Pdgf诱导的细胞归巢的制作方法

xiaoxiao2020-6-24  3

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专利名称:Pdgf 诱导的细胞归巢的制作方法
技术领域
本发明一般性涉及细胞归巢(homing)和组织再生。
背景技术
祖细胞已经从多个成熟组织中收获,并移植以进行组织再生。尽管其具有科学有效性,但是细胞移植在临床转化中具有相关的经济和法规方面的挑战,包括免疫排斥、病原体传播、潜在的肿瘤发生、包装/贮存/运输以及临床采用和行政审批中的困难。通过募集宿主内源细胞包括祖细胞而进行的组织再生在本领域已有论述(见例如Agrawal et al.2010PNAS107, 3351-3355)。包括MSC在内的各种细胞的迁移和归巢至不同器官的能力已经充分确定。(见例如Chamberlain et al., 2007, StemCells25:2739-2749 ;Kan et al., 2005, Current Drug Targets6:31-41 ;Loetscher andMoser,2002, Arthr itis Res.4:233-236 ;Shi, M.et al., 2007, Haematologica92:897-904 ;Sordi, V.et al.,2005,Bloodl06:419-427 ;美国专利申请公开 US2003/0129750A1 ;美国专利申请公开US2004/0258669A1 ;美国专利申请公开US2006/0110374A1 ;美国专利申请公开US2008/0193426A1 ;PCT 专利公开 W02008/094689A2)。TOGF是一种生长因子(即蛋白质),其在胚胎发育、细胞增殖、细胞迁移和血管发生中起作用。天然发生的roGF是二聚体糖蛋白,由两个A (-AA)或两个B(-BB)链或者两个(-AB)链的组合组成。发明概述在本发明的不同方面提供了组织再生的方法,包括使用对象的内源祖细胞在体内再生损害的组织。本发明的一方面提供了使细胞迁移至支架的方法。在一些实施方案中,所述方法包括放置包含有效量的血小板衍生生长因子(PDGF)的支架以与细胞液体连通(fluidcommunication)。在所述方法的一些实施方案中,所述支架不包含移植的细胞。在一些实施方案中,有效量的I3DGF诱导细胞迁移至支架。本发明另一方面提供了治疗具有组织或器官缺陷的对象的方法。在一些实施方案中,所述方法包括将包含有效量的roGF的支架植入组织或器官缺陷处或其附近。在所述方法的一些实施方案中,所述支架在植入前不包含移植的细胞。在一些实施方案中,有效量的PDGF诱导细胞迁移至支架。在一些实施方案中,迁移的细胞是祖细胞。在一些结构中,所述迁移细胞是牙槽干细胞(alveolar stem cell)。在一些实施方案中,PDGF包括PDGF-AA、PDGF-BB和PDGF-AB中至少之一。在一些结构中,PDGF包括PDGF-BB。在一些实施方案中,TOGF以大约lng/g支架至大约30,000ng/g支架的浓度存在于支架中。在一些结构中,所述支架包括具有浓度为大约lng/ml至大约100ng/ml的F1DGF的组合物。在一些结构中,所述支架包括具有浓度为大约50ng/ml的TOGF的组合物。在一些实施方案中,所述支架植入在对象中组织或器官缺陷部位。在一些实施方案中,所述支架包括至少两层。在一些实施方案中,所述支架包括包含roGF的至少一层。在一些实施方案中,所述支架包括第一层和第二层,第一层包含藻酸酯(alginate)和 PDGF,第二层包含 PLGA。在一些实施方案中,PDGF包囊化在微球体中。本发明的其它目的和特征在后文中部分可见及部分指出。附图描述本领域技术人员理解下文描述的图只是为了举例目的。所述图不以任何方式限制本发明的范围。



图1是一系列线图和一系列照片,示出通过FACS及多能性对牙槽干细胞/祖细胞的鉴定(图1A)和多能性包括(图1B)骨发生(von Kossa)、(图1C)脂肪生成(油红0),(图1D)软骨发生(safarin 0)和(图1E)肌生成(肌球蛋白重链)。图2是一系列柱状图和线图,示出TOGF-诱导的牙槽干细胞/祖细胞募集。图2A示出剂量依赖性迁移。图2B示出TOGF-BB在所有TOGF同种型中是最强力的化学引诱物。*p〈0.05。阴性对照或NC:无血清培养基;阳性对照或PC:具有15%FBS的DMEM。图2C示出TOGF受体在牙槽干细胞/祖细胞中的表达。灰线:未染色细胞的荧光强度;黑线:用特异性抗原标记的细胞的荧光强度。图3是一对照片,示出通过牙槽干细胞/祖细胞形成毛细管。在化学限定的培养基中,牙槽干细胞/祖细胞分化为用钙黄绿素AM标记的典型毛细管结构(图3A)。管形成通过15 u Ml-异硫氰基-4R-(甲基亚硫酰基)丁烷阻断(图3B)。图4是示出双层支架的示意图和照片。图4A是示出用底部聚丙交酯-乙交酯(PLGA)层及含有缓释SDF1、TGFP 3、IGFl和TOGFBB的明胶微球体的上部藻酸酯层制成的双层支架。图4B是示出植入在12周龄Sprague Dawley大鼠鼻背部皮下及在植入10周后收获的支架的照片。图5是植入在12周龄Sprague Dawley大鼠鼻背部皮下的及在植入10周后收获的支架的照片,与天然鼻软骨组织中充分整合。图6是示出细胞募集进支架的一系列照片。图7是示出聚集蛋白聚糖和II型胶原的软骨特异性标记的工程化的组织表达的一系列免疫化学照片。发明详述本发明至少部分基于观测到血小板衍生生长因子(TOGF)诱导祖细胞如成熟骨髓干细胞归巢。这些发现证实诱导内源或移植的祖细胞的募集进行组织再生。因此,包含roGF的支架可用于组织再生。本发明描述的是鉴定TOGF以剂量应答方式募集祖细胞如牙槽骨干细胞(alveolar bone stem cell)的能力的研究。如本文所示,所有F1DGF同种型能募集牙槽干细胞/祖细胞(见实施例1)。进一步地,PDGF-BB示出最强效力,其等于具有15%胎牛血清的阳性对照组。祖细胞如成熟牙槽干细胞是多能的,具有例如分化为例如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞和内皮样细胞的能力。因此,PDGF(如TOGF-BB)可用于募集祖细胞以再生组织如骨、软骨、肌肉、脂肪、血管、牙髓、象牙质和完整牙齿。不同实施方案提供了组织再生的方法,包括使用对象的内源祖细胞在体内再生损害的组织。血小板衍生生长因子(roGF)可用于诱导祖细胞如牙槽骨干细胞归巢以再生组织如牙髓、象牙质和牙齿,以及衍生其它类型组织,如骨、软骨、肌肉、脂肪和血管。这种方法通过在所述对象体内使用宿主细胞再生组织而非给所述对象移植或输送收获的细胞而可减少与行政审批和临床转化相关的挑战。PDGF 本发明描述的不同组合物和方法包括血小板衍生生长因子(TOGF)。本发明描述的PDGF 可选自如下一或多种:PDGF-AA,PDGF-BB,PDGF-CC,PDGF-DD 及 PDGF-AB。例如,PDGF 可以是如下一或多种:I3DGF-AA,TOGF-BB和TOGF-AB。如本文所示,虽然所有类型的H)GF-AA、PDGF-BB和TOGF-AB均导致细胞迁移,但是I3DGF-BB示出较高的细胞迁移率(见实施例1)。I3DGF可具有来自任何哺乳动物物种包括人的天然发生的TOGF的氨基酸序列。或者,PDGF可具有从天然发生的TOGF修饰的氨基酸序列,条件是所述TOGF具有与天然发生的蛋白质基本相同的活性。技术人员不用过多的实验即可鉴别许多这种TOGF衍生物。在一些实施方案中,所述I3DGF可具有人TOGF的氨基酸序列。例如,人I3DGF可具有GenBank登录号AAA60552.1的氨基酸序列。I3DGF可购自许多厂家。PDGF以任意浓度存在于本发明所述组合物中。在一些实施方案中,PDGF以大约lng/ml至大约1,000ng/ml支架的浓度存在于支架中。再例如,PDGF可以大约100ng/ml、大约 150ng/ml、大约 200ng/ml、大约 250ng/ml、大约 300ng/ml、大约 400ng/ml、大约 450ng/ml、大约 500ng/ml、大约 550ng/ml、大约 600ng/ml、大约 650ng/ml 或者大约 700ng/ml 的浓度存在。再例如,I3DGF可以大约10ng/ml至大约100ng/ml的浓度存在于支架中。再例如,PDGF可以大约10ng/ml至大约50ng/ml的浓度存在于支架中。再例如,PDGF可以大约 10ng/ml、大约 20ng/ml、大约 30ng/ml、大约 40ng/ml、大约 50ng/ml、大约 60ng/ml、大约70ng/ml、大约80ng/ml、大约90ng/ml或大约100ng/ml的浓度存在于支架中。如本发明所示,在10ng/ml、25ng/ml和50ng/ml浓度的F1DGF示出细胞迁移,而在50ng/ml观测到最高细胞迁移(见实施例1)。PDGF以任何浓度存在于本发明所述支架中。在一些实施方案中,PDGF以大约Ing/g支架至大约30,000ng/g支架的浓度存在于所述支架中。例如,F1DGF可以大约10ng/g支架至大约3,000ng/g支架的浓度存在于所述支架中。再例如,F1DGF可以大约10ng/g支架至大约300ng/g支架的浓度存在于所述支架中。再例如,PDGF可以大约200ng/g支架至大约500ng/g支架的浓度存在于所述支架中。再例如,PDGF可以大约300ng/g支架的浓度存在于所述支架中。
由于不同的支架材料以不同的速度释放指定量的roGF,因此也可以通过生长因子在指定时间如一周内释放的量而用于测量生长因子的“潜能”。在一些实施方案中,PDGF以大约l-1000ng/g支架的速度释放。例如,PDGF可以大约10-100ng/g支架的速度释放。祖细胞本发明描述的不同组合物和方法用于募集祖细胞或者诱导祖细胞迁移。祖细胞是未分化的或者部分未分化的细胞,其可分裂和增殖产生未分化或部分未分化的细胞或者可以分化产生至少一种分化或特化细胞。祖细胞可以是多潜能(pluripotent)细胞,意味着该细胞在分化时能自行更新及横向分化为多种组织类型。多潜能祖细胞包括干细胞,如胚胎干细胞和成熟干细胞。祖细胞可以是多能(multipotent)细胞。祖细胞可以自我更新。例如,祖细胞可以是干细胞。再例如,祖细胞可以是成熟干细胞。再例如,祖细胞可以是成熟牙槽骨干细胞。再例如,祖细胞可以是人成熟牙槽骨干细胞。牙槽骨干细胞可以衍生自神经嵴细胞。在一些实施方案中,祖细胞可以分化为或者另外形成成骨细胞、软骨细胞、月旨肪细胞、肌细胞或内皮样细胞。祖细胞可以通过本领域已知的多种方式分离、纯化或者培养。分离和培养祖细胞的方法见例如 Vunjak-Novakovic and Freshney (2006)Culture of Cells for Tissue Engineering, ffiley-Liss, ISBN-100471629359 论述。祖细胞可以包含或者衍生自动物,包括但不限于哺乳动物、爬行动物和禽类动物,更优选马、牛、狗、猫、绵羊、猪和鸡,最优选人。支架和基质材料本发明描述的组合物和方法的不同实施方案应用包含I3DGF的支架。支架可以由技术人员认为可用的任何基质材料建造。基质材料可以是生物相容材料,通常形成有孔的微蜂窝状(microcellular)支架,其提供细胞迁移至其中的物理支持结构。这种基质材料可以:使得细胞附着和迁移;输送和保留细胞和生化因子;使得细胞养分和表达的产物能够扩散;或者发挥某些机械和生物学影响以修饰细胞阶段的行为。所述基质材料通常形成有孔的生物相容材料的微蜂窝状支架,其提供物理支持结构和粘性基材以在体外或体内培养期间募集细胞并使其生长。合适的支架和基质材料在例如Ma and Elisseeff, ed.(2005) ScaffoldingIn Tissue Engineering,CRC,ISBN1574445219 ;Saltzman(2004)TissueEngineering!Engineering Principles for the Design of Replacement Organs andTissues, Oxford ISBN019514130X中描述。例如,基质材料至少部分可以是固体异种材料(例如轻憐灰石)(Kuboki et al.1995Connect Tissue Res32, 219-226 ;Murataet al.1998Int J Oral Maxillofac Surg27, 391-396)、固体异质材料(聚乙烯聚合物)(Saito and Takaoka2003Biomaterials242287 - 93 ;Isobe et al.1999J OralMaxillofac Surg57, 695-8),或者自体(Sweeney et al.1995.JNeurosurg83, 710-715) >同种异体(Bax et al.1999Calcif Tissue Int65, 83-89 ;Vil janen et al.1997Int JOral Maxillofac Surg26, 389-393)或者异质来源(Santos et al.1998.J Biomed MaterRes41, 87-94)的凝胶,及上述材料的组合(Alpaslan et al.1996Br J of Oral MaxillofacSurg34, 414-418)。包含所述支架的基质可具有合适的多孔性及合适的孔径,以便于细胞募集及细胞和养分在整个结构中扩散。所述基质可以是生物可降解的以为周围组织吸收该基质,这样可不需要通过手术去除。降解发生的速度可尽可能与组织或器官形成的速度相符。因此,当细胞在其自身周围建造其自身天然结构时,该基质能提供结构整体性及最终破坏,剩下可以承担机械荷载的新组织(neotissue)、新形成的组织或器官。在一些结构中,所述基质可以是可注射基质。所述基质可以通过使用最小的侵入性内窥镜方法输送给组织。所述支架可包含具有不同粘度相的基质材料。例如,基质可具有基本上的液体相或基本上的凝胶相。相之间的转变可以通过多种因素刺激,包括但不限于光、化学、磁性、电和机械刺激。例如,所述基质可以是热敏感性基质,在大约室温下具有基本上的液体相,在大约体温下是基本上的凝胶相。基质的液体相可具有较低的粘度,便于生长因子或其它添加剂的最佳分布及可注射性,而基质的固体相可具有增加的粘度,便于基质保留在靶组织处或其内。所述支架可包含一或更多层,每层具有相同或不同的基质材料。例如,支架可包含至少两层,至少三层,至少四层或更多层。再例如,支架可包含具有第一基质材料的第一层及具有第二基质材料的第二层。再例如,支架可包含具有藻酸酯的第一层及具有PLGA的第二层。诱导祖细胞募 集的物质(如TOGF)可以包含在多层支架的一或更多层中。例如,I3DGF(如TOGF-BB)可包含在支架的藻酸酯层也包含在PLGA层中(见例如图4)。再例如,I3DGF(如TOGF-BB)可以包含在支架的多层中。所述支架可包含由合成的聚合物形成的基质材料。这种合成的聚合物包括但不限于聚氨基甲酸酯,聚原酸酯(polyorthoesters),聚乙烯醇,聚酰胺,聚碳酸酯,聚乙烯卩比咯烷酮,海洋生物(marine)粘附蛋白,氰基丙烯酸酯,及其类似物、混合物、组合和衍生物。或者,所述基质可以由天然发生的生物聚合物形成。这种天然发生的生物聚合物或生物共聚物包括但不限于纤维蛋白,纤维蛋白原,纤连蛋白,胶原,藻酸酯及其它合适的生物聚合物。所述基质也可从天然发生的生物聚合物与合成的聚合物的混合物形成。支架可包括一或更多种基质材料,包括但不限于胶原凝胶,聚乙烯醇海绵,聚(D, L-丙交酯-乙交酯)纤维基质,polyglactin纤维,藻酸钙凝胶,聚乙醇酸网,聚酯(如聚-(L-乳酸)或聚酐),多糖(如藻酸酯),聚磷腈(polyphosphazene),聚丙烯酸酯,或者聚环氧乙烷-聚丙二醇嵌段共聚物。基质可以从蛋白质(如胞外基质蛋白如纤维蛋白,胶原和纤连蛋白)、聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)或者透明质酸产生。也可以使用合成聚合物,包括生物蚀解聚合物(如聚交酯,聚乙醇酸,聚乙丙交酯,聚己内酯,聚碳酸酯,聚酰胺,聚酐,聚氨基酸,聚原酸酯,聚缩醛,聚丙烯酸腈基酯),可降解聚氨基甲酸酯,不可蚀解聚合物(如聚丙烯酸酯,乙烯醋酸乙烯聚合物及其它酰基取代的醋酸纤维素及其衍生物),不可蚀解聚氨基甲酸酯,聚苯乙烯,聚氯乙烯,聚氟乙烯,聚(乙烯咪唑),氯磺化聚烯烃,聚环氧乙烷,聚乙烯醇,特氟隆 ,或者尼龙。所述支架可进一步包含任何其它生物活性分子,例如抗生素或其它趋化生长因子或其它成骨、成象牙质、成釉质或成牙骨质(cementogenic)生长因子。在一些实施方案中,所述支架通过加入如人血清白蛋白(HSA)、羟乙基淀粉、葡聚糖或者其组合而加强。用于本申请组合物中这些化合物的合适浓度为本领域技术人员已知,或者可以不用过度实验而易于确定。支架中化合物的浓度随着化合物的性质、其生理作用及希望的治疗和诊断作用而变化。治疗有效量通常是治疗剂显示希望的作用而无过度毒性的足够浓度。例如,基质可包括上述浓度的roGF。化合物可以通过任何已知方法掺入支架或基质材料中。在一些实施方案中,化合物包埋于凝胶中,如掺入所述支架或基质材料孔中的胶原凝胶。或者,可使用化学修饰方法使化合物与基质材料共价连接。基质的表面官能团可以使用本领域熟知的偶联剂如醛化合物、碳二亚胺等与所述化合物的反应性官能团偶联形成共价键。此外,可使用间隔分子使表面反应基团与生物分子的反应基团成缺口,使得这种分子在基质表面上更具灵活性。使生物分子附着于基质内部或外部的其它相似方法为本领域技术人员已知。支架的孔和通道可被工程化为各种直径。例如,支架的孔的直径可以是从微米至毫米范围。在一些实施方案中,基质材料的孔包括微通道。微通道通常平均直径为大约0.1 ii m至大约1,000 u m,如大约50 y m至大约500 u m(例如大约100 u m, 150 u m,大约200 u m,大约 250 u m,大约 300 u m,大约 350 u m,大约 400 u m,大约 450 u m,大约 500 u m 或者大约550 u m)。本领域技术人员理解微通道直径的分布可具有任何分布,包括正态分布或非正态分布。在一些实施方案中,微通道是基质材料的天然发生的特征。在其它实施方案中,微通道被工程化为发生在基质材料中。一些方法可用于制造有孔支架,包括颗粒浙滤、气体发泡、电纺丝(electrospinning)、冻干、衆料陶瓷发泡(foaming of ceramic from slurry)以及形成聚合海绵。其它方法可用于制造有孔支架,包括计算机辅助设计(CAD)及用生物绘图仪合成所述支架(如固体无模成型)(如Bioplotter , EnvisionTec, Germany)。在本发明的组合物中可加入的生物药物包括免疫调节剂及其它生物应答修饰剂。生物应答修饰剂通常涵盖生物分子(如肽、肽片段、多糖、脂质、抗体),其参与修饰生物学应答,如免疫应答或者 组织或器官生长和修复,以增强特别希望的治疗作用的方式进行,例如细菌细胞的胞吞或者组织或器官特异性细胞的生长或者血管化。生物药物也可以直接掺入基质成分中。本领域技术人员已知或者可易于确定可作为合适的非生物和生物药物的其它物质。本发明描述的组合物也可被修饰掺入诊断剂,如造影剂。这种物质的存在使得医生可以监测内部发生的伤口愈合的进展。这种化合物包括硫酸钡以及含有碘的多种有机化合物。举例的这些含碘化合物包括碘酸胺酸,胆影酸,碘沙酸葡胺,碘番酸,以及泛影酸衍生物如泛影酸钠。可用于所述组合物中的其它造影剂可易于由本领域技术人员确定,可包括例如使用放射性标记的脂肪酸或其类似物。组合物中物质的浓度随着化合物的性质,其生理作用以及希望的治疗或诊断作用而变化。治疗有效量通常是治疗剂展示希望的作用而无过度毒性的足够浓度。诊断有效量通常是诊断剂有效使得可以监测组织移植物的整合而潜在毒性最小的浓度。在任何情况中,本领域技术人员均易于确定在特定情况中对于特定化合物的希望的浓度。配制物本发明描述的物质和组合物可以使用一或更多种药物可接受的载体或赋形剂通过任何便利的方式配制,如Remington’ s Pharmaceutical Sciences(A.R.Gennaro1Ed.), 21st edition, ISBN: 0781746736 (2005)所述,所述文献以其全部内容援引加入本文。这种配制物含有治疗有效量的优选是纯化形式的本文所述生物学活性物质,及适量的载体以提供适合施用给对象的形式。所述配制物应该适合施用模式。本发明使用的物质可以通过已知方法配制以施用给对象,使用包括但不限于肠胃外、肺部、口服、局部、皮内、肌肉、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、眼部、口腔和直肠的几种途径。所述各个物质也可以组合一或更多种其它物质或者与其它生物学活性或生物学惰性物质一起施用。这种生物学活性或惰性物质可以是在液体中或者与所述物质机械连通或者通过离子、共价、Van der Waals、疏水性、亲水性或其它物理力附着于所述物质。可以配制控制释放(或者持续释放)制备物以延长物质的活性及减少给药频率。控制释放制备物也可用于实现作用发生时间或其他特性如物质的血液水平及因此影响副作用的发生。控制释放制备物可以设计为最初释放一定量的物质,产生希望的治疗作用,及逐步和持续释放其他量的物质以在延长的时间保持治疗作用水平。为了保持物质在机体内的近恒定水平,所述物质可以从剂型中以代替被代谢或从机体排泄的物质的量的速度释放。物质的控制释放可以通过多种诱导剂刺激,如PH改变,温度改变,酶,水,或者其它生理条件或分子。包囊化所述化合物可另外通过基于载体的系统如包囊化载体导入基质内或基质上。例如,roGF可以在聚合输送系统内包囊化以从基质内控制释放组织生长因子。这种载体可用作缓释组合物。例如,生长因子可以微囊化以提供增强的稳定性或延长的输送。包囊化载体包括但不限于微粒、脂质体、微球体等,或者上述任何的组合,以提供不同比例的希望的释放模式。技术人员将获知其他控制释放输送物质的方法。此外,这些及其他系统可以组合或修改以优化物质在基质内的整合/释放。例如,聚合输送系统可以是聚合微球体,优选PLGA聚合微球体。本领域已知许多聚合输送系统以及包囊化分子如生长因子的方法(见例如Varde and Pack (2004) ExpertOpin Biol Ther4, 35-51)。聚合微`球体可以使用天然或合成聚合物产生并且是大小范围在0.1-500 u m的颗粒系统。聚合微团(micelle)和polymeromes是聚合输送载体,与微球体具有相似特性,也可以促进本发明描述的化合物的包囊化和基质整合。对于多种有效荷载的微球体的制造、包囊化和稳定化在本领域技术范围内(见例如Varde&Pack(2004)ExpertOpin.Biol.4 (I) 35-51)。微球体的释放速度可以根据聚合物类型、聚合物分子量、共聚物组成、加入微球体配制物中的赋形剂以及微球体大小而调整。可用于形成微球体的聚合物材料包括PLA、PLGA、用DPPC包被的PLGA、DPPC, DSPC、EVAc、明胶、白蛋白、壳聚糖、葡聚糖、DL-PLG> SDLMs> PEG(如 ProMaxx)、透明质酸钠,二酮哌嗪衍生物(如 Technosphere),磷酸1丐-PEG颗粒和/或寡糖衍生物DPPG(如Solidose)。包囊化可以例如使用水/油单一乳化方法、水-油-水双乳化方法或冻干方法实现。可以利用一些商业包囊化技术(如ProLeaseO;),Alkerme)。脂质体也可用于整合化合物与基质。所述物质携带能力及脂质体的释放速度可依赖于脂质组成、大小、电荷、药物/脂质比率及输送方法。常规的脂质体由中性或阴离子脂质(天然或合成的)组成。常用的脂质是卵磷脂,如磷脂酰胆碱,磷脂酰乙醇胺,神经鞘磷脂,磷脂酰丝氨酸,磷脂酰甘油及磷脂酰肌醇。脂质体包囊化方法为本领域熟知(Galovic et al.(2002) Eur.J.Pharm.Sc1.15, 441-448 ;ffagner et al.(2002) J.LiposomeRes.12,259-270)。靶向的脂质体和反应性脂质体也可以组合所述物质和基质使用。靶向的脂质体具有附着于表面的靶向配体,如单克隆抗体或凝集素,使得可以与特异性受体和/或细胞类型相互作用。反应性或多形性脂质体包括广泛的脂质体,其共性是其在特定相互作用时改变其相和结构的倾向(如pH-敏感性脂质体)(见例如Lasic (1997) Liposomes inGene Delivery, CRC Press, FL)。方法本发明的各种实施方案提供了通过使用TOGF使祖细胞如宿主牙槽骨干细胞募集、归巢或诱导分化的方法。如本发明所示,牙槽骨骨髓(衍生自神经嵴细胞)得自牙槽骨样品,分离单个核细胞和贴壁细胞并在培养基中培养;用限定培养基处理以诱导骨发生、脂肪生成、软骨生成和肌生成;然后诱导内皮祖细胞。Transwell迁移测定示出宿主祖细胞的TOGF诱导的剂量依赖性迁移。因此示出祖细胞如成熟牙槽干细胞可以被募集进支架并被诱导分化为细胞如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞和内皮样细胞。在一些实施方案中,提供了使细胞迁移进支架的方法。所述方法可包括放置含有PDGF的支架以与细胞液体连通。如本文所用,如果细胞没有阻止细胞迁移进支架的物理屏障(如基底膜、网状结缔组织、脂肪结缔组织等),则支架是“与细胞液体连通”。不受任何特定机制的限制,确信细胞应答对细胞形成浓度梯度的I3DGF的存在,从而影响细胞朝向支架中较高浓度I3DGF迁移,从而细胞从其来源沿着有分泌物的途径(moist path)迁移至支架。支架任选不包含移植的哺乳动物细胞,即无细胞用于所述支架;支架中存在的任何细胞均迁移进支架中。这些方法不仅仅限 于募集任何特定细胞类型。特别地,所述方法可用于募集MSC谱系中任何未分化的或分化的细胞,例如成骨细胞,软骨细胞,肌细胞,脂肪细胞或者内皮细胞。例如所述细胞可以是上述祖细胞。支架通常被理解是三维结构,当将该支架置入组织部位时在其中细胞、组织、血管等可以生长、形成集落及建群。所述方法的支架可如本文所述。植入本发明所述组合物和方法由于其募集内源祖细胞的能力而具有显著临床价值,从而任选避免为对象移植细胞。确定治疗的需要典型是通过与审议组织或器官缺陷一致的病史和体检评定。需要本发明治疗方法和组合物的对象可以是具有、经诊断具有、怀疑具有或者处于发生组织或器官缺陷危险的对象。可通过本发明方法治疗的各种病症的诊断在本领域技术范围内。所述对象优选是动物,包括但不限于哺乳动物、爬行动物和禽类动物,更优选是马、牛、狗、猫、绵羊、猪和鸡,最优选是人。所述对象可以是动物对象,包括但不限于哺乳动物、爬行动物和禽类动物,更优选马、牛、狗、猫、绵羊、猪、小鼠、大鼠、猴、豚鼠和鸡,最优选是人。本发明所述包含roGF的组合物或者具有包含roGF的组合物的支架的有效量通常是能募集和诱导足够数目细胞如祖细胞迁移的量,以增加组织或器官的生物学功能。例如,需要的对象可具有至少大约5%、大约10%、大约25%、大约50%、大约75%、大约90%或更多的特定细胞类型的缺陷,所述方法可提供所述特定细胞类型的数目或功能的增力口。再例如,需要的对象可具有组织或器官损害,所述方法可提供该组织或器官的生物学功能增加至少大约5%,大约10%,大约25%,大约50%,大约75%,大约90%,大约100%或者大约200%,或者甚至增加大约300%,大约400%或者大约500%。再例如,需要的对象可具有疾病、失调或病症,所述方法提供足够的工程化支架可募集祖细胞及形成足以改善或稳定所述疾病、失调或病症的组织。例如,所述对象可具有导致细胞丧失、衰退、功能不良和/或死亡的疾病、失调或病症。举例的可治疗的病症包括神经、神经胶质或肌肉退行性失调,肌肉萎缩或营养失调,心脏病如充血性心衰,肝炎或肝硬化,自身免疫性疾病,糖尿病,癌症,导致组织或器官缺失的先天性缺陷,或者需要除去组织或器官的疾病、失调或病症,缺血性疾病如心绞痛,心肌梗塞及缺血性肢体,和/或意外组织缺陷或损害如骨折或创伤。在进一步的实例中,需要的对象具有增加的发生通过本发明方法延迟或阻止的疾病、失调或病症的风险。所述组织或器官可选自膀胱,脑,神经组织,神经胶质,食管,输卵管,心脏,胰腺,肠,胆囊,肾,肝,肺,卵巢,前列腺,脊髓,脾,胃,睾丸,胸腺,甲状腺,气管,泌尿生殖道,输尿管,尿道,子宫,乳房,骨骼肌,皮肤,脂肪,牙齿,骨和软骨。祖细胞可以来自其中移植了工程化组织组合物的相同对象。或者,祖细胞可以来自相同物种,或者甚至不同物种。工程化构建体的植入在本领域技术范围内。所述支架或基质材料可以完全或部分植入对象的组织或器官中,成为其功能部分。优选地,所述植入体最初附着于宿主及通过细胞单层与宿主连通。随时间内源细胞可以迁移进支架中形成组织。工程化组织周围的细胞可以被生物学活性材料引诱,所述材料包括生物学应答修饰剂,如多糖,蛋白质,肽,基因,抗原和抗体,其可选择性掺入基质中以提供需要的选择性,例如使细胞受体系连于基质,刺激细胞迁移进基质中,或者这二者。所述基质可包含凝胶相和允许细胞迁移的互相连接的通道,通过生物学和物理-化学梯度扩大。例如,植入种植的基质的周围的细胞可以被生物学活性材料包括TOGF引诱。本领域技术人员将识别并获知怎样使用适于引诱细胞至基质的其它生物学活性材料。本发明的方法、组合物和装置可包括用一或更多种酶、离子、生长因子和生物物质如凝血酶和钙或者其组 合同时或相继处理。本发明的方法、组合物和装置可包括用非生物和/或生物药物同时或相继处理。当用于本发明所述治疗中时,PDGF的治疗有效量可以是以纯的形式应用,或者是药物可接受的盐形式(在存在这种形式的情况中),有或没有药物可接受的赋形剂。例如,本发明的化合物可以在可用于任何医学治疗的合理的益处/风险比率以增加组织或器官的生物学功能的足够量施用。可以与药物可接受的载体组合以产生单一剂量形式的本发明所述组合物的量根据治疗的宿主和特定的施用模式而变化。本领域技术人员意识到每个剂量形式的各个剂量中含有的物质的单位含量不需要其自身组成治疗有效量,因为必需的治疗有效量可以通过施用许多单个剂量达到。本发明所述组合物的毒性和治疗效力可以通过标准药物学方法在细胞培养或实验动物中确定LD5tl (导致群体50%死亡的剂量)和ED5tl (群体50%治疗有效的剂量)而确定。毒性与治疗作用之间的剂量比率是治疗指数,可以用比率LD5(i/ED5(i表示,其中优选大的治疗指数。任何特定对象的特定治疗有效剂量水平根据许多因素而变化,包括治疗的疾病和疾病的严重性,应用的特定化合物的活性,应用的特定组合物,患者的年龄、体重、一般状况、性别和饮食,施用时间,施用途径,应用的组合物的排泄速度,治疗的持续时间,与应用的特定化合物组合或一致使用的药物,及医药领域熟知的因素等(见例如 Koda-Kimble et al.(2004)Applied Therapeutics: The Clinical Use ofDrugs, Lippincott ffilliams&ffilkins, ISBN0781748453 ;ffinter(2003)Basic ClinicalPharmacokinetics, 4th ed.,Lippincott Williams&ffilkins, ISBN0781741475 ;SharqeI (2004)AppIied Biopharmaceutics&Pharmacokinetics,McGraw-Hi11/Appleton&Lange, ISBN0071375503)。例如,本领域技术人员熟知所述组合物的起始剂量低于要求达到的希望的治疗作用的那些水平,逐步增加剂量直至达到希望的作用。如果需要,有效每日剂量可以分成多个剂量施用。结果,单一剂量组合物可含有这个量或其约数量以组成每日剂量。然而应理解本发明的化合物和组合物的总每日用量将由主治医生在合理医学判断范围内决定。本发明所述组 合物或者包含组合物的支架的施用可以是单一事件或者在整个治疗期间。例如,可以每日一次、每周一次、两周一次或者每月一次施用。根据本发明所述方法的治疗可以在组织或器官缺陷的常规治疗方式之前、同时或之后进行。本发明所述的组合物或包含组合物的支架可以与另一物质如抗生素、抗炎剂或者另一物质同时或相继施用。例如,可以与另一物质如抗生素或抗炎剂同时施用。试剂盒本发明还提供了试剂盒。这种试剂盒可包括本发明所述物质或组合物,在某些实施方案中,还包含给药指导。这种试剂盒可促进本发明所述方法的性能。当供给试剂盒时,所述组合物的不同成分可以包装在分别的容器中,在使用之前立即混合。成分包括但不限于包含TOGF的组合物,支架或者基质材料。如果需要,所述成分的这种单独包装可以存在于含有具有所述组合物的一或更多个单位剂型的包装或分配装置中。所述包装可例如包含金属或塑料箔如罩板包装。这种单独成分包装在某些情况中也可以允许长期贮存而不丧失该成分的活性。试剂盒也可包括在单独容器中的试剂,例如无菌水或盐水以加入单独包装的冻干的活性成分中。例如,密封的玻璃安瓶可含有冻干成分及在分开的安瓶中含无菌水、无菌盐水或者已经在中性非反应气体如氮气下包装的无菌的每种试剂。安瓶可以有任何合适材料组成,如玻璃,有机聚合物,如聚碳酸酯,聚苯乙烯,陶瓷,金属或者典型用于盛装试剂的任何其它材料。其它合适容器的实例包括瓶,其可以由与安瓶相似的物质制造,及包袋(envelope),其可以由箔片内衬组成,如铝或铝合金。其它容器包括试管,小瓶,烧瓶,瓶,注射器等。容器可具有无菌进入孔,如具有可由皮下注射针穿透的瓶塞的瓶。其它容器可具有由可易于除去的膜分开的两个室,在除去所述膜时使得所述成分混合。所述可除去的膜可以是玻璃、塑料、橡胶等。在某些实施方案中,试剂盒可以附带说明书材料。说明书可以印刷在纸或者其它基材上,或者作为电子可读介质提供,如软盘,小-CD-ROM,CD-ROM,DVD-ROM, Zip盘,录像带,录音带等。详细的说明书可以不与试剂盒直接附带,使用者可以通过厂商或试剂盒的经销商指定互联网网站获取。本发明所述的组合物和方法利用分子生物学方案可以根据本领域已知的各种标准技术进行(见例如 Sambrook and Russel(2006)Condensed Protocolsfrom Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, ISBN-10:0879697717 ;Ausubel et al.(2002)Short Protocols in MolecularBiology, 5th ed., Current Protocols, ISBN-10:0471250929 ;Sambrook andRussel(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring HarborLaboratory Press,ISBN-10:0879695773 ;Elhai, J.and ffolk,C.P.1988.Methods inEnzymology167, 747-754 ;Studier(2005)Protein Expr Purif.41 (I), 207 - 234 ;Gellissen, ed.(2005)Production of Recombinant Proteins:Novel Microbial andEukaryotic Expression Systems,ffiley-VCH, ISBN-10:3527310363 ;Baneyx(2004)Protein Expression Technologies, Taylor&Francis, ISBN-10:0954523253)。在此提供本发明所述的定义和方法以更好地定义本发明以及指导本领域技术人员实施本发明。除非特别指出,应理解所用术语是相关领域技术人员常规使用的含义。在一些实施方案中,用于描述和要求本发明一些实施方案的表不成分、性质如分子量、反应条件等的量的数字应理解在一些情况下由术语“大约”修饰。在一些实施方案中,术语“大约”用于指示一个值,包括用以确定所述值的装置或方法的平均值的标准误差。在一些实施方案中,说明书和权利要求书中的数字参数是大约值,可以根据由特定实施方案获得的希望的性质而变化。在一些实施方案中,所述数字参数应该根据所报道的有效数字和常规舍入方法进行解释。尽管描述本发明一些实施方案的宽范围的数字范围和参数是大约值,但是描述具体实施例的数值被报道为实际精确值。存在于本发明一些实施方案中的数值可能必然含有误差,产生自在它们各自测试测量中发现的标准误差。本文描述的数值范围仅仅是作为逐个指示落入该范围内的每个单独数值的简便方法。除非本文另有指示,每个数值掺入说明书中就像其在本文逐个描述一样。在一些实施方案中,除非特别指出,本文中描述特定实施方案(特别是某些如下权利要求中)所用术语“一个”和“所述”及相似用语可以理解为涵盖单数和复数。在一些实施方案中,除非明确指出,本 文包括权利要求书中所用术语“或者”是用于意味着“或者”,除非明确表示唯一选择或者是互相排斥的选择。术语“包含”、“具有”和“包括”是开放式系动词。任何形式或时态的一或多个这些动词如“包含”、“具有”、“包括”等也是开放式的。例如,“包含”、“具有”或者“包括”一或多个步骤的任何方法不限于仅具有这些一或多个步骤,也可以涵盖其它未列举的步骤。相似地,“包含”、“具有”或“包括” 一或多个特征的任何组合物或装置不限于仅具有那一或多个特征,可涵盖其它未列举的特征。除非特别指出或者与上下文明显矛盾,则本发明描述的所有方法可以以任何合适顺序进行。除非另外指明,关于某些实施方案提供的任何及所有实例或者举例用语(例如“如”)只是为了更好地例证本发明,而无限制本发明范围之意。本说明书中无用语应被理解为表示实施本发明必需的任何没有请求保护的元件。本发明的可选元件或实施方案的分组不应被理解为限制性的。每组成员可以单独提及和请求保护或者与该组的其它成员或者其它元件组合提及和请求保护。一组的一或多个成员可以由于便利或专利性原因而包含或缺失。当发生任何这种包含或缺失时,本说明书在此被认为含有如此修饰的组,因此满足所附权利要求书中使用的所有Markush组的书面描述要求。本文中引用的参考文献不应解释为承认其是本发明的现有技术。在对本发明进行详细描述的基础上,将显而易见在不偏离所附权利要求书限定的本发明的范围的前提下,修改、变化和等价实施方案是可能的。此外,应意识到本说明书中提供的所有实施例均是非限制性实施例。
实施例提供如下非限制性实施例以进一步例证本发明。本领域技术人员应意识到实施例中揭示的技术是发明人在实施本发明中经充分证实的代表性方法,因此可被认为是构成实施模式实例。然而,技术人员根据本发明揭示意识到在不偏离本发明精神和范围的前提下可以对特定实施方案进行多种改变,仍获得相同或相似结果。实施例1小牙槽骨样品在IRB许可下得自多个健康成人供体。选择牙槽骨骨髓是因为:1)其在研,及2)其在发育中衍生自神经嵴细胞。分离牙槽骨骨髓单个核细胞和贴壁细胞,在补加15%FBS、100U/mL青霉素-链霉素的DMEM中培养。通过抗体免疫细胞化学和FACS分析早期传代细胞(P3-P5)的Stro-l、CD105、Cd44、CD73、CD90和CD34的表达。为了检测多潜能性,将细胞用用于骨生成、脂肪生成、软骨发生和肌生成的化学限定的培养基处理。将细胞进一步朝向内皮祖细胞诱导并检测体外毛细管形成。进行Transwell迁移测定以确定PDGF以剂量应答形式募集牙槽干细胞/祖细胞的能力。FACS分析示出培养的牙槽干细胞/祖细胞表达Stro-1、⑶105、⑶73、⑶44和0)90,但是对于⑶34是阴性的(见例如图1A)。根据用von Kossa、油红O、safrarin 0及肌球蛋白重链染色,牙槽干细胞/祖细胞是分化的成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞和肌细胞(分别见例如图1B-E)。 Transwell迁移测定示出TOGF、特别是TOGF-BB诱导强力的剂量依赖性迁移。FACS分析示出牙槽干细胞/祖细胞表达I3DGFR-A和TOGF-B (见例如图2)。牙槽干细胞/祖细胞在化学限定的培养基中进一步分化为内皮样细胞,在基质胶上形成典型三维毛细管结构(见例如图3)。实施例2如下实施例示出通过细胞归巢促进的软骨形成。这种方法可用于医学方法中如鼻整形术。双层支架由底部聚丙交酯-乙交酯(PLGA)层和含有缓释SDF1、TGFP 3、IGFl和PDGFBB的明胶微球体的顶部藻酸酯层制造。将支架植入在12周龄Sprague Dawley大鼠鼻背皮下(见例如图4)。在植入10周后收获支架。结果示出通过支架形成大的异位组织,其呈现出与天然鼻软骨组织充分整合(见例如图5)。大量细胞募集进支架中形成工程化组织(见例如图6)。表达聚集蛋白聚糖和II型胶原的软骨特异性标记的工程化组织通过免疫组织化学示出(见例如图7)。
权利要求
1.使细胞迁移至支架的方法,包括: 放置包括有效量的血小板衍生生长因子(roGF)的支架与细胞液体连通; 其中 所述支架不包含移植的细胞;及 有效量的roGF诱导所述细胞迁移进支架。
2.治疗具有组织或器官缺陷的对象的方法,所述方法包括: 将包含有效量的roGF的支架植入在组织或器官缺陷处或其附近; 其中 所述支架在植入前不包含移植的细胞,及 有效量的I3DGF诱导细胞迁移进支架。
3.权利要求1-2任一项的方法,其中所述迁移细胞是祖细胞。
4.权利要求1-3任一项的方法,其中所述迁移细胞是牙槽干细胞。
5.权利要求1-4任一项的方法,其中所述I3DGF包含H)GF-AA、PDGF-BB和I3DGF-AB中的至少一种。
6.权利要求1-5任一项的方法,其中所述I3DGF包含TOGF-BB。
7.权利要求1-6任一项的方法,其中所述I3DGF以大约lng/g支架至大约30,000ng/g支架的浓度存在于支架中 。
8.权利要求1-6任一项的方法,其中所述支架包括包含I3DGF的组合物,所述I3DGF以大约lng/ml至大约100ng/ml的浓度存在于所述组合物中。
9.权利要求8的方法,其中所述支架包括包含I3DGF的组合物,所述I3DGF以50ng/ml浓度存在于所述组合物中。
10.权利要求1-9任一项的方法,其中所述支架植入在对象的组织或器官缺陷部位。
11.权利要求1-10任一项的方法,其中所述支架包含至少两层。
12.权利要求13的方法,其中至少一层包含H)GF。
13.权利要求12的方法,其中所述支架包含第一层和第二层,所述第一层包含藻酸酯和TOGF,所述第二层包含PLGA。
14.权利要求13的方法,其中所述I3DGF包囊化在微球体中。
15.权利要求1-14任一项的方法,其中所述I3DGF包囊化在微球体中。
16.一种支架,其包含: 基质材料,及 有效量的血小板衍生生长因子(roGF),其中所述有效量的roGF诱导细胞迁移进支架。
17.权利要求16的支架,其中所述支架不包含移植的细胞。
全文摘要
本发明提供了导致细胞迁移至支架的方法。本发明还提供了治疗具有组织缺陷的哺乳动物的方法。本发明进一步提供了包括血小板衍生生长因子(PDGF)的组织支架。此外,本发明提供了产生能募集细胞的组织支架的方法。
文档编号C12N5/00GK103210081SQ201180053295
公开日2013年7月17日 申请日期2011年10月3日 优先权日2010年10月1日
发明者J·J·毛, W·赵 申请人:纽约市哥伦比亚大学理事会

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