同时利用蔗糖和甘油的新的产琥珀酸突变微生物和利用其生产琥珀酸的方法

xiaoxiao2020-6-24  5

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专利名称:同时利用蔗糖和甘油的新的产琥珀酸突变微生物和利用其生产琥珀酸的方法
技术领域
本发明涉及一种能同时利用蔗糖和甘油作为碳源的产琥珀酸突变微生物。尤其是,本发明涉及一种能同时利用蔗糖和甘油以生产琥珀酸的产琥珀酸突变微生物,该突变微生物通过解除产琥珀酸微生物中的蔗糖介导的甘油分解代谢抑制机制而获得。
背景技术
琥珀酸是一种包含四个碳原子的二羧酸并能够被用于多种工业应用。琥珀酸可作为工业重要化学品(包括己二酸、1,,4- 丁二醇、乙二胺二琥珀酸盐、衣康酸、Y - 丁内酯、Y-氨基丁酸和四氢呋喃)的前体使用,并且琥珀酸(包括其前体)的全球市场规模估计大约 150 亿美兀(McKinlay 等,Appl.Microbiol.Biotechnol., 76:727, 2007)。随着当下对环境可持续发展的兴趣和因石油储备量减少和由此导致的价格波动,过去十年进行了生物基玻拍酸生产方面的全球性研究(McKinlay 等,Appl.Microbiol.Biotechnol.76:727, 2007 ;Song 等,Enzyme Microbial Technol., 39:352, 2006 ; Jantama 等,Biotechnol.Bioeng.,99:1140,2008)。尽管如此,时至今日已发现的任何种类的菌株都没有能够最大化琥珀酸的生产能力和产量的同时最小化副产物的产生。当生产能力高时,效率低,反过来,当效率高时,生产能力低。进一步说,当生产能力高时,也产生了大量副产物。因此,一种能够增加生产能力和产量同时只生产琥拍酸的理想菌株尚未被发现(Jantama等,Biotechnol.Bioeng.,99:1140,2008)。蔗糖的价格是常用于微生物发酵生产琥珀酸的葡萄糖价格的大约1/4。同时,随着全球生物柴油制造的快速增长,产生了作为副产物的甘油,其价格因超量供应和需要一种处理甘油的适当的方法而下降。因此,甘油的价格非常低并持续的下降(Miller-KleinAssociates, Oct.2006)。大部分微生物从不同的碳·源混合物中优先利用首选的碳源。为使其成为可能,大多数微生物拥有当首选碳源可用时抑制非首选碳源利用的分解代谢抑制机制(Gorke等,Nature Reviews, 6:613, 2008)。在受分解代谢抑制机制调节的碳源的优先利用方面,众所周知,如1942年Monod et al.所报道的,大肠杆菌在葡萄糖和乳糖都存在时呈现二次生长。在这里,首选的碳源是葡萄糖,大肠杆菌的二次生长曲线中,显示了葡萄糖彻底消耗后的短的滞后期后,开始消耗非首选碳源乳糖。因为这个分解代谢抑制机制,对于常规曼海姆菌株很难同时利用蔗糖和甘油。不过,利用甘油作为碳源具有许多优势。甘油是高度还原性的,当它作为碳源使用时,在中间体磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的生产中,比糖类(例如葡萄糖、木糖和蔗糖)产生多2倍的量的还原当量(熟0!1,嫩0 !^40!12等)。因此,甘油对于还原性化学品的生长是引人注目的碳源。(Yazdani等,Curr.0pin.Biotechnol., 18:213, 2007)。尽管如此,在很多情况下,在厌氧条件下的利用甘油的细胞生长速度比利用其他糖类的低,也因此使得利用甘油作为单一碳源虽然就还原力方面而言是有优势的,但是其显示出的低生长速度,使得在增加所需的生物产品的生产能力上受限制。
为克服该限制,如果能通过同时利用比甘油有更高利用速度且能使细胞生长处于更高水平和速度的糖类(例如蔗糖)增加甘油的利用速度,细胞便可以以高速度生长的同时可利用甘油的高还原力的优势,由此可以有效地生产还原性化合物,特别是琥珀酸。因此,本发明人为开发通过同时利用廉价的蔗糖和甘油以高效率生产高纯度的琥珀酸的方法进行了广泛的努力,结果发现当培养通过从产琥珀酸微生物中删除果糖磷酸转移酶编码基因或向微生物引入甘油激酶编码基因而获得的产琥珀酸突变微生物时,可解除突变微生物中的分解代谢抑制机制从而使该突变微生物实现以常规方法不能达到的同时利用蔗糖和甘油生产琥珀酸、使副产物的产生最小化,和以高效率和非常高的生产能力生产均一琥拍酸(homo-succinic acid),从而完成本发明。

发明内容
本发明的目的之一是提供一种突变微生物,其中解除了分解代谢抑制机制以便该微生物能够同时利用蔗糖和甘油,最大化琥珀酸的产量以接近理论水平,同时最小化副产物的产生,从而产生均一琥珀酸。本发明的另一个 目的是提供一种在厌氧条件下利用蔗糖和甘油作为碳源在所述的突变微生物中生产均一琥珀酸且不产生副产物的方法。技术方案为达到上述目的,本发明提供了一种能够同时利用蔗糖和甘油以生产琥珀酸的突变微生物,该突变微生物通过解除产琥珀酸微生物中蔗糖介导的甘油分解代谢抑制机制而获得。本发明还提供了一种制备能利用蔗糖和甘油以获得产琥珀酸突变微生物的方法,该方法包括解除产琥珀酸微生物中蔗糖介导的甘油分解代谢抑制。本发明还提供一种生产琥珀酸的方法,该方法包括步骤:在厌氧条件下培养前述产琥珀酸突变微生物;和从发酵液中回收琥珀酸。附图简述

图1示意性地显示了蔗糖和甘油的代谢途径和曼海姆菌株中的分解代谢抑制机制。确切地说,图1A显示了蔗糖和甘油常规的代谢途径和其中的分解代谢抑制机制,图1B显示了图1A中为解除分解代谢抑制机制有可能被代谢操作的部分(GLY,甘油;G3P,甘油-3-磷酸;SCR,蔗糖;G6P,葡萄糖-6-磷酸;FRU,果糖;F1P,果糖-1-磷酸;FBP, I, 6- 二磷酸果糖(果糖-1,6-二磷酸);PEP,磷酸烯醇式丙酮酸;SUC,琥珀酸;PYR,丙酮酸;IIBCF,果糖磷酸转移酶系统IIBC单元(fructose PTS IIBC unit) ;IIBCS,蔗糖磷酸转移酶系统IIBC单元(sucrose PTS IIBC unit) ;EI,酶I ;HPr,组氨酸蛋白;IIA,磷酸转移酶系统酶IIA (PTS enzyme IIA) ;Fpr,双功能果糖特异性IIA/HPr蛋白;AC,腺苷酸环化酶;cAMP,环腺苷酸;CRP,环腺苷酸受体蛋白)。图2为一组显示了获自曼海姆产琥珀酸菌PALK(图2A)、曼海姆产琥珀酸菌PALFK(图2B)和曼海姆产琥珀酸菌PALKG (图2C)的分批补料培养物的细胞生长情况和代谢产物的图表。图3为显示了获自以增加的量接种的曼海姆产琥珀酸菌PALFK菌株的分批补料培养物的细胞生长情况和代谢产物的图表。
图4A为显示了 MCRB培养方法的示意图,其中实线表示液流(培养基、包含细胞的培养基、包含代谢物的培养基等),虚线表示气流(二氧化碳)。图4B为显示获自使用MCRB培养方法的曼海姆产琥珀酸菌PALFK株的培养物的细胞生长情况和代谢产物的图表。
具体实施例方式除非另有定义,在此使用的全部科技术语与本发明所属技术领域普通技术人员通常的理解具有相同的含义。通常地,在此使用的术语是众所周知的和常规地用于本领域。一方面,本发明涉及能同时利用蔗糖和甘油以生产琥珀酸的突变微生物,该突变微生物通过解除产琥珀酸微生物中蔗糖介导的甘油分解代谢抑制机制而获得。本文使用的术语“分解代谢抑制机制”涉及当微生物在有多种碳源存在的培养基中培养时,在首选碳源存在的情况下,抑制该微生物的非首选碳源的利用的机制(Gorke等,Nature Reviews,6:613,2008)。对于产琥珀酸的曼海姆菌株,因为该分解代谢机制而不能同时利用蔗糖和甘油以
生产琥珀酸。通常地,当蔗糖和甘油共存时,在首选碳源蔗糖被消耗后,才消耗甘油。并且,相对于甘油,曼海姆菌更优选蔗糖,所以蔗糖和甘油同时存在时,其更快速地代谢蔗糖。本发明的目的在于人为地解除这个分解代谢抑制机制。分解代谢抑制机制主要分为两种:转录抑制和变构抑制(Deutscher等,Microbiol.Mol.Biol.Rev., 70: 939, 2006 ; Gorke 等,Nature reviews,6:613,2008 ;Pettigrew 等,J.Bacterio1., 178:2846,1996 ;Zwaig 等,J.Bacterio1., 102:753, 1970)。就转录抑制而言,GlpR调节子抑制参与细胞内甘油的转运和利用的基因的转录。本文使用的术语“变构抑制”涉及甘油激酶活性的减少,其由果糖1,6 二磷酸(FBP)或EIIA与甘油代谢中扮演关键角色的甘油激酶的结合而导致。在蔗糖和甘油同时存在的环境中,GlpR调节子引起的转录抑制与FBP和EIIA引起的变构抑制同时发生,所以甘油代谢通常被抑制。能解除这一分解代谢机制的策略避免了 GlpR引起的转录抑制以及FBP和EIIA引起的变构抑制。图1示意性地显示了曼海姆菌株中蔗糖和甘油的代谢途径以及分解代谢抑制机制。确切地说,图1A显示了蔗糖和甘油常规的代谢途径和分解代谢抑制机制;图1B显示了解除分解代谢抑制机制,图1A中可能被代谢操作的部分。图1中,实线箭头表示蔗糖和甘油的代谢途径,其粗度表示相对的代谢速度。细的虚线箭头表示磷酰基连续地从PEP到磷酸转移酶系统IIBC单元的转移过程,粗的虚线箭头示意性地显示了能诱导glp操纵子表达的多种途径,包括起始自磷酸化的IIA的途径、起始自腺苷酸环化酶(AC)的途径、起始自CRP-cAMP的途径、起始自G3P-GlpR的途径等。在末端有T形状的粗的虚线表示在glp操纵子中扮演关键角色的甘油激酶(GlpK)由非磷酸化的IIA和/或1,6-二磷酸果糖(FBP)引起的变构抑制的相对程度。如图1A中所示,蔗糖介导的甘油分解代谢抑制机制主要分为由GlpR等引起的转录抑制,和由FBP和EIIA引起的变构抑制。如图1B中所示,克服抑制的方法包括通过诱导产生多种活化剂而克服 转录抑制的方法,通过减少FBP或IIA的浓度来解除GlpK介导的变构抑制的方法等等。
例如,其为以下方法:从图1B的部分I移除IIBCF使得磷酸化的IIA的浓度相应增加以诱导AC表达,从而更多地产生cAMP以增加CRP-cAMP的产生,因而诱导glp操纵子的表达。因此由额外表达的GlpK产生的G3P将转录抑制物GlpR从glp调节子(glpABC、glpF、glpK等)的DNA结合位点上分离以促进glp调节子基因的转录。与此同时,保持非磷酸化的IIA的浓度在一个相对低的水平,且因移除IIBCF而减少蔗糖的总代谢导致FBP的浓度相对减少,从而缓解变构抑制。这两个因素的同步效果导致甘油代谢的增加。作为另一个实例,其为以下方法:增加图1B部分2中的磷酸化的IIA的浓度以诱导AC的表达,从而更多的产生cAMP以增加CRP-cAMP的产生,因而诱导glp操纵子的表达。因此由额外表达的GlpK产生的G3P使得转录抑制物GlpR从glp调节子的DNA结合位点上分离以促进glp调节子基因的转录,从而导致甘油代谢的增加。作为另一个实例,其为以下方法:诱导图1B部分3中的AC过表达使更多地产生cAMP以增加CRP-cAMP的产生,从而诱导glp操纵子的表达。由额外表达的GlpK产生的G3P将转录抑制物GlpR从glp调节子的DNA结合位点上分离以促进glp调节子基因的转录,从而导致甘油代谢的增加。作为另一个实例,其为以下方法:同时诱导图1B部分4中的CRP过表达和图1B部分3的AC过表达从而增加CRP-cAMP的产生,从而诱导glp操纵子的表达。由额外表达GlpK产生G3P,使得转录抑制物GlpR从glp调节子的DNA结合位点上分离以促进glp调节子基因的转录,从而导致甘油代谢的增加。作为另一个实例,其为以下方法:诱导图1B部分4中的CRP过表达,从而增加CRP-cAMP的产生,因此诱导glp操纵子的表达。通过额外表达的GlpK产生的G3P将转录抑制物GlpR从glp调节子的DNA结合位点上分离以促进glp调节子基因的表达,从而导致甘油代谢的增加。作为另一个实例,其为诱导图1B部分5中的GlpK过表达从而增加G3P的产生的方法。其将转录抑制物GlpR从glp操纵子的DNA结合位点上分离以促进glp操纵子基因的转录,从而导致甘油代谢的增加。作为另一个实例,其为过表达glp操纵子的所有基因或过表达一些基因的多种组合从而导致甘油代谢增加的方法。作为另一个实例,其为以下方法:将没有GlpR可以结合的位点的过表达启动子引入启动子位点以表达图1B部分5中的染色体上的glp操纵子的每一个转录单元,从而根本性地阻断GlpR导致的抑制且过表达glp调节子,从而导致甘油代谢增加。此外,还有移除GlpR因而解除glp操纵子的表达抑制从而导致甘油代谢增加的方法。作为另一个实例,其为减少图1B部分6和7中的IIA和/或FBP的浓度从而减弱GlpK引起的变构抑制的程度,由此导致甘油代谢增加的方法。除前述所列方法以外,还有这些方法可能的组合,例如,设计源自异源菌株的甘油激酶以受到较少的变构抑制或受到变构抑制时过表达从而导致甘油代谢的增加的方法。此夕卜,还有解除分解代谢抑制机制从而激活甘油代谢的方法。琥珀酸是典型的还原性化学品,其包括二个羧基,并以PEP (磷酸烯醇式丙酮酸)作为中间前体的C4化合物。产琥珀酸微生物是指与其他微生物相比生产更多琥珀酸并能用于商业化地发 酵生产琥珀酸的微生物。典型的产琥珀酸微生物包括瘤胃细菌。已知的瘤胃细菌包括放线杆菌属菌(Actinobacillus sp.),厌氧螺菌属菌(Anaerobiospirillumsp.)和曼海姆菌属菌(Mannheimia sp.,其包括 Basfia 属菌(Basfia sp.), Basfia 属最初分离时被命名为曼海姆菌属,后命名为“Basfia属”,且其16S rRNA序列与曼海姆菌属菌具有99.8%的同一性,因此Basfia属在本发明也被称为“曼海姆菌属”/Scholten等,W02009/024294A ;Kuhnert 等,Int.J.Syst.Evol.Microbiol.,60:44)。从已知多种生产玻珀酸的瘤胃细菌的部分基因信息(16s rRNA)、酶分析和发酵结果发现这些瘤胃细菌中从碳源生产琥珀酸的主要生物合成途径几乎与瘤胃细菌曼海姆菌属菌生产琥珀酸的生物合成途径相同。特别是参与琥珀酸生产的所有瘤胃细菌利用二氧化碳固定酶将C3化合物(磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸盐)转化成C4化合物(草酰乙酸和苹果酸)并将C4化合物转化成延胡索酸,从而产生玻拍酸(Zeikus 等,App1.Microbiol.Biotechnol., 51:545,1999 ;Lee 等,Appl.Environ.Microbiol.,72:1939,2006)。换言之,所有的瘤胃细菌(包括曼海姆菌属菌)有相同的生物合成琥珀酸的途径,并且对于本领域技术人员而言,本发明的基因突变能应用到除本发明实施例中所示的曼海姆产琥珀酸菌以外的源自瘤胃细菌的产琥珀酸菌株上是显而易见的。本发明中,产琥珀酸微生物可以是瘤胃细菌。该瘤胃细菌可以选自由曼海姆菌属菌、放线杆菌属菌和厌氧螺菌属菌组成的组。本发明中,曼海姆菌属菌株可以是曼海姆产琥珀酸菌PALK (KCTC10973BP)。本发明中,可以通过删除编码果糖磷酸转移酶的基因解除分解代谢抑制机制,并且突变微生物可以是曼海姆产琥珀酸菌PALFK (KCTC11694BP)。本发明中,可以通过引入编码甘油激酶的基因解除分解代谢抑制机制,并且产琥珀酸突变微生物可以是曼海姆产琥珀酸菌PALFK (KCTCl 1694BP)。本发明中,通过基因操纵产琥珀酸微生物的瘤胃细菌而构建提供琥珀酸的最高产量且不产生其他有机酸的产琥珀酸突变微生物。在本发明的一个实·例中,通过从曼海姆产琥珀酸菌PALK (KCTC10973BP)的基因组DNA中删除果糖磷酸转移酶编码基因(fruA)而构建具有同时代谢蔗糖和甘油的能力的曼海姆产琥珀酸菌PALFK (KCTCl 1694BP)。该构建的菌株以高产量和生产能力产生琥珀酸且不产生副产物。本发明中,通过采用同源重组方法失活该目标基因而删除基因。尽管如此,在本发明中可以使用任何基因操纵方法而没有特殊的限定,只要其可以修饰或消除目标基因从而不产生该目标基因编码的酶。本发明中,可以通过任何常规发酵过程中已知方法培养产琥珀酸突变微生物和回收琥珀酸。本发明中,在曼海姆产琥珀酸菌PALFK (KCTCl 1694BP)和常规突变株(曼海姆产琥珀酸菌PALK (KCTC10973BP))之间比较琥珀酸的产量、副产物的产生和碳源代谢能力。曼海姆产琥珀酸菌PALK (KCTC10973BP)是通过从曼海姆菌属菌株基因组中删除乳酸脱氢酶编码基因(ldhA)、磷酸转乙酰酶编码基因(pta)和乙酸激酶编码基因(ackA)而获得的突变微生物,其是未删除果糖磷酸转移酶编码基因(fruA)的本发明突变微生物曼海姆产琥珀酸菌 PALFK (KCTC11694BP)的亲本株。与产琥珀酸突变株曼海姆产琥珀酸菌PALK (KTCT10973BP)相比,本发明的产琥珀酸突变微生物曼海姆产琥珀酸菌PALFK(KCTC11694BP)的副产物(包括乳酸、丙酮酸、乙酸和甲酸)的产生最小化并且增加了琥珀酸的生产能力并接近理论产量(1.71-1.86mol/mol),表明其是生产琥拍酸的优良菌株。另一方面,本发明涉及制备能利用蔗糖和甘油生产琥珀酸的突变微生物的方法,该方法包括解除产琥珀酸微生物中的蔗糖介导的甘油分解代谢抑制机制。本发明的另一实例,通过将大肠杆菌甘油激酶编码基因导入曼海姆产琥珀酸菌PALK (KCTC10973BP)的基因组DNA中而构建具有同时代谢蔗糖和甘油能力的曼海姆产琥珀酸菌PALKG (KTCT11693BP)。该构建的菌株以高生产能力和产量生产琥珀酸且不产生副产物。也以之前描述的方式比较了产琥珀酸微生物曼海姆产琥珀酸菌PALKG(KCTC11693BP)。另一方面,本发明还提供生产琥珀酸的方法,该方法包括步骤:在厌氧条件下培养前述产琥珀酸突变微生物;和从发酵液中回收琥珀酸。本发明中,可在含有蔗糖和甘油二者的培养基中进行培养,且作为副产物的其他有机酸的产量是琥珀酸产量的1#%或更少。另一方面,本发明还涉及生产能力提高的生产琥珀酸的方法,该方法包括步骤:(a)在厌氧条件下培养 以高产量生产琥珀酸的同时很少或不产生副产物的突变微生物,或者为了能够同时利用蔗糖和甘油而解除蔗糖介导的甘油分解抑制机制所获得的突变微生物;(b)浓缩发酵液中的微生物细胞达到高浓度;(C)培养该高浓度细胞;和((1)从发酵液中回收琥珀酸。本发明中,浓缩发酵液中的细胞达到高浓度的步骤(b)可以通过接种高浓度生产菌株的接种法或膜式细胞循环生物反应器(MCRB)法(以下简称“MCRB法”)实现。依照使用能同时利用蔗糖和甘油以生产琥珀酸的本发明突变微生物的产琥珀酸的方法,可以以接近理论产量的超高产量生产琥珀酸且没有副产物。蔗糖的价格是通常用于微生物发酵生产琥珀酸的葡萄糖价格的大约1/4。而且,随着全球生物柴油制造的快速增长,产生了作为副产物的甘油,并因超量供应和需要一种处理甘油的合适方法使其价格降低。因此,甘油的价格非常低并持续的下降(Miller-Klein Associates, Oct.2006)。本发明的生产琥珀酸的方法的极高价值体现在能够低成本地通过微生物发酵生产琥珀酸,不是需要大量原材料成本的化学合成方法,以接近理论产量的超高产量生产琥珀酸,并且以超高纯度生产琥珀酸,从而使分离和纯化的成本最小化。使用本发明的PALFK株能够以非常高的接近理论产量(1.71到1.86mol/mol)的产量生产均一琥珀酸且没有副产物。三个因素(包括生产能力、产量和副产物/琥珀酸的比率)是琥珀酸生产的工业化中最关键的因素。确切地说,与初始投资成本和能源成本相关的生产能力以及产量是原材料的有效使用的衡量标准,并且与占据生物工艺成本重要部分的原材料成本有关;副产物/琥珀酸的比例与占据生物工艺总成本的一半或更多的分离和纯化成本有关。因此,本发明的一个实例中,使用PALFK菌株,使产量最大化并且使副产物/琥珀酸的比例最小化,将如前所述的三个关键因素中的两个(产量和副产物/琥珀酸的比率)改进到可达到的最高水平。此外,为找到改进生产能力的方法进行了广泛的努力,结果发现接种法和MCRB法增加发酵液中的细胞浓度并提高琥珀酸生产能力,分别是亲本株的至少2倍和10倍。实施例以下,在关于实例的更多细节方面描述本发明。显然对于本领域普通技术人员而言,这些实例仅为说明用途而不能解释为限制本发明的范围。尤其是,为了依据本发明删除基因,下述实例仅举例说明特定性的载体和作为宿主细胞的产琥珀酸微生物曼海姆菌属菌。尽管如此,显然对于本领域技术人员而言,使用其他种类的产琥珀酸微生物也能够提供产高纯度琥珀酸的突变微生物。实施例1:构建fru-A删除载体(pSacHR06fruA)为了通过同源重组从产琥珀酸微生物的基因组中删除fruA基因(果糖磷酸转移酶编码基因),以下述方式构建基因交换载体(交换基因的载体)。首先,以曼海姆产琥珀酸菌MBEL55E(KCTC0769BP)的基因组DNA作为模板,以引物对SEQ ID N0S:1和2、引物对SEQID N0S: 3和4以及引物对SEQ ID N0S: 5和6分别进行PCR,从而分别获得包括fruA左侧同源区域(HL)、氯霉素(Cm)抗性基因和fruA右侧同源区域(HR)的PCR片段。之后,使用上述三个PCR片段作为模板以及引物SEQ ID N0S:1和6进行重叠PCR,DNA片段用SacI和PstI消化并插入pSacHR06载体,从而构建获得pSacHR06fruA载体。SEQ ID NO:1:5’-ATCGCGGATCCGGTGGAAACCCTCGGTTTATTSEQ ID NO:2:5’-AATCTGCTCTGATGCGCAGCTAAAACCTGGTGCAATASEQ ID NO:3:5’-CCAGGTTTTAGCTGCGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGSEQ ID NO:4:5' -AATTACACTTGAAACCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACSEQ ID NO:5:5’-ATCCACAGAATCAGGGTTTCAAGTGTAATTGGCGGAGSEQ ID NO:6:5’-TCGACGCGTCGACTTCATCTAACCCCAACGCTTG实施例2:构建曼海姆产琥珀酸菌PALFK株使用出于删除fruA基因的目的而在实施例1中构建的pSacHR06fruA载体从曼海姆产琥珀酸菌PALK (KCTC10973BP)的基因组中删除fruA而构建突变株。尤其是,接种曼海姆产琥珀酸菌PALK (KCTC10973BP)到BHI (Brain-HeartInfusion)固体培养基,39°C培养36小时。将形成的克隆接种到IOmL BHI液体培养基并培养12小时。以1%的浓度将充分生长的细胞发酵液接种到IOOmL BHI液体培养基并在39°C下静态培养器中培养。大约4-5小时后,发酵液的0D_达到大约0.3-0.5时,0_4°C保持20分钟使得细胞不再生长。之后,4°C、4,500rpm离心发酵液15分钟以收集细胞。之后,在4°C下用200mL10%的甘油溶液重悬细胞并在前述条件下离心。重悬和离心共进行三次,同时每次减少1/210%甘油溶液的体积。最终获得的细胞用等体积10%甘油溶液重悬,分装并储藏在_80°C。如前所述获得的该细胞浓缩悬液与实施例1中构建的基因删除载体pSacHR06fruA混合并在2.5kV、25 μ F和200ohms的条件下进行电穿孔以用载体转化曼海姆产琥珀酸菌PALK (KCTC10973BP)。添加电穿孔细胞到BHI液体培养基并在39°C下静态培养器中孵育I小时。之后,接种培养液到包含6.8 μ g/mL抗生素氯霉素的BHI固体培养基上并在39°C下静态培养器中孵育48小时或更长时间。为了筛选发生双交叉的克隆,将形成的克隆接种到包含氯 霉素(6.8 μ g/mL)和100g/L蔗糖的BHI固体培养基上并培养24小时,此后将形成的克隆再次接种到同样的培养基上。在包含抗生素的BHI液体培养基中培养已在培养基上形成的突变株,并用Rochelle 等的方法(Rochelle 等,FEMS Microbiol.Lett.,100:59,1992)从培养的菌株中分离基因组DNA。用突变株中分离的基因组DNA作为模板进行PCR,并且对PCR产物进行电泳以确定fruA基因是否从基因组DNA中删除。通过下述方式进行两次PCR确定是否删除了 fruA基因。首先,以突变株基因组DNA作为模板和引物对SEQ ID N0S:7和8以及引物对SEQ ID N0S:9和10分别进行PCR。对两次PCR获得的PCR片段进行电泳以通过大小确定fruA的删除。结果,构建了曼海姆产琥珀酸菌PALFK (KCTC11694BP)并保藏在韩国典型培养物保藏中心(Korean Collection for Type Cultures),韩国生物科学和生物技术研究所(Korean Research Institute of Bioscience and Biotechnology),保藏编号KCTCl1694BP。SEQ ID NO:7:5’ -CTATGATTTGGTCGGGCGTTTSEQ ID NO:8:5’-TGAATGGCAGAAATTCGAAASEQ ID NO:9:5’ -TGATCTTCCGTCACAGGTATSEQ ID NO:10:5’ ’ TTGACCGCACTTTGCACATC实施例3:构建pME18glpK22载体和构建转入该载体的曼海姆产琥珀酸菌PALKG株为了获取包含大肠杆菌甘油激酶编码基因(glpK22)的DNA,使用大肠杆菌(Escherichia coli) K-12MG1655 (ATCC47076 ;美国典型培养物保藏中心,马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)的基因组DNA和引物对SEQ ID NOS: 11和12、引物对SEQ ID N0S: 13和14以及引物对SEQ ID N0S : 15和 16分别进行PCR。之后,以获得的三个PCR产物作为模板进行PCR。PCR产物包含glpK22基因,所述glpK22基因中编码序列的第913对碱基由原始大肠杆菌K-12MG1655的glpK基因的鸟嘌呤变为腺苷。已知相对于非突变glpK,glpK基因表达产生的甘油激酶遭受较少的FBP和IIA引起的变构抑制(Pettigrew等,J.Bacteriol.,178:2846,1996)。SEQ ID NO:11:5’-ACTCCGGAATTCAACGCACTGACAATCTCACTTSEQ ID NO:12:5' -CAGCGAAGCTTTTTGGGTAGAAAGTATAAAGACAGAATCACASEQ ID NO:13:5’-TTTATACTTTCTACCCAAAAAGCTTCGCTGTAATATGSEQ ID NO:14:5’-CCATAAACACCGCACTTTCCAACGCATAGTTCACTTCSEQ ID NO:15:5’-AACTATGCGTTGGAAAGTGCGGTGTTTATGGCAGGSEQ ID NO:16:5’-ACCTGCGAGCTCATTATTGATGTGTGCGGGGT将如上获得的PCR 产物克隆到 pME18 (Jang 等,Appl.Environ.Microbiol.,73:5411,2007)的EcoRI和SacI位点,从而构建pME18glpK22载体。并且使用引物SEQ IDN0S: 17到21由Sogent公司(韩国)对载体进行测序。SEQ ID NO:17:5’-TAGCTATGTGTTAAAGCCTTSEQ ID NO:18:5' -ACCAGGGCACCACCAGCTCC
SEQ ID NO:19:5’ -CCGATTACACCAACGCCTCTSEQ ID NO:20:5’-ATGTGGTTCCGGCATTTACCSEQ ID NO:21:5’ -TTATGCCGCATCCGGTAGTCCC
将如前所述构建的pME18glpK22载体转入曼海姆产琥珀酸菌PALK(KCTC10973BP)以构建曼海姆产琥珀酸菌PALKG (KCTC11693BP)株。为了导入该表达载体,如实施例2中所描述的进行细胞浓缩悬液的制备和电穿孔,并且将细胞接种到含有25 μ g/mL氨苄青霉素(代替氯霉素)的BHI固体培养基上,并在39°C下静态培养器中培养48小时。生成的纯克隆在BHI液体培养基中培养8小时,之后与甘油溶液混合使终浓度为15% (w/v),在这之后,细胞溶液被储存在_80°C备用。实施例4:使用曼海姆产琥珀酸菌PALFK株和PALKG株生产均一琥珀酸在含有10g/L蔗糖的IOmL MH5培养基(每升,2.5g酵母提取物,2.5g蛋白胨,IgNaCl,0.02g CaCl2.2Η20,0.2g MgCl2.6H20, 8.7g K2HPO4, andl0.0gNaHCO3)中和 39 °C 厌氧条件下,培养实施例2和3中构建的曼海姆产琥珀酸菌PALFK (KCTCl 1694BP)或PALKG(KCTC11693BP)达8小时。之后,在300mL同样的培养基中培养菌株。接种发酵液到包含2.5L 合成培养基(每升,Ig NaCl, 2g(NH4)2ΗΡ04, 0.02g CaCl2.2H20, 0.2g MgCl2.6H20, 8.709gK2HPO4, 0.5g半胱 氨酸,0.5g甲硫氨酸,0.5g丙氨酸,0.5g天冬酰胺,0.5g天冬氨酸,2.46g脯氨酸,0.5g丝氨酸,0.005g烟酸,0.005g泛酸钙,0.005g盐酸吡哆醇,0.005g硫胺,0.005g抗坏血酸和0.005g生物素)的微生物反应器(Bioflo3000,New BrunswickScientific C0., Edison,新泽西州,美国)中进行发酵。在22.25g/L (65mM)起始鹿糖浓度、4.6g/L (50mM)起始甘油浓度、39°C的温度、200rpm,同时向反应器中以(X2VVm (二氧化碳体积/培养器工作体积/每分)的速度通入纯二氧化碳的条件下进行发酵。发酵过程中,使用氨水调节发酵液的PH值到6.5,并且添加以下抗生素:对于PALK添加50 μ g/mL壮观霉素,对于PALFK添加6.8 μ g/mL氯霉素,对于PALKG添加25 μ g/mL氨苄青霉素。为生产高浓度的琥珀酸,当碳源完全消耗时,半连续地将700g/L蔗糖和甘油溶液添加到发酵液中。为与PALFK的性能相比较,以前述相同的方式培养产琥珀酸菌株曼海姆产琥珀酸菌PALK (KCTC10973BP)。用分光光度计测量并用之前测量的分光光度计的吸收值和干细胞重量的验证试验计算发酵液中的细胞浓度。发酵期间,定期地从生物反应器中收集样品。13,OOOrpm离心所收集的样品10分钟,之后通过高效液相色谱(HPLC)分析上清液中的多种代谢物、琥珀酸、蔗糖和甘油的浓度。结果,如图2和表I中所示,与曼海姆产琥珀酸菌PALK (KCTC10973BP)相比,曼海姆产琥珀酸菌PALFK (KCTC11694BP)显示了更高的琥珀酸产量并且产生了高纯度的琥珀酸且不产生副产物。甘油摄取的减少与增加大约7倍的琥珀酸表现的程度一致,并且甘油的摄取与副产物产生的减少直接相关,因为与使用蔗糖不同,使用甘油没有介导与副产物直接相关的丙酮酸盐的产生。此外,增加的甘油摄取可以减少需用的蔗糖的量,从而使用减少的碳源量以高产量生产均一琥珀酸。曼海姆产琥珀酸菌PALKG (KCTC11693BP)还显示了与PALFK株稍微不同的模式,其中在不削弱蔗糖利用和细胞生长的范围内增加PALKG株中甘油的利用,并因此维持丙酮酸盐的积累与PALK株相同的水平。然而,PALKG株利用甘油的能力比PALK株至少高两倍,结果,PALKG株以1.39mol/mol的产量生产琥珀酸,其比PALK株(1.24mol/mol)高。表1:曼海姆株培养物的特征
权利要求
1.一种能同时利用蔗糖和甘油以生产琥珀酸的突变微生物,该突变微生物通过解除产琥珀酸微生物中的蔗糖介导的甘油分解代谢抑制机制而获得。
2.权利要求1所述的突变微生物,其中产琥珀酸微生物是瘤胃细菌。
3.权利要求2所述的突变微生物,其中所述瘤胃细菌选自以下组成的组:曼海姆菌属(Mannheimia sp.)菌、放线杆菌属(Actinobacillus sp.)菌和厌氧螺菌属(Anaerobiospirillum sp.)菌。
4.权利要求3所述的突变微生物,其中所述曼海姆菌属菌株是曼海姆产琥珀酸菌PALK(Mannheimia succiniciproducens PALK) (KCTC10973BP)。
5.权利要求1所述的突变微生物,其中通过删除编码果糖磷酸转移酶的基因解除分解代谢抑制机制。
6.权利要求4所述的突变微生物,其中所述突变微生物是曼海姆产琥珀酸菌PALFK(Mannheimia succiniciproducens PALFK) (KCTC11694BP)。
7.权利要求1所述的突变微生物,其中通过引入编码甘油激酶的基因解除分解代谢抑制机制。
8.权利要求7所述的突变微生物,其中所述产琥珀酸突变微生物是曼海姆产琥珀酸菌PALKG (Mannheimia succiniciproducens PALKG) (KCTC11693BP)。
9.一种制备能利用蔗糖和甘油生产琥珀酸的突变微生物的方法,该方法包括解除产琥珀酸微生物中蔗糖介导的甘油分解代谢抑制机制。
10.权利要求9所述的方法,其中所述产琥珀酸微生物是瘤胃微生物。
11.权利要求10所述·的方法,其中所述瘤胃微生物选自以下组成的组:曼海姆菌属菌、放线杆菌属菌和厌氧螺菌属菌。
12.权利要求11所述的方法,其中所述曼海姆菌属菌株是曼海姆产琥珀酸菌PALK(KCTC10973BP)。
13.权利要求9所述的方法,其中通过删除编码果糖磷酸转移酶的基因解除分解代谢抑制机制。
14.权利要求9所述的方法,其中通过引入编码甘油激酶的基因解除分解代谢抑制机制。
15.一种生产琥珀酸的方法,该方法包括步骤:在厌氧条件下培养权利要求1至8的任一种产琥珀酸突变微生物;和从发酵液中回收琥珀酸。
16.权利要求15所述的方法,其中在含有蔗糖和甘油的培养基中进行培养。
17.权利要求15所述的方法,其中作为副产物产生的其他有机酸的量是琥珀酸产量的lwt%或更少。
18.—种生产能力增加的产琥珀酸的方法,该方法包括步骤: (a)在厌氧条件下培养以高产量产琥珀酸且很少或不产生副产物的突变微生物,或权利要求I至8中任一种突变微生物; (b)浓缩发酵液中的微生物细胞达到高浓度; (c)培养该高浓度的细胞;和 (d)从发酵液中回收琥珀酸。
19.权利要求18所述的方法,其中通过接种法或膜式细胞循环生物反应器(MCRB)法实施浓缩发酵液中 的细胞达到高浓度的步骤(b )。
全文摘要
本发明涉及一种能同时利用蔗糖和甘油作为碳源的产琥珀酸突变微生物。尤其是,本发明涉及一种能同时利用蔗糖和甘油生产琥珀酸的产琥珀酸突变微生物,该突变生物是通过解除产琥珀酸微生物中蔗糖介导的甘油分解代谢抑制机制而获。当培养产琥珀酸突变微生物时,其同时地利用蔗糖和甘油,因此能以最大产量接近理论产量的高生产能力生产琥珀酸,同时最小化副产物的产生。此外,依据本发明,可以更低成本地产生以常规方法低产量生产的多种还原性化学品。
文档编号C12P7/40GK103249832SQ201180051937
公开日2013年8月14日 申请日期2011年8月30日 优先权日2010年8月30日
发明者李相烨, 李政旭, 崔松, 李钟浩 申请人:韩国科学技术院

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