新表达载体的制作方法

xiaoxiao2020-6-24  5

【专利下载】Tel:18215660330

专利名称:新表达载体的制作方法
技术领域
本发明涉及用于使重组体蛋白质在哺乳动物细胞内高效地表达的新表达载体,具体涉及包括基因表达调控位点、位于其下游的编码所需蛋白质的基因、进一步位于下游的内部核糖体进入位点和进一步位于下游的编码谷氨酰胺合成酶的基因的表达载体。
背景技术
使用通过整合有编码所需蛋白质的基因的表达载体转化的哺乳动物细胞来制造重组体蛋白质的方法是在医药品制造等工业领域中广泛普及的技术,0-半乳糖苷酶么、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、葡糖脑苷脂酶、加硫酶、a -L-艾杜糖醛酸酶、酸性α -葡糖苷酶等溶酶体酶、组织型纤溶酶原激活物(t-PA)、凝血因子VI1、凝血因子珊、凝血因子IX等凝血因子、红细胞生成素、干扰素、血栓调节蛋白、卵泡刺激素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、各种抗体药物等使用该技术制造,作为医药品在市场上销售。这时,作为表达载体,一般采用在诱导强基因表达的基因调控位点、例如来源于巨细胞病毒(CMV)的启 动子、SV40初期启动子、延伸因子la (EF-1)启动子等的下游整合有编码所需蛋白质的基因的表达载体。导入了这样的表达载体的哺乳动物细胞可表达整合至表达载体的所需蛋白质,其表达量根据各个细胞而不同,并不一致。因此,为了高效地生产重组体蛋白质,需要从导入了表达载体的哺乳动物细胞中筛选所需蛋白质的表达水平高的细胞的步骤。为了进行该筛选,表达载体整合有起到筛选标记物的作用的基因。作为筛选标记物,最一般的是分解嘌呤霉素、新霉素等药剂的酶(耐药性标记物)。哺乳动物细胞在一定浓度以上的上述药剂的存在下死亡。但是,导入了表达载体的哺乳动物细胞可通过整合至表达载体中的药剂筛选标记物分解上述药剂,将其无毒化或低毒化,所以在上述药剂的存在下也可生存。因此,如果在含有一定浓度的上述药剂的培养基中培养导入了表达载体的细胞,仅以高水平表达药剂筛选标记物的细胞增殖,结果筛选出那些细胞。以高水平表达药剂筛选标记物的细胞存在同时整合至表达载体中的编码所需蛋白质的基因也以高水平表达的倾向,所以结果获得以高水平表达所需蛋白质的哺乳动物细胞。作为筛选标记物,还已知使用谷氨酰胺合成酶(GS)的表达载体(参照专利文献1、2)。谷氨酰胺合成酶是由谷氨酸和氨合成谷氨酰胺的酶。如果将哺乳动物细胞在作为谷氨酰胺合成酶的抑制剂的一定浓度的蛋氨酸磺酸盐(MSX)的存在下用谷氨酰胺缺陷培养基进行培养,则细胞死亡。但是,如果将作为筛选标记物整合了谷氨酰胺合成酶的表达载体导入哺乳动物细胞,则该细胞中谷氨酰胺合成酶的表达水平上升,所以在更高浓度的MSX的存在下也可增殖。这时,如果使MSX的浓度逐渐上升的同时继续培养,则可获得在更高浓度的MSX的存在下也可增殖的细胞。该现象被认为是因整合至哺乳动物细胞的基因组内的该表达载体在基因组内进行复制来增加拷贝数而引发。即,由于拷贝数增加,一个细胞中的基因组内存在的药剂筛选标记物的基因数增加,基因的表达量相对增加。这时,整合至表达载体中的编码所需蛋白质的基因的拷贝数也复制而增加,所以可获得以高水平表达所需蛋白质的哺乳动物细胞。例如,专利文献I中记载,通过使用GS表达载体和蛋氨酸磺酸盐(MSX),与使用DHFP (二氢叶酸还原酶)/MTX (甲氨蝶呤)的情况相比,可实现更高的拷贝数。此夕卜,专利文献2中记载,通过使用GS基因和MSX,宿主细胞的DNA中,随着GS基因的拷贝数的增加,也可以使与之不同的异型基因的拷贝数也增加,由此可增加所需多肽的生产水平。如上所述,含筛选标记物的表达载体适合于效率良好的重组体蛋白质的制造,得到广泛应用。表达载体上,编码所需蛋白质的基因和编码筛选标记物的基因一般分别整合至不同的基因调控位点下(参照专利文献3)。但是,还已知一个基因调控位点下串联整合编码所需蛋白质和筛选标记物的基因使其表达的方法(参照专利文献4、5、6、7),这时在编码所需蛋白质和筛选标记物的基因之间插入有内部核糖体进入位点(IRES:1nternalribosome entry site)等,由此可由一个基因调控位点表达2个基因。内部核糖体进入位点已知有多种,有来源于例如微小核糖核酸病毒、脊髓灰质炎病毒、脑心肌炎病毒、鸡传染性法氏囊病病毒的位点(参照专利文献8、9、10)。作为应用内部核糖体进入位点的表达载体,已知在内部核糖体进入位点的下游作为筛选标记物整合有单纯疱疹病毒胸苷激酶的表达载体(参照专利文献11)、使用2个以上的内部核糖体进入位点结合有3种以上的基因的表达载体(参照专利文献12)。如上所述,通过各种表达载体的开发,使用哺乳动物细胞制造重组体蛋白质的方法在红细胞生成素等医药品的制造中得到实用化,为了降低其制造成本,始终要求效率更高的表达载体的开发。现有技术文献专利文献专利文献1:日本专利特表昭63-502955号公报专利文献2:日本专 利特表平5 - 504050号公报专利文献3:日本专利特开2009-273427号公报专利文献4:日本专利特开昭59-173096号公报专利文献5:日本专利特开昭60-199387号公报专利文献6:日本专利特表平4 - 500004号公报专利文献7:日本专利特开平8-256776号公报专利文献8:日本专利特表平6 - 509713号公报专利文献9:日本专利特表平8 - 502644号公报专利文献10:日本专利特开平10-327871号公报专利文献11:日本专利特表2008-539785号公报专利文献12:日本专利特表2004-520016号公报发明的概要发明所要解决的技术问题本发明的目的在于提供用于使重组体蛋白质在哺乳动物细胞内高效地表达的新表达载体、通过该载体转化的哺乳动物细胞及该哺乳动物细胞的制造方法。解决技术问题所采用的技术方案为了上述目的的研究中,本发明人发现通过使用整合有基因表达调控位点以及位于其下游的编码人葡糖脑苷脂酶等所需蛋白质的基因、进一步位于下游的内部核糖体进入位点和进一步位于下游的编码谷氨酰胺合成酶的基因的表达载体使哺乳动物细胞转化,可使编码该蛋白质的基因以高水平表达,从而完成了本发明。即,本发明提供以下的发明。[1]表达载体,它是用于使蛋白质表达的表达载体,其中,包括基因表达调控位点以及位于其下游的编码该蛋白质的基因、进一步位于下游的内部核糖体进入位点和进一步位于下游的编码谷氨酰胺合成酶的基因。[2]如上述[1]的表达载体,其中,该基因表达调控位点选自来源于巨细胞病毒的启动子、SV40初期启动子、延伸因子I启动子。[3]如上述[1]或[2]的表达载体,其中,该内部核糖体进入位点来源于选自微小核糖核酸病毒科的病毒、口蹄疫病毒、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、冠状病毒、牛肠道病毒、泰勒氏小鼠脑脊髓炎病毒(Theiler’s murine encephalomyelitis virus)、柯萨奇病毒B型病毒、人免疫球蛋白重链结合蛋白基因、果蚬触角足(Antennapedia)基因、果蚬超双胸(Ultrabithorax)基因的病毒或基因的5’非翻译区。[4]如上述[1]或[2]的表达载体,其中,该内部核糖体进入位点来源于微小核糖核酸病毒科的病毒的5’非翻译区。[5]如上述[1]或[2]的表达载体,其中,该内部核糖体进入位点来源于小鼠脑心肌炎病毒的5’非翻译区。[6]如上述[1] [5]中的任一项的表达载体,其中,该内部核糖体进入位点是在野生型的内部核糖体进入位点的碱基序列中加入了 I个或2个以上的突变的位点。[7]如上述[6]的表达载体,其中,在该内部核糖体进入位点存在多个起始密码子,其中的一部分被破坏。[8]如上述[5]的表达载体,其中,该内部核糖体进入位点包含序列编号I的碱基序列。[9]如上述[5]的表达载体,其中,该内部核糖体进入位点包含序列编号2的碱基序列。[10]如上述[5]的表达载体,其中,该内部核糖体进入位点包含序列编号3的碱基序列。[11]如上述[5]的表达载体,其中,该内部核糖体进入位点包含序列编号4的碱基序列。[12]如上述[5]的表达载体,其中,该内部核糖体进入位点包含序列编号5的碱基序列。[13]如上述[5]的表达载体,其中,该内部核糖体进入位点包含序列编号6的碱基序列。[14]如上述[1] [13]中的任一项的表达载体,其中,在编码蛋白质的该基因与该内部核糖体进入位点之间的区域或编码谷氨酰胺合成酶的该基因的下游区域,除该内部核糖体进入位点之外,还包含其它内部核糖体进入位点及位于其下游的耐药性基因。[15]如上述[1] [13]中的任一项的表达载体,其中,除该基因表达调控位点之夕卜,还包含其它基因表达调控位点及位于其下游的耐药性基因。[16]如上述[14]或上述[15]的表达载体,其中,该耐药性基因为嘌呤霉素抗性基因或新霉素抗性基因。
[17]如上述[I] [16]中的任一项的表达载体,其中,编码蛋白质的该基因为来源于人的基因。[18]如上述[17]的表达载体,其中,来源于人的基因选自编码溶酶体酶、组织型纤溶酶原激活物(t-PA)、凝血因子、红细胞生成素、干扰素、血栓调节蛋白、卵泡刺激素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和抗体的基因。[19]如上述[17]的表达载体,其中,来源于人的基因为编码溶酶体酶的基因。[20]如上述[19]的表达载体,其中,该溶酶体酶选自α -半乳糖苷酶A、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、葡糖脑苷脂酶、加硫酶、a-L-艾杜糖醛酸酶、酸性α-葡糖苷酶。[21]如上述[17]的表达载体,其中,来源于人的基因为编码红细胞生成素的基因。[22]哺乳动物细胞,其中,通过上述[I] [21]中的任一项的表达载体进行了转化。[23]如上述[22]的细胞,其中,该哺乳动物细胞为CHO细胞。[24]使编码蛋白质的基因表达的转化细胞的制造方法,其中,包括:将上述[I] 中的任一项的表达载体导入哺乳动物细胞的步骤;将导入了该表达载体的哺乳动物细胞在谷氨酰胺合成酶抑制剂的存在下或者谷氨酰胺合成酶抑制剂和与耐药性基因对应的药剂的存在下进行筛选培养的步骤。发明的效果

如果采用本发明,则可获得用于在哺乳动物细胞内使所需重组体蛋白质高效地表达的表达载体。通过将该表达载体导入哺乳动物细胞,再进行筛选培养,可获得高效地生产该重组体蛋白质的转化细胞。如果使用这样得到的转化细胞,则可大幅降低该重组体蛋白质的制造成本。附图的简单说明

图1-1是表示pE-neo载体的构建方法的流程的图。图1-2是表示pE-neo载体的构建方法的流程的图。图2-1是表示pE-hygr载体的构建方法的流程的图。图2-2是表示pE-hygr载体的构建方法的流程的图。图2-3是表示pE-hygr载体的构建方法的流程的图。图3-1是表示pE-1RES-GS-puro的构建方法的流程的图。图3-2是表示pE-1RES-GS-puro的构建方法的流程的图。图3-3是表示pE-1RES-GS-puro的构建方法的流程的图。图3-4是表示pE-1RES-GS-puro的构建方法的流程的图。图3-5是表示pE-1RES-GS-puro的构建方法的流程的图。图3-6是表示pE-1RES-GS-puro的构建方法的流程的图。图3-7是表示pE-1RES-GS-puro的构建方法的流程的图。图3-8是表示pE-1RES-GS-puro的构建方法的流程的图。图3-9是表不pE-1RES-GS-puro的构建方法的流程的图。图4是表示pE-mIRES-GS-puro的构建方法的流程的图。图5是表示pE-mIRES-GS的构建方法的流程的图。
图6-1是表示用表达载体(pE-mIRES-GS (GBA))转化的hGBA表达细胞的活细胞密度的图。图6-2是表示用表达载体(pE-mIRES-GS (GBA))转化的hGBA表达细胞的葡糖脑苷脂酶的表达量(GBA活性)的图。图7-1 是表示用表达载体(pE-1RES-GS-puro (GBA)和 pE-mlRES-GS-puro (G BA))转化的hGBA表达细胞的活细胞密度的图。图7-2 是表示用表达载体(pE-1RES-GS-puro (GBA)和 pE-mlRES-GS-puro (G BA))转化的hGBA表达细胞的人葡糖脑苷脂酶的表达量(GBA活性)的图。图 8-1 是表示用表达载体(pE-1RES-GS-puro (EPO)和 pE-mlRES-GS-puro (E PO))转化的hEPO表达细胞的活细胞密度的图。图 8-2 是表示用表达载体(pE-1RES-GS-puro (EPO)和 pE-mlRES-GS-puro (E PO))转化的hEPO表达细胞的人红细胞生成素的表达量的图。实施发明的方式本发明中,“基因表达调控位点”是指可调节存在于其下游的基因的转录频率的DNA上的区域,一般被称为 启动子或启动子基因。基因表达调控位点存在于生物体内进行表达的几乎所有的基因的上游侧,调节其转录频率,其碱基序列多样。本发明中可使用的基因表达调控位点只要能在哺乳动物细胞内强力诱导整合于其下游的基因的转录即可,无特别限定,较好是来源于巨细胞病毒(SMV)的启动子、SV40初期启动子等来源于病毒的启动子和延伸因子la (EF-1)启动子等。本发明中,“内部核糖体进入位点”是指存在于mRNA链内部的核糖体直接结合且可不依存于帽结构开始翻译的区域(结构)或者通过转录生成该区域的DNA链的区域(结构)。此外,本发明中,“编码内部核糖体进入位点的基因”是指通过转录生成该区域的DNA链的区域(结构)。内部核糖体进入位点一般被称为IRES (internal ribosome entrysite),在微小核糖核酸病毒科的病毒(脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、小鼠脑心肌炎病毒等)、口蹄疫病毒、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、冠状病毒、牛肠道病毒、泰勒氏小鼠脑脊髓炎病毒、柯萨奇病毒B型等病毒的5’非翻译区和人免疫球蛋白重链结合蛋白、果蝇触角足、果蝇超双胸等基因的5’非翻译区中被发现。微小核糖核酸病毒的情况下,其IRES是由存在于mRNA的5’非翻译区的约450bp形成的区域。在这里,“病毒的5’非翻译区”是指病毒的mRNA的5’非翻译区或通过转录生成该区域的DNA链的区域(结构)。本发明中,内部核糖体进入位点只要在哺乳动物细胞内、特别是来源于中国仓鼠的卵巢的细胞(CH0细胞)内起到内部核糖体进入位点的作用即可,无特别限定,可以使用任一种位点。其中,可优选例举来源于病毒的5’非翻译区的内部核糖体进入位点,更优选例举来源于微小核糖核酸病毒科的病毒的5’非翻译区的内部核糖体进入位点,进一步更优选例举来源于小鼠脑心肌炎病毒的5’非翻译区的内部核糖体进入位点。本发明中,内部核糖体进入位点可直接使用具有野生型的碱基序列的位点。此外,这些野生型的内部核糖体进入位点的碱基序列中加入了I个或2个以上的突变(指例如置换、缺失或/和插入等)的突变型的内部核糖体进入位点也只要在哺乳动物细胞内(特别是CHO细胞内)起到内部核糖体进入位点的作用,可以使用任一种位点。此外,还可以使用融合了 2个以上的内部核糖体进入位点的嵌合体型的内部核糖体进入位点。
此外,本发明中,通过在内部核糖体进入位点的控制下配置编码谷氨酰胺合成酶的基因(GS基因),可调节GS基因的表达量。如果通过所述调节将GS基因的表达量调节至筛选培养中可获得足够的选择压力的一定范围内的量,如后所述,可筛选出以高水平表达重组体蛋白质的哺乳动物细胞。调节GS基因的表达量的情况下,通过从各种内部核糖体进入位点中适当选择使GS基因的表达量进一步增加或进一步减少的内部核糖体进入位点使用,可实现该目的。此夕卜,通过在内部核糖体进入位点中加入突变,也可实现该目的。该情况下,对加入该突变的位置等无特别限定,只要可将存在于内部核糖体进入位点的下游的GS基因的表达量调节至一定范围内的量即可,可以是任意条件。例如,为了使GS基因的表达量减少而加入突变的情况下,存在于野生型的内部核糖体进入位点的能用作翻译起点的多个起始密码子(ATG)可成为靶位。例如,通过突变破坏这些起始密码子,可使整合至与这些起始密码子同一阅读框内的GS基因的表达量减少。在这里,“破坏”是指通过向某一基因序列中加入突变而使该基因序列本来具有的功能无法发挥。例如,在野生型的小鼠脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点的3’末端存在3个起始密码子(ATG),将其序列示于序列编号1(5’ -ATGataatATGgccacaaccATG-3’:起始密码子为了明确表示而以大写字母表示)。使该存在于内部核糖体进入位点的下游的GS基因的表达量减少的情况下,加入突变破坏的起始密码子较好是自5’侧第2个和第3个的起始密码子,更好是第2个起始密码子。因此,作为这样的加入了突变的内部核糖体进入位点,可例举例如其3’末端为序列编号2(5’ -atgataatnnngccacaaccnnn-3’:n为任意的碱基)或序列编号32(5’ -atgataannnngccacaaccnnn-3’:n为任意的碱基)的碱基序列或者序列编号 3(5’ -atgataatnnngccacaaccatg-3’:n 为任意的喊基)或序列编号 33(5’ -atgataannnngccacaaccatg-3’:n为任意的碱基)的碱基序列。更具体为其3’末端为序列编号4(5’ -atgataagcttgccacaaccatg-3’ )的碱基序列的内部核糖体进入位点,自5’侧第2个的起始密码子通过突变被破坏。更具体来说,野生型的小鼠脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点包含序列编号5 (5’ -cccccccccctctccctcccccccccctaacgttactggccgaagccgcttggaataag gccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataatatggccacaaccatg-3> )的喊基序 列。此外,作为在该碱基序列中加入了突变的序列,可例举序列编号6(5’-CCCCCCCCCCtCtCcctcccccccccctaacgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataagcttgccacaaccatg-3’ )的减基序列。此外,也可以通过其它方法调节存在于野生型和/或突变型的内部核糖体进入位点的下游的GS基因的表达量。例如,使GS基因的表达量减少的情况下,通过将GS基因整合至与这些内部核糖体进入位点的起始密码子同一阅读框或者将抑制转录或翻译的碱基序列导入内部核糖体进入位点与存在于其下游的GS基因之间,也可以使该基因的表达量减少。抑制转录的碱基序列只要抑制整合至内部核糖体进入位点的下游的GS基因的转录的序列即可,无特别限定,例如有聚合酶加尾信号(5,-aataaa-3’ )等。此外,抑制翻译的碱基序列只要是抑制整合至内部核糖体进入位点的下游的该基因的翻译的序列即可,无特别限定,例如有诱导通读的终止密码子等妨碍正确翻译的序列等。本发明中,提到“谷氨酰胺合成酶”时,只要是可由谷氨酸和氨合成谷氨酰胺的酶即可,无特别限定,可以是来源于包括哺乳动物、爬虫类、鸟类、两栖类、属于鳞翅目(Lepidoptera)的香蛾(Bombyx mori)、草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)、尺蠖(Geometridae)等、属于双翅目(Diptera)的果蚬(Drosophila)等昆虫、原核生物、线虫、酵母、放线菌、丝状菌、子囊菌、担子菌和植物在内的任何生物,较好是哺乳动物的谷氨酰胺合成酶,可优选使用来源于人或中国仓鼠的谷氨酰胺合成酶(特别是来源于CHO细胞的谷氨酰胺合成酶)。此外,提到“谷氨酰胺合成酶抑制剂”时,只要可抑制上述谷氨酰胺合成酶的活性即可,无特别限定,可使用任一种酶,可优选例举蛋氨酸磺酸盐(MSX)。

本发明中,表达载体中除GS基因外可导入追加的筛选标记物基因。该追加的筛选标记物基因是可赋予导入表达载体的哺乳动物细胞以耐药性的基因(耐药性基因)。本发明中,可用作耐药性基因的基因只要是可赋予哺乳动物细胞以耐药性的基因即可,无特别限定,较好是可赋予细胞以对于嘌呤霉素、潮霉素、杀稻瘟素、新霉素等药剂的抗性的基因。其中,嘌呤霉素、潮霉素、杀稻瘟素、新霉素等药剂分别为“与耐药性基因对应的药剂”。这些耐药性基因中,可更优选例举嘌呤霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、杀稻瘟素抗性基因、新霉素抗性基因。本发明中,对于耐药性基因,通过设置与重组体蛋白质受到其控制的基因表达调控位点不同的其它基因表达调控位点(第二基因表达调控位点)并整合至其下游,可控制表达量。该情况下,该第二基因表达调控位点可使用能将耐药性基因的表达量调节至筛选培养中可获得足够的选择压力的一定范围内的量。即,通过相对抑制耐药性基因的表达量,可提高通过表达载体转化了的哺乳动物细胞对药剂的感受性,由此可筛选出以高水平表达编码所需蛋白质的基因而以高水平生产该重组体蛋白质的哺乳动物细胞。此外,本发明中,耐药性基因可介以位于其上游的第二内部核糖体进入位点整合至编码重组体蛋白质的基因与内部核糖体进入位点之间的区域或GS基因的下游的区域。由此,可通过第二内部核糖体进入位点控制耐药性基因的表达量。该情况下,作为第二内部核糖体进入位点,可使用与GS基因的上游的内部核糖体进入位点相同的位点,也可使用其它位点。此外,第二内部核糖体进入位点可从上述各种内部核糖体进入位点任意选择。对于第二内部核糖体进入位点,如上所述,可通过选择适当的位点或加入突变等来调节耐药性基因的表达量。本发明中,对于整合至表达载体的编码重组体蛋白质的基因的动物种类,包含来源于包括人的哺乳动物的基因,无特别限定。例如,将本发明的载体用于医疗用医药品的制造时,该基因基本上来源于人,用于家畜用医药品的制造时,基本上是来源于作为治疗对象的家畜的基因。此外,对该编码所需蛋白质的基因的种类也无特别限定,较好是编码α-半乳糖苷酶Α、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、葡糖脑苷脂酶、加硫酶、a-L-艾杜糖醛酸酶、酸性α -葡糖苷酶等溶酶体酶、组织型纤溶酶原激活物(t-PA)、凝血因子VI1、凝血因子珊、凝血因子IX等凝血因子、红细胞生成素、干扰素、血栓调节蛋白、卵泡刺激素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或者各种抗体药品的基因,更好是编码溶酶体酶和红细胞生成素的基因,进一步更好是编码葡糖脑苷脂酶和红细胞生成素的基因。本发明中,导入表达载体的哺乳动物细胞只要可表达目标重组体蛋白质即可,无特别限定,可以是从取自生物体的脏器、肌肉组织、皮肤组织、结缔组织、神经组织、血液、骨髓等采集的细胞的初代培养细胞、继代培养细胞和即使继代培养也性状稳定而形成细胞株的细胞中的任一种。此外,细胞可以是正常细胞、癌细胞中的任一种。可特别优选使用的细胞是来源于中国仓鼠的卵巢的CHO细胞、来源于人的成纤维细胞和非洲绿猴的肾成纤维细胞的COS细胞。本发明中,表达载体向哺乳动物细胞的导入为了使编码重组体蛋白质的基因在哺乳动物细胞内表达而进行,只要可实现该目的,可使用任何的方法。表达载体通常为环状的质粒,它可以直接呈环状或用限制酶剪切成直线状后导入细胞。导入了表达载体的哺乳动物细胞(表达载体导入细胞)在添加了谷氨酰胺合成酶抑制剂(例如MSX等)的不含谷氨酰胺的培养基或低谷氨酰胺培养基(该情况下,进一步添加了与耐药性基因对应的药剂(例如抗生素等)的培养基)中培养,仅选择出细胞内GS基因(该情况下,耐药性基因)(所谓的筛选标记物)表达的细胞。将其称为筛选培养,这时使用的培养基称为筛选培养基。筛选培养中,表达的筛选标记物的量与所添加的GS抑制剂或药剂的量等相比过多的情况下,无法产生足够的选择压力,无法获得重组体蛋白质的表达量相对较多的表达载体导入细胞;另一方面,表达的筛选标记物的量极端过少的情况下,细胞死亡或无法充分增殖,还是无法获得表达量相对较多的表达载体导入细胞。但是,如果可通过将表达的筛选标记物的量调节至一定范围内的量而提高对GS抑制剂或药剂的感受性获得足够的选择压力,则如下所述,可获得重组体蛋白质的表达量相对较多的表达载体导入细胞。S卩,将表达的筛选标记物的量调节至一定范围内的量而使得在筛选培养中可获得足够的选择压力后,通过使添加至筛选培养基中的GS抑制剂的浓度(该情况下,进一步为与耐药性基因对应的药剂的浓度)分阶段上升,可筛选出筛选标记物的表达量更多的表达载体导入细胞。这是由于筛选培养的过程中,表达载体导入细胞的基因组中整合的筛选标记物的数量通过复制而增加,仅筛选标记物的表达量相对增加了的表达载体导入细胞选择性增殖等原因。这时,整合至表达载体的编码重组体蛋白质的基因的拷贝数也增加,所以该基因的表达量也增加。因此,通过像这样筛选培养表达载体导入细胞,可筛选出所需重组体蛋白质的表达量相对较多的表达载体导入细胞。本说 明书中,将这样筛选出的表达载体导入细胞称为转化细胞。
本发明中,将作为筛选标记物整合了 GS基因以及耐药性基因的表达载体导入哺乳动物细胞的情况下,可筛选出表达量比仅整合了 GS基因的情况更多的转化细胞。本发明中,使添加至筛选培养基中的GS抑制剂或与耐药性基因对应的药剂的浓度分阶段上升的情况下,例如GS抑制剂为蛋氨酸磺酸盐时,其最大浓度较好是100 1000 μ Μ,更好是200 500 μ Μ,进一步更好是约300 μ Μ。或者,药剂为嘌呤霉素时,其最大浓度较好是3 30 μ Μ,更好是5 20 μ Μ,进一步更好是约10 μ Μ。
实施例以下,参照实施例对本发明进行更详细的说明,但本发明并不限定于实施例。[pE-neo载体和pE-hygr载体的构建]将pEF/myc/nuc载体(英杰公司(、y ^卜口夕工 >社))用Kpn I和Nco I进行消化,切出包含EF-1启动子及其第一内含子的区域,将其用T4DNA聚合酶进行平端化处理。将pC1-neo (英杰公司)用Bgl II和EcoR I进行消化,切除包含CMV的增强子/启动子和内含子的区域后,用T4DNA聚合酶进行平端化处理。向其中插入上述的包含EF-1a启动子及其第一内含子的区域,构筑pE-neo载体(图1-1和图1_2)。将pE-neo载体用Sfi I和BstX I进行消化,切除包含新霉素抗性基因的约Ikbp的区域(图2-1)。将pcDNA3.1/Hygro (+)(英杰公司)作为模板用引物Hyg-Sfi5’(5’-gaggccgcctcggcctctga-3,,序列编号 7)和引物 Hyg-Bst X 3,(5,_aaccatcgtgatgggtgctattcctttgc-3’,序列编号8),通过PCR反应扩增潮霉素基因(图2-2)。将扩增得到的潮霉素基因用Sfi I和Bst XI进行消化,插入上述的pE-neo载体中,构建pE_hygr载体(图2_3)。[pE-1RES-GS-puro 的构建]将表达载体pPGKIH (Miyahara M.等,J.Biol.Chem.275,613-618 (2000))用限制酶(Xho I和BamH I )进行消 化,切出包含来源于小鼠脑心肌炎病毒(EMCV)的内部核糖体进入位点(IRES)、潮霉素抗性基因(Hygr基因)和小鼠磷酸甘油酸激酶(mPGK)的聚腺苷酸化区域(mPGKpA)的喊基序列 IRES-Hygr-mPGKpA (5’-CTCGAGgaattcactccttcaggtgcaggcttgcctatcagaaggtggtggctggtgtggccaactggctcacaaataccactgagatcgacggtatcgataagcttgatatcgaattcCGCCCCCCCCCCCTC TCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCatgaaaaagcctgaactcaccgcgacgtctgtcgagaagtttctgatcgaaaagttcgacagcgtctccgacctgatgcagctctcggagggcgaagaatctcgtgctttcagcttcgatgtaggagggcgtggatatgtcctgcgggtaaatagctgcgccgatggtttctacaaagatcgttatgttcatcggcactttgcatcggccgcgctcccgattccggaagtgcttgacattggggaattcagcgagagcctgacctattgcatctcccgccgtgcacagggtgtcacgttgcaagacctgcctgaaaccgaactgcccgctgttctgcagccggtcgcggaggccatggatgcgatcgctgcggccgatcttagccagacgagcgggttcggcccattcggaccgcaaggaatcggtcaatacactacgtggcgtgatttcatatgcgcgattgctgatccccatgtgtatcactggcaaactgtgatggacgacaccgtcagtgcgtccgtcgcgcaggctctcgatgagctgatgctttgggccgaggactgccccgaagtccggcacctcgtgcacgcggatttcggctccaacaatgtcctgacggacaatggccgcataacagcggtcattgactggagcgaggcgatgttcggggattcccaatacgaggtcgccaacatcttcttctggaggccgtggttggcttgtatggagcagcagacgcgctacttcgagcggaggcatccggagcttgcaggatcgccgcggctccgggcgtatatgctccgcattggtcttgaccaactctatcagagcttggttgacggcaatttcgatgatgcagcttgggcgcagggtcgatgcgacgcaatcgtccgatccggagccgggactgtcgggcgtacacaaatcgcccgcagaagcgcggccgtctggaccgatggctgtgtagaagtactcgccgatagtggaaaccgacgccccagcactcgtccgagggcaaaggaatagTCGA·GaaattgatgatctattaagcaataaagacgtccactaaaatggaagtttttcctgtcatactttgttaagaagggtgagaacagagtacctacattttgaatggaaggattggagctacgggggtgggggtggggtgggattagataaatgcctgctctttactgaaggctctttactattgctttatgataatgtttcatagttggatatcataatttaaacaagcaaaaccaaattaagggccagctcattcctccactcacgatctatagatccactagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagcGGATCC-3’,序列编号9 ;5’端的以大写字母表不的序列CTCGAG为“Xho I位点”,其后由以大写字母表示的自CGC开始的序列及接着该序列的3个小写字母(atg)形成的区域为“包含来源于小鼠脑心肌炎病毒的5’非翻译区的内部核糖体进入位点的碱基序列”,自该atg开始以小写字母表示的区域为“编码潮霉素抗性基因的碱基序列”,其后的以小写字母表示的自aaa开始的区域为“包含小鼠磷酸甘油酸激酶(mPGK)的聚腺苷酸化区域的碱基序列”,以及3’端的以大写字母表示的序列GGATCC为“BamH I位点”的DNA片段(与Hygr基因对应的氨基酸序列以序列编号10表示)。将该DNA片段插A pBluescript SK (-)(斯垂塔基因公司(Stratagene社))的Xho I和BamH I之间,将其记作 pBSK(IRES-Hygr-m PGKpA)(图 3-1)。将pBSK(IRES-Hygr-mPGKpA)作为模板用引物 IRES5’(5’_caactcgagcggccgccccccccccctctccctcccccccccctaacgttact-3,,序列编号 11)和引物 IRES3,(5J-caagaagcttccagaggaactg-3’,序列编号12)通过PCR使包含EMCV的IRES的一部分的DNA片段扩增。将该DNA 片段用限制酶(Xho I 和 Hind III)进行消化,插入 pBSK (IRES-Hygr-mPGKpA)的 Xho I和 Hind III之间,将其记作 pBSK(Notl-1RES-Hygr-mPGKpA)(图 3_2)。将pBSK(Notl-1RES-Hygr-mPGKpA)用限制酶(Not I 和 BamH I )进行消化,插入pE-hygr载体的Not I和BamH I之间,将其记作质粒pE-1RES-Hygr (图3-3)。将表达载体pPGKIH 作为模板用引物 mPGKP5’(5’-gcgagatcttaccgggtaggggaggcgctt-3’,序列编号 13)和引物mPGKP3’(5’-gaggaattcgatgatcggtcgaaaggcccg_3,,序列编号14)通过PCR使包含mPGK的启动子区域(mPGKp)的碱基序列(5’-GCGagatctTACCGGGTAGGGGAGGCGCTTTTCCCAAGGCAGTCTGGAGCATGCGCTTTAGCAGCCCCGCTGGGCACTTGGCGCTACACAAGTGGCCTCTGGCCTCGCACACATTCCACATCCACCGGTAGGCGCCAACCGGCTCCGTTCTTTGGTGGCCCCTTCGCGCCACCTTCTACTCCTCCCCTAGTCAGGAAGTTCCCCCCCGCCCCGCAGCTCGCGTCGTGCAGGACGTGACAAATGGAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTCGTGCAGATGGACAGCACCGCTGAGCAATGGAAGCGGGTAGGCCTTTGGGGCAGCGGCCAATAGCAGCTTTGCTCCTTCGCTTTCTGGGCTCAGAGGCTGGGAAGGGGTGGGTCCGGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGGCGGGCGCCCGAAGGTCCTCCGGAGGCCCGGCATTCTGCACGCTTCAAAAGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTCTCCTCTTCCTCATCTCCGGGCCTTTCGACCgatcatcGAATTCctc-3’,序列编号 15 ;自 5’末端起最初以小写字母表示的序列agatct为“Bgl II位点”,接在其后的以大写字母表示的自TAC开始的序列为“包含小鼠磷酸甘油酸激酶基因的启动子区域的碱基序列”,以及其后以大写字母表示的序列GAATTC为“EcoR I位点”)的DNA片段扩增。将该DNA片段用限制酶(Bgl II和EcoR I )进行消化,插入pC1-neo (普洛麦格公司(Promega社))的Bgl II和EcoR I之间,将其记作pPGK-neo (图3-4)。将pE-1RES-Hygr用限制酶(Not I和BamH I )进行消化而切出DNA片段(IRES-Hygr),插入 pPGK-neo 的 Not I 和 BamH I 之间,将其记作 pPGK-1RES-Hygr (图 3-5)。由CHO-Kl 细胞制备 cDNA,将其作为模板用引物GS5’(5’_aatatggccacaaccatggcgacctcagcaagttcc-3’,序列编号 16)和引物 GS3’(5’-ggaggatccctcgagttagtttttgtattggaagggct-3’,序列编号17)通过PCR使包含GS基因的DNA片段扩增。将该DNA片段用限制酶(Bal I和BamH I )进行消化,插入pPGK-1RES-Hygr的Bal I和BamH I之间,将其记作pPGK-1RES-GS-ApolyA(图 3-6)。将pCAGIPuro (Miyahara Μ.等,J.Biol.Chem.275,613-618 (2000))作为模板用引物 puro5’(5’-gcttaagatgaccgagtacaagcccacg_3,,序列编号 18)和引物 puro3’(5’_cccatcgtgatggtcaggcaccgggcttgc-3’,序列编号19)通过PCR使包含嘌呤霉素抗性基因(puro基因)的碱基序列(5’-GcttaagATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCAGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGATCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCCGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTGAccatcacgatggG-3’,序列编号20 ;自5’端起最初以小写字母表不的序列cttaag为“Afl II位点”,接在其 后的以大写字母表示的自ATG开始的序列为“编码嘌呤霉素抗性基因(pur ο基因)的碱基序列”,其后以小写字母表示的序列为“Bst XI位点”)的DNA片段扩增(与puro基因对应的氨基酸序列以序列编号21表示)。将该DNA片段用限制酶(Afl II和Bst XI)进行消化,插入表达载体pE-neo的Afl II和Bst XI之间,将其记作pE-puro (图3-7)。将pE-puro 作为模板用引物 SV40polyA5’(5,-caacaagcggccgccctcgagttccctttagtgagggttaatgc-3,,序列编号 22)和引物 SV40polyA3,(5,-cccctgaacctgaaacataaaatg_3’,序列编号23)通过PCR使包含SV40后期聚腺苷酸化区域的D NA片段扩增。将该DNA片段用限制酶(Not I和Hpa I )进行消化,插入表达载体pE-puro的Not I和Hpa I之间,将其记作 pE-puro (Xho I )(图 3-8)。将pPGK-1RES-GS- Δ polyA用限制酶(Not I和Xho I )进行消化,切出包含IRES-GS区域的DNA片段,将其插入表达载体pE-puro (Xho I )的Not I和Xho I之间,将其记作 pE-1RES-GS-puro (图 3_9)。[pE-mlRES-GS-puro 的构建]
将表达载体pE-1RES-GS-puro 作为模板用引物 mIRES_GS5’(5’_acacgatgataagcttgccacaacc-3’,序列编号 24)和引物 mIRES_GS3’(5’-ctccacgatatccctgccata_3,,序列编号25)通过PCR使EMCV的自IRES至GS的区域扩增,使在EMCV的位于自IRES的5’侧第2个的起始密码子(ATG)加入突变而破坏的DNA片段扩增。将表达载体pE-1RES-GS-puro作为模板,使用该DNA片段和上述的引物IRES5’通过PCR使包括自IRES至GS区域的DNA片段扩增。将该DNA片段用限制酶(Not I和Pst I )进行消化,将所切出的DNA片段插入表达载体 pE-1RES-GS-puro 的 Not I 和 Pst I 之间,将其记作 pE-mlRES-GS-puro (图 4)。[pE-mlRES-GS 的构建]将表达载体pE-neo 作为模板用引物 SV40polyA5’(5’ -actaactcgagttccctttagtg-3,,序列编号 26)和引物 SV40polyA3’ (5,-aacggatccttatcggattttaccac-3’,序列编号27)通过PCR使包含SV40polyA区域的DNA片段扩增。将该DNA片段用限制酶(Xho I和BamH I )进行消化,插入pE-mlRES-GS-puro的Xho I和BamH I之间,将其记作pE-mlRES-GS(图 5)。[人葡糖脑苷脂酶(hGBA)表达载体的构建]将人肝脏快速克隆(Quick Clone) cDNA(克隆泰克公司(Clontecl^J;))作为模板用引物 hGBA5,(5,-gcaatacgcgtccgccaccatggagttttcaagtccttccagagagg-3,,序列编号28)和引物 hGBA3’(5,-ggacgcggccgcgagctctcactggcgacgccacaggtagg-3’,序列编号 29)通过PCR使包含人葡糖脑苷脂酶基因(hGBA基因)的DNA片段扩增。将该DNA片段用限制酶(Mlu I 和 Not I )进行消化,插入 pE-1RES-G S-puro、pE-mIRES_GS 和 pE-mlRES-GS-puro的 Mlu I 和 Not I 之间,分别记作 GBA 表达载体 pE-1RES-GS-puro (GBA)、pE-mIRES_GS (GBA)和 pE-mIRES-GS-pur o(GBA)。[人红细胞生成素(hEPO)表达载体的构建]
将pC1-neo (EPO)作为模板用引物 hEP05’(5,-aagacgcgtcgccaccatgggggtgcacgaatgtcctgc-3,,序列编号 30)和引物 hEP03,(5,-aagagcggccgctcatctgtcccctgtcctgcagg_3’,序列编号31)通过PCR使包含hEPO基因的DNA片段扩增。将该DNA片段用限制酶(Mlu I 和 Not I )进行消化,插入 pE-1RES-GS-puro 和 P E-mlRES-GS-puro 的 Mlu I 和Not I 之间,分别记作 hEPO 表达载体 pE-1RES-GS -puro (EPO)和 pE-mlRES-GS-puro (EPO)。[hGBA表达细胞和hEPO表达细胞的制备]向来源于中国仓鼠的卵巢的CHO-Kl细胞中使用Lipof ectamine2000试剂(英杰公司(Invitrogen 社))分别导入 pE-1RES-GS-puro (GBA)、pE-mlRES-GS(GBA)、pE-mlRES-GS-puro (GBA)、pE-1RES_GS-puro (EPO)和 pE-mlRES-GS-puro (EPO)。将这些细胞用筛选培养基进行筛选培养,获得hGBA表达转化细胞和hEPO表达转化细胞。这时,导入了pE-1RES-GS-puro (GBA)、pE-mlRES-GS-puro (GBA)、pE-1RES-GS-puro (EPO)和pE-mlRES-GS-puro (EPO)的细胞的筛选培养中使用含蛋氨酸磺酸盐(西格玛公司(SIGMA社))和嘌呤霉素(西格玛公司)的CD Opti CHO培养基(英杰公司)作为筛选培养基,导入了 pE-mlRES-GS (GBA)的细胞的筛选培养中使用含蛋氨酸磺酸盐(西格玛公司)的CD Opti CHO培养基(英杰公司)作为筛选培养基。筛选培养时,使蛋氨酸磺酸盐和嘌呤霉素的浓度分阶段上升,最终使蛋氨酸磺酸盐的浓度为300 μ Μ,嘌呤霉素的浓度为10 μ g/mL,使呈现耐药性的细胞选择性增殖。通过该筛选培养获得3种hGBA表达转化细胞和2种hEPO表达转化细胞。[hGBA表达细胞的培养和细胞密度的测定]将筛选培养得到的转化细胞以2 X IO5个/mL的细胞密度用含300 μ M蛋氨酸磺酸盐和10 μ g/mL嘌呤霉素的5mL⑶Opti CHO培养基在5% CO2存在下培养12天。培养温度自培养开始至第3天为止设定为37°C,然后设定为30°C。在培养的第4、7、10和12天对培养上清进行采样,测定细胞密度。其中,导入pE-mlRES-GS(GBA)得到的hGBA表达转化细胞的培养使用含300 μ M蛋氨酸磺酸盐的5mL⑶Opti CHO培养基进行。[hEPO表达细胞的培养和细胞密度的测定]将筛选培养得到的转化细胞以2 X IO5个/mL的细胞密度用含300 μ M蛋氨酸磺酸盐和10 μ g/mL嘌呤霉素的5mL⑶Opti CHO培养基在5% CO2存在下培养7天。培养温度自培养开始至第3天为止设定为37°C,然后设定为30°C。在培养的第7天对培养上清进行采样,测定细胞密度。[hGBA的活性测定]GBA活性测定将 Pasmanik-Chor M.等,Biochem J317, 81-88 (1996)中记载的方法作为参考实施。将磷酸-4-甲基伞形酮酯(4-MUF,西格玛化学公司(Sigma Chemical C0.)制)溶解于稀释用缓冲液(含0.125%牛磺胆酸钠、0.15% Triton Χ_100、0.1%牛血清白蛋白的IOOmM磷酸钾缓冲液(ρΗ5.96))后,进行梯度稀释,制成200、100、50、25、12.5、6.25和3.125mM浓度的标准溶液。将4-甲基伞形酮-β-D-吡喃葡糖苷(西格玛化学公司制)按照4mM的浓度溶解于稀释用缓冲液,将其作为底物溶液。检测样本根据需要在测定前用稀释用缓冲液稀释。向Fluoroplate F96中分别加入10 μ L4MUF标准溶液或检测标本后,加入70 μ L底物溶液混合。在37 V反应I小时后,向各孔中分别加入200 μ L作为反应终止液的50mM甘氨酸-NaOH缓冲液(pH10.6)后,用Fluoroplate读板机以激发波长355nm、检测波长460nm的条件测定荧光强度。根据4-MUF标准溶液的荧光强度绘制校正曲线,将各检测样本的突光强度内插至校正曲线中,算出活性(nmol/h/mL)。[采用ELISA法的hEPO的定量]由用重组体hEPO免疫了的兔的血液通过常规方法获得兔抗hEPO抗体溶液。重组体hEPO将国际公开公报(W02008/068879)中所记载的方法作为参考制成。将兔抗hEPO抗体溶液以每孔100 μ L加入96孔板,在4°C静置I小时使抗体固定于板。弃去液体后,将含
0.075% 吐温 20 的 1% BSA/TBS-T 溶液(Tris:0.005M, NaCl:0.138M, KC1:0.0027M,ρΗ8.0)以每孔100 μ L加入板中,在4°C静置I小时对板进行封闭。弃去液体,将板用含0.075%吐温20的TBS-T溶液清洗3次后,将稀释至适当浓度的检测标本以每孔100 μ L加入板中,在37°C静置I小时。这时,将通过Lowry法定量的自制的hEPO稀释至I 16ng/mL的浓度的溶液作为标准溶液,与检测标本同样加入板中静置。弃去液体,与上述同样清洗板后,将HRP标记的小鼠抗hEPO单克隆抗体(安迪生物科技公司(R&D社)制)作为二次抗体以每孔100 μ L加入板中,在37°C静置I小时。与上述同样清洗板后,加入HRP底物(普洛麦格公司(:/ 口 ^力'社)),在37°C静置15分钟后,加入盐酸停止反应。通过微孔板阅读仪测定450nm的吸光度,根据与标准溶液的吸光度的比较求出检测标本的hEPO浓度。[结果] 如上所述,将导入了作为依次整合有作为基因表达调控位点的延伸因子Ia启动子(EF-lp)、作为编码蛋白质的基因的人葡糖脑苷脂酶(hGBA)基因、作为内部核糖体进入位点的含示于序列编号4的碱基序列的来源于突变型小鼠脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点(EMCV-mlRES)和编码谷氨酰胺合成酶的基因(GS基因)的表达载体的pE-mlRES-GS (GBA)的CHO细胞用筛选培养基进行培养,测定培养基中的hGBA的活性,并测定细胞密度。实验独立进行4次(细胞团I 4)。细胞密度在4次中都在培养第7天达到约2.5 X IO6个/mL(图6_1)。另一方面,对于培养基中的hGBA活性,可知细胞团2在培养第10天达到30 μ mol/h/mL(图6_2),使用pE_mIRES-GS (GBA)转化CHO细胞,从而获得以高水平表达hGBA的细胞。但是,细胞团I和3中,培养基中的hGBA的活性极低,提示使用pE-mIRES-GS (GBA)的情况下,用筛选培养基培养后的细胞中以相当大的比例包含hGBA的表达量低的细胞。接着,将导入了作为依次整合有作为基因表达调控位点的EF-lp、作为编码蛋白质的基因的hGBA基因、作为内部核糖体进入位点的含示于序列编号I的碱基序列的来源于野生型小鼠脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点(EMCV-1RES)和GS基因以及作为耐药性基因的嘌呤霉素抗性基因(puro基因)的表达载体的pE-1RES-GS-puro (GBA)的CHO细胞用筛选培养基进行培养,测定培养基中的hGBA的活性,并测定细胞密度。实验独立进行3次(细胞团I 3)。细胞密度在3次中都在培养第7天达到约3 4X IO6个/mL,特别是细胞团3超过了 4X106个/mL(图7_1右侧)。另一方面,对于培养基中的hGBA活性,可知3次都在培养第10天达到5 10 μ mol/h/mL (图7_2右侧),使用pE-1RES-GS-puro (GBA)转化CHO细胞,从而获得以高水平表达hGBA的细胞。接着,将导入了作为依次整合有作为基因表达调控位点的EF-lp、作为编码蛋白质的基因的hGBA基因、作为内部核糖体进入位点的EMCV-mlRES和GS基因以及作为耐药性基因的puro基因的表达载体的pE-mlRES-GS-puro (GBA)的CHO细胞用筛选培养基进行培养,测定培养基中的hGBA的活性,并测定细胞密度。实验独立进行3次(细胞团I 3)。细胞密度在3次中都在培养第7天达到约2 3X IO6个/mL(图7_1左侧)。另一方面,对于培养基中的hGBA活性,可知3次都在培养第10天达到15 25 μ mol/h/mL (图7_2左侧),其表达量与使用pE-1RES-GS-puro (GBA)转化的CHO细胞的hGBA的表达量相比也明显更高,通过使用pE-mlRES-GS-pu ro (GBA)转化CHO细胞,可获得以极高水平表达hGBA的细胞。特别是细胞团3,在培养第12天hGBA的活性超过35 μ mol/h/mL,呈现极高水平的hGBA的表达。接着,将导入了作为依次整合有作为基因表达调控位点的EF-lp、作为编码蛋白质的基因的人红细胞生成素(hEPO基因)、作为内部核糖体进入位点的EMCV-1RES和GS基因以及作为耐药性基因的puro基因的表达载体的pE-1RES-GS-puro (EPO)的CHO细胞用筛选培养基进行培养,测定培养基中的hEPO的浓度,并测定细胞密度。实验独立进行2次(细胞团I 2)。细胞密度在2次中都在培养第7天达到约2 3X IO6个/mL(图8_1右侧)。另一方面,对于培养基中的hEPO浓度,可知在培养第7天hEPO的活性达到8 18 μ g/mL (图8-2右侧),使用pE-1RES-GS-puro (EPO)转化CHO细胞,从而获得以高水平表达hEPO的细胞。接着,将导入了作为依次整合有作为基因表达调控位点的EF-lp、作为编码蛋白质的基因的hEPO基因、作为内部核糖体进入位点的EMCV-mlRES和GS基因以及作为耐药性基因的puro基因的表达载体的pE-mlRES-GS-puro (EPO)的哺乳动物细胞用筛选培养基进行培养,测定培养基中的hEPO的浓度,并测定细胞密度。实验独立进行2次(细胞团I 2)。细胞密度在2次中都在培养第7天达到约2.5 3X IO6个/mL(图8_1左侧)。另一方面,对于培养基中的hGBA浓度,可知2次都在培养第7天hEPO的活性达到约63 μ g/mL (图8_2左侧),其表达量与使用pE-1RES-GS-puro (EPO)转化的CHO细胞的hGBA的表达量相比也明显更高,通过使用pE-mlRES-GS-puro (EPO)转化CHO细胞,可获得以极高水平表达hEPO的细胞。这些结果表示依次在基因表达调控位点的下游整合有编码所需蛋白质的基因、具有序列编号I或4的碱基序列的内部核糖体进入位点、谷氨酰胺合成酶的表达载体或者依次在基因表达调控位点的下游整合有编码所需蛋白质的基因、具有序列编号I或4的碱基序列的内部核糖体进入位点、谷氨酰胺合成酶以及耐药性基因的表达载体为使编码这些蛋白质的基因以高水平表达的表达载体。特别是表示依次在延伸因子Ia启动子的下游整合有编码蛋白质的基因、具有序列编号4的碱基序列的内部核糖体进入位点、谷氨酰胺合成酶以及作为耐药性基因的嘌呤霉素抗性基因的表达载体为使编码该蛋白质的该基因以高水平表达的表达载体。产业上利用的可能性如果采用本发明,则可使用哺乳动物细胞使重组体蛋白质以高水平表达,所以,例如可大幅降低含重组体蛋白质的医疗用医药品的制造成本。符号的说明I LacZ 启动子2 mPGK 启动子3含示 于序列编号I的碱基序列的来源于野生型小鼠脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点(EMCV-1RES)3a 含示于序列编号4的碱基序列的来源于突变型小鼠脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点(EMCV-mlRES)4 mPGK的聚腺苷酸化区域(mPGKpA)5 含EF-1p和第一内含子的碱基序列6 SV40后期聚聚腺苷酸化区域7 含SV40初期启动子的区域8 合成聚聚腺苷酸化区域9 含巨细胞病毒启动子的区域10 谷氨酰胺合成酶基因
权利要求
1.表达载体,它是用于使蛋白质表达的表达载体,其特征在于,包括基因表达调控位点以及位于其下游的编码该蛋白质的基因、进一步位于下游的内部核糖体进入位点和进一步位于下游的编码谷氨酰胺合成酶的基因。
2.如权利要求1的表达载体,其特征在于,该基因表达调控位点选自来源于巨细胞病毒的启动子、SV40初期启动子、延伸因子I启动子。
3.如权利要求1或2的表达载体,其特征在于,该内部核糖体进入位点来源于选自微小核糖核酸病毒科的病毒、口 蹄疫病毒、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、冠状病毒、牛肠道病毒、泰勒氏小鼠脑脊髓炎病毒、柯萨奇病毒B型病毒、人免疫球蛋白重链结合蛋白基因、果蝇触角足基因、果蝇超双胸基因的病毒或基因的5’非翻译区。
4.如权利要求1或2的表达载体,其特征在于,该内部核糖体进入位点来源于微小核糖核酸病毒科的病毒的5’非翻译区。
5.如权利要求1或2的表达载体,其特征在于,该内部核糖体进入位点来源于小鼠脑心肌炎病毒的5’非翻译区。
6.如权利要求1 5中的任一项的表达载体,其特征在于,该内部核糖体进入位点是在野生型的内部核糖体进入位点的碱基序列中加入了 I个或2个以上的突变的位点。
7.如权利要求6的表达载体,其特征在于,在该内部核糖体进入位点存在多个起始密码子,其中的一部分被破坏。
8.如权利要求5的表达载体,其特征在于,该内部核糖体进入位点包含序列编号I的碱基序列。
9.如权利要求5的表达载体,其特征在于,该内部核糖体进入位点包含序列编号2的碱基序列。
10.如权利要求5的表达载体,其特征在于,该内部核糖体进入位点包含序列编号3的碱基序列。
11.如权利要求5的表达载体,其特征在于,该内部核糖体进入位点包含序列编号4的碱基序列。
12.如权利要求5的表达载体,其特征在于,该内部核糖体进入位点包含序列编号5的碱基序列。
13.如权利要求5的·表达载体,其特征在于,该内部核糖体进入位点包含序列编号6的碱基序列。
14.如权利要求1 13中的任一项的表达载体,其特征在于,在编码蛋白质的该基因与该内部核糖体进入位点之间的区域或编码谷氨酰胺合成酶的该基因的下游区域,除该内部核糖体进入位点之外,还包含其它内部核糖体进入位点及位于其下游的耐药性基因。
15.如权利要求1 13中的任一项的表达载体,其特征在于,除该基因表达调控位点之夕卜,还包含其它基因表达调控位点及位于其下游的耐药性基因。
16.如权利要求14或15的表达载体,其特征在于,该耐药性基因为嘌呤霉素抗性基因或新霉素抗性基因。
17.如权利要求1 16中的任一项的表达载体,其特征在于,编码蛋白质的该基因为来源于人的基因。
18.如权利要求17的表达载体,其特征在于,来源于人的该基因选自编码溶酶体酶、组织型纤溶酶原激活物(t-PA)、凝血因子、红细胞生成素、干扰素、血栓调节蛋白、卵泡刺激素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和抗体的基因。
19.如权利要求17的表达载体,其特征在于,来源于人的该基因为编码溶酶体酶的基因。
20.如权利要求19的表达载体,其特征在于,该溶酶体酶选自0-半乳糖苷酶々、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、葡糖脑苷脂酶、加硫酶、a-L-艾杜糖醛酸酶、酸性α-葡糖苷酶。
21.如权利要求17的表达载体,其特征在于,来源于人的该基因为编码红细胞生成素的基因。
22.哺乳动物细胞,其特征在于,通过权利要求1 21中的任一项的表达载体进行了转化。
23.如权利要求22的细胞,其特征在于,该哺乳动物细胞为CHO细胞。
24.使编码蛋白质的基因表达的转化细胞的制造方法,其特征在于,包括:将上述[1] [21]中的任一项的表达载体导入哺乳动物细胞的步骤;将导入了该表达载体的哺乳动物细胞在谷氨酰胺合成酶抑制剂的存在下或者谷氨酰胺合成酶抑制剂和与耐药性基因对应的药剂的存在下进行筛选培养的步骤。
全文摘要
本发明揭示了用于使重组体蛋白质在哺乳动物细胞内高效地表达的新表达载体、通过该载体转化的哺乳动物细胞及该哺乳动物细胞的制造方法。该表达载体包括基因表达调控位点以及位于其下游的编码该蛋白质的基因、进一步位于下游的内部核糖体进入位点和进一步位于下游的编码谷氨酰胺合成酶的基因。
文档编号C12N5/10GK103201382SQ20118005365
公开日2013年7月10日 申请日期2011年11月8日 优先权日2010年11月8日
发明者高桥健一 申请人:日本化学研究株式会社

最新回复(0)