改进的真菌菌株的制作方法

xiaoxiao2020-6-24  7

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专利名称:改进的真菌菌株的制作方法
技术领域
本发明提供了改进的真菌菌株。在一些实施方案中,所述改进的真菌菌株可用于将纤维素材料(cellulosic material)水解成葡萄糖。
背景技术
纤维素是由β_1,4糖苷键连接的简单糖(simple sugar)葡萄糖的聚合物。许多微生物产生水解连接的葡聚糖的酶。这些酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase)和β-葡糖苷酶。内切葡聚糖酶在随机位置消化纤维素聚合物,将其打开以被纤维二糖水解酶攻击。纤维二糖水解酶从纤维素聚合物的末端连续地释放纤维二糖分子。纤维二糖是水溶性的β-1,4-连接的葡萄糖二聚体。葡糖苷酶水解纤维二糖为葡萄糖。转化木质纤维素原料为乙醇具有以下优点:大量原料的容易获得性、避免燃烧或陆地装填材料的需要、和降低的总的温室气体产生。木头、农业残余物、草本作物、和市政固体废料已经被考虑作为乙醇产生的原料。这些材料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。在纤维素被转化为葡萄 糖后,葡萄糖容易被酵母发酵为乙醇。发明概述本发明提供了改进的真菌菌株。在一些实施方案中,所述改进的真菌菌株可用于将纤维素材料水解成葡萄糖。本发明提供了真菌细胞,所述真菌细胞已被遗传修饰以减少由所述细胞分泌的内源性纤维二糖脱氢酶活性的量,其中所述真菌细胞来自科毛壳菌科(Chaetomiaceae),其中所述细胞包含纤维二糖脱氢酶I (cdhl)基因的缺失。在一些实施方案中,所述真菌细胞是毁丝霉属(Myceliophthora)的物种。在一些另外的实施方案中,所述真菌细胞是嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)。在一些实施方案中,所述真菌细胞已被遗传修饰以破坏纤维二糖脱氢酶的分泌信号肽。在一些另外的实施方案中,所述真菌细胞已被遗传修饰以减少由所述细胞表达的内源性纤维二糖脱氢酶的量。在一些另外的实施方案中,所述真菌细胞已被遗传修饰以破坏编码内源性纤维二糖脱氢酶的转录子中的翻译起始序列。又在一些另外的实施方案中,所述真菌细胞已被遗传修饰以将移码突变引入到编码内源性纤维二糖脱氢酶的转录子中。在一些另外的实施方案中,所述真菌细胞已被遗传修饰以减少编码内源性纤维二糖脱氢酶的基因的转录水平。在一些另外的实施方案中,所述真菌细胞已被遗传修饰以破坏编码内源性纤维二糖脱氢酶的基因的启动子。在一些实施方案中,所述真菌细胞已被遗传修饰以至少部分地缺失编码内源性纤维二糖脱氢酶的基因。在一些另外的实施方案中,所述真菌细胞已被遗传修饰以减少内源性纤维二糖脱氢酶的催化效力。在一些另外的实施方案中,所述真菌细胞中的纤维二糖脱氢酶的活性位点中的一个或多个残基已被遗传修饰。又在一些另外的实施方案中,所述真菌细胞中的纤维二糖脱氢酶的血红素结合结构域中的一个或多个残基已被遗传修饰。在一些实施方案中,本发明提供了包含纤维二糖脱氢酶的真菌细胞。在一些实施方案中,纤维二糖脱氢酶包含与SEQ ID NO:2至少约85%、约88%、约90%、约93%、约95 %、约97 %、约98 %或约99 %相同的氨基酸序列。在一些另外的实施方案中,真菌细胞已被修饰成使得所述细胞与该修饰之前或不含该修饰的真菌细胞相比分泌减少的量的内源性纤维二糖脱氢酶I (cdhl)。本发明还提供了包含两种或更多种纤维素水解性酶(cellulose hydrolyzingenzyme)的酶混合物,其中所述两种或更多种纤维素水解性酶中的至少一种由所述真菌细胞表达。在一些实施方案中,所述酶混合物是无细胞混合物。在一些另外的实施方案中,预处理的木质纤维素构成该酶混合物的至少一种基质。在一些另外的实施方案中,预处理的木质纤维素包含通过选自酸预处理、氨预处理、蒸汽爆破(steam explosion)和/或有机溶剂萃取的至少一种处理方法处理的木质纤维素。本发明还提供了用于产生葡萄糖的方法,包括使至少一种纤维素基质与包含两种或更多种纤维素水解性酶的酶混合物接触,其中所述两种或更多种纤维素水解性酶中的至少一种由本文提供的真菌细胞表达。本发明还提供了用于产生葡萄糖的方法,包括使至少一种纤维素基质与本文提供的至少一种酶混合物接触。在一些另外的实施方案中,所述酶混合物是无细胞混合物。在一些另外的实施方案中,所述纤维素基质是预处理的木质纤维素。又在一些另外的实施方案中,预处理的木质纤维素包含通过选自酸预处理、氨预处理、蒸汽爆破和/或有机溶剂萃取的至少一种处理方法处理的木质纤维素。在一些另外的实施方案中,本发明的方法还包括将葡萄糖发酵成终产物。在一些另外的实施方案中,终产物是燃料醇或前体工业化学品。在一些另外的实施方案中,所述燃料醇是乙醇或丁醇。又在一些另外的实施方案中,本发明的方法、酶混合物和/或真菌细胞提供对于该真菌细胞为同源或异源的至少一种纤维素降解酶。本发明还提供了包含如本文提供的至少一种真菌细胞和/或至少一种酶混合物的发酵培养基。附图简述

图1提供了嗜热毁丝霉(M.thermophila)⑶Hl的核苷酸序列和氨基酸序列(分别是 SEQ ID NO:1和 2)。图2提供了示出了以从100g/kg葡聚糖(预处理的玉米秸杆)产生的葡萄糖测量的CF-200和CF-400的相对糖化效力的图。在pH5、55°C下,反应以110 μ L体积中24.6%固体,以及128mM Na0Ac、3%酶进行。使用G0P0D测定测量葡萄糖。误差棒表示±lSD,n =4。发明描述
本发明提供了改进的真菌菌株。在一些实施方案中,所述改进的真菌菌株可用于将纤维素材料水解成葡萄糖。如本文指出的,本发明提供了用于将纤维素转化成葡萄糖的改进的真菌菌株。特别地,本文提供的改进的真菌菌株被遗传修饰以减少由所述细胞分泌的内源性纤维二糖脱氢酶活性的量。在本发明之前,通常认为纤维二糖脱氢酶通过降低纤维二糖的浓度增强了纤维素水解的速度,纤维二糖是一些纤维素酶组分的强力抑制剂(参见例如 Mansfield 等人,Appl.Environ.Microbiol.,63:3804-3809 [1997];和 Igarishi 等人,Eur.J.Biochem., 253:101-106 [1998])。此外,纤维二糖脱氢酶已被报告为在纤维素降解期间通过阻止水解产物抑制而在促进协同增强方面起关键作用(参见,例如Hai等人,J.Appl.Glycosc1.,49:9_17 [2002])。通常还认为纤维二糖脱氢酶在对木质纤维素脱木质(delignifying)方面是有用的,从而增强纤维素降解。近来,已经报道纤维二糖脱氢酶可增强来自糖基水解酶家族61的纤维素裂解增强蛋白(cellulolytic enhancing protein)的活性(参见例如,W02010/080532A1)并可用于为了氧化还原平衡目的的反应中。与本领域中的常规理解不同地,本发明提供了对产生纤维素酶的真菌细胞中的编码纤维二糖脱氢酶的基因的遗传修饰(例如,缺失)。该修饰导致来自由遗传修饰的细胞分泌的酶混合物的可发酵糖的产量改进。因此,由产生纤维素酶的生物体分泌的纤维二糖脱氢酶的减少提供了可在包含纤维素的基质的酶水解期间改进可发酵糖的产量的纤维素酶混合物。另外,cdh基因的缺失为在真菌细胞基因组中引入其他序列(例如,编码目的蛋白的异源序列)提供了额外的空间。因此,本文提供了真菌细胞,该真菌细胞已被遗传修饰以减少由所述细胞分泌的内源性纤维二糖脱氢酶活性的量,其中所述真菌细胞来自科毛壳菌科,且其中所述真菌细胞能够分泌包含纤维素的酶混合物。在一些实施方案中,所述真菌细胞能够分泌包含两种或更多种纤维素酶的酶混合物。在一些实施方案中,所述真菌细胞是下列属的毛壳菌科的成员:无毛毛壳属(Achaetomium)、无孔梭孢壳属(Aporothielavia)、毛_壳属(Chaetomidium)、毛壳属(Chaetomium)、Corylomyces、棒囊壳属(Corynascus)、法氏壳属(Farrowia)、梭孢壳属(Thielavia)、柄孢壳属(Zopfiella)或毁丝霉属的成员。在一些实施方案中,本文提供的遗传修饰的真菌细胞是选自下列属的毛壳菌科的成员:毁丝霉属、梭孢壳属、棒囊壳属或毛壳属。真菌分类学不断经历整理是公认的。因此,预期本发明的所有方面包括已被重新分类的属和物种,包括但不限于诸如嗜热毁丝霉的生物体,其已被给予多种其他名称(例如,嗜热侧抱霉(Sporotrichum thermophile)、嗜热侧抱霉(Sporotrichumthermophilum)、异梭抱壳菌(Thi`elavia heterothallica)、异棒囊壳菌(Corynascusheterothallica)、嗜热金抱子菌(Chrysosporium thermophilum)和印度毁丝霉(Myceliophthora indica))。实际上,预期本发明包括所有有性型、无性型及其同物异名、基本异名或分类学等价物。 在一些实施方案中,真菌细胞已被遗传修饰以减少由所述细胞分泌的内源性纤维二糖脱氢酶活性的量。在一些实施方案中,所述真菌细胞是毁丝霉属、梭孢壳属、侧孢霉属(Sporotrichum)、棒囊壳属、支顶孢属(Acremonium)、毛壳属、柿霉属(Ctenomyces)、柱霉属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)或嗜热子囊菌属(Thermoascus)的物种。在一些实施方案中,所述真菌细胞是嗜纤维素侧孢霉(Sporotrichum cellulophilum)、太瑞斯梭孢壳菌(Thielavia terrestris)、异棒囊壳菌、异梭孢壳菌、球毛壳菌(Chaetomiumglobosum)、柄篮状菌(Talaromyces stipitatus)或嗜热毁丝霉。在一些实施方案中,所述真菌细胞是分离的真菌细胞。 在一些实施方案中,所述真菌细胞已被遗传修饰以减少由所述细胞分泌的内源性纤维二糖脱氢酶的量。在一些实施方案中,所述真菌细胞已被遗传修饰以破坏纤维二糖脱氢酶的分泌信号肽。在一些实施方案中,所述真菌细胞已被遗传修饰以减少由所述细胞表达的内源性纤维二糖脱氢酶的量。例如,在一些实施方案中,所述真菌细胞被遗传修饰以破坏翻译起始序列,而在一些其他实施方案中,所述真菌细胞被遗传修饰以将移码突变引入到编码内源性纤维二糖脱氢酶的转录子中。在一些其他实施方案中,所述真菌细胞已被遗传修饰以减少编码内源性纤维二糖脱氢酶的基因的转录水平。例如,在一些实施方案中,所述真菌细胞被遗传修饰以破坏编码内源性纤维二糖脱氢酶的基因的启动子。例如,在一些实施方案中,通过使用终止密码子、终止子去除、转座子等遗传修饰所述真菌细胞以破坏编码内源性纤维二糖脱氢酶的基因。在一些另外的实施方案中,所述真菌细胞已被遗传修饰为至少部分地缺失编码内源性纤维二糖脱氢酶的基因。在一些其他实施方案中,所述真菌细胞已被遗传修饰以减少内源性纤维二糖脱氢酶的催化效力。在一些实施方案中,所述真菌细胞已被遗传修饰为使得纤维二糖脱氢酶的活性位点中的一个或多个残基已被突变。在一些实施方案中,所述真菌细胞的纤维二糖脱氢酶的血红素结合结构域中的一个或多个残基已被遗传修饰。实际上,预期用于修饰真菌细胞以减少由所述细胞表达和/或分泌的纤维二糖脱氢酶的量的任何合适的手段将可用在本发明中。在一些实施方案中,纤维二糖脱氢酶被包括在ECl.1.99.18内。在一些实施方案中,所述纤维二糖脱氢酶包含与SEQ ID NO:2至少约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约 90%、约 91 % 、约 92%、约 93%、约 94%、约 95%、约 96%、约 97%、约 98%、约 99%或约100%相同的氨基酸序列。在一些实施方案中,真菌细胞还包含编码对于该真菌细胞为异源的至少一种纤维素降解酶的至少一种基因。例如,在一些实施方案中,所述真菌细胞过表达编码纤维素降解酶例如葡糖苷酶的同源或异源基因。在一些实施方案中,所述真菌细胞过表达葡糖苷酶并已被遗传修饰以减少由所述细胞分泌的内源性纤维二糖脱氢酶活性的量。本发明还提供了包含两种或更多种纤维素水解性酶的酶混合物,其中所述两种或更多种纤维素水解性酶的至少一种由如本文提供的真菌细胞表达。例如,在一些实施方案中,所述真菌细胞是已被遗传修饰以减少由所述细胞分泌的内源性纤维二糖脱氢酶活性的量的细胞,其中所述真菌细胞是下列属的成员:毁丝霉属、梭孢壳属、侧孢霉属、棒囊壳属、支顶孢属、毛壳属、栉霉属、柱霉属、踝节菌属或嗜热子囊菌属。在一些实施方案中,所述酶混合物是无细胞混合物。在一些另外的实施方案中,酶混合物的基质包含预处理的木质纤维素。在一些实施方案中,预处理的木质纤维素包含通过酸预处理、氨预处理、蒸汽爆破和/或有机溶剂萃取处理的木质纤维素。在一些实施方案中,酶混合物还包含对于所述真菌细胞为异源的至少一种纤维素降解酶。在一些实施方案中,所述两种或更多种纤维素水解性酶中的至少一种由分离的真菌细胞表达。本发明还提供了用于产生葡萄糖的方法,该方法包括使纤维素与至少两种酶的混合物接触。例如,在一些实施方案中,该方法包括使纤维素与包含两种或更多种纤维素水解性酶的酶混合物接触,其中所述两种或更多种纤维素水解性酶的至少一种由如本文所述的真菌细胞表达。在一些实施方案中,该方法包括使纤维素与包含两种或更多种纤维素水解性酶的酶混合物接触,其中所述两种或更多种纤维素水解性酶的至少一种由已被遗传修饰以减少由所述细胞分泌的内源性纤维二糖脱氢酶活性的量的细胞表达,其中所述真菌细胞是毁丝霉属、梭孢壳属、侧孢霉属、棒囊壳属、支顶孢属、毛壳属、栉霉属、柱霉属、踝节菌属或嗜热子囊菌属。在一些实施方案中,这些方法导致来自水解的纤维素的葡萄糖和/或纤维二糖的产量增加和来自水解的纤维素的纤维二糖向氧化的糖产物的氧化减少,所述氧化的糖产物例如葡糖酸内酯、葡糖酸盐(gluconate)、葡糖酸(gluconic acid)、纤维二糖内酯和/或纤维二糖酸。在一些实施方案中,酶混合物是无细胞混合物。在一些另外的实施方案中,纤维素基质包含预处理的木质纤维素。在一些另外的实施方案中,预处理的木质纤维素包含通过例如酸预处理、氨预处理、蒸汽爆破和/或有机溶剂萃取的至少一种处理方法处理的木质纤维素。在一些实施方案中,这些方法还包括将葡萄糖发酵成终产物例如燃料醇或前体工业化学品。在一些实施方案中,燃料醇是乙醇或丁醇。在一些实施方案中,这些方法包括使纤维素与还包含对所述真菌细胞为异源的纤维素降解酶的酶混合物接触。本文还提供了包含任何一种上述实施方案的真菌细胞和/或包含来源于任何一种上述实施方案的真菌细胞的酶混合物的发酵培养基。定义除非另外指明,否则本发明的实践包括分子生物学、蛋白质工程和微生物学中通常使用的本领域技术范围内的常规技术。这些技术是众所周知的并被描述在本领域技术人员所熟知的许多教科书和参考文献作品中。本文在上文和下文提及的所有专利、专利申请、文章和出版物在此明确地被通过弓I用并入本文。除非本文另外定义,否则本文使用的所有技术和科学术语具有如本发明所涉及的领域的普通技术人员通常 理解的相同含义。许多技术词典是本领域技术人员已知的。虽然类似或等价于本文描述的方法和材料的任何合适的方法和材料可用在本发明的实践中,但是本文描述了一些优选的方法和材料。应理解,本发明不限于所描述的特定方法、操作说明和试剂,因为,这些方法、操作说明和试剂可根据本领域技术人员使用它们的情形而变化。因此,通过整体地参考本申请更充分地描述了下文紧接着定义的术语。另外,除非上下文明确地另外指明,否则如本文所用的单数“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数的指代对象。数值范围包括定义该范围的数字。因此,本文公开的每个数值范围意在包括落在该较宽的数值范围内的每个较窄的数值范围,如同这些较窄的数值范围都被明确地写在本文中一样。还预期本文公开的每个最大值(或最小值)的数字限值包括每个更低(或更高的)的数字限值,如同这些更低(或更高的)的数字限值都被明确地写在本文中一样。此外,本文提供的标题不是对可通过整体地参考本申请而获得的本发明的各个方面或实施方案的限制。因此,下文紧接着定义的术语通过整体地参考本申请更充分地定义。但是,为了有助于理解本发明,下文定义了一些术语。除非另外指明,否则分别地,核酸以Y至:V方向从左向右书写;氨基酸序列是以氨基至羧基方向从左向右书写。如本文所用的,术语“包含”及其同义词以其包括性含义(即,等价于术语“包括(including) ”及其相应的同义词)使用。如本文所用,“底物(substrate) ”是指通过酶的作用被转化或打算被转化为另一种化合物的物质或化合物。该术语不仅包括单种化合物还包括化合物的组合,诸如包含至少一种底物的溶液、混合物和其他材料。
如本文所用,“转化”是指底物被酶促转化为对应的产物。“转化百分比”是指在指定条件下在一段时间内被转化为产物的底物的百分比。因此,例如,纤维二糖脱氢酶(“CDH”或“cdh” )多肽的“酶活性”或“活性”可以表示为底物到产物的“转化百分比”。如本文所用,“分泌活性”是指细胞外环境(extracellular environment)中存在的由真菌细胞产生的纤维二糖氧化性酶(cellobiose oxidizing enzyme)的酶活性。细胞外环境可以是,例如,细胞外环境(extracellular milieu)诸如培养基。分泌活性受分泌的纤维二糖氧化性酶的总量影响,还受分泌的纤维二糖氧化性酶的催化效力影响。如本文所用,“催化效力的减少”是指如由本文提供的或本领域另外已知的标准技术测量的,纤维二糖氧化性酶相对于未修饰的纤维二糖氧化性酶的活性的减少。 如本文所用,术语“酶混合物”是指至少两种酶的组合。在一些实施方案中,至少两种酶在组合物中存在。在一些另外的实施方案中,酶混合物在细胞(例如,真菌细胞)中存在。在一些实施方案中,酶混合物中存在的酶的每一种或一些由不同真菌细胞和/或不同真菌培养物产生。在一些进一步的实施方案中,酶混合物中存在的所有酶由同一细胞产生。在一些实施方案中,酶混合物包含纤维素酶,而在一些另外的实施方案中,酶混合物包含纤维素酶以外的酶。在一些实施方案中,酶混合物包含至少一种纤维素酶和至少一种纤维素酶以外的酶。在一些实施方案中,酶混合物包含包括但不限于以下的酶:内切木聚糖酶(EC3.2.1.8)、β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)、a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC3.2.1.55)、α-葡糖醛酸酶(EC3.2.1.139)、乙酰基木聚糖酯酶(EC3.1.1.72)、阿魏酰酯酶(EC3.1.1.73)、香豆酰酯酶(EC3.1.1.73)、α -半乳糖苷酶(EC3.2.1.22), β -半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)、β -甘露聚糖酶(EC3.2.1.78)、β -甘露糖苷酶(EC3.2.1.25)、内切-聚半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.15)、果胶甲基酯酶(EC3.1.1.11)、内切-半乳聚糖酶(EC3.2.1.89)、果胶乙酰基酯酶(EC3.1.1.6)、内切-果胶裂解酶(EC4.2.2.10)、果胶酸裂解酶(EC4.2.2.2)、α鼠李糖苷酶(EC3.2.1.40)、外切-半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.82)、夕卜切-半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.67)、外切聚半乳糖醛酸裂解酶(EC4.2.2.9)、鼠李聚糖半乳糖醒酸内切裂解酶(rhamnogalacturonan endolyase)EC(4.2.2.B3)、鼠李聚糖半乳糖醒酸乙酰酯酶(EC3.2.1.Bll)、鼠李聚糖半乳糖醛酸半乳糖醛酸水解酶(EC3.2.1.Bll)、内切-阿拉伯聚糖酶(EC3.2.1.99)、虫漆酶(EC1.10.3.2)、锰依赖性过氧化物酶(EC1.10.3.2)、淀粉酶(EC3.2.1.1)、葡糖淀粉酶(EC3.2.1.3)、脂酶、木质素过氧化物酶(EC1.11.1.14)、和/或蛋白酶。在一些另外的实施方案中,本发明还提供包括至少一种扩展蛋白(expansin)和/或扩展蛋白样蛋白,诸如纤维膨胀因子(swollenin)(参见例如,Salheimo等,Eur.J.Biochem.,269 =4202-4211 [2002])和/或纤维膨胀因子样蛋白的酶混合物。扩展蛋白与植物细胞生长过程中细胞壁结构的松弛有关。已提出扩展蛋白破坏纤维素与其他细胞壁多糖之间的氢键而没有水解活性。以这种方法,认为它们允许纤维素纤维的滑动和细胞壁的扩展。纤维膨胀因子是一种扩展蛋白样蛋白,包括N端碳水化合物结合模块家族I结构域(CBD)和C端扩展蛋白样结构域。在一些实施方案中,扩展蛋白样蛋白和/或纤维膨胀因子样蛋白包括此类结构域中的一个或两个和/或破坏细胞壁的结构(例如破坏纤维素结构),任选地不产生可检测的量的还原糖。在一些另外的实施方案中,酶混合物包括纤维素整合蛋白(cellulose integrating protein)、支架蛋白和/或支架蛋白样蛋白的至少一种多肽产物(例如分别来自热纤梭菌(Clostridium thermocellum)或解纤维梭菌(Clostridiumcellulolyticum)的CipA或CipC)。在一些另外的实施方案中,酶混合物包括至少一种纤维素诱导蛋白和/或纤维素调节蛋白(cellulose induced protein and/or modulatingprotein)(例如,由来自里氏木霉的cipl或cip2基因和/或类似基因所编码的蛋白;参见例如,Foreman 等,J.Biol.Chem.,278:31988-31997 [2003])。在一些另外的实施方案中,酶混合物包括至少一种GH61和上述多肽类别中的每一种的至少一个成员、一个多肽类别中的若干成员、或这些多肽类别的任何组合,以提供适于多种用途的酶混合物。至少一种、两种、三种、四种、五种或多于五种酶和/或多肽的任何组合可用在本文提供的多种酶混合物中。事实上,不预期本发明的酶混合物限于任何特定的酶、多肽、组合,因为任何适合的酶混合物可用于本发明。如本文所用,术语“糖”是指任何碳水化合物,包括单糖(例如,葡萄糖、核糖、果糖、半乳糖等)、二糖(例如,蔗糖、乳糖、麦芽糖、纤维二糖、海藻糖、蜜二糖等)、寡糖(例如,棉子糖、水苏糖、直链淀粉等)、和多糖(例如,淀粉、糖原、纤维素、壳多糖、木聚糖、阿糖基木聚糖、甘露聚糖、墨角藻聚糖、半乳甘露聚糖、愈创葡聚糖、昆布多糖、金藻昆布多糖、支链淀粉、葡聚糖、糊精、麦芽糖糊精、菊粉、低聚果糖、聚葡萄糖等)。该术语涵盖简单的碳水化合物、以及复合的碳水化合物。事实上,不预期本发明限于任何特定的糖,因为多种糖和糖的形式可用于本发明。如本文所用,术语“糖水解性酶(saccharide hydrolyzing enzyme) ”是水解至少一种糖的任何酶。如本文所用的,术语“纤维二糖氧化性酶”指氧化纤维二糖的酶。在一些实施方案中,纤维二糖氧化性酶包括纤维二糖脱氢酶(EC1.1.99.18)。如本文所用的,术语“纤维二糖脱氢酶”、“⑶H”和“cdh”指纤维二糖:接受体(acceptor) 1-氧化还原酶,该 酶在接受体的存在下催化纤维二糖转化为纤维二糖_1,5-内酯和还原的接受体。纤维二糖脱氢酶的实例落在酶分类(E.C.1.1.99.18)中。通常2,6- 二氯靛酚可充当接受体,铁尤其是Fe (SCN) 3、分子氧、泛醌或细胞色素C和其他多酚类(polyphenolic)例如木质素也可充当接受体。该酶的底物包括纤维二糖、纤维-低聚糖、乳糖和D-葡糖基-1,4-β-D-甘露糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露二糖、硫代纤维二糖、半乳糖基-甘露糖、木二糖、木糖。虽然电子供体包括葡萄糖或甘露糖位于还原末端的β_1,4-二己糖类,但是α_1,4-己糖苷、己糖、戊糖和β_1,4戊糖聚合物(pentomer)可充当这些酶中至少一些酶的底物(参见,例如 Henriksson 等人,Biochim.Biophys.Acta-Prot.Struct.Mol.Enzymol.,1383:48-54 [1998];和 Schou 等人,Biochem.J.,330:565-571 [1998])。在一些实施方案中,本发明中的目的纤维二糖脱氢酶是由cdhl基因编码的CDHl。如本文所用的,术语“氧化”、“氧化(的)”及本文所用的类似术语指一种或多种纤维二糖氧化产物的酶促形成。当提及氧化的纤维二糖的百分比使用时,这些百分比反映相对于基质的初始量的重量百分比(w/w)。例如,当酶混合物与纤维二糖接触时,氧化的纤维二糖的百分比反映相对于溶液中存在的纤维二糖的初始量的重量百分比(w/w)。当酶混合物与纤维素基质接触时,氧化的纤维二糖的百分比反映基于能够从总的水解的纤维素产生的葡萄糖的最大量(即,Gmax)的重量百分比(w/w) (wt% )。如本文所用的,“纤维素”指通过β_1,4糖苷键连接的单糖葡萄糖的聚合物。
如本文所用的,“纤维二糖”指水溶性的β-1,4-连接的葡萄糖二聚体。如本文所用的,术语“纤维糊精”指不同长度的葡萄糖聚合物(即,包含至少两个葡萄糖单体)。每个葡萄糖单体通过β_1,4糖苷键连接。纤维糊精通过其聚合度(DP)分类,聚合度表示该纤维糊精包含的葡萄糖单体的数目。最常见的纤维糊精是:纤维二糖(DP=2);纤维三糖(DP = 3);纤维四糖(DP = 4);纤维五糖(DP = 5);以及纤维六糖(DP =6)。在一些实施方案中,纤维糊精具有2-6的DP(即,纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖和/或纤维六糖)。在一些实施方案中,纤维糊精具有大于6的DP。可测量纤维糊精分子的聚合度(例如通过质谱,包括但不限于基质辅助激光解吸/电离(MALDI)质谱和电喷雾电离离子阱(ES1-1T)质谱)。测量纤维糊精分子的聚合度的方法是本领域已知的(参见,例如,Melander 等人,Biomacromol.,7:1410-1421 [2006])。如本文所用,术语“纤维素酶”是指能够降解纤维素的任何酶。因此,该术语涵盖能够水解纤维素(β-1,4-葡聚糖或β-D-葡糖苷键)为较短的纤维素链、寡糖、纤维二糖和/或葡萄糖的酶。“纤维素酶”被分为三个亚类的酶:1,4-β-D-葡聚糖葡聚糖水解酶(1,4-β -D-glucan glucanohydrolase)( “内切葡聚糖酶”或“EG”);1,4_β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(“外切葡聚糖酶”、“纤维二 糖水解酶”或“CBH”);和β-D-葡糖苷-葡糖苷水解酶(葡糖苷酶”、“纤维二糖酶”、“BG”或“BGL”)。这些酶共同作用以催化含纤维素的基质的水解。内切葡聚糖酶断裂内部键并破坏纤维素的晶体结构,暴露个别的纤维素多糖链(“葡聚糖”)。纤维二糖水解酶逐步缩短葡聚糖分子,主要释放纤维二糖单元(葡萄糖的水溶性β-1,4-连接的二聚体)以及葡萄糖、纤维三糖和纤维四糖。葡糖苷酶将纤维二糖分裂为单体。纤维素酶通常包括协同作用以破坏纤维素为可溶的二糖或寡糖诸如纤维二糖的不同类型的纤维素分解性酶(cellulolytic enzyme)(内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶)的混合物,所述二糖或寡糖随后被葡糖苷酶进一步水解为葡萄糖。纤维素酶由多种微生物产生。来自丝状真菌和一些细菌的纤维素酶(和半纤维素酶)被广泛地用于许多工业应用,包括加工天然纤维为糖类。如本文所用,“产纤维素酶的真菌细胞”是产生至少一种纤维素酶(即,“纤维素水解性酶”)的真菌细胞。在一些实施方案中,本文提供的产纤维素酶的真菌细胞表达和分泌纤维素水解性酶的混合物。如本文所用,术语“纤维素水解性酶”、“纤维素分解性酶”和类似术语是指在破坏纤维素为可溶的二糖或寡糖诸如纤维二糖的过程中起作用的酶,所述二糖或寡糖随后被β -葡糖苷酶进一步水解为葡萄糖。纤维素水解性酶的混合物在本文还称为“纤维素酶”、“含纤维素酶的混合物”和/或“纤维素酶混合物”。如本文所用,术语“内切葡聚糖酶”和“EG”是指一类催化纤维素的内部β -1,4糖苷键水解的纤维素酶(EC3.2.1.4)。术语“内切葡聚糖酶”在本文进一步定义为内切-1,4-(1,3 ;1,4)-β -D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.4),其催化纤维素、纤维素衍生物(诸如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉中的I,4-β-D-糖苷键,混合的β_1,3葡聚糖诸如谷类β-D-葡聚糖或木糖葡聚糖、和包含纤维素组分的其他植物材料中的β-1,4键的内切水解。内切葡聚糖酶活性可基于基质粘度的减少或由还原糖检验确定的还原性末端的增加来确定(参见例如,Zhang等人,Biotechnol.Adv.,24:452-481 [2006]) 为了本发明的目的,内切葡聚糖酶活性使用羧甲基纤维素(CMC)水解来确定(参见例如,Ghose,Pur.Appl.Chem.,59:257-268[1987])。如本文所用,“EG1 ”是指分类在EC3.2.1.4下的从编码糖基水解酶(GH)家族7催化结构域的核酸序列表达的碳水化合物活性酶,或其任何蛋白、多肽或催化活性片段。在一些实施方案中,EGl功能地连接于碳水化合物结合模块(CBM),诸如家族I纤维素结合结构域。如本文所用,术语“EG2”是指分类在EC3.2.1.4下的从编码糖基水解酶(GH)家族5催化结构域的核酸序列表达的碳水化合物活性酶,或其任何蛋白、多肽或催化活性片段。在一些实施方案中,EG2功能地连接于碳水化合物结合模块(CBM),诸如家族I纤维素结合结构域。 如本文所用,术语“EG3”是指分类在EC3.2.1.4下的从编码糖基水解酶(GH)家族12催化结构域的核酸序列表达的碳水化合物活性酶,或其任何蛋白、多肽或催化活性片段。在一些实施方案中,EG3功能地连接于碳水化合物结合模块(CBM),诸如家族I纤维素结合结构域。如本文所用,术语“EG4”是指从分类在EC3.2.1.4下的编码糖基水解酶(GH)家族61催化结构域的核酸序列表达的碳水化合物活性酶,或其任何蛋白、多肽或催化活性片段。在一些实施方案中,EG4功能地连接于碳水化合物结合模块(CBM),诸如家族I纤维素结合结构域。如本文所用,术语"EG5"是指分类在EC3.2.1.4下的从编码糖基水解酶(GH)家族45催化结构域的核酸序列表达的碳水化合物活性酶,或其任何蛋白、多肽或催化活性片段。在一些实施方案中,EG5功能地连接于碳水化合物结合模块(CBM),诸如家族I纤维素结合结构域。如本文所用,术语"EG6"是指分类在EC3.2.1.4下的从编码糖基水解酶(GH)家族6催化结构域的核酸序列表达的碳水化合物活性酶,或其任何蛋白、多肽或催化活性片段。在一些实施方案中,EG6功能地连接于碳水化合物结合模块(CBM),诸如家族I纤维素结合结构域。如本文所用,术语"纤维二糖水解酶"和"CBH"是指水解纤维素中的糖苷键的一类纤维素酶(EC3.2.1.91)。术语"纤维二糖水解酶"在本文进一步定义为1,4-β -D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91),其催化纤维素、纤维寡糖或包含任何β -1,4-连接的葡萄糖的聚合物中的1,4-β-D-葡糖苷键水解,从链的还原性或非还原性末端释放纤维二糖(参见例如,Teeri, Tr.Biotechnol.,15:160-167[1997];和 Teeri 等人,Biochem.Soc.Trans.,26:173_178[1998])。在一些实施方案中,纤维二糖水解酶活性使用荧光二糖衍生物4-甲基伞形酮基β.-D-乳糖苷来确定(参见例如,van Tilbeurgh等人,FEBS Lett., 149:152-156[1982] JPvan Tilbeurgh and Claeyssens, FEBS Lett., 187:283-288[1985])。如本文所用,术语"CBHl "和“I型纤维二糖水解酶”是指分类在EC3.2.1.91下的从编码糖基水解酶(GH)家族7催化结构域的核酸序列表达的碳水化合物活性酶,或其任何蛋白、多肽或催化活性片段。在一些实施方案中,CBHl功能地连接于碳水化合物结合模块(CBM),诸如家族I纤维素结合结构域。如本文所用,术语"CBH2"和“2型纤维二糖水解酶”是分类在EC3.2.1.91下的指从编码糖基水解酶(GH)家族6催化结构域的核酸序列表达的碳水化合物活性酶,或其任何蛋白、多肽或催化活性片段。2型纤维二糖水解酶还常常称为“Cel6家族”。在一些实施方案中,CBH2功能地连接于碳水化合物结合模块(CBM),诸如家族I纤维素结合结构域。如本文所用,术语"葡糖苷酶"、"纤维二糖酶"和"BGL"是指催化纤维二糖水解为葡萄糖的一类纤维素酶(EC3.2.1.21)。术语"β -葡糖苷酶"在本文进一步定义为β -D-葡糖苷酶葡糖水解酶(E.C.3.2.1.21),其催化末端非还原性β -D-葡萄糖残基的水解,伴随β -D-葡萄糖的释放。β -葡糖苷酶活性可使用任何适当的方法确定(参见例如,J.Basic Microbiol.,42:55-66 [2002])。I 单位的 β -葡糖苷酶活性定义为在 40°C,pH5,在含0.01 %TWEEN⑩20的IOOmM柠檬酸钠中,从作为底物的ImM对硝基苯基-β -D-吡喃葡萄糖苷每分钟产生1.0pmol对硝基苯酹。如本文所用,术语"糖苷水解酶61"和"GH61"是指与一种或多种另外的纤维素酶联合使用时增强纤维素水解的一类纤维素酶。纤维素酶的GH61家族描述在例如,碳水化合物活性酶(CAZY)数据库中(参见例如,Harris等人,Biochem.,49(15):3305-16[2010])ο如本文所用的“半纤维素酶”是指能够催化将半纤维素水解成小的多糖诸如寡糖或单体糖的多肽。半纤维素包括木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯木聚糖、葡甘露聚糖和木葡聚糖。半纤维素酶包括例如,以下:内切木聚糖酶、β -木糖苷酶、a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶、a-D-葡糖醛酸酶、阿魏酰酯酶、香豆酰酯酶、α-半乳糖苷酶、半乳糖苷酶、甘露聚糖酶和甘露糖苷酶。如本文所用,术语"木聚糖降解活性"和"分解木聚糖的活性(xylanolyticactivity)"在本文定义为水解含木聚糖的材料的生物活性。测量分解木聚糖的活性的两种基本方法包括:(I)测量总的分解木聚糖的活性,和(2)测量单独的分解木聚糖的活性(内切木聚糖酶、木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α -葡糖醛酸酶、乙酰基木聚糖酯酶、阿魏酰酯酶和α -葡糖醛酸基酯酶)(参见例如,Biely和Puchard, J.Sc1.Food Agr.86:1636-1647 [2006] ;Spanikova `和 Biely,FEBS Lett.,580:4597-4601 [2006] JPHerrmann等人,Biochem.J.,321:375-381 [1997])。总的木聚糖降解活性可通过确定从多种类型的木聚糖,包括燕麦、二粒小麦、山毛榉木和落叶松木聚糖形成的还原糖或通过光度确定从多种共价染色的木聚糖释放的染色的木聚糖片段来测量。常见的总的分解木聚糖的活性检验是基于从聚合4-0-甲基葡糖醛酸木聚糖产生还原糖(参见例如,Bailey等人,J.Biotechnol., 23 =257-270 [1992]) 0在一些实施方案中,木聚糖降解活性通过在以下典型条件下测量山毛榉木木聚糖(SigmaChemical C0., Inc., St.Louis, M0., USA)被木聚糖-降解酶水解的增加来确定:lmL反应、5mg/mL基质(总固体)、5mg分解木聚糖的蛋白/g基质、50mM乙酸钠pH5、50°C、24小时、使用对轻基苯甲酰肼(PHBAH)检验的糖分析(参见例如,Lever, Anal.Biochem.,47:273-279[1972])。如本文所用,术语"木聚糖酶活性"是指催化木聚糖中的l,4-13_D-木糖苷键的内切水解的I,4-β-D-木聚糖-木聚糖水解酶活性(E.C.3.2.1.8)。在一些实施方案中,木聚糖酶活性使用山毛榉木木聚糖作为底物来确定。I单位的木聚糖酶活性定义为在50°C,PH5,在含0.01%TWEEN 20的50mM乙酸钠中,从作为底物的2g/升山毛榉木木聚糖在水解的最初阶段中每分钟产生1.0 μ mol还原糖(以葡萄糖当量测量;参见例如,Lever,Anal.Biochem.,47:273-279 [1972])。如本文所用,术语"β_木糖苷酶活性"是指催化短的β (I —4)_低聚木糖的外切-水解以从非还原性末端除去逐个的D -木糖残基的β -D -木糖苷木聚糖水解酶(E.C.3.2.1.37)。在本发明的一些实施方案中,I单位的木糖苷酶活性定义为在40°C, ρΗ5,在含0.01 %1'WEEM 20的IOOmM柠檬酸钠中,从作为底物的ImM对硝基苯基-β -D-木糖苷每分钟产生1.0 μ mol对硝基苯酚。如本文所用,术语"乙酰基木聚糖酯酶活性"是指催化乙酰基从聚合的木聚糖、乙酰化的木糖、乙酰化的葡萄糖、α-萘基乙酸酯和对硝基苯基乙酸酯水解的羧酸酯酶活性(EC3.1.1.72)。在本发明的一些实施方案中,乙酰基木聚糖酯酶活性在包含0.01%TWliliNCK.20的50mM乙酸钠pH5.0中使用0.5mM对硝基苯基乙酸酯作为底物来确定。I单位的乙酰基木聚糖酯酶活性定义为在PH5,25°C,能够每分钟释放Ipmol对硝基苯酚阴离子的酶的量。如本文所用,术语"阿魏酰酯酶活性"是指催化4-羟基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基从酯化的糖,通常是“自然”基质中的阿拉伯糖,水解以产生阿魏酸(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸)的4-羟基-3-甲氧基肉桂酰-糖水解酶活性(EC3.1.1.73)。阿魏酰酯酶还被称为阿魏酸酯酶、羟基肉桂酰酯酶、FAE-1I1、肉桂酰酯水解酶、FAEA, cinnAE、FAE-1或FAE-1I。在本发明的一些实施方案中,阿魏酰酯酶活性在50mM乙酸钠pH5.0中使用0.5mM对硝基苯基阿魏酸酯作为底物来确定。I单位的阿魏酰酯酶活性等于在pH5,25°C,能够每分钟释放I μ mol对硝基苯酚阴离子的酶的量。如本文所用,术语"α-葡糖醛酸酶活性"是指催化α-D-葡糖醛酸苷水解为D-葡糖醛酸和醇的a -D-葡糖苷酸葡糖醛酸水解酶活性(EC3.2.1.139)。I单位的α -葡糖醛酸酶活性等于在pH5,40°C,能够每分钟释放Ipmol葡糖醛酸或4_0_甲基葡糖醛酸的酶的量(参见例如,de Vries, J.Bacteriol.,180:243-249[1998])。如本文所用,术语"a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性"是指催化a-L-阿拉伯糖苷中的末端非还原性a-L-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解的a-L-阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃糖水角军酶(alpha-L-arabinofuranosidearabinofuranohydrolase)活性(EC3.2.1.55)。该酶活性作用于a-L-阿拉伯呋喃糖苷、包含(1,3)_键和/或(1,5)_键的a-L-阿拉伯聚糖(alpha-L-arabinan)、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖。a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶还被称为阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、C1-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、a-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶和a -L-阿拉伯聚糖酶。为了本发明的目的,a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性如下确定:使用每mLlOOmM乙酸钠pH5的5mg中等粘度的小麦阿糖基木聚糖(Megazyme InternationalIreland, Ltd.,Bray, C0.Wicklow, Ireland)在 40°C 以总体积 200 μ L 持续 30 分钟,随后通过ΛΜΙΝΠ Χ:..丨ΗΡΧ-87Η 柱色谱(Bio-Rad Laboratories, Inc.,Hercules, Calif.,USA)的阿拉伯糖分析。酶促木质素解聚可由通常协同起作用 的木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、虫漆酶和纤维二糖脱氢酶(CDH)完成。木质素降解必需的这些胞外酶常常被称为“木质素改性酶(lignin-modifying enzyme) ”或“LME”。这些酶中的三种包括两种糖基化的含血红素的过氧化物酶:木质素过氧化物酶(LIP) ;Mn依赖性过氧化物酶(MNP);和含铜的酹氧化酶:虫漆酶(LCC)。尽管木质素生物降解的反应式的细节迄今没有完全理解,不受理论束缚,暗示这些酶利用自由基用于解聚反应。如本文所用,术语“虫漆酶”是指在许多植物、真菌和微生物中发现的含铜的氧化酶。虫漆酶对酚类和类似分子具有酶活性并且进行一个电子的氧化。虫漆酶可以是聚合的并且酶活性形式可以是二聚体或三聚体。如本文所用,术语“Mn依赖性过氧化物酶”是指需要Mn的过氧化物酶。Mn依赖性过氧化物酶(MnP)的酶活性依赖于Mn2+。不受理论束缚,已表明这种酶的主要作用是将Mn2+氧化成 Mn3+(参见例如,Glenn 等,Arch.Biochem.Biophys., 251:688-696[1986])。随后,酌.类底物被产生的Mn3+氧化。如本文所用,术语“木质素过氧化物酶”是指体外催化聚合木质素的稀溶液的氧化解聚作用的胞外血红素。一些LiP的底物,最值得注意的是3,4_ 二甲氧基苄醇(藜芦醇,VA),是显示充当氧化还原介质(mediator)的活性氧化还原化合物。VA是与LiP同时被黄孢原毛平革菌(P.chrysosporium)的木质素分解培养物产生的次生代谢产物,且不受理论限制,已提出VA作为木质素的体内LiP催化氧化中的生理学氧化还原介质起作用(参见例如,Harvey,等,FEBS Lett.195:242-246 [1986])。如本文所用,术语“葡糖淀粉酶”(EC3.2.1.3)是指催化从寡糖和多糖分子的非还原性末端释放D-葡萄糖的酶。葡糖淀粉酶通常也被认为是一种类型的淀粉酶,称为淀粉_匍糖苷酶。如本文所用,术语“淀粉酶”(EC3.2.1.1)是指通过以内切或外切作用方式水解α-1,4和/或α-1,6葡糖苷键 来降解淀粉和相关化合物的淀粉裂解酶。淀粉酶包括α -淀粉酶(EC3.2.1.1) ; β -淀粉酶(3.2.1.2)、淀粉-淀粉酶(EC3.2.1.3)、α -葡糖苷酶(EC3.2.1.20)、支链淀粉酶(EC3.2.1.41)和异淀粉酶(EC3.2.1.68)。在一些实施方案中,淀粉酶是α -淀粉酶。如本文所用,术语“果胶酶”是指催化果胶水解成较小的单元,诸如寡糖或单体糖的酶。在一些实施方案中,酶混合物包括任何果胶酶,例如内切-聚半乳糖醛酸酶、果胶甲基酯酶、内切-半乳聚糖酶、果胶乙酰基酯酶、内切-果胶裂解酶、果胶酸裂解酶、α鼠李糖苷酶、外切-半乳糖醛酸酶、外切-聚半乳糖醛酸裂解酶、鼠李聚糖半乳糖醒酸(rhamnogalacturonan)水解酶、鼠李聚糖半乳糖醒酸裂解酶、鼠李聚糖半乳糖醛酸乙酰基酯酶、鼠李聚糖半乳糖醛酸半乳糖醛酸水解酶和/或木半乳糖醛酸酶(xy1galacturonase)。如本文所用,术语“内切-聚半乳糖醛酸酶”(EC3.2.1.15)是指催化果胶酸和其他半乳糖醒酸聚糖(galacturonan)中的1,4_ a -D-半乳糖苷醒酸键(I,4- a -D-galactosiduronic linkage)的随机水解的酶。这种酶还可以被称为“聚半乳糖醒酸酶果胶解聚酶”、“果胶酶(pectinase) ”、“内切聚半乳糖醛酸酶”、“果胶酶(pectolase) ”、“果胶水解酶”、“果胶聚半乳糖醛酸酶”、“聚-1,4-半乳糖醛酸苷聚糖水解酶”、“内切半乳糖醛酸酶”、“内切-D-半乳糖醛酸酶”或“聚(I,4-a-D-半乳糖醛酸苷)聚糖水解酶”。如本文所用,术语“果胶甲基酯酶”(EC3.1.1.11)是指催化如下反应的酶:果胶+η Η20 = η甲醇+果胶酸。该酶还可以称为“果胶酯酶”、“果胶脱甲氧基酶(pectin demethoxylase) ”、“果胶甲氧基酶”、“果胶甲基酯酶”、“果胶酶”、“果胶酯酶(pectinoesterase) ” 或“果胶甲酯水解酶(pectin pectylhydrolase) ”。如本文所用,术语“内切-半乳聚糖酶”(EC3.2.1.89)是指催化阿拉伯半乳聚糖中的1,4-β-D-半乳糖苷键的内切水解(endohydrolysis)的酶。该酶还可以称为“阿拉伯半乳聚糖内切_1,4-β -半乳糖苷酶”、“内切-1,4-β -半乳聚糖酶”、“半乳聚糖酶”、“阿拉伯半乳聚糖酶”或“阿拉伯半乳聚糖4-β -D-半乳聚糖水解酶”。如本文所用,术语“果胶乙酰基酯酶”是指催化果胶GaIUA残基的羟基处的乙酰基的脱乙酰基作用的酶。如本文所用,术语“内切-果胶裂解酶”(EC4.2.2.10)是指催化(I — 4) - a -D-半乳糖醛酸聚糖甲基酯的消除性切割以产生在其非还原性末端具有4-脱氧-6-0-甲基-a -D-半乳-4-烯醒酸糖基(4-deoxy-6-0_methyl-α -D-galact-4-enuronosy
I)基团的寡糖的酶。该酶还可以称为“果胶裂解酶”、“果胶反式-消除酶(pectintranS-eliminaSe)”、“内切-果胶裂解酶”、“聚甲基半乳糖醛酸反式消除酶”、“果胶甲基反式消除酶”、“果胶裂解酶(peCtolyaSe)”、“PL”、“PNL”、“PMGL” 或“(I — 4)-6-0-甲基-a -D-半乳糖醛酸聚糖裂解酶”。如本文所用,术语“果胶酸裂解酶”(EC4.2.2.2)是指催化(I —4)-a_D-半乳糖醛酸聚糖的消除性切割以产生在非还原性末端具有4-脱氧-a -D-半乳-4-烯醛酸糖基(4-deoxy-α-D-galact-4-enuronosyl)基团的寡糖的酶。该酶还可以称为“聚半乳糖醒酸反式消除酶(polygalacturonic transeliminase) ”、“果胶酸反式消除酶”、“聚半乳糖醒酸裂解酶”、“内切果胶甲基反式消除酶”、“果胶酸反式消除酶”、“内切半乳糖醛酸反式消除酶”、“果胶酸裂解酶”、“果胶裂解酶”、“ a -1,4-D-内切聚半乳糖醛酸裂解酶”、“PGA裂解酶”、“PPase-N”、“内切-α_1,4-聚半乳糖醛酸裂解酶”、“聚半乳糖醛酸裂解酶”、“果胶反式消除酶”、“聚半乳糖醛酸反式消除酶”或“(I — 4)-a -D-半乳糖醛酸聚糖裂解酶”。

如本文所用,术语“ α -鼠李糖苷酶” (EC3.2.1.40)是指催化α -L-鼠李糖苷或可选的鼠李聚糖半乳糖醛酸中的末端非还原性a-L-鼠李糖残基的水解的酶。这种酶还可以称为“ a -L-鼠李糖苷酶T”、“ a -L-鼠李糖苷酶N”或“ a -L-鼠李糖苷鼠李糖水解酶”。如本文所用,术语“外切-半乳糖醛酸酶”(EC3.2.1.82)是指从非还原性末端水解果胶酸,释放二半乳糖醒酸(digalacturonate)的酶。该酶还可以称为“外切-聚_ α _半乳糖醛酸苷酶”、“外切聚半乳糖苷酶”或“外切聚半乳糖醛酸苷酶”。如本文所用,术语“外切-半乳糖醛酸聚糖1,4-α半乳糖醛酸苷酶”(EC3.2.1.67)是指催化以下类型反应的酶:(I,4- a -D-半乳糖醛酸苷酶)n+H20 = (1,4-a-D-半乳糖醛酸苷)n-1+D-半乳糖醛酸。该酶还可以称为“聚[1- >4) a -D-半乳糖醛酸苷]半乳糖醛酸水解酶”、“外切聚半乳糖醛酸酶”、“聚(半乳糖醛酸)水解酶”、“外切-D-半乳糖醛酸酶”、“外切-D-半乳糖醛酸酶”、“外切聚-D-半乳糖醛酸酶”或“聚(I,4- a -D-半乳糖醛酸苷)半乳糖醛酸水解酶”。如本文所用,术语“外切聚半乳糖醛酸裂解酶”(EC4.2.2.9)是指催化4_(4_脱氧-a -D-半乳-4-烯醛酸糖基)-D-半乳糖醛酸从果胶酸(即去酯化的果胶)的还原性末端的消除性切割的酶。这种酶还可称为“果胶酸二糖裂解酶”、“果胶酸外切裂解酶”、“外切果胶酸反式消除酶”、“外切果胶酸裂解酶”、“外切聚半乳糖醛酸-反式-消除酶”、“PATE”、“外切-PATE”、“外切-PGL”或“(I — 4)-α -D-半乳糖醛酸聚糖还原性末端二糖裂解酶”。
如本文所用,术语“鼠李聚糖半乳糖醛酸酶”是指在由二糖[(l,2-a-L-鼠李糖酰-(I,4) - α -半乳糖基醛酸]组成的严格交替的鼠李聚糖半乳糖醛酸结构中以内切方式水解半乳糖基醛酸与吡喃鼠李糖基之间的键的酶。 如本文所用,术语“鼠李聚糖半乳糖醛酸裂解酶”是指在鼠李聚糖半乳糖醛酸中借助β -消除以内切方式切割a -L-Rhap-(I — 4) - a -D-GalpA键的酶。如本文所用,术语“鼠李聚糖半乳糖醛酸乙酰基酯酶”是指催化鼠李聚糖半乳糖醛酸中鼠李糖和半乳糖醛酸残基的交替主链的脱乙酰基作用的酶。如本文所用,术语“鼠李聚糖半乳糖醛酸半乳糖醛酸水解酶”是指以外切方式水解来自严格交替的鼠李聚糖半乳糖醛酸结构的非还原性末端的半乳糖醛酸的酶。这种酶还可以称为“木半乳糖醒酸聚糖(xylogalacturonan)水解酶”。如本文所用,术语“内切-阿拉伯聚糖酶”(EC3.2.1.99)是指催化1,5_阿拉伯聚糖中的1,5-α-阿拉伯呋喃糖苷键的内切水解的酶。该酶还可以称为“内切-阿拉伯酶”、“阿拉伯聚糖内切l,5-a-L-阿拉伯糖苷酶”、“内切-l,5-a-L-阿拉伯聚糖酶(endo-1,5-a -L-arabinanase) ”、“内切- a -1,5_L-阿拉伯聚糖酶(endo-α -1, 5-L-arabinase) ”、“内切-阿拉伯聚糖酶”或“ I,5- a -L-阿拉伯聚糖I,5- a -L-阿拉伯糖水解酶”。如本文所用,“蛋白酶”包括水解肽键的酶(肽酶)以及水解肽与其他部分诸如糖之间的键的酶(糖肽酶)。许多蛋白酶被表征在EC3.4之下并且适于在本发明中使用。一些特定类型的蛋白酶包括但不限于,半胱氨酸蛋白酶包括胃蛋白酶、木瓜蛋白酶,和丝氨酸蛋白酶包括糜蛋白酶、羧肽酶,和金属内切肽酶。如本文所用,"脂酶"包括水解脂质、脂肪酸、和酰基甘油酯,包括磷酸甘油酯、月旨蛋白、二酰基甘油等的酶。在植物中,脂质被用作限制水分损失和病原体感染的结构组分。这些脂质包括从脂肪酸衍生的 蜡以及角质和木栓质。如本文所用的,术语“分离的”和“纯化的”用来指被从其天然缔合的至少一种其他组分取出的分子(例如,分离的核酸、多肽[包括但不限于酶],等)或其他组分。因此,这些术语指被从其原始环境(例如,天然环境,如果其为天然存在的话)中取出的物质。预期该术语包括用于去除该分子天然缔合的至少一种组分的任何合适的方法。在一些实施方案中,这些术语还包括从其他细胞和/或培养基组分中分离的细胞。预期任何合适的分离方法可用在本发明中。在一些实施方案中,当物质以比天然存在的生物体或野生型生物体中存在的更高或更低的浓度存在于特定组合物中时,或其与由天然存在的生物体或野生型生物体表达后通常不存在的组分组合时,该物质被表述为“纯化的”。例如,存活的动物中存在的天然存在的多核苷酸或多肽是未分离的,但是从自然系统中的一些或全部的共存材料中分离到的同样的多核苷酸或多肽是分离的。在一些实施方案中,这些多肽是载体的一部分,和/或这些多核苷酸或多肽是组合物的一部分,并仍被认为是分离的,因为所述载体或组合物不是其天然环境的一部分。在一些实施方案中,核酸或蛋白质被表述为纯化的,例如,如果其在电泳凝胶或印迹中产生基本上一条带的话。当用于表示DNA序列时,术语“分离的”指已被从其天然遗传环境中取出并因此不含其他无关或不想要的编码序列,并因此为适合用在遗传改造的蛋白质产生系统中的形式的DNA序列。这些分离的分子是被从其天然环境中分离的分子且包括cDNA和基因组克隆。虽然本发明的分离的DNA分子不含其通常缔合的其他基因,但是可包括天然存在的5'和3'非翻译区(例如,启动子和终止子)。缔合区域的鉴定对于本领域普通技术人员将是明显的(参见例如,Dynan和Tijan,Nature316:774-78 [1985])。可选择地,术语“分离的DNA序列”被称为“克隆的DNA序列”。当用于表示蛋白质时,术语“分离的”指在除了其天然环境以外的条件中发现的蛋白质。在一些实施方案中,分离的蛋白质基本不含其他蛋白质,特别是其他同源蛋白质。如通过SDS-PAGE确定的,分离的蛋白质大于约10%纯,优选地大于约20%纯,且甚至更优选地大于约30%纯。如通过SDS-PAGE确定的,本发明另外的方面包括非常纯的形式(即,大于约40%纯、大于约60%纯、大于约70%纯、大于约80%纯、大于约90%纯、大于约95%纯、大于约97%纯、大于约98%纯或甚至大于约99%纯)的蛋白质。当用于表示纤维二糖脱氢酶时,“纯化”或“分离”指借助于从其本来缔合的一些或全部天然存在的成分中分离纤维二糖脱氢酶而使纤维二糖脱氢酶从其天然状态改变。这可通过任何合适的方法,包括本领域公认的分离技术,包括但不限于离子交换层析、亲和层析、疏水分离、透析、蛋白酶处理、硫酸铵沉淀或其他蛋白盐析沉淀、离心、尺寸排阻层析、过滤、微滤、凝胶电泳、梯度分离或任何其他合适的方法完成,以去除最终组合物中不期望的完整细胞、细胞碎片、杂质、无关蛋白质或酶。然后将提供另外的益处的成分,例如活化剂、抗抑制剂、期望的离子、控制pH的化合物、其他酶等加入包含纤维二糖脱氢酶的组合物中也是可能的。

如本文所用的,词组“基本纯的多肽”指其中该多肽物质为所存在的主要物质(即,以摩尔或重量计,其比组合物中任何其他单独的大分子物质更丰富)的组合物,并且当目的物质以摩尔或%重量计构成所存在的大分子物质的至少约百分之50时,其通常是基本纯的组合物。通常,基本纯的酶组合物以摩尔或%重量计将构成该组合物中存在的所有大分子物质的约60 %或更多、约70 %或更多、约80 %或更多、约90 %或更多、约95 %或更多、或约98%或更多。溶剂物质、小分子(< 500道尔顿)和元素的离子物质不被认为是大分子物质。如本文所用,术语提及酶混合物使用的“纯化工艺”涵盖物理地除去酶混合物的不期望组分的任何工艺。因此,在一些实施方案中,本文提供的纯化工艺包括从酶混合物物理地除去纤维二糖氧化性活性或反之亦然的纯化方法。预期本领域已知的任何适当的纯化工艺可用于本发明。事实上,不预期本发明限于任何特定的纯化工艺。如本文所用,术语“无细胞的酶混合物”包括已经从任何细胞,包括分泌该酶的细胞分离的酶。无细胞的酶混合物可通过本领域已知的多种方法的任一种制备,诸如过滤或离心方法。在一些实施方案中,酶混合物可以是,例如,部分无细胞的、基本上无细胞的或完全无细胞的。如本文所用,"多核苷酸"是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物、和其互补物(complement)。如果多核苷酸以其天然状态或当通过本领域技术人员已知的方法操作时,其可被转录并且/或者翻译以产生RNA、多肽或其片段,则所述多核苷酸被表述为“编码”RNA或多肽。该核酸的反义链也被表述为编码这些序列。如本领域已知的,RNA聚合酶可转录DNA以产生RNA,而且逆转录酶可逆转录RNA以产生DNA。因此,DNA分子可有效地编码RNA分子且反之亦然。术语"蛋白"和"多肽"在本文可互换地使用,是指氨基酸残基的聚合物。此外,术语"氨基酸"、“多肽”和“肽”涵盖天然存在的和合成的氨基酸、以及氨基酸类似物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些、以及后来被修饰的那些氨基酸(例如,羟基脯氨酸、Y -羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸)。如本文所用的,“目的蛋白”和“目的多肽”指期望的和/或被评价的蛋白/多肽。在一些实施方案中,目的蛋白被胞内表达,而在其他实施方案中,其为分泌的多肽。在一些实施方案中,“目的蛋白”或“目的多肽”包括本发明的酶。在一些实施方案中,目的蛋白为被融合到信号肽(即,待分泌的蛋白上的氨基端延伸部分)的分泌的多肽。几乎所有分泌的蛋白质使用在靶向到前体蛋白和前体蛋白穿过膜的转移中起关键作用的氨基端蛋白质延伸部分。该延伸部分在膜转移期间或膜转移之后立即被信号肽酶通过蛋白酶水解去除。如本文所用,术语“氨基酸类似物”是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物(即,α-碳原子结合于氢原子、羧基、氨基和R基,包括但不限于高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜和甲硫氨酸甲基锍)。在一些实施方案中,这些类似物具有修饰的R基(例如,正亮氨酸)和/或修饰的肽骨架,但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸在本文 由其公知的三字母符号或IUPAC-1UB生物化学命名委员会建议的单字母符号来提到。类似地,核苷酸可由其通常被接受的单字母代码来提到。氨基酸或核苷酸碱基的“位置”由根据其相对于N末端(或5’末端)的位置顺序地辨别每个氨基酸(或核苷酸碱基)的编号表示。由于在确定最佳比对时必须被考虑的缺失、插入、截短、融合等,通过简单地从N末端计数而确定的测试序列中的氨基酸残基编号不一定与其在参考序列中的对应位置的编号相同。例如,在测试序列具有相对于比对的参考序列的缺失的情况下,变体中在缺失位点将不存在对应于参考序列中的位置的氨基酸。在比对的测试序列中存在插入的情况下,该插入将不会对应于参考序列中的编号的氨基酸位置。在截短或融合的情况下,在参考序列或比对序列中可存在不对应于对应序列中的任何氨基酸的氨基酸串(stretches of amino acids)。本文互换地使用术语“野生型序列”和“天然存在的序列”表示宿主细胞中固有的或天然存在的多肽或多核苷酸序列。在一些实施方案中,野生型序列表示为蛋白质工程项目的起点的目的序列。野生型序列可编码同源或异源蛋白。同源蛋白是无干预时宿主细胞产生的蛋白质。异源蛋白是除非干预否则宿主细胞将不会产生的蛋白质。如本文所用的,“天然存在的酶”表示具有与自然界中发现的氨基酸序列(即,“野生型”)相同的未被修饰的氨基酸序列的酶。天然存在的酶包括固有酶(即,特定微生物中天然表达或发现的那些酶)。如本文所用,术语"参考酶"是指本发明的另一种酶(例如,“试验”酶)与其比较以确定被评价的其他酶中的改进的特征的存在的酶。在一些实施方案中,参考酶是野生型酶。在一些实施方案中,参考酶是指本发明的试验酶与其比较以确定被评价的试验酶中的改进的特征的存在的酶,所述改进的性质包括但不限于改进的热活性、改进的热稳定性、和/或改进的稳定性。在一些实施方案中,参考酶是野生型酶。如本文所用,术语"生物活性片段"是指具有氨基末端和/或羧基末端缺失和/或内部的缺失的多肽,但其中其余的氨基酸序列与与其比较的序列中相应位置相同,且该多肽保留全长多肽的基本上所有活性。如本文所用,术语“重组”是指宿主细胞中非自然存在的多核苷酸或多肽。在一些实施方案中,重组分子包含以非自然存在的方式连接在一起的两个或多个自然存在的序列。在一些实施方案中,由于故意的人工干预,“重组细胞”表达在细胞的天然(即,非重组)形式中未发现相同形式的基因和/或表达本来异常地过表达、低表达和/或完全不表达的天然基因。重组细胞包含至少一种重组的多核苷酸或多肽。核酸构建体、核酸(例如多核苷酸)、多肽或宿主细胞当是非自然存在的、人工的或工程改造的时,在本文称为“重组的”。“重组(Recombination) ”、“重组(recombining) ”和产生“重组的”核酸通常涵盖至少两种核酸片段的组装。本发明还提供重组的核酸构建体,包含在严格杂交条件下与编码具有SEQID NO:2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的互补物杂交的至少一种CDH多核苷酸序列。当核酸缔合,通常在溶液中缔合时,它们“杂交”。核酸杂交是由于各种被很好表征的物理-化学力,诸如氢键键合、溶剂排斥(solventexclusion)、碱基堆积等。如本文所用,在核酸杂交实验诸如Southern杂交或Northern杂交的背景下术语“严格的杂交洗涤条件”是序列依赖 性的,并且在不同环境参数下是不同的。对核酸杂交的广泛指导见 Ti jssen, 1993, " Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes,"第 I 部分,第 2 章(Elsevier,New York),其通过引用并入本文。对于至少100个核苷酸长度的多核苷酸而言,对低严格条件到极高严格条件限定如下:在标准的DNA印迹程序后,在42°C在5XSSPE,0.3% SDS,200 μ g/ml剪切和变性的鲑鱼精DNA,以及对于低严格性的25%甲酰胺,对于中等和中-高严格性的35%甲酰胺,或对于高严格性和极高严格性的50%甲酰胺中预杂交和杂交。对于至少100个核苷酸长度的多核苷酸,使用2XSSC,0.2% SDS50°C (低严格性)、在55°C (中等严格性)、在60°C (中-高严格性)、在65°C (高严格性)或在70°C (极高严格性)将载体材料最终洗涤三次,每次15分钟。中等严格条件涵盖本领域已知和在多种标准教科书中描述的那些,并包括洗涤溶液和杂交条件(例如,温度、离子强度和% SDS)的使用。中等严格条件的一个例子包括:在37 °C在包含以下的溶液中培养过夜:20%甲酰胺、5x SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5x Denhardt溶液、10%硫酸葡聚糖和20mg/mL变性剪切的鲑精DNA,随后在约37-50°C在Ix SSC中洗涤滤器。本领域技术人员知晓如何如所需地调整温度、离子强度等以适应诸如探针长度和类似因素的因素。如在本文的一些实施方案中使用的,严格条件或高严格度条件使用:(1)低离子强度和高温用于洗涤,例如在50°C 0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1 %十二烷基硫酸钠;(2)杂交期间,变性剂诸如甲酰胺,例如,50% (v/v)甲酰胺与0.1%牛血清白蛋白/0.1% Ficoll/0.1 %聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液、在pH6.5、750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠、在42°C;或(3)50%甲酰胺、5x SSC (0.75M NaCl、0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH6.8)、0.1%焦磷酸钠、5x Denhardt 溶液、超声处理的鲑精 DNA (50 μ g/mL)、0.1% SDS和10%硫酸葡聚糖、在42°C,在42°C在0.2x SSC (氯化钠/柠檬酸钠)中和在55°C在50%甲酰胺中洗涤,随后在55°C以含EDTA的0.1x SSC组成的高严格度洗涤。如本文所用的,用于表示细胞的术语“突变体文库”和“变体文库”指它们的基因组大部分是相同的但是包括一个或多个基因的不同的同源物的细胞群体。这些文库可用来,例如鉴定具有改善的性状的基因或操纵子。当用于表示多肽或核酸时,“文库”指一组(即,多种)异源多肽或核酸。文库由“成员”构成。文库的成员之间的序列差异造成了文库中存在的多样性。文库可采取多肽或核酸的简单混合物的形式,或可以是用核酸文库转化的生物体或细胞,例如细菌、病毒、动物或植物细胞的形式及类似形式。如本文所用的,术语“起始基因”指编码目的蛋白的待使用本发明改进、缺失、突变和/或以其他方式改变的目的基因。如本文在核酸背景下所用的术语“性质”及其语法等价物指可被选择或检测的核酸的任何特征或属性。这些性质包括但不限于影响结合多肽的性质、赋予包含特定核酸的细胞的性质、影响基因转录的性质(例如,启动子强度、启动子识别、启动子调控和/或增强子功能)、影响RNA加工的性质(例如,RNA剪接、RNA稳定性、RNA构象和/或转录后修饰)、影响翻译的性质(例如,水平、调控、mRNA与核糖体蛋白质的结合和/或翻译后修饰)。例如,可改变核酸对转录因子、聚合酶、调控因子等的结合位点以产生期望的特征或鉴定出不期望的特征。如本文在多肽(包括蛋白质)背景下所用的术语“性质”及其语法等价物指可被选择或检测的多肽的任何特征或属性。这些性质包括但不限于氧化稳定性、底物特异性、催化活性、热稳定性、碱稳定性、PH活性曲线、对蛋白酶降解的抗性、km、kcat、kcat/kffl比、蛋白质折叠、诱导免疫反应、不诱导免疫反应、结合配体的能力、结合受体的能力、被分泌的能力、被展示在细胞表面上的能力、低聚化的能力、信号转导的能力、刺激细胞增殖的能力、抑制细胞增殖的能力、诱导 凋亡的能力、被通过磷酸化或糖基化修饰的能力和/或治疗疾病的能力等。实际上,预期本发明不限于任何特定的性质。如本文所用,“相似性”是指相同或其保守氨基酸取代,如以下定义的。因此,为了相似性的目的,改变为相同或保守性取代不视为包括改变。氨基酸的缺失或非保守氨基酸取代在本文视为包括改变。相似性百分比的计算以对同一性百分比进行的相同方式进行。如本文所用的,关于表示氨基酸所用的“保守取代”指用化学上相似的氨基酸取代一种氨基酸。一般不改变比活性的氨基酸取代是本领域熟知的并被描述在许多教科书中。最通常发生的交换是 Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu 和Asp/Gly以及这些交换的逆向交换。如本文所用的,对于一种残基的保守取代物是同一组中的另一种残基。在一些实施方案中,保守氨基酸取代可以是诸如表A中所示的保守性取代的取代。显示的取代是基于氨基酸的物理化学性质,如此,是独立于生物体的。在一些实施方案中,保守氨基酸取代是示例性取代标题下所列的取代。
权利要求
1.一种真菌细胞,所述真菌细胞已被遗传修饰以减少由所述细胞分泌的内源性纤维二糖脱氢酶活性的量,其中所述真菌细胞来自科毛壳菌科(Chaetomiaceae),其中所述细胞包含纤维二糖脱氢酶I (cdhl)基因的缺失。
2.如权利要求1所述的真菌细胞,其中所述真菌细胞是毁丝霉属(Myceliophthora)的物种。
3.如权利要求1或2所述的真菌细胞,其中所述真菌细胞已被遗传修饰以破坏所述纤维二糖脱氢酶的分泌信号肽。
4.如权利要求1-3中任一项所述的真菌细胞,其中所述真菌细胞已被遗传修饰以减少由所述细胞表达的内源性纤维二糖脱氢酶的量。
5.如权利要求4所述的真菌细胞,其中所述真菌细胞已被遗传修饰以破坏编码所述内源性纤维二糖脱氢酶的转录子中的翻译起始序列。
6.如权利要求1-5中任一项所述的真菌细胞,其中所述真菌细胞已被遗传修饰以将移码突变引入到编码所述内源性纤维二糖脱氢酶的转录子中。
7.如权利要求1-6中任一项所述的真菌细胞,其中所述真菌细胞已被遗传修饰以减少编码所述内源性纤维二糖脱氢酶的基因的转录水平。
8.如权利要求7所述的真菌细胞,其中所述真菌细胞已被遗传修饰以破坏编码所述内源性纤维二糖脱氢酶的基因的启动子。
9.如权利要求1-8中任一项所述的真菌细胞,其中所述真菌细胞已被遗传修饰以至少部分地缺失编码所述内源性纤维二糖脱氢酶的基因。
10.如权利要求1-9中 任一项所述的真菌细胞,其中所述真菌细胞已被遗传修饰以减少所述内源性纤维二糖脱氢酶的催化效力。
11.如权利要求10所述的真菌细胞,其中所述真菌细胞的所述纤维二糖脱氢酶的活性位点中的一个或多个残基已被遗传修饰。
12.如权利要求1-11中任一项所述的真菌细胞,其中所述真菌细胞的所述纤维二糖脱氢酶的血红素结合结构域中的一个或多个残基已被遗传修饰。
13.如权利要求1-12中任一项所述的真菌细胞,其中所述纤维二糖脱氢酶包含与SEQID NO:2至少约85%、约88%、约90%、约93%、约95%、约97%、约98%或约99%相同的氨基酸序列。
14.一种酶混合物,包含两种或更多种纤维素水解性酶,其中所述两种或更多种纤维素水解性酶的至少一种由权利要求1-13中任一项所述的真菌细胞表达。
15.如权利要求14所述的酶混合物,其中所述酶混合物是无细胞混合物。
16.如权利要求14-15中任一项所述的酶混合物,其中所述酶混合物的基质包含预处理的木质纤维素。
17.如权利要求16所述的酶混合物,其中所述预处理的木质纤维素包含通过选自酸预处理、氨预处理、蒸汽爆破和有机溶剂萃取的处理方法处理的木质纤维素。
18.一种用于产生葡萄糖的方法,包括使至少一种纤维素基质与包含两种或更多种纤维素水解性酶的酶混合物接触,其中所述两种或更多种纤维素水解性酶的至少一种由权利要求1-13中任一项所述的真菌细胞表达。
19.一种用于产生葡萄糖的方法,包括使至少一种纤维素基质与权利要求14-17中任一项所述的酶混合物接触。
20.如权利要求18-19中任一项所述的方法,其中所述酶混合物是无细胞混合物。
21.如权利要求18-20中任一项所述的方法,其中所述纤维素基质是预处理的木质纤维素。
22.如权利要求21 所述的方法,其中所述预处理的木质纤维素包含通过选自酸预处理、氨预处理、蒸汽爆破和有机溶剂萃取的处理方法处理的木质纤维素。
23.如权利要求18-22中任一项所述的方法,还包括将所述葡萄糖发酵成终产物。
24.如权利要求23所述的方法,其中所述终产物是燃料醇或前体工业化学品。
25.如权利要求24所述的方法,其中所述燃料醇是乙醇或丁醇。
26.如权利要求1-13任一项所述的真菌细胞、权利要求14-17中任一项所述的酶混合物和/或权利要求18-25中任一项所述的方法,还包含对所述真菌细胞为同源或异源的纤维素降解酶。
27.—种发酵培养基,包含权利要求1-13或26中任一项所述的真菌细胞。
28.一种发酵培养基,包含权利要求14-17中任一项所述的酶混合物。
29.一种发酵培养基,包含权利要求1-13或26中任一项所述的真菌细胞和/或权利要求14-17中任一项所述的酶混合物。
全文摘要
本发明提供了改进的真菌菌株。在一些实施方案中,所述改进的真菌菌株可用于将纤维素材料水解成葡萄糖。本发明还提供了已被遗传修饰以减少由所述细胞分泌的内源性纤维二糖脱氢酶活性的量的真菌细胞,其中所述真菌细胞来自科毛壳菌科(Chaetomiaceae),其中所述细胞包含纤维二糖脱氢酶1(cdh1)基因的缺失。
文档编号C12N1/15GK103189496SQ201180052763
公开日2013年7月3日 申请日期2011年11月1日 优先权日2010年11月2日
发明者蒂普纳斯·贝德亚洛伊, 伊什·库马尔·达万 申请人:科德克希思公司

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