体外肝分化的制作方法

xiaoxiao2020-6-24  8

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专利名称:体外肝分化的制作方法
技术领域
本发明涉及多能人类细胞,尤其是人iPS细胞中肝分化的体外诱导。
背景技术
通过过表达体细胞中的一些转录因子衍生人诱导的多能干细胞(hIPSC)的可能性为再生医学和体外疾病模型化开辟了新的机会[I]。已经从患有各种疾病的患者产生了hIPSC[2] [3] [4],当这些细胞随后分化为神经祖细胞时它们具有多组报告疾病特异性表型[5] [6]。然而,迄今为止,并没有报道过用于特异于非神经元细胞(例如中胚层和内胚层谱系的细胞)的基于hIPSC的模型,也没有报道作为仅在完全分化的成体细胞中观察到的功能丧失的结果而发生的疾病(晚发性疾病)。此外,仍然关注的是,重编程和分化中固有的细胞应力阻止hIPSC来源的细胞模型保留控制蛋白质运输和活性的大量微妙的相互作用。理解这些相互作用对于理解多种疾病的机制是至关重要的并且还可为目前不能解释的在相同基因背景的个体之间观察到的临床表型变化提供研究方向[7] [8] [9]。这些问题尤其与肝病有关并且尤其是肝脏的遗传性代谢紊乱(MD)。这些疾病是由肝细胞中影响关键蛋白的基因突变造成的。尽管可通过全器官肝移植来治疗这些疾病,但这一过程会带来相当大的风险。因此,需要更好地理解疾病机制并开发替代性治疗方法[10] [11]。这样的研究受到培养原代肝细胞的困难以及不能提供如实复制造成疾病的蛋白质功能障碍和随之而来的细胞缺陷的相关人类干细胞样细胞系的限制[12]。

发明内容
本发明涉及一种用于高效体外诱导人iPS细胞成为肝祖细胞和肝细胞的方法。这种方法可用于例如产生用于基于细胞的治疗或疾病模型化(disease modelling)的肝细胞。 本发明的一个方面提供了一种用于诱导肝分化的方法,包括:( i )提供诱导的多能干(iPS)细胞的群体,(ii)在内胚层诱导培养基中培养该群体以产生前层确定型内胚层(前确定性内胚层,anterior definitive endoderm, ADE)细胞的群体,其中,该内胚层诱导培养基为化学成分确定的培养基(chemically definedmedium),其具有成纤维细胞生长因子活性并且刺激SMAD2和SMAD3介导的信号通路以及SMADU SMAD5和SMAD9介导的信号通路并抑制磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和糖原合酶激酶3β (GSK3P);以及(iii)在肝诱导培养基中培养ADE细胞的群体以产生肝祖细胞的群体,其中,该肝诱导培养基是化学成分确定的培养基(chemically defined medium),其刺激SMAD2和SMAD3介导的信号通路。该方法还可以包括:(iv)在肝成熟培养基中培养肝祖细胞的群体以产生肝细胞的群体。
优选地,iPS细胞为人iPS细胞。iPS细胞是多能细胞,其来源于非多能性的完全分化的祖细胞(ancestor cells)。适合的祖细胞包括成体成纤维细胞和外周血细胞。通常通过向细胞中引入多潜能性基因或蛋白(例如0ct4、Sox2和Soxl)而对祖细胞进行重新编程。该基因或蛋白可通过任何适合的技术被引入到分化的细胞中,包括质粒或更优选地病毒转染或直接蛋白递送。也可以向细胞中引入其他基因以增加诱导效率,例如Kif基因,如Kif-1、Kif-2、Kif-4和Kif-5 ;Myc基因,如C-myc、Liyc和Niyc ;nanog ;以及Lin28。在引入多潜能基因或蛋白之后,可对祖细胞进行培养。表达多潜能性标记物的细胞可被分离和/或纯化以产生iPS细胞的群体。用于产生iPS细胞的技术是本领域公知的(Yamanaka等人Nature2007;448:313_7;Yamanaka62007 年 6 月 7 日;I (I): 39-49.Kim 等人 Nature.2008Jul31; 454 (7204):646-50;Takahashi Cell.2007 年 11 月 30 日;131 (5):861-72.Park 等人 Nature.2008 年 I 月 10H ;451 (7175):141-6;Kim等人Cell Stem Cell.2009年6 月 5 日;4(6):472-6; Vallier, L.等人 Stem Cells, 2009.9999 (999A):ρ.Ν/Α.)iPS细胞可表达以下多潜能相关标记物中的一种或多种:0ct4、Sox2、碱性磷酸酶、SSEA-3、Nanog,SSEA-4、Tra-1-60、KLF-4 和 c_myc。在一些实施方式中,本文所述方法中使用的iPS细胞来源于获自个体的健康细胞,例如成纤维细胞,即,没有疾病相关表型或基因型的细胞。来源于健康细胞的iPS细胞可如本文所述使用以产生表现出正常(即,非疾病相关)表型的肝细胞。健康细胞可获自具有正常肝功能的个体或具有损伤的或功能障碍的肝细胞的患者,例如具有肝损伤或肝病的患者,例如肝炎(例如甲型、乙型、丙型、丁型、戊型、庚型或戌型肝炎)、肝硬化、肝细胞癌、非酒精性脂肪性肝病(non alcoholic fatty liver disease)、药物引起的肝损伤、酒精性肝病或自身免疫性肝病。在一些实施方式中,iPS细胞可来源于获自具有不同遗传背景的个体。例如,iPS细胞可由患有肝病的个体、 具有高肝病患病风险的个体和/或具有低肝病患病风险的个体的健康细胞产生。如本文所述由具有不同遗传背景的个体产生的肝细胞可用于研究肝病的机制并确定治疗靶标。表现出正常(S卩,非疾病相关)表型的肝细胞可用于对患有肝损伤或肝病的患者进行治疗,如下文所述,例如作为健康细胞来源的患者,iPS细胞获自该患者。在其他的实施方式中,本文所述的方法中使用的iPS细胞来源于获自个体的疾病相关细胞,即,表现出与肝病或肝功能障碍相关的表型或基因型的细胞,例如肝脏的遗传性代谢病GMD),如α I抗胰蛋白酶缺乏症、糖原贮积病如Ia型糖原贮积病、家族性高胆固醇血症、遗传性酪胺酸血症(遗传性高酪胺酸血症)、克里格勒-纳贾尔(Crigler Najjar)综合征、鸟氨酸氨基甲酰转移酶缺乏症、或因子IX缺乏症或其他血友病(haemophilia)、血色病(haemochromatosis)、威尔逊氏病、杜宾-约翰逊综合征、家族性淀粉样变性病、或雷夫叙姆病。可以采用具有例如与IMD或其他肝病相关的基因突变或缺陷的基因型的细胞,实例为成纤维细胞,例如可常规获得的皮肤成纤维细胞。可以如本文所示使用来源于获自个体的疾病相关细胞的iPS细胞(S卩,疾病特异性iPS细胞:ds-1PS或dhIPS)以产生表现出肝病相关的表型的肝细胞,例如MD表型。通常,肝细胞含有与该肝病相关的基因突变或缺陷。这些细胞可用于治疗患有如上文所述的肝损伤或疾病的患者或用于肝病模型化(modelling)和筛查。在其他的实施方式中,来源于获自患有肝病的个体的疾病相关细胞的iPS细胞(即,疾病特异性iPS细胞:ds-1PS或dhIPS)含有与该肝病相关的基因突变或缺陷,例如α 1-抗胰蛋白酶中的Glu342Lys,其是AlAT缺乏的原因。该突变或缺陷可在分化前在iPS细胞中被修正。例如,可用野生型核苷酸序列替换含有疾病相关的基因突变或损伤的ds-1PS细胞中的核苷酸序列。用于修正基因突变和缺陷的适合方法是本领域中公知的并且在本文中其他地方描述。这些修正的iPS细胞(c-1PSC)可被用于对患有如上文所述的肝损伤或肝病的患者进行治疗。肝病如上文所述,并且可以包括遗传性代谢紊乱(MD)。MD可以是与ER中的蛋白质错折叠相关的MD,例如α 1-抗胰蛋白酶缺乏;肝相关性受体功能丧失,例如家族性高胆固醇血症(FH);代谢紊乱,例如糖原储存病,如GSDla。肝病可以是迟发性病症或与成熟成体肝细胞相关的病症。在iPS细胞群体产生之后,可利用常规技术对其进行培养或维持(Vallier,L.等人 Dev.Biol.275,403-421 (2004),Cowan, C.A.等人 N.Engl.J.Med.350,1353-1356 (2004),Joannides, A.等人 Stem Cells24, 230-235 (2006) Klimanskaya, 1.等人 Lancet365, 1636-1641 (2005),Ludwig, T.E.等人 Nat.Biotechnol.24,185-187 (2006))。例如,适合用于本方法中的iPS细胞,尤其是人iPS细胞,可以在培养皿中在饲养细胞层上常规培养,例如经辐照的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF),例如在补充有4ng/ml FGF2的Knockout (KS)培养基中以适当的密度(例如IO5至IO6细胞/60mm培养皿)培养,或在具有饲养条件培养基或成分确定的培养基的适当基质(substrate)上培养。优选地,本文所述的方法中使用早期传代iPS细胞。早期传代iPS细胞是经过40代或更少,优选35代或更少,或 30代或更少次培养的细胞。本发明方法中使用的iPS细胞可通过酶促方法或机械方法进行传代。适合用于iPS细胞的培养基包括补充有4ng/ml FGF2的Knockout (KS)培养基;补充有20%血清补充物、1%非必需氨基酸、ImM L-谷氨酰胺、0.1mM β -巯基乙醇以及4ng/ml至10ng/ml人FGF2的Knockout达尔伯克改良伊格尔培养基(K0-DMEM);以及补充有20%的 knockout 血清替代物(knockout serum replacement,KSR)、6ng/ml FGF2(PeproTech)、ImM L-GlnUOO μ m非必需氨基酸、100 μ M2-巯基乙醇、50U/ml青霉素和50mg/ml链霉素的DMEM/F12。优选地,在培养期间利用无胶原酶试剂例如Accutase (Bioffest)来收获细胞。iPS细胞根据本文所述方法分化为肝细胞在三个阶段中发生。在第一阶段,iPS细胞的群体分化为前层确定型内胚层(anterior definitive endoderm, ADE)细胞。在第二阶段,ADE细胞分化为肝祖细胞(h印atic progenitor),并且在可选的第三阶段,该肝祖细胞分化为肝细胞。这些方法中使用的所有培养基都是化学成分确定的并且优选是人源化的。为了诱导iPS细胞的群体分化为ADE细胞,在内胚层诱导培养基中培养该iPS细胞的群体。内胚层诱导培养基为化学成分确定培养基(chemically defined medium, CDM),其(i)刺激由SMAD1、SMAD2、SMAD3和SMAD5介导的信号通路;(ii)抑制磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和糖原合酶激酶3β (GSK3 0 );并且(iii)具有成纤维细胞生长因子(FGF)活性。
化学成分确定培养基是用于培养细胞的营养液,其仅含有特定的组分,优选为已知化学结构的组分。优选地,该化学成分确定培养基是人源化的。人源化的化学成分确定培养基缺乏来源于非人类动物的组分或补充物,例如胎牛血清(FBS)、牛血清白蛋白(BSA)和小鼠饲养细胞。内胚层诱导培养基包含化学成分限定的基础培养基。适合的化学成分确定的基础培养基包括补充有胰岛素(例如0.5 μ g/ml至70 μ g/ml)、转铁蛋白(例如浓度为1.5 μ g/ml至150 μ g/ml)、抗氧化剂(例如1_硫代甘油,例如浓度为45 μ M至4.5mM)和脂质的MDM和/或F12。适合的化学成分确定的基础培养基包括Johansson and Wiles CDM (Johansson和Wiles (1995)Mol Cell Bioll5, 141-151),其中补充有聚乙烯醇、胰岛素、转铁蛋白和确定的脂质。Johansson and Wiles CDM 由以下物质组成:50%MDM (Gibco)+50%F12NUT_MIX(Gibco) ;7 μ g/ml胰岛素、15 μ g/ml转铁蛋白;lmg/ml聚乙烯醇(PVA) ; 1%化学成分确定的脂质浓缩物(Invitrogen);以及450 μ Ml-硫代甘油。其他适合的化学成分确定的基础培养基是本领域中公知的。为了避免使用牛血清白蛋白或人血清白蛋白,该化学成分确定的基础培养基在内胚层诱导培养基补充了浓度为0.5mg/ml至50mg/ml的聚乙烯醇(PVA)。补充有聚乙烯醇的化学成分确定的基础培养基通常被称为CDM-PVA。在内胚层诱导培养基中,CDM-PVA补充有另外的因子,优选重组人因子,其诱导iPS细胞分化为前层确定型内胚层(ADE)细胞。例如,CDM-PVA补充有成纤维细胞生长因子。成纤维细胞生长因子是一种通过与成纤维细胞生长因子受体(FGFR)结合而刺激细胞生长、增殖和细胞分化的蛋白因子。适合的成纤维细胞生长因子包括FGF家族的任何成员,例如FGFl至FGF14以及FGF15至FGF23中的任一种。 优选地,成纤维细胞生长因子为FGF2 (NCBI GeneID:2247,核酸序列NM_002006.361:41352694,氨基酸序列 NP_001997.4G1:41352695) ;FGF7 (也被称为角质化细胞生长因子(或 KGF),NCBI GeneID:2247,核酸序列 NM_002006.3G1:41352694,氨基酸序列 NP_001997.4G1:41352695);或 FGFlO (NCBI GeneID:2247,核酸序列NM_002006.3G1: 41352694,氨基酸序列 ΝΡ_001997.461:41352695)。更优选地,成纤维细胞生长因子为FGF2 (Amit, M.,等人DevelopmentalBiology227:271-278 (2000))。成纤维细胞生长因子(例如FGF2、FGF7和FGF10)可以利用常规重组技术获得或获自供应商(例如,R&D Systems, Minneapolis, MN; Stemgent Inc, USA)。方便地,内胚层诱导培养基中的FDF浓度为I至500ng/ml,优选约为40ng/ml。CDM-PVA可进一步补充有第一 TGF β配体,其在iPS细胞中刺激SMAD2和SMAD3介导的细胞内信号通路。TGFβ配体是TGFii超家族的肽。TGFβ超家族的成员具有特征结构并且是本领域中公知的。第一 TGFP配体可以为活化素(Activin)或TGFβ。活化素(活化素A:NCBI GeneID:3624 核酸参考序列 NM_002192.2G1:62953137,氨基酸参考序列NP_002183.1G1:4504699)是一种二聚体多肽,其通过刺激活化素/Nodal通路发挥一定范围的细胞作用(Vallier等人,Cell Sciencel 18:4495-4509 (2005) )0活化素可容易地从商业来源获得(例如Stemgent Inc.MA USA)。方便地,培养基中活化素的浓度可以为10至1000ng/ml,优选约为100ng/ml。TGFP (NCBI GeneID:7040 核酸参考序列 ΝΜ_000660.4G1:260655621,氨基酸参考序列NP_000651.3G1:63025222)是一种调节增殖和分化的同源二聚体多肽(Watabe,T.等人(2009).Cell Res.19:103-115)。重组人TGFP可容易地从商业来源获得(例如StemgentInc.MA USA)。方便地,培养基中TGFP的浓度可以为10至1000ng/ml,优选约为100ng/ml。CDM-PVA可进一步补充有第二 TGFP配体,其在iPS细胞中刺激SMAD1、SMAD5和SMAD9介导的细胞内信号 通路。第二 TGFP配体可以是骨形态发生蛋白(BMP)。骨形态发生蛋白结合于骨形态发生蛋白受体(BMPR)并通过由SMAD1、SMAD5和SMAD9介导的通路刺激细胞内信号传导。适合的骨形态发生蛋白包括BMP家族的任何成员,例如BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6或BMP7。优选地,第二 TGFP 配体为 BMP2 (NCBI GeneID: 650,核酸序列 NM_001200.2G1:80861484 ;氨基酸序列 NP_001191.1G1:4557369)或 BMP4 (NCBIGeneID:652,核酸序列NM_001202.3G1:157276592 ;氨基酸序列 NP_001193.2G1: 157276593)。骨形态发生蛋白可利用常规重组技术产生或获自供应商(例如R&D, Minneapolis, USA, Stemgent Inc, USA)。方便地,培养基中骨形态发生蛋白(例如BMP2或BMP4)的浓度可以为I至500ng/ml,优选为约10ng/ml。因此,内胚层诱导培养基可以包含补充有聚乙烯醇、FGF、第一和第二 TGFii配体、PI3K抑制剂和GSK3 β抑制剂的化学成分确定的基础培养基。ΡΙ3Κ抑制剂抑制磷脂酰肌醇3-激酶(例如磷脂酰肌醇_4,5_ 二磷脂酸盐3_激酶(EC2.7.1.153))的活性。适合的ΡΙ3Κ抑制剂包括渥曼青霉素、LY301497(17-b-羟基渥曼青霉素);LY294002(2-吗啉-4 基-8-苯并色-4-酮=Maclean 等人(2007) Stem Cells2529_38) ;CLB1309(KN309: (±) -2- ({1- [7-甲基-2-(吗啉-4-基)-4-氧-批啶并[I,2_a]嘧啶 _9_基]乙基}氨基)苯甲酸);PX-866( (IE, 4S, 4aR, 5R, 6aS, 9aR) -5-(乙酰氧基)_1_[(二 _2_ 丙烯-1-基氨基)亚甲基]-4,4a, 5, 6, 6a, 8, 9, 9a_八氢-11-轻基_4_(甲氧基甲基)_4a, 6a_ 二甲基环戊[5,6]萘并[1,2-c]吡喃-2,7,10(1!1)-三酮);比87114 (喹诺酮吡咯并嘧啶;#6图17);GDC-0941(#3图17; 2-(IH-吲唑-4-基)-6-[[4-(甲基磺酰基)-1-哌嗪基]甲基]_4_(4-吗啉基)-噻吩并[3,2-d]嘧啶);TGX-221 (7-甲基-2-(4-吗啉基)-9-[1-(苯基氨基)乙基]-4H-吡啶并[I, 2-a]嘧啶-4-酮)、槲皮素;BEZ235 (#4 图 17);XL147 (#1 图 17);X1765(#2 图 17) ;PX-866 (#5 图 17) ;ZSTK474 (2-(2-二氟甲基苯丙咪唑-1-基)4,6-二吗啉代-1, 3,5-三嗪);和SF1126 (2-[2-甲氧基乙基氨基]_8_苯基-4H-1-苯并吡喃_4_酮)。其他的PI3K抑制剂是本领域可获得的。适合的PI3K抑制剂可获自供应商(例如Calbiochem CA USA)。例如,内胚层诱导培养基可以含有I至100 μ M的ΡΙ3Κ抑制剂(例如LY294002),优选约10 μ Mo
GSK3 0抑制剂抑制糖原合酶激酶3β (Gene ID2932:EC2.7.11.26)的活性。适合的抑制剂包括CHIR99021 (6- ((2- ((4- (2,4- 二氯苯基)_5_ (4-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶 _2_ 基)氨基)乙基)氨基)烟腈;Ring D.B.等人,Diabetes, 52:588-595 (2003))alsterpaullone、kenpaullone (9-溴-7,12- 二氢卩引哚并[3,2-D] [I]苯并氮杂卓-6(5H)_ 酮)、SB216763 (3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡P各-2,5- 二丽),和SB415286 (3_[ (3-氣~4~轻苯基)氨基]~4~ (2-硝基苯基)-1H-批咯-2,5-二酮)。适合的糖原合酶激酶3 β抑制剂可获自供应商(例如,Stemgent Inc.MAUSA; Cayman Chemical C0.MI USA)。例如,内胚层诱导培养基可以含有0.3 μ M至30 μ M的GSK3 β抑制剂,例如CHIR99021,优选约3 μ M0在一些实施方式中,内胚层诱导培养基可以由补充有活化素、FGF2、ΒΜΡ-4、磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂(优选LY294002)、和糖原合酶激酶3 β抑制剂(优选CHIR99021)的CDM-PVA基础培养基构成。优选地,内胚层诱导培养基中的活化素、FGF2和ΒΜΡ-4均为重组人蛋白。哺乳动物细胞培养物是本领域中公知的(参见,例如Basic CellCulture Protocols, C.Helgason, Humana Press Inc.U.S.(2004 年 10 月 15 日)ISBN:1588295451;Human Cell Culture Protocols (Methods in Molecular MedicineS.) Humana Press Inc., U.S.(2004 年 12 月 9 日)ISBN:1588292223;Culture of AnimalCells: A Manual of Basic Technique, R.Freshney, John ffiley&Sons Inc (2005 年 8 月2 日)ISBN:0471453293,Ho WY et al J Immunol Methods.(2006)310:40-52,Handbookof Stem Cells (ed.R.Lanza) ISBN:0124366430)。培养基及其成分可获自商业来源(例如,Gibco, Roche, Sigma, Europa bioproducts, R&D Systems)。可以米用标准哺乳动物细胞培养条件,例如37° C,21%氧气,5% 二氧化碳。优选每两天更换培养基并使得细胞通过重力沉降。 优选在不存在饲养细胞的单层中在涂覆有血清(优选人血清)或细胞外基质蛋白(如纤连蛋白、层粘连蛋白或胶原)的基质(substrate)上培养细胞。适合的培养技术是本领域中公知的。在优选的实施方式中,iPS细胞分化为前层确定型内胚层(ADE)细胞可在三个单独的步骤中进行。例如,iPS细胞群体向ADE细胞的分化可以包括:(a)在内胚层诱导培养基中培养iPSC群体例如12至36小时,优选约24小时;(b)在没有糖原合酶激酶3 β抑制剂的内胚层诱导培养基中进一步培养该群体例如12至36小时,优选约24小时;以及(c)在刺激SMAD2和SMAD3信号通路并且具有成纤维细胞生长因子活性的ADE诱导培养基中进一步培养该群体例如12至36小时,优选约24小时,以产生前层确定型内胚层(ADE)细胞的群体。ADE诱导培养基是化学成分确定的培养基,其包含化学成分确定的基础培养基。适合的化学成分确定的基础培养基包括RPM1-1640。RPM1-1640 (Moore, G.E.和 Woods L.K., (1976) Tissue Culture AssociationManual.3,503-508)是一种无血清基础培养基,含有无机盐、氨基酸、维生素、抗氧化剂和缓冲剂。RPM1-1640是本领域中公知的并且可容易地从商业来源获得(例如,Sigma-AldrichMI USA)。表2中示出了 RPM1-1640培养基的组分。化学成分确定的基础培养基可以补充有无血清培养基补充物。适合的无血清培养基补充物包括 B27 (Brewer 等人 J.Neurosci Res35567_576 (1993))和 NS21 (Chen 等人J.Neurosci Meths (2008) 171239-247)。无血清培养基补充物,例如B27和N21是本领域公知的并且可从商业渠道广泛获得(例如,Invitrogen;Sigma Aldrich Inc)。在ADE诱导培养基中,化学成分确定的基础培养基还补充有另外的因子(优选重组人因子)以产生前层确定型内胚层(ADE)细胞的群体。例如,化学成分确定的基础培养基可补充有刺激SMAD2和SMAD3介导的胞内信号通路的成纤维细胞生长因子(FGF)和第一TGF^配体。上文中更加详细地描述了 FGF和第一 TGF β配体。在一些实施方式中,ADE诱导培养基可以包含补充有I至1000ng/ml第一 TGF β配体,例如活化素,优选100ng/ml,以及4至400ng/ml的FGF,例如FGF2,优选40ng/ml FGF的化学成分确定的基础培养基。该化学成分确定的基础培养基可以是补充有B27或NS21培养基补充物的RPM1-1640。优选地,培养iPS细胞的群体2至4天,最优选3天,以产生ADE细胞的群体。前层确定型内胚层(ADE)细胞可以表达内胚层标记物,例如Soxl7、foxA2、GSC、Mixl1、LhxI,、CXCR4、GATA6、Eomes 和 Hex。前层确定型内胚层(ADE)细胞的群体可以不表达多潜能性标记物或与外胚层或中胚层谱系相关的标记物。例如,ADE细胞可以不以可检测水平表达以下标记物中的一种或多种,优选全部:0ct4、Sox2、碱性磷酸酶、SSEA-3、Nanog、SSEA-4、Tra-1-60 和 KLF-4。

可在分化中的细胞群体中监测和/或检测一种或多种ADE细胞标记物和/或一种或多种多能细胞标记物的表达。这使得能够确定该细胞群体的分化或内胚层诱导的范围。在分化之后,可将ADE细胞的群体与其他细胞类型基本上分离。例如,在培养基中培养后,该群体可含有85%或更多,90%或更多,95%或更多,或98%或更多的ADE细胞。优选地,该ADE细胞的群体与不需要纯化的其他细胞类型充分分离。如果需要,通过任何常规技术(例如FACS)来纯化ADE细胞的群体。在一些实施方式中,可在进一步分化为肝谱系之前扩增该ADE细胞的群体。可通过任何常规技术例如在补充有FGF的培养基(例如上文所述的ADE诱导培养基)中扩增ADE细胞。为了诱导ADE细胞的群体分化为肝祖细胞,在肝诱导培养基中培养该ADE细胞的群体。肝诱导培养基是化学成分确定的培养基(CDM),其刺激由SMAD2和SMAD3介导的信号通路并诱导分化为肝谱系。肝诱导培养基包含补充有一种或多种诱导ADE细胞分化为肝祖细胞的另外的因子(优选重组人因子)的化学成分确定的基础培养基。适合的化学成分确定的基础培养基(CDM)包括上文所述的RPM1-1640。CDM可以补充有刺激SMAD2和SMAD3介导的信号通路的第一 TGFP配体,例如上文所述的TGF β或活化素。优选地,该培养基补充有5至500ng/ml的第一 TGFP配体,例如活化素,优选约50ng/ml οADE细胞的群体可培养4至6天,优选约5天,以产生肝祖细胞的群体。
可在分化中的细胞群体中监测和/或检测一种或多种肝祖细胞标记物和/或一种或多种ADE细胞标记物的表达。这使得能够确定所培养的分化的范围(程度)。肝祖细胞能够分化为肝细胞或分化为胆管上皮细胞并表达两种谱系的标记物。肝祖细胞可表达α-胎蛋白(AFP)、细胞角蛋白18 (CK18)、细胞角蛋白19 (CK19)、肝细胞核因子4 (HNF4)、和肝细胞核因子6 (HNF6)中的一种或多种。这些标记物中的一种或多种的检测是分化为肝谱系的指征。可将肝祖细胞的群体与其他细胞类型基本上分离。例如,在培养基中培养之后,该群体可含有80%或更多,85%或更多,90%或更多,或95%或更多的肝祖细胞。优选地,将肝祖细胞的群体与不需要纯化的其他细胞类型充分分离。如果需要,通过常规技术来纯化肝祖细胞的群体。在如上文所述的培养基中培养之后,将肝祖细胞的群体与培养基分离和/或从培养基除去。适合的技术是本领域中公知的。可将肝祖细胞在培养物中扩增、保持、储存,例如利用常规技术冷冻储存,或用于治疗或本文所述的其他应用。例如,如下文所述,肝祖细胞可用于基于细胞的治疗。在一些实施方式中,方法可包括诱导肝祖细胞分化为肝细胞。为了诱导分化,在肝成熟培养基中培养肝祖细胞的群体,该肝成熟培养基由补充有另外的因子(优选重组人因子)的化学成分确定的基础培养基(CDM)构成,以诱导肝祖细胞成熟为肝祖细胞。适合的化学成分确定的基础培养基(CDM)包括CMRL和h印atozyme SFM(GIBCO ; Invitrogen Inc)。

CMRL基础培养基是本领域中公知的无血清基础培养基并且可容易地通过商业来源获得(例如 Cat No: 11530037Invitrogen; Product#C0422Sigma)o 表 3 中示出了 CMRL 培养基的组成。hepatozyme SFM是一种可通过商业来源获得的无血清基础培养基(例如CatNol7705; InvitrogenX化学成分确定的基础培养基(CDM)可补充有一种或多种诱导肝母细胞或肝祖细胞分化或成熟为肝细胞的因子。例如,该基础培养基可补充有肝细胞生长因子(HGF)或表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)0肝细胞生长因子(HGF)(NCBI GeneID: 3082,核酸序列 ΝΜ_000601.4G1: 58533168,氨基酸序列NP_000592.3G1:33859835)是一种间充质来源的分裂素,其是SI肽酶的纤溶酶(plasminogen)亚家族的成员JGF可利用常规重组技术产生或获自供应商(例如PeprotechIncNJ USA)。通常,培养基中HGF的浓度可以是2至200 μ g/ml,优选约20 μ g/ml。内皮细胞生长因子(EGF) (NCBI GeneID: 1950,核酸序列ΝΜ_001178130.1G1: 296011012,氨基酸序列 NP_001171601.1G1: 296011013; Reynolds, B.A.等人J.Neurosc1.12:4565-4574(1992))是一种通过与其受体(EGFR)结合来调节增殖和分化的生长因子。EGF可利用常规重组技术产生或获自供应商(例如P印rotech Inc NJUSA, Stemgent IncUSA) 通常,培养基中EGF的浓度为2至200 μ g/ml,优选约20 μ g/ml。化学成分确定的培养基(CDM)也可以补充有一种或多种诱导肝细胞分化和成熟的因子,例如制瘤素-M (oncostatin-M)。制瘤素_M (NCBIGeneID:5008,核酸序列NM_020530.3G1:28178862,氨基酸序列 NP_065391.1G1: 10092621)是 IL-6 家族的细胞因子。制瘤素-M可以利用常规重组技术产生或获自供应商(例如R&D Systems, MN USA; AbeamLtd, UK)o通常,培养基中制瘤素-M的浓度可以为I至100 μ g/ml,优选约10 μ g/ml。肝祖细胞的群体可培养10至40天,优选约25天,以产生肝细胞的群体。肝细胞可以表达白蛋白,α 1-抗胰蛋白酶(AAT),细胞色素p450 (CYP)例如CYP3A4、CYP1A2、CYP2E1、CYP2C19、CYP2C9 和 CYP2D6,因子 IX,载脂蛋白 A2,CEBPa 和转甲状腺素蛋白(transthyretin)中的一种或多种。在一些实施方式中,肝细胞可以不表达祖细胞(progenitor)标记物如AFP、CK18和Soxl7中的一种或多种。可监测和/或检测细胞群体中一种或多种肝祖细胞标记物和/或一种或多种肝细胞标记物的表达。例如,可确定肝细胞的群体表达或产生的白蛋白和/或α 1-抗胰蛋白酶。这使得能够确定和/或监测培养的群体中分化的程度。可通过任何适合的技术来确定细胞标记物的表达,包括免疫细胞化学、免疫荧光分析、RT-PCR、荧光活化的细胞分选(FACS)以及酶分析。可以监测和/或确定执行一种或多种肝细胞功能的群体中细胞的能力。例如,可以监测和/或确定细胞执行解毒作用、糖原贮积、分泌AAT或白蛋白、胆汁产生、血小板生成素产生、血管紧张素产生、氨转化为尿素(尿素循环)、胆固醇合成、糖原分解、糖原生成和脂肪形成中的一种或多种的能力。可将肝细胞的群体与其他细胞类型基本分离。例如,在培养基中培养后,该群体可含有80%或更多,85%或更多,90%或更多,95%或更多,的肝细胞。如上文所述,可通过白蛋白和/或α 1-抗胰蛋白酶的 表达来确定群体中肝细胞的存在或比例。优选地,肝细胞的群体与不需要纯化的其他细胞类型充分分离。如果需要,通过任何常规技术(包括FACS)来纯化肝细胞的群体。可对在本文所述方法中的任意阶段产生的ADE细胞、肝祖细胞和/或肝细胞进行分离和/或纯化。可利用本领域技术人员公知的任何技术将细胞与群体中的其他细胞类型分离,包括那些基于通过抗体和磁珠或荧光活化细胞分选(FACS)来识别细胞外抗原决定簇(表位,epitope)的技术,包括使用抗如下文所述的特征标记物的细胞外区域的抗体。可利用标准哺乳动物培养技术来扩增、培养或保持如本文所述产生的肝细胞的群体。在一些实施方式中,可通过冷冻干燥和/或低温贮存来储存如本文所述产生的肝细胞的群体。可将肝细胞的群体与其他试剂混合,例如缓冲剂、载体、稀释剂、防腐剂或药用赋形剂。下文中更加详细地描述了适合的试剂。如上文所述,疾病特异性iPS细胞可用于产生显示出与肝病(例如MD)相关的表型的肝细胞。具有与疾病相关表型的肝细胞可以表现出一种或多种与该疾病相关的病理学(特征)。如本文所述的方法包括检测或测量肝细胞群体中的一种或多种疾病病理学。疾病病理学可以包括在所述肝细胞群体中的异常生长、细胞凋亡增加、异常基因表达;对胰升糖素(胰高血糖素,glucagon)刺激的异常响应;蛋白聚集或聚合;ER中的蛋白捕获(protein entrapment);胆固醇摄取;脂质和/或糖原累积;乳糖产生;以及上文所述的一种或多种肝细胞功能缺失中的一种或多种。产生具有疾病病理学的肝细胞的方法可以包括:如上文所述诱导ds-1PS细胞的群体的体外肝分化,从而产生具有疾病病理学的肝细胞的群体。来源于ds-1PS细胞的肝细胞可在从ds-1PS细胞开始分化的10天、20天或40天内显示出疾病病理学特征。在具有疾病表型(例如MD表型)的肝细胞产生后,可对其进行培养、扩增或保持,例如用于筛选。保持具有疾病表型的肝细胞的方法包括如上文所述培养来源于ds-1PS细胞的具有疾病表型的肝细胞群体。本发明的另一方面提供了由上述方法产生的分离的肝细胞的群体或肝祖细胞的群体。该群体可含有80%或更多,85%或更多,90%或更多,或95%或更多的肝细胞或肝祖细胞。由本文所述方法产生的肝细胞可以显示出一种或多种特异于成熟肝细胞的功能或功能性特征。例如,该肝细胞能够储存糖原和LDL、分泌AAT和/或白蛋白、通过CytP450途径代谢药物以及在肝细胞特异性Ap0AII启动子的控制下表达GFP蛋白。该肝细胞能够产生胆汁、血小板生成素(thrombopoietin)、血管紧张素、尿素和胆固醇中的一种或多种;并执行糖原分解、糖原生成和脂肪生成中的一种或多种。在一些实施方式中,肝细胞可以不完全分化为成熟的成体肝细胞而是可以继续表达一种或多种祖细胞标记物(例如AFP);表达降低水平的Alb和/或显示出与成熟成体肝细胞相比降低的CYP3A4活性。肝细胞可以显示出以下特征中的一种或多种:偶发性双核(occasionalbinucleity);糖原忙积;顶部微突(apical microprotrusion);粗糙和光滑内质网(ER)以及突出的高尔基体。由本文所述的方法产生的肝细胞或肝祖细胞不表达用于产生iPS细胞的外源性重编程因子,其仍可以作为逆转录病毒转基因(retroviral transgene)而存在于细胞中。肝细胞或肝祖细胞的群体可用于人体或动物体治疗的方法中,例如对具有损伤的或功能障碍的肝组织的患者进行治疗。该群体也可用于制造用于治疗损伤的或功能障碍的肝组织的药物。具有损伤的或功能障碍的肝组织的个体可能患有肝炎(例如、甲型、乙型、丙型、丁型、戊型、庚型或戌型肝炎(hepatitis K))、肝硬化、肝细胞癌、非酒精性脂肪性肝病、药物引起的肝损伤、酒精性肝病、自身免疫性肝病或遗传性代谢病例如α I型抗胰蛋白酶缺乏症、糖原贮积病例如Ia型糖原贮积病、家族性高胆固醇血症、遗传性(高)酪胺酸血症、克里格勒-纳贾尔(crigler-najjar)综合征、鸟氨酸氨基甲酰转移酶缺乏症、或因子IX缺乏症或其他血友病、血色病、威尔逊氏病(Wilson’s disease)、杜宾-约翰逊综合征(Dubin-Johnson syndrome)、家族性淀粉样变性病、或雷夫叙姆病(Refsum,s disease)。对于治疗性应用,该肝细胞优选为临床级肝细胞。对具有损伤的或功能障碍的肝组织的患者进行治疗的方法包括:向需要其的个体给予如上文所述产生的肝细胞或肝祖细胞的群体。
肝细胞的群体可以被移植、灌注(输注)或以其他方式给予至个体的肝脏中。适合的技术是本领域中公知的。肝细胞的群体可由来源于获自该个体的细胞的iPS细胞产生。在一些实施方式中,如上文所述,可在iPS细胞分化为肝细胞或肝祖细胞之前修正iPS细胞中的与疾病相关的突变或遗传缺陷。本发明的一些方面还扩展至包含如本文所述产生的肝细胞或肝祖细胞的药物组合物、药物、药品或其他组合物;包括向患者给予这样的肝细胞或肝祖细胞的方法,例如如上文所述用于治疗(可包括预防性治疗)损伤的或功能障碍的肝组织;以及制造药物组合物的方法,包括将这样的肝细胞或肝祖细胞与药用赋形剂、媒剂或载体以及可选地一种或多种其他成分混合。向个体给予的肝细胞或肝祖细胞可被基因改造以产生治疗性分子,例如药物或生长因子(Behrstock S 等人,Gene Ther2006 年 3 月;13 (5):379-88,Klein SM 等人,HumGene Ther2005 年 4 月;16 (4):509-21)。本发明提供了含有根据本发明产生的肝细胞或肝祖细胞以及一种或多种其他组分的组合物。除了肝细胞之外,根据本发明并且根据本发明使用的药物组合物还可包含药用赋形剂、载体、缓冲剂、防腐剂、稳定剂、抗氧化剂或本领域技术人员公知的其他物质。这样的物质应该是无毒的并且应该不会妨碍肝细胞的活性。载体或其他物质的准确性质取决于给药途径。液体药物组合物通常包括液态载体,例如水、石油、动物油或植物油、矿物油或合成油。可以包括生理盐水溶液、组织培养液或细胞培养液(tissueor cell culturemedia)、葡萄糖或其他糖溶液或二醇类例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。该组合物可以为可肠胃外施用的水溶液,其是无热原的并且具有适合的pH、等张性和稳定性。相关技术领 域的技术人员能够利用例如等张媒剂如氯化钠、林格氏注射液或乳酸化林格氏注射液很好地制备适合的溶液。可利用人工脑脊髓液来制备组合物。可通过本领域已知的任何技术将肝细胞或肝祖细胞移植到患者体内(例如 Lindval 1,0.(1998) Mov.Disord.13,Suppl.1: 83-7 ; Freed, C.R 等人,(1997)Cell Transplant,6,201-202;Kordower 等人,(1995)New England Journalof Medicine,332,1118-1124;Freed,C.R., (1992)New England Journal ofMedicine, 327,1549-1555,Le Blanc 等人,Lancet2004 年 5 月 I 日;363 (9419): 1439-41 )。尤其是,可将细胞悬液注射到患者的门静脉(portal vein)中。优选以“预防有效量”或“治疗有效量”(尽管预防在有些情况下也被认为是治疗)给予根据本发明的组合物,其足以显示出对于个体的益处。实际给予的量,以及给药的速率和时程将取决于所治疗的疾病的性质和严重程度。治疗的处方例如剂量的确定等是普通医疗从业人员和其他医生的职责。取决于所治疗的病症,可单独给予组合物或与其他治疗同时或顺序地联合给予组合物。在一些实施方式中,如本文中所述产生的群体中的肝细胞或肝祖细胞可显示出正常的表型。例如,细胞可获自具有肝损伤或功能障碍的个体并且可用于产生iPS细胞。在一些实施方式中,该iPS细胞可以含有突变或基因缺陷并且可利用常规重组技术来修正这种突变或缺陷以产生具有正常表型的iPS细胞。可由本文中所述的这些iPS细胞产生具有正常表型的肝细胞或肝祖细胞,并将其移植到患者体内以修复或改善肝损伤或功能障碍。在其他的实施方式中,如本文中所述产生的群体中的肝细胞或肝祖细胞可显示出疾病表型。例如,细胞可获自具有肝损伤或功能障碍的个体并被用于产生疾病特异性iPS(ds-1PS)细胞。具有疾病表型的肝细胞或肝祖细胞可获自如本文中所述的这些iPS细胞。然后可对这些细胞进行处理以恢复正常表型。例如,可体外修正引起疾病表型的基因突变或缺陷。各种技术均可用于修正分离的哺乳动物细胞中的基因突变或缺陷。在缺陷或突变被修正并恢复了正常表型之后,可将肝细胞或肝祖细胞移植到患者体内以修复或改善肝损伤或功能障碍。如上文所述产生的肝细胞的群体可用于模型化测试化合物与肝细胞之间的相互作用,例如在毒性筛选、模型化肝病和筛选具有潜在治疗效果的化合物中。用于筛选化合物的方法可包括:使通过上文所述方法产生的肝细胞的群体与测试化合物接触,以及确定该测试化合物对所述肝细胞的影响和/或所述肝细胞对该测试化合物的影响。肝细胞可显示出正常表型或疾病表型。相对于不存在测试化合物的情况,可在存在测试化合物的情况下确定肝细胞的生长或存活力。生长或存活力的下降是该化合物具有肝毒性效应的指征。相对于不存在测试化合物的情况,可在存在测试化合物的情况下确定基因表达。例如,可确定白蛋白,α 1-抗胰蛋白酶(AAT),细胞色素p450酶例如CYP3A4、CYP1A2、CYP2E1、CYP2C19、 CYP2C9和CYP2D6,因子IX、载脂蛋白A2,CEBPa和/或转甲状腺素蛋白的表达。表达的下降是化合物具有肝毒性效应的指征。基因表达可例如通过RT-PCR以核酸水平来确定,或例如通过免疫学技术(如ELISA)或通过活性测定以蛋白质水平来确定。细胞色素P450测定(例如发光测定、荧光测定或生色测定)是本领域中公知的并且可从供应商处获得。可以确定测试化合物通过肝细胞的代谢、降解或分解。在一些实施方式中,可以连续地或在一个或多个时间点确定或测量测试化合物和/或所述测试化合物的代谢产物的量或浓度随时间的变化。例如,可以确定或测量测试化合物的量或浓度的下降和/或所述测试化合物的代谢产物的量或浓度的增加。在一些实施方式中,可以确定测试化合物和/或代谢产物的量或浓度的变化。适合用于测量测试化合物或代谢产物的量的技术包括质谱测定法。这可用于确定测试化合物的体内半衰期、毒性、效力或其他体内性质。相对于不存在测试化合物的情况下,可在存在测试化合物的情况下确定和/或测量肝细胞的一种或多种功能。例如,可以确定和/或测量肝细胞执行有机化合物的解毒作用、糖原贮积、AAT或白蛋白分泌、胆汁产生、血小板生成素蛋白产生、血管紧张素产生、氨转化为尿素、胆固醇合成、糖原分解、糖原生成和脂肪生成中的一种或多种的能力。相对于不存在测试化合物的情况,在存在测试化合物的情况下肝细胞执行这些功能中的一种或多种的能力下降是该化合物具有肝毒性效应的指征。用于筛选可用于治疗肝病的化合物的方法可包括:
使如上文所述产生的显示出疾病表型的肝细胞群体与测试化合物接触,以及
确定该测试化合物对所述肝细胞的影响。
该肝细胞可以显示出疾病表型。可以确定测试化合物对肝细胞中一种或多种疾病病理学的影响。例如,可以确定测试化合物对细胞生长、基因表达、蛋白质聚集或聚合;ER中的蛋白质捕获;胆固醇摄取、脂质和/或糖原累积;以及乳酸产生中的一种或多种的影响。
适合的技术是本领域中公知的并且包括免疫染色、质谱、蛋白质印迹法和酶促测定。
相对于不存在测试化合物的情况,在存在测试化合物的情况下肝细胞中一种或多种疾病病理学的减少或改善 可以是该测试化合物可用于治疗肝病(例如遗传性代谢病症)的指征。上文中提供了遗传性代谢紊乱的实例。
本文中所述的方法可以包括鉴定使得肝细胞中的一种或多种疾病病理学(例如IMD病理学)减少或改善的测试化合物的步骤。使得疾病病理学减少的化合物可用于开发用于治疗肝病的治疗方法。
在其他的实施方式中,肝细胞可显示出正常的表型并且可以例如来源于相对于一般群体具有肝病的高患病风险或高易感性的个体。可以确定测试化合物对细胞生长或基因表达,例如细胞色素 p450 (CYP)如 CYP3A4、CYP1A2、CYP2E1、CYP2C19、CYP2C9 和 CYP2D6 中的一种或多种的表达的影响。可以确定测试化合物对肝细胞的一种或多种功能的影响。例如,可以确定和/或测量相对于不存在测试化合物的情况下,在存在测试化合物情况下肝细胞执行有机化合物的解毒作用、糖原贮积、AAT或白蛋白分泌、胆汁产生、血小板生成素蛋白产生、血管紧张素产生、氨转化为尿素、胆固醇合成、糖原分解、糖原生成和脂肪生成中的一种或多种的能力。
相对于不存在测试化合物的情况,在存在测试化合物的情况下基因表达、生长和/或一种或多种功能的提高可以是该化合物可用于治疗肝病例如肝炎(例如,甲型、乙型、丙型、丁型、戊型、庚型或戌型肝炎)、肝硬化、肝细胞癌、非酒精性脂肪性肝病、药物引起的肝损伤、酒精性肝病或自身免疫性肝病的指征。
在鉴定能够减少或改善肝细胞中的一种或多种疾病病理学的化合物之后,可对该化合物进行修饰以优化其药学性质。这可利用本领域中公知的模型化技术来进行。
可利用一次或多次二次筛选对利用一次或多次初始筛选鉴定出的能够减少或改善肝细胞中的一种或多种疾病病理学(例如MD病理学)的测试化合物进行进一步评价。
二次筛选可涉及例如在动物模型中对生物学功能和或活性进行体外和/或体内测试。例如,可以确定测试化合物减少或改善疾病的动物模型中与肝病相关的一种或多种症状或病理学的能力。
在鉴定出能够减少或改善肝细胞中一种或多种疾病病理学的测试化合物之后,分离和/或纯化该化合物,或可替代地利用重组表达或化学合成的常规技术来合成该化合物。此外,可在制备(即,组合物的制造或配制)中制造和/或使用该化合物,例如,药物、药物组合物或药品。可将它们给药至个体以用于治疗肝病。
根据本文公开内容,对于本领域技术人员而言,本发明的各个其他方面和实施方式是显而易见的。
本申请说明书中提到的所有文献均以其全文结合于本文作为参考。
本文中使用的“和/或”被理解为具体披露两个具体特征或组分中的每一个或两者,包括另一者或不包括另一者。例如,“A和/或B”被认为具体披露了(i) A, (ii) B和(iii)A和B中的每一种,就像本文中单独提到每一种时一样。
除非上下文中另外指出,上文中所述特征的描述和定义不限于本发明的任何特定方面或实施方式,而是等同地适用于所述的所有方面和实施方式。


现在以举例的方式并参照附图和下述表格来说明本发明的某些方面和实施方式。
图1至图5示出了由疾病特异性hIPSC (dhIPSC)生成肝细胞。
图1示出了概括了用于使dhIPSC文库分化为肝细胞的实验方案的流程图。
图2示出了标记肝细胞发育关键阶段的特异性蛋白表达的免疫染色分析(第4天内胚层:CXCR4、Soxl7和Foxa2 ;第20天,肝祖细胞CK18、CK19和α胎蛋白(AFP);第25天,胎肝细胞:白蛋白(Alb)、AFP和α 1-抗胰蛋白酶(ΑΑΤ))。
图3示出了标记dhIPSC分化为肝细胞的关键阶段的基因表达的实时PCR分析。
图4示出了在确定的培养条件下来源于hESC的确定型内胚层向胎肝细胞的分化。图4A示出了在诱导肝分化的条件下在生长25天的DE细胞中肝细胞标记物的表达。图4B示出了 FACS分析,其示出了白蛋白(ALB) α -1-抗胰蛋白酶(AAT)和α -1-胎蛋白(AFP)在来源于hESC的胎肝细胞中的共表达(第25天)。图4C示出了 hESC来源的肝胎细胞中白蛋白(ALB)、角蛋白18 (CK18)和α-1-抗胰蛋白酶(AAT)的表达的免疫染色分析(第25天)。比例尺为50 μ Μ。图4D示出了 ELISA分析,其示出了 hESC来源的肝胎细胞的培养基中的α -1 -抗胰蛋白酶(AAT )和白蛋白分泌。图4E示出了在hESC来源的肝胎细胞中可由地塞米松(DEX)诱导的CYP3A4活性。图4F示出了 DIL测定,该测定显示出胆固醇的摄取和PAS染色,其中PAS染色示出hESC来源的胎肝细胞中的糖原贮积。比例尺为50 μ M0
图5示出了在如FACS分析所示肝分化25天之后表达白蛋白的细胞的部分。
图6示出了通过透射电子显微镜进行的dhIPSC来源的肝细胞的形态学分析,显示出存在(I)顶绒毛状突起(apical microvilli )和(2)糖原玫瑰花结(glycogen rosette)。所示出的该数据获自一个细胞系(line)(患者1,细胞系I),但其为所有类似特征的细胞系的代表性细胞系。
图7至图10示出了 利用dhIPSC的α 1-抗胰蛋白酶缺乏症(AlATD)的体外模型化。
图7示出了分化为肝细胞的lATD-dhlPSC,其显示出包括存在如过碘酸雪夫氏染色(PAS) (Glycogen)所示的细胞内白蛋白(Albumin)、糖原忙积的原代人肝细胞的功能活性特征,如荧光素化低密度脂蛋白(DIL)结合(LDL结合)所示的低密度脂蛋白胆固醇摄取,白蛋白分泌和活性CytP450代谢(Cyp3A4活性)。
图8示出了在患者特异性肝细胞(A1ATD,上部图)和对照hIPSC来源的肝细胞(对照,下部图)中利用聚合物特异性2C1抗体(中间图,绿色荧光)或检测所有形式的α 1-抗胰蛋白酶(左侧图,红色荧光)进行的错折叠的聚合α 1-抗胰蛋白酶表达的免疫染色分析。
图9示出了来源于AlATD dhIPSC的肝细胞微粒体亚细胞部分的内切糖苷酶H(Endo H)消化,证实了错折叠的聚合α 1-抗胰蛋白酶蛋白在内质网中保持。η=3
图10示出了 ELISA以评价在用MG132蛋白质体(proteosomal)抑制过夜之后,患者特异性(AlATD)和对照hIPSC来源的肝细胞(对照)的细胞内表达(细胞)和所有(All)以及聚合的(Polymeric) α 1-抗胰蛋白酶蛋白的分泌(培养基)。η=3
图11和图12示出了利用dhIPSC进行的家族性高胆固醇血症的体外模型化。
图11示出了分化为肝细胞的FH-dhIPSC,其显示出包括细胞内存在白蛋白(Albumin)、糖原忙积(Glycogen)、白蛋白分泌和活性CytP450代谢(Cyp3A4活性)的原代人肝细胞的功能活性特征。
图12示出了荧光素化的低密度脂蛋白结合的FACS分析,其证实了与阳性对照(对照,蓝色曲线)相比,FH-dhIPSC来源的肝细胞(ra,红色曲线)缺少有效吸收低密度脂蛋白的能力。使用在不存在LDL的条件下生长的hIPSC作为阴性对照(未染色)。
图13至图17示出了利用dhIPSC进行的Ia型糖原贮积病的体外模型化。
图13示出了分化为肝细胞的GSD-dhlPSC,其显示出包括细胞内存在白蛋白(Albumin)、白蛋白分泌和活性CytP450代谢(Cyp3A4活性)的原代人肝细胞的功能活性特征。
图14示出了过碘酸雪夫氏染色,其示出了与获自对照对象(对照)的hIPSC来源的肝细胞相比,GSD-dhlPSC来源的肝细胞(GSDla)中细胞内糖原的过量累积。n=3
图15示出了 BODIPY染色,其示出了与获自对照对象(对照)的hIPSC来源的肝细胞相比,GSD-dhlPSC来源的肝细胞(GSDla)中细胞内脂质的过量累积。n=3
图16示出了如PEPCK、G6P和IGFBPl的表达的qRT_PCR分析所示的dhIPSC来源的肝细胞适当上调高血糖素的转录靶,在用IOOnM盐酸高血糖素(升糖素)盐酸盐(glucagonhydrochloride)刺激0、1、2和3小时候进行分析。
图17示出了当利用24小时收集细胞培养基的ELISA进行评价时,GSD-dhlPSC来源的肝细胞(GSDla)与来自对照对象的hIPSC来源的肝细胞(对照)分泌更多的乳酸盐(GSDla)0 n=3
图18示出了 PI3K抑制剂的实例。
图19示出了 c-hIPSC来源的肝细胞样细胞中恢复的AlAT的功能性分析。图19A示出了免疫荧光结果,其 示出了由c-hIPSC生成的肝细胞样细胞中不存在聚合的AlAT蛋白。所有形式的AlAT (左图)和错折叠的聚合12A1AT (中间图)。图19B和图19C示出了 ELISA数据以评价来源于AlATD-hlPSC (ZZ)、chIPSC (RR)和对照hIPSCs (++)的肝细胞样细胞中聚合AlAT蛋白的细胞内水平(19B)和分泌水平(19C)。图19D示出了由未修正的(ZZ)、修正的(RR)和对照(++)hIPSC来源的肝细胞样细胞(上图)和对应的培养基(下图)免疫沉淀AlAT的内切糖苷酶H (E)和肽:N-糖苷酶(P)消化。图19E示出了糜蛋白酶ELISA,其示出了修正的细胞(RR)具有优于未修正细胞(ZZ)且接近于成体肝细胞的AlAT酶抑制活性。图19F和图19G示出了检测人白蛋白(图19F)和AlAT (图19G)的移植的肝部分的免疫荧光。用DAPI复染DNA。图19H示出了小鼠血清中人白蛋白的ELISA读数,对每只小鼠进行纵向跟踪。星号:对小鼠进行组织学分析。比例尺:100μπι。B、C和E中的数据以平均值土s.d.(n=3)示出。进行学生氏t检验。NS:不显著。
具体实施方式
SM.

hIPSC衍牛和培养
在经过适当的伦理学审查和患者同意之后,从在Addenbrooke’s Hospital就医的志愿患者获得8mm皮肤穿孔活检(伦理委员会编号08/H0311/201 ;R&D No:A091485)。成纤维细胞利用标准化实验室实验方案获自在GMP条件下捐献的组织,并在标准成纤维细胞培养基中进行扩增。另外的成纤维细胞样品获自INSERM (法国)和Coriell Biorepository 如表I中详细记载的,从7位不同的患者总共获得5个不同的疾病样品。莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus)来源的载体均含有四个人基因(0ct_4、Sox2、c_Myc和Klf4)之一的编码序列,而相应的病毒颗粒由Vectalys (Toulouse,法国)生成并用于以10倍的多重感染力感染成纤维细胞,如Yamanaka和他的同事原来描述的以及我们最近描述的[29]。衍生完成后,在标准hESC 培养条件(knockout [KSR],(Gibco) +FGF2 (4ng/ml; R&DSystems Inc.,Minneapolis)下在含有经辐照的小鼠饲养细胞的培养皿中培养hIPSC。_3] RNA提取和实时聚合酶链反应
利用RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden,德国)从hIPSC或分化的祖细胞提取总RNA。用无RNA酶的DNA酶(RNase-Free DNase) (Qiagen)处理每个样品以避免DNA污染。对于每个样品,利用 Superscript II Reverse Transcriptase( Invitrogen)逆转录0.6 μ g的总RNA。如所述制备实时聚合酶链反应(PCR)混合物(SensiMiX实验方案;Quantace,伦敦),然后在94° C变性5分钟并在94° C循环30秒,在60° C循环3秒,并在72° C循环30秒,接着在完成40次循环之后在72° C最后延伸10分钟。在别处描述了引物序列[16]。利用Stratagene Mx3005P (La Jolla, CA)—式三份进行实时PCR反应并在同一次运行中归一化为胆色素原脱氨酶(porphobilinogen deaminase, PB⑶)。QPCR数据表不为三次独立实验的平均值,误差条指示平均值的标准误差。在末尾处的表格中列出了用于实时PCR分析的引物。_5] 免疫荧光
在4° C在4%多聚甲醒(paraformaldehyde)中将hIPSC或其分化的祖细胞固定20分钟,然后在PBS中洗涤3次。在室温下将细胞在含有10%驴血清(Serotec Ltd.)的PBS中培养20分钟,并随后与溶解在1%驴血清的PBS溶液中的一抗一起在4° C培养过夜,如下所述:Oct-4 (1:100; Abeam ab 18976 [Cambridge, U.K.])、Sox2 (1:100; Abeamab15830)、Brachyury (1:100;Abeam ab20680 或 R&D Systems Inc.) > Sox17(R&D SystemsInc.)、FoxA2 (1:50 ; Abeam ab5074)、GATA4 (1:250; Santa Cruz Biotechnology Inc.) >GATA6(1:200;Abeam ab22600 或 Santa Cruz Biotechnology Inc.) > CXCR4(1:100;R&DSystems Inc.或 BD Pharmingen)、CK18 (1: 50,Dako)、CK19 (1:50,Dako)、白蛋白(1:100; R&D1455)、α -胎蛋白(1: 300,Dako A008)、α 1-抗胰蛋白酶(1: 100,SigmaA0608)。然后将细胞在PBS中洗涤3次并与德克萨斯红或结合了异硫氰酸荧光素的抗小鼠IgG(Sigma-Aldrich; 1:200,在 1%驴血清的 PBS 溶液中)或兔 IgG( Jackson Laboratory, BarHarbor, ME; 1:400,在驴血清的 PBS 溶液中)或山羊 IgG (Jackson Laboratory; 1:400,在驴血清的PBS溶液中)在室温下一起培养2小时。 通过在PBS中洗涤3次除去未结合的二抗。向第一洗漆物中加入Hoechst33258( Sigma-Aldrich; 1:10,000)。为了使脂质可见,使用脂质特异性染色 BODIPY (硼-二吡咯亚甲基染料;B0DIPY 493/503Invitrogen.D-3922)。
畸胎瘤(Teratomas)
机械收集hIPSC后立即进行移植,并且将大约IO6个细胞接种于8周龄C.B.-17/GbmsTac-scidbgDFN7 雄性小鼠(Taconic M&B, ejby, Denmark)的辜丸囊之下,在20° C-24° C,50%室内湿度,14小时-10小时的亮-暗循环以及充足食物和水的条件下圈养并保持。60天处死小鼠,然后利用剃刀刀片(razor blade)将经注射的睾丸切成等份。将材料在4%中性缓冲甲醛中固定过夜,并通过醇/ 二甲苯的分级系列将其脱水。将组织包埋在石蜡中,以5 μ m连续切片,之后进行H&E染色和表征。通过原位荧光杂交来证实所选区域的人类来源(人特异性探针,CEP XY;Vysis Inc., Downers Grove, IL)。实验经动物实验地区委员会(Regional Committee for Animal Experimentation)允许后进行(Stockholm, Sweden;Dnr N107/06)。
核型分析(Karytotype analysis)
使hIPSC在IOcm培养皿上生长至汇合(confluency),然后收获,中期染色体涂片(metaphase spread)通过剑桥大学医院细胞遗传学诊断学实验室获得。
hIPSC向肝细胞的分化
利用5mg/ml胶原酶IV/分散酶(0.1%, GIBCO) 1:1 (v/v)混合物将hIPSC传代;然后将其转移至预先涂覆有CDM-PVA中的胎牛血清(FBS)的平板上或如前所述转移至预先涂覆有人纤连蛋白的平板中[16]。对于接下来的第一天,细胞在补充有CHIR99021(3 μ M, Stemgent)、Ly294002 (10 μ M, Calbiochem)、活化素(100ng/ml, R&D systems)、FGF2(40ng/ml, R&D systems)和 BMP4 (lOng/ml, R&D systems)的 CDM-PVA 中生长,以使得 hIPSC分化为原条样细胞(primitive streak like cell)。在第二天,使得到的细胞在补充有Ly294002 (10 μ Μ, Calbiochem)、活化素(100ng/ml)、FGF2 (40ng/ml, R&D systems)和 BMP4(10ng/ml,R&D systems)的CDM-PVA中生长,以使得它们朝向确定型内胚层(definitiveendoderm)分化。在第三天,将基础培养基换成RPMI (Gibcol640)并补充有活化素(IOOng/ml, R&D systems)、FGF2 (40ng/ml, R&D systems)和B27以获得前层确定型内胚层细胞(ADE)。为了诱导肝内胚层,然后将ADE细胞在补充有活化素(50ng/ml,R&D systems)的RPMI (Gibcol640)存在条件下培养5天。最后,为了使所得的肝祖细胞成熟,使细胞在补充有 HGF (20 μ g/ml, Peprotech)和制瘤素 M (10 μ g/ml, R&D)的 CMRL/Hepatozyme(Invitrogen)基础培养基中生长。
流式细胞术
为了检测白蛋白阳性细胞,在肝细胞分化实验方案结束时将贴壁细胞在PBS中洗涤两次,然后在细胞分裂缓冲液(Invitrogen,Carlsbad, CA)中在37° C培养20分钟。通过轻柔地移液管吸打分离细胞并在含有0.1%叠氮化物(azide)(Serotec Ltd., Oxford, U.K.)和0.l%Triton-X的PBS+3%正常山羊血清(NGS)中以大约0.1-1XlO5个细胞/ml重悬浮。然后在4° C将细胞与原代小鼠抗人白蛋白抗体(R&D1455; 1/100)或小鼠IgG同种型对照(BD Pharmingen)一起培养 40 分钟。然后通过 FACS Calibur 机(BDBiosciences, SanJose,加利福尼亚州,USA)对细胞进行分析。记录白蛋白阳性细胞的数目,其为三次单独实验的平均值。
禾1|用石典克》酉享(OptiPrep Axis Shield2010)步讲梯度矛口 EndoH消ih讲对于亚细胞分级分离
使dhIPSC来源的肝细胞在6孔平板中生长并利用细胞刮刀收获细胞。然后通过使细胞在具有小球的均质器中反复通过将其机械破坏。以3000g离心细胞悬液5分钟(4° C),稀释上清液至35%0ptiPr印的最终浓度并将其转移至新的离心管中。小心地使2ml的30%0ptiPrep和Iml的0%0ptiprep在上清液顶部上顺序分层并以70,OOOg使管旋转2小时(4° C)。小心地抽吸在两个底层之间形成的液体界面并再次以100,OOOg旋转45分钟(4° C)。将随后形成的沉淀物(球粒,pellet)重悬浮于50 μ I缓冲液中并标记为微粒体部分。对于糖类内切酶H[EC3.2.1.96,糖肽-D-甘露糖基-N4-(N-乙酰基-D-葡糖胺基)2-天冬酰胺1,4-N-乙酰基-b-葡糖胺水解酶]消化,在37° C用500单位的EndoH酶(Boehringher Mannheim,曼海姆,德国)消化微粒体细胞部分3小时并如下文所述进行分析。
SDS PAGE和蛋白质印迹分析
将30 μ I样品与10 μ 14χ上样缓冲液(含有10% (ν/ν) β -巯基乙醇和4% (w/v)SDS)混合并利用8% (w/v)丙烯酰胺SDS-PAGE进行分析。在200mA下经2h将蛋白质从凝胶转移至Immobilon P膜(Millipore Corp.,Bedford, MA)上以用于进行蛋白质印迹分析。向转移缓冲液中加入20% (v/v)甲醇。转移后,在PBT (PBS+0.1% (v/v) Tween20)中洗涤膜并在PBT+5% (w/v)干燥的脱脂奶粉中阻断(封闭)过夜。第二天,将该膜与在PBT乳中以1:10,000稀释的抗-α 1-抗胰蛋白酶抗体一起培养I小时,用PBT以5分钟洗涤6次,然后与1:100, 000抗小鼠IgG辣根过氧化物酶抗体在PBT乳中培养I小时。在5分钟内用PBT再洗漆该膜 6 次并在显影前利用 ECL Super Signal West Femto maximum sensitivitysubstrate (Pierce)在PBS中洗漆15分钟并曝光膜。
α 1-抗胰蛋白酶的酶联免疫吸附测定(ELISA)
以2 μ g/ml在碳酸盐/重碳酸盐缓冲液(Na2C03/NAHC03,pH9.5)中用亲和纯化的抗α 1-抗胰蛋白酶兔多克隆抗体(Abcam31657,Cambridge, UK)涂覆高结合表面C0STAR96-孔板(Corning, NY, USA)过夜。洗涤(0.9%w/v NaCl, 0.05%v/v Tween20)后,将平板在阻断缓冲液(PBS,0.25%w/v BSA, 0.05%v/v Tween20)中阻断2小时。在阻断缓冲液中稀释样品(培养基或在 50 μ I 的 Nonidet 裂解缓冲液(150mM NaCl, 50mMTris-Cl, ρΗ7.5,1%(ν/ν))Nonidet Ρ-40中裂解的细胞)和标准品(等离子体纯化的M或Z α 1-抗胰蛋白酶)并向每个孔中加入50 μ 1,然后培养2小时。洗涤后,将孔与9C5或2C1单克隆抗体(I μ g/ml,在阻断缓冲液中稀释)一起培养,并培养2小时。用兔抗小鼠IgG HRP标记的抗体(SigmaAldrich, Haverhill, UK, 1:20, 000)检测结合的单克隆抗体I小时。用TMB液态底物(SigmaAldrich, Haverhill, UK)将反应在暗处显影10分钟,并用IM H2SO4终止反应。在Thermo-max微板读数器(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, U.S.A.)上在 450nm 处读取吸光度。对于蛋白体阻断试验,使细胞在6孔板中生长并在收获前16小时(过夜)向培养基中加入1/10,000稀释的MG132 (AG Scientific, USA)。对照样品与向其中加入的PBS体积相等。
白蛋白的酶联免疫吸附测定(ELISA)
剑桥大学医院生物化学诊断学实验室利用实验室人白蛋白特异性ELISA试剂盒(BioSupply UK)平行三次对24小时后收集的细胞培养基进行了分析。数值表示为ng/百万细胞/ml培养基。
细朐色素P450活件
根据制造商说明书利用P450-G1O测试试剂盒平行三次测量进行Cyp3A4活性试验。然后利用P450-GloMax96微板照度计(Iuminometer)分析细胞色素活性。
过碘酸雪夫氏(Periodic acid Schiff, PAS)染色
根据制造商说明书的指导利用试剂盒(Sigma395B_lKT)平行三次在细胞上进行PAS染色。随后进行淀粉酶(diastase)消化以证实阳性染色是由于存在糖原造成的。
诱射电子显微镜(TEM)
在0.9%NaCl中简单漂洗细胞并在4%戊二醛中在4° C固定2小时。然后在固定下从平板刮取细胞并通过漂洗重悬浮于0.1M PIPES中。通过TEM进行分析。
LDL 摄取
从(Stoughton, MA)购买Dil-LDL染色试剂盒并根据制造商说明书进行试验。实施FACS分析,比较ra疾病特异性hIPSC肝细胞中的Dil结合与对照(!fepG2细胞)中的Dil结合
GFP报告子
如前所述用AP0A-11-GFP慢病毒载体(Ientivector)转导细胞[16]并通过显微镜检查。
对高升糖素刺激的代谢酶应答
在补充有2mM L-谷氨酰胺、100U/1青霉素、100 μ g/ml链霉素、和0.5%牛血清白蛋白(全部来自Sigma-Aldrich)的无血清、高葡萄糖DMEM中培养dhIPSC来源的肝细胞 6 小时。用 IOOnM 盐酸高血糖素 23 (NovoNordisk, Bagsvaerd, Denmark)或PBS (Sigma-Aldrich)作为阴性对照刺激细胞。根据制造商的指导利用RNeasy Kit(Qiagen, Hilden,德国)在刺激后0、1、2或3小时收获总RNA并进行纯化。根据制造商的指导在25 μ I含有200U莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶、500ng随机引物和0.5mM脱氧三磷酸核苷(全部来自Promega, Wisconsin, MA)的反应混合物中在I μ gRNA上实施逆转录。利用Taqman PCR Mastermix (Applied Biosystems)和基因特异性正向引物和反向引物以及突光探针使 cDNA 在 ABI7900 检测系统(Applied Biosystems, Foster City, CA)上经历实时定量PCR。将所有结果归一化为人36B4作为参照基因。PEPCK (Hs00159918_ml)、G6P(Hs00609178_ml)和IGFBPl (Hs00426285_ml)的引物和探针作为预制储备购自AppliedBiosystems。利用 Sigma-Aldrich (正向引物:5,-GCAGATCCGCATGTCCCTT-3’ ;反向引物:5’ -TGTTTTCCAGGTGCCCTCG-3’;探针:5’ -[J0EE]AGGCTGTGGTGCTGATG[TAMRA]_3’)在实验室中设计并合成36B4的寡核苷酸。
AlATD-hlPSC 中 Z 突夺的修 if
AlATD-hlPSC如上文所述。将2 X IO6个hIPSC与ZFN表达载体以及供体模板共转染,并在转染后4天开始经历嘌呤霉素选择(I μ g/ml)。为于进行转位子(transposon)切除,用 pCMV-yPBase 转染靶细胞(Yusa,K.等人,PNAS U S A108, 1531-1536 (2011)),培养 4天,重新铺板并在250ηΜ1-(2-脱氧-2-氟代-β -D-阿糖呋喃基)_5_碘尿嘧啶(FIAU)中进行选择。为了增加克隆发生(clonogenicity),在分离前4小时和铺板后24小时用ROCK抑制剂26,Y-27632 (10 μ M)处理细胞。在2周后挑取得到的克隆,利用PCR进行分析并通过DNA印迹分析进一步证实。
免疫缺陷UPA转基因小鼠中的hIPSC来源的肝细胞样细胞移植
将所有小鼠在无热原条件下圈养,动物研究获得了 Institut Pasteur动物实验委员会和法国工业部的批准。将分化的细胞(5X IO5个细胞/动物在50 μ I DMEM中)注射到3-4周龄Alb-uPA+/+;Rag2-/-; I12rg-/_小鼠(n=7)小鼠的脾脏中。在移植2周后处死接受注射的小鼠以用于组织学分析。收集血液样品并利用ELISA (Bethy Laboratories)量化血浆中的人白蛋白。用人白蛋白(Dako)或人AlAT (Dako)特异性抗体利用免疫荧光来分析冷冻肝切片。未进行移植的小鼠用作对照。
益果
发现获自患病患者的5个hIPSC来源的肝细胞成功地概括了在相关疾病中观察到的细胞病理学的关键特征,例如错折叠的突变α 1-抗胰蛋白酶在内质网中的聚集、缺乏LDL受体介导的胆固醇摄取和细胞脂质升高以及糖原累积。这些数据首次证明了 hIPSC能够被用于模型化成体细胞中不同范围的遗传性疾病。
来自患有肝的遗传性代谢病(IMD)的患者的hIPSC文库的产生
皮肤成纤维细胞获自来自患有一定程度MD的7个个体和3个健康对照的皮肤活检切片(20hIPSC个细胞系,7位患者,5种疾病-表I)。然后利用Yamanaka等人[13]开发的四因子方法(four factor approach)将这些体细胞重编程为多能干细胞。对于每个个体,hIPSC衍生的成功率可在0.01%至0.1%的较大范围内变化,这证实了能够重编程来自不同年龄和性别的患者的皮肤成纤维细胞的现有可变性。在可能的情况下,随后3个hIPSC细胞系/个体用于进行进一步分析,以确定来源于相同个体的细胞系之间现有分化能力的保守可变性(conserved variability)。对所得的hIPSC细胞系的文库(来自10个个体的20个细胞系)的形态学、多能性标记物表达、体内和体外形成三个胚层的衍生物的能力、正常染色体组型以及内源性和外源性多能基因的表达谱进行表征。
所有的hIPSC均表达内源性多能性标记物并且能够分化为神经外胚层细胞、内胚层和中胚层细胞,这证实了我们能够从体细胞产生多能干细胞。令人感兴趣的是,hIPSC细胞系均能够分化为一个特定的胚层,这表明在为了本研究生成的hIPSC细胞系分化能力中不存在强可变性。此外,仅在化学成分确定条件下长时间生长的hIPSC (40代)中观察到异常的染色体组型。这暗示了用于扩增hIPSC的培养体系能够影响它们的遗传稳定性,如已针对人类胚胎干细胞(hESC) 描述的[14]。因此,仅“早期传代”的hIPSC (<p30)被用于本研究。病毒整合的数目在细胞系和患者之间是不同的(可变的),这支持前述的研究,这表明完全重编程与病毒整合的具体方式无关[15]。
最后,在我们的hIPSC细胞系中很少检测到外源性转基因的异位表达(ectopicexpression),这证明了我们的病毒载体在多能干细胞中待沉默的效力。所有这些结果表明,用于本研究生成的hIPSC细胞系被完全重编程,并因此表现出来源于患有IMD的患者的hIPSC细胞系的独特文库。
从患者特异性hIPSC产生肝细胞的有效且简单的方法的开发
我们最近已经开发出了使人ES和正常hIPSC分化为肝细胞的有效实验方法[16]。这种培养体系提供为分化的新方法提供了基础,并优选用于患者特异性hIPSC。我们的主要目的是开发一种能够使大量的hIPSC细胞系有效地分化为肝细胞的简单方法。来源于健康个体(n=6; 2种不同对象)和患有α 1-抗胰蛋白酶缺乏症(η=6; 3个不同患者)的个体的hIPSC细胞系用于经验性筛选大范围的培养条件。
图1中描述了所得的实验方案。该三步实验方案遵循肝细胞发育的天然途径的关键阶段。第一步由利用补充有活化素、FGF2、BMP-4和PI3激酶抑制剂的CDM-PVA培养基使hIPSC成为表达前层确定型内胚层的特异性标记物SOX17、CXCR4、fOXA2和Hex的内胚层细胞组成,其中肝细胞由该前层确定型内胚层产生(图1b和图lc)。然后利用活化素和B27补充剂使所得的内胚层细胞分化为表达AFP、CK18、CK19、HNF4和HNF6的肝祖细胞(图2、图3)。
到第25天,在补充有肝细胞生长因子(HGF)和制瘤素-M的CMRL/肝细胞培养基混合物中的最终成熟产生表达白蛋白和α 1-抗胰蛋白酶的肝细胞样细胞(图2、图3和图4)。FACS分析显示,在这些培 养条件下产生的细胞中的80%表达白蛋白(图4),这证实了利用这种方法产生的细胞群的同源性。到第25天,细胞表现出与人肝细胞的强烈形态学相似性,显示偶发性双核(图1)、糖原贮积和顶部微突(图5),粗糙和光滑内质网(ER)以及突出的高尔基体。另外,hIPSC来源的肝细胞与天然人肝细胞共有类似的体外功能特征,从而其能够储存糖原和LDL、分泌白蛋白、经由CytP450通路代谢药物(图6)并在肝细胞特异性Ap0AII启动子的控制下表达GFP蛋白。此外,在这些细胞中依然抑制外源性重编程因子的表达,这证实了逆转录病毒转基因中分化后保持沉默。
尽管这些数据提供了重要证据以示出在我们的培养体系中产生的肝脏细胞的相关功能性特征,但我们意识到这些细胞并没有最终分化,如通过其继续表达AFP所证明的(图2和图3)。相对而言,这些肝细胞有可能在胎儿胚胎发育的头三个月结束至完全的成体细胞之间的某处发育,如通过其α 1-抗胰蛋白酶基因表达水平和通过FCS观察到的白蛋白表达细胞的百分比所显示的(图1d)。
在我们的培养体系中产生的肝脏细胞表达肝细胞标记物,例如白蛋白(ALB)、α-1-抗胰蛋白酶(AAT)、aAP0F、TAT、TD02、TTR、HNF4a 和 HHEX (图 4A)。胎儿标记物如α甲胎蛋白(AFP)和CYP3A7的表达在整个分化过程中也得以保持,但成体细胞色素CYP3A4的表达仍然相对较低(图4A),这暗示了这些细胞为胎儿样肝细胞并且需要进一步成熟以产生成体细胞。这些观察结果通过免疫染色和FACS分析得到了证实,其示出了 ALB、细胞角蛋白18 (cytokeratinl8)、AAT和AFP的同源共表达(图4B和图4C)。然而,这些细胞也显示出肝细胞的功能性特征,例如(i) ALB和AAT分泌(图4D),(ii)可通过地塞米松诱导的Cyp3A4活性(图4E),(iii)胆固醇摄取和(iv)糖原贮积(图4F)。
最后,我们观察了将这种培养体系应用于大量的细胞系(来自10个个体的20个hIPSC细胞系),并且仅有两个hIPSC细胞系不能分化为肝脏细胞。
总之,这些结果证明了我们的确定培养条件使hIPSC分化为胎儿肝细胞的近似同源细胞群的效力,其显示出特异于成熟肝细胞的一些功能性特征。
利用患者特异性hIPSC的肝病的体外模型化:α 1-抗胰蛋白酶缺乏症
通过调查疾病特异性hIPSC (dhIPSC)来源的肝细胞是否能复制从其获得的疾病的关键特征来评价我们的方法用于体外模型化肝病的有效性。我们首先关注α -抗胰蛋白酶缺乏的dhIPSC。之前的研究已经显示出Z等位基因(Glu342Lys)导致形成保持在ER中的α 1-抗胰蛋白酶的有序聚合物[17]。这些聚合物累积在肝细胞中,使得纯合子容易发生新生性肝炎、肝硬化和肝细胞癌[18]。α 1-抗胰蛋白酶聚合的这种通路集中于临床表型[17]。因此,我们使用2C1聚合物特异性单克隆抗体[30]来检测α 1_抗胰蛋白酶缺乏dhIPSC来源的肝细胞中的聚合物。通过免疫染色(图8)并通过ELISA分析(图10)来检测聚合物。这些数据表明,α 1-抗胰蛋白酶聚合物的累积仅在来自患有α 1-抗胰蛋白酶缺乏症的个体的dhIPSC来源的肝细胞中发生。来自对照对象的hIPSC来源的肝细胞中均不存在聚合物。在用内切核苷酶H消化之后,通过细胞的亚细胞分级分离来证实聚合物的细胞定位(图9),内切核苷酶H是这样一种酶,在高尔基体中加入唾液酸之后其除去仍为高甘露糖ER形式的N-连接的聚糖而不影响寡糖链。
内切核苷酶H处理使得患者特异性hIPSC来源的肝细胞中的全部胞内α 1-抗胰蛋白酶减少至单一 50-kDa条带而对照hIPSC来源的肝细胞没有减少,这表明在ER中保留了所有这样的胞内α 1-抗胰蛋白酶。重要的是,观察到的聚合物增加在取自相同患者的三个不同hIPSC细胞系之间一致而在取自不同患者的hIPSC细胞系之间则有差异。这种表型差异性与患者中的疾病状态相关并因此反映了这种疾病的临床特征。然而,在来源于AlATD患者2的hIPSC细胞系中观察到低水平的聚合物表达,其也尤其耐内胚层分化。因此,在本研究中观察到的疾病表型中的差异性主要反映了 hIPSC实现有效肝分化的能力。
最后,为了研究这种细胞系将来用于体外药物筛选的潜在应用,我们评价了向培养基中加入蛋白酶体抑制剂(MG132)过夜的影响。这种重要蛋白降解途径的阻断揭示了α 1-抗胰蛋白酶聚合物的疾病特异性细胞内增加(图10)。综合这些结果表明,dhIPSC来源的肝细胞能够在体外模型化α 1-抗胰蛋白酶缺乏症的关键病理学特征并且还证明其将来可用于药物筛选试验。
利用患者特异性hIPSC进行肝病的体外模型化:家族性高胆固醇血症
为了证实我们的培养体系能够模型化临床疾病,以及为了研究其用于研究特异于其他亚细胞位置的疾病过程的潜力,我们表征了来自一位患有家族性高胆固醇血症(FH)的患者的dhIPSC来源的肝细胞。FH中的主要缺陷是LDL受体的功能削弱从而导致过量的血浆LDL和过早发生动脉粥样硬化[19]。从患有的个体产生的dhIPSC细胞系分化为表现出典型功能特征的肝细胞(图11)。分化细胞的蛋白质印迹分析证实了不存在LDL受体。
我们的模型中也保留了这种受体缺乏的体内功能意义(functionalimplication),如通过免疫染色和FACS分析所示出的,表明FH-dhIPSC来源的肝细胞与LDL结合的能力被削弱(图12)。这些结果表明,dhIPSC能够成功应用于模型化并且因此可适用于模型化涉及跨膜蛋白运输和受体功能紊乱的其他疾病。
利用患者特异性hIPSC进行肝病的体外模型化:Ia型糖原贮积病(GSD-1a)
最后,我们使用我们的方法模型化细胞质代谢削弱的代表性病症。GSD-1a是由葡萄糖-6-磷酸酶缺乏引起的,葡萄糖-6-磷酸酶是催化葡萄糖-6-磷酸酯水解为葡萄糖和磷酸酯的主要酶,这是糖原生成和糖原分解的最终步骤。患有GSD-1a的个体不能保持葡萄糖动态平衡而会发生高血脂、乳酸过多症、高尿酸血症、肝肿大、肾肿大和生长延迟[20]。使来自一个对象的三个GSD-1a细胞系分化并针对其肝细胞样特性表征所得的细胞(图13)。
在过碘酸雪夫氏染色之后观察细胞疾病表型的确认,其显示出与对照相比,GSDladhIPSC来源的肝细胞累积显著较高量的细胞内糖原(图14)。此外,相同的细胞还复制了疾病的其他特征,例如过量的脂质累积(图15)和乳酸的过量产生(图17)。关键的是,在胰高血糖素刺激之后细胞表现出三个典型相关胰高血糖素-响应基因的表达的诱导(图16)[21][22]。这些结果证明了不仅GSDla的关键细胞特性(cellular aspect)能够进行体外模型化,而且在我们的培养体系中产生的肝细胞还对中间代谢的关键激素显示出至少一些反应性,因此这暗示了我们的方法能够被应用于模型化其他更多的一般代谢紊乱。
通过开发使得大量hIPSC细胞系能够有效分化为成熟肝细胞状态细胞的简单的化学成分确定的培养体系,我们已经举例证明了几组非神经元来源的疾病的模型化,其表型为成体细胞中复杂蛋白失调的结果。我们已模型化的这三种疾病包括不同类型的病理学机制,从ER中的蛋白质错折叠到细胞表面受体功能障碍以及最后的细胞质代谢障碍,从而证明了这种新的方法的开发应用于其他研究领域的潜在广泛应用。
可通过首先考虑最常见的和最好表征的病症从我们的疾病类型α 1-抗胰蛋白酶缺乏症来举例说明我们的模型化系统的潜力。之前的研究已经证明了 ER中Z聚合物的错折叠和捕获是临床表型的根本机制[17]。然而,还没有解释具有相同表型的个体之间显示出的表型变化。这样的变化可能是由于不同患者处理错折叠蛋白的能力不同[23][24][8] [9,18] [7]。现在正在试图阐明负责处理这样的蛋白的肝细胞特异性质量控制机制[25,26]。尽管一种这样的途径(蛋白体)在一些肝细胞系[27]和肝外哺乳动物细胞系[28]中的Za 1-抗胰蛋白酶代谢中起到重要作用,但其在人类干细胞的蛋白体中仅能够近似处理蛋白(approximate protein handling)。此外,尽管我们增加了对蛋白质降解途径的理解,但仍然不清楚Za 1-抗胰蛋白酶的累积如何导致细胞死亡和肝功能衰竭。为了增加我们对这种机制和其他相关机制(对类似的蛋白质错折叠病症的病因是很关键的)的理解,阐明特异于人类肝细胞的蛋白质降解途径是研究的至关重要的下一阶段。通过产生能够保留疾病特异性蛋白质聚合和ER捕获的核心要素的患者特异性hIPSC来源的肝细胞,我们在本文中示出了能够利用该新型体外细胞体系来有效地研究这样的微妙细胞内过程。
此外,我们的数据还提供了相同细胞内过程可被准确保留的指征,尽管存在对细胞进行离体(离体回输)重编程和分化实验方案的高紧迫意义(stressful implication)[8,24]。
随后用我们的模型系统评价的两种其他疾病,强化证明了在以患者特异性方式利用dhIPSC中保留了肝细胞中蛋白质功能障碍的下游作用。我们首先通过复制缺少LDL受体介导的LDL脂质吸收到肝细胞中成功构建了家族性高胆固醇血症的新型细胞模型。!^模型示出了该平台如何唯一 地装配以提供控制受体功能障碍的肝细胞特异性固有过程的整体印象,从核合成到通过ER运输以及最终在细胞膜处回收。该平台可良好地适用于对大范围的各种肝相关受体病理学(receptoropathy)的其他后续研究。
hIPSC来源的肝细胞中基因缺陷的修IH
接下来,我们利用piggyback转位子修正了来源于患有α 1-抗胰蛋白酶缺乏症(AlATD)的个体的 hIPSC 的突变(Yusa 等人(2011)PNAS USA1081531-1536;Wang 等人(2008) 1059290-9295)。AlATD 是一种常染色体隐性(遗传)病症(autosomal recessivedisorder),以1/2000的比率在北欧世系的个体中发现并且为最常见的肝脏遗传性代谢病(Perlmutter, D.H.Cell Death Differl6, 39-45(2009);Gooptu, B.&Lomas, D.A.AnnuRevBiochem78, 147-176(2009))。其由AlAT基因(Z等位基因;Glu342Lys)上的单点突变造成,导致蛋白在肝细胞的内质网中形成有序的聚合物。所得的内含物引起肝硬化,目前肝硬化只能通过肝移植来治疗。供体的愈加不足和免疫抑制治疗的有害作用是器官移植的主要限制因素,使得基于hIPSC的治疗潜力高度引人关注。我们采用了 ZFN技术,其刺激hESC和hIPSC 中的基因革巴向(Urnov, F.D.et al.Nat Rev Genetll, 636-646 (2010).Hockemeyer, D.et al.Nat Biotechnol27, 851-857(2009);Zou, J.et al.CellStem Cell5, 97-110(2009))。ZFN对被设计为特异性切割Z突变的位点。利用piggyBac重复(侧接PGK-puix) tk基因盒)从同基因(isogenic) DNA构建祀载体。为了使突变和piggyBac转位子之间的距离最小,将CTG亮氨酸密码子(突变的IObp上游)转变为TTA亮氨酸密码子,形成TTAA序列,其将在piggyBac切除后留在基因组中。
通过PCR针对靶克隆筛选在ZFN表达载体的共电穿孔之后获得的耐嘌呤霉素hIPSC克隆和靶载体。来源于3位不同患者的AlATD-hlPSC细胞系产生靶克隆(表4)。显著地,54%的耐嘌呤霉素克隆靶向于一个等位基因,而4%的耐嘌呤霉素克隆同时靶向于两个等位基因。
为了从这些修饰的克隆除去piggyBac侧接的(flanked)选择基因盒,我们用过度活化形式的piggyBac转座酶顺时转染两个纯合的祀克隆(B-16和C-G4) (Yusa etal (2011) supra)并使它们经历FIAU选择。通过PCR分析所得的耐FIAU克隆的基因型并通过DNA印迹法确认。在11%的耐FIAU克隆中观察到双等位基因切除(表5)。序列分析证明了 Z突变在两个等位基因上被修正并且转座子切除产生了最初计划的TTAA序列。所得修正的AlATD-hlPSC (c -hIPSC)细胞系在超过20次传代中保持了多能标记物的表达以及其分化为表达三个胚层的标记物的细胞的能力,这证明了基因组修饰并未改变c-hIPSC的多能性。
我们利用比较基因组杂交(CGH)分析了 hIPSC细胞系的基因组完整性。三分之二的AlATD-hlPSC原代细胞系与它们的亲代成纤维细胞不同,这显示出20kb至1.3Mb的扩增或删除(缺失),包括获得(gain) 20ql1.21 (其为hESC中频繁扩增的区域)(Lefort, N.et al.Nat Biotechnol 26, 1364-1366 (2008) ; Spits, C.et al.NatBiotechnol26, 1361-1363(2008))。与其亲代成纤维细胞相比,细胞系A保留了正常基因组含量。令人备受鼓舞的是,我们发现在ZFN刺激的靶向之后,六个纯合子克隆中的四个具有与它们的亲代hIPSC细胞系相比未发生变化的基因组。将16个具有双等位基因piggyBac切除的细胞系与它们的相应原代hIPSC进行比较,12个细胞系具有未发生变化的基因组。我们还通过SNP测试分析了 hIPSC细胞系以检查杂合性的损失,并发现所分析的所有细胞系均在其整个基因组中保留了杂合性。这种观察结果证明了双等位基因的基因修正是由于在两个等位基因处同时切除后同时发生的同源重组,并且有丝分裂重组与这一过程无关。
我们对修正的B-16-C2细胞系及其亲代成纤维细胞的外显子组(exome)进行测序。比较这些外显子组识别出29个突变。通过原代hIPSC细胞系的分析和纯合靶向的中期基因(中间物,intermediate)来确定这些突变的起源(genesis)。在原代hIPSC细胞系中检测到24个点突变和一个Ι-bp缺失,并且在基因修正期间引发了 4个突变:一个在靶向期间,三个在PiggyBac切除期间。所出现的这些突变在培养过程中发生,因为它们的基因组标签(genomic signature)与ZFN脱祀(off-target)位点或piggyBac整合位点不一致。总之,我们得出结论认为ZFN与piggyBac的组合使得能够快速且彻底地修正hIPSC中的点突变,而不会影响它们的基本特征。
为了证实hIPSC的基因修正带来期望的表型修正,使hIPSC体外分化为肝细胞样细胞,其是受到AlATD疾病影响的主要细胞类型。如所期望的发生修正细胞系的分化,产生肝细胞样细胞的近似纯合群体。
显著地,分化细胞的CGH分析显示出肝分化既不增加基因异常的数目也不选择具有异常染色体组型的细胞。所得的细胞共有其体内配对物的关键功能性质,包括糖原贮积、LDL-胆固醇摄取、白蛋白分泌和细胞色素P450活性。重要的是,免疫荧光和ELISA均证实了在c-hlPSCs-来源的肝细胞样细胞中不存在突变聚合A1AT,而是有效分泌正常内切核苷酶H-不敏感的单体(monomeric)AlAT (图19A-图19D)。另外,分泌的AlAT显示出酶促抑制活性可比得上获自正常成体肝细胞的那些(图19E),从而指示了能够实现酶抑制活性的生理学恢复。
最后,在经由脾脏内注射移植到Alb-uPA+/+;Rag2-/-; 112rg_/_小鼠肝脏中之后评价c-hIPSC来源的肝细胞样细胞(B-C16-2细胞系)的体内功能。注射后14天收获的肝脏被发现通过利用特异于人白蛋白和AlAT的抗体鉴别的人类细胞克隆(图19F、图19G)。这些人肝细胞样细胞分布在整个肝页中并且观察到其被整合到现有的小鼠薄壁组织(parenchyma)中(图19F、图19G)。另外,在至少5周内检测到移植的动物的血清中的人白蛋白(图18H),而在小鼠中均未检测到肿瘤形成。因此,c-hIPSC-来源的肝细胞样细胞能够在体内克隆肝脏并且显示出它们的人ESC来源配对物的功能活性特征(Touboul,T.et al.Hepatology51, 1754-1765 (2010))。总之,这些分析证明了导致患者来源的细胞中AlAT功能恢复的Z突变的基因修正。
上述实验证据证明了用于基于细胞的AlATD治疗中的患者特异性iPSC中基因修正的适用性。利用由具有仙台病毒载体(Sendaiviral vector)的成纤维细胞重编程的患者特异性iPSC在众多临床相关细胞中重复进行基因修正,这是一种非整合型(integration-free) 方法(Fusaki, N.,et al.Proc Jpn Acad Ser B Phys BiolSci85, 348-362 (2009))。通过上述方法修正通过CGH分析具有完整基因组的原代hIPSC细胞系。最终产物iPSC-3-G5-A7具有经修正的A1AT,其与亲代成纤维细胞相比具有完整基因组,并且在分化为肝细胞样细胞时表达正常AlAT蛋白。这首次证明了突变修正的患者特异性iPSC的产生。
经修正的iPS C有效分化为肝细胞样细胞并将其移植到肝损伤而没有肿瘤形成的动物模型中。另外,发现来源于不同患者的hIPSC被有效修正,这表明本发明的方法能够适用于大量的AlATD-hlPSC细胞系。尽管双等位基因修正能够在少于4个月内进行,但我们的方法可与大规模产生经修正的患者特异性hIPSC相容,不仅适用于AlATD而且也适用于其他单基因病症。
因此,本研究以若干种方式处于先进的hIPSC领域。首先,证明利用单一平台模型化患有不同疾病的成体细胞的可能性回答了 hIPSC-疾病模型化领域中最紧迫的问题之一。因而这种认识使得我们提供了强有力且容易的可重现技术资源以用于不同研究领域的潜在应用。第二,通过证明hIPSC来源的肝细胞能够从不同遗传背景和疾病背景的多个患者产生,显示出我们的系统是一种用于早期安全和治疗性筛选可能与制药行业有关的肝脏靶标化合物的有效新方法。最后并且或许也是最重要的,证明了能够从一组疾病纯合衍生地得到大量的患者特异性肝细胞的能力,这对于基于细胞的治疗是理想的,说明我们已经朝向患者特异性hIPSC技术领域又迈进了一大步。
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30.Miranda, E.,et al.,(in press-Hepatology).表 I
权利要求
1.一种用于诱导肝分化的方法,包括: (i)提供诱导的多能干(iPS)细胞的群体, (ii)在内胚层诱导培养基中培养所述群体,以产生前层确定型内胚层(ADE)细胞的群体, 其中,所述内胚层诱导培养基为化学成分确定的培养基,其具有成纤维细胞生长因子活性并且刺激SMAD2和SMAD3介导的信号通路以及SMAD1、SMAD5和SMAD9介导的信号通路,并且抑制磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和糖原合酶激酶3 β (GSK3 β );以及 (iii)在肝诱导培养基中培养ADE细胞的群体,以产生肝祖细胞的群体, 其中,所述肝诱导培养基是化学成分确定的培养基,其刺激SMAD2和SMAD3介导的信号通路。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述内胚层诱导培养基包含成纤维细胞生长因子。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中,所述内胚层诱导培养基包含第一TGF3配体,其刺激SMAD2和SMAD3介导的信号通路。
4.根据权利要求3所述的方法,其中,所述第一TGFii配体为活化素。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述内胚层诱导培养基包含第二TGF β配体,其刺激SMAD1、SMAD5和SMAD9介导的信号通路。
6.根据权利要求5所 述的方法,其中,所述第二TGFii配体为骨形态发生蛋白。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述内胚层诱导培养基包含ΡΙ3Κ抑制剂和GSK3 0抑制剂。
8.根据权利要求7所述的方法,其中,所述ΡΙ3Κ抑制剂为LY294002。
9.根据权利要求7或8所述的方法,其中,所述GSK30抑制剂为CHIR99021。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述肝诱导培养基包含第一TGF β配体,其刺激SMAD2和SMAD3介导的信号通路。
11.根据权利要求10所述的方法,其中,所述第一TGFii配体为活化素。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,步骤(ii)包含: Ca)在所述内胚层培养基中培养iPSC的群体, (b)在缺少GSK30抑制剂的所述内胚层诱导培养基中进一步培养所述群体;以及 (c)在ADE诱导培养基中进一步培养所述群体,以产生所述前层确定型内胚层(ADE)细胞的群体,所述ADE诱导培养基刺激SMAD2和SMAD3信号通路并具有成纤维细胞生长因子活性。
13.根据权利要求12所述的方法,其中,所述ADE诱导培养基包含成纤维细胞生长因子。
14.根据权利要求12或13所述的方法,其中,所述AE诱导培养基包含第一TGFii配体,其刺激SMAD2和SMAD3介导的信号通路。
15.根据权利要求14所述的方法,其中,所述第一TGFii配体为活化素。
16.根据权利要求12至15中任一项所述的方法,其中,所述群体在步骤a)至步骤c)中均培养24小时。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法,进一步包括:(iv)在肝成熟培养基中培养所述肝祖细胞的群体,以产生肝细胞的群体。
18.根据权利要求17所述的方法,其中,所述肝祖细胞的群体培养10至20天,以产生所述肝细胞的群体。
19.根据权利要求17或18所述的方法,包括确定由所述肝细胞的群体产生的白蛋白和/或α 1-抗胰蛋白酶。
20.根据权利要求17至19中任一项所述的方法,其中,至少80%的所述肝细胞的群体表达白蛋白和/或α 1-抗胰蛋白酶。
21.根据权利要求17至20中任一项所述的方法,包括扩增所述肝祖细胞或肝细胞的群体。
22.根据权利要求17至21中任一项所述的方法,包括培养或维持所述肝祖细胞或肝细胞的群体。
23.根据权利要求17至22中任一项所述的方法,包括储存所述肝祖细胞或肝细胞的群体。
24.根据前述权利要求中任一项所述的方法,包括将所述肝祖细胞或肝细胞的群体与药用赋形剂混合。
25.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述iPS细胞为人iPS细胞。
26.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述iPS细胞被传代30次或更少。
27.根据前述权利要求中任一项所述 的方法,其中,所述iPS细胞来源于获自个体的成纤维细胞。
28.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述iPS细胞来源于获自具有损伤的或功能障碍的肝组织的个体的细胞,并且所述群体中的肝细胞表现正常表型。
29.根据权利要求28所述的方法,其中,所述iPS细胞中与肝病相关的基因突变或缺陷被修正,使得所述肝细胞表现正常表型。
30.根据权利要求29所述的方法,其中,所述肝病为遗传性代谢紊乱。
31.根据权利要求30所述的方法,其中,所述MD选自由α 抗胰蛋白酶缺乏症、糖原贮积病、家族性高胆固醇血症、遗传性酪胺酸血症、克里格勒-纳贾尔综合征、鸟氨酸氨基甲酰转移酶缺乏症、因子IX缺乏症、血色病、威尔逊氏病、杜宾-约翰逊综合征、家族性淀粉样变性病和雷夫叙姆病组成的组。
32.根据权利要求29所述的方法,其中,所述基因突变或缺陷为AlAT中的Glu342Lys突变,所述肝病为α I抗胰蛋白酶缺乏症。
33.根据权利要求1至27中任一项所述的方法,其中,所述iPS细胞来源于获自患有肝病的个体的细胞,并且所述群体中的肝细胞表现疾病表型。
34.根据权利要求33所述的方法,其中,所述肝病为遗传性代谢紊乱。
35.根据权利要求34所述的方法,其中,所述MD选自由α 抗胰蛋白酶缺乏症、糖原贮积病、家族性高胆固醇血症、遗传性酪胺酸血症、克里格勒-纳贾尔综合征、鸟氨酸氨基甲酰转移酶缺乏症、因子IX缺乏症、血色病、威尔逊氏病、杜宾-约翰逊综合征、家族性淀粉样变性病和雷夫叙姆病组成的组。
36.根据权利要求33至35中任一项所述的方法,包括检测或测量所述肝细胞的群体中的一种或多种疾病病理学。
37.根据权利要求36所述的方法,其中,通过测量或确定所述肝细胞群体中的蛋白质聚集或聚合;ER中的蛋白质捕获;胆固醇摄取;脂质和/或糖原累积;以及乳酸产生中的一种或多种来检测所述疾病病理学。
38.根据权利要求33至37中任一项所述的方法,包括修正所述群体中的所述肝细胞中的基因突变或缺陷,以使得所述肝细胞表现正常表型。
39.一种由根据权利要求1至35或38中任一项所述的方法产生的分离的肝祖细胞或肝细胞的群体,其中,所述祖细胞或肝细胞表现正常表型。
40.根据权利要求39所述的群体,其用于对人体或动物体进行治疗的方法中。
41.根据权利要求40所述的群体,其用于对具有损伤的或功能障碍的肝组织的患者进行治疗的方法中。
42.一种由根据权利要求3 6至37中任一项所述的方法产生的肝细胞的群体,其中,所述肝细胞表现疾病表型。
43.一种对具有损伤的或功能障碍的肝组织的患者进行治疗的方法,包括: 向需要其的个体给予根据权利要求39所述的肝细胞的群体。
44.权利要求39所述的群体在制备用于对具有损伤的或功能障碍的肝组织的患者进行治疗的药物中的应用。
45.一种筛选化合物的方法,包括: 使由根据权利要求1至38中任一项所述的方法产生的分离的肝细胞与测试化合物接触,以及 确定所述测试化合物对所述肝细胞的影响和/或所述肝细胞对所述测试化合物的影响。
46.根据权利要求45所述的方法,包括相对于不存在所述测试化合物的情况,在存在所述测试化合物的情况下确定所述肝细胞的生长或存活力或所述肝细胞执行一种或多种肝细胞功能的能力, 其中,生长、存活力或执行一种或多种肝细胞功能的能力下降是所述化合物具有肝毒性效应的指征。
47.根据权利要求46所述的方法,其中,确定所述肝细胞对所述测试化合物的代谢。
48.根据权利要求47所述的方法,包括确定或测量测试化合物的量或浓度的下降和/或所述测试化合物代谢物的量或浓度的增加。
49.一种筛选用于治疗肝病的化合物的方法,包括: 使由根据权利要求1至38中任一项所述的方法产生的肝细胞的群体与测试化合物接触,以及 确定所述测试化合物对所述肝细胞的影响。
50.根据权利要求49所述的方法,其中,所述肝细胞表现疾病表型,并且确定所述测试化合物对所述肝细胞中的一种或多种疾病病理学的影响。
51.根据权利要求50所述的方法,其中,确定所述测试化合物对蛋白质聚集或聚合;ER中的蛋白质捕获;胆固醇摄取;脂质和/或糖原累积;以及乳酸产生中的一种或多种的影响。
52.根据权利要求50至51中任一项所述的方法,其中,相对于不存在所述测试化合物的情况,在存在所述测试化合物的情况下所述肝细胞中的一种或多种疾病病理学的减少或改善是所述测试化合物可用于治疗肝病的指征。
53.根据权利要求49所述的方法,其中,所述肝细胞表现正常表型,并且确定所述测试化合物对所述肝细胞执行一种或多种肝细胞功能的能力的影响。
54.根据权利要求53所述的方法,其中,所述一种或多种肝细胞功能选自解毒作用、糖原贮积、分泌AAT或白蛋白、胆汁产生、血小板生成素产生、血管紧张素产生、氨转化为尿素、胆固醇合成、糖原分解、糖原生成和脂肪形成。
55.根据权利要求53至54中任一项所述的方法,其中,相对于不存在测试化合物的情况,在存在所述测试化合物的情况下所述肝细胞执行一种或多种肝细胞功能的能力提高是所述测试化合物 可用于治疗肝病的指征。
全文摘要
本发明涉及通过在内胚层诱导培养基中培养诱导的多能干(iPS)细胞以产生前层确定型内胚层(ADE)细胞的群体,然后在肝诱导培养基中培养该ADE细胞的群体以产生可以可选地分化为肝细胞的肝祖细胞的群体,从而诱导肝分化。该内胚层诱导培养基为具有成纤维细胞生长因子活性的化学成分确定的培养基,其刺激SMAD2和SMAD3介导的信号通路以及SMAD1、SMAD5和SMAD9介导的信号通路,并抑制磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和糖原合酶激酶3β(GSK3β);并且该肝诱导培养基是化学成分确定的培养基,其刺激SMAD2和SMAD3介导的信号通路。这些方法可用于例如产生肝细胞和肝祖细胞以用于基于细胞的治疗或疾病模型化。
文档编号C12N5/071GK103180436SQ201180051351
公开日2013年6月26日 申请日期2011年8月25日 优先权日2010年8月25日
发明者卢多维克·瓦利耶, 谢赫·塔米尔·拉希德, 尼古拉斯·汉南, 卓欣桦 申请人:剑桥实业有限公司

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