转运植物螯合肽的组合物的制作方法

xiaoxiao2020-6-24  6

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专利名称:转运植物螯合肽的组合物的制作方法
技术领域
本发明涉及转运植物螯合肽的组合物,其包括编码植物中ATP结合盒(ABC)转运蛋白的ABCC (多药耐药相关蛋白(MRP))亚家族的DNA分子。
背景技术
砷(As)已广泛用于医药、工业及农业应用领域。在医药领域中,砷(As)已用于治疗疾病,诸如梅毒、锥虫病或阿米巴痢疾。在农业应用领域中,含砷的除草剂诸如甲基砷酸二钠(DSMA)已用于控制杂草和有害昆虫。然而,砷(As)是剧毒的环境污染物,已知其引起多种与健康有关的问题。在一些国家,如中国、泰国和美国,其中正在积极进行采矿作业,以及孟加拉国和印度,已报道砷(As)污染地下水。受污染的地下水已成为问题,因为其被用作数千人的饮用水及农业用水。通过饮用污染的水或食用污染的水灌溉的土壤中栽培的作物,引起人类砷(As)中毒。这种中毒并不限于由砷(As)导致的,而是通常由有毒重金属及类金属诸如镉、汞等导致,其通过自然界的食物链在人体内累积,引起大脑、神经和骨骼的慢性损伤。而且,由于金属和类金属不容易从人体内排出,其长期导致人体内的问题。此外,污染的环境及其损害持续数代。因此,将这些有毒金属(或类金属)从环境中清除非常重要。在这方面,活生物体通常具有使用结合进入人体的有害物质的生物材料或转运蛋白,来缓解有害物质毒性的机制。有助于这种活生物体抵抗有害物质的基因可以一种比目前本领域中广为人知的方法诸如物理、化学、植物修复技术或植物提取技术更经济且环境友好的方式,用于清理该有害物质污染的环境。特别是,植物具有优势,因为它们不破坏原有的生态系统,具有美感,且可节约管理,且还通过简单的外源基因表达表现出新的特性。因此,现已积极进行研究通过将优良基因植入植物来改善植物,将其用于植物修复或植物提取。这被称为植物修复。

因此,有必要研发植物中参与吸收更多的重金属和类金属,并提高对有毒重金属和类金属的抗性的遗传信息。砷(As)以五价离子形式As (V)存在于土壤中,并通过转运具有与As (V)相似结构的磷酸盐的蛋白质进入植物根部。然后,砷(As)很容易转化为三价离子As(III)。而且,因为大多数砷(As)以还原状态的As(III)形式存在如稻田中,其通过属于水孔蛋白家族的膜蛋白被吸收至植物中。在水稻中,As(III)通过硅外排转运蛋白Lsi2排入木质部中,以使砷(As)可由根转运到茎。在细胞中,As(III)首先与植物螯合肽结合以解毒,且这种复合物最终被转运至液泡,来表现抗性。因此,为了使植物表现出对有毒重金属和类金属的抗性,转运蛋白将有毒金属(或类金属)_植物螯合肽复合物转运至液泡的作用是必需的。然而,编码起这种作用的植物蛋白的基因仍待发现。植物螯合肽(PC)通过与类金属和重金属如砷(As)螯合在解毒作用的第一阶段发挥作用,且植物的液泡作为重金属和砷(As)的最终解毒存储区。使用PC的解毒过程是产生PC的植物和其他活生物体的特征,其区别于不能合成PCS (编码PC合酶的基因)或PC的人类和芽殖酵母。因此,已长期进行积极研究以研发在植物液泡中螯合有毒金属(或类金属)的PC-金属(或类金属)转运蛋白。然而,参与转运与PC结合的重金属至植物液泡的转运蛋白和参与转运与PC结合的As (III)的转运蛋白仍有待确定。

发明内容
技术问题因此,本发明旨在解决现有技术的问题,且本发明的目的是提供转运植物螯合肽的组合物,其包括编码植物中ATP结合盒(ABC)转运蛋白的ABCC(多药耐药相关蛋白(MRP))亚家族的DNA分子。本发明的另一目的是提供一种方法,其能提高植物对至少一种以下物质的抗性,所述物质选自由砷、镉及其化合物组成的组中。在这里,所述方法包括用组合物转化植物,转运植物螯合肽与至少一种以下物质的复合物形式至转化植物的液泡,所述物质选自由砷、镉及其化合物组成的组中。本发明的还另一目的是提供一种用组合物转化植物并转运植物螯合肽或植物螯合肽与至少一种以下物质的复合物至转化植物的液泡的方法,所述物质选自由砷、镉及其化合物组成的组中。

技术方案为了完成以上目的,本发明人已进行研究筛选已知为ABC蛋白的多药耐药相关蛋白(MRP)亚家族的ABCC亚家族成员,以确定与植物中有害物质的解毒作用相关的候选转运蛋白。结果,发明人已确定了两种在有害物质的解毒作用中起重要作用的ABC转运蛋白。更具体地说,本发明人已发现这两种ABC转运蛋白是液泡中需要抵抗有害物质的植物螯合肽(PC)或PC复合物的转运蛋白,所述有害物质如砷、镉和/或其化合物。因此,基于这些事实完成本发明。本发明的一方面提供转运植物螯合肽的组合物,其包括编码植物中ATP结合盒(ABC)转运蛋白的ABCC(多药耐药相关蛋白(MRP))亚家族的DNA分子。本发明的另一方面提供一种方法,其能提高植物对至少一种以下物质的抗性,所述物质选自由砷、镉及其化合物组成的组中。在这里,所述方法包括用组合物转化植物,转运植物螯合肽与至少一种以下物质的复合物形式至转化植物的液泡,所述物质选自由砷、镉及其化合物组成的组中。本发明的另一方面还提供一种用组合物转化植物并转运植物螯合肽或植物螯合肽与至少一种以下物质的复合物至植物的液泡的方法,所述物质选自由砷、镉及其化合物组成的组中。本发明将在下文进行进一步详细描述。根据本发明的一个具体实施例,提供了转运植物螯合肽的组合物,其包括编码植物中ATP结合盒(ABC)转运蛋白的ABCC(多药耐药相关蛋白(MRP))亚家族的DNA分子。植物中ATP结合盒转运蛋白的多药耐药相关蛋白(MRP或ABCC)-亚家族(以下称为ABC转运蛋白的ABCC-亚家族)是一种ABC转运蛋白,其用于转移质膜外细胞质中的多种有机物质,并将有机物质转运至植物液泡。ABC转运蛋白存在于多种活生物体中,从原核生物至人类的肝细胞,并转运多种物质。根据本发明的一个具体实施例,由转运植物螯合肽的组合物转运的植物螯合肽可能是不与任何组分结合的植物螯合肽自身(载脂蛋白-PC2 Upo-PC2)),或植物螯合肽与至少一种以下物质的复合物形式,所述物质选自由锌(Zn)、铜(Cu)、铅(Pb)、银(Ag)、汞(Hg)、硒(Se)、砷(As)、镉(Cd)及其化合物组成的组中。更优选地,植物螯合肽可以是植物螯合肽与至少一种以下物质的复合物形式,所述物质选自砷(As)、镉(Cd)及其化合物组成的组中。如图14-18所示,转运植物螯合肽自身(载脂蛋白-PC2)不比转运PC2-As复合物更有效,但通过ABC转运蛋白转运载脂蛋白-PC2为液泡提供了载脂蛋白-PC2,其是稳定通过另一个转运未结合金属和类金属的转运蛋白转运至液泡的有毒金属(或类金属)所必需的,且载脂蛋白-PC2可替代或被添加,有效地用于生产高分子量的巯基-As复合物,其与砷(As)具有高结合亲和力。细胞中有害物质解毒的最后阶段是有害物质螯合于液泡,其主要取决于植物螯合肽(PC)。植物螯合肽(PC)是金属结合肽,其合成由其他有毒金属以及砷(As)或镉(Cd)诱导。PC用于通过巯基螯合如砷、镉及其化合物的有害物质,并螯合所述螯合复合物于液泡中,以保护细胞组分不受有害物质如活性金属(或类金属)的侵害。这种PC介导的解毒作用是产生PC的活生物体的特征,包括各种植物,例如,藻类、苔藓、秀丽隐杆线虫和裂殖酵母,其区别于不能合成PCS(编码PC合酶的基因)或PC的人类和芽殖酵母。特别是,本发明人已确定有害物质如砷、镉和其化合物的解毒作用,主要取决于植物中与植物螯合肽共轭的有毒物质的液泡螯合。优选地,植物包括拟南芥、水稻、烟草、洋葱、胡萝卜、黄瓜、油菜、油橄榄、甘薯、马铃薯、芸苔油菜、萝卜、莴苣、西兰花、矮牵牛、向日葵、芥菜、结缕草,日本白桦、杨树、朝鲜柳和赛黑桦。更优选地,包括拟南芥或水稻。在本发明中,表述“编码植物ABC转运蛋白的ABCC亚家族的DNA分子”包括编码植物ABC转运蛋白的ABCC亚家族的基因、突变体、衍生物及其同系物和片段等。优选地,编码植物中ABC转运蛋白的ABCC亚家族的DNA分子是编码ABC转运蛋白的ABCC亚家族的基因,其可以是编码存在于拟南芥液泡中PC转运蛋白的基因,例如,AtABCCl (例如,NM_001036039.1 或 NM_102777.2),AtABCC2 (例如,NM_129020.3),AtABCClK 或 AtMRP12)(例如,NM_102779.2),或 AtABCC12(或 AtMRP13)(例如,NM_102778.3),及水稻中编码与AtABCCl和AtABCC2具有高同源性的ABC转运蛋白的ABCC亚家族的蛋白质的基因,例如,OsABCCI (例如,AJ535215.1),或0sABCC3 (或OsMRPll)(例如,NM_001072322.1)。由拟南芥的AtABCCl和AtABCC2编码的转运蛋白具有高度保守的氨基酸序列,且属于ABCC亚族的分支I,并都存在于液泡膜中。它们转运与植物螯合肽以复合物形式进入液泡的砷、含砷的除草剂或镉,并解毒。而且,如图23所示,由水稻的OsABCCI基因及拟南芥的AtABCCl和AtABCC2基因编码的蛋白质的氨基酸序列具有70%或更高的序列同源性。更具体地说,水稻的OsABCCI基因编码的蛋白质与拟南芥的AtABCCl编码的蛋白质的氨基酸序列具有70%或更多 的同一性及84%或更多的相似性,且与拟南芥的AtABCC2编码的蛋白质的氨基酸序列具有72%或更多的同一性及85%或更多的相似性。
因此,根据本发明的转运植物螯合肽的组合物与AtABCCl或AtABCC2蛋白质的氨基酸序列具有70%或更多的序列同源性,且因为其转运PC复合物形式的有害物质至液泡,包涵的意思是其包括有助于抵抗并累积有害物质的DNA分子。更优选地,所述组合物包括AtABCCl (例如ΝΜ_001036039.I或ΝΜ_102777.2),及AtABCC2 (例如NM_129020.3)。由AtABCCl和AtABCC2基因编码的转运蛋白是植物螯合肽转运蛋白,其在发现植物螯合肽(PC)后,已在植物中发现很长时间了,且在植物细胞液泡中的PC转运活性起重要作用,所述植物细胞包括拟南芥的叶肉细胞。因此,转运蛋白在与PC结合的各种外源分子、重金属和类金属包括砷(As)的解毒作用中起重要作用。根据本发明的另一具体实施例,提供了一种方法,其能提高植物对至少一种以下物质的抗性,所述物质选自由砷、镉及其化合物组成的组中,所述方法包括用根据本发明的组合物转化植物,并转运植物螯合肽与至少一种以下物质的复合物形式至转化植物的液泡,所述物质选自由砷、镉及其化合物组成的组中。根据本发明的还另一具体实施例,提供了一种用根据本发明的组合物转化植物并转运植物螯合肽或植物螯合肽与至少一种以下物质的复合物至转化植物的液泡的方法,所述物质选自由砷、镉及其化合物组成的组。被转化的植物包括各种原生质体、细胞、植物、植物组织及植物器官。转化的植物包括使用基因工程方法的异源DNA序列,且旨在在植物细胞、植物组织、植物器官或植物中表达并表达异源DNA序列。可使用相关领域已知的方法制备植物转化株,且在这种情况下,已知的代表性方法是根癌农杆菌-介导的DNA转化。更优选地,使用以下方法制备重组农杆菌菌株,所述方法选自由电穿孔、微粒注射或基因枪组成的组中,并使用浸溃法将菌株导入植物。可广泛使用包括载体的转化系统,所述载体如病毒载体(例如,由花椰菜花叶病毒(CaMV)获得)及细菌载体(例如,由土壤杆菌获得)。在选择和/或筛选制备的植物转化株后,可使用已知方法将转化植物的细胞、组织或器官再生为完整的植物。适当地选择转化方法和/或再生技术,`对本领域技术人员显而易见的。优选地,所述植物包括拟南芥、水稻、烟草、洋葱、胡萝卜、黄瓜、油菜、油橄榄、甘薯、马铃薯、芸苔油菜、萝卜、莴苣、西兰花、矮牵牛、向日葵、芥菜、结缕草,日本白桦、杨树、朝鲜柳和赛黑桦。更优选地,包括拟南芥或水稻。优选地,水稻通常生长于还原环境的稻田水中。在这种情况下,稻田中的砷(As)主要以As (III)形式存在。提高砷(As)在水稻的茎和根中的螯合和解毒使得稻粒中砷(As)累积显著减少,并阻止砷(As)通过食物链移动,通过减少将水稻作为主食食用的人类对有害物质的摄入量,对有害物质的抗性和累积提高的植物,在预防严重的由摄入有害物质导致的健康相关的问题上是极其有用的。所述细胞是原核细胞或真核细胞,优选地,植物细胞是选自以下植物的细胞,所述植物选自由拟南芥、水稻、烟草、洋葱、胡萝卜、黄瓜、油菜、油橄榄、甘薯、马铃薯、芸苔油菜、萝卜、莴苣、西兰花、矮牵牛、向日葵、芥菜、结缕草,日本白桦、杨树、朝鲜柳和赛黑桦组成的组中。如上所述,根据本发明的转运植物螯合肽的组合物可用于提高植物对有害物质的抗性或累积,并以节约的形式简单地清除有害物质污染的位点。有益效果
根据本发明的转运植物螯合肽的组合物可单独用于累积并螯合植物螯合肽或用于累积并螯合植物螯合肽与有害物质的组合,通过转运植物螯合肽和/或有害物质至细胞液泡中,从而减少从植物的根至茎迁移的毒性物质的含量。因此,根据本发明的转运植物螯合肽的组合物可用于研发作物,其中存在于植物的可食部分,如叶、茎、果实的毒性物质的含量降低。此外,根据本发明的转运植物螯合肽的组合物可应用于不可食用的植物,以研发用于植物修复或植物提取的植物,并提高其对砷、砷化合物和镉的累积量及抗性,从而可能研发用于环境清理(植物修复或植物提取)的植物,并获得环境友好及节约的清洁方式效果。


图1至图3示出了 atabccl、atabcc2双基因敲除的突变体对镉(Cd)、砷(As(V))及砷除草剂DSMA的高敏感性。图4和图5示出了通过比较各自的单突变体对砷除草剂DSMA的敏感性得到的结
果O图6示出了通过比较atabccl、atabcc2双基因敲除的突变体及与PC合成相关的基因损坏的突变体cadl-3对砷(Ac)的敏感性得到的结果。图7和图8示出了根据砷(Ac)浓度的野生型(WT)、atabccl基因敲除突变体、atabcc2基因敲除突变体及atabccl、atabcc2双基因敲除突变体的重量和根长。图9示出了通过PCR和RT-PCR制备的atabccl、atabcc2双基因敲除的纯合子系。图10示出了 abccl-3基因敲除的纯合子遗传图谱。

图11和图12示出了在表达植物螯合肽合酶(PCS)的芽殖酵母(SM7)中,AtABCCl和AtABCC2提高了对砷的抗性及累积。图13示出了表达AtABCCl或AtABCC2的SM7菌株比用AtABCCl或AtABCC2转化的SM7菌株含有更高水平的PC。图14示出了随时间变化的进入酵母(SM7)微粒体泡的PC2-As的吸收。图15示出了随时间变化的进入酵母(SM7)微粒体泡的PC2-Cd的吸收。图16示出了载脂蛋白-PC2和PC2-As的转运活性比较,及通过NH4+和钒酸盐转运PC2-As的抑制活性比较。图17示出了通过测定AtABCC2转运砷(As)是否是非螯合形式得到的结果。图18示出了在表达AtABCCl (正方形)或AtABCC2 (三角形)的酵母(SM7)微粒体泡中PC2-As (实线)和载脂蛋白-PC2 (虚线)的转运活性的浓度依赖性。图19示出了通过比较PC2-As及载脂蛋白-PC2转运至从atabccl、atabcc2双基因敲除植物和野生型植物分离的完整液泡的活性得到的结果。图20示出了总植物PC含量,反映了 atabccl、atabcc2双基因敲除的植物和野生型植物的液泡及细胞质。图21示出了拟南芥中通过NH4+和钒酸盐转运PC2-As的抑制活性。图22示出了拟南芥中AtABCCl或AtABCC2不由砷(As)诱导。图23示出了 AtABCCl和AtABCC2基因编码的蛋白质的氨基酸序列与水稻的OsABCCl (OsMRPl)、0sABCC3 (OsMRPlI)基因编码的蛋白质的氨基酸序列的序列同源性。
具体实施例方式为了更好的理解本发明,下文将列出本发明优选的实施例。然而,实施例中所做的说明仅仅是为了更好的理解本发明,而不是限制本发明的范围。表I本发明的具体实施例中使用的拟南芥ABCC (MRP)基因敲除突变株
权利要求
1.一种转运植物螯合肽的组合物,其包含编码植物中ATP结合盒(ABC)转运蛋白的ABCC(多药耐药相关蛋白(MRP))亚家族的DNA分子。
2.根据权利要求1所述的组合物,其中植物螯合肽是植物螯合肽与至少一种以下物质的复合物形式,所述物质选自砷、镉及其化合物组成的组中。
3.根据权利要求1所述的组合物,其中DNA分子是至少一种分子,其选自由AtABCCl、AtABCC2、AtABCCll、AtABCCl2、OsABCCI 及 0sABCC3 组成的组中。
4.根据权利要求1所述的组合物,其中所述植物选自由拟南芥、水稻、烟草、洋葱、胡萝卜、黄瓜、油菜、油橄榄、甘薯、马铃薯、芸苔油菜、萝卜、莴苣、西兰花、矮牵牛、向日葵、芥菜、结缕草,日本白桦、杨树、朝鲜柳和赛黑桦组成的组中。
5.一种提高植物对至少一种以下物质的抗性的方法,所述物质选自由砷、镉及其化合物组成的组中,所述方法包括: 用根据权利要求1至4中任一项所述的组合物转化植物 '及 将至少一种以下物质与植物螯合肽以复合物形式转运至转化植物的液泡,所述物质选自由砷、镉及其化合物组成的组中。
6.一种用根据权利要求1至4中任一项所述的组合物转化植物,并转运植物螯合肽或植物螯合肽与至少一种以下物质的复合物至转化植物的液泡的方法,所述物质选自由砷、镉及其化合物组成 的组中。
全文摘要
本发明涉及转运植物螯合肽的组合物,其包括编码植物中ATP结合盒(ABC)转运蛋白的ABCC(多药耐药相关蛋白(MRP))亚家族的DNA分子。通过转运植物螯合肽和/或有害物质至细胞液泡中,所述转运植物螯合肽的组合物可单独地或与有害物质组合用于累积并螯合植物螯合肽,从而减少从植物的根至茎迁移的毒性物质的含量。因此,所述DNA分子可应用于研发作物,其中存在于植物的可食部分,如叶、茎、果实的毒性物质的含量降低。此外,所述DNA分子可应用于不可食用的植物,以研发用于植物修复或植物提取的植物,并提高植物对砷、砷化合物和镉的累积量及抗性,从而可能以环境友好及节约的清洁方式实现植物修复或植物提取。
文档编号C12N15/29GK103228786SQ201180052080
公开日2013年7月31日 申请日期2011年8月2日 优先权日2010年10月28日
发明者李永淑, 恩里科·马丁诺亚, 朴祉映, 宋元镛, 大卫·G·门多萨科扎特, 朱利安·I·施罗德 申请人:浦项工科大学校产学协力团

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