用于产生可发酵糖类的组合物和方法

xiaoxiao2020-6-24  7

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专利名称:用于产生可发酵糖类的组合物和方法
技术领域
本发明提供用于产生可发酵糖类的组合物和方法。在一些实施方案中,本发明提供遗传修饰的真菌生物体。在一些另外的实施方案中,本发明提供可用于增强纤维素材料向可发酵糖类(例如,葡萄糖)的水解的酶,和使用所述酶的方法。在一些进一步的实施方案中,本发明提供可用于水解纤维素材料的酶混合物。背景纤维素是由β_1,4糖苷 键连接的简单糖(simple sugar)葡萄糖的聚合物。许多微生物产生水解连接的葡聚糖的酶。这些酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase)和β-葡糖苷酶。内切葡聚糖酶在随机位置消化纤维素聚合物,将其打开以被纤维二糖水解酶攻击。纤维二糖水解酶从纤维素聚合物的末端连续地释放纤维二糖分子。纤维二糖是水溶性的β-1,4-连接的葡萄糖二聚体。葡糖苷酶水解纤维二糖为葡萄糖。转化木质纤维素原料为乙醇具有以下优点:大量原料的容易获得性、避免燃烧或陆地装填材料的土地的需要、和降低的总的温室气体产生。木头(wood)、农业残余物、草本作物、和市政固体废料已经被考虑作为乙醇产生的原料。这些材料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。在纤维素被转化为葡萄糖后,葡萄糖容易被酵母发酵为乙醇。尽管在增加木质纤维素原料的酶促降解效力方面已经得到进展,使用酶促工艺改进可发酵糖类的产量仍有巨大需求。发明概沭本发明提供遗传修饰的真菌生物体、以及增强纤维素材料向葡萄糖的水解的酶、和使用所述酶的方法。本发明提供已被遗传修饰以减少由所述真菌细胞产生的内源葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶(oxidizing enzyme)活性的量的真菌细胞。在一些实施方案中,所述真菌细胞是子囊菌(Ascomycete)、属于亚门盘菌亚门(Pezizomycotina),和/或其中所述真菌细胞是来自科毛壳菌科(Chaetomiaceae)。在一些实施方案中,所述真菌细胞是毁丝霉属(Myceliophthora)、梭孢壳属(Thielavia)、侧孢霉属(Sporotrichum)、链孢霉属(Neurospora)、粪壳菌属(Sordaria)、柄孢壳菌属(Podospora)、大角间座壳属(Magnaporthe)、镰孢菌属(Fusarium)、赤霉菌属(Gibberella)、葡萄孢盘菌属(Botryotinia)、腐质霉属(Humicola)、新萨托菌属(Neosartorya)、核腔菌属(Pyrenophora)、暗球腔菌属(Phaeosphaeria)、核盘菌属(Sclerotinia)、毛壳属(Chaetomium)、丛赤壳菌属(Nectria)、轮枝孢属(Verticillium)、棒囊壳属(Corynascus)、支顶抱属(Acremonium)、木节霉属(Ctenomyces)、金抱属(Chrysosporium)、节格孢属(Scytalidium)、篮状菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)或曲霉属(Aspergillus)的物种。在一些另外的实施方案中,所述真菌细胞是毁丝霉属、梭孢壳属、侧孢霉属、金孢属、棒囊壳属、支顶孢属、毛壳属、柿霉属、节格孢属、篮状菌属或嗜热子囊菌属的物种,而在一些其他实施方案中,所述真菌细胞是嗜热侧孢霉(Sporotrichum thermophile)、嗜纤维素侧抱霉(Sporotrichum cellulophiIum)、Thielavia heterothallica、太瑞斯梭抱壳霉(Thielavia terrestris)、Corynascusheterothallicus 或嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)。在一些实施方案中,所述真菌细胞已被遗传修饰以减少由所述真菌细胞产生的内源葡萄糖氧化性酶和/或纤维二糖脱氢酶的量。在一些另外的实施方案中,所述真菌细胞已被遗传修饰以减少由所述真菌细胞产生的内源葡萄糖氧化性酶和/或纤维二糖脱氢酶的量和增加至少一种糖水解性酶(hydrolyzing enzyme)的产生。在一些进一步的实施方案中,所述真菌细胞已被遗传修饰以减少由所述真菌细胞产生的内源葡萄糖氧化性酶和/或纤维二糖脱氢酶的量和增加至少一种糖水解性酶的产生,且其中所述真菌细胞是担子菌(Basidiomycete)、属于纲伞菌纲(Agaricomycetes)。在一些实施方案中,所述担子菌是侧耳属(Pleurotus)、隔孢伏革菌属(Peniophora)、栓菌属(Trametes)、阿太菌属(Athelia)、小核菌属(Sclerotium)、鸡揪菌属(Termitomyces)、小火焰菌属(Flammulina)、粉孢革菌属(Coniphora)、灵芝属(Ganoderma)、密孔菌属(Pycnoporus)、拟腊菌属(Ceriporiopsis)、原毛平革菌属(Phanerochaete)、褐裙菌属(Gloeophyllum)、猴头菌属(Hericium)、异担子菌属(Heterobasidion)、胶化孔菌属(Gelatoporia)、环柄燕属(Lepiota)或fE齿菌属(Irpex)的物种。在一些实施方案 中,所述真菌细胞已被遗传修饰以减少由所述真菌细胞分泌的内源葡萄糖氧化酶(oxidase)和/或纤维二糖脱氢酶的量。在一些另外的实施方案中,所述真菌细胞已被遗传修饰以破坏所述葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶的分泌信号肽。在一些进一步的实施方案中,所述真菌细胞已被遗传修饰以减少由所述真菌细胞表达的内源葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶的量。在又一些另外的实施方案中,所述真菌细胞已被遗传修饰以破坏编码所述内源葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶的转录子中的翻译起始序列。在一些另外的实施方案中,所述真菌细胞已被遗传修饰以在编码所述内源葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶的转录子引入移码突变。在一些进一步的实施方案中,所述真菌细胞已被遗传修饰以减少编码所述内源葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶的基因的转录水平。在一些实施方案中,所述真菌细胞已被遗传修饰以破坏编码所述内源葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶的基因的启动子。在又一些另外的实施方案中,所述真菌细胞已被遗传修饰以至少部分地缺失编码所述内源葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶的至少一种基因。在一些进一步的实施方案中,所述真菌细胞已被遗传修饰以减少所述内源葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶的催化效力。在一些另外的实施方案中,所述真菌细胞已被遗传修饰以突变所述葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶的活性位点中的一个或多个残基。在一些进一步的实施方案中,所述真菌细胞已被遗传修饰以突变所述葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶的血红素结合结构域中的一个或多个残基。在本文提供的真菌细胞的一些实施方案中,所述葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶选自纤维二糖脱氢酶(EC1.1.99.18)、葡萄糖氧化酶(EC1.1.3.4)、吡喃糖氧化酶(EC1.1.3.10)、葡萄糖寡糖氧化酶(EC1.1.99.B3)、吡喃糖脱氢酶(EC1.1.99.29)和葡萄糖脱氢酶(EC1.1.99.10)。在一些另外的实施方案中,所述葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶包括与 SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14和/或16至少约80%、约81%、约82%、约83%、约 84%、约 85%、约 86%、约 87%、约 88%、约 89%、约 90%、约 91%、约 92%、约 93%、约94 %、约95 %、约96 %、约97 %、约98 %或约99 %相同的氨基酸序列。在一些进一步的实施方案中,所述葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶是纤维二糖脱氢酶(EC1.1.99.18)。在一些实施方案中,所述真菌细胞已被遗传修饰以减少由所述真菌细胞在所述遗传修饰之前产生的两种或多种内源葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶的葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶活性的量。在一些进一步的实施方案中,所述两种或多种所述葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶的第一种包括与SEQ ID吣:2、4、6、8、10、12、14和/或16至少约80%、约81%、约82%、约 83%、约 84%、约 85%、约 86%、约 87%、约 88%、约 89%、约 90%、约 91%、约 92%、约93 %、约94 %、约95 %、约96 %、约97 %、约98 %或约99 %相同的氨基酸序列,且所述两种或多种所述葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶的第二种包括与SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14和/或16至少约80%、约81 %、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约 89%、约 90%、约 91 %、约 92%、约 93%、约 94%、约 95%、约 96%、约 97%、约 98%或约99 %相同的氨基酸序列。本发明还提供包含两种或多种纤维素水解性酶的酶混合物,其中所述两种或多种纤维素水解性酶的至少一种由本文提供的真菌细胞的至少一种表达。本发明还提供包含两种或多种纤维素水解性酶的酶混合物,其中所述两种或多种纤维素水解性酶的至少一种由已被遗传修饰以减少由所述真菌细胞分泌的内源葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶活性的量的真菌细胞产生,且其中所述真菌细胞是子囊菌、属于亚门盘菌亚门。在一些实施方案中,所述真菌细胞是毁丝霉属、梭孢壳属、侧孢霉属、棒囊壳属、支顶孢属、毛壳属、栉霉属、节格孢属、篮状菌属或嗜热子囊菌属的物种。本发明还提供包含两种或多种纤维素水解性酶的酶混合物,其中所述两种或多种纤维素水解性酶的至少一种由已被遗传修饰以减少由所述真菌细胞分泌的内源葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶活性的量和增加至少一种糖水解性酶的产生的真菌细胞产生,且其中所述真菌细胞是担子菌、属于纲伞菌纲。在一些实施方案中,所述酶混合物是无细胞混合物。在一些另外的实施方案中,所述酶混合物的基质包括预处 理的木质纤维素。在一些进一步的实施方案中,所述预处理的木质纤维素包括以选自酸预处理、铵预处理、蒸汽爆破和/或有机溶剂提取的处理方法处理的木质纤维素。本发明还提供包含两种或多种纤维素水解性酶的酶混合物,其中所述真菌纤维素酶混合物相对于亲本(或参考)酶混合物被修饰以至少部分地缺乏葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶活性。本发明还提供包含两种或多种纤维素水解性酶的酶混合物,所述纤维素水解性酶的至少一种是对真菌细胞内源的,其中所述真菌细胞是担子菌、属于纲伞菌纲或子囊菌、属于亚门盘菌亚门,且其中所述酶混合物的特征在于,当所述酶混合物与纤维二糖和/或葡萄糖接触时,10小时后不多于约10%、约15%或约20%的所述纤维二糖和/或葡萄糖被氧化。在酶混合物的一些实施方案中,所述真菌细胞已被遗传修饰以减少由所述真菌细胞分泌的葡萄糖和/或纤维二糖氧化酶活性的量。在一些进一步的实施方案中,所述酶混合物是无细胞混合物。在一些另外的实施方案中,所述酶混合物包括至少一种葡糖苷酶。在一些进一步的实施方案中,所述酶混合物包含选自内切葡聚糖酶(EG)、β-葡糖苷酶(BGL)、I型纤维二糖水解酶(CBHl)、2型纤维二糖水解酶(CBH2)、和/或糖苷水解酶61 (GH61)、和/或所述纤维素酶的变体的至少一种纤维素酶。在一些实施方案中,所述酶混合物还包含至少一种纤维二糖脱氢酶。在一些实施方案中,所述纤维二糖脱氢酶是⑶Hl和/或⑶Η2。在一些另外的实施方案中,所述酶混合物还含至少一种纤维素酶和/或至少一种另外的酶。在一些进一步的实施方案中,所述酶混合物已经受纯化工艺以从所述酶混合物选择性地去除一种或多种葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶。在一些实施方案中,所述纯化工艺包括选择性沉淀以分离所述葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶与所述酶混合物中存在的其他酶。在一些另外的实施方案中,所述酶混合物包含一种或多种葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶的至少一种抑制剂。本发明还提供产生纤维二糖和/或葡萄糖的方法,包括将纤维素基质与包含两种或多种纤维素水解性酶的酶混合物接触来产生葡萄糖和/或纤维二糖,其中所述纤维素水解性酶的至少一种是对为子囊菌、属于亚门盘菌亚门的真菌细胞内源的,且其中所述酶混合物的特征在于,当所述酶混合物与纤维二糖和/或葡萄糖接触时,10小时后不多于约10 %、约15 %或约20 %的所述纤维二糖和/或葡萄糖被氧化。在一些实施方案中,所述子囊菌是毁丝霉属、梭孢壳属、侧孢霉属、链孢霉属、粪壳菌属、柄孢壳菌属、大角间座壳属、镰孢菌属、赤霉菌属、葡萄孢盘菌属、腐质霉属、新萨托菌属、核腔菌属、暗球腔菌属、核盘菌属、毛壳属、丛赤壳菌属、轮枝孢属或曲霉属的物种。本发明还提供产生纤维二糖和/或葡萄糖的方法,包括将纤维素基质与包含两种或多种纤维素水解性酶的酶混合物接触来产生葡萄糖和/或纤维二糖,其中所述纤维素水解性酶的至少一种是对为担子菌、属于纲伞菌纲的真菌细胞内源的,且其中所述酶混合物的特征在于,当所述酶混合物与纤维二糖和/或葡萄糖接触时,10小时后不多于约10%、约15%或约20%的所述纤维二糖和/或葡萄糖被氧化。在一些实施方案中,所述担子菌是侧耳属、隔孢伏革菌属、栓菌属、阿太菌属、小核菌属、鸡揪菌属、小火焰菌属、粉孢革菌属、灵芝属、密孔菌属、拟蜡菌属、原毛平革菌属、褐褶菌属、猴头菌属、异担子菌属、胶化孔菌属、环柄燕属或祀齿菌属的物种。本发明还提供产生纤维二糖和/或葡萄糖的方法,包括将纤维素基质与包含两种或多种纤维素水解性酶的酶混合物接触来产生葡萄糖和/或纤维二糖,其中所述纤维素水解性酶的至少一种是对为属于子囊菌、亚门盘菌亚门的真菌细胞内源的,且其中,在由所述酶混合物水解的纤维素之中,至少约80%、约85%或约90%以纤维二糖和/或葡萄糖的形式存在。在一些实施方案中,所述子囊菌是毁丝霉属、梭孢壳属、侧孢霉属、链孢霉属、粪壳菌属、柄孢壳菌属、大角间座壳属、镰孢菌属、赤霉菌属、葡萄孢盘菌属、腐质霉属、新萨托菌属、核腔菌属、暗球腔菌属、核盘菌属、毛壳属、丛赤壳菌属、轮枝孢属或曲霉属的物种。在一些实施方案中,所述子囊菌是嗜热毁丝霉、Thielavia heterothallica或嗜热侧孢霉。在一些实施方案中,所述真菌细胞是嗜热毁丝霉。本发明还提供产生纤维二糖和/或葡萄糖的方法,包括将纤维素基质与包含两种或多种纤维素水解性酶的酶混合物接触来产生葡萄糖和 /或纤维二糖,其中所述纤维素水解性酶的至少一种是对为担子菌、属于纲伞菌纲的真菌细胞内源的,且其中,在由所述酶混合物水解的纤维素之中,至少约80%、约85%或约90%以纤维二糖和/或葡萄糖的形式存在。在一些实施方案中,所述担子菌是侧耳属、隔孢伏革菌属、栓菌属、阿太菌属、小核菌属、鸡揪菌属、小火焰菌属、粉孢革菌属、灵芝属、密孔菌属、拟蜡菌属、原毛平革菌属、褐褶菌属、猴头菌属、异担子菌属、胶化孔菌属、环柄菇属或耙齿菌属的物种。本发明还提供从纤维素产生纤维二糖和/或葡萄糖的方法,包括用酶混合物处理纤维素基质来产生葡萄糖,其中所述酶混合物相对于来自参考(或亲本)真菌细胞的分泌的酶混合物被修饰以至少部分地缺乏葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶活性。在所述方法的一些实施方案中,所述酶混合物是无细胞混合物。在一些另外的实施方案中,所述纤维素基质包括预处理的木质纤维素。在一些进一步的实施方案中,所述预处理的木质纤维素包括以选自酸预处理、铵预处理、蒸汽爆破和/或有机溶剂提取的处理方法处理的木质纤维素。在一些进一步的实施方案中,所述方法还包括发酵所述纤维二糖和/或葡萄糖为终产物。在一些实施方案中,所述终产物是至少一种燃料醇(fuel alcohol)和/或至少一种前体工业化学品(precursor industrial chemical)。在一些另外的实施方案中,所述燃料醇是乙醇或丁醇。在一些实施方案中,从纤维素产生纤维二糖和/或葡萄糖的所述工艺与所述发酵以同步糖化发酵(SSF)方法进行。在一些进一步的另外的实施方案中,所述酶混合物由已被遗传修饰以减少由所述真菌细胞分泌的一种或多种内源葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶的量的真菌细胞产生。在一些实施方案中,所述酶混合物已经受纯化工艺以从所述酶混合物选择性地去除至少一种葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶。在一些进一步的实施方案中,所述纯化工艺包括选择性沉淀以分离所述葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶与所述酶混合物中存在的其他酶。在又一些另外的实施方案中,所述酶混合物包含所述葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶的至少一种抑制剂 。在一些实施方案中,所述抑制剂包括选自叠氮化钠、氰化钾、金属阴离子、和其组合的广谱氧化酶抑制剂。在一些实施方案中,所述抑制剂包括选自纤维二糖咪唑(cellobioimidazole)、龙胆二糖、乳糖酸-1, 5-内酯、纤维二糖酸-1,5-内酯、三-N-乙酸基壳三糖、甲基-β-D纤维二糖苷酶(methyl-β-D cellobiosidase)、2,2-二吡啶、细胞色素C、和其组合的纤维二糖脱氢酶(EC1.1.99.18)的特异性抑制剂。在一些实施方案中,所述方法是分批工艺,而在一些其他实施方案中,其是连续工艺,在一些进一步的实施方案中,其是分批补料工艺,在又进一步的实施方案中,其是以任何顺序进行的分批工艺、连续工艺、和/或分批补料工艺的组合。在一些实施方案中,所述方法在至少10,000升的反应体积中进行,而在一些其他实施方案中,所述方法在至少100,000升的反应体积中进行。在一些实施方案中,所述酶混合物包含至少一种β-葡糖苷酶,而在一些其他实施方案中,所述酶混合物不包含β-葡糖苷酶。在一些实施方案中,所述酶混合物包含至少一种内切葡聚糖酶,而在一些其他实施方案中,所述酶混合物不包含内切葡聚糖酶。在一些实施方案中,所述酶混合物包含选自内切葡聚糖酶(EG)、β -葡糖苷酶(BGL)、1型纤维二糖水解酶(CBHl)、2型纤维二糖水解酶(CBH2)、和/或糖苷水解酶61 (GH61)、和/或所述纤维素酶的变体的至少一种纤维素酶。本发明还提供产生葡萄糖的方法,包括将纤维素与包含两种或多种纤维素水解性酶的酶混合物接触,其中所述两种或多种纤维素水解性酶的至少一种由本文提供的真菌细胞产生。本发明还提供产生葡萄糖的方法,包括将纤维素与包含两种或多种纤维素水解性酶的酶混合物接触,其中所述两种或多种纤维素水解性酶的至少一种由已被遗传修饰以减少由所述真菌细胞分泌的内源葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶活性的量的真菌细胞产生,其中所述真菌细胞是子囊菌、属于亚门盘菌亚门。在一些实施方案中,所述真菌细胞是毁丝霉属、梭孢壳属、侧孢霉属、棒囊壳属、支顶孢属、毛壳属、栉霉属、节格孢属、篮状菌属或嗜热子囊菌属的物种。本发明还提供产生葡萄糖的方法,包括将纤维素与包含两种或多种纤维素水解性酶的酶混合物接触,其中所述两种或多种纤维素水解性酶的至少一种由已被遗传修饰以减少由所述真菌细胞分泌的内源葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶活性的量和增加至少一种糖水解性酶的产生的真菌细胞产生,其中所述真菌细胞是担子菌、属于纲伞菌纲。本发明还提供产生葡萄糖的方法,包括将纤维素与至少一种本文提供的酶混合物接触。在一些实施方案中,所述纤维素包括预处理的木质纤维素。在一些另外的实施方案中,所述预处理的木质纤维素包括以选自酸预处理、铵预处理、蒸汽爆破和/或有机溶剂提取的处理方法处理的木质纤维素。在一些另外的实施方案中,所述酶混合物是无细胞混合物。在一些进一步的实施方案中,所述方法还包括发酵所述葡萄糖为终产物。在一些实施方案中,所述终产物是燃料醇或前体工业化学品。在一些实施方案中,所述燃料醇是乙醇或丁醇。本发明还提供本文提供的真菌细胞、以及本文提供的酶混合物、和本文提供的方法,还包含对所述真菌细胞异源的纤维素降解酶。本发明还提供包含至少一种本文提供的真菌细胞的发酵培养基。本发明还提供包含至少一种本文提供的酶混合物的发酵培养基。本发明还提供包含如本文提供的至少一种真菌细胞和/或至少一种酶混合物的发酵培养基。本发明还提供产生至少一种纤维素酶的方法,包括在使得产生所述至少一种纤维素酶的条件下至少一种本 文提供的真菌细胞。在一些实施方案中,所述真菌细胞是重组的。本发明还提供包含至少一种本文提供的纤维素酶的组合物。附图描沭

图1是显示使用从菌株CF-402、CF-403和CF-401获得的酶混合物水解纤维素的产物的图表,如在实施例1和实施例7中进一步描述的。黑色柱代表测量的葡萄糖产生。浅色柱代表测量的葡糖酸(gluconate)产生。水平线上方的数字表示葡萄糖和葡糖酸比例(fraction)的总和。图2是显示使用由菌株CF_400(包含cdhl缺失);菌株CF-401 (包含cdhl和cdh2的缺失)和菌株CF-402 (包含cdhl和cdh2)产生的酶混合物水解纤维素的产物的图表,如在实施例8中进一步描述的。图3和4提供嗜热毁丝霉⑶Hl和⑶H2的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NO:5_8)。图5和6提供嗜热毁丝霉GOl和G02的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NO: 1-4)。图7提供米曲霉(A.0ryzae)吡喃糖氧化酶的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NO:9-10)。图8提供点枝顶孢霉(A.strictum)葡萄糖寡糖氧化酶的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NO: 11-12)。图9提供双孢蘑菇(A.bisporus)吡喃糖脱氢酶的核苷酸和氨基酸序列(SEQ IDNO:13-14)。图10提供柄篮状菌(T.stipitatus)ATCC10500葡萄糖脱氢酶的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NO:15-16)。图11提供显示使用包含纤维二糖脱氢酶活性的酶混合物对可获得的纤维素的分级回收的图表。黑色柱代表使用实施例1中所述的辣根过氧化物酶偶联的酶检验测量的葡萄糖产量。浅色柱代表使用实施例9中所述的用于确定纤维素转化的IR方法计算的预计
的葡萄糖产量。图12A和12B是显示纤维三糖的酸水解(图12A)或由包含纤维二糖脱氢酶的酶混合物产生的纤维素水解产物(图12B)的作用的HPLC色谱图,如实施例11中所述的。图13提供使用缺少(Turbo)或包含(CF-402)纤维二糖脱氢酶活性的酶混合物获得的纤维素水解产物的IR谱。竖向箭头指示由CF-402酶混合物产生的水解产物独特的在1715CHT1的羰基峰。图14A和14B是鉴定使用由菌株CF-402分泌的纤维素酶从葡萄糖(图5A)或从纤维素水解产物产生的氧化的葡萄糖产物的HPLC色谱图,如实施例13中所述的。发明描沭本发明提供 遗传修饰的真菌生物体、以及增强纤维素材料向葡萄糖的水解的酶、和使用所述酶的方法。本文提到的所有专利和出版物,包括在这些专利和出版物中公开的所有序列均通过引用明确地并入本文。除非另外指明,否则本发明的实施涉及在分子生物学领域、发酵领域、微生物学领域和相关领域中通常使用的常规技术,这些技术是所属领域普通技术人员已知的。除非在本文另外定义,否则本文使用的所有技术和科学术语均具有在本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。尽管在本发明的实施或试验中可使用与本文所述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料,但描述了一些适合的方法和材料。实际上,意图在于本发明不限于本文所述的特定方法学、方案和试剂,因为这些可随使用它们的背景而改变。本文提供的标题不是对本发明的多个方面或实施方案的限制。尽管如此,为了促进对本发明的理解,以下定义了若干术语。数值范围包括限定范围的数字。这样,本文公开的每个数值范围旨在包括落在这种较宽的数值范围内的每个较窄的数值范围,如同这种较窄的数值范围全部被明确写在本文一样。意图还在于本文公开的每个最大(或最小)的数值限制包括每个较低(或较高)的数值限制,如同这种较低(或较高)的数值限制被明确地写在本文一样。如本文所用,术语“包括”及其同源词以其包含的意义使用(即,等同于术语“包含”及其对应的同源词)。如在此处和在所附权利要求中所用,除非上下文另外清楚地表示,否则单数“一(a)”、“一(an)”和“该(the) ”包括复数指代。因此,例如,提到“宿主细胞”包括多个此类
宿主细胞。除非另外指明,否则分别以5'至3'方向从左到右书写核酸;以氨基到羧基方向从左到右书写氨基酸序列。本文提供的标题不是对可通过参照作为整体的说明书而具有的本发明的多个方面或实施方案的限制。据此,通过参照作为整体的说明书更完全地定义以下所定义的术语。
如本文所用,“底物(substrate) ”是指通过酶的作用被转化或打算被转化为另一种化合物的物质或化合物。该术语不仅包括单种化合物还包括化合物的组合,诸如包含至少一种底物的溶液、混合物和其他材料。如本文所用,“转化”是指底物被酶促转化为对应的产物。“转化百分比”是指在指定条件下在一段时间内被转化为产物的底物的百分比。因此,例如,纤维二糖脱氢酶(“CDH”或“cdh” )多肽的“酶活性”或“活性”可以表示为底物到产物的“转化百分比”。如本文所用,“分泌活性”是指细胞外环境(extracellular environment)中存在的由真菌细胞产生的葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶的酶活性。细胞外环境可以是,例如,细胞外环境(extracellular milieu)诸如培养基。分泌活性受分泌的葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶的总量影响,还受分泌的葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶的催化效力影响。如本文所用,“催化效力的减少”是指如由本文提供的或本领域另外已知的标准技术测量的,葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶相对于未修饰的葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶的活性的减少。 如本文所用,术语“酶混合物”是指至少两种酶的组合。在一些实施方案中,至少两种酶在组合物中存在。在一些另外的实施方案中,酶混合物在细胞(例如,真菌细胞)中存在。在一些实施方案中,酶混合物中存在的酶的每一种或一些由不同真菌细胞和/或不同真菌培养物产生。在一些进一步的实施方案中,酶混合物中存在的所有酶由同一细胞产生。在一些实施方案中,酶混合物包含纤维素酶,而在一些另外的实施方案中,酶混合物包含纤维素酶以外的酶。在一些实施方案中,酶混合物包含至少一种纤维素酶和至少一种纤维素酶以外的酶。在一些实施方案中,酶混合物包含包括但不限于以下的酶:内切木聚糖酶(EC3.2.1.8)、β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)、a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC3.2.1.55)、α-葡糖醛酸酶(EC3.2.1.139)、乙酰基木聚糖酯酶(EC3.1.1.72)、阿魏酰酯酶(EC3.1.1.73)、香豆酰酯酶(EC3.1.1.73)、α -半乳糖苷酶(EC3.2.1.22), β -半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)、β -甘露聚糖酶(EC3.2.1.78)、β -甘露糖苷酶(EC3.2.1.25)、内切-聚半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.15)、果胶甲基酯酶(EC3.1.1.11)、内切-半乳聚糖酶(EC3.2.1.89)、果胶乙酰基酯酶(EC3.1.1.6)、内切-果胶裂解酶(EC4.2.2.10)、果胶酸裂解酶(EC4.2.2.2)、α鼠李糖苷酶(EC3.2.1.40)、外切-半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.82)、夕卜切-半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.67)、外切聚半乳糖醛酸裂解酶(EC4.2.2.9)、鼠李聚糖半乳糖醒酸内切裂解酶(rhamnogalacturonan endolyase)EC(4.2.2.B3)、鼠李聚糖半乳糖醒酸乙酰酯酶(EC3.2.1.Bll)、鼠李聚糖半乳糖醛酸半乳糖醛酸水解酶(EC3.2.1.Bll)、内切-阿拉伯聚糖酶(EC3.2.1.99)、虫漆酶(EC1.10.3.2)、锰依赖性过氧化物酶(EC1.10.3.2)、淀粉酶(EC3.2.1.1)、葡糖淀粉酶(EC3.2.1.3)、脂酶、木质素过氧化物酶(EC1.11.1.14)、和/或蛋白酶。在一些另外的实施方案中,本发明还提供包括至少一种扩展蛋白(expansin)和/或扩展蛋白样蛋白,诸如纤维膨胀因子(swollenin)(参见例如,Salheimo等,Eur.J.Biochem.,269 =4202-4211 [2002])和/或纤维膨胀因子样蛋白的酶混合物。扩展蛋白与植物细胞生长过程中细胞壁结构的松弛有关。已提出扩展蛋白破坏纤维素与其他细胞壁多糖之间的氢键而没有水解活性。以这种方法,认为它们允许纤维素纤维的滑动和细胞壁的扩展。纤维膨胀因子是一种扩展蛋白样蛋白,包括N端碳水化合物结合模块家族I结构域(CBD)和C端扩展蛋白样结构域。在一些实施方案中,扩展蛋白样蛋白和/或纤维膨胀因子样蛋白包括此类结构域中的一个或两个和/或破坏细胞壁的结构(例如破坏纤维素结构),任选地不产生可检测的量的还原糖。在一些另外的实施方案中,酶混合物包括纤维素整合蛋白(cellulose integrating protein)、支架蛋白和/或支架蛋白样蛋白的至少一种多肽产物(例如分别来自热纤梭菌(Clostridium thermocellum)或解纤维梭菌(Clostridiumcellulolyticum)的CipA或CipC)。在一些另外的实施方案中,酶混合物包括至少一种纤维素诱导蛋白和/或纤维素调节蛋白(cellulose induced protein and/or modulatingprotein)(例如,由来自里氏木霉的cipl或cip2基因和/或类似基因所编码的蛋白;参见例如,Foreman 等,J.Biol.Chem.,278 =31988-31997 [2003]) 在一些另外的实施方案中,酶混合物包括至少一种GH61和上述多肽类别中的每一种的至少一个成员、一个多肽类别中的若干成员、或这些多肽类别的任何组合,以提供适于多种用途的酶混合物。至少一种、两种、三种、四种、五种或多于五种酶和/或多肽的任何组合可用在本文提供的多种酶混合物中。事实上,不预期本发明的酶混合物限于任何特定的酶、多肽、组合,因为任何适合的酶混合物可用于本发明。如本文所用,术语“糖”是指任何碳水化合物,包括单糖(例如,葡萄糖、核糖、果糖、半乳糖等)、二糖(例如,蔗糖、乳糖、麦芽糖、纤维二糖、海藻糖、蜜二糖等)、寡糖(例如,棉子糖、水苏糖、直链淀粉等)、和多糖(例如,淀粉、糖原、纤维素、壳多糖、木聚糖、阿糖基木聚糖、甘露聚糖、墨角藻聚糖、半乳甘露聚糖、愈创葡聚糖、昆布多糖、金藻昆布多糖、支链淀粉、葡聚糖、糊精、麦芽糖糊精、菊粉、低聚果糖、聚葡萄糖等)。该术语涵盖简单的碳水化合物、以及复合的碳水化合物。事实上,不预期本发明限于任何特定的糖,因为多种糖和糖的形式可用于本发明。如本文所用,术语“糖水解性酶(saccharide hydrolyzing enzyme) ”是水解至少一种糖的任何酶。如本文所用,术语“葡萄糖氧化性酶(glucose oxidizing enzyme) ”和“纤维二糖氧化性酶(cellobiose oxidizing enzyme) ”是指氧化葡萄糖和/或纤维二糖的酶。例如,葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶包括葡萄糖氧化酶(EC1.1.3.4)、纤维二糖脱氢酶(EC1.1.99.18)、吡喃糖氧化酶(EC1.1.3.10)、葡萄糖寡糖氧化酶(EC1.1.99.B3)、吡喃糖脱氢酶(EC1.1.99.29)和葡萄糖脱氢酶(EC1.1.99.10)。如本文所用,术语“葡萄糖氧化酶(glucose oxidase) ”和“GO”是指为催化β -D-葡萄糖氧化为D-葡糖酸-1,5-内酯的氧化还原酶的酶,D-葡糖酸-1,5-内酯是在水溶液中与葡糖酸(gluconic acid)或葡糖酸盐(gluconate)以pH依赖性平衡存在的环状酯。示例性葡萄糖氧化酶落入酶分类(EC1.1.3.4)。为了作为催化剂起作用,葡萄糖氧化酶通常利用共底物的氧化剂,诸如黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)。该酶是对β -D-葡萄糖高度特异性的。然而,葡萄糖氧化酶还可对底物2-脱氧-D-葡萄糖、D-甘露糖和D-半乳糖表现某种较小的氧化酶活性(参见例如,Bentley, Meth.Enzymol.,9:86[1996])。如本文所用,术语“纤维二糖脱氢酶”和“⑶H”是指在接受体(acceptor)的存在下催化纤维二糖转化为纤维二糖酸-1,5-内酯和还原的接受体的纤维二糖:接受体1-氧化还原酶。纤维二糖脱氢酶的实例落入酶分类( E.C.1.1.99.18)。通常2,6_ 二氯靛酚可作为接受体起作用,铁尤其是Fe(SCN)3、分子氧、泛醌或细胞色素C、和其他聚酚醛类(polyphenolics)诸如木质素也可以。该酶的底物包括纤维二糖、纤维_寡糖、乳糖和D-葡糖基-1,4-β -D-甘露糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露二糖、硫代纤维二糖、半乳糖基-甘露糖、木二糖、木糖。电子供体包括在还原端带有葡萄糖或甘露糖的β-1-4 二己糖,而α-1-4己糖苷、己糖、戍糖和β-1-4戍糖聚合物(pentomer)可用作这些酶中的至少一些酶的底物(参见例如,Henriksson 等人,Biochim.Biophys.Acta-Prot.Struct.Mol.Enzymol.,1383:48-54 [1998];和 Schou 等人,Biochem.J.,330:565_571 [1998])。如本文所用,术语“氧化”、“氧化的”和本文使用的类似术语是指包括但不限于纤维二糖酸内酯、纤维二糖酸、葡糖酸内酯、葡糖酸盐和/或葡糖酸的一种或多种葡萄糖或纤维二糖氧化产物的酶促形成。当提及氧化的纤维二糖和/或葡萄糖的百分比使用时,这些百分比反映相对于基质的初始量的重量百分比(w/w)。例如,当酶混合物与纤维二糖和/或葡萄糖接触时,氧化的纤维二糖和/或葡萄糖的百分比反映相对于溶液中存在的纤维二糖和/或葡萄糖的初始量的重量百分比(w/W)。当酶混合物与纤维素基质接触时,氧化的纤维二糖和/或葡萄糖的百分比反映基于能够从总的水解的纤维素产生的葡萄糖的最大量(即,Gmax)的重量百分比(w/w) (wt% )。如本文所用,术语“纤维二糖脱氢酶”和“CDH”是指在接受体的存在下催化纤维二糖转化为纤维二糖酸-1,5-内酯和还原的接受体的纤维二糖:接受体1-氧化还原酶。纤维二糖脱氢酶的实例被包括在酶分类(E.C.1.1.99.18)中。在一些实施方案中,本发明中的目标纤维二糖脱氢酶是CDHl,其由cdhl基因编码。在一些实施方案中,本发明中的目标纤维二糖脱氢酶是⑶H2,其由cdh2基因编码。在一些实施方案中,⑶Hl和⑶H2 二者都是感兴趣的。如本文所用,术语“卩比喃糖氧化酶(pyranose oxidase”)”和“PO”是指催化D-葡萄糖和O2转化为2-脱氢-D-葡萄糖和H2O2的酶。吡喃糖氧化酶的实例落入酶分类(E.C.1.1.3.10)。这类酶的系统名称是吡喃糖:氧2-氧化还原酶。其他常用名称包括葡萄糖2-氧化酶和吡喃糖-2-氧化酶。该酶的底物包括D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、L-山梨糖、D-葡糖酸-1,5-内酯、纤维二糖和龙胆二糖。如本文所用,术语“葡萄糖寡糖氧化酶(glucooligosaccharide oxidase) ”和“G00X”是指催化在还原性末端上带有葡萄糖并且每个糖残基由α-或β_1,4糖苷键连接的寡糖氧化的酶。葡萄糖寡糖氧化酶的实例落入酶分类(E.C.1.1.99.Β3)。这类酶的系统名称是碳水化合物:接受体氧化还原酶。该酶的底物包括麦芽糖、乳糖、纤维二糖和达7个残基的麦芽糖衍生物。
如本文所用,术语“批喃糖脱氢酶”和“TOH”是指催化吡喃糖和接受体的反应以产生2-脱氢吡喃糖(或3-脱氢吡喃糖或2,3_ 二脱氢吡喃糖)和还原的接受体的酶。TOH还催化吡喃糖苷和接受体的反应以产生3-脱氢吡喃糖苷(或3,4-双脱氢吡喃糖苷)和还原的接受体。吡喃糖脱氢酶的实例落入酶分类(E.C.1.1.99.29)。这类酶的系统名称是吡喃糖:接受体氧化还原酶。其他常用名称包括吡喃糖2,3-脱氢酶。PDH利用FAD作为辅因子。处于吡喃糖形式的许多醛糖和酮糖、以及糖苷、葡糖-寡糖、蔗糖和乳糖可作为供体。1,4_苯醌或二茂铁鐵(ferricenium)离子(通过去除一个电子而被氧化的二茂铁)可用作接受体。不同于ECl.1.3.10 (吡喃糖氧化酶),吡喃糖脱氢酶不与O2相互作用和表现极其宽的底物耐受性和对不同糖类的(二)氧化的可变的区域选择性(C-3、C-2或C-3+C-2或C-3+C-4)。D-葡萄糖专门地或优先地在C-3被氧化(依赖于酶来源),但也可在C-2+C-3被氧化。吡喃糖脱氢酶还可作用于1- > 4- α -和1- > 4- β -葡糖-寡糖、非还原性葡糖-寡糖和L-阿拉伯糖,它们不是ECl.1.3.10的底物。糖类以其吡喃糖形式但不是以其呋喃糖形式被吡喃糖脱氢酶氧化。如本文所用,术语“葡萄糖脱氢酶”和“GDH”是指催化D-葡萄糖和接受体的反应以产生D-葡糖酸-1,5-内酯和还原的接受体的酶。葡萄糖脱氢酶的实例落入酶分类(Ε.C.1.1.99.10)。这类酶的系统名称是D-葡萄糖:接受体1-氧化还原酶。⑶H利用FAD作为辅因子。如本文所用,术语“纤维素酶”是指能够降解纤维素的任何酶。因此,该术语涵盖能够水解纤维素(β-1,4-葡聚糖或β-D-葡糖苷键)为较短的纤维素链、寡糖、纤维二糖和/或葡萄糖的酶。“纤维素酶”被分为三个亚类的酶:1,4-β-D-葡聚糖葡聚糖水解酶(1,4-β -D-glucan glucanohydrolase)( “内切葡聚糖酶”或“EG”);1,4_β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(“外切葡聚糖酶”、“纤维二糖水解酶”或“CBH”);和β-D-葡糖苷-葡糖苷水解酶(葡糖苷酶”、“纤维二糖酶”、“BG”或“BGL”)。这些酶共同作用以催化含纤维素的基质的水解。内切葡聚糖酶断裂内部键并破坏纤维素的晶体结构,暴露个别的纤维素多糖链(“葡聚糖”)。纤维二糖水解酶逐步缩短葡聚糖分子,主要释放纤维二糖单元(葡萄糖的水溶性β-1,4-连接的二聚体)以及葡萄糖、纤维三糖和纤维四糖。葡糖苷酶将纤维二糖分裂为葡萄糖单体。纤维素酶通常包括协同作用以破坏纤维素为可溶的二糖或寡糖诸如纤维二糖的不同类型的纤维素分解性酶(cellulolytic enzyme)(内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶)的混合物,所述二糖或寡糖随后被葡糖苷酶进一步水解为葡萄糖。纤维素酶由多种微生物产生。来自丝状真菌和一些细菌的纤维素酶(和半纤维素酶)被广泛地用于许多工业应用,包括加工天然纤维为糖类。
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如本文所用,“产纤维素酶的真菌细胞”是产生至少一种纤维素酶(即,“纤维素水解性酶”)的真菌细胞。在一些实施方案中,本文提供的产纤维素酶的真菌细胞表达和分泌纤维素水解性酶的混合物。如本文所用,术语“纤维素水解性酶”、“纤维素分解性酶”和类似术语是指在破坏纤维素为可溶的二糖或寡糖诸如纤维二糖的过程中起作用的酶,所述二糖或寡糖随后被葡糖苷酶进一步水解为葡萄糖。纤维素水解性酶的混合物在本文还称为“纤维素酶”、“含纤维素酶的混合物”和/或“纤维素酶混合物”。如本文所用,术语“内切葡聚糖酶”和“EG”是指一类催化纤维素的内部β -1,4糖苷键水解的纤维素酶(EC3.2.1.4)。术语“内切葡聚糖酶”在本文进一步定义为内切-1,4-(1,3 ;1,4)-β -D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.4),其催化纤维素、纤维素衍生物(诸如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉中的I,4-β-D-糖苷键,混合的β_1,3葡聚糖诸如谷类β-D-葡聚糖或木糖葡聚糖、和包含纤维素组分的其他植物材料中的β-1,4键的内切水解。内切葡聚糖酶活性可基于基质粘度的减少或由还原糖检验确定的还原性末端的增加来确定(参见例如,Zhang等人,Biotechnol.Adv.,24:452_481 [2006])。为了本发明的目的,内切葡聚糖酶活性使用羧甲基纤维素(CMC)水解来确定(参见例如,Ghose,Pur.App1.Chem.,59:257_268[1987])。如本文所用,“EG1 ”是指分类在EC3.2.1.4下的从编码糖基水解酶(GH)家族7催化结构域的核酸序列表达的碳水化合物活性酶,或其任何蛋白、多肽或催化活性片段。在一些实施方案中,EGl功能地连接于碳水化合物结合模块(CBM),诸如家族I纤维素结合结构域。如本文所用,术语“EG2”是指分类在EC3.2.1.4下的从编码糖基水解酶(GH)家族5催化结构域的核酸序列表达的碳水化合物活性酶,或其任何蛋白、多肽或催化活性片段。在一些实施方案中,EG2功能地连接于碳水化合物结合模块(CBM),诸如家族I纤维素结合结构域。如本文所用,术语“EG3”是指分类在EC3.2.1.4下的从编码糖基水解酶(GH)家族12催化结构域的核酸序列表达的碳水化合物活性酶,或其任何蛋白、多肽或催化活性片段。在一些实施方案中,EG3功能地连接于碳水化合物结合模块(CBM),诸如家族I纤维素结合结构域。如本文 所用,术语“EG4”是指从分类在EC3.2.1.4下的编码糖基水解酶(GH)家族61催化结构域的核酸序列表达的碳水化合物活性酶,或其任何蛋白、多肽或催化活性片段。在一些实施方案中,EG4功能地连接于碳水化合物结合模块(CBM),诸如家族I纤维素结合结构域。如本文所用,术语"EG5"是指分类在EC3.2.1.4下的从编码糖基水解酶(GH)家族45催化结构域的核酸序列表达的碳水化合物活性酶,或其任何蛋白、多肽或催化活性片段。在一些实施方案中,EG5功能地连接于碳水化合物结合模块(CBM),诸如家族I纤维素结合结构域。如本文所用,术语"EG6"是指分类在EC3.2.1.4下的从编码糖基水解酶(GH)家族6催化结构域的核酸序列表达的碳水化合物活性酶,或其任何蛋白、多肽或催化活性片段。在一些实施方案中,EG6功能地连接于碳水化合物结合模块(CBM),诸如家族I纤维素结合结构域。如本文所用,术语"纤维二糖水解酶"和"CBH"是指水解纤维素中的糖苷键的一类纤维素酶(EC3.2.1.91)。术语"纤维二糖水解酶"在本文进一步定义为1,4-β -D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91),其催化纤维素、纤维寡糖或包含任何β -1,4-连接的葡萄糖的聚合物中的1,4-β-D-葡糖苷键水解,从链的还原性或非还原性末端释放纤维二糖(参见例如,Teeri, Tr.Biotechnol., 15: 160-167[1997];和 Teeri 等人,Biochem.Soc.Trans.,26:173_178[1998])。在一些实施方案中,纤维二糖水解酶活性使用荧光二糖衍生物4-甲基伞形酮基β.-D-乳糖苷来确定(参见例如,van Tilbeurgh等人,FEBS Lett.,149:152-156[1982];和 van Tilbeurgh and Claeyssens, FEBS Lett.,187:283-288[1985])。如本文所用,术语"CBH1"和“I型纤维二糖水解酶”是指分类在EC3.2.1.91下的从编码糖基水解酶(GH)家族7催化结构域的核酸序列表达的碳水化合物活性酶,或其任何蛋白、多肽或催化活性片段。在一些实施方案中,CBHl功能地连接于碳水化合物结合模块(CBM),诸如家族I纤维素结合结构域。如本文所用,术语"CBH2"和“2型纤维二糖水解酶”是分类在EC3.2.1.91下的指从编码糖基水解酶(GH)家族6催化结构域的核酸序列表达的碳水化合物活性酶,或其任何蛋白、多肽或催化活性片段。2型纤维二糖水解酶还常常称为“Cel6家族”。在一些实施方案中,CBH2功能地连接于碳水化合物结合模块(CBM),诸如家族I纤维素结合结构域。如本文所用,术语"β-葡糖苷酶"、"纤维二糖酶"和"BGL"是指催化纤维二糖水解为葡萄糖的一类纤维素酶(EC3.2.1.21)。术语"β -葡糖苷酶"在本文进一步定义为β -D-葡糖苷酶葡糖水解酶(E.C.3.2.1.21),其催化末端非还原性β -D-葡萄糖残基的水解,伴随β -D-葡萄糖的释放。β -葡糖苷酶活性可使用任何适当的方法确定(参见例如,J.Basic Microbiol.,42:55-66 [2002])。I 单位的 β -葡糖苷酶活性定义为在 40°C,pH5,在含0.01%TWEEN 20的IOOmM柠檬酸钠中,从作为底物的ImM对硝基苯基-β -D-吡喃葡萄糖苷每分钟产生1.0pmol对硝基苯酹。如本文所用,术语"糖苷水解酶61"和"GH61"是指与一种或多种另外的纤维素酶联合使用时增强纤维素水解的一类纤维素酶。纤维素酶的GH61家族描述在例如,碳水化合物活性酶(CAZY)数据库中(参见例如,Harris等人,Biochem.,49(15):3305-16[2010])ο如本文所用的“半纤维素酶”是指能够催化将半纤维素水解成小的多糖诸如寡糖或单体糖的多肽。半纤维素包括木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯木聚糖、葡甘露聚糖和木葡聚糖。半纤维素酶包括例如,以下:内切木聚糖酶、β -木糖苷酶、a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶、a-D-葡糖醛酸酶、阿魏酰酯酶、香豆酰酯酶、α-半乳糖苷酶、半乳糖苷酶、甘露聚糖酶和甘露糖苷酶。如本文所用,术语"木聚糖降解活性"和"分解木聚糖的活性(xylanolyticactivity)"在本文定义为水解含木聚糖的材料的生物活性。测量分解木聚糖的活性的两种基本方法包括:(I)测量总的分解木聚糖的活性,和(2)测量单独的分解木聚糖的活性(内切木聚糖酶、木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α -葡糖醛酸酶、乙酰基木聚糖酯酶、阿魏酰酯酶和α -葡糖醛酸基酯酶)(参见例如,Biely和Puchard, J.Sc1.Food Agr.86:1636-1647 [2006] ;Spanikova 和 Biely,FEBS Lett.,580:4597_4601 [2006] JPHerrmann等人,Biochem.J.,321:375_381 [1997])。总的木聚糖降解 活性可通过确定从多种类型的木聚糖,包括燕麦、二粒小麦、山毛榉木和落叶松木聚糖形成的还原糖或通过光度确定从多种共价染色的木聚糖释放的染色的木聚糖片段来测量。常见的总的分解木聚糖的活性检验是基于从聚合4-0-甲基葡糖醛酸木聚糖产生还原糖(参见例如,Bailey等人,J.Biotechnol.,23:257_270 [1992])。在一些实施方案中,木聚糖降解活性通过在以下典型条件下测量山毛榉木木聚糖(SigmaChemical C0., Inc., St.Louis, M0., USA)被木聚糖-降解酶水解的增加来确定:lmL反应、5mg/mL基质(总固体)、5mg分解木聚糖的蛋白/g基质、50mM乙酸钠pH5、50°C、24小时、使用对轻基苯甲酰肼(PHBAH)检验的糖分析(参见例如,Lever, Anal.Biochem.,47:273-279[1972])。如本文所用,术语"木聚糖酶活性"是指催化木聚糖中的l,4-13_D-木糖苷键的内切水解的I,4-β-D-木聚糖-木聚糖水解酶活性(E.C.3.2.1.8)。在一些实施方案中,木聚糖酶活性使用山毛榉木木聚糖作为底物来确定。I单位的木聚糖酶活性定义为在50°C,PH5,在含0.01%TWEEN 20的50mM乙酸钠中,从作为底物的2g/升山毛榉木木聚糖在水解的最初阶段中每分钟产生1.0 μ mol还原糖(以葡萄糖当量测量;参见例如,Lever,Anal.Biochem.,47:273_279 [1972])。
如本文所用,术语"β_木糖苷酶活性"是指催化短的β (I —4)_低聚木糖的外切-水解以从非还原性末端除去逐个的D -木糖残基的β -D -木糖苷木聚糖水解酶(E.C.3.2.1.37)。在本发明的一些实施方案中,I单位的木糖苷酶活性定义为在40°C, ρΗ5,在含0.01%TWEEN 20的IOOmM柠檬酸钠中,从作为底物的ImM对硝基苯基-β -D-木糖苷每分钟产生1.0 μ mol对硝基苯酚。如本文所用,术语"乙酰基木聚糖酯酶活性"是指催化乙酰基从聚合的木聚糖、乙酰化的木糖、乙酰化的葡萄糖、α-萘基乙酸酯和对硝基苯基乙酸酯水解的羧酸酯酶活性(EC3.1.1.72)。在本发明的一些实施方案中,乙酰基木聚糖酯酶活性在包含0.01%TWEEN 20的50mM乙酸钠pH5.0中使用0.5mM对硝基苯基乙酸酯作为底物来确定。I单位的乙酰基木聚糖酯酶活性定义为在pH5,25°C,能够每分钟释放Ipmol对硝基苯酚阴离子的酶的量。如本文所用,术语"阿魏酰酯酶活性"是指催化4-羟基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基从酯化的糖,通常是“自然”基质中的阿拉伯糖,水解以产生阿魏酸(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸)的4-羟基-3-甲氧基肉桂酰-糖水解酶活性(EC3.1.1.73)。阿魏酰酯酶还被称为阿魏酸酯酶、羟基肉桂酰酯酶、FAE-1I1、肉桂酰酯水解酶、FAEA, cinnAE、FAE-1或FAE-1I。在本发明的一些实施方案中,阿魏酰酯酶活性在50mM乙酸钠pH5.0中使用0.5mM对硝基苯基阿魏酸酯作为底物来确定。I单位的阿魏酰酯酶活性等于在pH5,25°C,能够每分钟释放I μ mol对硝基苯酚阴离子的酶的量。如本文所用,术语"α-葡糖醛酸酶活性"是指催化a-D-葡糖醛酸苷水解为D-葡糖醛酸和醇的a -D-葡糖苷酸 葡糖醛酸水解酶活性(EC3.2.1.139)。I单位的α -葡糖醛酸酶活性等于在pH5,40°C,能够每分钟释放Ipmol葡糖醛酸或4_0_甲基葡糖醛酸的酶的量(参见例如,de Vries, J.Bacteriol.,180:243_249[1998])。如本文所用,术语"a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性"是指催化a-L-阿拉伯糖苷中的末端非还原性a-L-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解的a-L-阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃糖水角军酶(alpha-L-arabinofuranoside arabinofuranohydrolase)活性(EC3.2.1.55)。该酶活性作用于a-L-阿拉伯呋喃糖苷、包含(1,3)_键和/或(1,5)_键的a-L-阿拉伯聚糖(alpha-L-arabinan)、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖。a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶还被称为阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、a-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶、a -L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶和a -L-阿拉伯聚糖酶。为了本发明的目的,a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性如下确定:使用每mLlOOmM乙酸钠pH5的5mg中等粘度的小麦阿糖基木聚糖(Megazyme InternationalIreland, Ltd.,Bray, C0.Wicklow, Ireland)在 40°C 以总体积 200 μ L 持续 30 分钟,随后通过ΑΜ1ΝΕΧ .ΗΡΧ-87Η 柱色谱(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, Calif., USA)的阿拉伯糖分析。酶促木质素解聚可由通常协同起作用的木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、虫漆酶和纤维二糖脱氢酶(CDH)完成。木质素降解必需的这些胞外酶常常被称为“木质素改性酶(lignin-modifying enzyme) ”或“LME”。这些酶中的三种包括两种糖基化的含血红素的过氧化物酶:木质素过氧化物酶(LIP) ;Mn依赖性过氧化物酶(MNP);和含铜的酹氧化酶:虫漆酶(LCC)。尽管木质素生物降解的反应式的细节迄今没有完全理解,不受理论束缚,暗示这些酶利用自由基用于解聚反应。如本文所用,术语“虫漆酶”是指在许多植物、真菌和微生物中发现的含铜的氧化酶。虫漆酶对酚类和类似分子具有酶活性并且进行一个电子的氧化。虫漆酶可以是聚合的并且酶活性形式可以是二聚体或三聚体。如本文所用,术语“Mn依赖性过氧化物酶”是指需要Mn的过氧化物酶。Mn依赖性过氧化物酶(MnP)的酶活性依赖于Mn2+。不受理论束缚,已表明这种酶的主要作用是将Mn2+氧化成 Mn3+(参见例如,Glenn 等,Arch.Biochem.Biophys., 251:688-696[1986])。随后,酌.类底物被产生的Mn3+氧化。如本文所用,术语“木质素过氧化物酶”是指体外催化聚合木质素的稀溶液的氧化解聚作用的胞外血红素。一些LiP的底物,最值得注意的是3,4_ 二甲氧基苄醇(藜芦醇,VA),是显示充当氧化还原介质(mediator)的活性氧化还原化合物。VA是与LiP同时被黄孢原毛平革菌(P.chrysosporium)的木质素分解培养物产生的次生代谢产物,且不受理论限制,已提出VA作为木质素的体内LiP 催化氧化中的生理学氧化还原介质起作用(参见例如,Harvey,等,FEBS Lett.195:242-246 [1986])。如本文所用,术语“葡糖淀粉酶”(EC3.2.1.3)是指催化从寡糖和多糖分子的非还原性末端释放D-葡萄糖的酶。葡糖淀粉酶通常也被认为是一种类型的淀粉酶,称为淀粉_匍糖苷酶。如本文所用,术语“淀粉酶”(EC3.2.1.1)是指通过以内切或外切作用方式水解α-1,4和/或α-1,6葡糖苷键来降解淀粉和相关化合物的淀粉裂解酶。淀粉酶包括α -淀粉酶(EC3.2.1.1) ; β -淀粉酶(3.2.1.2)、淀粉-淀粉酶(EC3.2.1.3)、α -葡糖苷酶(EC3.2.1.20)、支链淀粉酶(EC3.2.1.41)和异淀粉酶(EC3.2.1.68)。在一些实施方案中,淀粉酶是α -淀粉酶。如本文所用,术语“果胶酶”是指催化果胶水解成较小的单元,诸如寡糖或单体糖的酶。在一些实施方案中,酶混合物包括任何果胶酶,例如内切-聚半乳糖醛酸酶、果胶甲基酯酶、内切-半乳聚糖酶、果胶乙酰基酯酶、内切-果胶裂解酶、果胶酸裂解酶、α鼠李糖苷酶、外切-半乳糖醛酸酶、外切-聚半乳糖醛酸裂解酶、鼠李聚糖半乳糖醒酸(rhamnogaIacturonan)水解酶、鼠李聚糖半乳糖醒酸裂解酶、鼠李聚糖半乳糖醛酸乙酰基酯酶、鼠李聚糖半乳糖醛酸半乳糖醛酸水解酶和/或木半乳糖醛酸酶(xy1galacturonase)。如本文所用,术语“内切-聚半乳糖醛酸酶”(EC3.2.1.15)是指催化果胶酸和其他半乳糖醒酸聚糖(galacturonan)中的1,4_ a -D-半乳糖苷醒酸键(I,
4-a -D-galactosiduronic linkage)的随机水解的酶。这种酶还可以被称为“聚半乳糖醒酸酶果胶解聚酶”、“果胶酶(pectinase) ”、“内切聚半乳糖醛酸酶”、“果胶酶(pectolase) ”、“果胶水解酶”、“果胶聚半乳糖醛酸酶”、“聚-1,4-半乳糖醛酸苷聚糖水解酶”、“内切半乳糖醛酸酶”、“内切-D-半乳糖醛酸酶”或“聚(I,4-a-D-半乳糖醛酸苷)聚糖水解酶”。如本文所用,术语“果胶甲基酯酶”(EC3.1.1.11)是指催化如下反应的酶:果胶+η Η20 = η甲醇+果胶酸。该酶还可以称为“果胶酯酶”、“果胶脱甲氧基酶(pectin demethoxylase) ”、“果胶甲氧基酶”、“果胶甲基酯酶”、“果胶酶”、“果胶酯酶(pectinoesterase) ” 或“果胶甲酯水解酶(pectin pectylhydrolase) ”。
如本文所用,术语“内切-半乳聚糖酶”(EC3.2.1.89)是指催化阿拉伯半乳聚糖中的1,4-β-D-半乳糖苷键的内切水解(endohydrolysis)的酶。该酶还可以称为“阿拉伯半乳聚糖内切_1,4-β -半乳糖苷酶”、“内切-1,4-β -半乳聚糖酶”、“半乳聚糖酶”、“阿拉伯半乳聚糖酶”或“阿拉伯半乳聚糖4-β -D-半乳聚糖水解酶”。如本文所用,术语“果胶乙酰基酯酶”是指催化果胶GaIUA残基的羟基处的乙酰基的脱乙酰基作用的酶。如本文所用,术语“内切-果胶裂解酶”(EC4.2.2.10)是指催化(I — 4)-a-D-半乳糖醛酸聚糖甲基酯的消除性切割以产生在其非还原性末端具有4-脱氧-6-0-甲基-a -D-半乳-4-烯醒酸糖基(4-deoxy-6-0_methyl-α -D-galact-4-enuronosyI)基团的寡糖的酶。该酶还可以称为“果胶裂解酶”、“果胶反式-消除酶(pectintranS-eliminaSe)”、“内切-果胶裂解酶”、“聚甲基半乳糖醛酸反式消除酶”、“果胶甲基反式消除酶”、“果胶裂解酶(peCtolyaSe)”、“PL”、“PNL”、“PMGL” 或“(I — 4)-6-0-甲基-a -D-半乳糖醛酸聚糖裂解酶”。如本文所用,术语“果胶酸裂解酶”(EC4.2.2.2)是指催化(I —4)-a_D-半乳糖醛酸聚糖的消除性切割以产生在非还原性末端具有4-脱氧-a -D-半乳-4-烯醛酸糖基(4-deoxy-α-D-galact-4-enuronosyl)基团的寡糖的酶。该酶还可以称为“聚半乳糖醒酸反式消除酶(polygalacturonic transeliminase) ”、“果胶酸反式消除酶”、“聚半乳糖醒酸裂解酶”、“内切果胶甲基反式消除酶”、“果胶酸反式消除酶”、“内切半乳糖醛酸反式消除酶”、“果胶酸裂解酶”、“果胶裂解酶”、“ a -1,4-D-内切聚半乳糖醛酸裂解酶”、“PGA裂解酶”、“PPase-N”、“内切-α_1,4-聚半乳糖醛酸裂解酶”、“聚半乳糖醛酸裂解酶”、“果胶反式消除酶”、“聚半乳糖醛酸反式消除酶”或“(I — 4)-a -D-半乳糖醛酸聚糖裂解酶”。如本文所用,术语“ α -鼠李糖苷酶” (EC3.2.1.40)是指催化α -L-鼠李糖苷或可选的鼠李聚糖半乳糖醛酸中的末端非还原性a-L-鼠李糖残基的水解的酶。这种酶还可以称为“ a -L-鼠李糖苷酶T”、“ a -L-鼠李糖苷酶N”或“ a -L-鼠李糖苷鼠李糖水解酶”。如本文所用,术语“外切-半乳糖醛酸酶”(EC3.2.1.82)是指从非还原性末端水解果胶酸,释放二半乳糖醒酸(digalacturonate)的酶。该酶还可以称为“外切-聚_ α _半乳糖醛酸苷酶”、“外切聚半乳糖苷酶”或“外切聚半乳糖醛酸苷酶”。如本文所用,术语“外切-半乳糖醛酸聚糖1,4-α半乳糖醛酸苷酶”(EC3.2.1.67)是指催化以下类型反应的酶:(I,4- a -D-半乳糖醛酸苷酶)n+H20 = (1,4-a-D-半乳糖醛酸苷)n-1+D-半乳糖醛酸。该酶还可以称为“聚[1- >4) a -D-半乳糖醛酸苷]半乳糖醛酸水解酶”、“外切聚半乳糖醛酸酶”、“聚(半乳糖醛酸)水解酶”、“外切-D-半乳糖醛酸酶”、“外切-D-半乳糖醛酸酶”、“外切聚-D-半乳糖醛酸酶”或“聚(I,4- a -D-半乳糖醛酸苷)半乳糖醛酸水解酶”。如本文所用,术语“外切聚半乳糖醛酸裂解酶”(EC4.2.2.9)是指催化4_(4_脱氧-a -D-半乳-4-烯醛酸糖基)-D-半乳糖醛酸从果胶酸(即去酯化的果胶)的还原性末端的消除性切割的酶。这种酶还可称为“果胶酸二糖裂解酶”、“果胶酸外切裂解酶”、“外切果胶酸反式消除酶”、“外切果胶酸裂解酶”、“外切聚半乳糖醛酸-反式-消除酶”、“PATE”、“外切-PATE”、“外切-PGL”或“(I — 4)-a-D-半乳糖醛酸聚糖还原性末端二糖裂解酶”。如本文所用,术语“鼠李聚糖半乳 糖醛酸酶”是指在由二糖[(I,2- a -L-鼠李糖酰-(I,4) - α -半乳糖基醛酸]组成的严格交替的鼠李聚糖半乳糖醛酸结构中以内切方式水解半乳糖基醛酸与吡喃鼠李糖基之间的键的酶。如本文所用,术语“鼠李聚糖半乳糖醛酸裂解酶”是指在鼠李聚糖半乳糖醛酸中借助β -消除以内切方式切割a -L-Rhap-(I — 4) - a -D-GalpA键的酶。如本文所用,术语“鼠李聚糖半乳糖醛酸乙酰基酯酶”是指催化鼠李聚糖半乳糖醛酸中鼠李糖和半乳糖醛酸残基的交替主链的脱乙酰基作用的酶。如本文所用,术语“鼠李聚糖半乳糖醛酸半乳糖醛酸水解酶”是指以外切方式水解来自严格交替的鼠李聚糖半乳糖醛酸结构的非还原性末端的半乳糖醛酸的酶。这种酶还可以称为“木半乳糖醒酸聚糖(xylogalacturonan)水解酶”。如本文所用,术语“内切-阿拉伯聚糖酶”(EC3.2.1.99)是指催化1,5_阿拉伯聚糖中的1,5-α-阿拉伯呋喃糖 苷键的内切水解的酶。该酶还可以称为“内切-阿拉伯酶”、“阿拉伯聚糖内切l,5-a-L-阿拉伯糖苷酶”、“内切-l,5-a-L-阿拉伯聚糖酶(endo-1,
5-a -L-arabinanase) ”、“内切- a -1,5_L-阿拉伯聚糖酶(endo-α -1, 5-L-arabinase) ”、“内切-阿拉伯聚糖酶”或“ I,5- a -L-阿拉伯聚糖I,5- a -L-阿拉伯糖水解酶”。如本文所用,“蛋白酶”包括水解肽键的酶(肽酶)以及水解肽与其他部分诸如糖之间的键的酶(糖肽酶)。许多蛋白酶被表征在EC3.4之下并且适于在本发明中使用。一些特定类型的蛋白酶包括但不限于,半胱氨酸蛋白酶包括胃蛋白酶、木瓜蛋白酶,和丝氨酸蛋白酶包括糜蛋白酶、羧肽酶,和金属内切肽酶。如本文所用,"脂酶"包括水解脂质、脂肪酸、和酰基甘油酯,包括磷酸甘油酯、月旨蛋白、二酰基甘油等的酶。在植物中,脂质被用作限制水分损失和病原体感染的结构组分。这些脂质包括从脂肪酸衍生的蜡以及角质和木栓质。如本文所用,术语“分离的”和“纯化的”用于指从与之天然缔合的至少一种另外的组分中被除去的分子(例如,分离的核酸、多肽[包括但不限于酶]等等)或其他组分。预期该术语涵盖用于除去分子与之天然缔合的至少一种组分中的任何适当的方法。在一些实施方案中,该术语还涵盖从其他细胞和/或培养基组分分离的细胞。预期任何适当的分离方法可用于本发明。如本文所用,术语提及酶混合物使用的“纯化工艺”涵盖物理地除去酶混合物的不期望组分的任何工艺。因此,在一些实施方案中,本文提供的纯化工艺包括从酶混合物物理地除去一种或多种葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶或反之亦然的纯化方法。预期本领域已知的任何适当的纯化工艺可用于本发明。事实上,不预期本发明限于任何特定的纯化工艺。如本文所用,术语“无细胞的酶混合物”包括已经从任何细胞,包括分泌该酶的细胞分离的酶。无细胞的酶混合物可通过本领域已知的多种方法的任一种制备,诸如过滤或离心方法。在一些实施方案中,酶混合物可以是,例如,部分无细胞的、基本上无细胞的或完全无细胞的。如本文所用,"多核苷酸"是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物、和其互补物(complement)。术语"蛋白"和"多肽"在本文可互换地使用,是指氨基酸残基的聚合物。此外,术语"氨基酸"、“多肽”和“肽”涵盖天然存在的和合成的氨基酸、以及氨基酸类似物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些、以及后来被修饰的那些氨基酸(例如,羟基脯氨酸、Y-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸)。如本文所用,术语“氨基酸类似物”是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物(即,α-碳原子结合于氢原子、羧基、氨基和R基,包括但不限于高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜和甲硫氨酸甲基锍)。在一些实施方案中,这些类似物具有修饰的R基(例如,正亮氨酸)和/或修饰的肽骨架,但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸在本文由其公知的三字母符号或IUPAC-1UB生物化学命名委员会建议的单字母符号来提到。类似地,核苷酸可由其通常被接受的单字母代码来提到。氨基酸或核苷酸碱基的“位置”由根据其相对于N末端(或5’末端)的位置顺序地辨别每个氨基酸(或核苷酸碱基)的编号表示。由于在确定最佳比对时必须被考虑的缺失、插入、截短、融合等,通过简单地从N末端计数而确定的测试序列中的氨基酸残基编号不一定与其在参考序列中的对应位置的编号相同。例如,在测试序列具有相对于比对的参考序列的缺失的情况下,变体中在缺失位点将不存在对应于参考序列中的位置的氨基酸。在比对的测试序列中存在插入的情况下,该插入将不会对应于参考序列中的编号的氨基酸位置。在截短或融合的情况下,在参考序列或比对序列中可存在不对应于对应序列中的任何氨基酸的氨基酸串(stretches of amino acids)。如本 文所用,当在给定的氨基酸或多核苷酸序列编号的上下文中使用时,术语“参考…编号”或“对应于”指当给定的氨基酸或多核苷酸序列与指定的参考序列相比时,参考序列的残基编号。如本文所用,术语"参考酶"是指本发明的另一种酶(例如,“试验”酶)与其比较以确定被评价的其他酶中的改进的特征的存在的酶。在一些实施方案中,参考酶是野生型酶。在一些实施方案中,参考酶是指本发明的试验酶与其比较以确定被评价的试验酶中的改进的特征的存在的酶,所述改进的性质包括但不限于改进的热活性、改进的热稳定性、和/或改进的稳定性。在一些实施方案中,参考酶是野生型酶。如本文所用,术语"生物活性片段"是指具有氨基末端和/或羧基末端缺失和/或内部的缺失的多肽,但其中其余的氨基酸序列与与其比较的序列中相应位置相同,且该多肽保留全长多肽的基本上所有活性。如本文所用,术语“重组”是指宿主细胞中非自然存在的多核苷酸或多肽。在一些实施方案中,重组分子包含以非自然存在的方式连接在一起的两个或多个自然存在的序列。在一些实施方案中,由于故意的人工干预,“重组细胞”表达在细胞的天然(即,非重组)形式中未发现相同形式的基因和/或表达本来异常地过表达、低表达和/或完全不表达的天然基因。重组细胞包含至少一种重组的多核苷酸或多肽。核酸构建体、核酸(例如多核苷酸)、多肽或宿主细胞当是非自然存在的、人工的或工程改造的,在本文称为“重组的”。“重组(Recombination) ”、“重组(recombining) ”和产生“重组的”核酸通常涵盖至少两种核酸片段的组装。本发明还提供重组的核酸构建体,包含在严格杂交条件下与编码具有SEQ ID NO:6和/或8的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的互补物杂交的至少一种CDH多核苷酸序列。当核酸缔合,通常在溶液中缔合时,它们“杂交”。核酸杂交是由于各种被很好表征的物理-化学力,诸如氢键键合、溶剂排斥(solvent exclusion)、碱基堆积等。如本文所用,在核酸杂交实验诸如Southern杂交或Northern杂交的背景下术语“严格的杂交洗涤条件”是序列依赖性的,并且在不同环境参数下是不同的。对核酸杂交的广泛指导见 Ti jssen, 1993, " Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes,"第 I 部分,第 2 章(Elsevier,New York),其通过引用并入本文。对于至少100个核苷酸长度的多核苷酸而言,对低严格条件到极高严格条件限定如下:在标准的DNA印迹程序后,在42°C在5XSSPE,0.3% SDS,200 μ g/ml剪切和变性的鲑鱼精DNA,以及对于低严格性的25%甲酰胺,对于中等和中-高严格性的35%甲酰胺,或对于高严格性和极高严格性的50%甲酰胺中预杂交和杂交。对于至少100个核苷酸长度的多核苷酸,使用2XSSC,0.2% SDS50°C (低严格性)、在55°C (中等严格性)、在60°C (中-高严格性)、在65°C (高严格性)或在70°C (极高严格性)将载体材料最终洗涤三次,每次15分钟。中等严格条件涵盖本领域已知和在多种标准教科书中描述的那些,并包括洗涤溶液和杂交条件(例如,温度、离子强度和% SDS)的使用。中等严格条件的一个例子包括:在37 °C在包含以下的溶液中培养过夜:20%甲酰胺、5x SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5x Denhardt溶液、10%硫酸葡聚糖和20mg/mL变性剪切的鲑精DNA,随后在约37-50°C在Ix SSC中洗涤滤器。本领域技术人员知晓如何如所需地调整温度、离子强度等以适应诸如探针长度和类似因素的因素。如在本文的一些实施方案中使用的,严格条件或高严格度条件使用:(I)低离子强度和高温用于洗涤,例如在50°C 0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1 %十二烷基硫酸钠;(2)杂交期间,变性剂诸如甲酰胺,例如,50% (v/v)甲酰胺与0.1%牛血清白蛋白/0.1% Ficoll/0.1 %聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液、在pH6.5、750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠、在42 °C ;或(3) 50%甲酰胺、5x SSC (0.75M NaCl、0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(ρΗ6.8)、0.1%焦磷酸钠、5x Denhardt 溶液、超声处理的鲑精 DNA(50 μ g/mL)、0.1% SDS和10%硫酸葡聚糖、在42°C,在42°C在0.2x SSC (氯化钠/柠檬酸钠)中和在55°C在50%甲酰胺中洗涤,随后在55°C以含EDTA的0.1x SSC组成的高严格度洗涤。如本文所 用,“相似性”是指相同或其保守氨基酸取代,如以下定义的。因此,为了相似性的目的,改变为相同或保守性取代不视为包括改变。氨基酸的缺失或非保守氨基酸取代在本文视为包括改变。相似性百分比的计算以对同一性百分比进行的相同方式进行。保守氨基酸取代可以是诸如表A中所示的保守性取代的取代。显示的取代是基于氨基酸的物理化学性质,如此,是独立于生物体的。在一些实施方案中,保守氨基酸取代是示例性取代标题下所列的取代。
权利要求
1.一种真菌细胞,所述真菌细胞已被遗传修饰以减少由所述真菌细胞产生的内源葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶活性的量,其中所述真菌细胞是子囊菌(Ascomycete)、属于亚门盘菌亚门(Pezizomycotina),和/或其中所述真菌细胞是来自科毛壳菌科(Chaetomiaceae)。
2.如权利要求1所述的真菌细胞,其中所述真菌细胞是毁丝霉属(Myceliophthora)、梭孢壳属(Thielavia)、侧孢霉属(Sporotrichum)、链孢霉属(Neurospora)、粪壳菌属(Sordaria)、柄孢壳菌属(Podospora)、大角间座壳属(Magnaporthe)、镰孢菌属(Fusarium)、赤霉菌属(Gibberella)、葡萄孢盘菌属(Botryotinia)、腐质霉属(Humicola)、新萨托菌属(Neosartorya)、核腔菌属(Pyrenophora)、暗球腔菌属(Phaeosphaeria)、核盘菌属(Sclerotinia)、毛壳属(Chaetomium)、丛赤壳菌属(Nectria)、轮枝抱属(Verticillium)、棒囊壳属(Corynascus)、支顶抱属(Acremonium)、木节霉属(Ctenomyces)、金孢属(Chrysosporium)、节格孢属(Scytalidium)、篮状菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)或曲霉属(Aspergillus)的物种。
3.如权利要求1和/或2所述的真菌细胞,其中所述真菌细胞是毁丝霉属、梭孢壳属、侧孢霉属、金孢属、棒囊壳属、支顶孢属、毛壳属、栉霉属、节格孢属、篮状菌属或嗜热子囊菌属的物种。
4.如权利要求1和/或2所述的真菌细胞,其中所述真菌细胞是嗜热侧孢霉(Sporotrichum thermophile)或嗜纤维素侧抱霉(Sporotrichum cellulophiIum)。
5.如权利要求1和/或2所述的真菌细胞,其中所述真菌细胞是Thielaviaheterothallica 或太瑞斯梭抱壳霉(Thielavia terrestris)。
6.如权利要求1和/或2所述的真菌细胞,其中所述真菌细胞是CorynascusheterothalIicus。
7.如权利要求1和/或 2所述的真菌细胞,其中所述真菌细胞是嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)。
8.如权利要求1-7任一项所述的真菌细胞,其中所述真菌细胞已被遗传修饰以减少由所述真菌细胞产生的内源葡萄糖氧化性酶和/或纤维二糖脱氢酶的量。
9.如权利要求1-8任一项所述的真菌细胞,其中所述真菌细胞已被遗传修饰以减少由所述真菌细胞产生的内源葡萄糖氧化酶和/或纤维二糖脱氢酶的量和增加至少一种糖水解性酶的产生。
10.如权利要求1-9任一项所述的真菌细胞,其中所述真菌细胞已被遗传修饰以减少由所述真菌细胞产生的内源葡萄糖氧化酶和/或纤维二糖脱氢酶的量和增加至少一种糖水解性酶的产生,且其中所述真菌细胞是担子菌(Basidiomycete)、属于纲伞菌纲(Agaricomycetes)。
11.如权利要求10所述的真菌细胞,其中所述担子菌是侧耳属(Pleurotus)、隔孢伏革菌属(Peniophora)、栓菌属(Trametes)、阿太菌属(Athelia)、小核菌属(Sclerotium)、鸡揪菌属(Termitomyces)、小火焰菌属(Flammulina)、粉孢革菌属(Coniphora)、灵芝属(Ganoderma)、密孔菌属(Pycnoporus)、拟腊菌属(Ceriporiopsis)、原毛平革菌属(Phanerochaete)、褐裙菌属(Gloeophyllum)、猴头菌属(Hericium)、异担子菌属(Heterobasidion)、胶化孔菌属(Gelatoporia)、环柄燕属(Lepiota)或IE齿菌属(Irpex)的物种。
12.如权利要求1-11任一项所述的真菌细胞,其中所述真菌细胞已被遗传修饰以减少由所述真菌细胞分泌的内源葡萄糖氧化酶和/或纤维二糖脱氢酶的量。
13.如权利要求12所述的真菌细胞,其中所述真菌细胞已被遗传修饰以破坏所述葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶的分泌信号肽。
14.如权利要求1-13任一项所述的真菌细胞,其中所述真菌细胞已被遗传修饰以减少由所述真菌细胞表达的内源葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶的量。
15.如权利要求14所述的真菌细胞,其中所述真菌细胞已被遗传修饰以破坏编码所述内源葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶的转录子中的翻译起始序列。
16.如权利要求14-15任一项所述的真菌细胞,其中所述真菌细胞已被遗传修饰以在编码所述内源葡萄糖和/或纤维二糖 氧化性酶的转录子引入移码突变。
17.如权利要求1-16任一项所述的真菌细胞,其中所述真菌细胞已被遗传修饰以减少编码所述内源葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶的基因的转录水平。
18.如权利要求17所述的真菌细胞,其中所述真菌细胞已被遗传修饰以破坏编码所述内源葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶的基因的启动子。
19.如权利要求1-18任一项所述的真菌细胞,其中所述真菌细胞已被遗传修饰以至少部分地缺失编码所述内源葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶的至少一种基因。
20.如权利要求1-19任一项所述的真菌细胞,其中所述真菌细胞已被遗传修饰以减少所述内源葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶的催化效力。
21.如权利要求20所述的真菌细胞,其中所述真菌细胞已被遗传修饰以突变所述葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶的活性位点中的一个或多个残基。
22.如权利要求20-21任一项所述的真菌细胞,其中所述真菌细胞已被遗传修饰以突变所述葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶的血红素结合结构域中的一个或多个残基。
23.如权利要求1-22任一项所述的真菌细胞,其中所述葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶选自纤维二糖脱氢酶(EC1.1.99.18)、葡萄糖氧化酶(EC1.1.3.4)、吡喃糖氧化酶(EC1.1.3.10)、葡萄糖寡糖氧化酶(EC1.1.99.B3)、吡喃糖脱氢酶(EC1.1.99.29)和葡萄糖脱氢酶(EC1.1.99.10)。
24.如权利要求1-23任一项所述的真菌细胞,其中所述葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶包括与 SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14和/或16至少约80%、约81%、约82%、约83%、约 84%、约 85%、约 86%、约 87%、约 88%、约 89%、约 90%、约 91%、约 92%、约 93%、约94 %、约95 %、约96 %、约97 %、约98 %或约99 %相同的氨基酸序列。
25.如权利要求1-24任一项所述的真菌细胞,其中所述葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶是纤维二糖脱氢酶(EC1.1.99.18)。
26.如权利要求1-25任一项所述的真菌细胞,其中所述真菌细胞已被遗传修饰以减少由所述真菌细胞在所述遗传修饰之前产生的两种或多种内源葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶的葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶活性的量。
27.如权利要求1所述的真菌细胞,其中所述两种或多种所述葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶的第一种包括与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14和/或16至少约80%、约81%,约 82%、约 83%、约 84%、约 85%、约 86%、约 87%、约 88%、约 89%、约 90%、约 91%、约.92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%相同的氨基酸序列,且所述两种或多种所述葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶的第二种包括与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14 和 / 或 16 至少约 80%、约 81 %、约 82%、约 83%、约 84%、约 85%、约 86%、约 87%、约 88%、约 89%、约 90%、约 91%、约 92%、约 93%、约 94%、约 95%、约 96%、约97 %、约98 %或约99 %相同的氨基酸序列。
28.一种酶混合物,所述酶混合物包含两种或多种纤维素水解性酶,其中所述两种或多种纤维素水解性酶的至少一种由权利要求1-27任一项所述的真菌细胞表达。
29.一种酶混合物,所述酶混合物包含两种或多种纤维素水解性酶,其中所述两种或多种纤维素水解性酶的至少一种由已被遗传修饰以减少由所述真菌细胞分泌的内源葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶活性的量的真菌细胞产生,且其中所述真菌细胞是子囊菌、属于亚门盘菌亚门。
30.如权利要求29所述的酶混合物,其中所述真菌细胞是毁丝霉属、梭孢壳属、侧孢霉属、棒囊壳属、支顶孢属、毛壳属、栉霉属、节格孢属、篮状菌属或嗜热子囊菌属的物种。
31.一种酶混合物,所述酶混合物包含两种或多种纤维素水解性酶,其中所述两种或多种纤维素水解性酶的至少一种由已被遗传修饰以减少由所述真菌细胞分泌的内源葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶活性的量和增加至少一种糖水解性酶的产生的真菌细胞产生,且其中所述真菌细胞是担子菌、属于纲伞菌纲。
32.如权利要求28-31任一项所述的酶混合物,其中所述酶混合物是无细胞混合物。
33.如权利要求28-32任一项所述的酶混合物,其中所述酶混合物的基质包括预处理的木质纤维素。
34.如权利要求33所述的酶混合物,其中所述预处理的木质纤维素包括以选自酸预处理、铵预处理、蒸汽爆破和/或有机溶剂提取的处理方法处理的木质纤维素。
35.一种酶混合物,所述酶混合物包含两种或多种纤维素水解性酶,其中所述真菌纤维素酶混合物相对于亲本(或参考)酶混合物被修饰以至少部分地缺乏葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶活性。
36.一种酶混合物,所述酶混合物包含两种或多种纤维素水解性酶,所述纤维素水解性酶的至少一种是对真菌细胞内源的,其中所述真菌细胞是担子菌、属于纲伞菌纲或子囊菌、属于亚门盘菌亚门,且其中所述酶混合物的特征在于,当所述酶混合物与纤维二糖和/或葡萄糖接触时,10小时后不多于约10%、约15%或约20%的所述纤维二糖和/或葡萄糖被氧化。
37.如权利要求36所述的酶混合物,其中所述真菌细胞已被遗传修饰以减少由所述真菌细胞分泌的葡萄糖和/或纤维二糖氧化酶活性的量。
38.如权利要求28-37任一项所述的酶混合物,其中所述酶混合物是无细胞混合物。
39.如权利要求28-38任一项所述的酶混合物,其中所述酶混合物包括至少一种β-葡糖苷酶。
40.如权利要求28-39任一项所述的酶混合物,其中所述酶混合物包含选自内切葡聚糖酶(EG)、β -葡糖苷酶(BGL)、I型纤维二糖水解酶(CBHl)、2型纤维二糖水解酶(CBH2)、和/或糖苷水解 酶61 (GH61)、和/或所述纤维素酶的变体的至少一种纤维素酶。
41.如权利要求28-40任一项所述的酶混合物,还包含至少一种纤维二糖脱氢酶。
42.如权利要求41所述的酶混合物,其中所述纤维二糖脱氢酶是⑶Hl和/或⑶H2。
43.如权利要求28-42任一项所述的酶混合物,还包含至少一种纤维素酶和/或至少一种另外的酶。
44.如权利要求28-43任一项所述的酶混合物,其中所述酶混合物已经受纯化工艺以从所述酶混合物选择性地去除一种或多种葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶。
45.如权利要求44所述的酶混合物,其中所述纯化工艺包括选择性沉淀以分离所述葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶与所述酶混合物中存在的其他酶。
46.如权利要求28-45任一项所述的酶混合物,其中所述酶混合物包含一种或多种葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶的至少一种抑制剂。
47.一种产生纤维二糖和/或葡萄糖的方法,包括将纤维素基质与包含两种或多种纤维素水解性酶的酶混合物接触来产生葡萄糖和/或纤维二糖,其中所述纤维素水解性酶的至少一种是对为子囊菌、属于亚门盘菌亚门的真菌细胞内源的,且其中所述酶混合物的特征在于,当所述酶混合物与纤维二糖和/或葡萄糖接触时,10小时后不多于约10%、约15%或约20%的所述纤维二糖和/或葡萄糖被氧化。
48.如权利要求47所述的方法,其中所述子囊菌是毁丝霉属、梭孢壳属、侧孢霉属、链孢霉属、粪壳菌属、柄孢壳菌属、大角间座壳属、镰孢菌属、赤霉菌属、葡萄孢盘菌属、腐质霉属、新萨托菌属、核腔菌属、暗球腔菌属、核盘菌属、毛壳属、丛赤壳菌属、轮枝孢属或曲霉属的物种。
49.一种产生纤维二糖和/或葡萄糖的方法,包括将纤维素基质与包含两种或多种纤维素水解性酶的酶混合物接触来产生葡萄糖和/或纤维二糖,其中所述纤维素水解性酶的至少一种是对为担子菌、属于纲伞菌纲的真菌细胞内源的,且其中所述酶混合物的特征在于,当所述酶混合物与纤维二糖和/或葡萄糖接触时,10小时后不多于约10%、约15%或约20%的所述纤维二糖和/或葡萄糖被氧化。
50.如权利要求49所述的方法,其中所述担子菌是侧耳属、隔孢伏革菌属、栓菌属、阿太菌属、小核菌属、鸡揪菌属、小火焰菌属、粉孢革菌属、灵芝属、密孔菌属、拟蜡菌属、原毛平革菌属、褐褶菌属、猴头菌属、异担子菌属、胶化孔菌属、环柄菇属或耙齿菌属的物种。
51.一种产生纤维二糖和/或葡萄糖的方法,包括将纤维素基质与包含两种或多种纤维素水解性酶的酶混合物接触来产生葡萄糖和/或纤维二糖,其中所述纤维素水解性酶的至少一种是对为子囊菌、属于亚门盘菌亚门的真菌细胞内源的,且其中,在由所述酶混合物水解的纤维素之中,至少约80%、约85%或约90%以纤维二糖和/或葡萄糖的形式存在。
52.如权利要求51所述的方法,其中所述子囊菌是毁丝霉属、梭孢壳属、侧孢霉属、链孢霉属、粪壳菌属、柄孢壳菌属、大角间座壳属、镰孢菌属、赤霉菌属、葡萄孢盘菌属、腐质霉属、新萨托菌属、核腔菌属、暗球腔菌属、核盘菌属、毛壳属、丛赤壳菌属、轮枝孢属或曲霉属的物种。
53.如权利要求51和/或52所述的方法,其中所述子囊菌是嗜热毁丝霉、Thielaviaheterothallica或嗜热侧孢霉。
54.如权利要求51-53任一项所述的方法,其中所述真菌细胞是嗜热毁丝霉。
55.一种产生纤维二糖和/或葡萄糖的方法,包括将纤维素基质与包含两种或多种纤维素水解性酶的酶混合物接触来产生葡萄糖和/或纤维二糖,其中所述纤维素水解性酶的至少一种是对为担子菌、属于纲伞菌纲的真菌细胞内源的,且其中,在由所述酶混合物水解的纤维素之中,至少约80 %、约85 %或约90 %以纤维二糖和/或葡萄糖的形式存在。
56.如权利要求55所述的方法,其中所述担子菌是侧耳属、隔孢伏革菌属、栓菌属、阿太菌属、小核菌属、鸡揪菌属、小火焰菌属、粉孢革菌属、灵芝属、密孔菌属、拟蜡菌属、原毛平革菌属、褐褶菌属、猴头菌属、异担子菌属、胶化孔菌属、环柄菇属或耙齿菌属的物种。
57.一种从纤维素产生纤维二糖和/或葡萄糖的方法,包括用酶混合物处理纤维素基质来产生葡萄糖,其中所述酶混合物相对于来自参考(或亲本)真菌细胞的分泌的酶混合物被修饰以至少部分地缺乏葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶活性。
58.如权利要求47-57任一项所述的方法,其中所述酶混合物是无细胞混合物。
59.如权利要求47-58任一项所述的方法,其中所述纤维素基质包括预处理的木质纤维素。
60.如权利要求59所述的方法,其中所述预处理的木质纤维素包括以选自酸预处理、铵预处理、蒸汽爆破和/或有机溶剂提取的处理方法处理的木质纤维素。
61.如权利要求47-60任一项所述的方法,还包括发酵所述纤维二糖和/或葡萄糖为至少一种终产物。
62.如权利要求61所述的方法,其中所述终产物是至少一种燃料醇和/或至少一种前体工业化学品。
63.如权利要求62所述的方法,其中所述燃料醇是乙醇或丁醇。
64.如权利要求61-63任一项所述的方法,其中从纤维素产生纤维二糖和/或葡萄糖的工艺与所述发酵以同步糖化发酵(SSF)方法进行。
65.如权利要求47-64任 一项所述的方法,其中所述酶混合物由已被遗传修饰以减少由所述真菌细胞分泌的一种或多种内源葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶的量的真菌细胞产生。
66.如权利要求47-65任一项所述的方法,其中所述酶混合物已经受纯化工艺以从所述酶混合物选择性地去除至少一种葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶。
67.如权利要求66所述的方法,其中所述纯化工艺包括选择性沉淀以分离所述葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶与所述酶混合物中存在的其他酶。
68.如权利要求47-67任一项所述的方法,其中所述酶混合物包含所述葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶的至少一种抑制剂。
69.如权利要求68所述的方法,其中所述抑制剂包括选自叠氮化钠、氰化钾、金属阴离子、和其组合的广谱氧化酶抑制剂。
70.如权利要求68-69任一项所述的方法,其中所述抑制剂包括选自纤维二糖咪唑、龙胆二糖、乳糖酸-1,5-内酯、纤维二糖酸-1,5-内酯、三-N-乙酰基壳三糖、甲基-β -D纤维二糖苷酶、2,2-二吡啶、细胞色素C、和其组合的纤维二糖脱氢酶(EC1.1.99.18)的特异性抑制剂。
71.如权利要求47-70任一项所述的方法,其中所述方法是分批工艺。
72.如权利要求47-70任一项所述的方法,其中所述工艺是连续工艺。
73.如权利要求47-70任一项所述的方法,其中所述方法是分批补料工艺。
74.如权利要求47-70任一项所述的方法,其中所述方法包括以任何顺序进行的分批工艺、连续工艺、和/或分批补料工艺的任何组合。
75.如权利要求47-74任一项所述的方法,其中所述方法在至少10,OOO升的反应体积中进行。
76.如权利要求47-75任一项所述的方法,其中所述方法在至少100,000升的反应体积中进行。
77.如权利要求47-76任一项所述的方法,其中所述酶混合物包含至少一种β-葡糖苷酶。
78.如权利要求47-77任一项所述的方法,其中所述酶混合物包含选自内切葡聚糖酶(EG)、β -葡糖苷酶(BGL)、I型纤维二糖水解酶(CBHl)、2型纤维二糖水解酶(CBH2)、和/或糖苷水解酶61 (GH61)、和/或所述纤维素酶的变体的至少一种纤维素酶。
79.—种产生葡萄糖的方法,包括将纤维素与包含两种或多种纤维素水解性酶的酶混合物接触,其中所述两种或多种纤维素水解性酶的至少一种由权利要求1-27任一项所述的真菌细胞产生。
80.一种产生葡萄糖的方法,包括将纤维素与包含两种或多种纤维素水解性酶的酶混合物接触,其中所述两种或多种纤维素水解性酶的至少一种由已被遗传修饰以减少由所述真菌细胞分泌的内源葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶活性的量的真菌细胞产生,其中所述真菌细胞是子囊菌、属于亚门盘菌亚门。
81.如权利要求80所述的方法,其中所述真菌细胞是毁丝霉属、梭孢壳属、侧孢霉属、棒囊壳属、支顶孢属、毛壳属、栉霉属、节格孢属、篮状菌属或嗜热子囊菌属的物种。
82.—种产生葡萄 糖的方法,包括将纤维素与包含两种或多种纤维素水解性酶的酶混合物接触,其中所述两种或多种纤维素水解性酶的至少一种由已被遗传修饰以减少由所述真菌细胞分泌的内源葡萄糖和/或纤维二糖氧化性酶活性的量和增加至少一种糖水解性酶的产生的真菌细胞产生,其中所述真菌细胞是担子菌、属于纲伞菌纲。
83.—种产生葡萄糖的方法,包括将纤维素与权利要求28-46任一项所述的酶混合物接触。
84.如权利要求47-83任一项所述的方法,其中所述纤维素包括预处理的木质纤维素。
85.如权利要求84所述的方法,其中所述预处理的木质纤维素包括以选自酸预处理、铵预处理、蒸汽爆破和/或有机溶剂提取的处理方法处理的木质纤维素。
86.如权利要求47-85任一项所述的方法,其中所述酶混合物是无细胞混合物。
87.如权利要求47-86任一项所述的方法,还包括发酵所述葡萄糖为终产物。
88.如权利要求87所述的方法,其中所述终产物是燃料醇或前体工业化学品。
89.如权利要求88所述的方法,其中所述燃料醇是乙醇或丁醇。
90.如权利要求1-27任一项所述的真菌细胞、如权利要求28-46任一项所述的酶混合物、或如权利要求47-89任一项所述的方法,还包含对所述真菌细胞异源的纤维素降解酶。
91.一种发酵培养基,包含如权利要求1-27和/或90任一项所述的真菌细胞。
92.一种发酵培养基,包含如权利要求28-46和/或90任一项所述的酶混合物。
93.一种发酵培养基,包含如权利要求90和/或91所述的真菌细胞和/或如权利要求90和/或92所述的酶混合物。
94.一种产生至少一种纤维素酶的方法,包括在使得产生所述至少一种纤维素酶的条件下权利要求1-27任一项中提供的至少一种真菌细胞。
95.如权利要求94所述的方法,其中所述真菌细胞是重组的真菌细胞。
96.一种组合物,包 含权利要求94和/或95所述的至少一种纤维素酶。
全文摘要
本申请提供产生表现纤维素材料向葡萄糖的增强的水解的酶混合物的遗传修饰的真菌生物体、由所述遗传修饰的真菌生物体产生的酶混合物、和使用此类酶混合物从纤维素产生葡萄糖的方法。
文档编号C12P7/10GK103189516SQ201180052762
公开日2013年7月3日 申请日期2011年11月1日 优先权日2010年11月2日
发明者伊什·库马尔·达万, 蒂普纳斯·贝德亚洛伊, 安德鲁·肖, 欧列·坦查克, 克里斯多佛·希尔, 成松·刘, 阿马拉·乔克施, 布莱恩·R·斯科特 申请人:科德克希思公司

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