用于扩增核酸的方法和仪器的制作方法

xiaoxiao2020-6-24  6

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专利名称:用于扩增核酸的方法和仪器的制作方法
用于扩增核酸的方法和仪器本发明涉及用于扩增核酸的方法和微流体装置,涉及一种改进的微流体装置和一种操作微流体装置的方法,并且涉及一种包括检测仪器和微流体装置的系统。WO 2010/041088描述了一种微流体装置和一种操作该微流体装置的方法。该微流体装置具有一个进行PCR反应的反应室。该反应室填充有一种凝胶并且对于进行该PCR反应所必需的试剂保持在该凝胶的基质内直到该微流体装置被使用。在使用之前该微流体装置可以与以稳定状态存在的这些试剂进行存储。该微流体装置还适合自动化使用。该微流体装置配备有一个将有待扩增的DNA与其他的细胞成分分离的分离室。根据本发明的一个第一方面,提供的一种扩增核酸的方法,包括:提供一个微流体装置,该微流体装置中有一个空间,该空间填充有一种凝胶介质,在该空间中的该凝胶介质的基质内支持了用于进行一种PCR反应的至少一种试剂;使一个含有核酸的样品与该凝胶介质进行接触;使用该至少一种试剂在该空间中对来自于该样品的核酸进行PCR扩增;并且其中与该凝胶介质进行接触的该样品包括全细胞或细胞裂解物,而未将该核酸与这些细胞的其他成分进行任何预先分离。优选地该方法还包括对在这个微流体装置内的该PCR扩增的多种核酸产物进行分析。例如,这些核酸产物可以通过对这些PCR产物进行电泳分离来分析。该样品可以是一种口腔棉签样品或者一种血液样品。依照本发明的一个第二方面,提供了一种用于核酸扩增的微流体装置,包括:一个空间,该空间填充有一种凝胶介质;该空间还包含用来进行一种PCR反应的至少一种试剂,该至少一种试剂被支持在该凝胶介质的基质之中;一个开口,该开口从该微流体装置的一个外表面延伸到该空间中的该凝胶介质;并且其中该开口没有用于将核酸与其他细胞成分分离开的装置。 优选地,该微流体装置包括与该空间处于流体联通的一个通道,该通道包含一种分离介质,该分离介质用于将一种PCR反应的多种核酸产物分离开。对于本发明的该第一和第二方面,该凝胶介质在其中可以包含核苷三磷酸类,核酸引物和聚合酶中的至少一种。优选地在该凝胶介质的基质内支持了所有的这些试剂。根据本发明的该第一和第二方面,该凝胶介质优选地具有一种均质性构成。此外,这些在该凝胶介质的基质内的PCR试剂优选地在该凝胶介质中是均匀分布的。在本发明的该第二方面的一个特别优选实施例中,该微流体装置包括:一个通道以及从该外表面延伸到该通道的一个孔;一种凝胶,该凝胶被提供在该通道中并且可任选地部分地延伸进入该孔之中;一个液体空间,该液体空间没有该凝胶而用于接受一种液体,该液体空间至少部分地位于该孔中并且延伸到该凝胶,这样使得填充该液体空间的一种液体与该凝胶相接触;以及一个电极,该电极可接受在该孔中以便至少部分地位于该液体空间之中。依照本发明的一个第三方面,提供了一个微流体装置,包括:一个通道以及从该装置的外表面延伸到该通道的一个孔;一种凝胶,该凝胶被提供在该通道中并且可任选地部分地延伸进入该孔之中;一个液体空间,该液体空间没有该凝胶而用于接受一种液体,该液体空间至少部分地位于该孔中并且延伸到该凝胶,这样使得填充该液体空间的一种液体与该凝胶相接触;以及一个电极,该电极可接受在该孔中以便至少部分地位于该液体空间之中。依照本发明的一个第四方面,提供了一种操作微流体装置的方法,包括:提供一个微流体装置,该微流体装置具有一个通道,该通道包含一种凝胶;使用一个电极来施加一个电压以便引起沿着该通道的动电学运动;并且该电极与在该空间中的一种导电性液体相接触,该空间没有该凝胶并且该液体与该凝胶相接触。该动电学运动可以包括电渗运动或电泳运动或两者的混合。依照本发明的一个第五方面,提供了一种系统,该系统包括检测仪器和一个微流体装置,该检测仪器具有检测装置并且该微流体装置具有一个分析区域,该检测仪器具有至少一个固定的定位器以及对抗一种弹性偏置力可移动的至少一个定位器,该微流体装置是由该检测仪器可夹持的,这是通过使这些定位器与该微流体装置相接触并且使该至少一个被偏置的定位器将该微流体装置推在该至少一个固定的定位器上以便将该微流体装置定位在相对于该检测仪器的一个预定的位置中,并且其中当微流体装置被如此夹持时,该检测装置以及该分析区域被相互定位以用于在该分析区域上该检测装置的操作。优选地,该微流体装置具有一个基底表面并且该检测仪器具有一个支持表面,当该微流体装置被夹持时该基底表面置于该支持表面上。在一个优选实施例中,该微流体装置具有安排在一个矩形中的四个侧边缘。这些检测仪器具有至少两个固定的定位器以及至少两个弹性偏置的定位器。这样安排以便当该微流体装置被这些检测仪器夹持时,该至少两个固定的定位器与这些侧边缘中相邻的两个相接触,并且该至少两个弹性偏置的定位器与这四个侧边缘的不同的相邻的两个相接触。 该分析区域可以包括一个通道,在该通道中使用由该检测装置发射的一个光束检测一种分析物。在这种情况下,该光束的宽度大于该通道的宽度。当该微流体装置被该检测仪器夹持时,该微流体装置相对于该检测仪器的位置变化相对于该光束以及该通道的相对宽度是足够的小,这样使得该位置变化不影响在该通道中对该分析物的检测。下面是通过举例对本发明的实施例的更详细说明,参照附加示意图,其中:

图1是一个微流体装置的俯视平面图;图2是图1的微流体装置的横断面图,该图是在图1的A-A线上取的;并且图3是当该微流体装置被该检测装置夹持时,图1和图2的微流体装置的俯视平面图。如图1所示,通过举例,该微流体装置10是矩形的并且长约120毫米,宽约60毫米。参考图2,该微流体装置10是由一个上矩形玻璃板12和一个下矩形玻璃板14形成。该上玻璃板12的下表面16与该下玻璃板14的上表面18是通过一种合适的已知方法接合在一起的。热接合是优选的方法。该上板12的上表面20形成了该微流体装置10的一个上外表面并且该下玻璃板14的下表面22形成了该微流体装置10的一个下外表面。如图2所示,该上玻璃板12的厚度(如图2所示的高度)比该下玻璃板14的厚度大。通过举例,该上玻璃板可以具有3毫米的厚度并且该下玻璃板可以具有I毫米的厚度。该微流体装置10配备有第一孔24,第二孔26,第三孔28和第四孔30。这些孔24,26,28,30中的每一个孔都用来接收一个对应的电极,如下面将要详细讨论的。该第一孔24在图2中以纵向(垂直)截面显示。正如图2所示,每个孔采取圆柱状孔的形式,这些孔在该上板12的上表面20和下表面16之间钻穿该上板12。该第一孔24,第二孔26,第三孔28和第四孔30中的每一个孔具有一个大约2毫米到3毫米的直径。该微流体装置10还具有一个进行聚合酶链式反应(PCR)扩增工艺的内室32,如下面将要详细讨论的。该PCR室32在形状上是圆柱形的并且在将该上玻璃板12和该下玻璃板14接合在一起前已经通过以下而形成:从该上玻璃板12的下表面16开始,钻一个部分路径进入该上玻璃板12的圆柱形孔该微流体装置10还具有一个样品收集孔34。该样品收集孔34具有一个具有更大直径的上圆柱部分36和一个具有更小直径的下圆柱部分38。如图2所示,该样品收集孔34的下部分38在该上部分36与该PCR室32之间延伸。该样品收集孔34是通过以下而形成的:首先是用一个大直径钻头从该上表面20钻进该上玻璃板12。这样形成了该上部分36。然后用一个小直径钻头在该上部分36与该PCR室32之间进行钻孔以形成该下部分38。该微流体装置10还具有一个样品传送通道40和一个分离通道42。正如图1所示,该样品传送通道40从该第一孔24延伸至该PCR室32并且从该PCR室32延伸至该第二孔26。如图2所示,该样品传送通道40直接开放进入该第一孔24并且还直接开放进入该PCR室32。尽管未在这些附图中显示,该样品传送通道40直接开放进入该第二孔26。该样品传送通道40的横断面尺寸一般来说小于500微米(尽管可以用较大的尺寸)。例如,该样品传送通道40可以有一个大约100微米的宽度和一个大约20微米的深度。该样品传送通道40是在该上板12与该下板14接合在一起之前,通过在该下板14的上表面18上形成一个适当截面和尺寸的凹槽而形成的。在这两个板12,14接合时,该上板12的下表面16将该凹槽封闭以形成该样品传送通道40。如图1所示,该分离通道42从该第三孔28延伸至该第四孔30。该分离通道42直接开放进入该第三孔28和该第四孔30。该分离通道42和该样品传送通道40具有相似的尺寸,并且以相似的方 式形成。该样品传送通道40和该分离通道42在两者的一个交叉点43处彼此处于流体联通。此外,该微流体装置10配备有四个电极插头44,其中的一个显示在图2中。这四个电极插头44优选地是彼此相同的,但是不必如此。每个电极插头44是从一个由绝缘材料制成的帽46和一个穿过该帽46的电极48而形成的。如图2所示,该帽46的大小是使得它可以插入到这些孔24,26,28,30中的一个以形成一个紧密密封。该第一孔24,第二孔26,第三孔28和第四孔30的表面,该PCR室32,该样品收集孔34,该样品传送通道40和分离通道42被硅烷化以减少在使用时核酸对该玻璃的结合。在该上板玻璃12和该下玻璃板14在已连接在一起以后进行硅烷化。该微流体装置10在被放在一个烘箱里在90° C过夜干燥以前用水清理并且用空气干燥。然后将该装置10保存在一个干燥器里直到进行硅烷化。(对用于容纳这些硅烷化试剂的玻璃仪器进行相似处理。)将异辛烷(1000微升)与三氯(1H,1H,2H,2H)全氟辛基硅烷(145微升)混合。该混合物被泵入到该微流体装置10里并且穿过这些通道40,42和这些孔/室24,26,28,30,32,34。搁置五分钟后,通过泵空气通过该微流体装置来清除该混合物。然后用异辛烷清洗该微流体装置10,接着用空气进行干燥。最后,将丙酮,然后空气,然后水泵入通过该微流体装置10。在如下所述将该微流体装置10填充不同凝胶之前,将其在一个烘箱中烘干一小时。首先,将该样品传送通道40用一种琼脂糖凝胶50填充。为了形成该琼脂糖凝胶50,将低熔点琼脂糖溶解在无核酸水中并且在75° C将该溶液加热10分钟。该琼脂糖的最终浓度是1.5%(重量:重量)。如下将该琼脂糖凝胶50插入到该样品传送通道40里。首先,将该第三孔28和该第四孔30,以及还有该样品收集孔34的上部分36用合适的紧塞堵塞,这些塞子占据了孔28,30,36的大部分空间。然后,当该凝胶已形成,但是同时该凝胶仍处于熔化状态时,将其通过该第一孔24减压注入到该样品传送通道40里。在这个过程中,该琼脂糖凝胶50通过该样品传送通道40传递至该第二孔26。考虑到事实是该样品收集孔34是被堵塞的,该琼脂糖凝胶50没有进入该PCR室32,或者只小程度地进入(该PCR室32与该样品传送通道40处于液体联通)。一旦该琼脂糖凝胶50到达了该第二孔26的基底,注射停止。然后允许该凝胶在该样品传送通道40里凝固并且把该第一孔24和该第二孔26清理掉凝胶。然后该分离通道42用聚环氧乙烷凝胶52填充。该聚环氧乙烷凝胶52是通过用一种长时间搅拌的方法,将聚环氧乙烷在无核酸Tris-EDTA缓冲液中混合至浓度为2.5% (重量:重量)而进行制备。在该凝胶52凝固之前将其引入到该分离室42里。为了引入该聚环氧乙烷凝胶52,该第一孔24和该第二孔26以及该样品收集孔34是被堵塞的。然后将该熔化态的凝胶经由该第三孔28减压引入到该该分离室42里。这个过程是持续的直到该聚环氧乙烷凝胶到达该第四孔30的基底。在该聚环氧乙烷凝胶52凝固后,凝胶被从该第三孔28和该第四孔30清除。 在将该聚环氧乙烷凝胶52引入到该分离通道42中的过程中,少量的琼脂糖凝胶50被从该样品传送通道40和该分离通道42的交叉点43处移去。这部分琼脂糖凝胶50被运至该第四孔30并且不为任何目的。在这个实例中,该PCR室32由一种凝胶54填充,该凝胶54包含进行PCR必需的所有试剂。这些试剂被容纳在该PCR室32内的凝胶54的基质内。这些试剂是众所周知的用于进行PCR扩增反应的标准试剂。由此可见,这些PCR试剂包括充当引物的核酸序列以便扩增预订部分的引入到该PCR室32中的样品核酸。这些试剂还包括核苷三磷酸类和一种聚合酶。优选地,这些试剂将包括一种染料,该染料与该PCR反应产生的核酸片段结合。例如,该染料可以是一种荧光染料或者一种对比色检测有强烈吸收峰的染料。如下面所讨论的,在对这些DNA片段后续分离中该染料是用来辅助DNA片段检测的,这些DNA片段产生于该PCR反应中。通过具体实例,这些PCR试剂包含下面的组分。如下面所讨论的,右栏的浓度是用该凝胶1:1稀释前的浓度。
权利要求
1.一种扩增核酸的方法,包括: 提供一个微流体装置,该微流体装置中具有一个空间,该空间填充有一种凝胶介质,在该空间中的该凝胶介质的基质内支持了用于进行一种PCR反应的至少一种试剂; 使一种包含核酸的样品与该凝胶介质进行接触; 使用该至少一种试剂在该空间中对来自于该样品的核酸进行PCR扩增;并且 其中与该凝胶介质进行接触的该样品包含全细胞或细胞裂解物,而未将该核酸与这些细胞的其他成分进行任何预先分离。
2.根据权利要求1所述的方法,进一步包括对在该微流体装置内的该PCR扩增的多种核酸产物进行分析。
3.根据权利要求2所述的方法,其中所述分析包括对这些PCR产物进行电泳分离。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的方法,其中该至少一种试剂包括用于进行该PCR反应的核苷三磷酸类、引物核酸以及聚合酶中的至少一种。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的方法,其中该凝胶介质具有一种均质性构成。
6.根据权利要求1到5中任一项所述的方法,其中该至少一种试剂是遍布该凝胶介质均匀分布的。
7.根据权利要求1到6中任一项所述的方法,其中该样品是一种口腔棉签样品。
8.根据权利要求1到6中任一项所述的方法,其中该样品是一种血液样品。
9.一种用于核酸扩增 的微流体装置,包括: 一个空间,该空间填充有一种凝胶介质; 该空间还包含用来进行一种PCR反应的至少一种试剂,该至少一种试剂被支持在该凝胶介质的基质之中; 一个开口,该开口从该微流体装置的一个外表面延伸到该空间中的凝胶介质; 并且其中该开口没有用于将核酸与其他细胞成分分离开的装置。
10.根据权利要求9所述的微流体装置,进一步包括与该空间处于流体联通的一个通道,该通道包含一种分离介质,该分离介质用于将一种PCR反应的多种核酸产物分离开。
11.根据权利要求9或权利要求10所述的微流体装置,其中该至少一种试剂包括用于进行该PCR反应的核苷三磷酸类、核酸引物以及聚合酶中的至少一种。
12.根据权利要求9到11中任一项所述的微流体装置,其中该凝胶介质具有一种均质性构成。
13.根据权利要求9到12中任一项所述的微流体装置,其中该至少一种试剂是遍布该凝胶介质均匀分布的。
14.根据权利要求9到13中任一项所述的微流体装置,包括:一个通道以及从该外表面延伸到该通道的一个孔;一种凝胶,该凝胶被提供在该通道中并且可任选地部分地延伸进入该孔之中;一个液体空间,该液体空间没有该凝胶而用于接受一种液体,该液体空间至少部分地位于该孔中并且延伸到该凝胶,这样使得填充该液体空间的一种液体与该凝胶相接触;以及一个电极,该电极可接受在该孔中以便至少部分地位于该液体空间之中。
15.一种微流体装置,包括:一个通道以及从该装置的一个外表面延伸到该通道的一个孔;一种凝胶,该凝胶被提供在该通道中并且可任选地部分地延伸进入该孔之中;一个液体空间,该液体空间没有该凝胶而用于接受一种液体,该液体空间至少部分地位于该孔中并且延伸到该凝胶,这样使得填充该液体空间的一种液体与该凝胶相接触;以及一个电极,该电极可接受在该孔中以便至少部分地位于该液体空间之中。
16.一种操作微流体装置的方法,该方法包括: 提供一个微流体装置,该微流体装置具有一个通道,该通道包含一种凝胶;使用一个电极来施加一个电压以便引起沿着该通道的动电学运动;并且该电极与在该空间中的一种导电性液体相接触,该空间没有该凝胶并且该液体与该凝胶相接触。
17.—种系统,包 括检测仪器和一个微流体装置,该检测仪器具有检测装置并且该微流体装置有一个分析区域,该检测仪器具有至少一个固定的定位器以及对抗一种弹性偏置力可移动的至少一个定位器,该微流体装置是由该检测仪器可夹持的,这是通过使这些定位器与该微流体装置相接触并且使该至少一个被偏置的定位器将该微流体装置推在该至少一个固定的定位器上以便将该微流体装置定位在相对于该检测仪器的一个预定的位置中,并且其中当微流体装置被如此夹持时,该检测装置以及该分析区域被相互定位成用于在该分析区域上该检测装置的操作。
18.根据权利要求17所述的系统,其中该微流体装置具有一个基底表面并且该检测仪器具有一个支持表面,当该微流体装置被如此夹持时该基底表面置于该支持表面上。
19.根据权利要求17或权利要求18所述的系统,其中该微流体装置具有安排在一个矩形中的四个侧边缘,该检测仪器具有至少两个所述固定的定位器以及至少两个所述弹性偏置的定位器,并且其中当该微流体装置被如此夹持时,该至少两个固定的定位器与这些侧边缘中相邻的两个相接触,而该至少两个弹性偏置的定位器与这四个侧边缘的不同的相邻的两个相接触。
20.根据权利要求17到19中任一项所述的系统,其中该分析区域包括一个通道,在该通道中使用由该检测装置发射的一个光束检测到一种分析物,该光束的宽度大于该通道的宽度,其中当该微流体装置被该检测仪器如此夹持时,该微流体装置相对于该检测仪器的位置变化相对于该光束以及该通道的相对宽度是足够的小,这样使得所述位置变化不影响在所述通道中对所述分析物的检测。
全文摘要
一种扩增核酸的方法,包括提供一个微流体装置(10),该微流体装置中具有一个空间(32)。这个空间(32)填充有一种凝胶介质(54)。在空间(32)内的凝胶介质(54)的基质内支持有用于进行PCR反应的多种试剂。使一种包含核酸的样品与该凝胶介质(54)进行接触。这种样品包含全细胞或细胞裂解物,而未将该核酸与这些细胞的其他成分进行任何预先分离。在该空间中使用这些PCR试剂对来自该样品的核酸进行PCR扩增。
文档编号C12Q1/68GK103189525SQ201180053392
公开日2013年7月3日 申请日期2011年9月21日 优先权日2010年9月21日
发明者斯蒂芬·约翰·哈斯韦尔, 科斯蒂·简·肖, 彼得·多克尔 申请人:赫尔大学

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