化(Buchholz 等,Biocatalysts and Enzyme Technology, Wiley-VCHVerlag GmbH&C0.KGaA, ffeinheim, Germany, 2005)。使酶如碳酸野酶固定化的具体方法包括但不限于与包含多功能性胺的液体介质和包含交联剂的液体介质一起将酶喷雾到微粒多孔载体上,如记载于W02007/036235 (在此通过提述并入)的,将碳酸酐酶及交联剂(例如,戊二醛)与卵清蛋白层连接,其继而粘附于聚合支持物上的粘着层,如记载于W02005/114417(在此通过提述并入)的,或者将碳酸酐酶与硅土载体(如记载于美国专利N0.5,776,741的)或者与硅烷,或者CNBr活化的载体表面如玻璃偶联,碳酸酐酶与聚合物珠上的甲基丙烯酸酯的共聚合,如记载于Bhattacharya等,2003, Biotechnol.Appl.Biochem.38:111-117 (在此通过提述并入)的,或者使用球状蛋白和粘合剂,如记载于US2010/068784的。也可以使用标签如组氨酸样标签(例如,6x His标签或HQ标签)或纤维素结合模块(CBM)来固定化碳酸酐酶(Liu等,2008, Biotechnol.Prog.25:68-74)。本发明的一个实施方案是包含适合于固定化的基质和选自下组的碳酸酐酶的组合物:a)源自 Persephonella marina DSM14350 或可由 Persephonella marinaDSM14350生成;或b)具有与SEQ ID NO: 2的氨基酸残基20至243或SEQ ID NO:4的氨基酸残基29至251对应的氨基酸序列的多肽;或c)与SEQ ID NO:2的氨基酸残基20至243或SEQ ID NO:4的氨基酸残基29至251 至少 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 或 99% 相同的多肽;或d) (a)、(b)或(C)中具有碳酸酐酶活性的片段;或e)由在非常低的、低的、中 等的、中等-高的或高的严格性条件下与下列多核苷酸序列杂交的核酸序列编码的多肽:i)编码SEQ ID N0:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的多核苷酸序列;或ii)SEQ ID NO:1 或 SEQ ID NO: 3 的多核苷酸序列;或iii) (i)或(ii)中至少100个连续核苷酸的亚序列;或iv)⑴或(ii)的互补链;或f)由如下的核酸序列编码的多肽,所述核酸序列由于遗传密码简并性不与SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:3的多核苷酸序列杂交,但其编码具有依照b)或c)的氨基酸序列的多肽;或g)由如下的核酸序列编码的多肽,所述核酸序列与SEQ ID NO:1或SEQ ID N0:3至少 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 或 99% 相同。在本发明的又一个实施方案中,在基质上固定化碳酸酐酶。基质可以例如选自下组:珠、织物、纤维、中空纤维、膜、微粒、多孔表面、棒、整装填料和管。合适基质的具体例子包括氧化铝、膨润土、生物聚合体、碳酸钙、磷酸钙凝胶、碳、纤维素、陶器支持物、粘土、胶原、玻璃、羟磷灰石、离子交换树脂、高岭土、尼龙、酚聚合物、聚氨苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚丙烯、聚合物水凝胶、Sephadex、Sepharose、娃土凝胶、沉淀的娃土、和TEFLON牌PTFE。在本发明的一个实施方案中,依照 Methods in Enzymology volume XLIV(章节!ImmobilizedEnzymes,第 Il8 页-第 1;34 页,Klaus Mosbach 编,Academic Press, New York, 1976)(在此通过提述并入)中描述的技术将碳酸酐酶在尼龙基质上固定化。可以依照本领域中已知的方法来稳定化要在组合物中包含的多肽,例如,通过添加抗氧化剂或还原剂以限制多肽的氧化来稳定化组合物中的多肽,或者可以通过添加聚合物如PVP、PVA、PEG、糖、寡聚物、多糖或已知对于固体或液体组合物中的多肽稳定性有益的其它合适的聚合物来使其稳定化或者可以通过添加酶活性位点中存在的稳定化离子,例如锌(例如氯化锌或硫酸锌)来使其稳定化。可以添加防腐剂,如Proxel或青霉素以延长货架期或应用中的性能。在本发明的实施方案中,通过吸附到基质、表面或基片上固定化碳酸酐酶。基质、表面或基片的非限制性例子包括那些来自下组的:珠、织物、纤维、中空纤维、膜、微粒、多孔表面、棒、整装填料和管。合适的基质、表面或基片的具体例子包括氧化铝、膨润土、生物聚合体、碳酸钙、磷酸钙凝胶、碳、纤维素、陶器支持物、粘土、胶原、玻璃、羟磷灰石、离子交换树脂、高岭土、尼龙、酚聚合物、聚氨苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚丙烯、聚丙烯腈(丙烯酸树脂)、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、聚氨基甲酸酯、聚合物水凝胶、Sephadex、Sepharose、娃土凝胶、沉淀的硅土、和TEFLON牌PTFE。在实施方案中,可以在吸附酶后干燥基质、表面或基片。在又一个实施方案中,本发明的组合物是在二氧化碳捕获中可适用的组合物。
实施例实施例1在枯草芽抱杆菌中克隆并表达Persephonella marina DSM14350碳酸野酶Persephonella marina是一种于80 °C左右生长的海洋细菌((..丨 /,等,2002,Internat ional Journal of Systematic and EvolutionaryMicrobiology,52, 1349-1359)。设计基于Persephonella marina DSM14350碳酸酐酶蛋白质序列(UniProt登录号C0QRB5)的合成基因,并针对枯草芽孢杆菌优化基因密码子选择。密码子优化方法使用与下文表I中的密码子表中频率成比例的同义密码子来设计基因。此方法是本领域中已知的,见例如Gustafsson等,2004,Trends inBiotechnology22:346-353。表1:枯草芽孢杆菌密码子频率
权利要求
1.可从属于PersephonelIa属的菌株获得的或可由属于PersephonelIa属的菌株生成的碳酸酐酶用于从含有二氧化碳的介质提取二氧化碳的用途。
2.依照权利要求1的用途,其中所述碳酸酐酶可从选自下组的菌株获得或可由选白下组的菌株生成:菌种 Persephonella marina、Persephonella hydrogeniphila 或Persephonella guaymasensis 中的一种。
3.依照权利要求1或2的用途,其中所述碳酸酐酶可从如下菌株之一获得或可由如下菌株之一生成:Persephonella marina DSM14350、Persephonella hydrogeniphilaDSM15103 或 Persephonella guaymasensis DSM14351。
4.依照权利要求1至3中任一项的用途,其中所述碳酸酐酶是 a)源自 Persephonella marina DSM14350 的或可由 Persephonella marina DSM14350生成的;或 b)具有与SEQID NO:2的氨基酸残基20至243或SEQ ID NO:4的氨基酸残基29至251对应的氨基酸序列的多肽;或 c)与SEQID NO: 2的氨基酸残基20至243或SEQ ID NO:4的氨基酸残基29至251至少60%相同的多肽;或 d)(a)、(b)或(c)中具有碳酸酐酶活性的片段;或 e)由核酸序列编码的多肽,所述核酸序列在中等严格性条件下与如下杂交: i)编码SEQID N0:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的多核苷酸序列;或 ii)SEQID NO:1或SEQ ID NO: 3的多核苷酸序列;或 iii)(i)或Qi)中至少100个连续核苷酸的亚序列;或 iv)⑴或(ii)的互补链;或 f)由核酸序列编码的多肽,所述核酸序列由于遗传密码简并性不与SEQID N0:1或SEQID NO:3的多核苷酸序列杂交,但其编码具有依照b)或c)的氨基酸序列的多肽;或 g)由核酸序列编码的多肽,所述核酸序列与SEQID NO:1或SEQ ID NO: 3至少60%相同。
5.依照前述权利要求中任一项的用途,其中所述碳酸酐酶在80°C以上的温度15分钟后维持至少50%残余活性。
6.依照前述权利要求中任一项的用途,其中所述含有二氧化碳的介质是气体或多相混合物。
7.依照权利要求6的用途,其中所述含有二氧化碳的气体或多相混合物通过燃烧发出。
8.依照权利要求6的用途,其中所述气体是烟道气体。
9.依照权利要求6的用途,其中所述含有二氧化碳的气体或多相混合物是粗天然气或合成气。
10.依照权利要求6的用途,其中所述含有二氧化碳的气体或多相混合物是沼气。
11.依照权利要求1至5中任一项的用途,其中所述含有二氧化碳的介质是含有碳酸氢盐的液体,而所述二氧化碳提取是碳酸氢盐向二氧化碳的转化。
12.依照权利要求11的用途,其中所述含有二氧化碳的介质进一步包含基于胺的化合物。
13.依照权利要求12的用途,其中所述基于胺的化合物是Tris或MDEA。
14.依照权利要求11至13中任一项的用途,其中所述含有二氧化碳的介质进一步包含HPO广,如 K2HPO4 或 Na2HPO4。
15.依照前述权利要求中任一项的用途,其中在55°C_120°C的温度实施所述二氧化碳提取。
16.—种用于提取二氧化碳的方法,包括用可从属于Persephonella属的菌株获得的或可由属于Persephonella属的菌株生成的碳酸酐酶处理含有二氧化碳的介质。
17.一种分离或合成的多核苷酸,其编码具有碳酸酐酶活性的多肽,其中所述多核苷酸选自下组: a)通过SEQID NO:1的密码子优化获得的多核苷酸,其中经密码子优化的多核苷酸的核苷酸序列与SEQ ID NO:1至少60%相同;或b)具有与SEQID NO:3的核酸残基88至653对应的核苷酸序列的多核苷酸;或 c)与SEQID NO: 3的核酸残基88至653至少85%相同的多核苷酸;或 d)(a)或(b)中编码具有碳酸酐酶活性的多肽的片段。
18.—种包含权利要求17的多核苷酸的核酸构建体,所述多核苷酸与指导所述多肽在表达宿主中生成的一个或多个 控制序列可操作连接。
19.一种重组表达载体,其包含权利要求18的核酸构建体。
20.一种重组宿主细胞,其包含权利要求18的核酸构建体或权利要求19的重组表达载体。
21.一种组合物,其包含赋形剂和选自下组的碳酸酐酶: a)源自Persephonella marina DSM14350 的或可由 Persephonella marina DSM14350生成的多肽;或 b)具有与SEQID NO:2的氨基酸残基20至243或SEQ ID NO:4的氨基酸残基29至251对应的氨基酸序列的多肽;或 c)与SEQID NO: 2的氨基酸残基20至243或SEQ ID NO:4的氨基酸残基29至251至少60%相同的多肽;或 d)(a)、(b)或(c)中具有碳酸酐酶活性的片段;或 e)由核酸序列编码的多肽,所述核酸序列在中等严格性条件下与如下杂交: i)编码SEQID N0:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的多核苷酸序列;或 ii)SEQID NO:1或SEQ ID NO: 3的多核苷酸序列;或 iii)(i)或Qi)中至少100个连续核苷酸的亚序列;或 iv)⑴或(ii)的互补链;或 f)由核酸序列编码的多肽,所述核酸序列由于遗传密码简并性不与SEQID N0:1或SEQID NO:3的多核苷酸序列杂交,但其编码具有依照b)或c)的氨基酸序列的多肽;或g)由核酸序列编码的多肽,所述核酸序列与SEQID NO:1或SEQ ID NO: 3至少60%相同。
22.依照权利要求21的组合物,其中所述组合物包含适于固定化的基质。
23.依照权利要求22的组合物,其中所述基质选自下组:珠、织物、纤维、中空纤维、膜、微粒、多孔表面、棒、和管。
24.一种用于提取二氧化碳的生物反应器,其中所述反应器包含可从如下菌株获得的或可由如下菌株生成的碳酸酐酶:属于Persephonella属的菌株,优选选自由Persephonella mar ina> Persephone I la hydrogeniphila 或 Persephonella guaymasensis组成的菌种的组的菌株,甚至更优选作为DSM14350、DSM15103或DSM14351保藏的菌株。
25.依照权利要求24的生物反应器,其中所述碳酸酐酶是 a)源自Persephonella marina DSM14350 的或可由 Persephonella marina DSM14350生成的;或 b)具有与SEQID NO:2的氨基酸残基20至243或SEQ ID NO:4的氨基酸残基29至251对应的氨基酸序列的多肽;或 c)与SEQID NO: 2的氨基酸残基20至243或SEQ ID NO:4的氨基酸残基29至251至少60%相同的多肽;或 d)(a)、(b)或(c)中具有碳酸酐酶活性的片段;或 e)由核酸序列编码的多肽,所述核酸序列在中等严格性条件下与如下杂交: i)编码SEQID N0:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的多核苷酸序列;或 ii)SEQID NO:1或SEQ ID NO: 3的多核苷酸序列;或 iii)(i)或(ii)中至少100个连续核苷酸的亚序列;或 iv)⑴或(ii)的互补链;或 f)由核酸序列编码的多肽,所述核酸序列由于遗传密码简并性不与SEQID N0:1或SEQID NO:3的多核苷酸序列杂交,但其编码具有依照b)或c)的氨基酸序列的多肽;或 g)由核酸序列编码的多肽,所述核酸序列与SEQID NO:1或SEQ ID NO: 3至少60%相同。
26.依照权利要求24或25的反应器,其中所述反应器包含下列元件: a)至少一个吸收模块; b)至少一个沉淀台; c)载体液体;和 d)用于使所述吸收模块与所述沉淀台连接,使得所述载体液体可以从所述吸收模块通到所述沉淀台的手段。
27.依照权利要求24或25的反应器,其中所述反应器包含下列元件: a)至少一个吸收模块; b)至少一个解吸模块; c)载体液体;和 d)用于连接所述吸收模块和所述解吸模块,使得所述载体液体可以从所述吸收模块通到所述解吸模块的手段。
28.依照权利要求24、25或27中任一项的生物反应器,其中所述碳酸酐酶包埋在所述吸收模块中或在所述解吸模块中或在这两个模块中,或包埋在所述沉淀台中。
29.依照权利要求24至28中任一项的生物反应器,其中所述反应器进一步包含基于碳酸氢盐的载体液体。
30.依照权利要求24至29中任一项的生物反应器,其中所述反应器进一步包含基于胺的载体液体。
31.依照权利要求30的生物反应器,其中所述基于胺的载体液体包括Tris或MDEA。
32.依照权利要求29至31中任一项的生物反应器,其中所述反应器进一步包含ΗΡ042_,如 K2HPO4 或 Na2HPO 4。
全文摘要
本发明涉及Persephonella碳酸酐酶在例如从烟道气体、天然气、沼气或环境空气提取CO2中的用途。Persephonella碳酸酐酶由于其极端热稳定性而特别良好地适合于这些目的。
文档编号C12N9/88GK103180438SQ201180051316
公开日2013年6月26日 申请日期2011年8月24日 优先权日2010年8月24日
发明者M.S.博彻特 申请人:诺维信公司

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