制备骨移植材料的方法和通过所述方法制备的骨移植材料的制作方法
专利名称：制备骨移植材料的方法和通过所述方法制备的骨移植材料的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种使用诸如拔除的牙齿或骨的身体硬组织制备骨移植材料的方法，并且更具体地，涉及一种使用具有牙齿的人自己的拔除的牙齿或其同类的牙齿制备骨移植材料的方法，以及通过所述方法制备的骨移植材料。
2.
背景技术：
在矫形外科或牙医学领域，骨移植材料通常包括自体骨、同类骨(另一人的骨)、异种骨(通常，牛骨)、合成骨(钙复合物)，等等。在这些材料中，包含细胞、有机/无机物质和蛋白质的自体骨是最优选的移植材料，然而，这涉及潜在地导致更多损伤的缺点。由于同类骨表现出轻微的免疫反应，使其经历冷冻或冻干工艺以减少抗原性。通常已知脱矿骨不含钙，它们大多数使用骨形态发生蛋白(下文简称为“BMP”)和胶原蛋白，表现出比非脱矿骨更好的临床结果。由于异种骨涉及较高的免疫反应，因此其仅利用不含有机物质的无机物质(钙复合物)并且与自体骨或同类骨相比显示较差的骨再生能力。另外，由于有疯牛病的危险，一些采用合成的钙复合物形式的合成骨。为了使骨移植材料产生快速的骨形成，需要可以快速形成新血管并且细胞可以增殖的合适环境。为此目的，重要的是从自体骨或同类骨中去除钙。从前一段时间的研究知道牙齿可以用作骨移植材料。然而，这个发现仍然仅停留在动物测试水平上。
作为将牙齿用作骨移植材料的常规技术的实例，在已公开的韩国专利申请第2010-040427号中记载的发明涉及一种使用需要种植外科手术的患者的牙齿作为移植材料的方法，该方法包括:拔除牙齿用于种植外科手术；将牙齿研磨成粉末；清洗研磨的牙齿粉末；从清洗过的牙齿粉末去除水、脂肪和矿物质；冷冻干燥清洗过的牙齿粉末；将冻干的牙齿粉末应用于其上进行种植外科手术的牙槽骨；以及在牙槽骨上进行种植外科手术。然而，上述方法存在的问题是到使用患者的拔除的牙齿制备骨移植材料并且制备好的骨移植材料可以实际使用要花费约10天以上的时间。因此，本发明的目的是提供一种通过加工诸如拔除的牙齿或骨的身体硬组织来制备骨移植材料的方法和通过所述方法制备的骨移植材料，所述方法能够相当大地减少制备所需要的时间。本发明的另一个目的是提供一种制备骨移植材料的方法以及通过所述方法制备的骨移植材料，所述方法能够现场地从拔除的牙齿制备移植材料，无需将拔除的牙齿转移到另一场所(‘牙齿的转移’)。
本发明要完成的技术任务不特别地限于上述那些，而是具有本发明所属技术领域中的公知常识的人从下面的描述可以显而易见地理解其他任务。根据本发明为实现上述目的的一个实施方案，提供了一种制备骨移植材料的方法，该方法包括使用化学试剂对选自拔除的牙齿和骨的至少一种身体硬组织执行至少一次化学处理，其中使用化学试剂的化学处理(‘化学试剂处理’)与包括真空声波处理的声波处理一起进行，所述真空声波处理在减压下提供超声波辐射。根据本发明的一个优选实施方案，就有效去矿质和防止组织破坏的可能性而言，所述声波处理可以在15kHz-40kHz的超声波频率下进行。根据本发明的另一优选实施方案，考虑到在身体硬组织内外的有效去矿质，所述真空声波处理可以在IOmmHg(托)-700mmHg(托)的真空压力下进行。更优选地，所述真空声波处理可以在1001111]1!^(托)-6001111]1!^(托)的真空压力下进行。根据本发明的另一优选实施方案，就通过将超声强度和真空压力有效组合所实现的最大化去矿质效率而言，本文中进行的声波处理可以包括按连续顺序地，在减压下辐射超声波的真空声波处理，在非减压条件下辐射超声波的非真空声波处理，和在减压下辐射超声波的进一步真空声波处理。根据本发明的另一优选实施方案，所述化学试剂处理可以在室温至60°C的范围内进行。根据本发明的另一优选实施方案，除了化学试剂处理以外还可以包括使用蒸馏水的处理用于除清洗以外的其他目的，并且所述使用蒸馏水的处理可以是包括声波处理的方法。根据具体的实施方案，考虑到拔除的牙齿的去矿质，该方法包括:去除并清洗拔除的牙齿的软组织和牙髓( 步骤Si);从由SI处理过的牙齿分离牙冠和牙根，并且在分离的牙冠和牙根中形成至少一个孔洞(步骤S2);清洗由S2处理过的牙齿(步骤S3);以及将由S3处理过的牙齿浸泡在盐酸溶液中，同时进行声波处理，将牙齿从所述溶液中取出并清洗(步骤S4)。此外，该方法还包括:将由S4处理过的牙齿浸泡在含有蛋白酶抑制剂的PBS溶液中，同时进行声波处理，将牙齿从所述溶液中取出并清洗(步骤S5);将由S5处理过的牙齿浸泡在氯化钙溶液中，同时进行声波处理，将牙齿从所述溶液中取出并清洗(步骤S6)；以及将由S6处理过的牙齿浸泡在EDTA溶液中，同时进行声波处理，将牙齿从所述溶液中取出并清洗(步骤S7)。如果胶原蛋白被进一步凝胶化，则该方法还可以包括:将由S7处理过的牙齿浸泡在氯化锂溶液中，同时进行声波处理，将牙齿从所述溶液中取出并清洗(步骤S8);以及将由S8处理过的牙齿浸泡在蒸馏水中，同时进行声波处理(步骤S9)。加工过的牙齿可以在冷藏或冻干后在室温下保存，并且如果有必要，可以进行EO气体灭菌。使用根据本发明的任一个实施方案的拔除的牙齿，可以现场地直接制备骨移植材料，无需另外转移牙齿。因此，根据本发明的一个实施方案中的制备骨移植材料的方法，拔除的牙齿可以通过将牙齿浸泡在无菌生理盐水、蒸馏水或乙醇中冷藏，或以另外的方式，在从浸泡溶液中取出后冷冻保存。关于本发明的一个实施方案中的制备骨移植材料的方法，考虑到S4中的浸泡用于保留与骨形成相关的蛋白或类似物，该过程优选地在室温至60°C的范围内进行60-75分钟。
关于本发明的一个实施方案中的制备骨移植材料的方法，为了在保留与骨形成相关的蛋白的同时去除不需要的蛋白，在步骤S5、S6、S7和S8中的每个步骤中的浸泡优选在室温至60°C的范围内进行5-10分钟。关于本发明的一个实施方案中的制备骨移植材料的方法，为了保留与骨形成相关的蛋白或类似物，在步骤S5和S7中的每个步骤中的浸泡可以在pH7-8下进行。关于本发明的一个实施方案中的制备骨移植材料的方法，为了在保留与骨形成相关的蛋白或类似物的同时快速地去除无机成分，在S4中使用的盐酸溶液的浓度优选为
0.5N-2N。更优选地，在S4中使用的盐酸溶液的浓度可以为0.5N-0.6N。根据本发明的一个实施方案中的制备骨移植材料的方法，该方法可以使用拔除的牙齿现场地进行，并且可以在不另外转移牙齿的情况下获得上述材料。如果需要保存，根据本发明的一个实施方案的制备骨移植材料的方法还可以包括由S9处理过的牙齿在无菌条件下的冷藏。如果需要保存，根据本发明的一个实施方案的制备骨移植材料的方法还可以包括在将由S9处理过的牙齿在无菌条件下冷藏后或在制备骨移植材料后立刻，将所述牙齿冻干并在室温下保存。在此情况下，如果有必要，可以进一步包括EO气体灭菌以进行额外的灭菌。此外，本发明提供了一种通过从上述方法中选择的任一种方法制备的骨移植材料。根据本发明的一个实施方案的制备骨移植材料的方法可以通过使用化学试剂对身体硬组织诸如拔除的牙齿进行化学处理 来适当地制备骨移植材料，其中所述处理涉及声波处理(包括真空声波处理)以便极大地减少上述化学试剂处理所需的时间。而且，由于拔除的牙齿可以现场地加工，无需另外地转移牙齿，因此拔除的牙齿可以在2小时内直接用作移植材料。如上所述，本发明可以具有一些优势，其中通过处理身体硬组织诸如拔除的牙齿、骨等制备骨移植材料所需的时间可以相当大地减少，并且这样的骨移植材料可以使用拔除的牙齿来制备，无需另外地转移拔除的牙齿。
图1是根据本发明的一个实施方案通过化学处理与在减压下辐射超声波的声波处理一起处理的身体硬组织的电子显微镜照片，图2是通过化学处理与在不减小压力的条件下辐射超声波的声波处理一起处理的身体硬组织的电子显微镜照片，图3是显示根据本发明的一个实施方案处理的牙齿移植材料的western印迹分析结果的照片，图4是显示根据本发明的一个实施方案处理的牙齿移植材料的SEM结果的照片，图5是显示根据本发明的一个实施方案处理的牙齿移植材料的XRD结果的照片，以及图6是显示在根据本发明的制备骨移植材料的过程中的SI至S3期间在使用保存溶液处理之前和之后细菌培养的结果的照片。
A:对于在乙醇中保存时处理的牙齿，发现在其处理之前和之后由于乙醇的缘故，牙齿处于无菌状态。B:对于在盐水中保存时处理的牙齿，发现在其处理前牙齿未处于无菌状态，而在其处理后变成无菌。C:对于在盐水中保存时处理的牙齿，发现在其处理前未处于无菌状态，而在其处理后变成无菌。下面，将参照附图详细地描述本发明。本发明涉及骨移植材料及其制备方法。更具体地，提供了一种使用身体硬组织诸如自体牙齿或骨制备骨移植材料的方法。此方法也可以应用于加工同种异体牙齿和骨移植材料。身体硬组织可以包括根据对硬组织的病理学鉴定而取出的骨组织。下文中，以下的描述可以提供用于集中于身体硬组织中的牙齿，然而，本发明不特别地限于此。用于牙槽骨的移植材料是用于承受咀嚼压力的骨，并且其必须要经受骨重建。在牙齿的组成成分中，有机组分是I型胶原蛋白，而无机组分包括用于骨重建的元素。本发明涉及一种使用废弃的牙齿制备用于治疗牙槽骨的移植材料，所述废弃的牙齿包含与牙槽骨相同的组成成分。前文和后文中，‘废弃的牙齿’或‘拔除的牙齿’可以指任何牙齿，包括通过牙根管或假体治疗的牙齿，蛀牙等，并且要理解自体牙齿和同种异体牙齿包括在其中。根据本发明的制备骨移植材料的方法是使用拔除的牙齿和由拔除的牙齿通过化学试剂处理制备骨移植材料的方法。在本文中，化学试剂处理包括用于不同目的的制备骨移植材料的全过程，例如，脱脂、去矿质、从拔除的牙齿提取各种组分等，并且本发明的方法可以包括至少一种化学试剂处理。根据本发明，化学试剂处理与包括真空声波处理的声波处理一起进行以便获得极大改善的效率，由此显著地减少总处理时间，所述真空声波处理在减压下辐射超声波。关于声波处理，在减压下辐射超声波的真空声波处理可以根据真空度以及超声波频率控制空腔形成，由此去除附着于身体硬组织诸如拔除的牙齿的表面的气泡并诱导深深地穿透至样品内部。难以清楚地明确在牙齿的化学试剂处理中真空声波处理的活动机制。然而，可以预期，如果化学试剂处理与处于预定范围的超声频率(超声强度)的真空声波处理一起进行，则在开始减压时空腔形成的相对程度很大且断裂强度很高，从而启动对牙齿表面上牙本质中的钙组分的去除。因此，当压力减小到所需水平或以下(在低压力的情况下)时，即，真空度以预定的范围存在时，阻碍超声波传输的成分，诸如样品中的微小空气粒子，可以被负压去除，并且可以使空腔形成的相对程度最小化。而且，尽管断裂强度变弱，但空腔穿透至如上所述脱落的牙本 质中，从而允许进行所需的化学处理。当真空增加时，空腔形成的相对程度减小。并且，如果压力减小至预定的真空度或以下，对空腔形成的程度的影响不会大幅度地改变。
考虑到上述方面，真空声波处理中的真空度优选为10mmHg($)-700mmHg($)。更优选地，真空度可以为100_!^(托)-600_!^(托)。当真空度很低时,可能相对地消除真空效应，由此导致本发明的所需结果出现太晚的问题。在前文和下文中，要理解“包括真空声波处理的声波处理”是指除了在减压下辐射超声波的真空声波处理以外还有在相关领域中已知的任何其他声波处理方法。根据本发明的一个优选实施方案，就化学试剂处理的最大效率和防止其对组织的破坏的方面而言，所述声波处理优选在15kHz-40kHz的频率范围内进行。更具体地，所述声波处理可以以20kHz-40kHz进行。例如，当频率增加时，超声强度低并且很少能达到化学试剂处理的所需效率。另一方面，如果频率减小，则超声强度高，可以达到化学试剂处理的所需效率，然而，可能会发生组织破坏。在本发明中最优选的声波处理可以同时包括真空声波处理和非-真空声波处理。在此，所述非-真空声波处理可以指在非减压下进行的声波处理。更具体地，真空声波处理、非-真空声波处理和真空声波处理可以按连续顺序进行。例如，当在化学试剂处理期间在预定范围的超声频率下压力开始减小时，S卩，如果进行真空声波处理，贝1J去除了在牙齿和骨组织(Volkman氏管(Volkman’s cannal))内的小空间中存在的阻碍超声波穿透的空气。然后，当这种压力减小终止并且在非-真空条件下进行声波处理时，空腔形成可能再次最大化，并且可以促进硬组织表面上的所需化学试剂处理。此外，当在预定时间后重新开始减小压力，即，再次进行真空声波处理时，可以消除阻碍超声波传输的微小-空气粒子，空腔形成可以再次被最小化，由此增加了超声波的渗透性并促进硬组织内部的化学处理效应，并且进行化学处理处的部分的破坏可以被相当大地减少。真空声波处理/非-真空声波处理/真空声波处理之间的时间分布可以根据超声强度和样品的条件而变化。关于与化学试剂处理一起进行的声波处理，为了研究压力减小的效应，在具有不同初始重量的身体硬组织浸泡在50-200ml的盐酸溶液(0.6N浓度)中持续60分钟并同时进行真空声波处理(通过以20kHz的超声波频率施加600mmHg(托)的真空)的情况下，和在其中通过在与前一种情况相同的条件下进行化学试剂处理的同时在不施加真空的条件下以20kHz的超声波频率进行声波处理来处理上述身体硬组织的情况下，对化学试剂处理效应的评价结果可以通过测量硬组织的每个重量变化获得并显示在下面的表I和表2中。提出的测试数据使用0.6N盐酸溶液获得，并且，进一步，发现使用具有优选浓度范围的盐酸溶液可以获得相似的结果。而且，作为对照，通过已公开的韩国专利申请第2010-040427号中记载的现有方法观察的化学试剂处理后的重量变化及其结果显示在下面的表3中。在预定的时间取出组织，在蒸馏水中清洗该组织，并且用干纱布擦拭组织的湿表面以使其干燥之后，通过用具有l/100g单位的天平(型号:MWP，CASC0.，Ltd.)测量重量。根据下面的公式I可以计算重量减少比。公式I重量减少比)= (样品的初始重量-经过预定时间后样品的重量)/初始重量 XlOO重量减少比证明依照使用盐酸溶液的间接处理，化学试剂处理的效率已经达到所需目标。表I
权利要求
1.一种制备骨移植材料的方法，所述方法包括:使用化学试剂对选自拔除的牙齿和骨的至少一种身体硬组织执行至少一次化学处理， 其中使用化学试剂的化学处理(‘化学试剂处理’)与包括真空声波处理的声波处理一起进行，所述真空声波处理在减压下提供超声波辐射。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述声波处理在15kHz-40kHz范围的超声波频率下进行。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述真空声波处理在101111]1!^(托)-7001111]1!^(托)范围的真空压力下进行。
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述真空声波处理在IOOmmHg(托)-600mmHg (托)范围的真空压力下进行。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述声波处理包括按连续顺序的，在减压下辐射超声波的真空声波处理，在非减压条件下辐射超声波的非真空声波处理，和在减压下辐射超声波的进一步真空声波处理。
6.根据权利要求1所 述的方法，其中所述化学试剂处理在室温至60°C的范围内进行。
7.根据权利要求1所述的方法，还包括使用蒸馏水的处理用于除清洗以外的其他目的，其中所述使用蒸馏水的处理与声波处理一起进行。
8.根据权利要求1所述的方法，还包括:去除并清洗拔除的牙齿的软组织和牙髓(步骤 SI)； 从由SI处理过的牙齿分离牙冠和牙根，并且在分离的牙冠和牙根中形成至少一个孔洞(步骤S2)； 清洗由S2处理过的牙齿(步骤S3);以及 将由S3处理过的牙齿浸泡在盐酸溶液中，同时进行声波处理，将牙齿从所述溶液中取出并清洗(步骤S4)。
9.根据权利要求8所述的方法，还包括:将由S4处理过的牙齿浸泡在含有蛋白酶抑制剂的PBS溶液中，同时进行声波处理，将牙齿从所述溶液中取出并清洗(步骤S5)； 将由S5处理过的牙齿浸泡在氯化钙溶液中，同时进行声波处理，将牙齿从所述溶液中取出并清洗(步骤S6);以及 将由S6处理过的牙齿浸泡在EDTA溶液中，同时进行声波处理，将牙齿从所述溶液中取出并清洗(步骤S7)。
10.根据权利要求9所述的方法，还包括:将由S7处理过的牙齿浸泡在氯化锂溶液中，同时进行声波处理，将牙齿从所述溶液中取出并清洗(步骤S8);以及 将由S8处理过的牙齿浸泡在蒸馏水中，同时进行声波处理(步骤S9)。
11.根据权利要求1或8所述的方法，其中所述拔除的牙齿保存在无菌生理盐水、蒸馏水或乙醇中。
12.根据权利要求8所述的方法，其中，在S4中，所述浸泡在室温至60°C的范围内进行60-75分钟。
13.根据权利要求9所述的方法，其中，在步骤S5、S6、S7和S8中的每个步骤中，所述浸泡在室温至60°C的范围内进行5-10分钟。
14.根据权利要求9所述的方法，其中，在步骤S5和S7中的每个步骤中，所述浸泡在PH7-8下进行。
15.根据权利要求8所述的方法，其中在S4中使用的盐酸溶液的浓度为0.5N-2N。
16.根据权利要求15所述的方法，其中在S4中使用的盐酸溶液的浓度范围为0.5N-0.6N。
17.根据权利要求10所述的方法，其中，在步骤S8中，所述浸泡在室温至60°C的范围内进行5-10分钟。
18.根据权利要求10所述的方法，还包括对由S9处理过的牙齿在无菌条件下进行冷藏。
19.根据权利要求10所述的方法，还包括在对由S9处理过的牙齿在无菌条件下冷藏后或立即在其制备后，将所述牙齿冻干并在室温下保存。
20.根据权利要求10所述的方法，还包括在对由S9处理过的牙齿在无菌条件下冷藏后或立即在其制备后，将所述牙齿冻干并进行EO气体灭菌。
21.通过选自权利要求1-20任`一项的制备方法制备的骨移植材料。
全文摘要
本发明涉及一种使用拔除的牙齿制备骨移植材料的方法，以及通过该方法制备的骨移植材料，并且具体地，涉及一种能够在短时间内使用患者的拔除的牙齿或同类的牙齿制备骨移植材料的骨移植材料制备方法。
文档编号C12N5/071GK103200972SQ201180052326
公开日2013年7月10日 申请日期2011年9月26日 优先权日2010年10月27日
发明者朴昶铢, 李润珍 申请人:克世摸生物医学有限公司
技术领域：
本发明涉及一种使用诸如拔除的牙齿或骨的身体硬组织制备骨移植材料的方法，并且更具体地，涉及一种使用具有牙齿的人自己的拔除的牙齿或其同类的牙齿制备骨移植材料的方法，以及通过所述方法制备的骨移植材料。
2.
背景技术：
在矫形外科或牙医学领域，骨移植材料通常包括自体骨、同类骨(另一人的骨)、异种骨(通常，牛骨)、合成骨(钙复合物)，等等。在这些材料中，包含细胞、有机/无机物质和蛋白质的自体骨是最优选的移植材料，然而，这涉及潜在地导致更多损伤的缺点。由于同类骨表现出轻微的免疫反应，使其经历冷冻或冻干工艺以减少抗原性。通常已知脱矿骨不含钙，它们大多数使用骨形态发生蛋白(下文简称为“BMP”)和胶原蛋白，表现出比非脱矿骨更好的临床结果。由于异种骨涉及较高的免疫反应，因此其仅利用不含有机物质的无机物质(钙复合物)并且与自体骨或同类骨相比显示较差的骨再生能力。另外，由于有疯牛病的危险，一些采用合成的钙复合物形式的合成骨。为了使骨移植材料产生快速的骨形成，需要可以快速形成新血管并且细胞可以增殖的合适环境。为此目的，重要的是从自体骨或同类骨中去除钙。从前一段时间的研究知道牙齿可以用作骨移植材料。然而，这个发现仍然仅停留在动物测试水平上。
作为将牙齿用作骨移植材料的常规技术的实例，在已公开的韩国专利申请第2010-040427号中记载的发明涉及一种使用需要种植外科手术的患者的牙齿作为移植材料的方法，该方法包括:拔除牙齿用于种植外科手术；将牙齿研磨成粉末；清洗研磨的牙齿粉末；从清洗过的牙齿粉末去除水、脂肪和矿物质；冷冻干燥清洗过的牙齿粉末；将冻干的牙齿粉末应用于其上进行种植外科手术的牙槽骨；以及在牙槽骨上进行种植外科手术。然而，上述方法存在的问题是到使用患者的拔除的牙齿制备骨移植材料并且制备好的骨移植材料可以实际使用要花费约10天以上的时间。因此，本发明的目的是提供一种通过加工诸如拔除的牙齿或骨的身体硬组织来制备骨移植材料的方法和通过所述方法制备的骨移植材料，所述方法能够相当大地减少制备所需要的时间。本发明的另一个目的是提供一种制备骨移植材料的方法以及通过所述方法制备的骨移植材料，所述方法能够现场地从拔除的牙齿制备移植材料，无需将拔除的牙齿转移到另一场所(‘牙齿的转移’)。
本发明要完成的技术任务不特别地限于上述那些，而是具有本发明所属技术领域中的公知常识的人从下面的描述可以显而易见地理解其他任务。根据本发明为实现上述目的的一个实施方案，提供了一种制备骨移植材料的方法，该方法包括使用化学试剂对选自拔除的牙齿和骨的至少一种身体硬组织执行至少一次化学处理，其中使用化学试剂的化学处理(‘化学试剂处理’)与包括真空声波处理的声波处理一起进行，所述真空声波处理在减压下提供超声波辐射。根据本发明的一个优选实施方案，就有效去矿质和防止组织破坏的可能性而言，所述声波处理可以在15kHz-40kHz的超声波频率下进行。根据本发明的另一优选实施方案，考虑到在身体硬组织内外的有效去矿质，所述真空声波处理可以在IOmmHg(托)-700mmHg(托)的真空压力下进行。更优选地，所述真空声波处理可以在1001111]1!^(托)-6001111]1!^(托)的真空压力下进行。根据本发明的另一优选实施方案，就通过将超声强度和真空压力有效组合所实现的最大化去矿质效率而言，本文中进行的声波处理可以包括按连续顺序地，在减压下辐射超声波的真空声波处理，在非减压条件下辐射超声波的非真空声波处理，和在减压下辐射超声波的进一步真空声波处理。根据本发明的另一优选实施方案，所述化学试剂处理可以在室温至60°C的范围内进行。根据本发明的另一优选实施方案，除了化学试剂处理以外还可以包括使用蒸馏水的处理用于除清洗以外的其他目的，并且所述使用蒸馏水的处理可以是包括声波处理的方法。根据具体的实施方案，考虑到拔除的牙齿的去矿质，该方法包括:去除并清洗拔除的牙齿的软组织和牙髓( 步骤Si);从由SI处理过的牙齿分离牙冠和牙根，并且在分离的牙冠和牙根中形成至少一个孔洞(步骤S2);清洗由S2处理过的牙齿(步骤S3);以及将由S3处理过的牙齿浸泡在盐酸溶液中，同时进行声波处理，将牙齿从所述溶液中取出并清洗(步骤S4)。此外，该方法还包括:将由S4处理过的牙齿浸泡在含有蛋白酶抑制剂的PBS溶液中，同时进行声波处理，将牙齿从所述溶液中取出并清洗(步骤S5);将由S5处理过的牙齿浸泡在氯化钙溶液中，同时进行声波处理，将牙齿从所述溶液中取出并清洗(步骤S6)；以及将由S6处理过的牙齿浸泡在EDTA溶液中，同时进行声波处理，将牙齿从所述溶液中取出并清洗(步骤S7)。如果胶原蛋白被进一步凝胶化，则该方法还可以包括:将由S7处理过的牙齿浸泡在氯化锂溶液中，同时进行声波处理，将牙齿从所述溶液中取出并清洗(步骤S8);以及将由S8处理过的牙齿浸泡在蒸馏水中，同时进行声波处理(步骤S9)。加工过的牙齿可以在冷藏或冻干后在室温下保存，并且如果有必要，可以进行EO气体灭菌。使用根据本发明的任一个实施方案的拔除的牙齿，可以现场地直接制备骨移植材料，无需另外转移牙齿。因此，根据本发明的一个实施方案中的制备骨移植材料的方法，拔除的牙齿可以通过将牙齿浸泡在无菌生理盐水、蒸馏水或乙醇中冷藏，或以另外的方式，在从浸泡溶液中取出后冷冻保存。关于本发明的一个实施方案中的制备骨移植材料的方法，考虑到S4中的浸泡用于保留与骨形成相关的蛋白或类似物，该过程优选地在室温至60°C的范围内进行60-75分钟。
关于本发明的一个实施方案中的制备骨移植材料的方法，为了在保留与骨形成相关的蛋白的同时去除不需要的蛋白，在步骤S5、S6、S7和S8中的每个步骤中的浸泡优选在室温至60°C的范围内进行5-10分钟。关于本发明的一个实施方案中的制备骨移植材料的方法，为了保留与骨形成相关的蛋白或类似物，在步骤S5和S7中的每个步骤中的浸泡可以在pH7-8下进行。关于本发明的一个实施方案中的制备骨移植材料的方法，为了在保留与骨形成相关的蛋白或类似物的同时快速地去除无机成分，在S4中使用的盐酸溶液的浓度优选为
0.5N-2N。更优选地，在S4中使用的盐酸溶液的浓度可以为0.5N-0.6N。根据本发明的一个实施方案中的制备骨移植材料的方法，该方法可以使用拔除的牙齿现场地进行，并且可以在不另外转移牙齿的情况下获得上述材料。如果需要保存，根据本发明的一个实施方案的制备骨移植材料的方法还可以包括由S9处理过的牙齿在无菌条件下的冷藏。如果需要保存，根据本发明的一个实施方案的制备骨移植材料的方法还可以包括在将由S9处理过的牙齿在无菌条件下冷藏后或在制备骨移植材料后立刻，将所述牙齿冻干并在室温下保存。在此情况下，如果有必要，可以进一步包括EO气体灭菌以进行额外的灭菌。此外，本发明提供了一种通过从上述方法中选择的任一种方法制备的骨移植材料。根据本发明的一个实施方案的制备骨移植材料的方法可以通过使用化学试剂对身体硬组织诸如拔除的牙齿进行化学处理 来适当地制备骨移植材料，其中所述处理涉及声波处理(包括真空声波处理)以便极大地减少上述化学试剂处理所需的时间。而且，由于拔除的牙齿可以现场地加工，无需另外地转移牙齿，因此拔除的牙齿可以在2小时内直接用作移植材料。如上所述，本发明可以具有一些优势，其中通过处理身体硬组织诸如拔除的牙齿、骨等制备骨移植材料所需的时间可以相当大地减少，并且这样的骨移植材料可以使用拔除的牙齿来制备，无需另外地转移拔除的牙齿。
图1是根据本发明的一个实施方案通过化学处理与在减压下辐射超声波的声波处理一起处理的身体硬组织的电子显微镜照片，图2是通过化学处理与在不减小压力的条件下辐射超声波的声波处理一起处理的身体硬组织的电子显微镜照片，图3是显示根据本发明的一个实施方案处理的牙齿移植材料的western印迹分析结果的照片，图4是显示根据本发明的一个实施方案处理的牙齿移植材料的SEM结果的照片，图5是显示根据本发明的一个实施方案处理的牙齿移植材料的XRD结果的照片，以及图6是显示在根据本发明的制备骨移植材料的过程中的SI至S3期间在使用保存溶液处理之前和之后细菌培养的结果的照片。
A:对于在乙醇中保存时处理的牙齿，发现在其处理之前和之后由于乙醇的缘故，牙齿处于无菌状态。B:对于在盐水中保存时处理的牙齿，发现在其处理前牙齿未处于无菌状态，而在其处理后变成无菌。C:对于在盐水中保存时处理的牙齿，发现在其处理前未处于无菌状态，而在其处理后变成无菌。下面，将参照附图详细地描述本发明。本发明涉及骨移植材料及其制备方法。更具体地，提供了一种使用身体硬组织诸如自体牙齿或骨制备骨移植材料的方法。此方法也可以应用于加工同种异体牙齿和骨移植材料。身体硬组织可以包括根据对硬组织的病理学鉴定而取出的骨组织。下文中，以下的描述可以提供用于集中于身体硬组织中的牙齿，然而，本发明不特别地限于此。用于牙槽骨的移植材料是用于承受咀嚼压力的骨，并且其必须要经受骨重建。在牙齿的组成成分中，有机组分是I型胶原蛋白，而无机组分包括用于骨重建的元素。本发明涉及一种使用废弃的牙齿制备用于治疗牙槽骨的移植材料，所述废弃的牙齿包含与牙槽骨相同的组成成分。前文和后文中，‘废弃的牙齿’或‘拔除的牙齿’可以指任何牙齿，包括通过牙根管或假体治疗的牙齿，蛀牙等，并且要理解自体牙齿和同种异体牙齿包括在其中。根据本发明的制备骨移植材料的方法是使用拔除的牙齿和由拔除的牙齿通过化学试剂处理制备骨移植材料的方法。在本文中，化学试剂处理包括用于不同目的的制备骨移植材料的全过程，例如，脱脂、去矿质、从拔除的牙齿提取各种组分等，并且本发明的方法可以包括至少一种化学试剂处理。根据本发明，化学试剂处理与包括真空声波处理的声波处理一起进行以便获得极大改善的效率，由此显著地减少总处理时间，所述真空声波处理在减压下辐射超声波。关于声波处理，在减压下辐射超声波的真空声波处理可以根据真空度以及超声波频率控制空腔形成，由此去除附着于身体硬组织诸如拔除的牙齿的表面的气泡并诱导深深地穿透至样品内部。难以清楚地明确在牙齿的化学试剂处理中真空声波处理的活动机制。然而，可以预期，如果化学试剂处理与处于预定范围的超声频率(超声强度)的真空声波处理一起进行，则在开始减压时空腔形成的相对程度很大且断裂强度很高，从而启动对牙齿表面上牙本质中的钙组分的去除。因此，当压力减小到所需水平或以下(在低压力的情况下)时，即，真空度以预定的范围存在时，阻碍超声波传输的成分，诸如样品中的微小空气粒子，可以被负压去除，并且可以使空腔形成的相对程度最小化。而且，尽管断裂强度变弱，但空腔穿透至如上所述脱落的牙本 质中，从而允许进行所需的化学处理。当真空增加时，空腔形成的相对程度减小。并且，如果压力减小至预定的真空度或以下，对空腔形成的程度的影响不会大幅度地改变。
考虑到上述方面，真空声波处理中的真空度优选为10mmHg($)-700mmHg($)。更优选地，真空度可以为100_!^(托)-600_!^(托)。当真空度很低时,可能相对地消除真空效应，由此导致本发明的所需结果出现太晚的问题。在前文和下文中，要理解“包括真空声波处理的声波处理”是指除了在减压下辐射超声波的真空声波处理以外还有在相关领域中已知的任何其他声波处理方法。根据本发明的一个优选实施方案，就化学试剂处理的最大效率和防止其对组织的破坏的方面而言，所述声波处理优选在15kHz-40kHz的频率范围内进行。更具体地，所述声波处理可以以20kHz-40kHz进行。例如，当频率增加时，超声强度低并且很少能达到化学试剂处理的所需效率。另一方面，如果频率减小，则超声强度高，可以达到化学试剂处理的所需效率，然而，可能会发生组织破坏。在本发明中最优选的声波处理可以同时包括真空声波处理和非-真空声波处理。在此，所述非-真空声波处理可以指在非减压下进行的声波处理。更具体地，真空声波处理、非-真空声波处理和真空声波处理可以按连续顺序进行。例如，当在化学试剂处理期间在预定范围的超声频率下压力开始减小时，S卩，如果进行真空声波处理，贝1J去除了在牙齿和骨组织(Volkman氏管(Volkman’s cannal))内的小空间中存在的阻碍超声波穿透的空气。然后，当这种压力减小终止并且在非-真空条件下进行声波处理时，空腔形成可能再次最大化，并且可以促进硬组织表面上的所需化学试剂处理。此外，当在预定时间后重新开始减小压力，即，再次进行真空声波处理时，可以消除阻碍超声波传输的微小-空气粒子，空腔形成可以再次被最小化，由此增加了超声波的渗透性并促进硬组织内部的化学处理效应，并且进行化学处理处的部分的破坏可以被相当大地减少。真空声波处理/非-真空声波处理/真空声波处理之间的时间分布可以根据超声强度和样品的条件而变化。关于与化学试剂处理一起进行的声波处理，为了研究压力减小的效应，在具有不同初始重量的身体硬组织浸泡在50-200ml的盐酸溶液(0.6N浓度)中持续60分钟并同时进行真空声波处理(通过以20kHz的超声波频率施加600mmHg(托)的真空)的情况下，和在其中通过在与前一种情况相同的条件下进行化学试剂处理的同时在不施加真空的条件下以20kHz的超声波频率进行声波处理来处理上述身体硬组织的情况下，对化学试剂处理效应的评价结果可以通过测量硬组织的每个重量变化获得并显示在下面的表I和表2中。提出的测试数据使用0.6N盐酸溶液获得，并且，进一步，发现使用具有优选浓度范围的盐酸溶液可以获得相似的结果。而且，作为对照，通过已公开的韩国专利申请第2010-040427号中记载的现有方法观察的化学试剂处理后的重量变化及其结果显示在下面的表3中。在预定的时间取出组织，在蒸馏水中清洗该组织，并且用干纱布擦拭组织的湿表面以使其干燥之后，通过用具有l/100g单位的天平(型号:MWP，CASC0.，Ltd.)测量重量。根据下面的公式I可以计算重量减少比。公式I重量减少比)= (样品的初始重量-经过预定时间后样品的重量)/初始重量 XlOO重量减少比证明依照使用盐酸溶液的间接处理，化学试剂处理的效率已经达到所需目标。表I
权利要求
1.一种制备骨移植材料的方法，所述方法包括:使用化学试剂对选自拔除的牙齿和骨的至少一种身体硬组织执行至少一次化学处理， 其中使用化学试剂的化学处理(‘化学试剂处理’)与包括真空声波处理的声波处理一起进行，所述真空声波处理在减压下提供超声波辐射。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述声波处理在15kHz-40kHz范围的超声波频率下进行。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述真空声波处理在101111]1!^(托)-7001111]1!^(托)范围的真空压力下进行。
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述真空声波处理在IOOmmHg(托)-600mmHg (托)范围的真空压力下进行。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述声波处理包括按连续顺序的，在减压下辐射超声波的真空声波处理，在非减压条件下辐射超声波的非真空声波处理，和在减压下辐射超声波的进一步真空声波处理。
6.根据权利要求1所 述的方法，其中所述化学试剂处理在室温至60°C的范围内进行。
7.根据权利要求1所述的方法，还包括使用蒸馏水的处理用于除清洗以外的其他目的，其中所述使用蒸馏水的处理与声波处理一起进行。
8.根据权利要求1所述的方法，还包括:去除并清洗拔除的牙齿的软组织和牙髓(步骤 SI)； 从由SI处理过的牙齿分离牙冠和牙根，并且在分离的牙冠和牙根中形成至少一个孔洞(步骤S2)； 清洗由S2处理过的牙齿(步骤S3);以及 将由S3处理过的牙齿浸泡在盐酸溶液中，同时进行声波处理，将牙齿从所述溶液中取出并清洗(步骤S4)。
9.根据权利要求8所述的方法，还包括:将由S4处理过的牙齿浸泡在含有蛋白酶抑制剂的PBS溶液中，同时进行声波处理，将牙齿从所述溶液中取出并清洗(步骤S5)； 将由S5处理过的牙齿浸泡在氯化钙溶液中，同时进行声波处理，将牙齿从所述溶液中取出并清洗(步骤S6);以及 将由S6处理过的牙齿浸泡在EDTA溶液中，同时进行声波处理，将牙齿从所述溶液中取出并清洗(步骤S7)。
10.根据权利要求9所述的方法，还包括:将由S7处理过的牙齿浸泡在氯化锂溶液中，同时进行声波处理，将牙齿从所述溶液中取出并清洗(步骤S8);以及 将由S8处理过的牙齿浸泡在蒸馏水中，同时进行声波处理(步骤S9)。
11.根据权利要求1或8所述的方法，其中所述拔除的牙齿保存在无菌生理盐水、蒸馏水或乙醇中。
12.根据权利要求8所述的方法，其中，在S4中，所述浸泡在室温至60°C的范围内进行60-75分钟。
13.根据权利要求9所述的方法，其中，在步骤S5、S6、S7和S8中的每个步骤中，所述浸泡在室温至60°C的范围内进行5-10分钟。
14.根据权利要求9所述的方法，其中，在步骤S5和S7中的每个步骤中，所述浸泡在PH7-8下进行。
15.根据权利要求8所述的方法，其中在S4中使用的盐酸溶液的浓度为0.5N-2N。
16.根据权利要求15所述的方法，其中在S4中使用的盐酸溶液的浓度范围为0.5N-0.6N。
17.根据权利要求10所述的方法，其中，在步骤S8中，所述浸泡在室温至60°C的范围内进行5-10分钟。
18.根据权利要求10所述的方法，还包括对由S9处理过的牙齿在无菌条件下进行冷藏。
19.根据权利要求10所述的方法，还包括在对由S9处理过的牙齿在无菌条件下冷藏后或立即在其制备后，将所述牙齿冻干并在室温下保存。
20.根据权利要求10所述的方法，还包括在对由S9处理过的牙齿在无菌条件下冷藏后或立即在其制备后，将所述牙齿冻干并进行EO气体灭菌。
21.通过选自权利要求1-20任`一项的制备方法制备的骨移植材料。
全文摘要
本发明涉及一种使用拔除的牙齿制备骨移植材料的方法，以及通过该方法制备的骨移植材料，并且具体地，涉及一种能够在短时间内使用患者的拔除的牙齿或同类的牙齿制备骨移植材料的骨移植材料制备方法。
文档编号C12N5/071GK103200972SQ201180052326
公开日2013年7月10日 申请日期2011年9月26日 优先权日2010年10月27日
发明者朴昶铢, 李润珍 申请人:克世摸生物医学有限公司
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