控制细胞与基质结合的方法
专利名称：控制细胞与基质结合的方法
控制细胞与基质结合的方法
背景技术：
本发明涉及用于促进细胞黏附基质的方法，所述基质对于这些细胞通常无亲和性或仅有低亲和性。本发明还涉及使用非肌肉型肌球蛋白II抑制剂布雷他汀(Blebbistatin)和至少一个表面包被有与所述表面无亲和性或仅低亲和性的细胞的装置。现有抟术目前使用的大部分治疗型细胞(包括成人干细胞)以锚定/附着依赖性方式增殖，这也适用于可能的替代方式，例如胚胎干细胞和诱导性多能干细胞(iPS)。但是，所述增殖方式与规模和经济上的严重限制有内在关联。对于细胞扩增而言，细胞通常被接种至平面上，它们在数小时内附着于所述平面，增殖，并通过蛋白水解酶和/或移除钙来收获。附着不是均一过程，而是出现在特定的区域，即所谓黏着斑区域。一旦附着，细胞便通过内部马达蛋白施加张力。从而，细胞骨架变得有序且在多种过程中行使功能，包括运输、支架和细胞存活。细胞脱落后，这些随着马达蛋白建立的内部张力变化而快速收缩，而先前有序的内部结构(细胞骨架和其它)则受到扰乱。若无法再附着至表面，所述细胞则会启动称为附着依赖性凋亡/失巢凋亡的细胞死亡程序。US-A-20100009442 描述了 Rho相关卷曲激酶(ROCK)的抑制剂(例如Y-27632、H-1152或法舒地尔(Fasudil)),其是Rho GTP酶的效应分子且已知控制血管收缩和神经轴突延伸，可以用作凋亡/失巢凋亡抑制剂，从而促进多能干细胞，特别是胚胎干细胞的存活和/或增殖速率。ROCK抑制剂存在时，干细胞能在亚克隆或传代之前和/或之后培养而不添加饲养细胞和/或血清。负责产生细胞张力的主要细胞骨架马达蛋白是非肌肉型肌球蛋白II (称为肌球蛋白II)。Straight等(2003)鉴定了非肌肉型肌球蛋白II的特定小分子抑制剂，以试图详细分析胞浆移动。该高度活性的小分子抑制细胞起泡，称作“布雷他汀(Blebbistatin) ”。该化合物可透过细胞，良性，并且重要的是容易可逆。Walker等(2010)公开了布雷他汀用于增强人多能干细胞(包括人胚胎干细胞和诱导性多能干细胞)存活的应用。用布雷他汀处理提高人多能干细胞在克隆密度和悬浮条件下的存活率。此外，布雷他汀与合成基质联用可支持所述干细胞自我更新的确定环境。US-A-20100216181描述使用布雷他汀或ROCK抑制剂作为存活因子，在不含血清和饲养细胞的培养基中培养多能干细胞。这里，通过在旋转瓶或生物反应器内培养细胞来生成大量细胞。大量的附着依赖性细胞可以在生物反应器内或微载体(例如，珠)上产生，当所述细胞在悬浮条件下培养时，所述微载体可增加能使细胞得以生长的表面积。例如，从US-A-20100093083已知用于大量生产干细胞(包括多能和胚胎干细胞)的方法。本文中，所述细胞培养在内含多种微载体的无血清培养基中。所述细胞能够附着至所述微载体，并在控制条件下于生物反应器内扩增。所述培养基可额外补充有促进所述干细胞增殖和存活或防止分化的成分，例如，GSK3酶或MEK酶抑制剂。扩增后，使用酶促或非酶促细胞解离试剂从所述微载体上分离所述细胞。但是，该方法的缺点在于，只能使用对细胞具有充足亲和性的微载体。
发明内容
本发明的一个目标在于，提供用于促进细胞黏附基质的方法，这些细胞对所述基质通常无亲和性或仅有低亲和性。该目标通过一种方法解决，其中，由向所述细胞供给所述非肌肉型肌球蛋白II抑制剂布雷他汀来促进所述细胞对所述基质的黏附，从而使所述细胞能够附着对其不具足够亲和性的表面。令人吃惊的是，向所述细胞供给所述抑制剂可增强这些细胞附着通常对其无亲和性或仅有低亲和性的表面的能力。因此，可以以有利的方式将布雷他汀作为一种增强剂使用，所述增强剂使用户能够促进细胞附着特定基质，例如用于悬浮培养的微载体或覆盖例如Teflon &的表面。因此，布雷他汀是拓宽用于细胞培养的合适基质选择的有用工具，从而能优化并因此大幅改进依赖于细胞对微载体附着的细胞的培养方法。由于在待培养细胞能够附着的基质方面存在多许多的选择，这促进了培养条件的改进和优化。此外，可以通过向所述细胞添加布雷他汀来实现对用于其它需求但通常不适用于活细胞的合适基质(例如，一些医疗装置的表面)优化的定居表面。因此，用所述抑制剂处理所述细胞使这些细胞有能力在不适于培养这些细胞的表面上附着和增殖。通过本发明所述的方法，大幅拓宽了适用于培养和/或扩增细胞的基质(例如，微载体或医疗装置的)选择。布雷他汀是在施加至细胞培养物时使由缺少附着而引起的细胞死亡最小化并促进单细胞培养的小分子。对比ROCK抑制剂，布雷他汀用作非肌肉型肌球蛋白II的直接、非竞争性抑制剂。其不干扰复杂信号级联，而是直接靶向非肌肉型肌球蛋白II和其通过结合肌球蛋白-ADP-Pi复合物与肌动蛋白的相互作用。重要的是，布雷他汀是肌球蛋白II的易调整且易可逆(良性)抑制剂。布雷他汀增强细胞尤其是附着依赖性细胞附着对其不具有足够亲和性的表面的能力。因此，布雷他汀能用作控制细胞附着可能特定基质的黏附触发齐U。此外，布雷他汀大大增强严格依赖黏附的细胞的悬浮存活。所述物质可在需要时简易地添加至培养基。在本发明的一个优选实施方式中，所述基质是非粘性材料或至少部分包被有非粘性材料。所述非粘性材料可包括聚四氟乙烯(PTFE,商品名(DuPont):Teflonw )、聚氟乙烯(PFE)、全氟烷氧基(PFA)、氟化乙烯丙烯(FEP)、二氧化钛复合物或包含二氧化钛的组合物，或其任何组合。优选地，所述基质是医疗装置的表面，所述医疗装置优选是支架、贴片或人造血管或器官。例如为了避免血细胞、蛋白或类似物的不需要附着，所述装置通常由不适于细胞培养的材料制成或包被，所以通常难以使细胞定居所述装置。但是，有些时候希望用活细胞(优选干细胞)覆盖所述装置，从而其可用作移植物、取代组织、修补探针等。并且，通过用自体同源的细胞覆盖移植物可以有效抑制免疫系统对所述移植物的排斥。如本发明所述，通过向细胞提供布雷他汀可有利地使细胞能够在医疗装置上定居，从而准备并改进这些装置用于若干医疗应用。
在本发明的另一个优选实施方式中，所述基质是多种微载体，从而使所附着所述基质的细胞能够在悬浮条件下培养。在该实施方式中，增加细胞得以生长的表面积，从而细胞在悬浮条件下(优选在合适的生物反应器中)培养时能在微载体(优选合适的珠)上大量生产。如本发明所述，可以使用市售可得的微载体诸如Cytodex (通用电气医疗集团(GEHealthcare)，GB)、Hillex(索罗希尔公司(SoloHill),美国)或类似物,包括但不限于通过改变温度优选通过降低温度移出细胞的温控微载体。对于细胞扩增，可向现有培养物添加额外微载体，从而提供额外的附着区域以增加细胞数量。因此，仅通过添加更多微载体来容易地实现细胞培养物的扩增。对于具体应用而言，使用不同尺寸微载体可能是有益的。在本发明的另一个优选实施方式中，所述细胞是附着依赖性细胞，特别是成人干细胞，优选是间充质干细胞。然而，本发明所述的方法包括能由布雷他汀增强基质亲和性的所有细胞类型。由于布雷他汀增强细胞存活并且降低悬浮培养中的细胞集聚，所述细胞可在悬浮培养条件下(如上所述优选固定在微载体上)容易地扩增。对于一些应用而言，若所述细胞悬浮在血清减少或无血清的培养基中，则可能是有利的。在本发明的一个特别优选实施方式中，所述细胞在布雷他汀存在下被冰冻和/或解冻，然后使所述细胞接触所述基质。在该情况下，布雷他汀有利地稳定所述细胞，并因而在冰冻和/或解冻所述细胞时对所述细胞起到保护作用。即，布雷他汀增加细胞的冻存恢复，并且，在冷冻前添加布雷他汀有利于细胞冻存。因此，本发明的一个重要方面是使用布雷他汀来促进细胞附着对其不具足够亲和性的基质。本发明的另一个重要方面是使用布雷他汀,用对医疗装置的表面无亲和性或仅有低亲和性的细胞来包被该表面，所述医疗装置优选是支架、贴片或人造血管或器官。本发明的又一个重要方面涉及具有被细胞覆盖的至少一个表面的装置，所述细胞对该表面通常无亲和性或仅有低亲和性。所述表面可包括非粘性材料，优选聚四氟乙烯(PTFE,商品名(DuPont): Teflon )、聚氟乙烯(PFE)、全氟烧氧基(PFA)、氟化乙烯丙烯(FEP)、二氧化钛复合物或包含二氧化钛的组合物，或其任何组合。在本发明的一个优选实施方式中，所述装置的表面由附着依赖性细胞覆盖，所述附着依赖性细胞特别是成人干细胞，优选间充质干细胞。在本发明的另一个优选实施方式中，所述装置是医疗装置，优选是支架、贴片或人造血管或器官。基本而言，本发明所述的概念涉及有利使用布雷他汀来促进细胞附着对其不具足够亲和性的基质，在细胞转移进入悬浮培养过程中防止/减少细胞死亡，促进细胞存活，允许细胞重定位至原本不合适的表面，并最终加强细胞增殖，优选附着依赖性细胞。受益于培养中使用布雷他汀的细胞类型的范围很大，其包括已知治疗上有用的细胞以及目前正在开发的候选物，例如人胚胎干细胞(HES)和诱导性多能干细胞(iPS)。HES细胞通常以聚集形式生长，并需要频繁酶促分离来得以扩增。但是，该方法常引起细胞死亡/损失，因而可以充分得益于使用布雷他汀，而且，实际上，使用布雷他汀可以是完全悬浮培养扩增HES细胞中的一个步骤。虽然在平面上培养成人干细胞和iPS细胞更加稳固，但是在传代以及尤其是完全悬浮培养扩增成人细胞的步骤过程中，使用布雷他汀也是有利的。虽然对多能成人干细胞的扩增尤为感兴趣，用于此概念的细胞类型不应限定于干细胞，而是包括所有附着依赖性细胞类型。本文所用的“非肌肉型肌球蛋白II抑制剂”或“肌球蛋白II抑制剂”指通过直接靶向肌球蛋白II而抑制非肌肉型肌球蛋白II的一种分子或多种分子。因此，本发明的概念包括直接影响非肌肉型肌球蛋白II的抑制剂。布雷他汀或其任何类似物或衍生物，是所述抑制剂的一个例子。然而，本发明不限于该示例，而是可以包括对非肌肉型肌球蛋白II具有相似作用的其它抑制剂。本文所用的“附着依赖性细胞”指悬浮在流体中时通常无活性的，必须黏附至固体表面以存活和生长的细胞。本文所用的“成人干细胞”也称为“体干细胞”，指能够自我更新并且能够产生多种不同细胞类型后代，尤其是来自其来源组织或器官的所有细胞类型的多能细胞。“成人干细胞”包括但不限于，间充质干细胞、造血干细胞、内皮干细胞、神经干细胞及其修饰。本文所用的“成人干细胞”不包括诱导性多能干细胞(iPS细胞)。本文所用的术语“诱导性多能干细胞”(iPS细胞)指源自非多能体细胞的多能细胞，所述非多能体细胞通过诱导表达特异性转录因子而重编程。在多能性方面，iPS细胞与胚胎干细胞类似。本文所用的“胚胎干细胞”指能够向所有三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)分化的多能细胞和种系细胞。参考附图，进一步示例性地详细描述本发明。
图1显示布雷他汀对源自骨髓的间充质干细胞(BM-MSC)的细胞积聚(A:显微照片)、细胞存活(B:柱形图)和凋亡(C:柱形图)的作用。有或没有不同浓度的布雷他汀时检测细胞积聚(A)、细胞存活(B)和凋亡(C)多至七天。使用ROCK抑制剂(Y-27532)作为阳性对照。将细胞加至不支持附着生长的深孔。在悬液(深孔，130RPM)和附着(六孔)培养中对BM-MSC测试不同浓度的布雷他汀和Y-27632 (培养基含有10%FBS)。显然布雷他汀防止或至少明显减少细胞积 聚，使细胞能够存活，并且减少间充质干细胞深孔培养中的凋亡。A:采用10 μ M布雷他汀的处理防止细胞成团，然而细胞对照(DMS0、PBS)和用少于10 μ M布雷他汀处理的细胞形成单聚集体。B:用染料排除分析(碘化丙锭)通过FACS来定量活细胞。与对照培养物(DMS0、PBS)相反，用大于5μ M布雷他汀处理的细胞显示与平面培养细胞相似的活力程度(约90%)。布雷他汀的促存活作用显示为浓度依赖性,其在10 μ M达到峰值，而在较高和较低的布雷他汀浓度都有所降低。C:用膜联蛋白V分析(碘化丙锭)通过FACS来定量凋亡细胞。与对照培养物(DMS0、PBS)相反，用10 μ M布雷他汀处理的细胞受到抗凋亡保护。图2显示由膜联蛋白V染色和后续FACS分析所示，用不同抑制剂浓度处理并在黏附/静态条件下(A)或悬浮/振荡条件下(B)培养的BM-MSC的凋亡水平。在此，显然布雷他汀消除悬浮培养中的细胞死亡，并且显示与Υ-27632相当或更强的抗凋亡作用。5μΜ以下的布雷他汀仅有有限的效果，其中，在10 μ M时达到最高效果。图3显示由碘化丙锭染色和后续FACS分析所示，用不同抑制剂浓度处理并在黏附/静态条件下(A)或悬浮/振荡条件下(B)培养的BM-MSC的细胞死亡率。该分析显示，布雷他汀显著消减细胞死亡，特别是在10-50 μ M浓度，最佳在10 μ M浓度。图4.1 4.3显示由丙锭浓度揭示并在悬浮/振荡条件下于深孔中培养的细胞周期概况(G1/G0和G2)。使BM-MSC培养物持续纳入BrdU，并在不同时间点(至多3天)取样。大多数细胞在G1/G0期(高密度培养)，但仍有一些G2期细胞出现。无MN细胞(未检测到多核细胞)。因此，布雷他汀对悬浮培养的细胞周期无显著影响。图5.1 5.3显示由碘化丙啶和后续FACS分析所示，用不同抑制剂浓度处理并在静态条件下于六孔中培养的细胞的细胞周期概况(G1/G0和G2)。使BM-MSC培养物持续纳入BrdU,并在不同时间点(至多3天)取样。大多数细胞在G1/G0期(高密度培养)，但仍有一些G2期细胞出现。无MN细胞(未检测到多核细胞)。在持续处理过程中观察到黏附T培养瓶培养物(G2/M)略微减慢细胞周期。图6显示在Lumox-biofoil袋疏水侧培养的未经布雷他汀处理的BM-MSC (对照)。显示用〈0.1%DMS0处理48h之后观察到的细胞菌落和附着细胞。没有观察到显著的细胞附着。图7显示在Lumox-biofoil袋疏水侧培养的BM-MSC。显示用10 μ M布雷他汀处理48h之后观察到的细胞菌落和附着细胞。大量细胞附着至所述疏水表面。因此，若与图6 (对照)相比，布雷他汀处理使BM-MSC对该表面的亲和性增加。图8显示的柱状图反映布雷他汀和Y-27632对来自骨髓的间充质干细胞(BM-MSC)而同时移位所述细胞的影响。亚融合BM-MSC接受4h预处理(10μΜ布雷他汀或10μΜY-27632对比对照)，并随后使用胰蛋白酶/EDTA在37C°孵育3min。在使细胞从无特殊包被的组织培养瓶表面移位后确定细胞计数(A)。与对照条件(无布雷他汀)相比，在肌球蛋白II抑制存在下的细胞移位更少。在药物处理条件下，移位细胞无聚集体。因此，布雷他汀和Y-27632都显示抗细胞移位和聚集的保护作用，即，所述细胞保持稳定附着所述基质，并且无法轻易洗去。再接种细胞(所有条件按相同密度:5000细胞/cm2)并在不含药物的培养基中再培养7天。测定7天后细胞计数⑶和活力(C)。若BM-MEC从基质移位并再接种用于进一步培养，布雷他汀对所述细胞有显著保护作用，使7天培养后的增殖和活性增强。在后续无药物传代(第7天) 的移位之前用布雷他汀和Y-27632处理观察到细胞增殖(产量和活力)增加，其中Y-27632引起的增加较少。图9显示附着微载体的来自骨髓的间充质干细胞(BM-MSC)的葡萄糖消耗㈧、乳酸盐生产(B)和细胞数量(C)的柱状图。BM-MSC接种在微载体上，用于有或没有10 μ M布雷他汀时的悬浮培养，并使之增殖6天。无搅拌孵育24h后，对所述培养物取样，以测定细胞计数、葡萄糖消耗和细胞接种。搅拌情况下再孵育5天之后，再次测定葡萄糖消耗(A)、乳酸盐生产(B)、细胞计数(C)和载体上的细胞接种(图11，载体上DAPI染色细胞)。24h之后，布雷他汀存在下的细胞接种相较对照显著增加。虽然布雷他汀似乎对6天后BM-MSC的葡萄糖消耗和乳酸盐生产没有影响，但是在使用所述抑制剂处理后，细胞数量显著增加。因此，布雷他汀对细胞具有保护作用，使在微载体上生长6天后的增殖增强。图10显示根据图9在孵育6天后微载体的显微照片(载体上的DAPI染色BM-MSC)。这里清楚显示，布雷他汀存在时(B)附着所述微载体的细胞比所述抑制剂不存在时(A，对照)多许多。图11显示经包被培养皿中培养的人胚胎干细胞(hESC)的显微照片。在包被有Matrigelw的培养皿上于不含血清或动物来源成分的X-VIVO确定成分培养基中培养所述细胞。A:不用抑制剂处理(对照)，B:用10 μ M布雷他汀短暂处理(左侧显微照片:4倍放大倍数，右侧显微照片:10倍放大倍数)，C:在撤去布雷他汀后培养I天。hESC在X-VIVO中的分裂后附着性低(A:5 15%)。当所述培养物分裂时(EDTA传代)，向所述培养基补充10 μ M布雷他汀。与X-VIVO中不含布雷他汀的hESC培养物分裂后附着性相比，这显著增加了 hESC附着(B:80 95%)。实际上，甚至个体化的hESC都极好地附着。在24h后用不含布雷他汀的X-VIVO替代所述培养物的培养基，以观察在无布雷他汀时细胞如何保持附着和增殖。在此，无法观察到显著变化(C)。图12显示的柱状图反映布雷他汀(Bb，㈠对映异构体)对来自骨髓的间充质干细胞(BM-MSC)的影响。在排斥性Teflonκ箔上用10 μ M Bb培养MSC4天，在第4天计数附着所述箔的细胞。棒代表每孔细胞数。对照培养物:DMSO或PBS中的BM-MSC，无抑制剂。观察到肌球蛋白抑制下的细胞产量相较对照显著增加。因此，BM-MSC在Teflon 箔上附着
并增殖。图13显示的柱状图反映布雷他汀(Bb，㈠对映异构体)对来自脐带血的干细胞(CB-USSC)的影响。在排斥性Teflor^'箔上用10 μ M Bb培养USSC4天，在第4天计数附着所述箔的细胞。棒代表每孔细胞数。对照培养物:DMSO或PBS中的CB-USSC，无抑制剂。观察到肌球蛋白抑制下的细胞产量相较对照极显著增加。因此，CB-USSC在Tef]cmK'箔上附着
并增殖。图14显示的柱状图反映布雷他汀(Bb，㈠对映异构体)对来自骨髓的间充质干
细胞(BM-MSC)的影响。在排斥性Teflo,'箔上用10 μ M Bb培养MSC直至达到融合，在细
胞接种后的第6天计数附着所述箔的细胞。棒代表每孔细胞数。对照培养物:DMSO或PBS
中的BM-MSC，无抑制剂。BM-MSC在Teflonκ箔上不形成完全融合层。肌球蛋白抑制下的细
胞产量相较对照没有差异，与4天实验的明显不一致可能归因于较长培养时间(6天相比4天)和/或增加的初始细胞数量(在分泌ECM以接种于上方面，双倍量的细胞附着可能更加有效)。图15显示的柱状图反映布雷他汀(Bb，㈠对映异构体)对来自脐带血的干细胞(CB-USSC)的影响。在排斥性Teflon"箔上用10 μ M Bb培养USSC直至达到融合，在细胞接种后的第6天计数附着所述箔的细胞。棒代表每孔细胞数。对照培养物:DMS0或PBS中的CB-USSC，无抑制剂。USSC在肌球蛋白抑制下于Teflon'箔上形成融合层，观察到肌球蛋白抑制下的细胞产量相较对照培养物显著增加。图16显示的柱状图反映布雷他汀(Bb，(-)对映异构体)对低血清EGM2+Dex培养基中(3%血清)培养的来自脐带血的干细胞(CB-USSC)的影响。USSC用10 μ M Bb在排
斥性Teflor^箔皿上培养，并在细胞接种后的第4天计数。棒代表每孔细胞数。对照培养物:DMS0或PBS中的CB-USSC，无抑制剂。USSC显示在肌球蛋白抑制下的增殖显著增强。在Teflon 箔上血清减少(EGM2)培养基中的USSC附着和增殖通过抑制肌球蛋白而增强。图17显示的柱状图反映布雷他汀(Bb，(-)对映异构体)对无血清MSCGM-⑶培养基中培养的来自脐带血的干细胞(CB-USSC)的影响。USSC用10 μ M Bb在排斥性Teflon"'箔皿上培养，并在细胞接种后的第4天计数。 棒代表每孔细胞数。对照培养物:DMSO或PBS中的CB-USSC，无抑制剂。在无关肌球蛋白抑制的无血清培养基中，USSC附着在TefloiP箔
上，但没有显著增殖。可以观察到肌球蛋白抑制下的细胞产量相较对照无明显增长。图18显示来自脐带血的染色干细胞(CB-USSC)在PTFE血管上的照片(PTFE=聚
四氟乙烯(polytetrafIuoroethylene),商品名(DuPont): Teflon..、)。A) DMSO 对照，B) PBS 对照，C) 10 μ M (-)布雷他汀。与对照培养物相比，在排斥性PTFE-血管材料上用10 μ M Bb培养USSC3天。与对照相比，在肌球蛋白抑制下观察到显著增强的细胞扩散，但没有聚集体形成。图19显示人胚胎干细胞(hEST)在有或没有肌球蛋白抑制的冻存之前和之后的活细胞密度(柱形)和恢复(三角形)(BB=布雷他汀)。图20显示在冻存细胞解冻后两天和四天的平均人胚胎干细胞(hEST)总数的柱状图。通常仅能冻存细胞团，而非个体ES细胞。该图显示，抑制肌球蛋白显著增强个体细胞在冻存后的存活。总而言之，图19和图20显示，布雷他汀使个体hESC的冻存恢复增加至与hESC团相当的水平。而且，在冷冻前添加布雷他汀有利于个体hESC的冻存。根据上文所示的实验数据，显然非肌肉型肌球蛋白II的直接抑制剂例如布雷他汀，对细胞团尤其是 附着依赖性细胞团有一些积极作用。例如，肌球蛋白II直接抑制剂-增强细胞在悬浮培养中的存活，-降低细胞在悬浮培养中的积聚，-促进在不适于细胞培养的基质上附着和增殖，-提供用于控制细胞与特定基质附着的工具，-在细胞移位过程中起保护作用，-在细胞的冷冻和/或解冻时对其有保护作用，-在细胞分选(例如FACS)过程中起保护作用，-促进来自脐带血和骨髓MNC-分离物(初生组织)的初始细胞附着，-肌球蛋白抑制弓I起BM-MSC接种的适度增强和CB-USSC在Teflonx箔上附着的有力增强，-肌球蛋白抑制引起CB-USSC在Teflon1〈上的融合生长。-肌球蛋白抑制正面影响MSC-GM(无血清培养基)中无血清条件下的接种，和-肌球蛋白抑制正面影响EGM2-MV中血清减少条件下的接种和增殖。本发明的另一方面是提供用于控制细胞，尤其是附着依赖性细胞粘附基质的方法，所述方法允许选择用于细胞的高产率生产和低损伤分离的合适基质。特定提供一种方法，其中，通过向细胞提供直接抑制非肌肉型肌球蛋白II的抑制剂分子来控制细胞对基质的附着。向所述细胞提供所述抑制剂可增强这些细胞附着至原本对其没有足够亲和性的表面的能力。因此，可以有利方式应用所述直接抑制非肌肉型肌球蛋白II的抑制剂分子作为一种触发剂，所述触发剂使用户能够控制细胞附着特定基质，例如用于悬浮培养的微载体。此外，本发明所述的抑制剂是拓宽用于细胞培养的合适基质选择的有用工具，从而能优化并因此大大改进依赖于细胞对微载体附着的细胞培养方法。优选地，通过向所述细胞提供所述抑制剂分子而促进所述细胞对所述基质的附着。用所述抑制剂处理所述细胞使这些细胞有能力在不适于培养这些细胞的表面上附着和增殖。即，本发明所述的方法大幅拓宽了适用于培养和/或扩增细胞的基质(例如，微载体)选择。因此，由于在待培养细胞能够黏附的基质方面存在多得多的选择，这促进了培养条件的改进和优化。根据本发明的一个优选实施方式，所述基质是多种微载体，并且附着所述载体的细胞在悬浮条件下培养。在该实施方式中，增加细胞得以生长的表面积，从而细胞在悬浮条件下(优选在合适的生物反应器中)培养时能在微载体(优选合适的珠)上大量产出。在本发明的一个优选实施方式中，所述细胞是附着依赖性细胞，特别是成人干细胞，优选是间充质干细胞。但是，如本发明所述的方法包括通过直接抑制非肌肉型肌球蛋白II的抑制剂能够影响细胞对基质的亲和力的所有细胞类型。本发明的一个重要方面在于使用布雷他汀控制细胞对上述表面的黏附。本发明的另一个发面中提供用于扩增细胞的方法，所述方法包括(a)悬浮所述细胞，(b)使所述细胞附着多种微载体的表面，以及(C)在悬浮条件下培养附着微载体的细胞。根据本发明，在步骤(a)中悬浮所述细胞之前和/或当时，用直接抑制非肌肉型肌球蛋白II的抑制剂分子处理所述细胞。在该方法中，大幅增加细胞得以生长的表面积，从而细胞在悬浮条件下(优选在合适的生物反应器中)培养时能在微载体(优选合适的珠)上大量产出。所述抑制剂促进所述细胞对所述微载体的黏附，并增强细胞优选附着依赖性细胞粘附对其没有亲和性或亲和性不足的表面的能力。在一些方面中，所述细胞在步骤(a)和(b)中至少一个之前经冷冻和解冻。令人吃惊的是，在本发明所述的方法过程中冷冻和解冻所述细胞使得所述细胞在扩增过程中的黏附和存活有所改善，从而能够显著增加细胞产量。在此，肌球蛋白II抑制剂还在细胞冷冻和解冻时对其起保护作用。根据本发明的一个优选实施方式，所述细胞是附着依赖性细胞，特别是成人干细胞，优选是间充质干细胞。然而，本发明所述的方法包括在直接抑制非肌肉型肌球蛋白II的抑制剂存在时能够有效扩增的所有细胞类型。本发明的另一个重要方面在于，应用布雷他汀来扩增附着多种微载体的细胞，其中，附着所述微载体的所述细胞在悬浮条件下培养。本发明的另一方面中提供一种用于从组织分离细胞的方法，所述方法包括(a)在直接抑制非肌肉型肌球蛋白II的抑制剂分子存在下解离所述组织，和(b)从解离自所述组织的细胞中分离感兴趣的细胞。令人吃惊地显示本发明所述的抑制剂显著改善了来自原代分离物的细胞的存活和恢复。因此，本发明所述方法的一个优势在于:细胞从组织包埋状态到悬浮状态的转换得到了改善。因此，在分离细胞时用所述抑制剂分子处理所述细胞产生较高产率，并且偶尔还能从组织鉴定出新细胞类型。在分离感兴趣的细胞之后，这些细胞可在悬浮培养条件下扩增，以产出更高数量的细胞用于进一步应用。优选地，在直接抑制非肌 肉型肌球蛋白II的抑制剂分子存在下扩增所述感兴趣的细胞。所述感兴趣的细胞可以是附着依赖性细胞，特别是成人干细胞，优选是间充质干细胞。若附着依赖性细胞已经分离，则在不含所述抑制剂分子的附着依赖性细胞培养条件下扩增所述细胞可能是合适的。所述抑制剂分子可以是布雷他汀。布雷他汀是在施加至细胞培养物时使由缺少附着而引起的细胞死亡最小化并促进单细胞培养的小分子。与ROCK抑制剂相反，布雷他汀用作非肌肉型肌球蛋白II的直接、非竞争性抑制剂。布雷他汀不干扰复杂信号转导级联，而是以非肌肉型肌球蛋白II为直接目标，并且，其通过结合肌球蛋白-ADP-Pi复合物与肌动蛋白相互作用。重要的是，布雷他汀是肌球蛋白II的易调整且易可逆(良性)抑制剂。布雷他汀大大增强原本绝对依赖黏附的细胞的悬浮存活。可在需要时向培养基简易添加所述基质，而且其作用通过移除所述基质是直接且立即完全可逆的。所述分子是至关重要的工具，在向悬浮培养转换方面，所述分子在悬液初期过程中最小化细胞死亡，在从组织鉴定出新细胞方面，所述分子在细胞提取(即，从组织包埋状态或生境转换为悬浮状态)过程中最小化细胞死亡。本发明的一个重要方面是可以利用布雷他汀来分离附着依赖性细胞，特别是在附着依赖性细胞从组织包埋状态向悬浮状态转换过程中增加所述细胞的产量。本发明的另一个重要方面是使用布雷他汀来增强生长因子对附着依赖性细胞的作用，所述附着依赖性细胞优选是成人干细胞，特别是间充质干细胞。本发明的另一个重要方面是在无血清培养附着依赖性细胞过程中使用布雷他汀来替代结合因子，所述细胞优选是成人干细胞，特别是间充质干细胞。用直接抑制非肌肉型肌球蛋白II的抑制剂分子(优选布雷他汀)处理细胞，从本质上影响所述细胞的特性，使得经处理的细胞显示新特性和不同于那些未处理细胞的能力。因此，用肌球蛋白II抑制剂处理的细胞是，至少在一定程度上是，具有不同形态和生物成分的新型细胞。因此，本发明还包 括如本发明所述方法扩增或分离的细胞，优选干细胞，更优选成人干细胞，特别是间充质干细胞。即，本发明涉及在存在直接抑制非肌肉型肌球蛋白II的抑制剂分子存在时培养或分离的所有细胞，所述抑制剂分子优选布雷他汀。此外，独立于本发明所述的方法，本发明包括用直接抑制非肌肉型肌球蛋白II的抑制剂分子处理或在所述抑制剂分子存在下培养的任何细胞，优选干细胞，更优选成人干细胞，特别是间充质干细胞，所述抑制剂分子优选布雷他汀。本发明还包括一种组合物，所述组合物包括至少一个细胞，优选干细胞，更优选成人干细胞，特别是间充质干细胞，如本发明所述。在本发明的一个优选实施方式中，所述组合物可以包含细胞培养基或合适于保证所述细胞活力的其它溶液。然而，本发明不限于这类组合物。例如，如本发明所述的组合物可以可选地包括悬浮在合适保护性基质中冷冻的细胞。本发明还包括一种包含至少一个细胞和至少一种抑制剂分子的组合物，所述细胞优选干细胞，更优选成人干细胞，特别是间充质干细胞，所述抑制剂分子直接抑制非肌肉型肌球蛋白II，优选是布雷他汀。在本发明的一个优选实施方式中，本发明所述的组合物中的至少一种基本不含血清。例如，所述组合物可以在包含布雷他汀的无血清培养基中包含间充质干细胞悬液。如本发明所述的细胞和/或组合物可以包括在非医疗性实验室使用的试剂盒内，或作为药物制备物的部分。文献:Straight 等，Science, 2003，299，1743-1747.Walker, A., Su, H., Conti, M.A., Harb, N., Adelstein, R.S., Sato, N.:Nature Communications, 2010, DC1 :10.1038, ncommsl 074.
权利要求
1.用于促进细胞黏附基质的方法，其特征在于，所述细胞对基质的黏附由向所述细胞提供非肌肉型肌球蛋白II抑制剂布雷他汀来促进，从而使所述细胞能够附着对所述细胞不具足够亲和性的表面。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基质是非粘性材料或至少部分包被有非粘性材料。
3.如权利要求2所述的方法 ，其特征在于，所述非粘性材料包括聚四氟乙烯(PTFE)、聚氟乙烯(PFE)、全氟烷氧基(PFA)、氟化乙烯丙烯(FEP)、二氧化钛复合物或包含二氧化钛的组合物，或其任何组合。
4.如权利要求1 3中任一项所述的方法，其特征在于，所述基质是医疗装置的表面，所述医疗装置优选是支架、贴片或人造血管或器官。
5.如权利要求1 3中任一项所述的方法，其特征在于，所述基质是多种微载体。
6.如权利要求1 5中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞是附着依赖性细胞，特别是成人干细胞，优选间充质干细胞。
7.如权利要求1 6中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞在悬浮培养条件下扩士豳>曰ο
8.如权利要求1 7中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞悬浮在血清减少或无血清培养基中。
9.如权利要求1 8中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞在布雷他汀存在下被冷冻和/或解冻，然后使所述细胞接触所述基质。
10.布雷他汀用于促进细胞黏附对所述细胞不具足够亲和性的基质的应用。
11.布雷他汀用于使对医疗装置的表面无亲和性或仅有低亲和性的细胞包被所述表面的应用，所述医疗装置优选是支架、贴片或人造血管或器官。
12.具有由细胞包被的至少一个表面的装置，所述细胞通常对该表面无亲和性或仅有低亲和性。
13.如权利要求12所述的装置，其特征在于，所述表面包括非粘性材料，优选是聚四氟乙烯(PTFE)、聚氟乙烯(PFE)、全氟烷氧基(PFA)、氟化乙烯丙烯(FEP)、二氧化钛复合物或包含二氧化钛的组合物，或其任何组合。
14.如权利要求12或13所述的装置，其特征在于，所述细胞是附着依赖性细胞，特别是成人干细胞，优选间充质干细胞。
15.如权利要求12 14中任一项所述的装置，其特征在于，所述装置是医疗装置，优选支架、贴片或人造血管或器官。
全文摘要
本发明涉及用于促进细胞黏附通常对其无亲和性或仅有低亲和性的基质的方法，其中，由向所述细胞提供非肌肉型肌球蛋白II抑制剂布雷他汀(Blebbistatin)来促进所述细胞对所述基质的黏附，从而使所述细胞能够附着在对其不具有足够亲和性的表面。令人吃惊的是，向所述细胞供给所述抑制剂增强这些细胞附着通常对其无亲和力或仅有低亲和力的表面(例如PTFE())的能力。本发明还涉及非肌肉型肌球蛋白II抑制剂布雷他汀和至少一个表面包被有与所述表面无亲和性或仅低亲和性的细胞的装置的应用。
文档编号C12N5/0775GK103201377SQ201180053932
公开日2013年7月10日 申请日期2011年11月9日 优先权日2010年11月9日
发明者J·塞恩克, C·范登博斯, C·罗森鲍姆, 聂颖 申请人:隆萨科隆有限公司
控制细胞与基质结合的方法
背景技术：
本发明涉及用于促进细胞黏附基质的方法，所述基质对于这些细胞通常无亲和性或仅有低亲和性。本发明还涉及使用非肌肉型肌球蛋白II抑制剂布雷他汀(Blebbistatin)和至少一个表面包被有与所述表面无亲和性或仅低亲和性的细胞的装置。现有抟术目前使用的大部分治疗型细胞(包括成人干细胞)以锚定/附着依赖性方式增殖，这也适用于可能的替代方式，例如胚胎干细胞和诱导性多能干细胞(iPS)。但是，所述增殖方式与规模和经济上的严重限制有内在关联。对于细胞扩增而言，细胞通常被接种至平面上，它们在数小时内附着于所述平面，增殖，并通过蛋白水解酶和/或移除钙来收获。附着不是均一过程，而是出现在特定的区域，即所谓黏着斑区域。一旦附着，细胞便通过内部马达蛋白施加张力。从而，细胞骨架变得有序且在多种过程中行使功能，包括运输、支架和细胞存活。细胞脱落后，这些随着马达蛋白建立的内部张力变化而快速收缩，而先前有序的内部结构(细胞骨架和其它)则受到扰乱。若无法再附着至表面，所述细胞则会启动称为附着依赖性凋亡/失巢凋亡的细胞死亡程序。US-A-20100009442 描述了 Rho相关卷曲激酶(ROCK)的抑制剂(例如Y-27632、H-1152或法舒地尔(Fasudil)),其是Rho GTP酶的效应分子且已知控制血管收缩和神经轴突延伸，可以用作凋亡/失巢凋亡抑制剂，从而促进多能干细胞，特别是胚胎干细胞的存活和/或增殖速率。ROCK抑制剂存在时，干细胞能在亚克隆或传代之前和/或之后培养而不添加饲养细胞和/或血清。负责产生细胞张力的主要细胞骨架马达蛋白是非肌肉型肌球蛋白II (称为肌球蛋白II)。Straight等(2003)鉴定了非肌肉型肌球蛋白II的特定小分子抑制剂，以试图详细分析胞浆移动。该高度活性的小分子抑制细胞起泡，称作“布雷他汀(Blebbistatin) ”。该化合物可透过细胞，良性，并且重要的是容易可逆。Walker等(2010)公开了布雷他汀用于增强人多能干细胞(包括人胚胎干细胞和诱导性多能干细胞)存活的应用。用布雷他汀处理提高人多能干细胞在克隆密度和悬浮条件下的存活率。此外，布雷他汀与合成基质联用可支持所述干细胞自我更新的确定环境。US-A-20100216181描述使用布雷他汀或ROCK抑制剂作为存活因子，在不含血清和饲养细胞的培养基中培养多能干细胞。这里，通过在旋转瓶或生物反应器内培养细胞来生成大量细胞。大量的附着依赖性细胞可以在生物反应器内或微载体(例如，珠)上产生，当所述细胞在悬浮条件下培养时，所述微载体可增加能使细胞得以生长的表面积。例如，从US-A-20100093083已知用于大量生产干细胞(包括多能和胚胎干细胞)的方法。本文中，所述细胞培养在内含多种微载体的无血清培养基中。所述细胞能够附着至所述微载体，并在控制条件下于生物反应器内扩增。所述培养基可额外补充有促进所述干细胞增殖和存活或防止分化的成分，例如，GSK3酶或MEK酶抑制剂。扩增后，使用酶促或非酶促细胞解离试剂从所述微载体上分离所述细胞。但是，该方法的缺点在于，只能使用对细胞具有充足亲和性的微载体。
发明内容
本发明的一个目标在于，提供用于促进细胞黏附基质的方法，这些细胞对所述基质通常无亲和性或仅有低亲和性。该目标通过一种方法解决，其中，由向所述细胞供给所述非肌肉型肌球蛋白II抑制剂布雷他汀来促进所述细胞对所述基质的黏附，从而使所述细胞能够附着对其不具足够亲和性的表面。令人吃惊的是，向所述细胞供给所述抑制剂可增强这些细胞附着通常对其无亲和性或仅有低亲和性的表面的能力。因此，可以以有利的方式将布雷他汀作为一种增强剂使用，所述增强剂使用户能够促进细胞附着特定基质，例如用于悬浮培养的微载体或覆盖例如Teflon &的表面。因此，布雷他汀是拓宽用于细胞培养的合适基质选择的有用工具，从而能优化并因此大幅改进依赖于细胞对微载体附着的细胞的培养方法。由于在待培养细胞能够附着的基质方面存在多许多的选择，这促进了培养条件的改进和优化。此外，可以通过向所述细胞添加布雷他汀来实现对用于其它需求但通常不适用于活细胞的合适基质(例如，一些医疗装置的表面)优化的定居表面。因此，用所述抑制剂处理所述细胞使这些细胞有能力在不适于培养这些细胞的表面上附着和增殖。通过本发明所述的方法，大幅拓宽了适用于培养和/或扩增细胞的基质(例如，微载体或医疗装置的)选择。布雷他汀是在施加至细胞培养物时使由缺少附着而引起的细胞死亡最小化并促进单细胞培养的小分子。对比ROCK抑制剂，布雷他汀用作非肌肉型肌球蛋白II的直接、非竞争性抑制剂。其不干扰复杂信号级联，而是直接靶向非肌肉型肌球蛋白II和其通过结合肌球蛋白-ADP-Pi复合物与肌动蛋白的相互作用。重要的是，布雷他汀是肌球蛋白II的易调整且易可逆(良性)抑制剂。布雷他汀增强细胞尤其是附着依赖性细胞附着对其不具有足够亲和性的表面的能力。因此，布雷他汀能用作控制细胞附着可能特定基质的黏附触发齐U。此外，布雷他汀大大增强严格依赖黏附的细胞的悬浮存活。所述物质可在需要时简易地添加至培养基。在本发明的一个优选实施方式中，所述基质是非粘性材料或至少部分包被有非粘性材料。所述非粘性材料可包括聚四氟乙烯(PTFE,商品名(DuPont):Teflonw )、聚氟乙烯(PFE)、全氟烷氧基(PFA)、氟化乙烯丙烯(FEP)、二氧化钛复合物或包含二氧化钛的组合物，或其任何组合。优选地，所述基质是医疗装置的表面，所述医疗装置优选是支架、贴片或人造血管或器官。例如为了避免血细胞、蛋白或类似物的不需要附着，所述装置通常由不适于细胞培养的材料制成或包被，所以通常难以使细胞定居所述装置。但是，有些时候希望用活细胞(优选干细胞)覆盖所述装置，从而其可用作移植物、取代组织、修补探针等。并且，通过用自体同源的细胞覆盖移植物可以有效抑制免疫系统对所述移植物的排斥。如本发明所述，通过向细胞提供布雷他汀可有利地使细胞能够在医疗装置上定居，从而准备并改进这些装置用于若干医疗应用。
在本发明的另一个优选实施方式中，所述基质是多种微载体，从而使所附着所述基质的细胞能够在悬浮条件下培养。在该实施方式中，增加细胞得以生长的表面积，从而细胞在悬浮条件下(优选在合适的生物反应器中)培养时能在微载体(优选合适的珠)上大量生产。如本发明所述，可以使用市售可得的微载体诸如Cytodex (通用电气医疗集团(GEHealthcare)，GB)、Hillex(索罗希尔公司(SoloHill),美国)或类似物,包括但不限于通过改变温度优选通过降低温度移出细胞的温控微载体。对于细胞扩增，可向现有培养物添加额外微载体，从而提供额外的附着区域以增加细胞数量。因此，仅通过添加更多微载体来容易地实现细胞培养物的扩增。对于具体应用而言，使用不同尺寸微载体可能是有益的。在本发明的另一个优选实施方式中，所述细胞是附着依赖性细胞，特别是成人干细胞，优选是间充质干细胞。然而，本发明所述的方法包括能由布雷他汀增强基质亲和性的所有细胞类型。由于布雷他汀增强细胞存活并且降低悬浮培养中的细胞集聚，所述细胞可在悬浮培养条件下(如上所述优选固定在微载体上)容易地扩增。对于一些应用而言，若所述细胞悬浮在血清减少或无血清的培养基中，则可能是有利的。在本发明的一个特别优选实施方式中，所述细胞在布雷他汀存在下被冰冻和/或解冻，然后使所述细胞接触所述基质。在该情况下，布雷他汀有利地稳定所述细胞，并因而在冰冻和/或解冻所述细胞时对所述细胞起到保护作用。即，布雷他汀增加细胞的冻存恢复，并且，在冷冻前添加布雷他汀有利于细胞冻存。因此，本发明的一个重要方面是使用布雷他汀来促进细胞附着对其不具足够亲和性的基质。本发明的另一个重要方面是使用布雷他汀,用对医疗装置的表面无亲和性或仅有低亲和性的细胞来包被该表面，所述医疗装置优选是支架、贴片或人造血管或器官。本发明的又一个重要方面涉及具有被细胞覆盖的至少一个表面的装置，所述细胞对该表面通常无亲和性或仅有低亲和性。所述表面可包括非粘性材料，优选聚四氟乙烯(PTFE,商品名(DuPont): Teflon )、聚氟乙烯(PFE)、全氟烧氧基(PFA)、氟化乙烯丙烯(FEP)、二氧化钛复合物或包含二氧化钛的组合物，或其任何组合。在本发明的一个优选实施方式中，所述装置的表面由附着依赖性细胞覆盖，所述附着依赖性细胞特别是成人干细胞，优选间充质干细胞。在本发明的另一个优选实施方式中，所述装置是医疗装置，优选是支架、贴片或人造血管或器官。基本而言，本发明所述的概念涉及有利使用布雷他汀来促进细胞附着对其不具足够亲和性的基质，在细胞转移进入悬浮培养过程中防止/减少细胞死亡，促进细胞存活，允许细胞重定位至原本不合适的表面，并最终加强细胞增殖，优选附着依赖性细胞。受益于培养中使用布雷他汀的细胞类型的范围很大，其包括已知治疗上有用的细胞以及目前正在开发的候选物，例如人胚胎干细胞(HES)和诱导性多能干细胞(iPS)。HES细胞通常以聚集形式生长，并需要频繁酶促分离来得以扩增。但是，该方法常引起细胞死亡/损失，因而可以充分得益于使用布雷他汀，而且，实际上，使用布雷他汀可以是完全悬浮培养扩增HES细胞中的一个步骤。虽然在平面上培养成人干细胞和iPS细胞更加稳固，但是在传代以及尤其是完全悬浮培养扩增成人细胞的步骤过程中，使用布雷他汀也是有利的。虽然对多能成人干细胞的扩增尤为感兴趣，用于此概念的细胞类型不应限定于干细胞，而是包括所有附着依赖性细胞类型。本文所用的“非肌肉型肌球蛋白II抑制剂”或“肌球蛋白II抑制剂”指通过直接靶向肌球蛋白II而抑制非肌肉型肌球蛋白II的一种分子或多种分子。因此，本发明的概念包括直接影响非肌肉型肌球蛋白II的抑制剂。布雷他汀或其任何类似物或衍生物，是所述抑制剂的一个例子。然而，本发明不限于该示例，而是可以包括对非肌肉型肌球蛋白II具有相似作用的其它抑制剂。本文所用的“附着依赖性细胞”指悬浮在流体中时通常无活性的，必须黏附至固体表面以存活和生长的细胞。本文所用的“成人干细胞”也称为“体干细胞”，指能够自我更新并且能够产生多种不同细胞类型后代，尤其是来自其来源组织或器官的所有细胞类型的多能细胞。“成人干细胞”包括但不限于，间充质干细胞、造血干细胞、内皮干细胞、神经干细胞及其修饰。本文所用的“成人干细胞”不包括诱导性多能干细胞(iPS细胞)。本文所用的术语“诱导性多能干细胞”(iPS细胞)指源自非多能体细胞的多能细胞，所述非多能体细胞通过诱导表达特异性转录因子而重编程。在多能性方面，iPS细胞与胚胎干细胞类似。本文所用的“胚胎干细胞”指能够向所有三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)分化的多能细胞和种系细胞。参考附图，进一步示例性地详细描述本发明。
图1显示布雷他汀对源自骨髓的间充质干细胞(BM-MSC)的细胞积聚(A:显微照片)、细胞存活(B:柱形图)和凋亡(C:柱形图)的作用。有或没有不同浓度的布雷他汀时检测细胞积聚(A)、细胞存活(B)和凋亡(C)多至七天。使用ROCK抑制剂(Y-27532)作为阳性对照。将细胞加至不支持附着生长的深孔。在悬液(深孔，130RPM)和附着(六孔)培养中对BM-MSC测试不同浓度的布雷他汀和Y-27632 (培养基含有10%FBS)。显然布雷他汀防止或至少明显减少细胞积 聚，使细胞能够存活，并且减少间充质干细胞深孔培养中的凋亡。A:采用10 μ M布雷他汀的处理防止细胞成团，然而细胞对照(DMS0、PBS)和用少于10 μ M布雷他汀处理的细胞形成单聚集体。B:用染料排除分析(碘化丙锭)通过FACS来定量活细胞。与对照培养物(DMS0、PBS)相反，用大于5μ M布雷他汀处理的细胞显示与平面培养细胞相似的活力程度(约90%)。布雷他汀的促存活作用显示为浓度依赖性,其在10 μ M达到峰值，而在较高和较低的布雷他汀浓度都有所降低。C:用膜联蛋白V分析(碘化丙锭)通过FACS来定量凋亡细胞。与对照培养物(DMS0、PBS)相反，用10 μ M布雷他汀处理的细胞受到抗凋亡保护。图2显示由膜联蛋白V染色和后续FACS分析所示，用不同抑制剂浓度处理并在黏附/静态条件下(A)或悬浮/振荡条件下(B)培养的BM-MSC的凋亡水平。在此，显然布雷他汀消除悬浮培养中的细胞死亡，并且显示与Υ-27632相当或更强的抗凋亡作用。5μΜ以下的布雷他汀仅有有限的效果，其中，在10 μ M时达到最高效果。图3显示由碘化丙锭染色和后续FACS分析所示，用不同抑制剂浓度处理并在黏附/静态条件下(A)或悬浮/振荡条件下(B)培养的BM-MSC的细胞死亡率。该分析显示，布雷他汀显著消减细胞死亡，特别是在10-50 μ M浓度，最佳在10 μ M浓度。图4.1 4.3显示由丙锭浓度揭示并在悬浮/振荡条件下于深孔中培养的细胞周期概况(G1/G0和G2)。使BM-MSC培养物持续纳入BrdU，并在不同时间点(至多3天)取样。大多数细胞在G1/G0期(高密度培养)，但仍有一些G2期细胞出现。无MN细胞(未检测到多核细胞)。因此，布雷他汀对悬浮培养的细胞周期无显著影响。图5.1 5.3显示由碘化丙啶和后续FACS分析所示，用不同抑制剂浓度处理并在静态条件下于六孔中培养的细胞的细胞周期概况(G1/G0和G2)。使BM-MSC培养物持续纳入BrdU,并在不同时间点(至多3天)取样。大多数细胞在G1/G0期(高密度培养)，但仍有一些G2期细胞出现。无MN细胞(未检测到多核细胞)。在持续处理过程中观察到黏附T培养瓶培养物(G2/M)略微减慢细胞周期。图6显示在Lumox-biofoil袋疏水侧培养的未经布雷他汀处理的BM-MSC (对照)。显示用〈0.1%DMS0处理48h之后观察到的细胞菌落和附着细胞。没有观察到显著的细胞附着。图7显示在Lumox-biofoil袋疏水侧培养的BM-MSC。显示用10 μ M布雷他汀处理48h之后观察到的细胞菌落和附着细胞。大量细胞附着至所述疏水表面。因此，若与图6 (对照)相比，布雷他汀处理使BM-MSC对该表面的亲和性增加。图8显示的柱状图反映布雷他汀和Y-27632对来自骨髓的间充质干细胞(BM-MSC)而同时移位所述细胞的影响。亚融合BM-MSC接受4h预处理(10μΜ布雷他汀或10μΜY-27632对比对照)，并随后使用胰蛋白酶/EDTA在37C°孵育3min。在使细胞从无特殊包被的组织培养瓶表面移位后确定细胞计数(A)。与对照条件(无布雷他汀)相比，在肌球蛋白II抑制存在下的细胞移位更少。在药物处理条件下，移位细胞无聚集体。因此，布雷他汀和Y-27632都显示抗细胞移位和聚集的保护作用，即，所述细胞保持稳定附着所述基质，并且无法轻易洗去。再接种细胞(所有条件按相同密度:5000细胞/cm2)并在不含药物的培养基中再培养7天。测定7天后细胞计数⑶和活力(C)。若BM-MEC从基质移位并再接种用于进一步培养，布雷他汀对所述细胞有显著保护作用，使7天培养后的增殖和活性增强。在后续无药物传代(第7天) 的移位之前用布雷他汀和Y-27632处理观察到细胞增殖(产量和活力)增加，其中Y-27632引起的增加较少。图9显示附着微载体的来自骨髓的间充质干细胞(BM-MSC)的葡萄糖消耗㈧、乳酸盐生产(B)和细胞数量(C)的柱状图。BM-MSC接种在微载体上，用于有或没有10 μ M布雷他汀时的悬浮培养，并使之增殖6天。无搅拌孵育24h后，对所述培养物取样，以测定细胞计数、葡萄糖消耗和细胞接种。搅拌情况下再孵育5天之后，再次测定葡萄糖消耗(A)、乳酸盐生产(B)、细胞计数(C)和载体上的细胞接种(图11，载体上DAPI染色细胞)。24h之后，布雷他汀存在下的细胞接种相较对照显著增加。虽然布雷他汀似乎对6天后BM-MSC的葡萄糖消耗和乳酸盐生产没有影响，但是在使用所述抑制剂处理后，细胞数量显著增加。因此，布雷他汀对细胞具有保护作用，使在微载体上生长6天后的增殖增强。图10显示根据图9在孵育6天后微载体的显微照片(载体上的DAPI染色BM-MSC)。这里清楚显示，布雷他汀存在时(B)附着所述微载体的细胞比所述抑制剂不存在时(A，对照)多许多。图11显示经包被培养皿中培养的人胚胎干细胞(hESC)的显微照片。在包被有Matrigelw的培养皿上于不含血清或动物来源成分的X-VIVO确定成分培养基中培养所述细胞。A:不用抑制剂处理(对照)，B:用10 μ M布雷他汀短暂处理(左侧显微照片:4倍放大倍数，右侧显微照片:10倍放大倍数)，C:在撤去布雷他汀后培养I天。hESC在X-VIVO中的分裂后附着性低(A:5 15%)。当所述培养物分裂时(EDTA传代)，向所述培养基补充10 μ M布雷他汀。与X-VIVO中不含布雷他汀的hESC培养物分裂后附着性相比，这显著增加了 hESC附着(B:80 95%)。实际上，甚至个体化的hESC都极好地附着。在24h后用不含布雷他汀的X-VIVO替代所述培养物的培养基，以观察在无布雷他汀时细胞如何保持附着和增殖。在此，无法观察到显著变化(C)。图12显示的柱状图反映布雷他汀(Bb，㈠对映异构体)对来自骨髓的间充质干细胞(BM-MSC)的影响。在排斥性Teflonκ箔上用10 μ M Bb培养MSC4天，在第4天计数附着所述箔的细胞。棒代表每孔细胞数。对照培养物:DMSO或PBS中的BM-MSC，无抑制剂。观察到肌球蛋白抑制下的细胞产量相较对照显著增加。因此，BM-MSC在Teflon 箔上附着
并增殖。图13显示的柱状图反映布雷他汀(Bb，㈠对映异构体)对来自脐带血的干细胞(CB-USSC)的影响。在排斥性Teflor^'箔上用10 μ M Bb培养USSC4天，在第4天计数附着所述箔的细胞。棒代表每孔细胞数。对照培养物:DMSO或PBS中的CB-USSC，无抑制剂。观察到肌球蛋白抑制下的细胞产量相较对照极显著增加。因此，CB-USSC在Tef]cmK'箔上附着
并增殖。图14显示的柱状图反映布雷他汀(Bb，㈠对映异构体)对来自骨髓的间充质干
细胞(BM-MSC)的影响。在排斥性Teflo,'箔上用10 μ M Bb培养MSC直至达到融合，在细
胞接种后的第6天计数附着所述箔的细胞。棒代表每孔细胞数。对照培养物:DMSO或PBS
中的BM-MSC，无抑制剂。BM-MSC在Teflonκ箔上不形成完全融合层。肌球蛋白抑制下的细
胞产量相较对照没有差异，与4天实验的明显不一致可能归因于较长培养时间(6天相比4天)和/或增加的初始细胞数量(在分泌ECM以接种于上方面，双倍量的细胞附着可能更加有效)。图15显示的柱状图反映布雷他汀(Bb，㈠对映异构体)对来自脐带血的干细胞(CB-USSC)的影响。在排斥性Teflon"箔上用10 μ M Bb培养USSC直至达到融合，在细胞接种后的第6天计数附着所述箔的细胞。棒代表每孔细胞数。对照培养物:DMS0或PBS中的CB-USSC，无抑制剂。USSC在肌球蛋白抑制下于Teflon'箔上形成融合层，观察到肌球蛋白抑制下的细胞产量相较对照培养物显著增加。图16显示的柱状图反映布雷他汀(Bb，(-)对映异构体)对低血清EGM2+Dex培养基中(3%血清)培养的来自脐带血的干细胞(CB-USSC)的影响。USSC用10 μ M Bb在排
斥性Teflor^箔皿上培养，并在细胞接种后的第4天计数。棒代表每孔细胞数。对照培养物:DMS0或PBS中的CB-USSC，无抑制剂。USSC显示在肌球蛋白抑制下的增殖显著增强。在Teflon 箔上血清减少(EGM2)培养基中的USSC附着和增殖通过抑制肌球蛋白而增强。图17显示的柱状图反映布雷他汀(Bb，(-)对映异构体)对无血清MSCGM-⑶培养基中培养的来自脐带血的干细胞(CB-USSC)的影响。USSC用10 μ M Bb在排斥性Teflon"'箔皿上培养，并在细胞接种后的第4天计数。 棒代表每孔细胞数。对照培养物:DMSO或PBS中的CB-USSC，无抑制剂。在无关肌球蛋白抑制的无血清培养基中，USSC附着在TefloiP箔
上，但没有显著增殖。可以观察到肌球蛋白抑制下的细胞产量相较对照无明显增长。图18显示来自脐带血的染色干细胞(CB-USSC)在PTFE血管上的照片(PTFE=聚
四氟乙烯(polytetrafIuoroethylene),商品名(DuPont): Teflon..、)。A) DMSO 对照，B) PBS 对照，C) 10 μ M (-)布雷他汀。与对照培养物相比，在排斥性PTFE-血管材料上用10 μ M Bb培养USSC3天。与对照相比，在肌球蛋白抑制下观察到显著增强的细胞扩散，但没有聚集体形成。图19显示人胚胎干细胞(hEST)在有或没有肌球蛋白抑制的冻存之前和之后的活细胞密度(柱形)和恢复(三角形)(BB=布雷他汀)。图20显示在冻存细胞解冻后两天和四天的平均人胚胎干细胞(hEST)总数的柱状图。通常仅能冻存细胞团，而非个体ES细胞。该图显示，抑制肌球蛋白显著增强个体细胞在冻存后的存活。总而言之，图19和图20显示，布雷他汀使个体hESC的冻存恢复增加至与hESC团相当的水平。而且，在冷冻前添加布雷他汀有利于个体hESC的冻存。根据上文所示的实验数据，显然非肌肉型肌球蛋白II的直接抑制剂例如布雷他汀，对细胞团尤其是 附着依赖性细胞团有一些积极作用。例如，肌球蛋白II直接抑制剂-增强细胞在悬浮培养中的存活，-降低细胞在悬浮培养中的积聚，-促进在不适于细胞培养的基质上附着和增殖，-提供用于控制细胞与特定基质附着的工具，-在细胞移位过程中起保护作用，-在细胞的冷冻和/或解冻时对其有保护作用，-在细胞分选(例如FACS)过程中起保护作用，-促进来自脐带血和骨髓MNC-分离物(初生组织)的初始细胞附着，-肌球蛋白抑制弓I起BM-MSC接种的适度增强和CB-USSC在Teflonx箔上附着的有力增强，-肌球蛋白抑制引起CB-USSC在Teflon1〈上的融合生长。-肌球蛋白抑制正面影响MSC-GM(无血清培养基)中无血清条件下的接种，和-肌球蛋白抑制正面影响EGM2-MV中血清减少条件下的接种和增殖。本发明的另一方面是提供用于控制细胞，尤其是附着依赖性细胞粘附基质的方法，所述方法允许选择用于细胞的高产率生产和低损伤分离的合适基质。特定提供一种方法，其中，通过向细胞提供直接抑制非肌肉型肌球蛋白II的抑制剂分子来控制细胞对基质的附着。向所述细胞提供所述抑制剂可增强这些细胞附着至原本对其没有足够亲和性的表面的能力。因此，可以有利方式应用所述直接抑制非肌肉型肌球蛋白II的抑制剂分子作为一种触发剂，所述触发剂使用户能够控制细胞附着特定基质，例如用于悬浮培养的微载体。此外，本发明所述的抑制剂是拓宽用于细胞培养的合适基质选择的有用工具，从而能优化并因此大大改进依赖于细胞对微载体附着的细胞培养方法。优选地，通过向所述细胞提供所述抑制剂分子而促进所述细胞对所述基质的附着。用所述抑制剂处理所述细胞使这些细胞有能力在不适于培养这些细胞的表面上附着和增殖。即，本发明所述的方法大幅拓宽了适用于培养和/或扩增细胞的基质(例如，微载体)选择。因此，由于在待培养细胞能够黏附的基质方面存在多得多的选择，这促进了培养条件的改进和优化。根据本发明的一个优选实施方式，所述基质是多种微载体，并且附着所述载体的细胞在悬浮条件下培养。在该实施方式中，增加细胞得以生长的表面积，从而细胞在悬浮条件下(优选在合适的生物反应器中)培养时能在微载体(优选合适的珠)上大量产出。在本发明的一个优选实施方式中，所述细胞是附着依赖性细胞，特别是成人干细胞，优选是间充质干细胞。但是，如本发明所述的方法包括通过直接抑制非肌肉型肌球蛋白II的抑制剂能够影响细胞对基质的亲和力的所有细胞类型。本发明的一个重要方面在于使用布雷他汀控制细胞对上述表面的黏附。本发明的另一个发面中提供用于扩增细胞的方法，所述方法包括(a)悬浮所述细胞，(b)使所述细胞附着多种微载体的表面，以及(C)在悬浮条件下培养附着微载体的细胞。根据本发明，在步骤(a)中悬浮所述细胞之前和/或当时，用直接抑制非肌肉型肌球蛋白II的抑制剂分子处理所述细胞。在该方法中，大幅增加细胞得以生长的表面积，从而细胞在悬浮条件下(优选在合适的生物反应器中)培养时能在微载体(优选合适的珠)上大量产出。所述抑制剂促进所述细胞对所述微载体的黏附，并增强细胞优选附着依赖性细胞粘附对其没有亲和性或亲和性不足的表面的能力。在一些方面中，所述细胞在步骤(a)和(b)中至少一个之前经冷冻和解冻。令人吃惊的是，在本发明所述的方法过程中冷冻和解冻所述细胞使得所述细胞在扩增过程中的黏附和存活有所改善，从而能够显著增加细胞产量。在此，肌球蛋白II抑制剂还在细胞冷冻和解冻时对其起保护作用。根据本发明的一个优选实施方式，所述细胞是附着依赖性细胞，特别是成人干细胞，优选是间充质干细胞。然而，本发明所述的方法包括在直接抑制非肌肉型肌球蛋白II的抑制剂存在时能够有效扩增的所有细胞类型。本发明的另一个重要方面在于，应用布雷他汀来扩增附着多种微载体的细胞，其中，附着所述微载体的所述细胞在悬浮条件下培养。本发明的另一方面中提供一种用于从组织分离细胞的方法，所述方法包括(a)在直接抑制非肌肉型肌球蛋白II的抑制剂分子存在下解离所述组织，和(b)从解离自所述组织的细胞中分离感兴趣的细胞。令人吃惊地显示本发明所述的抑制剂显著改善了来自原代分离物的细胞的存活和恢复。因此，本发明所述方法的一个优势在于:细胞从组织包埋状态到悬浮状态的转换得到了改善。因此，在分离细胞时用所述抑制剂分子处理所述细胞产生较高产率，并且偶尔还能从组织鉴定出新细胞类型。在分离感兴趣的细胞之后，这些细胞可在悬浮培养条件下扩增，以产出更高数量的细胞用于进一步应用。优选地，在直接抑制非肌 肉型肌球蛋白II的抑制剂分子存在下扩增所述感兴趣的细胞。所述感兴趣的细胞可以是附着依赖性细胞，特别是成人干细胞，优选是间充质干细胞。若附着依赖性细胞已经分离，则在不含所述抑制剂分子的附着依赖性细胞培养条件下扩增所述细胞可能是合适的。所述抑制剂分子可以是布雷他汀。布雷他汀是在施加至细胞培养物时使由缺少附着而引起的细胞死亡最小化并促进单细胞培养的小分子。与ROCK抑制剂相反，布雷他汀用作非肌肉型肌球蛋白II的直接、非竞争性抑制剂。布雷他汀不干扰复杂信号转导级联，而是以非肌肉型肌球蛋白II为直接目标，并且，其通过结合肌球蛋白-ADP-Pi复合物与肌动蛋白相互作用。重要的是，布雷他汀是肌球蛋白II的易调整且易可逆(良性)抑制剂。布雷他汀大大增强原本绝对依赖黏附的细胞的悬浮存活。可在需要时向培养基简易添加所述基质，而且其作用通过移除所述基质是直接且立即完全可逆的。所述分子是至关重要的工具，在向悬浮培养转换方面，所述分子在悬液初期过程中最小化细胞死亡，在从组织鉴定出新细胞方面，所述分子在细胞提取(即，从组织包埋状态或生境转换为悬浮状态)过程中最小化细胞死亡。本发明的一个重要方面是可以利用布雷他汀来分离附着依赖性细胞，特别是在附着依赖性细胞从组织包埋状态向悬浮状态转换过程中增加所述细胞的产量。本发明的另一个重要方面是使用布雷他汀来增强生长因子对附着依赖性细胞的作用，所述附着依赖性细胞优选是成人干细胞，特别是间充质干细胞。本发明的另一个重要方面是在无血清培养附着依赖性细胞过程中使用布雷他汀来替代结合因子，所述细胞优选是成人干细胞，特别是间充质干细胞。用直接抑制非肌肉型肌球蛋白II的抑制剂分子(优选布雷他汀)处理细胞，从本质上影响所述细胞的特性，使得经处理的细胞显示新特性和不同于那些未处理细胞的能力。因此，用肌球蛋白II抑制剂处理的细胞是，至少在一定程度上是，具有不同形态和生物成分的新型细胞。因此，本发明还包 括如本发明所述方法扩增或分离的细胞，优选干细胞，更优选成人干细胞，特别是间充质干细胞。即，本发明涉及在存在直接抑制非肌肉型肌球蛋白II的抑制剂分子存在时培养或分离的所有细胞，所述抑制剂分子优选布雷他汀。此外，独立于本发明所述的方法，本发明包括用直接抑制非肌肉型肌球蛋白II的抑制剂分子处理或在所述抑制剂分子存在下培养的任何细胞，优选干细胞，更优选成人干细胞，特别是间充质干细胞，所述抑制剂分子优选布雷他汀。本发明还包括一种组合物，所述组合物包括至少一个细胞，优选干细胞，更优选成人干细胞，特别是间充质干细胞，如本发明所述。在本发明的一个优选实施方式中，所述组合物可以包含细胞培养基或合适于保证所述细胞活力的其它溶液。然而，本发明不限于这类组合物。例如，如本发明所述的组合物可以可选地包括悬浮在合适保护性基质中冷冻的细胞。本发明还包括一种包含至少一个细胞和至少一种抑制剂分子的组合物，所述细胞优选干细胞，更优选成人干细胞，特别是间充质干细胞，所述抑制剂分子直接抑制非肌肉型肌球蛋白II，优选是布雷他汀。在本发明的一个优选实施方式中，本发明所述的组合物中的至少一种基本不含血清。例如，所述组合物可以在包含布雷他汀的无血清培养基中包含间充质干细胞悬液。如本发明所述的细胞和/或组合物可以包括在非医疗性实验室使用的试剂盒内，或作为药物制备物的部分。文献:Straight 等，Science, 2003，299，1743-1747.Walker, A., Su, H., Conti, M.A., Harb, N., Adelstein, R.S., Sato, N.:Nature Communications, 2010, DC1 :10.1038, ncommsl 074.
权利要求
1.用于促进细胞黏附基质的方法，其特征在于，所述细胞对基质的黏附由向所述细胞提供非肌肉型肌球蛋白II抑制剂布雷他汀来促进，从而使所述细胞能够附着对所述细胞不具足够亲和性的表面。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基质是非粘性材料或至少部分包被有非粘性材料。
3.如权利要求2所述的方法 ，其特征在于，所述非粘性材料包括聚四氟乙烯(PTFE)、聚氟乙烯(PFE)、全氟烷氧基(PFA)、氟化乙烯丙烯(FEP)、二氧化钛复合物或包含二氧化钛的组合物，或其任何组合。
4.如权利要求1 3中任一项所述的方法，其特征在于，所述基质是医疗装置的表面，所述医疗装置优选是支架、贴片或人造血管或器官。
5.如权利要求1 3中任一项所述的方法，其特征在于，所述基质是多种微载体。
6.如权利要求1 5中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞是附着依赖性细胞，特别是成人干细胞，优选间充质干细胞。
7.如权利要求1 6中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞在悬浮培养条件下扩士豳>曰ο
8.如权利要求1 7中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞悬浮在血清减少或无血清培养基中。
9.如权利要求1 8中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞在布雷他汀存在下被冷冻和/或解冻，然后使所述细胞接触所述基质。
10.布雷他汀用于促进细胞黏附对所述细胞不具足够亲和性的基质的应用。
11.布雷他汀用于使对医疗装置的表面无亲和性或仅有低亲和性的细胞包被所述表面的应用，所述医疗装置优选是支架、贴片或人造血管或器官。
12.具有由细胞包被的至少一个表面的装置，所述细胞通常对该表面无亲和性或仅有低亲和性。
13.如权利要求12所述的装置，其特征在于，所述表面包括非粘性材料，优选是聚四氟乙烯(PTFE)、聚氟乙烯(PFE)、全氟烷氧基(PFA)、氟化乙烯丙烯(FEP)、二氧化钛复合物或包含二氧化钛的组合物，或其任何组合。
14.如权利要求12或13所述的装置，其特征在于，所述细胞是附着依赖性细胞，特别是成人干细胞，优选间充质干细胞。
15.如权利要求12 14中任一项所述的装置，其特征在于，所述装置是医疗装置，优选支架、贴片或人造血管或器官。
全文摘要
本发明涉及用于促进细胞黏附通常对其无亲和性或仅有低亲和性的基质的方法，其中，由向所述细胞提供非肌肉型肌球蛋白II抑制剂布雷他汀(Blebbistatin)来促进所述细胞对所述基质的黏附，从而使所述细胞能够附着在对其不具有足够亲和性的表面。令人吃惊的是，向所述细胞供给所述抑制剂增强这些细胞附着通常对其无亲和力或仅有低亲和力的表面(例如PTFE())的能力。本发明还涉及非肌肉型肌球蛋白II抑制剂布雷他汀和至少一个表面包被有与所述表面无亲和性或仅低亲和性的细胞的装置的应用。
文档编号C12N5/0775GK103201377SQ201180053932
公开日2013年7月10日 申请日期2011年11月9日 优先权日2010年11月9日
发明者J·塞恩克, C·范登博斯, C·罗森鲍姆, 聂颖 申请人:隆萨科隆有限公司
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