棒状细菌转化体及使用该转化体的苯酚的制造方法
专利名称：棒状细菌转化体及使用该转化体的苯酚的制造方法
技术领域：
本发明涉及苯酚生产技术。更详细而言，本发明涉及为了赋予苯酚生产功能而实施了特定基因操作的谷氨酸棒杆菌的转化体及使用该转化体的高效的苯酚的制造技术。
背景技术：
在全球变暖和化石资源枯竭问题的背景下，已经认识到以可再生资源为原料的化学品制造与生物燃料制造并列地作为新产业生物炼制而成为实现低碳社会的重要策略，并聚焦了广泛的关注。但是，对于以可再生资源为原料的生物苯酚生产而言，与乳酸、乙醇的生产相比，从作为原料的糖类开始的代谢反应阶段非常多，因此生产率低，并且作为产物的苯酚会使细菌的增殖受到抑制或者存在由苯酚产生的细胞毒性等，基于上述理由，目前还不能进行工业性的生产。作为苯酚的重要用途，可以列举酚醛树脂。酚醛树脂是由苯酚与醛类的加成缩合反应生成且在塑料中具有最古老历史的树脂，由于其优良的耐热性、耐久性等优点，目前仍被用于汽车用金属替代材料、半导体密封材料、电路基板等各种用途。另外，对于迄今为止的酚醛树脂而言，由于原料苯酚与醛类的反应性极高，所得到的高分子形成复杂的三维网状结构，因此，难以实现聚合物的精密结构设计和在纳米材料中的发展，从而认为难以应用于高附加价值的用途。但是近年来，随着高分子的物性理论和仿真技术的快速发展，只要使网状结构精密化则能够由酚醛树脂创制高功能性材料。在这样的背景下，日本的酚醛树脂生产量正在逐年增加。
目前的苯酚的工业生产法(异丙苯法)是以石油来源的苯和丙烯作为原料、需要大量的溶剂类和大量的热能的、典型的化学工业的高能耗型工艺。因此，从保护地球环境和减少温室效应气体的观点出发，当务之急是开发二氧化碳排放少的节能型的、能够由可再生资源制造的、废弃物排放低的环境和谐型工艺，即建立生物苯酚制造技术。迄今为止尚未报道过自然界中的苯酚生产菌。就利用基因重组菌的苯酚生产技术而言，非专利文献I公开了使用羟基苯甲酸梭菌(Clostridium hydroxybenzoicum)的细胞悬池液或细胞提取液,用50小时将2mM的4-轻基苯甲酸酯/盐完全转变成苯酹的技术。另外，专利文献I公开了使用导入有阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)的4_轻基苯甲酸脱羧酶基因的转化菌由4-羟基苯甲酸酯/盐制造苯酚的技术。但是，非专利文献I和专利文献I的方法在实用中不能高效地制造苯酚。现有技术文献专利文献专利文献1:日本特开2006-050914号非专利文献非专利文献 I !International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol.52，2002, 801-807.
发明内容
发明所要解决的问题本发明的课题在于提供能够以4-羟基苯甲酸酯/盐为原料高效地制造苯酚的微生物、以及能够以4-羟基苯甲酸酯/盐为原料高效地制造苯酚的方法。用于解决问题的手段为了解决上述问题，本发明人反复进行了研究，得到下述发现。(i)在谷氨酸棒杆菌中导入4-羟基苯甲酸脱羧酶基因而得到的转化体能够高效地由4-羟基苯甲酸酯/盐生产苯酚。(ii)该转化体中，存在于宿主谷氨酸棒杆菌的染色体上的苯酚2-单加氧酶基因被破坏或发生缺陷时，能够更高效地生产苯酚。(iii)该转化体在还原条件下的反应液中实质上不增殖的状态下进行反应时，苯酚生产效率特别高。本发明是基于上述发现而完成的，其提供下述转化体及苯酚的制造方法。第I项.一种具有苯酚生产能力的转化体，其通过将编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶(4-hydroxybenzoate decarboxylase)活性的酶的基因导入宿主谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)而得至丨第2项.如第I项所述的转化体，其中，编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的酶的基因为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的基因、萎缩芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus)来源的基因、枯草芽抱杆菌斯氏亚种(Bacillus subtilis subsp.spizizenii)来源的基因、克氏朽1檬酸杆菌(Citrobacter koseri)来`源的基因、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)来源的基因、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)来源的基因、霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)来源的基因、阪崎肠杆菌(Enterobactersakazakii)来源的基因、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)来源的基因、弗格森埃希氏菌(Escherichia fergusonii)来源的基因、多粘类芽抱杆菌(Paenibacillus poIymyxa)来源的基因或菠萝泛菌(Pantoea ananatis)来源的基因。第3项.如第I项所述的转化体，其中，编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的酶的基因为下述(a)或(b)的DNA,(a)由序列号16、序列号23、序列号26、序列号29、序列号32、序列号35、序列号38、序列号41、序列号44、序列号47、序列号50或序列号53的碱基序列构成的DNA ；(b)在严格的条件下与由(a)中任一个碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交且编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的多肽的DNA。第4项.如第I项 第3项中任一项所述的转化体，其中，宿主谷氨酸棒杆菌为存在于其染色体上的、编码具有苯酹2-单加氧酶(phenol 2-monooxygenase)活性的酶的基因被破坏或发生缺陷的谷氨酸棒杆菌。第5项.如第I项 第4项中任一项所述的转化体，其中，宿主谷氨酸棒杆菌为存在于其染色体上的、编码具有4-轻基苯甲酸轻化酶(4-hydroxybenzoate hydroxylase)活性的酶的基因被破坏或发生缺陷的谷氨酸棒杆菌。
第6项.如第I项 第3项中任一项所述的转化体，其中，宿主谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌 R(FERM P-18976)、ATCC13032 或 ATCC13869。第7项.如第I项 第3项中任一项所述的转化体，其中，宿主谷氨酸棒杆菌为存在于谷氨酸棒杆菌R(FERM P-18976)、ATCC13032或ATCC13869的染色体上的、编码具有苯酚2-单加氧酶活性的酶的基因被破坏或发生缺陷的谷氨酸棒杆菌。第8项.如第I项 第3项中任一项所述的转化体，其中，宿主谷氨酸棒杆菌为存在于谷氨酸棒杆菌R(FERM P-18976)、ATCC13032或ATCC13869的染色体上的、编码具有4-羟基苯甲酸羟化酶活性的酶的基因被破坏或发生缺陷的谷氨酸棒杆菌。第9 项.谷氨酸棒杆菌 PHE21(保藏编号:NITE BP-996)、PHE21-2、PHE21-3、PHE21-4、PHE21-5、PHE21-6、PHE21-7、PHE21-8、PHE21-9、PHE21-10、PHE21-11、PHE21-12、PHE22-1、PHE22-2、PHE22-3、PHE22-4、PHE22-5、PHE22-6、PHE22-7、PHE22-8、PHE22-9、PHE22-10、PHE22-11、PHE22-12、PHE23-1、PHE23-2、PHE23-3、PHE23-4、PHE23-5、PHE23-6、PHE23-7、PHE23-8、PHE23-9、PHE23-10、PHE23-11 或 PHE23-12 的转化体。第10项.一种苯酚的制造方法，其中，包括:使第I项 第9项中任一项所述的转化体在还原条件下、在含有4-羟基苯甲酸酯或其盐的反应液中反应的步骤，和回收反应液中的苯酚的步骤。第11项.如第10项所述的苯酚的制造方法，其中，反应步骤中，转化体实质上不
增殖。·第12项.如第10项或第11项所述的苯酚的制造方法，其中，还原条件下的反应液的氧化还原电位为-200 -500毫伏。发明效果通过使用本发明的转化体，能够以高效率由4-羟基苯甲酸酯/盐制造苯酚。一般而言，微生物的增殖会因苯酚这样的溶剂的细胞毒性而受到抑制，因此，难以使用微生物来制造苯酚，但根据本发明方法，能够使用微生物以实用上足够良好的效率制造苯酹。
图1是表示实施例中使用的质粒的构成的图。图2是表示苯酚对各种微生物在需氧条件下的增殖的影响的图。
具体实施例方式以下，对本发明进行详细说明。(I)具有苯酚生产能力的转化体本发明的具有苯酚生产能力的转化体是将编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的酶的基因导入宿主谷氨酸棒杆菌而得到的转化体。宿丰作为宿主使用的谷氨酸棒杆菌为Bargey’ s Manual of DeterminativeBacteriology (伯杰氏系统细菌学手册)，Vol.8，599(1974)中定义的一组微生物。
具体而言，可以列举谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) R(FERMP-18976)、ATCC13032、ATCC13869、ATCC13058、ATCC13059、ATCC13060、ATCC13232、ATCC13286、ATCC13287、ATCC13655、ATCC13745、ATCC13746、ATCC13761、ATCC14020、ATCC31831、MJ-233(FERM BP-1497)或 MJ-233AB-41 (FERM BP-1498)等菌株。其中，优选R(FERM P-18976)株、ATCC13032 株及 ATCC13869 株，更优选 R(FERM P-18976)株。另外,根据分子生物学的分类,黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、散枝短杆菌(Brevibacterium divaricatum)、百合棒杆菌(Corynebacterium Iilium)等棒状细菌的菌名也统一在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中[Liebl, ff.et al., Transfer of Brevibacteriumdivaricatum DSM20297T, “Brevibacterium flavum”DSM20411， “Brevibacteriumlactofermentum，，DSM20412and DSM1412, and Corynebacterium glutamicum and theirdistinction by rRNA gene restriction patterns.1nt J Syst Bacteriol.41:255-260.(1991)，驹形和男等，棒状细菌的分类，发酵与工业，45:944-963 (1987)]，因此，包含在本发明中。另外，除了野生株以外，谷氨酸棒杆菌也可以是其突变株或人工的基因重组体。可以列举例如乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyrvate carboxylase)、苹果酸脱氧酶(malate dehydrogenase)等的基因的破坏株。通过使用这种基因破坏株作为宿主，能够提高苯酚的生产率或抑制副产物的生成。其中，优选乳酸脱氢酶基因的破坏株。该基因破坏株中，乳酸脱氢酶基因被破坏，由此使丙酮酸至乳酸的代谢途径被阻断。其中，特别优选谷氨酸棒杆菌R(FERM P-18976)株的乳酸脱氢酶基因的破 坏株。这种基因破坏株可以通过基因工程的方法按照常规方法来制作。例如，W02005/010182A1中记载了乳酸脱氢酶破坏株及其制作方法。4~羊子基苯甲酸月兑豫酶基因(bsdBCD或dca)4-羟基苯甲酸脱羧酶为催化通过4-羟基苯甲酸酯/盐脱羧而生成苯酚的反应的酶。编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的酶的基因的来源没有特别限定，可以列举:枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽抱杆菌(Bacillus megaterium)、地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)、萎缩芽抱杆菌(Bacillus atrophaeus)、枯草芽抱杆菌斯氏亚种(Bacillus subtilis subsp.spizizenii)等芽孢杆菌属细菌来源的基因；克氏朽1檬酸杆菌(Citrobacter koseri)等朽1檬酸杆菌属细菌来源的基因；产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、霍氏肠杆菌(Enterobacterhormaechei)、阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)等肠杆菌属细菌来源的基因；大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、弗格森埃希氏菌(Escherichia fergusonii)等埃希氏菌属细菌来源的基因；多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus poIymyxa)等类芽孢杆菌属细菌来源的基因；菠萝泛菌(Pantoea ananatis)等泛菌属细菌来源的基因等。其中，优选芽孢杆菌属细菌特别是枯草芽孢杆菌来源的基因、肠杆菌属细菌特别是阴沟肠杆菌来源的基因、埃希氏菌属细菌特别是大肠埃希氏菌来源的基因。另外，编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的酶的基因根据来源使用各种不同的简称。例如，枯草芽孢杆菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因简称为bsdBCD。本说明书中，有时无论来源如何将4-羟基苯甲酸脱羧酶基因均简称为“dca”。作为枯草芽孢杆菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号16的碱基序列构成的DNA，作为萎缩芽孢杆菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号23的碱基序列构成的DNA，作为枯草芽孢杆菌斯氏亚种来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号26的碱基序列构成的DNA，作为克氏柠檬酸杆菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号29的碱基序列构成的DNA，作为产气肠杆菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号32的碱基序列构成的DNA，作为阴沟肠杆菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号35的碱基序列构成的DNA，作为霍氏肠杆菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号38的碱基序列构成的DNA，作为阪崎肠杆菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号41的碱基序列构成的DNA，作为大肠埃希氏菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号44的碱基序列构成的DNA，作为弗格森埃希氏菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号47的碱基序列构成的DNA，作为多粘类芽孢杆菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号50的碱基序列构成的DNA，作为菠萝泛菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号53的碱基序列构成的DNA。另外，本发明中，也可以使用在严格的条件下与由序列号16、序列号23、序列号26、序列号29、序列号32、序列号35、序列号38、序列号41、序列号44、序列号47、序列号50或序列号53的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交且编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的多肽的DNA。本发明中，“严格的条件”是指一般的条件、例如Molecular Cloning, A LaboratoryManual (分子克隆实验指南)，第二版，1989，Vol2, pll.45中记载的条件。具体而言,是指在比完全杂交的解链温度(Tm)低5 10°C的温度下发生杂交的情况。4_轻基苯甲酸脱竣酶活性可以利用《Genomics, 86，342-351，2005 “Materialsand Methods”》中记载的 方法进行测定。简单地来说明，向试验用液中添加被测酶，制备含有IOOmM MES, pH6.0UmM DTT、5mM4-羟基苯甲酸酯/盐和酶的反应液，测定270nm下的吸光度的斜率(初速度)。对于不添加4-羟基苯甲酸酯/盐的体系也同样进行反应，作为背景值。将两个测定值的差作为4-羟基苯甲酸脱羧酶活性。另外，本发明中，也可以使用由与序列号16、序列号23、序列号26、序列号29、序列号32、序列号35、序列号38、序列号41、序列号44、序列号47、序列号50或序列号53的碱基序列具有90%以上、优选95%以上、更优选98%以上的同一性的碱基序列构成且编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的多肽的DNA。本发明中，碱基序列的同一性是利用GENETYX第8版(GENETYX株式会社七1、f ^ ^制造)算出的值。由序列号16、序列号23、序列号26、序列号29、序列号32、序列号35、序列号38、序列号41、序列号44、序列号47、序列号50或序列号53的碱基序列构成的DNA的同源物可以通过例如使用基于这些碱基序列按照常规方法设计的引物或探针的PCR或杂交由其他生物种的DNA文库中选择，由此以高概率得到编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的多肽。用于转化的载体的构建
将通过PCR扩增得到的编码4-羟基苯甲酸脱羧酶的DNA各自克隆到能够在宿主中扩增的适当的载体中即可。作为质粒载体，只要是包含在谷氨酸棒杆菌内担负自主复制功能的基因的质粒载体即可。作为其具体例，可以列举:乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)2256 来源的 pAM330[日本特开昭 58-67699]、[Miwa, K.etal.，Cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria.Agric.Biol.Chem.48:2901-2903(1984)]和[Yamaguchi，R.et al., Determination of the completenucleotide sequence of the Brevibacterium lactofermentum plasmid pAM330and theanalysis of its genetic information.Nucleic Acids Symp.Ser.16:265-267 (1985)]、谷氨酸棒杆菌ATCC13058来源的pHM1519[Miwa，K.et al., Cryptic plasmids in glutamicacid-producing bacteria.Agric.Biol.Chem.48:2901-2903 (1984)]和 pCRY30 [Kurusu，Y.et al.，Identification of plasmid partition function in coryneform bacteria.App1.Environ.Microbiol.57:759-764(1991)]、谷氨酸棒杆菌 T250 来源的 pCG4[日本特开昭 57-183799]、[Katsumata,R.et al., Protoplast transformation ofglutamate-producing bacteria with plasmid DNA.J.Bacteriol.、159:306-311(1984)]、pAGl、pAG3、pAG14、pAG50[日本特开昭 62-166890]、pEKO、pEC5、pEKExl [Eikmanns，Β.J.etal., A family of Corynebacterium glutamicum/Escherichia coli shuttle vectors forcloning,controlled gene expression,and promoter probing.Gene, 102:93-98(1991)]
坐寸ο作为优选的启动子，可以列举谷氨酸棒杆菌R来源的甘油醛-3-磷酸脱氢酶A基因(gapA)的启动子PgapA、苹果酸脱氢酶基因(mdh)的启动子Pmdh、乳酸脱氢酶A基因(IdhA)的启动子PldhA等,其中，优选PgapA。作为优选的终止子，可以列举大肠杆菌rRNA操纵子的rrnB T1T2终止子、大肠杆菌的trpA终止子、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)的trp终止子等，其中，优选rrnB TIT2终止子。MiL转化方法可以没有限制地使用公知的方法。作为这样的公知的方法，可以列举例如氯化钙/氯化铷法、磷酸钙法、DEAE-葡聚糖介导的转染、电穿孔法等。其中，对于谷氨酸棒杆菌优选电脉冲法，电脉冲法可以通过公知的方法[Kurusu, Y.et al.，Electroporation-transformation system for Coryneform bacteria by auxotrophiccomplementation.Agric.Biol.Chem.54:443-447 (1990)]和[Vertes A.A.etal., Presence of mrr-and mcr-like restriction systems in Coryneform bacteria.Res.Microbiol.144:181-185(1993)]进行。转化体使用微生物的培养中通常使用的培养基进行培养即可。作为该培养基，通常可以使用含有碳源、氮源、无机盐类及其他营养物质等的天然培养基或合成培养基等。作为碳源，可以列举:葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖、麦芽糖、甘露糖醇、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、淀粉、糖蜜、山梨糖醇、甘油等糖质或糖醇；乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、马来酸或葡糖酸等有机酸；乙醇、丙醇等醇等。另外 ，还可以根据期望使用正链烷烃等烃等。碳源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。培养基中的这些碳源的浓度通常设定为约0.1 约10 (w/v%)即可。作为氮源，可以列举:氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵等无机铵化合物或有机铵化合物、尿素、氨水、硝酸钠、硝酸钾等。另外，也可以使用玉米浆、肉提取物、蛋白胨、NZ-胺、蛋白质水解物、氨基酸等含氮有机化合物等。氮源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。培养基中的氮源浓度因使用的氮化合物而异，通常设定为约0.1 约10(w/v%)即可。作为无机盐类，可以列举例如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴或碳酸钙等。这些无机盐可以单独使用一种或者两种以上混合使用。培养基中的无机盐类浓度因使用的无机盐而异，通常设定为约0.01 约I (w/v%)即可。作为营养物质，可以列举例如肉提取物、蛋白胨、多聚蛋白胨、酵母提取物、干酵母、玉米浆、脱脂奶粉、脱脂大豆盐酸水解物或者动植物或微生物菌体的提取物或它们的分解物等。营养物质的培养基浓度因使用的营养物质而异，通常设定为约0.1 约10(w/v%)即可。另外，还可以根据需要添加维生素类。作为维生素类，可以列举例如生物素、硫胺素(维生素BI)、吡哆醇(维生素B6)、泛酸、肌醇、尼克酸等。培养基的pH优选约5 约8。作为优选的微生物培养培养基，可以列举A培养基[Inui, M.et al., Metabolicanalysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinateproductions under oxygen deprivation conditions.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.7:182-196(2004)]、BT 培养基[Omumasaba, C.A.et al., Corynebacteriumglutami cum glyceraIdehyde- 3-phosphate dehydrogenase isoforms withopposite,ATP-dependent regulation.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8:91-103(2004)] 培养温度设定为约15°C 约45°C即可，培养时间设定为约I天 约7天即可。_0] 宿主染色体基因的破坏或缺失宿主谷氨酸棒杆菌中，优选存在于其染色体上的、编码具有苯酚2-单加氧酶活性的酶的基因(poxF)被破坏或发生缺失，由此能够更高效地制造苯酹。另外，宿主谷氨酸棒杆菌中，优选存在于其染色体上的、编码具有4-羟基苯甲酸羟化酶活性的酶的基因(PobA)被破坏或发生缺失，由此，能够更高效地制造苯酚。特别优选poxF和pobA这两者均被破坏或发生缺失。制作以使基因的部分序列缺失而不产生正常发挥功能的酶蛋白的方式进行改变后的缺失型基因，利用包含该基因的DNA转化细菌，在缺失型基因与染色体上的基因之间引起同源重组，由此能够将染色体上的基因置换成缺失型或破坏型的基因。由缺失型或破坏型的基因编码的酶蛋白即使生成也具有与野生型酶蛋白不同的立体结构，功能降低或消失。由这种利用同源重组的基因置换所致的基因缺失或破坏方法已经确立，有:使用包含温度敏感性复制起点的质粒、能够进行接合转移的质粒的方法；利用在宿主内不具有复制起点的自杀载体的方法等(美国专利第6303383号、日本特开平05-007491号)。具体而言，通过实施例1的项目中记载的方法，能够得到poxF被破坏或缺失的谷氨酸棒杆菌。另外，通过同样的方法，能够得到PobA被破坏或缺失的谷氨酸棒杆菌。(II)苯酷的制造方法
可以通过包括使上述说明过的本发明的转化体在含有4-羟基苯甲酸酯/盐的反应液中反应的步骤和回收反应液中的苯酚的步骤的方法来制造苯酚。微牛物的增葙在反应之前，优选将转化体在需氧条件下、在约25°C 约38°C的温度下培养约12小时 约48小时而使其增殖。培养用培养基反应之前的转化体的需氧培养中使用的培养基可以使用含有碳源、氮源、无机盐类及其他营养物质等的天然培养基或合成培养基。作为碳源，也可以使用:糖类(葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖等单糖；蔗糖、麦芽糖、乳糖、纤维二糖、木二糖、海藻糖等二糖；淀粉等多糖；糖蜜等);甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇 、甘油等糖醇；乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、马来酸、葡糖酸等有机酸；乙醇、丙醇等醇；正链烷烃等烃等。碳源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。作为氮源，可以使用氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵等无机铵化合物或有机铵化合物、尿素、氨水、硝酸钠、硝酸钾等。另外，也可以使用玉米浆、肉提取物、蛋白胨、NZ-胺、蛋白质水解物、氨基酸等含氮有机化合物等。氮源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。氮源在培养基中的浓度因使用的氮化合物而异，通常设定为约0.1 约10(w/v%)即可。作为无机盐类，可以列举磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴、碳酸钙等。无机盐可以单独使用一种或者两种以上混合使用。无机盐类在培养基中的浓度因使用的无机盐而异，通常设定为约0.01 约I (w/v%)即可。作为营养物质，可以列举肉提取物、蛋白胨、多聚蛋白胨、酵母提取物、干酵母、玉米浆、脱脂奶粉、脱脂大豆盐酸水解物、动植物或微生物菌体的提取物或它们的分解物等。营养物质在培养基中的浓度因使用的营养物质而异，通常设定为约0.1 约10(w/v%)即可。还可以根据需要进一步添加维生素类。作为维生素类，可以列举生物素、硫胺素(维生素BI)、吡哆醇(维生素B6)、泛酸、肌醇、尼克酸等。培养基的pH优选约6 约8。作为具体的优选的谷氨酸棒杆菌用培养基，可以列举A培养基[Inui, M.et al., Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate andsuccinate productions under oxygen deprivation conditions.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.7:182-196 (2004)]、BT 培养基[Omumasaba, C.A.et al.,Corynebacteriumglutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms withopposite,ATP-dependent regulation.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8:91-103(2004)]等。这些培养基中，使糖类浓度在上述范围内来使用即可。反应液反应液可以使用含有苯酚前体(苯酚原料)的水、缓冲液、无机盐培养基等。作为前体，使用4-羟基苯甲酸酯/盐。作为4-羟基苯甲酸酯/盐，可以列举钠盐、钾盐等盐；与碳原子数I 4的醇的酯等。其中，优选盐，更优选钠盐。前体可以单独使用一种或者两种以上混合使用。
反应液中的4-羟基苯甲酸酯/盐的浓度优选约0.5 约20 (w/v%)，更优选约I 约10(w/v%),进一步优选约2 约5(w/v%)。4-轻基苯甲酸酯/盐由于为芳香族化合物而具有抑制细胞存活的作用，但4-羟基苯甲酸酯/盐浓度为上述范围时，能够高效地制造苯酚。作为缓冲液，可以列举磷酸缓冲液、Tris缓冲液、碳酸缓冲液等。缓冲液的浓度优选约IOmM 约150mM。作为无机盐培养基，可以列举含有磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴、碳酸钙等无机盐中的一种或两种以上的培养基。其中，优选含有硫酸镁的培养基。作为无机盐培养基，具体而言，可以列举BT培养基[Omumasaba, C.A.et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8:91-103 (2004)]等。无机盐类在培养基中的浓度因使用的无机盐而异,通常设定为约0.01 约I (w/v%)即可。反应液的pH优选约6 约8。反应中,优选在使用氨水溶液、氢氧化钠水溶液等利用PH控制器(例如，工4 O株式会社制造，型号:DT-1023)将反应液的pH控制在中性附近、特别是约7的同时进行反应。反应条件反应温度即反应中的转化体的存活温度优选约20°C 约50°C，更优选约25 V 约47°C。反应温度为上述温度范围时，能够高效地制造苯酚。
另外，反应时间优选约I天 约7天，更优选约I天 约3天。培养可以是分批培养、流加培养、连续培养中的任何一种。其中，优选分批培养。<还原备件>反应可以在需氧条件下进行，也可以在还原条件下进行，优选在还原条件下进行。在还原条件下，谷氨酸棒杆菌实质上不增殖，能够更高效地生产苯酚。还原条件由反应液的氧化还原电位规定。反应液的氧化还原电位优选约-200mV 约-500mV，更优选约_250mV 约_500mV。反应液的还原状态可以简单地利用刃天青指示剂(在还原状态下由蓝色脱色为无色)推测，使用氧化还原电位差计(例如，BR0ADLEY JAMES公司制造，ORP电极)能够准确地测定。处于还原条件下的反应液的制备方法可以没有限制地使用公知的方法。例如，可以使用反应液用水溶液代替蒸馏水等作为反应液制备用的液体介质，反应液用水溶液的制备方法参考例如硫酸还原微生物等绝对厌氧性微生物用的培养液制备方法(Pfennig, Net.al., (1981):The dissimilatory sulfate-reducing bacteria, In The Prokaryotes, AHandbook on Habitats, Isolation and Identification of Bacteria, Ed.by Starr, M.P.et.al.p.926-940, Berlin, Springer Verlag.)或“农艺化学实验书第三卷、京都大学农学部农艺化学教室编、1990年第26次印刷、产业图书株式会社出版”等，能够得到期望的还原条件下的水溶液。具体而言，可以通过对蒸馏水等进行加热处理或减压处理将溶解气体除去而得到还原条件的反应液用水溶液。在这种情况下，可以通过在约IOmmHg以下、优选约5mmHg以下、更优选约3mmHg以下的减压条件下将蒸懼水等处理约I分钟 约60分钟、优选约5分钟 约40分钟来将溶解气体、特别是溶解氧除去而得到还原条件下的反应液用水溶液。另外，也可以添加适当的还原剂(例如，硫代乙醇酸、抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、巯基乙酸、硫代乙酸、谷胱甘肽、硫化钠等)来制备还原条件的反应液用水溶液。将上述方法适当组合而成的方法也是有效的还原条件的反应液用水溶液的制备方法。反应中也优选将反应液维持于还原条件。为了维持反应过程中的还原条件，优选尽可能地防止从反应体系外混入氧，具体而言，可以列举将反应体系用氮气等惰性气体或二氧化碳等密封的方法。作为更有效地防止氧混入的方法，为了在反应过程中使本发明的需氧性细菌的菌体内的代谢功能高效地发挥作用，有时也需要添加维持反应体系的PH的调节液或适当添加各种营养素溶解液，在这种情况下，预先从添加溶液中除去氧是有效的。苯酚的回收通过以上述方式进行培养，在反应液中生产出苯酚。可以通过回收反应液来回收苯酚，也可以进一步利用公知的方法从反应液中分离出苯酚。作为这种公知的方法，可以列举蒸馏法、膜透过法、有机溶剂提取法等。实施例以下，利用实施例详细地说明本发明，但本发明不受这些实施例的限定。实施例1苯酚生产基因的克隆和表达(I)从微牛物中提取染 色体DNA从谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum) R(FERM P-18976)中提取染色体 DNA 的操作如下进行:向 A 培养基[将(NH2) 2C02g、(NH4) 2S047g、KH2PO40.5g、K2HPO40.5g、MgSO4.7Η200.5g、0.06% (w/v) Fe2SO4.7H20+0.042% (w/v) MnSO4.2H201ml、0.02%(w/v)生物素溶液lml、0.01% (w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、维生素分析酪蛋白水解物7g溶解于IL蒸馏水中]中添加终浓度为4%的50%(w/v)葡萄糖溶液作为碳源，使用钼环接种后，在33°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名:GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒,安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBRC14144中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到NBRC Medium N0.802培养基[将多聚蛋白胨10g、酵母提取物2g、MgSO4.7H201g溶解于IL蒸馏水中]中后，在37°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名=GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒,安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus) JCM9070中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到JCM Medium N0.22培养基[将蛋白胨10g、牛肉提取物10g、NaC15g溶解于IL蒸馏水中]中后，在30°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名:GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒,安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从枯草芽抱杆菌斯氏亚种(Bacillussubtilis subsp.spizizenii)NBRC 101239中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到NBRC Medium N0.802培养基[将多聚蛋白胨log、酵母提取物2g、MgSO4.7H201g溶解于IL蒸馏水中]中后，在37°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名=GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。克氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)ATCC BAA-895的染色体DNA(目录号BAA-895D-5)从 ATCC (American Type Culture Collection,美国典型培养物保藏中心)获得。从产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes) NBRC13534中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到NBRC Medium N0.802培养基[将多聚蛋白胨10g、酵母提取物2g、MgSO4.7H201g溶解于IL蒸馏水中]中后，在37°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名=GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒,安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae) NBRC13535中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到NBRC Medium N0.802培养基[将多聚蛋白胨10g、酵母提取物2g、MgSO4.7H201g溶解于IL蒸馏水中]中后，在37°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名=GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒,安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)ATCC49162中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到胰酪胨大豆肉汤培养基[将30g胰酪胨大豆肉汤(BD公司制造，目录号211825)溶解于IL蒸馏水中]中后，在30°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名:GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒,安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。阪崎肠杆菌(Enterobactersakazakii) ATCC BAA-894 来源的染色体 DNA (目录号BAA-894D-5)从 ATCC (A merican Type Culture Collection,美国典型培养物保藏中心)获得。从大肠埃希氏菌(Escherichia coli)ff NBRC13500中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到NBRC Medium N0.802培养基[将多聚蛋白胨10g、酵母提取物2g、MgSO4.7H201g溶解于IL蒸馏水中]中后，在30°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名=GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒,安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从弗格森埃希氏菌(Escherichia fergusonii)NBRC102419中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到NBRC Medium N0.802培养基[将多聚蛋白胨10g、酵母提取物2g、MgS04.7H201g溶解于IL蒸馏水中]中后，在30°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名AenomicPr印细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从多粘类芽抱杆菌(Paenibacillus polymyxa)NBRC15309中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到NBRC Medium N0.802培养基[将多聚蛋白胨10g、酵母提取物2g、MgS04.7H201g溶解于IL蒸馏水中]中后，在30°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名KenomicPr印细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。
从菠萝泛菌(Pantoea ananatis) LMG20103中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到BCCM/LMG BacteriCulture Medium N0.1培养基[将牛肉提取物lg、酵母提取物2g、蛋白胨5g、NaC15g溶解于IL蒸馏水中]中后，在30°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名KenomicPr印细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。(2)克隆载体的构建克降载体DCRB22的构律通过以下的PCR法对分别包含乳酪棒杆菌JCMl2072来源的质粒pCASEl的DNA复制起点(以下记作pCASEl-ori)序列和克隆载体pHSG298 (宝生物株式会社制造)的DNA片段进行扩增。PCR时，为了分别将pCASEl-ori序列、克隆载体pHSG298克隆化，基于序列号I (pCASEl-ori序列)、序列号2 (克隆载体-pHSG298)分别合成下述一对引物来使用。pCASEl-ori序列扩增用引物(a-1):5’ -AT AGATCT AGAACGTCCGTAGGAGC-3’(序列号 3)
(b-Ι):5’ -AT AGATCT GACTTGGTTACGATGGAC-3’(序列号 4)另外，引物(a-Ι)和(b-Ι)上附加有BglII限制性内切酶位点。克隆载体pHSG298扩增用引物(a-2):5’ -AT AGATCT AGGITTCCCGACTGGAAAG-3’(序列号 5)(b-2):5，-AT AGATCT CGTGCCAGCTGCATTAATGA-3’(序列号 6)另外，引物(a-2)和(b-2)上附加有BglII限制性内切酶位点。模板DNA使用提取自由日本微生物保藏中心(JCM)获得的乳酪棒杆菌JCM12072的总DNA和克隆载体pHSG298 (宝生物株式会社制造)。实际的PCR中，使用热循环仪GeneAmp PCR系统9700 (应用生物系统公司制造)，并使用TaKaRa LA Taq(宝生物株式会社制造)作为反应试剂在下述的条件下进行。反应液:
权利要求
1.一种具有苯酚生产能力的转化体，其通过将编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的酶的基因导入宿主谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)而得到。
2.如权利要求1所述的转化体，其中，编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的酶的基因为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的基因、萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)来源的基因、枯草芽孢杆菌斯氏亚种(Bacillus subtilis subsp.spizizenii)来源的基因、克氏朽1檬酸杆菌(Citrobacter koseri)来源的基因、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)来源的基因、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)来源的基因、霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)来源的基因、阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)来源的基因、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)来源的基因、弗格森埃希氏菌(Escherichiafergusonii)来源的基因、多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus poIymyxa)来源的基因或菠萝泛菌(Pantoea ananatis)来源的基因。
3.如权利要求1所述的转化体，其中，编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的酶的基因为下述(a)或(b)的DNA， (a)由序列号16、序列号23、序列号26、序列号29、序列号32、序列号35、序列号38、序列号41、序列号44、序列号47、序列号50或序列号53的碱基序列构成的DNA ； (b)在严格的条件下与由(a)中任一个碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交且编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的多肽的DNA。
4.如权利要求1 3中任一项所述的转化体，其中，宿主谷氨酸棒杆菌为存在于其染色体上的、编码具有苯酚2-单加氧酶活性的酶的基因被破坏或发生缺陷的谷氨酸棒杆菌。
5.如权利要求1 4中任一项所述的转化体，其中，宿主谷氨酸棒杆菌为存在于其染色体上的、编码具有4-羟基苯甲酸羟化酶活性的酶的基因被破坏或发生缺陷的谷氨酸棒杆菌。
6.如权利要求1 3中任一项所述的转化体，其中，宿主谷氨酸棒杆菌是保藏编号为FERM P-18976 的谷氨酸棒杆菌 R、ATCC13032 或 ATCC13869。
7.如权利要求1 3中任一项所述的转化体，其中，宿主谷氨酸棒杆菌是存在于保藏编号为FERM P-18976的谷氨酸棒杆菌R、ATCC13032或ATCC13869的染色体上的、编码具有苯酚2-单加氧酶活性的酶的基因被破坏或发生缺陷的谷氨酸棒杆菌。
8.如权利要求1 3中任一项所述的转化体，其中，宿主谷氨酸棒杆菌是存在于保藏编号为FERM P-18976的谷氨酸棒杆菌R、ATCC13032或ATCC13869的染色体上的、编码具有4-羟基苯甲酸羟化酶活性的酶的基因被破坏或发生缺陷的谷氨酸棒杆菌。
9.保藏编号为NITE BP-996 的谷氨酸棒杆菌 PHE21、PHE21-2、PHE21-3、PHE21-4、PHE21-5、PHE21-6、PHE21-7、PHE21-8、PHE21-9、PHE21-10、PHE21-11、PHE21-12、PHE22-1、PHE22-2、PHE22-3、PHE22-4、PHE22-5、PHE22-6、PHE22-7、PHE22-8、PHE22-9、PHE22-10、PHE22-11、PHE22-12、PHE23-1、PHE23-2、PHE23-3、PHE23-4、PHE23-5、PHE23-6、PHE23-7、PHE23-8、PHE23-9、PHE23-10、PHE23-11 或 PHE23-12 的转化体。
10.一种苯酚的制造方法，其中，包括: 使权利要求1 9中任一项所述的转化体在还原条件下、在含有4-羟基苯甲酸酯或其盐的反应液中反应的步骤，和 回收反应液中的苯酚的步骤。
11.如权利要求10所述的苯酚的制造方法，其中，反应步骤中，转化体实质上不增殖。
12.如权利要求10或11所述的苯酚的制造方法，其中，还原条件下的反应液的氧化还原电位为-200 -500毫伏。
全文摘要
一种具有苯酚生产能力的转化体，其通过将编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶(4-hydroxybenzoate decarboxylase)活性的酶的基因导入宿主谷氨酸棒杆菌而得到。一种苯酚的制造方法，其中，包括使该转化体在还原条件下、在含有4-羟基苯甲酸酯或其盐的反应液中反应的步骤和回收反应液中的苯酚的步骤。
文档编号C12P7/22GK103228784SQ20118005441
公开日2013年7月31日 申请日期2011年11月9日 优先权日2010年11月10日
发明者汤川英明, 乾将行 申请人:绿色苯酚·高机能苯酚树脂制造技术研究组合
技术领域：
本发明涉及苯酚生产技术。更详细而言，本发明涉及为了赋予苯酚生产功能而实施了特定基因操作的谷氨酸棒杆菌的转化体及使用该转化体的高效的苯酚的制造技术。
背景技术：
在全球变暖和化石资源枯竭问题的背景下，已经认识到以可再生资源为原料的化学品制造与生物燃料制造并列地作为新产业生物炼制而成为实现低碳社会的重要策略，并聚焦了广泛的关注。但是，对于以可再生资源为原料的生物苯酚生产而言，与乳酸、乙醇的生产相比，从作为原料的糖类开始的代谢反应阶段非常多，因此生产率低，并且作为产物的苯酚会使细菌的增殖受到抑制或者存在由苯酚产生的细胞毒性等，基于上述理由，目前还不能进行工业性的生产。作为苯酚的重要用途，可以列举酚醛树脂。酚醛树脂是由苯酚与醛类的加成缩合反应生成且在塑料中具有最古老历史的树脂，由于其优良的耐热性、耐久性等优点，目前仍被用于汽车用金属替代材料、半导体密封材料、电路基板等各种用途。另外，对于迄今为止的酚醛树脂而言，由于原料苯酚与醛类的反应性极高，所得到的高分子形成复杂的三维网状结构，因此，难以实现聚合物的精密结构设计和在纳米材料中的发展，从而认为难以应用于高附加价值的用途。但是近年来，随着高分子的物性理论和仿真技术的快速发展，只要使网状结构精密化则能够由酚醛树脂创制高功能性材料。在这样的背景下，日本的酚醛树脂生产量正在逐年增加。
目前的苯酚的工业生产法(异丙苯法)是以石油来源的苯和丙烯作为原料、需要大量的溶剂类和大量的热能的、典型的化学工业的高能耗型工艺。因此，从保护地球环境和减少温室效应气体的观点出发，当务之急是开发二氧化碳排放少的节能型的、能够由可再生资源制造的、废弃物排放低的环境和谐型工艺，即建立生物苯酚制造技术。迄今为止尚未报道过自然界中的苯酚生产菌。就利用基因重组菌的苯酚生产技术而言，非专利文献I公开了使用羟基苯甲酸梭菌(Clostridium hydroxybenzoicum)的细胞悬池液或细胞提取液,用50小时将2mM的4-轻基苯甲酸酯/盐完全转变成苯酹的技术。另外，专利文献I公开了使用导入有阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)的4_轻基苯甲酸脱羧酶基因的转化菌由4-羟基苯甲酸酯/盐制造苯酚的技术。但是，非专利文献I和专利文献I的方法在实用中不能高效地制造苯酚。现有技术文献专利文献专利文献1:日本特开2006-050914号非专利文献非专利文献 I !International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol.52，2002, 801-807.
发明内容
发明所要解决的问题本发明的课题在于提供能够以4-羟基苯甲酸酯/盐为原料高效地制造苯酚的微生物、以及能够以4-羟基苯甲酸酯/盐为原料高效地制造苯酚的方法。用于解决问题的手段为了解决上述问题，本发明人反复进行了研究，得到下述发现。(i)在谷氨酸棒杆菌中导入4-羟基苯甲酸脱羧酶基因而得到的转化体能够高效地由4-羟基苯甲酸酯/盐生产苯酚。(ii)该转化体中，存在于宿主谷氨酸棒杆菌的染色体上的苯酚2-单加氧酶基因被破坏或发生缺陷时，能够更高效地生产苯酚。(iii)该转化体在还原条件下的反应液中实质上不增殖的状态下进行反应时，苯酚生产效率特别高。本发明是基于上述发现而完成的，其提供下述转化体及苯酚的制造方法。第I项.一种具有苯酚生产能力的转化体，其通过将编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶(4-hydroxybenzoate decarboxylase)活性的酶的基因导入宿主谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)而得至丨第2项.如第I项所述的转化体，其中，编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的酶的基因为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的基因、萎缩芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus)来源的基因、枯草芽抱杆菌斯氏亚种(Bacillus subtilis subsp.spizizenii)来源的基因、克氏朽1檬酸杆菌(Citrobacter koseri)来`源的基因、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)来源的基因、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)来源的基因、霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)来源的基因、阪崎肠杆菌(Enterobactersakazakii)来源的基因、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)来源的基因、弗格森埃希氏菌(Escherichia fergusonii)来源的基因、多粘类芽抱杆菌(Paenibacillus poIymyxa)来源的基因或菠萝泛菌(Pantoea ananatis)来源的基因。第3项.如第I项所述的转化体，其中，编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的酶的基因为下述(a)或(b)的DNA,(a)由序列号16、序列号23、序列号26、序列号29、序列号32、序列号35、序列号38、序列号41、序列号44、序列号47、序列号50或序列号53的碱基序列构成的DNA ；(b)在严格的条件下与由(a)中任一个碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交且编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的多肽的DNA。第4项.如第I项 第3项中任一项所述的转化体，其中，宿主谷氨酸棒杆菌为存在于其染色体上的、编码具有苯酹2-单加氧酶(phenol 2-monooxygenase)活性的酶的基因被破坏或发生缺陷的谷氨酸棒杆菌。第5项.如第I项 第4项中任一项所述的转化体，其中，宿主谷氨酸棒杆菌为存在于其染色体上的、编码具有4-轻基苯甲酸轻化酶(4-hydroxybenzoate hydroxylase)活性的酶的基因被破坏或发生缺陷的谷氨酸棒杆菌。
第6项.如第I项 第3项中任一项所述的转化体，其中，宿主谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌 R(FERM P-18976)、ATCC13032 或 ATCC13869。第7项.如第I项 第3项中任一项所述的转化体，其中，宿主谷氨酸棒杆菌为存在于谷氨酸棒杆菌R(FERM P-18976)、ATCC13032或ATCC13869的染色体上的、编码具有苯酚2-单加氧酶活性的酶的基因被破坏或发生缺陷的谷氨酸棒杆菌。第8项.如第I项 第3项中任一项所述的转化体，其中，宿主谷氨酸棒杆菌为存在于谷氨酸棒杆菌R(FERM P-18976)、ATCC13032或ATCC13869的染色体上的、编码具有4-羟基苯甲酸羟化酶活性的酶的基因被破坏或发生缺陷的谷氨酸棒杆菌。第9 项.谷氨酸棒杆菌 PHE21(保藏编号:NITE BP-996)、PHE21-2、PHE21-3、PHE21-4、PHE21-5、PHE21-6、PHE21-7、PHE21-8、PHE21-9、PHE21-10、PHE21-11、PHE21-12、PHE22-1、PHE22-2、PHE22-3、PHE22-4、PHE22-5、PHE22-6、PHE22-7、PHE22-8、PHE22-9、PHE22-10、PHE22-11、PHE22-12、PHE23-1、PHE23-2、PHE23-3、PHE23-4、PHE23-5、PHE23-6、PHE23-7、PHE23-8、PHE23-9、PHE23-10、PHE23-11 或 PHE23-12 的转化体。第10项.一种苯酚的制造方法，其中，包括:使第I项 第9项中任一项所述的转化体在还原条件下、在含有4-羟基苯甲酸酯或其盐的反应液中反应的步骤，和回收反应液中的苯酚的步骤。第11项.如第10项所述的苯酚的制造方法，其中，反应步骤中，转化体实质上不
增殖。·第12项.如第10项或第11项所述的苯酚的制造方法，其中，还原条件下的反应液的氧化还原电位为-200 -500毫伏。发明效果通过使用本发明的转化体，能够以高效率由4-羟基苯甲酸酯/盐制造苯酚。一般而言，微生物的增殖会因苯酚这样的溶剂的细胞毒性而受到抑制，因此，难以使用微生物来制造苯酚，但根据本发明方法，能够使用微生物以实用上足够良好的效率制造苯酹。
图1是表示实施例中使用的质粒的构成的图。图2是表示苯酚对各种微生物在需氧条件下的增殖的影响的图。
具体实施例方式以下，对本发明进行详细说明。(I)具有苯酚生产能力的转化体本发明的具有苯酚生产能力的转化体是将编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的酶的基因导入宿主谷氨酸棒杆菌而得到的转化体。宿丰作为宿主使用的谷氨酸棒杆菌为Bargey’ s Manual of DeterminativeBacteriology (伯杰氏系统细菌学手册)，Vol.8，599(1974)中定义的一组微生物。
具体而言，可以列举谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) R(FERMP-18976)、ATCC13032、ATCC13869、ATCC13058、ATCC13059、ATCC13060、ATCC13232、ATCC13286、ATCC13287、ATCC13655、ATCC13745、ATCC13746、ATCC13761、ATCC14020、ATCC31831、MJ-233(FERM BP-1497)或 MJ-233AB-41 (FERM BP-1498)等菌株。其中，优选R(FERM P-18976)株、ATCC13032 株及 ATCC13869 株，更优选 R(FERM P-18976)株。另外,根据分子生物学的分类,黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、散枝短杆菌(Brevibacterium divaricatum)、百合棒杆菌(Corynebacterium Iilium)等棒状细菌的菌名也统一在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中[Liebl, ff.et al., Transfer of Brevibacteriumdivaricatum DSM20297T, “Brevibacterium flavum”DSM20411， “Brevibacteriumlactofermentum，，DSM20412and DSM1412, and Corynebacterium glutamicum and theirdistinction by rRNA gene restriction patterns.1nt J Syst Bacteriol.41:255-260.(1991)，驹形和男等，棒状细菌的分类，发酵与工业，45:944-963 (1987)]，因此，包含在本发明中。另外，除了野生株以外，谷氨酸棒杆菌也可以是其突变株或人工的基因重组体。可以列举例如乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyrvate carboxylase)、苹果酸脱氧酶(malate dehydrogenase)等的基因的破坏株。通过使用这种基因破坏株作为宿主，能够提高苯酚的生产率或抑制副产物的生成。其中，优选乳酸脱氢酶基因的破坏株。该基因破坏株中，乳酸脱氢酶基因被破坏，由此使丙酮酸至乳酸的代谢途径被阻断。其中，特别优选谷氨酸棒杆菌R(FERM P-18976)株的乳酸脱氢酶基因的破 坏株。这种基因破坏株可以通过基因工程的方法按照常规方法来制作。例如，W02005/010182A1中记载了乳酸脱氢酶破坏株及其制作方法。4~羊子基苯甲酸月兑豫酶基因(bsdBCD或dca)4-羟基苯甲酸脱羧酶为催化通过4-羟基苯甲酸酯/盐脱羧而生成苯酚的反应的酶。编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的酶的基因的来源没有特别限定，可以列举:枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽抱杆菌(Bacillus megaterium)、地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)、萎缩芽抱杆菌(Bacillus atrophaeus)、枯草芽抱杆菌斯氏亚种(Bacillus subtilis subsp.spizizenii)等芽孢杆菌属细菌来源的基因；克氏朽1檬酸杆菌(Citrobacter koseri)等朽1檬酸杆菌属细菌来源的基因；产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、霍氏肠杆菌(Enterobacterhormaechei)、阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)等肠杆菌属细菌来源的基因；大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、弗格森埃希氏菌(Escherichia fergusonii)等埃希氏菌属细菌来源的基因；多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus poIymyxa)等类芽孢杆菌属细菌来源的基因；菠萝泛菌(Pantoea ananatis)等泛菌属细菌来源的基因等。其中，优选芽孢杆菌属细菌特别是枯草芽孢杆菌来源的基因、肠杆菌属细菌特别是阴沟肠杆菌来源的基因、埃希氏菌属细菌特别是大肠埃希氏菌来源的基因。另外，编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的酶的基因根据来源使用各种不同的简称。例如，枯草芽孢杆菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因简称为bsdBCD。本说明书中，有时无论来源如何将4-羟基苯甲酸脱羧酶基因均简称为“dca”。作为枯草芽孢杆菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号16的碱基序列构成的DNA，作为萎缩芽孢杆菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号23的碱基序列构成的DNA，作为枯草芽孢杆菌斯氏亚种来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号26的碱基序列构成的DNA，作为克氏柠檬酸杆菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号29的碱基序列构成的DNA，作为产气肠杆菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号32的碱基序列构成的DNA，作为阴沟肠杆菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号35的碱基序列构成的DNA，作为霍氏肠杆菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号38的碱基序列构成的DNA，作为阪崎肠杆菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号41的碱基序列构成的DNA，作为大肠埃希氏菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号44的碱基序列构成的DNA，作为弗格森埃希氏菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号47的碱基序列构成的DNA，作为多粘类芽孢杆菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号50的碱基序列构成的DNA，作为菠萝泛菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号53的碱基序列构成的DNA。另外，本发明中，也可以使用在严格的条件下与由序列号16、序列号23、序列号26、序列号29、序列号32、序列号35、序列号38、序列号41、序列号44、序列号47、序列号50或序列号53的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交且编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的多肽的DNA。本发明中，“严格的条件”是指一般的条件、例如Molecular Cloning, A LaboratoryManual (分子克隆实验指南)，第二版，1989，Vol2, pll.45中记载的条件。具体而言,是指在比完全杂交的解链温度(Tm)低5 10°C的温度下发生杂交的情况。4_轻基苯甲酸脱竣酶活性可以利用《Genomics, 86，342-351，2005 “Materialsand Methods”》中记载的 方法进行测定。简单地来说明，向试验用液中添加被测酶，制备含有IOOmM MES, pH6.0UmM DTT、5mM4-羟基苯甲酸酯/盐和酶的反应液，测定270nm下的吸光度的斜率(初速度)。对于不添加4-羟基苯甲酸酯/盐的体系也同样进行反应，作为背景值。将两个测定值的差作为4-羟基苯甲酸脱羧酶活性。另外，本发明中，也可以使用由与序列号16、序列号23、序列号26、序列号29、序列号32、序列号35、序列号38、序列号41、序列号44、序列号47、序列号50或序列号53的碱基序列具有90%以上、优选95%以上、更优选98%以上的同一性的碱基序列构成且编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的多肽的DNA。本发明中，碱基序列的同一性是利用GENETYX第8版(GENETYX株式会社七1、f ^ ^制造)算出的值。由序列号16、序列号23、序列号26、序列号29、序列号32、序列号35、序列号38、序列号41、序列号44、序列号47、序列号50或序列号53的碱基序列构成的DNA的同源物可以通过例如使用基于这些碱基序列按照常规方法设计的引物或探针的PCR或杂交由其他生物种的DNA文库中选择，由此以高概率得到编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的多肽。用于转化的载体的构建
将通过PCR扩增得到的编码4-羟基苯甲酸脱羧酶的DNA各自克隆到能够在宿主中扩增的适当的载体中即可。作为质粒载体，只要是包含在谷氨酸棒杆菌内担负自主复制功能的基因的质粒载体即可。作为其具体例，可以列举:乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)2256 来源的 pAM330[日本特开昭 58-67699]、[Miwa, K.etal.，Cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria.Agric.Biol.Chem.48:2901-2903(1984)]和[Yamaguchi，R.et al., Determination of the completenucleotide sequence of the Brevibacterium lactofermentum plasmid pAM330and theanalysis of its genetic information.Nucleic Acids Symp.Ser.16:265-267 (1985)]、谷氨酸棒杆菌ATCC13058来源的pHM1519[Miwa，K.et al., Cryptic plasmids in glutamicacid-producing bacteria.Agric.Biol.Chem.48:2901-2903 (1984)]和 pCRY30 [Kurusu，Y.et al.，Identification of plasmid partition function in coryneform bacteria.App1.Environ.Microbiol.57:759-764(1991)]、谷氨酸棒杆菌 T250 来源的 pCG4[日本特开昭 57-183799]、[Katsumata,R.et al., Protoplast transformation ofglutamate-producing bacteria with plasmid DNA.J.Bacteriol.、159:306-311(1984)]、pAGl、pAG3、pAG14、pAG50[日本特开昭 62-166890]、pEKO、pEC5、pEKExl [Eikmanns，Β.J.etal., A family of Corynebacterium glutamicum/Escherichia coli shuttle vectors forcloning,controlled gene expression,and promoter probing.Gene, 102:93-98(1991)]
坐寸ο作为优选的启动子，可以列举谷氨酸棒杆菌R来源的甘油醛-3-磷酸脱氢酶A基因(gapA)的启动子PgapA、苹果酸脱氢酶基因(mdh)的启动子Pmdh、乳酸脱氢酶A基因(IdhA)的启动子PldhA等,其中，优选PgapA。作为优选的终止子，可以列举大肠杆菌rRNA操纵子的rrnB T1T2终止子、大肠杆菌的trpA终止子、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)的trp终止子等，其中，优选rrnB TIT2终止子。MiL转化方法可以没有限制地使用公知的方法。作为这样的公知的方法，可以列举例如氯化钙/氯化铷法、磷酸钙法、DEAE-葡聚糖介导的转染、电穿孔法等。其中，对于谷氨酸棒杆菌优选电脉冲法，电脉冲法可以通过公知的方法[Kurusu, Y.et al.，Electroporation-transformation system for Coryneform bacteria by auxotrophiccomplementation.Agric.Biol.Chem.54:443-447 (1990)]和[Vertes A.A.etal., Presence of mrr-and mcr-like restriction systems in Coryneform bacteria.Res.Microbiol.144:181-185(1993)]进行。转化体使用微生物的培养中通常使用的培养基进行培养即可。作为该培养基，通常可以使用含有碳源、氮源、无机盐类及其他营养物质等的天然培养基或合成培养基等。作为碳源，可以列举:葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖、麦芽糖、甘露糖醇、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、淀粉、糖蜜、山梨糖醇、甘油等糖质或糖醇；乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、马来酸或葡糖酸等有机酸；乙醇、丙醇等醇等。另外 ，还可以根据期望使用正链烷烃等烃等。碳源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。培养基中的这些碳源的浓度通常设定为约0.1 约10 (w/v%)即可。作为氮源，可以列举:氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵等无机铵化合物或有机铵化合物、尿素、氨水、硝酸钠、硝酸钾等。另外，也可以使用玉米浆、肉提取物、蛋白胨、NZ-胺、蛋白质水解物、氨基酸等含氮有机化合物等。氮源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。培养基中的氮源浓度因使用的氮化合物而异，通常设定为约0.1 约10(w/v%)即可。作为无机盐类，可以列举例如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴或碳酸钙等。这些无机盐可以单独使用一种或者两种以上混合使用。培养基中的无机盐类浓度因使用的无机盐而异，通常设定为约0.01 约I (w/v%)即可。作为营养物质，可以列举例如肉提取物、蛋白胨、多聚蛋白胨、酵母提取物、干酵母、玉米浆、脱脂奶粉、脱脂大豆盐酸水解物或者动植物或微生物菌体的提取物或它们的分解物等。营养物质的培养基浓度因使用的营养物质而异，通常设定为约0.1 约10(w/v%)即可。另外，还可以根据需要添加维生素类。作为维生素类，可以列举例如生物素、硫胺素(维生素BI)、吡哆醇(维生素B6)、泛酸、肌醇、尼克酸等。培养基的pH优选约5 约8。作为优选的微生物培养培养基，可以列举A培养基[Inui, M.et al., Metabolicanalysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinateproductions under oxygen deprivation conditions.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.7:182-196(2004)]、BT 培养基[Omumasaba, C.A.et al., Corynebacteriumglutami cum glyceraIdehyde- 3-phosphate dehydrogenase isoforms withopposite,ATP-dependent regulation.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8:91-103(2004)] 培养温度设定为约15°C 约45°C即可，培养时间设定为约I天 约7天即可。_0] 宿主染色体基因的破坏或缺失宿主谷氨酸棒杆菌中，优选存在于其染色体上的、编码具有苯酚2-单加氧酶活性的酶的基因(poxF)被破坏或发生缺失，由此能够更高效地制造苯酹。另外，宿主谷氨酸棒杆菌中，优选存在于其染色体上的、编码具有4-羟基苯甲酸羟化酶活性的酶的基因(PobA)被破坏或发生缺失，由此，能够更高效地制造苯酚。特别优选poxF和pobA这两者均被破坏或发生缺失。制作以使基因的部分序列缺失而不产生正常发挥功能的酶蛋白的方式进行改变后的缺失型基因，利用包含该基因的DNA转化细菌，在缺失型基因与染色体上的基因之间引起同源重组，由此能够将染色体上的基因置换成缺失型或破坏型的基因。由缺失型或破坏型的基因编码的酶蛋白即使生成也具有与野生型酶蛋白不同的立体结构，功能降低或消失。由这种利用同源重组的基因置换所致的基因缺失或破坏方法已经确立，有:使用包含温度敏感性复制起点的质粒、能够进行接合转移的质粒的方法；利用在宿主内不具有复制起点的自杀载体的方法等(美国专利第6303383号、日本特开平05-007491号)。具体而言，通过实施例1的项目中记载的方法，能够得到poxF被破坏或缺失的谷氨酸棒杆菌。另外，通过同样的方法，能够得到PobA被破坏或缺失的谷氨酸棒杆菌。(II)苯酷的制造方法
可以通过包括使上述说明过的本发明的转化体在含有4-羟基苯甲酸酯/盐的反应液中反应的步骤和回收反应液中的苯酚的步骤的方法来制造苯酚。微牛物的增葙在反应之前，优选将转化体在需氧条件下、在约25°C 约38°C的温度下培养约12小时 约48小时而使其增殖。培养用培养基反应之前的转化体的需氧培养中使用的培养基可以使用含有碳源、氮源、无机盐类及其他营养物质等的天然培养基或合成培养基。作为碳源，也可以使用:糖类(葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖等单糖；蔗糖、麦芽糖、乳糖、纤维二糖、木二糖、海藻糖等二糖；淀粉等多糖；糖蜜等);甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇 、甘油等糖醇；乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、马来酸、葡糖酸等有机酸；乙醇、丙醇等醇；正链烷烃等烃等。碳源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。作为氮源，可以使用氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵等无机铵化合物或有机铵化合物、尿素、氨水、硝酸钠、硝酸钾等。另外，也可以使用玉米浆、肉提取物、蛋白胨、NZ-胺、蛋白质水解物、氨基酸等含氮有机化合物等。氮源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。氮源在培养基中的浓度因使用的氮化合物而异，通常设定为约0.1 约10(w/v%)即可。作为无机盐类，可以列举磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴、碳酸钙等。无机盐可以单独使用一种或者两种以上混合使用。无机盐类在培养基中的浓度因使用的无机盐而异，通常设定为约0.01 约I (w/v%)即可。作为营养物质，可以列举肉提取物、蛋白胨、多聚蛋白胨、酵母提取物、干酵母、玉米浆、脱脂奶粉、脱脂大豆盐酸水解物、动植物或微生物菌体的提取物或它们的分解物等。营养物质在培养基中的浓度因使用的营养物质而异，通常设定为约0.1 约10(w/v%)即可。还可以根据需要进一步添加维生素类。作为维生素类，可以列举生物素、硫胺素(维生素BI)、吡哆醇(维生素B6)、泛酸、肌醇、尼克酸等。培养基的pH优选约6 约8。作为具体的优选的谷氨酸棒杆菌用培养基，可以列举A培养基[Inui, M.et al., Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate andsuccinate productions under oxygen deprivation conditions.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.7:182-196 (2004)]、BT 培养基[Omumasaba, C.A.et al.,Corynebacteriumglutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms withopposite,ATP-dependent regulation.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8:91-103(2004)]等。这些培养基中，使糖类浓度在上述范围内来使用即可。反应液反应液可以使用含有苯酚前体(苯酚原料)的水、缓冲液、无机盐培养基等。作为前体，使用4-羟基苯甲酸酯/盐。作为4-羟基苯甲酸酯/盐，可以列举钠盐、钾盐等盐；与碳原子数I 4的醇的酯等。其中，优选盐，更优选钠盐。前体可以单独使用一种或者两种以上混合使用。
反应液中的4-羟基苯甲酸酯/盐的浓度优选约0.5 约20 (w/v%)，更优选约I 约10(w/v%),进一步优选约2 约5(w/v%)。4-轻基苯甲酸酯/盐由于为芳香族化合物而具有抑制细胞存活的作用，但4-羟基苯甲酸酯/盐浓度为上述范围时，能够高效地制造苯酚。作为缓冲液，可以列举磷酸缓冲液、Tris缓冲液、碳酸缓冲液等。缓冲液的浓度优选约IOmM 约150mM。作为无机盐培养基，可以列举含有磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴、碳酸钙等无机盐中的一种或两种以上的培养基。其中，优选含有硫酸镁的培养基。作为无机盐培养基，具体而言，可以列举BT培养基[Omumasaba, C.A.et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8:91-103 (2004)]等。无机盐类在培养基中的浓度因使用的无机盐而异,通常设定为约0.01 约I (w/v%)即可。反应液的pH优选约6 约8。反应中,优选在使用氨水溶液、氢氧化钠水溶液等利用PH控制器(例如，工4 O株式会社制造，型号:DT-1023)将反应液的pH控制在中性附近、特别是约7的同时进行反应。反应条件反应温度即反应中的转化体的存活温度优选约20°C 约50°C，更优选约25 V 约47°C。反应温度为上述温度范围时，能够高效地制造苯酚。
另外，反应时间优选约I天 约7天，更优选约I天 约3天。培养可以是分批培养、流加培养、连续培养中的任何一种。其中，优选分批培养。<还原备件>反应可以在需氧条件下进行，也可以在还原条件下进行，优选在还原条件下进行。在还原条件下，谷氨酸棒杆菌实质上不增殖，能够更高效地生产苯酚。还原条件由反应液的氧化还原电位规定。反应液的氧化还原电位优选约-200mV 约-500mV，更优选约_250mV 约_500mV。反应液的还原状态可以简单地利用刃天青指示剂(在还原状态下由蓝色脱色为无色)推测，使用氧化还原电位差计(例如，BR0ADLEY JAMES公司制造，ORP电极)能够准确地测定。处于还原条件下的反应液的制备方法可以没有限制地使用公知的方法。例如，可以使用反应液用水溶液代替蒸馏水等作为反应液制备用的液体介质，反应液用水溶液的制备方法参考例如硫酸还原微生物等绝对厌氧性微生物用的培养液制备方法(Pfennig, Net.al., (1981):The dissimilatory sulfate-reducing bacteria, In The Prokaryotes, AHandbook on Habitats, Isolation and Identification of Bacteria, Ed.by Starr, M.P.et.al.p.926-940, Berlin, Springer Verlag.)或“农艺化学实验书第三卷、京都大学农学部农艺化学教室编、1990年第26次印刷、产业图书株式会社出版”等，能够得到期望的还原条件下的水溶液。具体而言，可以通过对蒸馏水等进行加热处理或减压处理将溶解气体除去而得到还原条件的反应液用水溶液。在这种情况下，可以通过在约IOmmHg以下、优选约5mmHg以下、更优选约3mmHg以下的减压条件下将蒸懼水等处理约I分钟 约60分钟、优选约5分钟 约40分钟来将溶解气体、特别是溶解氧除去而得到还原条件下的反应液用水溶液。另外，也可以添加适当的还原剂(例如，硫代乙醇酸、抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、巯基乙酸、硫代乙酸、谷胱甘肽、硫化钠等)来制备还原条件的反应液用水溶液。将上述方法适当组合而成的方法也是有效的还原条件的反应液用水溶液的制备方法。反应中也优选将反应液维持于还原条件。为了维持反应过程中的还原条件，优选尽可能地防止从反应体系外混入氧，具体而言，可以列举将反应体系用氮气等惰性气体或二氧化碳等密封的方法。作为更有效地防止氧混入的方法，为了在反应过程中使本发明的需氧性细菌的菌体内的代谢功能高效地发挥作用，有时也需要添加维持反应体系的PH的调节液或适当添加各种营养素溶解液，在这种情况下，预先从添加溶液中除去氧是有效的。苯酚的回收通过以上述方式进行培养，在反应液中生产出苯酚。可以通过回收反应液来回收苯酚，也可以进一步利用公知的方法从反应液中分离出苯酚。作为这种公知的方法，可以列举蒸馏法、膜透过法、有机溶剂提取法等。实施例以下，利用实施例详细地说明本发明，但本发明不受这些实施例的限定。实施例1苯酚生产基因的克隆和表达(I)从微牛物中提取染 色体DNA从谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum) R(FERM P-18976)中提取染色体 DNA 的操作如下进行:向 A 培养基[将(NH2) 2C02g、(NH4) 2S047g、KH2PO40.5g、K2HPO40.5g、MgSO4.7Η200.5g、0.06% (w/v) Fe2SO4.7H20+0.042% (w/v) MnSO4.2H201ml、0.02%(w/v)生物素溶液lml、0.01% (w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、维生素分析酪蛋白水解物7g溶解于IL蒸馏水中]中添加终浓度为4%的50%(w/v)葡萄糖溶液作为碳源，使用钼环接种后，在33°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名:GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒,安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBRC14144中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到NBRC Medium N0.802培养基[将多聚蛋白胨10g、酵母提取物2g、MgSO4.7H201g溶解于IL蒸馏水中]中后，在37°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名=GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒,安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus) JCM9070中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到JCM Medium N0.22培养基[将蛋白胨10g、牛肉提取物10g、NaC15g溶解于IL蒸馏水中]中后，在30°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名:GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒,安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从枯草芽抱杆菌斯氏亚种(Bacillussubtilis subsp.spizizenii)NBRC 101239中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到NBRC Medium N0.802培养基[将多聚蛋白胨log、酵母提取物2g、MgSO4.7H201g溶解于IL蒸馏水中]中后，在37°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名=GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。克氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)ATCC BAA-895的染色体DNA(目录号BAA-895D-5)从 ATCC (American Type Culture Collection,美国典型培养物保藏中心)获得。从产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes) NBRC13534中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到NBRC Medium N0.802培养基[将多聚蛋白胨10g、酵母提取物2g、MgSO4.7H201g溶解于IL蒸馏水中]中后，在37°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名=GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒,安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae) NBRC13535中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到NBRC Medium N0.802培养基[将多聚蛋白胨10g、酵母提取物2g、MgSO4.7H201g溶解于IL蒸馏水中]中后，在37°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名=GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒,安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)ATCC49162中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到胰酪胨大豆肉汤培养基[将30g胰酪胨大豆肉汤(BD公司制造，目录号211825)溶解于IL蒸馏水中]中后，在30°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名:GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒,安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。阪崎肠杆菌(Enterobactersakazakii) ATCC BAA-894 来源的染色体 DNA (目录号BAA-894D-5)从 ATCC (A merican Type Culture Collection,美国典型培养物保藏中心)获得。从大肠埃希氏菌(Escherichia coli)ff NBRC13500中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到NBRC Medium N0.802培养基[将多聚蛋白胨10g、酵母提取物2g、MgSO4.7H201g溶解于IL蒸馏水中]中后，在30°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名=GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒,安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从弗格森埃希氏菌(Escherichia fergusonii)NBRC102419中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到NBRC Medium N0.802培养基[将多聚蛋白胨10g、酵母提取物2g、MgS04.7H201g溶解于IL蒸馏水中]中后，在30°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名AenomicPr印细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从多粘类芽抱杆菌(Paenibacillus polymyxa)NBRC15309中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到NBRC Medium N0.802培养基[将多聚蛋白胨10g、酵母提取物2g、MgS04.7H201g溶解于IL蒸馏水中]中后，在30°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名KenomicPr印细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。
从菠萝泛菌(Pantoea ananatis) LMG20103中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到BCCM/LMG BacteriCulture Medium N0.1培养基[将牛肉提取物lg、酵母提取物2g、蛋白胨5g、NaC15g溶解于IL蒸馏水中]中后，在30°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名KenomicPr印细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。(2)克隆载体的构建克降载体DCRB22的构律通过以下的PCR法对分别包含乳酪棒杆菌JCMl2072来源的质粒pCASEl的DNA复制起点(以下记作pCASEl-ori)序列和克隆载体pHSG298 (宝生物株式会社制造)的DNA片段进行扩增。PCR时，为了分别将pCASEl-ori序列、克隆载体pHSG298克隆化，基于序列号I (pCASEl-ori序列)、序列号2 (克隆载体-pHSG298)分别合成下述一对引物来使用。pCASEl-ori序列扩增用引物(a-1):5’ -AT AGATCT AGAACGTCCGTAGGAGC-3’(序列号 3)
(b-Ι):5’ -AT AGATCT GACTTGGTTACGATGGAC-3’(序列号 4)另外，引物(a-Ι)和(b-Ι)上附加有BglII限制性内切酶位点。克隆载体pHSG298扩增用引物(a-2):5’ -AT AGATCT AGGITTCCCGACTGGAAAG-3’(序列号 5)(b-2):5，-AT AGATCT CGTGCCAGCTGCATTAATGA-3’(序列号 6)另外，引物(a-2)和(b-2)上附加有BglII限制性内切酶位点。模板DNA使用提取自由日本微生物保藏中心(JCM)获得的乳酪棒杆菌JCM12072的总DNA和克隆载体pHSG298 (宝生物株式会社制造)。实际的PCR中，使用热循环仪GeneAmp PCR系统9700 (应用生物系统公司制造)，并使用TaKaRa LA Taq(宝生物株式会社制造)作为反应试剂在下述的条件下进行。反应液:
权利要求
1.一种具有苯酚生产能力的转化体，其通过将编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的酶的基因导入宿主谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)而得到。
2.如权利要求1所述的转化体，其中，编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的酶的基因为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的基因、萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)来源的基因、枯草芽孢杆菌斯氏亚种(Bacillus subtilis subsp.spizizenii)来源的基因、克氏朽1檬酸杆菌(Citrobacter koseri)来源的基因、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)来源的基因、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)来源的基因、霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)来源的基因、阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)来源的基因、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)来源的基因、弗格森埃希氏菌(Escherichiafergusonii)来源的基因、多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus poIymyxa)来源的基因或菠萝泛菌(Pantoea ananatis)来源的基因。
3.如权利要求1所述的转化体，其中，编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的酶的基因为下述(a)或(b)的DNA， (a)由序列号16、序列号23、序列号26、序列号29、序列号32、序列号35、序列号38、序列号41、序列号44、序列号47、序列号50或序列号53的碱基序列构成的DNA ； (b)在严格的条件下与由(a)中任一个碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交且编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的多肽的DNA。
4.如权利要求1 3中任一项所述的转化体，其中，宿主谷氨酸棒杆菌为存在于其染色体上的、编码具有苯酚2-单加氧酶活性的酶的基因被破坏或发生缺陷的谷氨酸棒杆菌。
5.如权利要求1 4中任一项所述的转化体，其中，宿主谷氨酸棒杆菌为存在于其染色体上的、编码具有4-羟基苯甲酸羟化酶活性的酶的基因被破坏或发生缺陷的谷氨酸棒杆菌。
6.如权利要求1 3中任一项所述的转化体，其中，宿主谷氨酸棒杆菌是保藏编号为FERM P-18976 的谷氨酸棒杆菌 R、ATCC13032 或 ATCC13869。
7.如权利要求1 3中任一项所述的转化体，其中，宿主谷氨酸棒杆菌是存在于保藏编号为FERM P-18976的谷氨酸棒杆菌R、ATCC13032或ATCC13869的染色体上的、编码具有苯酚2-单加氧酶活性的酶的基因被破坏或发生缺陷的谷氨酸棒杆菌。
8.如权利要求1 3中任一项所述的转化体，其中，宿主谷氨酸棒杆菌是存在于保藏编号为FERM P-18976的谷氨酸棒杆菌R、ATCC13032或ATCC13869的染色体上的、编码具有4-羟基苯甲酸羟化酶活性的酶的基因被破坏或发生缺陷的谷氨酸棒杆菌。
9.保藏编号为NITE BP-996 的谷氨酸棒杆菌 PHE21、PHE21-2、PHE21-3、PHE21-4、PHE21-5、PHE21-6、PHE21-7、PHE21-8、PHE21-9、PHE21-10、PHE21-11、PHE21-12、PHE22-1、PHE22-2、PHE22-3、PHE22-4、PHE22-5、PHE22-6、PHE22-7、PHE22-8、PHE22-9、PHE22-10、PHE22-11、PHE22-12、PHE23-1、PHE23-2、PHE23-3、PHE23-4、PHE23-5、PHE23-6、PHE23-7、PHE23-8、PHE23-9、PHE23-10、PHE23-11 或 PHE23-12 的转化体。
10.一种苯酚的制造方法，其中，包括: 使权利要求1 9中任一项所述的转化体在还原条件下、在含有4-羟基苯甲酸酯或其盐的反应液中反应的步骤，和 回收反应液中的苯酚的步骤。
11.如权利要求10所述的苯酚的制造方法，其中，反应步骤中，转化体实质上不增殖。
12.如权利要求10或11所述的苯酚的制造方法，其中，还原条件下的反应液的氧化还原电位为-200 -500毫伏。
全文摘要
一种具有苯酚生产能力的转化体，其通过将编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶(4-hydroxybenzoate decarboxylase)活性的酶的基因导入宿主谷氨酸棒杆菌而得到。一种苯酚的制造方法，其中，包括使该转化体在还原条件下、在含有4-羟基苯甲酸酯或其盐的反应液中反应的步骤和回收反应液中的苯酚的步骤。
文档编号C12P7/22GK103228784SQ20118005441
公开日2013年7月31日 申请日期2011年11月9日 优先权日2010年11月10日
发明者汤川英明, 乾将行 申请人:绿色苯酚·高机能苯酚树脂制造技术研究组合
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