扩增胰岛β细胞和使其再分化的方法
专利名称：扩增胰岛β细胞和使其再分化的方法
扩增胰岛β细胞和使其再分化的方法发明领域和背景I型糖尿病是由于胰岛产胰岛素β细胞的自身免疫破坏所导致的。因为难以调整最佳胰岛素剂量，胰岛素施用不能阻止该疾病的长期并发症。用经调控的产胰岛素细胞替换损伤的细胞被认为是I型糖尿病的终极疗法。胰腺移植已获成功，但受供体缺乏的严重限制。随着新型胰岛分离和免疫抑制方法的发展，已报道了每个接受者利用来自2-3个供体的膜岛的显著成功(Shapiro AM, Lakey JR, Ryan EA 等人.New Engl J Med 2000 ；343:230-238)。该进展强调了开发人类胰腺供体的替代形式的迫切需要，即用于移植的培养的人类β细胞的丰富来源。终末分化的、有丝分裂期后的胰岛细胞难以在组织培养中扩增(expand)。将成体的和胎儿的人类胰岛细胞培养于含IlmM葡萄糖并补充有10% FBS和肝细胞生长因子的RPMI 1640培养基中的HTB-9基质上，其表现以最多10-15次群体倍增增殖，之后经历衰老。利用逆转录病毒将人类端粒酶(hTERT)的催化亚基导入到细胞中，其表达不能延长复制时间跨度(Halvorsen TL, Beattie GM, Lopez AD, Hayek A, Levine F.J Endocrinol 2000 ；166 =103-109)。由于大量的细胞死亡，该方法导致胰岛细胞团块的3-4次扩增。通过延长的培养进行β细胞扩增的过程伴有细胞的去分化。在许多情况下，细胞的去分化伴有表型的重大改变，其中其形态从含大量细胞-细胞连接和细胞角蛋白纤维网络的上皮细胞的形态变为具有成纤维细胞或间充质外观的细胞的形态。该去分化的过程称作上皮细胞-间充质细胞转变(EMT)，并认为其部分地受锌指转录因子Snail的诱导介导。Slug，是Snail家族成员，已参与皮肤创伤的再上皮化和损伤后受损的骨骼肌的再生。在胰腺干细胞的领域中，Gershengorn等人[Science，2004，306，2261-2264]，提出了培养的原代β细胞能够EMT和 去分化为成纤维细胞样(fibroblastoid-like)的细胞类型。Gershengorn提出了该过程可被逆转，且这些成纤维细胞样细胞随后可通过所谓的间充质细胞-上皮细胞转变再分化为胰腺内分泌细胞。该文章发表后，Gershongorn收回了该说法并表明，经历分化的是存在于胰岛中的间充质干细胞而非去分化的β细胞[Davani等人，Stem cells，卷 25，第 12 期，3215-3222 页，2007]。有丝分裂后的β细胞的被迫扩增的替代方式是诱导具有天然的自我扩增能力的干细胞/祖细胞分化成产胰岛素细胞。胚胎干细胞的定向分化已生成了与β细胞相比较仅产生少量胰岛素的细胞，且其在移植中的潜在用途遭遇伦理上的反对、以及有关畸胎瘤的风险的担心。还已将成体干细胞分化为产胰岛素细胞。然而，这些细胞类型在组织培养中的扩增效率和其分化为产胰岛素细胞的比率需要极大地提高以允许用于移植的大量细胞数目的产生。已清楚地证明，利用激活发育事件的级联反应的主要基因(dominant gene)可至少部分地使定型细胞重编程。本发明人的美国专利申请第20050244966号教导了通过导向内分泌胰腺发育的主要转录因子诸如Pdxl的表达，胎儿肝细胞重编程为β样产胰岛素细胞。诱导人类胎儿肝细胞大量地产生并贮存成熟的胰岛素，其中约三分之一由正常β细胞产生，响应于生理葡萄糖水平而释放，并在STZ-糖尿病非肥胖型糖尿病重症联合免疫缺陷(NOD-scid)小鼠中替代细胞功能。该修饰的细胞表达多种细胞基因。已在表皮生长因子和神经生长因子的存在下离体(ex vivo)扩增了胰岛细胞。虽然这些细胞表现了高胰岛素含量，但它们不响应于葡萄糖分泌胰岛素(Lechner A.等人，Biochem Biophys Res Commun327:581-588,2005)。国际申请W02006/054305教导了在CMRL-1066培养基中扩增胰岛细胞。已显示大量的因子促进组织培养中的β -细胞增殖和分化二者。生长激素家族成员，包括胎盘催乳激素(PL)、生长激素(GH)和促乳素(PRL)，在新生大鼠胰岛细胞中诱导复制。已观察到肝细胞生长因子(HGF)对人类胎儿和成体胰岛以及小鼠胰岛的显著的促分裂效应。在激活素A或烟酰胺存在下，已显示HGF在培养的胎儿胰岛中以及胰腺细胞系中刺激β-细胞分化。已显示胰高血糖素样肽I (GLP-1)和其更稳定的类似物exendin-4在胰腺细胞系中刺激β_细胞增殖和诱导胰岛素基因表达。还已显示表皮生长因子(EGF)家族成员，包括EGF、TGFa和β细胞素(betacellulin)，刺激β-细胞增殖和分化。β细胞素对于包括胰岛β (β)细胞的多种细胞类型是有效的有丝分裂原。显示其可在阿脲和STZ处理的小鼠中增加胰岛素新生，并在90%胰腺切除术的大鼠中加速胰岛素再生[Li L，等人，Endocrinology 2001；142:5379-5385]。Rukstalis 等人[Endocri nology 147 (6) 2997-3006]教导了转录因子 Snail 在永生化的胰腺内分泌细胞系中调节激素表达。而且，公开了，在那些细胞系中利用siRNA使Snail下调提闻了膜岛素基因表达。美国专利申请第20060292127号教导了通过将细胞与调控转录因子Snail/slug/slit家族的剂相接触使β细胞去分化而不是再分化。国际申请W02006/054305教导了在含β细胞素和/或ngn_3的培养基中的扩增的β细胞的再分化。发明概沭根据本发明的一些实施方案的方面，提供了离体提高成体胰岛β细胞中胰岛素含量的方法，该方法包括将成体胰岛β细胞暴露于含烟酰胺、exendin-4、激活素A和葡萄糖的培养基，该培养基不含血清，从而提高成体胰岛β细胞中的胰岛素含量。离体提高表达SLUG的祖细胞中胰岛素含量的方法，所述方法包括使所述祖细胞中的所述SLUG的量或活性下调，从而提高所述祖细胞中的胰岛素含量。根据本发明的一些实施方案的方面，提供了细胞的分离的群体(isolatedpopulation of cells),其包含下调SLUG的siRNA,其中所述细胞分泌胰岛素。根据本发明的一些实施方案的方面，提供了根据本发明的方法生成的细胞的分离的群体。根据本发明的一些实施方案的方面，提供了在受治疗者中治疗糖尿病的方法，所述方法包括将治疗有效量的本发明的成体胰岛β细胞的群体移植到受治疗者中，从而治疗糖尿病。根据本发明的一些实施方案的方面，提供了本发明的成体胰岛β细胞的群体在受治疗者中治疗糖尿病的应用。
包含本发明的成体胰岛β细胞的群体作为活性成分的药物组合物。根据本发明的一些实施方案，方法包括:(a)将成体胰岛β细胞暴露于含烟酰胺、exendin-4、激动素A的培养基，其中葡萄糖以IO-1OOmM的浓度存在；和随后(b)将成体胰岛β细胞暴露于含烟酰胺和exendin-4的另外的培养基，其中葡萄糖以0.5-10mM的浓度存在。根据本发明的一些实施方案，烟酰胺以1-1OOmM的浓度存在。根据本发明的一些实施方案，exendin-4以1-1OOnM的浓度存在。根据本发明的一些实施方案，激动素A以1-1OOnM的浓度存在。根据本发明的一些实施方案，另外的培养基不含激动素A。根据本发明的一些实施方案，培养基不含β细胞素。根据本发明的一些实施方案，另外的培养基不含β细胞素。
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根据本发明的一些实施方案，成体胰岛β细胞包括去分化的成体胰岛β细胞。根据本发明的一些实施方案，去分化的成体胰岛β细胞包括从β细胞生成的诱导性多能干细胞。根据本发明的一些实施方案，去分化的成体胰岛β细胞通过培养成体胰岛β细胞至少10代而生成。根据本发明的一些实施方案，培养在CMRL培养基中进行。根据本发明的一些实施方案，方法还包括在步骤(a)之前扩增胰岛β细胞。根据本发明的一些实施方案，步骤(a)进行6天。根据本发明的一些实施方案，步骤(b)进行2天。根据本发明的一些实施方案，方法还包括在步骤(b)之后分离成体胰岛β细胞。
根据本发明的一些实施方案，分离利用锌结合染料来进行。根据本发明的一些实施方案,锌结合染料包括新点绿(Newport green)。根据本发明的一些实施方案，分离利用抗NCAM抗体来进行。根据本发明的一些实施方案，用胰酶消化成体胰岛β细胞。根据本发明的一些实施方案，方法还包括将成体胰岛β细胞与下调SLUG的量或活性的剂接触。根据本发明的一些实施方案，祖细胞选自由去分化的成体胰岛β细胞、间充质干细胞和从β细胞去分化的诱导性多能干细胞组成的组。根据本发明的一些实施方案，利用针对SLUG的多核苷酸剂进行下调。根据本发明的一些实施方案，利用抗体来进行下调。根据本发明的一些实施方案，多核苷酸包括siRNA剂或shRNA剂。根据本发明的一些实施方案，接触在暴露之后进行。根据本发明的一些实施方案，去分化的成体胰岛β细胞通过培养成体胰岛β细胞至少10代而生成。根据本发明的一些实施方案，培养在CMRL培养基中进行。根据本发明的一些实施方案，分离的成体胰岛β细胞的群体经遗传修饰以表达药剂。
除非另外指定，否则本文所用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域中的普通技术人员所通常理解的相同含义。虽然与本文所描述的方法和材料相似的或等效的那些方法和材料可用于本发明的实施方案的实践或试验中，以下描述了示例性的方法和/或材料。如有冲突，以本发明的说明书，包括定义为准。此外，材料、方法和例子仅为示例性的而并不意在必须限制。附图简沭本文通过仅举例的方式参照附图和图像描述了本发明的一些实施方案。现详细地具体参照了附图，应强调的是以举例的方式显示了细节，并用于示例性地讨论本发明的实施方案的目的。在这一方面，关于附图所采用的描述使本领域技术人员清楚可以如何实践本发明的实施方案。在附图中:
图1A-B示出了可在无外源的(xeno-free)和无血清的条件下扩增β细胞来源的细胞。A:在无外源的(XF)或含血清的CMRL 1066培养基(CMRL)中扩增的胰岛细胞在第2代的显微照片。B:对于增殖标志物Ki67的GFP-标记的β细胞来源的(B⑶)细胞的免疫荧光分析。图2示出了不同的再分化条件对胰岛素mRNA表达的影响。从两个供体扩增并在不同的再分化条件下孵育共8天，第7代的细胞中的胰岛素转录子的qPCR分析。完全再分化混合物(RC)包括:CMRL 1066培养基、25mM葡萄糖、抗生素、胰岛素、铁传递蛋白、硒(ITS)、N2补充物、B27补充物、烟酰胺(NA)、激活素A (ActA)、β细胞素(BTC)、Exendin 4 (EX) 01.步骤1:第1-6天无BTC的RC步骤2:第7-8天无BTC的RC，5.6mM葡萄糖
2.步骤1:第1-6天无BTC的RC步骤2:第7-8天无BTC和ActA的RC，5.6mM葡萄糖数值为平均值土SD，相对于人类RPLPO标准化。图3示出了降低的葡萄糖水平诱导胰岛素表达，同时减少了其他激素的转录子。在RC中再分化8天，第9代的、或在RC中再分化7天、和在带有5.6mM葡萄糖的RC中在第8天时的细胞中的胰岛激素转录子的qPCR分析。数值为平均值土SD，相对于人类RPLPO标准化。INS =胰岛素，SST =生长激素抑制素，GCG =胰高血糖素，PPY =胰多肽。图4是显现活胰岛细胞中的分化的显微照片。用在胰岛素启动子控制下表达荧光标志物DsRed2的慢病毒感染胰岛细胞培养物。通过转移到RC而在第6代时诱导分化。如通过DsRed2表达所显现的(右)，这导致了细胞群集和胰岛素启动子活性的激活。左侧是相同视野的相差图像。UTR:未处理的。图5A-B是示出分选DsRed2表达之后再分化的效应的图。将第6_7代的扩增的细胞在RC中孵育8-11天，然后通过FACS分选。A:qPCR分析显示了再分化后胰岛素表达的上调。数值为平均值土SD，相对于人类RPLPO(大核糖体蛋白)标准化。B:分选的细胞每百万个细胞含375ng C-肽，为人类胰岛中的水平的8%。UTR:未处理的。图6A-B示出了利用新点绿(NG)对再分化的细胞的分选。A:使第5代的胰岛细胞在RC中分化8天。利用NG对含胰岛素的细胞染色，并通过FACS分选。分选的点图显示了在P2门中分选的突光细胞的不同群体。B:分选的细胞、未分选的分化的细胞和未处理的(UTR)细胞中胰岛素转录子的qPCR分析。数值为平均值土SD，相对于人类RPLPO标准化。图7A-F示出了胰岛细胞分化的条件的开发，且表明分化主要代表BCD-细胞再分化。A:在SFM中孵育指定的天数的在第6代的扩增的胰岛细胞中的β细胞基因表达的qPCR分析。数值为相对于未处理的细胞(第O天)的平均值土SD(n = 3-4个供体)，并相对于人类RPLPO标准化。*p < 0.05 ;**p < 0.005。B-D:用于筛选胰岛细胞分化条件的测定。用RIP-DsRed2慢病毒感染胰岛细胞(B)，然后试验不同的分化条件。C:在第5代的扩增的细胞(UTR，未处理的细胞)中未观察到DsRed2表达，而将细胞转移到SFM或RC导致了胰岛素启动子激活，其可通过DsRed2荧光的出现在活细胞中监测。线条= 200ym。D:分化的流式细胞术定量显示，用RC处理导致了与SFM相比较再分化的细胞数目增高6倍。E:用于β细胞标记的病毒载体(vector)的示意图。F:由扩增的胰岛细胞的群体中的不同的细胞来源生成胰岛素表达细胞的预测。胰岛细胞的初始培养物由约一半的产胰岛素β细胞(紫色实心圆)和一半非β细胞(空心圆)组成。β细胞的标记效率为约50% (绿色实心圆)。扩增去分化的胰岛细胞且然后在SFM或RC中分化，并定量C-肽+细胞中eGFP+细胞的百分比。考虑到eGFP标记效率，预计B⑶细胞的再分化导致 50%共染色。来自非BCD细胞的胰岛素表达细胞的从头分化应导致无共染色，而两种机制的出现将导致低百分比的共染色的细胞。共染色定量显示，BCD细胞的再分化是在两种条件下生成的胰岛素表达细胞的主要来源。百分比指示从第4-6代的扩增的胰岛细胞再分化的C-肽+细胞中eGFP+细胞的比例(基于3个供体的每个中计数> 400个细胞)。显示了代表性的显微照片。用DAPI将DNA染为蓝色。线条=10 μ m。图8A-E示出了通过可溶性因子诱导的B⑶细胞的再分化。A、B:用RC处理的第5代的胰岛细胞中的β细胞基因的诱导的动力学。A:qPCR分析。数值为相对于未处理的细胞(第O天)的平均值土 SE (η = 3-4个供体)并相对于人类RPLPO或GAPDH标准化。*p < 0.05 ;**p < 0.01。B:c-肽和roxi共染色的细胞的免疫荧光分析。数值为平均值土 SE (对数尺度)，基于每个时间点处从3个供体中的每一个计数> 500个细胞。*p < 0.05，相对于未处理的细胞(第O天)。显示了代表性的显微照片。线条=25 μ m。C、D:用RC处理8天的第5-7代的胰岛细胞中的β细胞基因表达的分析。C:qPCR分析。数值为相对于未处理的细胞(第O天)的平均值 土 SE (对数尺度)(η = 3-4个供体)，并相对于人类RPLPO标准化。*ρ < 0.05 ;#ρ < 0.005 < 0.0005。D:共染色C-肽和指定的蛋白(绿色的)的细胞的免疫荧光分析。线条=10μπι。百分比指示C-肽+细胞中对于每个标志物呈阳性的细胞的比例。数据为平均值土SD，基于从3个供体的每个中计数> 200个细胞。E:在来自4个供体的未培养的胰岛细胞、来自4个供体的第5代的扩增的胰岛细胞(UTR)、和用RC处理的来自3个供体的第5代的扩增的胰岛细胞的cDNA微阵列分析中检测到的基因表达模式的无监督聚类(unsupervised clustering)。图9A-D示出了分选的再分化的B⑶细胞中的胰岛素产生和分泌。用RIP_DsRed2病毒感染扩增的胰岛细胞(第6-7代)并用RC处理8天。分选DsRed2+细胞并分析。Α:β细胞转录子的qPCR分析。数值为相对于人类胰岛的平均值土 SE (η = 3个供体)，并相对于人类RPLPO标准化。B:新鲜人类胰岛和DsRed2分选的RC处理的胰岛细胞的人类C-肽含量。数值为平均值土 SE (η = 3个供体)。注意，绝大多数所贮存的胰岛素是经加工的(仅9%胰岛素原(proinsulin))。C:在16.7mM葡萄糖和IBMX存在下来自人类胰岛和RC处理的扩增的胰岛细胞的葡萄糖诱导的胰岛素分泌。数值为人类C-肽的平均值土SD，相对于OmM葡萄糖和IBMX (η = 3个供体)。D:电子显微镜分析显示在用RC处理8天的第6代的细胞中典型的胰岛素分泌囊泡的存在，与在分离的人类胰岛中的β细胞中所观察到的那些相当。线条=0.5ym0图10Α-Η示出了 B⑶细胞再分化包括间充质细胞-上皮细胞转变(MET)。A、B:胰岛细胞去分化期间SLUG表达的诱导。A:所示的传代的扩增的胰岛细胞的qPCR分析。数值为相对于未培养的胰岛的平均值土SE (η = 4个供体)并相对于人类RPLPO标准化。*p<0.05。B:从未培养的胰岛和所示的传代数目的扩增的胰岛细胞中提取的蛋白的免疫印迹分析。HSC70，热休克同源物70。C:在胰岛细胞再分化期间SLUG表达的下调。在用RC处理8天后第6-7代的扩增的胰岛细胞的qPCR分析。数值为相对于未处理的细胞的平均值土 SE (η = 4个供体)，并相对于人类RPLPO标准化。*ρ < 0.05。D:在用RC处理8天期间第5代的扩增的胰岛细胞中的NCAD和ECAD转录子的变化的动力学的qPCR分析。数值为相对于未处理的细胞的平均值土 SE (关于ECAD的对数尺度)(η = 4个供体)，并相对于人类RPLPO或GAPDH标准化。*ρ < 0.05 ;#ρ < 0.01。E:在用RC处理8天后第6代的扩增的胰岛细胞的免疫染色分析显示了波形蛋白阳性的细胞数目的减少(平均值土SD，基于从3个供体的每个中计数> 400个细胞)，和波形蛋白和C-肽的互斥表达。箭头指向可能已丢失波形蛋白表达但还未激活胰岛素表达的细胞。线条=IOym0 F:在用RC处理8天后第5代的扩增的胰岛细胞中C-肽和BrdU的共染色。百分比指示在再分化处理的第2-8天掺入BrdU之后，总细胞中BrdU阳性细胞的比例。数据为平均值土SD，基于从3个供体的每个中计数500个细胞。线条=20 μ m。G:用表达两种SLUG shRNA中的一种或乱序(SCR) shRNA的慢病毒感染的第5代的扩增的胰岛细胞的免疫印迹分析。UTR，未处理的细胞。H:用表达两种SLUG shRNA中的一种或乱序shRNA的慢病毒感染并用RC处理4天的第5代的扩增的胰岛细胞中的胰岛素转录子的qPCR分析。数值为相对于未处理的细胞的平均值土SE (η =
3-6个供体)，并相对于人类RPLPO或GAPDH标准化。p-值为相对于SCR的。UI，用RC处理的未感染的细胞。图1lA-H分别示出了 B⑶细胞再分化包括胰腺和胰岛祖细胞转录因子S0X9和NGN3的表达。A:扩增的胰岛细胞(第6代)的RC处理导致激素表达细胞而非胰岛素表达细胞的生成。用RC处理细胞8天并用对于指定的激素的抗体染色(通过对C-肽的染色鉴定产胰岛素细胞)。数值为平均值土 SE (η = 4个供体)，基于从每个供体计数> 500个细胞。绿色的数值指示了在与来自6个供体的谱系示踪细胞的平行实验中评分的共1736个激素阳性的eGFP+细胞中对于每种激素呈阳性的细胞的百分比。B-D:再分化期间的S0X9激活。用RC处理第5代的胰岛细胞8天。B:S0X9的上调的动力学的qPCR分析。数值为相对于未处理的细胞(第O天)的平均值土 SE (η = 4个供体)，并相对于人类RPLPO或GAPDH标准化。*ρ < 0.05。C:通过免疫荧光分析对S0X9+细胞的定量。数值为平均值土SD，基于每个时间点从3个供体中的每个中计数> 500个细胞。( 0.01, ( 0.001,相对于未处理的细胞(第O天)。D:左侧，免疫荧光分析检测单独的波形蛋白或S0X9染色的细胞，以及双阳性的细胞。右侧，C-肽和S0X9染色是互斥的。线条=IOym0 E:利用表达两种SLUG shRNA中的一种或乱序的sh RNA的慢病毒感染并用RC处理4天，第5代的扩增的胰岛细胞中S0X9转录子的qPCR分析。数值为相对于未处理的细胞的平均值土SE (η =4-6个供体)，并相对于人类RPLPO或GAPDH标准化。UI，RC处理的未感染的细胞。F:再分化期间激活了 NGN3。人类胎儿胰腺细胞(左图)和利用RC处理的胰岛细胞处理8天后第5代的扩增的胰岛细胞(右图)中NGN3mRNA表达的原位杂交分析。线条=25 μ m。G-H:胰岛细胞去分化期间S0X9的瞬时激活。G:所示的传代的扩增的胰岛细胞的qPCR分析。数值为相对于未培养的胰岛的平均值土 SE (η = 3个供体)并相对于人类RPLPO标准化。*p
<0.05。H:从未培养的胰岛和所示的传代数目的扩增的胰岛细胞中提取的蛋白的免疫印迹分析。图12A-B示出了 β细胞中RIP-CreER转基因表达的特异性。利用RIP-CreER病毒感染人类胰岛细胞并在感染后2-3天对Cre蛋白和4种胰岛激素共染色(胰岛素+细胞通过对C-肽的染色而鉴定)。数值为平均值土 SD (η = 3个供体；基于从每个供体计数400个细胞)。图13Α-Β示出了 RC处理期间胰岛祖细胞基因的上调的动力学。用RC处理所示的天数的第5代的扩增的胰岛细胞的qPCR分析。数值为相对于未处理的细胞(第O天)的平均值土SE (η = 4个供体)，并相对于人类GAPDH标准化，*p < 0.05，#p ( 0.01，***p ^ 0.001。图14示出了 RC处理后INSMl的上调。在用RC处理8天后第5代的扩增的胰岛细胞中的INSMl转录子的qPCR分析。数值为相对于未处理的细胞的平均值土SE (η = 4个供体)，并相对于人类RPLPO标准化。发明具体实施方式
的描述本发明，在其一些实施方案中，涉及在成体胰岛β细胞中增加胰岛素含量的方法。在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，应理解，本发明的应用不必限于以下描述中所列出的或通过实施例所示例的细节。本发明能够以其他实施方案或能够以多种方式实践或进行。因此，根据本发明的一方面，提供了离体提高成体胰岛β细胞中胰岛素含量的方法，所述方法包括将成体胰岛β细胞暴露于含烟酰胺、exendin-4、激活素A和葡萄糖的培养基，所述培养基不含血清，从而提高成体胰岛β细胞中的胰岛素含量。如本文所用的短语“离体(ex-vivo) ”指从活的生物体中移出并在生物体外(例如，在试管中)培养的细胞。如本文所用的，短语“成体胰岛β细胞”指出生后的(例如，非胚胎的)胰岛内分泌细胞，其能够响应于增高的葡萄糖浓度分泌胰岛素并表达典型的β细胞标志物。β细胞标志物的例子包括,但不限于,胰岛素和Pdx。本发明的该方面的分离的成体胰岛β细胞可以是同种性质的或异种性质的(homogeneous or heterogeneous nature)。因此，例如，本发明的该方面的成体胰岛β细胞可被包括在分离的胰岛中。胰岛细胞可包括以下:1)产生胰岛素的β细胞；2)产生胰高血糖素的α细胞；3)产生生长激素抑制素的S细胞(或D细胞)；和/或产生胰多肽的F细胞。这些细胞中的多肽激素(胰岛素、胰高血糖素、生长激素抑制素和胰多肽)以分泌颗粒的形式贮存于分泌囊泡中。分离胰岛的方法是本领域中熟知的。 例如，可利用胶原酶和ficoll梯度从胰腺组织中分离胰岛。优选地将本发明的成体胰岛β细胞分散成单细胞悬液-例如，通过添加胰酶或通过研磨。可将成体胰岛β细胞进一步分离，使其基本上不含在其体内环境中存在的其他物质(例如，其他细胞、蛋白、核酸等)，例如，通过FAC分选来分离。成体胰岛β细胞可获自任何自体的或非自体的(即，同种异体的或异种的)哺乳动物供体。例如，细胞可从人类尸体中分离。成体胰岛β细胞的去分化可通过扩增(即，培养)延长的传代数目而进行，-例如，在CMRL培养基中。如本文所用的，术语“扩增(expanding) ”指通过细胞分裂的过程而非简单地通过过度生长而扩大,增加本发明的成体胰岛β细胞的数目和总量。根据一个实施方案，细胞在含约IO-1OOmM葡萄糖，更优选地为10_50mM，更优选地为10-25mM，比如例如25mM浓度的葡萄糖的Mesencult XF培养基中扩增。优选地扩增细胞至少6代、7代、8代、9代、10代、11代、12代、13代、14代、15代、或至少16代。根据一个具体的实施方案，扩增在粘附条件下进行，所述粘附条件包括在选自由层粘连蛋白、纤连蛋白、基质月父和Mesencult XF粘附基质组成的组的粘附培养基上鮮育。
根据另一个实施方案，成体胰岛β细胞的去分化可通过利用已知生成诱导性多能干细胞(iPS)细胞的基因转染细胞来实现。已将Oct-3/4和Sox基因家族的某些成员(Soxl、Sox2、Sox3和Soxl5)鉴定为参与诱导过程的关键转录调控子，其缺失使诱导不可能。然而，已鉴定包括Klf家族的某些成员0(1€1、1(1€2、1(1€4和1(1€5)、1^(3家族的某些成员(C-myc、L-myc和N_myc)、Nanog和LIN28的另外的基因提高诱导效率。根据一个实施方案，通过以下使细胞再分化:(a)在含烟酰胺、exendin-4、激活素A和10_50mM葡萄糖的培养基中孵育成体胰岛β细胞，该培养基不含血清；和随后(b)在含烟酰胺、exendin-4和0.5-10mM葡萄糖的另外的培养基中孵育成体胰岛β细胞。烟酰胺的示例性的浓度范围包括Ι-lOOmM，更优选地为l_50mM、更优选地为l-20mM,比如例如10mM。exendin 4的示例性的浓度范围包括1-lOOnM，更优选地为1_50ηΜ，更优选地为1-20ηΜ,比如例如8nM。激活素A的示例性的浓度范围包括1-lOOnM，更优选地为1_50ηΜ，更优选地为1-20ηΜ,比如例如8nM。对于步骤A，葡萄糖的示例性的浓度范围包括lO-lOOmM，更优选地为10_50mM，更优选地为10-25mM，比如例如25mM。对于步骤B，葡萄糖的示例性的浓度范围包括0.5-10mM,更优选地为l_10mM，更优选地为2.5-7.5mM,比如例如5.6mM。利用本文描述的方法获得的细胞能够以葡萄糖响应方式分泌胰岛素并典型地表达β细胞特异性基因(例如rox-1)。根据一个特定的实施方案，根据本文描述的方法生成的分离的群体的细胞的至少10%是由β细胞再分化的细胞。根据一个特定的实施方案，根据本文描述的方法生成的分离的群体的细胞的至少20%是由β细胞再分化的细胞。根据一个特定的实施方案，根据本文描述的方法生成的分离的群体的细胞的至少30%是由β细胞再分化的细胞。根据一个特定的实施方案，根据本文描述的方法生成的分离的群体的细胞的至少40%是由β细胞再分化的细胞。根据又一个另外的实施方案，根据本文描述的方法生成的分离的群体的细胞的至少20%分泌胰岛素。根据又一个另外的实施方案，根据本文描述的方法生成的分离的群体的细胞的至少30%分泌胰岛素。根据又一个另外的实施方案，根据本文描述的方法生成的分离的群体的细胞的至少40%分泌胰岛素。根据又一个另外的实施方案，根据本文描述的方法生成的分离的群体的细胞的至少50%分泌胰岛素。优选地，本文所描述的群体中的细胞中的大多数表达Η)Χ1、ΝΚΧ2.2、NKX6.1、IAPP和PCI/3和β细胞功能必需的其他蛋白。优选地，如通过RT-PCR所测量的，与非再分化的β细胞相比较，细胞表达增加的量的β细胞转录因子(例 如，HBLX9、NEUROD, ΝΚΧ2.2和ΝΚΧ6.1)。可以在本文所描述的分离的群体中被上调的其他基因包括KIR6.2、SURl和GCK。本发明人已显示，以上所描述的再分化方案导致了称作SLUG(snail同源物2，编码具有Swiss prot编号043623的蛋白)的基因-GenBankTM登录号BC014890的下调。将理解的是，本发明涵盖用于该再分化方案(或任何另外的再分化方案)的下调SLUG的另外的方式(例如，通过利用特异性地针对该蛋白的剂，比如通过利用抗体或SiRNA剂)。以下是能够下调SLUG的表达水平和/或活性的剂的列表。能够下调SLUG的剂的一个例子是能够特异性地结合SLUG的抗体或抗体片段。优选地，该抗体特异性地结合SLUG的至少一个表位。如本文所用的，术语“表位”指抗原上与抗体的互补位结合的任何抗原决定簇。如本发明所用的术语“抗体”包括完整的分子以及能够与巨噬细胞结合的其功能性片段，比如Fab、F(ab' )2和Fv。这些功能性抗体片段如下所定义:(I)Fab，含有抗体分子的单价抗原结合片段的片段，可通过用木瓜蛋白酶消化整个抗体生成完整的轻链和一个重链的部分而产生；(2)Fab'，可通过用胃蛋白酶处理整个抗体，然后还原，产生完整的轻链和重链的部分而获得的抗体分子的片段；每个抗体分子获得两个Fab'片段；(3)(Fab' )2，可通过用胃蛋白酶处理整个抗体而不进行随后的还原而获得的抗体的片段；F(ab' )2是通过两个二硫键保持在一起的两个Fab'片段的二聚体；(4)Fv，定义为含表达为两个链的轻链的可变区和重链的可变区的遗传工程化的片段；和(5)单链抗体(“SCA”)，含轻链的可变区和重链的可变区的遗传工程化的分子，通过适宜的多肽连接物连接作为遗传融合的单链分子。
SLUG的下调还可通过RNA沉默来实现。如本文所用的，短语“ RNA沉默”指由RNA分子所介导的一组调控机制[例如，RNA干扰(RNAi)、转录基因沉默(TGS)、转录后基因沉默(PTGS)、压制、共抑制和翻译阻抑]，导致对应的蛋白编码基因的表达的抑制或“沉默”。已在包括植物、动物和真菌的许多类型的生物体中观察到RNA沉默。如本文所用的，术语“RNA沉默剂”指能够特异性地抑制或“沉默”靶基因的表达的RNA。在某些实施方案中，RNA沉默剂能够通过转录后沉默机制阻止mRNA分子的完全加工(例如，完整的翻译和/或表达)。RNA沉默剂包括非编码RNA分子，例如包括成对的链的RNA双链体，以及前体RNA，可由其生成小的非编码RNA。示例性的RNA沉默剂包括dsRNA诸如siRNA、miRNA和shRNA。在一个实施方案中，RNA沉默剂能够诱导RNA干扰。在另一个实施方案中，RNA沉默剂能够介导翻译阻抑。根据本发明的一个实施方案，RNA沉默剂对于靶标RNA(例如，SLUG)是特异性的，且并不交叉抑制或沉默与靶基因表现99%或更小总体同源性的基因或剪接变体，所述更少总体同源性例如，与靶基因小于 98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81% 的总体同源性。RNA干扰指在动物中由短干扰RNA(SiRNA)介导的序列特异性转录后基因沉默的过程。在植物中对应的过程通常称作转录后基因沉默或RNA沉默，且在真菌中还被称作压制。转录后基因沉默的过程被认为是用于阻止外源基因表达的进化保守的细胞防卫机制，并通常为多种植物群(flora)和动物门(phyla)所共有。这种对于外源基因表达的阻止可经由特异性地破坏同源的单链RNA或病毒基因组RNA的细胞反应响应于双链RNA(dsRNA)的产生而演变，所述双链RNA来源于病毒感染或来自随机整合进入到宿主基因组中的转座子元件。细胞中的长dsRNA的存在刺激了称作dicer的核糖核酸酶III的活性。Dicer参与将dsRNA加工成称作短干 扰RNA(siRNA)的dsRNA的短片段。来源于dicer活性的短干扰RNA通常长度约21至约23个核苷酸，且包括约19个碱基对双链体。RNAi响应还以核酸内切酶复合物为特征，其通常称作RNA诱导的沉默复合物(RISC)，其介导具有与siRNA双链体的反义链互补的序列的单链RNA的切割。靶RNA的切割发生在与siRNA双链体的反义链互补的区域中部。因此,本发明的一些实施方案涵盖dsRNA用于下调从mRNA的蛋白表达的用途。根据一个实施方案，dsRNA大于30bp。长dsRNA (即，dsRNA大于30bp)的用途非常有限，由于认为这些双链RNA的较长的区域将导致干扰素的诱导和PKR应答。然而，使用长dsRNA可提供大量的优点，原因在于细胞可选择最佳沉默序列，减少了试验大量siRNA的必要；长dsRNA将允许沉默文库具有比siRNA必需的复杂性小的复杂性；并且，可能最重要的是，当用作治疗剂时，长dsRNA能够阻止病毒逃逸突变。多项研究证明长dsRNA可用于沉默基因表达，而不会诱导应激反应或导致显著的偏离IE标效应_参见例如[Strat等人，Nucleic Acids Research, 2006,卷34,第13号 3803-3810 ；Bhargava A 等人.Brain Res.Protoc.2004 ；13:115-125 ；Diallo Μ.，等人，Oligonucleotides.2003 ； 13:381-392 ；Paddison P.J.,等人，Proc.Natl Acad.Sc1.USA.2002 ；99:1443-1448 ；Tran N.，等人，FEBS Lett.2004 ；573:127-134]。具体地，本发明根据其一些实施方案涵盖导入长dsRNA (超过30个碱基转录子)以用于其中不激活干扰素途径的细胞(例如，胚细胞和卵母细胞)中的基因沉默，参见例如 Billy 等人,PNAS 2001,卷 98,第 14428-14433 页.和 Diallo 等人，Oligonucleotides,2003 年 10 月 I H,13(5):381-392.do1:10.1089/154545703322617069。本发明根据其一些实施方案还涵盖导入特别设计以不诱导干扰素和PKR途径的长dsRNA 以用于下调基因表达。例如，Shinagwa和 Ishii [Genes & Dev.17 (11): 1340-1345,2003]已开发了称作pDECAP的载体，以从RNA聚合酶II (Pol II)启动子表达长的双链RNA。由于来自pDECAP的转录子缺少协助ds-RNA输出到细胞质的5’ -帽结构和3’ -聚腺苷酸尾巴二者，来自pDECAP的长ds-RNA不会诱导干扰素应答。避开哺乳动物系统中的干扰素和PKR途径的另一种方法是通过经由转染或内源性表达而导入小抑制性RNA(siRNA)。术语“ siRNA”指诱导 RNA干扰(RNAi)途径的小抑制性RNA双链体(通常在18_30碱基对之间)。通常，siRNA是化学合成的21mer，具有中央的19bp双链体区域和对称的末端2-碱基3’ -悬突，虽然最近已描述，化学合成的25-30碱基长度的RNA双链体与在相同的位置的21mer相比较可具有多达100倍增高的效力。理论认为在触发RNAi时利用较长的RNA获得的所观察到的增高的效力起因于向Dicer提供了底物(27mer)而非产物(2Imer),且这提高了 siRNA双链体进入到RISC的速率或效率。已发现3’ -悬突的位置影响着siRNA的效力，且在反义链上具有3’ -悬突的不对称的双链体一般比在有义链上具有3’-悬突的那些更有效(Rose等人，2005)。这可归因于不对称的链载入到RISC中，因为当靶向反义转录子时观察到相反的效率模式。可连接双链干扰RNA (例如，siRNA)的链以形成发夹或茎-环结构(例如，shRNA)。因此，如所提到的，本发明的一些实施方案的RNA沉默剂还可以是短发夹RNA(shRNA)。如本文所用的，术语“ shRNA”指具有茎-环结构的RNA剂，包括具有互补序列的第一区域和第二区域，互补的程度和区域的方向足以使区域之间发生碱基配对，第一区域和第二区域通过环区域连接，环由环区域中的核苷酸(或核苷酸类似物)之间缺少碱基配对而引起。环中的核苷酸的数目是3至23、或5至15、或7至13、或4至9、或9至11之间并包括端点的数目。环中的某些核苷酸可参与与环中的另外的核苷酸的碱基配对相互作用。可用于形成环的寡核苷酸序列的例子包括5' -UUCAAGAGA-3' (Brummelkamp,T.R.等人.(2002) Science 296:550)和 5' -UUUGUGUAG-3' (Castanotto,D.等人.(2002) RNA 8:1454)。本领域技术人员将认识到，所得的单链寡核苷酸形成包括能够与RNAi机器(RNAimachinery)相互作用的双链区域的莖-环或发夹结构。根据另一个实施方案，RNA沉默剂可以是miRNA。miRNA是由编码不同大小的初级转录子的基因产生的小RNA。其已在动物和植物二者中被鉴定。初级转录子(称作“初级-miRNA”)经过多种核水解(nucleolytic)步骤被加工成较短的前体miRNA,或“前-miRNA”。前-miRNA以折叠的形式存在，从而最终的(成熟)miRNA以双链体存在，该两个链被称作miRNA (将最终与靶标碱基配对的链)。前-miRNA是将miRNA双链体从前体移除的dicer形式的底物，之后，与siRNA类似，双链体可被捕获到RISC复合物中。已证明miRNA可转基因地表达且通过前体形式而非整个初级形式的表达而生效。(Parizotto等人.(2004)Genes & Development 18:2237-2242 和 Guo 等人.(2005)Plant Cell 17:1376-1386)。
不同于siRNA, miRNA仅以部分互补性结合转录子序列(Zeng等人,2002, Molec.Cell 9 =1327-1333)并抑制翻译而不影响稳态的RNA水平(Lee等人，1993，Cell 75:843-854 ;Wightman 等人，1993，Cell 75:855-862)。miRNA 和 siRNA 二者被 Dicer 加工并与RNA诱导的沉默复合物的组分缔合(Hutvagner等人,2001, Science 293:834-838 ；Grishok等人，2001, Cell 106:23-34 ；Ketting 等人，2001, Genes Dev.15:2654-2659 !Williams等人，2002，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 99:6889-6894 ;Hammond 等人，2001，Science 293:1146-1150 ；Mourlatos 等人,2002, Genes Dev.16:720-728)。最近的报告(Hutvagner 等人，2002, Sciencexpress 297:2056-2060)假设，通过miRNA途径还是通过siRNA途径进行基因调控是仅由与靶转录子的互补性的程度来决定的。据推测，与mRNA靶标仅部分相同的siRNA将与miRNA相似地在翻译抑制而非触发RNA降解中起作用。适用于本发明的一些实施方案的RNA沉默剂的合成可按如下来进行。首先，在SLUG mRNA序列的AUG起始密码子的下游扫描AA 二核苷酸序列。将每个AA和3’邻近的19个核苷酸的存在记录为可能的siRNA靶位点。优选地，siRNA靶位点选自开放读码框，因为非翻译区(UTR)中调控蛋白结合位点较为丰富。UTR结合蛋白和/或翻译起始复合物可干扰siRNA核酸内切酶复合物的结合[Tuschl ChemBiochem.2 =239-245]。然而将理解的是，针对非翻译区的siRNA也可以是有效的，如对GATOH所证明的，其中针对5’UTR的siRNA介导了细胞GAPDH mRNA约90%的下降并完全消除了蛋白水平(www.ambion.com/techlib/tn/91/912.html)。其次，利用任何序列比对软件，诸如从NCBI服务器可获得的BLAST软件(www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST/),将可能的祀位点与适当的基因组数据库(例如，人类、小鼠、大鼠等)比较。过滤掉与另外的编码序列表现出显著同源性的推测的靶位点。选择符合条件的靶序列作为siRNA合成的模板。优选的序列是包括低G/C含量的那些序列，因为已证明这些序列与具有高于55%的G/C含量的那些序列相比较更有效地介导基因沉默。沿着靶基因的长度，优选选择多个靶位点用于评价。为了更好地评价所选择的siRNA，优选地共同使用阴性对照。阴性对照siRNA优选地包括与该siRNA相同的核苷酸组成，但与基因组无显著同源性。这样，优选地使用该siRNA的乱序的核苷酸序列，条件是其不会表现出与任何其他基因的任何显著的同源性。将理解的是，本发明的一些实施方案的RNA沉默剂不必限于仅含RNA的那些分子，而还包括化学修饰的核苷酸和非核苷酸。在一些实施方案中，本文提供的RNA沉默剂可在功能上与细胞渗透肽”结合。如本文所用的，“细胞渗透肽”是包括短(约12-30个残基)氨基酸序列或功能基序的肽，其赋予与膜可渗透复合物跨细胞的质膜和/或核膜的转运有关的不依赖能量的(即，非内吞作用)移位性质。本发明的一些实施方案的膜可渗透复合物中所用的细胞渗透肽优选地包括至少一个非功能的半胱氨酸残基，其是游离的或被衍生以与双链核糖核酸形成二硫键，所述双链核糖核酸已经被修饰以用于这样的键合。赋予这样的性质的代表性的氨基酸基序在美国专利第6，348，185号中列出，其内容在此通过引用明确地并入。本发明的一些实施方案的细胞渗透肽优选地包括但不限于，穿膜肽(penetratin)、转运素(transportan)、plsl、TAT (48-60)、pVEC、MTS、和 MAP。 能够下调SLUG的另一种剂是能够特异性地切割SLUG的mRNA转录子或DNA序列的脱氧核酶(DNAzyme)分子。脱氧核酶是单链的多核苷酸，其能够切割单链的和双链的靶序列二者(Breaker, R.R.和 Joyce, GChemistry and Biologyl995 ；2:655 ；Santoro, S.W.&Joyce, G.F.Proc.Natl, Acad.Sc1.USA 1997 ；943:4262)。已提出了脱氧核酶的一般模型(“10-23”模型)。“10-23”脱氧核酶具有15个脱氧核糖核苷酸的催化域，侧翼为各7至9个脱氧核糖核苷酸的两个底物识别域。该类型的脱氧核酶可在嘌呤:嘧啶连接处有效地切割其底物RNA(Santoro, S.W.& Joyce,G.F.Proc.Natl, Acad.Sc1.USA 199 ;关于脱氧核酶的综述参见 Khachigian，LM[Curr Opin Mol Ther 4:119-21(2002)]。Joyce等人的美国专利第6，326，174号中公开了识别单链和双链祀切割位点的合成的、工程化的脱氧核酶的构建和扩增的实例。最近观察到相似设计的针对人类尿激酶受体的脱氧核酶抑制尿激酶受体表达，且成功地在体内抑制结肠癌细胞转移(Itoh等人，20002, Abstract 409, Ann Meeting Am Soc Gen Ther www.asgt.0rg)。在另一个应用中，与bcr-abl癌基因互补的脱氧核酶成功地在白血病细胞中抑制癌基因表达，并在CML和ALL病例中的自体骨髓 移植中减少了复发率。SLUG的下调还可通过利用能够与编码SLUG的mRNA转录子特异性地杂交的反义多核苷酸来进行。能够下调SLUG的另一种剂是能够特异性地切割编码SLUG的mRNA转录子的核酶分子。核酶正在被越来越多地用于通过切割编码感兴趣的蛋白的mRNA而序列特异性抑制基因表达[Welch等人，Curr Opin Biotechnol.9:486-96 (1998)]。设计核酶以切割任何特定的靶RNA的可能性使其成为基础研究和治疗应用中有价值的工具。调控细胞中SLUG基因的表达的另一种方法是经由三链体形成寡核苷酸(TFO)。最近的研究已显示，可设计能够以序列特异性的方式识别并结合双链螺旋DNA中的多嘌呤/多卩密唳区域的TFO0这些识别规则由以下所概述:Maher III, L.J.,等人，Science, 1989 ；245:725-730 ；Moser, H.E.，等人，Science, 1987 ；238:645-630 ；Beal, P.A.，等人 Science,1992 ；251:1360-1363 ；Cooney, Μ.，等人，Science, 1988 ；241:456-459 ;和 Hogan，Μ.Ε.，等人，欧洲公布375408。对寡核苷酸的修饰，诸如引入嵌入剂和骨架取代，以及优化结合条件(pH和阳离子浓度)，已帮助克服了对TFO活性的固有障碍，比如电荷排斥和不稳定性，且最近已显示可使合成的寡核苷酸祀向特定的序列(关于最近的综述参见Seidman和Glazer,J Clin Invest 2003;112:487-94)。一般，三链体形成寡核苷酸具有序列对应:寡核苷酸3' —A G G T双链体5' —A G C T双链体3' -T C G A然而，已显示A-AT和G-GC三链体具有最大的三螺旋稳定性(Reither和Jeltsch，BMC Biochem, 2002,9 ^ 12日，电子出版)。相同的作者已证明，根据A-AT和G-GC规则设计的TFO不会形成非特异性三链体，表明三链体形成确实是序列特异性的。 因此对于SLUG调控区域中的任何给定的序列，可设计三链体形成序列。三链体形成寡核苷酸长度优选地为至少15bp，更优选地为25bp，更加优选地为30bp或更多核苷酸，长达 50bp 或 IOObp。用TFO转染细胞(例如，经由阳离子脂质体)，且与靶DNA形成三螺旋结构诱导了空间的和功能的改变，阻断了转录起始和延伸，允许在内源性的DNA中导入所需的序列改变并导致基因表达的特异性下调。这种在用TFO处理的细胞中抑制基因表达的例子包括哺乳动物细胞中的游离体supFGl基因和内源性HPRT基因的敲除(Vasquez等人，Nucl AcidsRes.1999 ；27:1176_81，和 Puri，等人，J Biol Chem, 2001 ；276:28991-98)，和在前列腺病因中重要的Ets2转录因子(Carbone，等人，Nucl Acid Res.2003 ;31:833-43)，以及促炎性ICAM-1基因(Besch等人，J Biol Chem, 2002 ；277 =32473-79)的表达的序列和靶标特异性下调。此外，Vuyisich和Beal最近已显不,序列特异性的TFO能够与dsRNA结合,抑制dsRNA依赖性酶诸如RNA依赖性激酶的活性(Vuyisich和Beal，Nuc.Acids Res 2000 ；28:2369-74)。此外，根据上述原则设计的TFO可诱导能够实现DNA修复的定向诱变，从而提供了内源性基因的表达的下调和上调二者(Seidman和Glazer，J Clin Invest 2003 ；112:487-94)。有效的TFO的设计、合成和施用的详细描述可见于Froehler等人的美国专利申请第 2003 017068 号和第 2003 0096980 号、和 Emanuele 等人的第 2002 0128218 号和第 20020123476号、和Lawn的美国专利第5，721，138号。能够下调SLUG的另一种剂可以是与SLUG结合和/或切割SLUG的任何分子。这样的分子可以是SLUG拮抗剂、或SLUG抑制肽。将理解的是，SLUG的至少催化部分或结合部分的非功能类似物也可用作下调SLUG的剂。可与本发明的一 些实施方案一起使用以下调SLUG的另一种剂是阻止SLUG激活或DNA结合的分子。还可进一步修饰(例如，遗传修饰)本发明的成体胰岛β细胞的群体以表达药齐U，诸如治疗剂、端粒酶基因、减少免疫介导的排斥的剂或标志物基因。预期治疗剂诸如抗代谢物(例如，嘌呤类似物、嘧啶类似物)、酶抑制剂和肽模拟物在本发明中通常可以是有用的。可减少免疫介导的排斥的基因的例子是子宫珠蛋白基因。子宫珠蛋白是在孕期表达的蛋白，其赋予免疫耐受性并阻止炎症反应。上文描述了遗传修饰本发明的成体胰岛β细胞的方法。根据一个实施方案，再分化之后，将β细胞与胰岛中存在的其他胰腺细胞分离。这可利用锌结合染料诸如新点绿来进行(参见Parnaud G,等人.Proliferation of sortedhuman and rat beta cells.Diabetologia 2008.51:91-100)或利用抗 NCAM 抗体来进行(参见 Banerjee M, Otonkoski T.A simple two-step protocol for the purificationof human pancreatic beta cells.Diabetologia 2009.52:621-625.)。因为本发明的成体胰岛细胞以葡萄糖响应方式贮存和分泌胰岛素，其可用于治疗与胰岛素缺乏相关的疾病比如糖尿病。因此，根据本发明的另一方面，提供了在受治疗者中治疗糖尿病的方法，所述方法包括将治疗有效量的本发明的离体扩增和再分化的成体胰岛β细胞的群体移植到受治疗者中，从而治疗糖尿病。如本文所用的，“糖尿病”指在生物体中由因为胰岛素的生物合成或产生的缺陷所致的胰岛素的绝对缺乏引起(I型糖尿病)或由存在胰岛素抵抗即受损的胰岛素作用的胰岛素的相对缺乏引起(2型糖尿病)的疾病。因此糖尿病患者具有绝对的胰岛素缺乏或相对的胰岛素缺乏，并除其他症状和病征外表现出增高的血糖浓度、尿中葡萄糖的存在和排尿过多。短语“治疗”指在患有或诊断为疾病、疾患或病症的个体中抑制或阻止疾病、疾患或病症的发展和/或导致疾病、疾患或病症的减少、减轻或消退。本领域技术人员将知道可用于评估疾病、疾患或病症的发展的多种方法和测定，和类似地，可用于评估疾病、疾患或病症的减少、减轻或消退的多种方法和测定。如本文所用的，“移植”指利用任何适宜的途径提供本发明的再分化的成体胰岛β细胞。虽然设想了其他施用方法，通常，β细胞治疗通过利用导管注射到肝的门静脉中而实现。如上所述，本发明的成体胰岛β细胞可来源于自体来源或来源于同种异体来源诸如人类尸体或供体。因为当非自体细胞被施用于身体时可能诱导免疫反应，已开发了一些方法来减少非自体细胞的排斥的可能性。这些方法包括抑制接受者的免疫系统，或在移植前将非自体细胞胶囊化到免疫隔离的半渗透性膜中。胶囊化技术通常分类为包括小球形囊泡的微囊化和包括较大的平面片和中空纤维膜的巨囊化(Uludag, H.等人.Technology of mammalian cell encapsulation.AdvDrug Deliv Rev.2000 ；42:29-64)。制备微胶囊的方法是本领域中已知的，且包括例如以下中所公开的:Lu MZ,等人，Cell encapsulation with alginate and alpha-phenoxycinnamylidene-acetylated poly (allylamine).Biotechnol Bioeng.2000,70:479-83, Chang TM 和 PrakashS.Procedures for microencapsulation of enzymes,cells and genetically engineeredmicroorganisms.Mol Biotechnol.2001,17:249-60,和 Lu MZ,等人，A novel cellencapsulation method using photosensitive poly (allylamine alpha-cyanocinnamylideneacetate).J Microencapsul.2000,17:245-51。
例如，微胶囊的制备是通过将改性的胶原与2-甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)、甲基丙烯酸(MAA)和甲基丙烯酸甲酯(MMA)的三元聚合物壳复合，生成2-5 μ m厚的胶囊。这样的微胶囊可利用另外的2-5 μ m的三元聚合物壳进一步胶囊化以赋予带负电荷的平滑表面并使血楽■蛋白吸附最小化(Chia, S.M.等人.Mult1-layered microcapsules for cellencapsulation Biomaterials.2002 23:849-56)。其他微胶囊是基于海洋多糖藻酸盐(Sambanis, A.Encapsulated islets indiabetes treatment.Diabetes Thechnol.Ther.2003, 5:665-8)或其衍生物。例如，微胶囊可通过在氯化钙存在下在聚阴离子藻酸钠和硫酸纤维素钠与聚阳离子聚(亚甲基-共-胍)盐酸盐之间的聚合电解质络合来制备。将理解的是，当使用较小的胶囊时，细胞胶囊化得以改进。因此，当胶囊尺寸从Imm降低到400 μ m时，胶囊化的细胞的质量控制、机械稳定性、扩散性质和体外活性提高了(Canaple L.等人，Improving cell encapsulation through size control.J BiomaterSci Polym Ed.2002 ; 13:783-96)。并且，发现具有良好控制的小至7nm的孔径、定制的表面化学和精确的微结构的纳米孔生物胶囊成功地免疫隔离了细胞的微环境(WilliamsD.Small is beautiful:microparticle and nanoparticle technology in medicaldevices.Med Device Technol.1999,10:6~9 ；Desai, T.A.Microfabrication technologyfor pancreatic cell encapsulation.Expert Opin Biol Ther.2002, 2:633-46)。免疫抑制剂的例子包括但不限于，氨甲蝶呤、环磷酰胺、环孢素、环孢霉素A、氯喹、轻氯喹、硫氮磺胺批唳(sulphasalazopyrine)、金盐、D-青霉胺、来氟米特、硫唑嘌呤、阿那白滞素、英夫利昔单抗(REMICADE.sup.R)、靶向炎性细胞因子的生物剂TNFa阻断剂依那西普、和非留体类抗炎药(NSAID)。NSAID的例子包括但不限于，乙酰水杨酸、胆碱水杨酸镁、二氟尼柳、水杨酸镁、双水杨酯、水杨酸钠、双氯芬酸、依托度酸、非诺洛芬、氟吡洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、甲氧胺苯酸钠、萘普生、萘丁美酮、保泰松、吡罗昔康、舒林酸、托美汀、扑热息痛、布洛芬、Cox-2抑制剂和曲马多。可将本发明的成体胰岛β细胞本身，或在其中其与适宜的运载体(carrier)或赋形剂混合的药物组合物中移植到人类受治疗者中。如本文所用的“药物组合物”指本文所描述的一种或多种活性成分与其他化学组分诸如生理上适宜的运载体和赋形剂的制品。药物组合物的目的是为了协助将化合物施用到生物体。本文中术语“活性成分”指负责生物效应的本发明的成体胰岛β细胞。下文中，短语“生理学上可接受的运载体”和“药学上可接受的运载体”可互换地使用，指不会对生物体产生显著的刺激和不会消除所施用的化合物的生物活性和性质的运载体或稀释剂。这些短语中包括佐剂(adjuvant)。
本文中术语“赋形剂”指添加到药物组合物中以进一步协助活性成分的施用的惰性物质。非限制地，赋形剂的例子包括碳酸钙、磷酸钙、多种糖类和淀粉类型、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。本发明的药物组合物可通过本领域中熟知的方法来制造，例如，通过常规的混合、溶解、粒化、制造糖衣药丸、磨细、乳化、胶囊化、包埋(entrapping)或冻干工艺。因此用于根据本发明的用途的药物组合物可以常规的方式利用一种或多种生理学上可接受的运载体来配制，所述生理学上可接受的运载体包括赋形剂和助剂，其协助将活性成分加工为可用于药学应用的制品。合适的制剂取决于所选择的施用途径。对于注射，药物组合物的活性成分可在水溶液中配制，优选地在生理学相容的缓冲液诸如汉克氏溶液、林格氏溶液或生理盐缓冲液。适用于本发明中的药物组合物包括其中含有有效实现预期目的的量的活性成分的组合物。更具体地，治疗有效量意为有效预防、减轻或改善疾患(例如，糖尿病)的症状或延长被治疗的受治疗者的生存的活性成分(产胰岛素细胞)的量。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力之内，尤其是根据本文提供的详细的公开内容。对于本发明的方法中所用的任何制品，可从动物模型(例如，STZ糖尿病小鼠)估计治疗有效量或剂量以达到想要的浓度或效价。这样的信息可用于更准确地确定在人类中有效的剂量。本文所描述的活性成分的毒性和治疗效力可在实验动物中通过标准的药学方案来确定。可将从这些动物研究中获得的数据用于配制一系列用于人类的剂量。根据所用的剂型和所用的施用途径，剂量可以是不同的。确切的制剂、施用途径和剂量可由每个医师参照患者的状况来选择。(参见，例如，Fingl,等人，1975,于"The Pharmacological Basisof Therapeutics ",中第 I 章第 I 页)。施药量和间隔可单独地调整以提供足以诱导血糖量正常的细胞数(最低有效浓度，MEC)。对于每种制品，MEC将是不同的，但可从体外数据来估计。获得MEC所必需的剂量将取决于个体的特征和施用的途径。可使用检测测定来确定血浆浓度。当然，待施用的组合物的量将取决于被治疗的受治疗者、疾病的严重度、施用的方式、处方医师的判断等。若需要，本发明的组合物可存在于包装或分配器装置中，比如FDA批准的药盒，其可含有一种或多种含活性成分的单位剂型。包装可以，例如，包括金属箔或塑料箔，比如泡罩包装。包装或分配器装置可附有施用说明书。包装或分配器还可设有与容器一起的须知，该须知为监管药物的制造、使用或销售的政府机构指定的形式，其反映了组合物的形式或人类施用或兽医施用获机构批准。这样的须知，例如，可以是关于处方药由美国食品与药物管理局批准的标签，或批准的产品内页。还可制备在相容的药物运载体中配制的包括本发明的制剂的组合物，并将其置于适当的容器中，并贴上关于适应症(indicated condition)的治疗的标签，如以上所详述。术语“包含(comprises)”、“包含(comprising) ”、“包括(includes) ”、“包括(including) ”、“具有(having) ”和其同根词意为“包括但不限于”。术语“由......组成”意为“包括且限于”。术语“基本上由......组成”意为该组合物、方法或结构可包括另外的成分、步骤 和/或部件不会实质性地改变所请求保护的组合物、方法或结构的基本的和新颖的特征。如本文所用的，除非文中另外清楚地规定，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the) ”包括复数指代对象。例如，术语“化合物”或“至少一种化合物”可包括多种化合物，包括其混合物。遍及本申请，本发明的多种实施方案可以范围形式来呈现。应理解的是，范围形式的描述仅为方便和简洁，并不应解释为对本发明的范围的硬性限制。因此，应认为范围的描述具体地公开了该范围中的所有可能的子范围以及单独的数值。例如，应认为比如从I至6的范围的描述具体地公开了子范围比如从I至3、从I至4、从I至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及该范围中的单独的数目，例如，1、2、3、4、5和6。无论范围的宽度如何其均适用。当本文指定了数值范围时，其意在包括该指定的范围中的任何引用的数字(分数或整数)。短语第一指定数字和第二指定数字“之间的范围(ranging)/范围(ranges) ”和短语第一指定数字“至”第二指定数字“之间的范围(ranging)/范围(ranges) ”在本文可互换地使用，且意为包括第二和第二指定的数字和其间的所有分数和整数。如本文所用的术语“方法”指用于实现给定的任务的方式、工具、技术和方案，包括但不限于，化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域中的专业人员已知的或易于从其已知的方式、工具、技术和方案中开发的那些方式、工具、技术和方案。如本文所用的，术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减缓或逆转病症的发展，基本上减轻病症的临床上的或美学上的症状，或基本上阻止病症的临床上或美学上的症状的出现。
应理解的是，为清楚起见而在分开的实施方案中描述的本发明的某些特征，也可在单一的实施方案中组合地提供。相反地，为简便起见而在单一的实施方案中描述的本发明的多种特征，也可分开来提供，或以任何适宜的子组合来提供，或在本发明的任何其他所描述的实施方案中适宜地提供。多个实施方案中描述的某些特征不应被认为是那些实施方案的必要特征，除非无那些元素时该实施方案不生效。如上文所描绘和以下权利要求书部分中所请求保护的本发明的多个实施方案和方面在以下的实施例中得到实验支持。
实施例现参考以下实施例，其连同以上描述以非限制的方式示出了本发明的一些实施方案。一般，本文所用的名称和本发明中所用的实验室方案包括分子技术、生物化学技术、微生物技术和重组DNA技术。文献中充分地解释了这些技术。参见，例如，“Molecular Cloning:A laboratory Manual，，Sambrook等人，(1989) ；uCurrent Protocolsin Molecular Biology” 卷 1-1II Ausubel, R.M.，编(1994) ；Ausubel 等人，“CurrentProtocols in Molecular Biology”，John Wiley and Sons, Baltimore,Maryland(1989)；Perbal, iiA Practical Guide to Molecular Cloning，，，John Wiley & Sons，NewYork (1988) ;Watson 等人，“Recombinant DNA”，Scientific American Books，New York ；Birren 等人.(编)“Genome Analysis:A Laboratory Manual Series”，卷 1-4，ColdSpring Harbor Laboratory Press, New York(1998);如以下中所列出的方法:美国专利第 4，666，828 号；第 4，683，202 号；第 4，801，531 号；第 5，192，659 号和第 5，272，057 号；“Cell Biology:ALaboratory Handbook，，，卷 1-1II Cellis，J.E.，编(1994) ;Freshney 的“Culture of Animal Cells-A Manual of Basic Technique, Wiley-Liss,N.Y.(1994)，第三版；“Current Protocols in Immunology”卷 1-1II Coligan J.E.，编(1994) ;Stites 等人.(编)，“Basic and Clinical Immunology，，(第八片反)，Appleton & Lange, Norwalk,CT (1994) ；Mishell 和 Shiigi (编)，“Selected Methods in Cellular Immunology”，W.H.Freeman and C0.，New York (1980);可获得的免疫测定在专利和科学文献中广泛地描述，参见，例如，美国专利第3，791，932号；第3，839，153号；第3，850，752号；第3，850，578号；第 3，853，987 号；第 3，867，517 号；第 3，879，262 号；第 3，901，654 号；第 3，935，074号；第 3，984，533 号；第 3，996，345 号；第 4，034，074 号；第 4，098，876 号；第 4，879，219号；第 5，011，771 号和第 5，281，521 号,Oligonucleotide Synthesis”Gait，Μ.J.，编(1984) ；iiNucleic Acid Hybridization”Hames，B.D.，和 Higgins S.J.，编.(1985)；“Transcription and Translation” Hames，B.D.，和 Higgins S.J.，编(1984) ;“AnimalCell CulturenFreshney,R.1.，编(1986) Immobilized Cells and Enzymes^IRL Press,(1986) ;“A Practical Guide to Molecular Cloning” Perbal，B.，(1984)和“Methodsin Enzymology，，卷 1-317，Academic Press ;“PCR Protoeols:A Guide To Methods AndApplicatiohs”，Academic Press，San Diego, CA(1990) ;Marshak 等人，“Strategies forProtein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual，，CSHLPress (1996);其全部通过引用并入，如同其在本文中完全列出。遍及本文提供了其他一般参考文献。其中的方案被认为是本领域中熟知的，并为方便读者而提供。其中所含的全部信息通过引用并入本文。实施例1作为胰岛素来源的扩增的β细胞材料和方法无外源条件下的扩增:将成体人类胰岛细胞铺板到包被有MesenCult XF附着基质(Stem Cell Technology, Canada)的平板中并在 MesenCult XF 培养基(Stem CellTechnology, Canada)中扩增。在可溶性因子混合物中的再分化:再分化方案基于超低附着平板中的无血清培养基(SFM)中的细胞的群集，并以2个步骤暴露于可溶性因子的混合物:步骤1:在含25mM葡萄糖并补充有I % BSA级分V、100U/ml青霉素、100 μ g/ml链霉素、ITS (胰岛素、铁传递蛋白、硒)、N2补充物、B27补充物、IOmM烟酰胺、8nM exendin-4和8nM激活素A的CMRL 1066培养基中孵育6天。步骤2:在含5.6mM葡萄糖并补充有I % BSA级分V、100U/ml青霉素、100 μ g/ml链霉素、ITS、N2补充物、B27补充物、IOmM烟酰胺和8nM exendin-4的CMRL 1066培养基中孵
育2天。新点绿(NG):将再分化的细胞经胰酶消化成单细胞悬液，在PBS中2.5 μ M NG中与0.00125%普朗尼克F-127 —起孵育10分钟，并进行FACS分析。结果诱导细胞以与血清存在时细胞生长的速率相当的速率进行复制(图1Α)。如通过Ki67染色所判断的(图1B)，显示谱系示踪β细胞来源的(BCD)细胞在这些条件下复制。与试验的所有其他组合相比，再分化方案导致了最高水平的胰岛素mRNA(图2)。这些水平与组合中的一些相比是其4倍以上。步骤2中葡萄糖浓度的降低不仅导致了较高的胰岛素mRNA水平，还导致了其他胰岛激素的较低的mRNA水平(图3)。利用我们的谱系示踪方法，本发明人已显示该处理导致了 BCD细胞的特异性再分化，这与来自存在于胰岛制品中的其他细胞类型的细胞不同。在获自4个不同的人类供体的细胞中，再分化后C-肽阳性细胞的百分比为9.1 ±3.5%。因为β细胞占原代胰岛细胞群体的约40% (43±3%)，且BCD细胞的比例在扩增期间保持稳定，C-肽阳性细胞的百分比代表BCD细胞中约23%再分化。使用了报告子RIP-DsRed2慢病毒以允许通过追寻活细胞中红色荧光的出现而优化再分化方案(图4)。该标记方法还允许在步骤2结束时分选再分化的胰岛素阳性细胞。DsRed2阳性细胞含胰岛素mRNA水平为人类胰岛中发现的胰岛素mRNA水平的52% (图5A)。人类C-肽含量为374±160ng/106细胞，代表其在人类胰岛中的水平的8% (图5B)。胰岛素原含量为171±22ng/106细胞,表不85.6%的胰岛素原被加工为成熟的胰岛素。再分化方案重复地对来自所有供体的细胞起作用。显示响应于该处理的目前最近的传代为第12代，代表着4096倍扩增。
新点绿(NG)，已知与Zn++离子结合的一种荧光染料，用于标记β细胞，β细胞在胰岛素囊泡中含Zn++离子。已显示该染料与细胞生存力和功能完全相容。如图6Α中所见，被标记的细胞可易于与未标记的细胞区分和通过FACS分选。分选导致胰岛素阳性细胞的大量富集(图6B)。实施例2B⑶细胞再分化的条件的开发材料和方法 细胞培养:分离后2.8±1.2天收到人类胰岛。如通过双硫腙染色所确定的，胰岛纯度为83±9%。将来自单独的供体的胰岛(参见表I中的供体列表)分散为单细胞，如先前所描述(1-4)的标记β细胞并在含5.6mM葡萄糖和补充有10% FCS、青霉素(50单位/ml)和链霉素(50 μ g/ml)(均来自Gibco-1nvitrogen)的CMRL 1066培养基(除另指明外，组织培养试剂来自 Biological Industries, Israel)中扩增。表I
权利要求
1.一种离体提高表达SLUG的祖细胞中的胰岛素含量的方法，所述方法包括下调所述祖细胞中的所述SLUG的量或活性,从而提高所述祖细胞中的胰岛素含量。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述祖细胞选自由去分化的成体胰岛β细胞、间充质干细胞和从β细胞去分化的诱导性多能干细胞组成的组。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述下调通过利用多核苷酸剂来进行。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述下调通过利用针对所述SLUG的抗体来进行。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述多核苷酸剂包括针对所述SLUG的siRNA剂或shRNA 剂。
6.如权利要求2所述的方法，其中所述下调通过将所述去分化的成体胰岛β细胞暴露于含烟酰胺、exendin-4、激活素A和葡萄糖的培养基来进行，所述培养基不含血清。
7.如权利要求6所述的方法，包括: (a)将所述成体胰岛β细胞暴露于含 所述烟酰胺、所述exendin-4、所述激活素A的培养基，其中所述葡萄糖以IO-1OOmM的浓度存在；和随后 (b)将所述成体胰岛β细胞暴露于含所述烟酰胺和所述exendin-4的另外的培养基，其中所述葡萄糖以0.5-10mM的浓度存在。
8.如权利要求6或7所述的方法，其中所述烟酰胺以1-1OOmM的浓度存在。
9.如权利要求6或7所述的方法,其中所述exendin-4以1-1OOmM的浓度存在。
10.如权利要求6或7所述的方法，其中所述激活素A以1-1OOnM的浓度存在。
11.如权利要求7所述的方法，其中所述另外的培养基不含激活素A。
12.如权利要求6或7所述的方法，其中所述培养基不含β细胞素。
13.如权利要求7所述的方法，其中所述另外的培养基不含β细胞素。
14.如权利要求2或6所述的方法，其中所述去分化的成体胰岛β细胞通过培养所述成体胰岛β细胞至少10代而生成。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述培养在CMRL培养基中进行。
16.如权利要求7所述的方法，还包括在步骤(a)之前扩增所述胰岛β细胞。
17.如权利要求7所述的方法，其中步骤(a)进行6天。
18.如权利要求7所述的方法，其中步骤(b)进行2天。
19.如权利要求7所述的方法，还包括在步骤(b)之后分离所述成体胰岛β细胞。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述分离利用锌结合染料来进行。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述锌结合染料包括新点绿。
22.如权利要求19所述的方法，其中所述分离利用抗NCAM抗体来进行。
23.如权利要求2所述的方法，其中用胰酶消化所述去分化的成体胰岛β细胞。
24.一种离体提高成体胰岛β细胞中的胰岛素含量的方法，所述方法包括将所述成体胰岛β细胞暴露于含烟酰胺、exendin-4、激活素A和葡萄糖的培养基，所述培养基不含血清，从而提高所述成体胰岛β细胞中的胰岛素含量。
25.如权利要求24所述的方法，包括: (a)将所述成体胰岛β细胞暴露于含所述烟酰胺、所述exendin-4、所述激活素A的培养基，其中所述葡萄糖以IO-1OOmM的浓度存在；和随后 (b)将所述成体胰岛β细胞暴露于含所述烟酰胺和所述exendin-4的另外的培养基，其中所述葡萄糖以0.5-10mM的浓度存在。
26.如权利要求24所述的方法，其中所述烟酰胺以1-1OOmM的浓度存在。
27.如权利要求24所述的方法，其中所述exendin-4以1-1OOnM的浓度存在。
28.如权利要求24所述的方法，其中所述激活素A以1-1OOnM的浓度存在。
29.如权利要求25所述的方法，其中所述另外的培养基不含激活素A。
30.如权利要求24所述的方法，其中所述培养基不含β细胞素。
31.如权利要求25所述的方法，其中所述另外的培养基不含β细胞素。
32.如权利要求24所述的方法，其中所述成体胰岛β细胞包括去分化的成体胰岛β细胞。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述去分化的成体胰岛β细胞包括从β细胞生成的诱导性多能干细胞。
34.如权利要求32所述的方法，其中所述去分化的成体胰岛β细胞通过培养所述成体胰岛β细胞至少10代而生成。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述培养在CMRL培养基中进行。
36.如权利要求25所述的方法，还包括在步骤(a)之前扩增所述胰岛β细胞。
37.如权利要求25所述的方法，其中步骤(a)进行6天。
38.如权利要求25所述的方法，其中步骤(b)进行2天。
39.如权利要求25所述的方法，还包括在步骤(b)之后分离所述成体胰岛β细胞。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述分离利用锌结合染料来进行。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述锌结合染料包括新点绿。
42.如权利要求39所述的方法，其中所述分离利用抗NCAM抗体来进行。
43.如权利要求24所述的方法，其中用胰酶消化所述成体胰岛β细胞。
44.如权利要求24所述的方法,还包括将所述成体胰岛β细胞与下调SLUG的量或活性的剂接触。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述接触在所述暴露之后进行。
46.一种细胞的分离的群体，包含下调SLUG的siRNA，其中所述细胞分泌胰岛素。
47.一种细胞的分离的群体，根据权利要求24-45中任一项所述的方法生成。
48.一种在受治疗者中治疗糖尿病的方法，所述方法包括将治疗有效量的权利要求46或47所述的成体胰岛β细胞的群体移植到所述受治疗者中，从而治疗糖尿病。
49.权利要求46或47所述的成体胰岛β细胞的群体用于在受治疗者中治疗糖尿病的用途。
50.如权利要求46或47所述的分离的成体胰岛β细胞的群体，所述成体胰岛β细胞经遗传修饰以表达药剂。
51.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求46或47所述的成体胰岛β细胞的群体作为活性成分和药学上可接受的运载体。
全文摘要
本发明提供了离体提高表达SLUG的祖细胞中的胰岛素含量的方法。该方法包括使祖细胞中的SLUG的量或活性下调。还提供了从而生成的细胞的群体和其用途。
文档编号C12N5/071GK103210082SQ201180054714
公开日2013年7月17日 申请日期2011年9月15日 优先权日2010年9月15日
发明者西蒙·埃弗拉特, 霍尔格·A·鲁斯 申请人:雷蒙特亚特特拉维夫大学有限公司
扩增胰岛β细胞和使其再分化的方法发明领域和背景I型糖尿病是由于胰岛产胰岛素β细胞的自身免疫破坏所导致的。因为难以调整最佳胰岛素剂量，胰岛素施用不能阻止该疾病的长期并发症。用经调控的产胰岛素细胞替换损伤的细胞被认为是I型糖尿病的终极疗法。胰腺移植已获成功，但受供体缺乏的严重限制。随着新型胰岛分离和免疫抑制方法的发展，已报道了每个接受者利用来自2-3个供体的膜岛的显著成功(Shapiro AM, Lakey JR, Ryan EA 等人.New Engl J Med 2000 ；343:230-238)。该进展强调了开发人类胰腺供体的替代形式的迫切需要，即用于移植的培养的人类β细胞的丰富来源。终末分化的、有丝分裂期后的胰岛细胞难以在组织培养中扩增(expand)。将成体的和胎儿的人类胰岛细胞培养于含IlmM葡萄糖并补充有10% FBS和肝细胞生长因子的RPMI 1640培养基中的HTB-9基质上，其表现以最多10-15次群体倍增增殖，之后经历衰老。利用逆转录病毒将人类端粒酶(hTERT)的催化亚基导入到细胞中，其表达不能延长复制时间跨度(Halvorsen TL, Beattie GM, Lopez AD, Hayek A, Levine F.J Endocrinol 2000 ；166 =103-109)。由于大量的细胞死亡，该方法导致胰岛细胞团块的3-4次扩增。通过延长的培养进行β细胞扩增的过程伴有细胞的去分化。在许多情况下，细胞的去分化伴有表型的重大改变，其中其形态从含大量细胞-细胞连接和细胞角蛋白纤维网络的上皮细胞的形态变为具有成纤维细胞或间充质外观的细胞的形态。该去分化的过程称作上皮细胞-间充质细胞转变(EMT)，并认为其部分地受锌指转录因子Snail的诱导介导。Slug，是Snail家族成员，已参与皮肤创伤的再上皮化和损伤后受损的骨骼肌的再生。在胰腺干细胞的领域中，Gershengorn等人[Science，2004，306，2261-2264]，提出了培养的原代β细胞能够EMT和 去分化为成纤维细胞样(fibroblastoid-like)的细胞类型。Gershengorn提出了该过程可被逆转，且这些成纤维细胞样细胞随后可通过所谓的间充质细胞-上皮细胞转变再分化为胰腺内分泌细胞。该文章发表后，Gershongorn收回了该说法并表明，经历分化的是存在于胰岛中的间充质干细胞而非去分化的β细胞[Davani等人，Stem cells，卷 25，第 12 期，3215-3222 页，2007]。有丝分裂后的β细胞的被迫扩增的替代方式是诱导具有天然的自我扩增能力的干细胞/祖细胞分化成产胰岛素细胞。胚胎干细胞的定向分化已生成了与β细胞相比较仅产生少量胰岛素的细胞，且其在移植中的潜在用途遭遇伦理上的反对、以及有关畸胎瘤的风险的担心。还已将成体干细胞分化为产胰岛素细胞。然而，这些细胞类型在组织培养中的扩增效率和其分化为产胰岛素细胞的比率需要极大地提高以允许用于移植的大量细胞数目的产生。已清楚地证明，利用激活发育事件的级联反应的主要基因(dominant gene)可至少部分地使定型细胞重编程。本发明人的美国专利申请第20050244966号教导了通过导向内分泌胰腺发育的主要转录因子诸如Pdxl的表达，胎儿肝细胞重编程为β样产胰岛素细胞。诱导人类胎儿肝细胞大量地产生并贮存成熟的胰岛素，其中约三分之一由正常β细胞产生，响应于生理葡萄糖水平而释放，并在STZ-糖尿病非肥胖型糖尿病重症联合免疫缺陷(NOD-scid)小鼠中替代细胞功能。该修饰的细胞表达多种细胞基因。已在表皮生长因子和神经生长因子的存在下离体(ex vivo)扩增了胰岛细胞。虽然这些细胞表现了高胰岛素含量，但它们不响应于葡萄糖分泌胰岛素(Lechner A.等人，Biochem Biophys Res Commun327:581-588,2005)。国际申请W02006/054305教导了在CMRL-1066培养基中扩增胰岛细胞。已显示大量的因子促进组织培养中的β -细胞增殖和分化二者。生长激素家族成员，包括胎盘催乳激素(PL)、生长激素(GH)和促乳素(PRL)，在新生大鼠胰岛细胞中诱导复制。已观察到肝细胞生长因子(HGF)对人类胎儿和成体胰岛以及小鼠胰岛的显著的促分裂效应。在激活素A或烟酰胺存在下，已显示HGF在培养的胎儿胰岛中以及胰腺细胞系中刺激β-细胞分化。已显示胰高血糖素样肽I (GLP-1)和其更稳定的类似物exendin-4在胰腺细胞系中刺激β_细胞增殖和诱导胰岛素基因表达。还已显示表皮生长因子(EGF)家族成员，包括EGF、TGFa和β细胞素(betacellulin)，刺激β-细胞增殖和分化。β细胞素对于包括胰岛β (β)细胞的多种细胞类型是有效的有丝分裂原。显示其可在阿脲和STZ处理的小鼠中增加胰岛素新生，并在90%胰腺切除术的大鼠中加速胰岛素再生[Li L，等人，Endocrinology 2001；142:5379-5385]。Rukstalis 等人[Endocri nology 147 (6) 2997-3006]教导了转录因子 Snail 在永生化的胰腺内分泌细胞系中调节激素表达。而且，公开了，在那些细胞系中利用siRNA使Snail下调提闻了膜岛素基因表达。美国专利申请第20060292127号教导了通过将细胞与调控转录因子Snail/slug/slit家族的剂相接触使β细胞去分化而不是再分化。国际申请W02006/054305教导了在含β细胞素和/或ngn_3的培养基中的扩增的β细胞的再分化。发明概沭根据本发明的一些实施方案的方面，提供了离体提高成体胰岛β细胞中胰岛素含量的方法，该方法包括将成体胰岛β细胞暴露于含烟酰胺、exendin-4、激活素A和葡萄糖的培养基，该培养基不含血清，从而提高成体胰岛β细胞中的胰岛素含量。离体提高表达SLUG的祖细胞中胰岛素含量的方法，所述方法包括使所述祖细胞中的所述SLUG的量或活性下调，从而提高所述祖细胞中的胰岛素含量。根据本发明的一些实施方案的方面，提供了细胞的分离的群体(isolatedpopulation of cells),其包含下调SLUG的siRNA,其中所述细胞分泌胰岛素。根据本发明的一些实施方案的方面，提供了根据本发明的方法生成的细胞的分离的群体。根据本发明的一些实施方案的方面，提供了在受治疗者中治疗糖尿病的方法，所述方法包括将治疗有效量的本发明的成体胰岛β细胞的群体移植到受治疗者中，从而治疗糖尿病。根据本发明的一些实施方案的方面，提供了本发明的成体胰岛β细胞的群体在受治疗者中治疗糖尿病的应用。
包含本发明的成体胰岛β细胞的群体作为活性成分的药物组合物。根据本发明的一些实施方案，方法包括:(a)将成体胰岛β细胞暴露于含烟酰胺、exendin-4、激动素A的培养基，其中葡萄糖以IO-1OOmM的浓度存在；和随后(b)将成体胰岛β细胞暴露于含烟酰胺和exendin-4的另外的培养基，其中葡萄糖以0.5-10mM的浓度存在。根据本发明的一些实施方案，烟酰胺以1-1OOmM的浓度存在。根据本发明的一些实施方案，exendin-4以1-1OOnM的浓度存在。根据本发明的一些实施方案，激动素A以1-1OOnM的浓度存在。根据本发明的一些实施方案，另外的培养基不含激动素A。根据本发明的一些实施方案，培养基不含β细胞素。根据本发明的一些实施方案，另外的培养基不含β细胞素。
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根据本发明的一些实施方案，成体胰岛β细胞包括去分化的成体胰岛β细胞。根据本发明的一些实施方案，去分化的成体胰岛β细胞包括从β细胞生成的诱导性多能干细胞。根据本发明的一些实施方案，去分化的成体胰岛β细胞通过培养成体胰岛β细胞至少10代而生成。根据本发明的一些实施方案，培养在CMRL培养基中进行。根据本发明的一些实施方案，方法还包括在步骤(a)之前扩增胰岛β细胞。根据本发明的一些实施方案，步骤(a)进行6天。根据本发明的一些实施方案，步骤(b)进行2天。根据本发明的一些实施方案，方法还包括在步骤(b)之后分离成体胰岛β细胞。
根据本发明的一些实施方案，分离利用锌结合染料来进行。根据本发明的一些实施方案,锌结合染料包括新点绿(Newport green)。根据本发明的一些实施方案，分离利用抗NCAM抗体来进行。根据本发明的一些实施方案，用胰酶消化成体胰岛β细胞。根据本发明的一些实施方案，方法还包括将成体胰岛β细胞与下调SLUG的量或活性的剂接触。根据本发明的一些实施方案，祖细胞选自由去分化的成体胰岛β细胞、间充质干细胞和从β细胞去分化的诱导性多能干细胞组成的组。根据本发明的一些实施方案，利用针对SLUG的多核苷酸剂进行下调。根据本发明的一些实施方案，利用抗体来进行下调。根据本发明的一些实施方案，多核苷酸包括siRNA剂或shRNA剂。根据本发明的一些实施方案，接触在暴露之后进行。根据本发明的一些实施方案，去分化的成体胰岛β细胞通过培养成体胰岛β细胞至少10代而生成。根据本发明的一些实施方案，培养在CMRL培养基中进行。根据本发明的一些实施方案，分离的成体胰岛β细胞的群体经遗传修饰以表达药剂。
除非另外指定，否则本文所用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域中的普通技术人员所通常理解的相同含义。虽然与本文所描述的方法和材料相似的或等效的那些方法和材料可用于本发明的实施方案的实践或试验中，以下描述了示例性的方法和/或材料。如有冲突，以本发明的说明书，包括定义为准。此外，材料、方法和例子仅为示例性的而并不意在必须限制。附图简沭本文通过仅举例的方式参照附图和图像描述了本发明的一些实施方案。现详细地具体参照了附图，应强调的是以举例的方式显示了细节，并用于示例性地讨论本发明的实施方案的目的。在这一方面，关于附图所采用的描述使本领域技术人员清楚可以如何实践本发明的实施方案。在附图中:
图1A-B示出了可在无外源的(xeno-free)和无血清的条件下扩增β细胞来源的细胞。A:在无外源的(XF)或含血清的CMRL 1066培养基(CMRL)中扩增的胰岛细胞在第2代的显微照片。B:对于增殖标志物Ki67的GFP-标记的β细胞来源的(B⑶)细胞的免疫荧光分析。图2示出了不同的再分化条件对胰岛素mRNA表达的影响。从两个供体扩增并在不同的再分化条件下孵育共8天，第7代的细胞中的胰岛素转录子的qPCR分析。完全再分化混合物(RC)包括:CMRL 1066培养基、25mM葡萄糖、抗生素、胰岛素、铁传递蛋白、硒(ITS)、N2补充物、B27补充物、烟酰胺(NA)、激活素A (ActA)、β细胞素(BTC)、Exendin 4 (EX) 01.步骤1:第1-6天无BTC的RC步骤2:第7-8天无BTC的RC，5.6mM葡萄糖
2.步骤1:第1-6天无BTC的RC步骤2:第7-8天无BTC和ActA的RC，5.6mM葡萄糖数值为平均值土SD，相对于人类RPLPO标准化。图3示出了降低的葡萄糖水平诱导胰岛素表达，同时减少了其他激素的转录子。在RC中再分化8天，第9代的、或在RC中再分化7天、和在带有5.6mM葡萄糖的RC中在第8天时的细胞中的胰岛激素转录子的qPCR分析。数值为平均值土SD，相对于人类RPLPO标准化。INS =胰岛素，SST =生长激素抑制素，GCG =胰高血糖素，PPY =胰多肽。图4是显现活胰岛细胞中的分化的显微照片。用在胰岛素启动子控制下表达荧光标志物DsRed2的慢病毒感染胰岛细胞培养物。通过转移到RC而在第6代时诱导分化。如通过DsRed2表达所显现的(右)，这导致了细胞群集和胰岛素启动子活性的激活。左侧是相同视野的相差图像。UTR:未处理的。图5A-B是示出分选DsRed2表达之后再分化的效应的图。将第6_7代的扩增的细胞在RC中孵育8-11天，然后通过FACS分选。A:qPCR分析显示了再分化后胰岛素表达的上调。数值为平均值土SD，相对于人类RPLPO(大核糖体蛋白)标准化。B:分选的细胞每百万个细胞含375ng C-肽，为人类胰岛中的水平的8%。UTR:未处理的。图6A-B示出了利用新点绿(NG)对再分化的细胞的分选。A:使第5代的胰岛细胞在RC中分化8天。利用NG对含胰岛素的细胞染色，并通过FACS分选。分选的点图显示了在P2门中分选的突光细胞的不同群体。B:分选的细胞、未分选的分化的细胞和未处理的(UTR)细胞中胰岛素转录子的qPCR分析。数值为平均值土SD，相对于人类RPLPO标准化。图7A-F示出了胰岛细胞分化的条件的开发，且表明分化主要代表BCD-细胞再分化。A:在SFM中孵育指定的天数的在第6代的扩增的胰岛细胞中的β细胞基因表达的qPCR分析。数值为相对于未处理的细胞(第O天)的平均值土SD(n = 3-4个供体)，并相对于人类RPLPO标准化。*p < 0.05 ;**p < 0.005。B-D:用于筛选胰岛细胞分化条件的测定。用RIP-DsRed2慢病毒感染胰岛细胞(B)，然后试验不同的分化条件。C:在第5代的扩增的细胞(UTR，未处理的细胞)中未观察到DsRed2表达，而将细胞转移到SFM或RC导致了胰岛素启动子激活，其可通过DsRed2荧光的出现在活细胞中监测。线条= 200ym。D:分化的流式细胞术定量显示，用RC处理导致了与SFM相比较再分化的细胞数目增高6倍。E:用于β细胞标记的病毒载体(vector)的示意图。F:由扩增的胰岛细胞的群体中的不同的细胞来源生成胰岛素表达细胞的预测。胰岛细胞的初始培养物由约一半的产胰岛素β细胞(紫色实心圆)和一半非β细胞(空心圆)组成。β细胞的标记效率为约50% (绿色实心圆)。扩增去分化的胰岛细胞且然后在SFM或RC中分化，并定量C-肽+细胞中eGFP+细胞的百分比。考虑到eGFP标记效率，预计B⑶细胞的再分化导致 50%共染色。来自非BCD细胞的胰岛素表达细胞的从头分化应导致无共染色，而两种机制的出现将导致低百分比的共染色的细胞。共染色定量显示，BCD细胞的再分化是在两种条件下生成的胰岛素表达细胞的主要来源。百分比指示从第4-6代的扩增的胰岛细胞再分化的C-肽+细胞中eGFP+细胞的比例(基于3个供体的每个中计数> 400个细胞)。显示了代表性的显微照片。用DAPI将DNA染为蓝色。线条=10 μ m。图8A-E示出了通过可溶性因子诱导的B⑶细胞的再分化。A、B:用RC处理的第5代的胰岛细胞中的β细胞基因的诱导的动力学。A:qPCR分析。数值为相对于未处理的细胞(第O天)的平均值土 SE (η = 3-4个供体)并相对于人类RPLPO或GAPDH标准化。*p < 0.05 ;**p < 0.01。B:c-肽和roxi共染色的细胞的免疫荧光分析。数值为平均值土 SE (对数尺度)，基于每个时间点处从3个供体中的每一个计数> 500个细胞。*p < 0.05，相对于未处理的细胞(第O天)。显示了代表性的显微照片。线条=25 μ m。C、D:用RC处理8天的第5-7代的胰岛细胞中的β细胞基因表达的分析。C:qPCR分析。数值为相对于未处理的细胞(第O天)的平均值 土 SE (对数尺度)(η = 3-4个供体)，并相对于人类RPLPO标准化。*ρ < 0.05 ;#ρ < 0.005 < 0.0005。D:共染色C-肽和指定的蛋白(绿色的)的细胞的免疫荧光分析。线条=10μπι。百分比指示C-肽+细胞中对于每个标志物呈阳性的细胞的比例。数据为平均值土SD，基于从3个供体的每个中计数> 200个细胞。E:在来自4个供体的未培养的胰岛细胞、来自4个供体的第5代的扩增的胰岛细胞(UTR)、和用RC处理的来自3个供体的第5代的扩增的胰岛细胞的cDNA微阵列分析中检测到的基因表达模式的无监督聚类(unsupervised clustering)。图9A-D示出了分选的再分化的B⑶细胞中的胰岛素产生和分泌。用RIP_DsRed2病毒感染扩增的胰岛细胞(第6-7代)并用RC处理8天。分选DsRed2+细胞并分析。Α:β细胞转录子的qPCR分析。数值为相对于人类胰岛的平均值土 SE (η = 3个供体)，并相对于人类RPLPO标准化。B:新鲜人类胰岛和DsRed2分选的RC处理的胰岛细胞的人类C-肽含量。数值为平均值土 SE (η = 3个供体)。注意，绝大多数所贮存的胰岛素是经加工的(仅9%胰岛素原(proinsulin))。C:在16.7mM葡萄糖和IBMX存在下来自人类胰岛和RC处理的扩增的胰岛细胞的葡萄糖诱导的胰岛素分泌。数值为人类C-肽的平均值土SD，相对于OmM葡萄糖和IBMX (η = 3个供体)。D:电子显微镜分析显示在用RC处理8天的第6代的细胞中典型的胰岛素分泌囊泡的存在，与在分离的人类胰岛中的β细胞中所观察到的那些相当。线条=0.5ym0图10Α-Η示出了 B⑶细胞再分化包括间充质细胞-上皮细胞转变(MET)。A、B:胰岛细胞去分化期间SLUG表达的诱导。A:所示的传代的扩增的胰岛细胞的qPCR分析。数值为相对于未培养的胰岛的平均值土SE (η = 4个供体)并相对于人类RPLPO标准化。*p<0.05。B:从未培养的胰岛和所示的传代数目的扩增的胰岛细胞中提取的蛋白的免疫印迹分析。HSC70，热休克同源物70。C:在胰岛细胞再分化期间SLUG表达的下调。在用RC处理8天后第6-7代的扩增的胰岛细胞的qPCR分析。数值为相对于未处理的细胞的平均值土 SE (η = 4个供体)，并相对于人类RPLPO标准化。*ρ < 0.05。D:在用RC处理8天期间第5代的扩增的胰岛细胞中的NCAD和ECAD转录子的变化的动力学的qPCR分析。数值为相对于未处理的细胞的平均值土 SE (关于ECAD的对数尺度)(η = 4个供体)，并相对于人类RPLPO或GAPDH标准化。*ρ < 0.05 ;#ρ < 0.01。E:在用RC处理8天后第6代的扩增的胰岛细胞的免疫染色分析显示了波形蛋白阳性的细胞数目的减少(平均值土SD，基于从3个供体的每个中计数> 400个细胞)，和波形蛋白和C-肽的互斥表达。箭头指向可能已丢失波形蛋白表达但还未激活胰岛素表达的细胞。线条=IOym0 F:在用RC处理8天后第5代的扩增的胰岛细胞中C-肽和BrdU的共染色。百分比指示在再分化处理的第2-8天掺入BrdU之后，总细胞中BrdU阳性细胞的比例。数据为平均值土SD，基于从3个供体的每个中计数500个细胞。线条=20 μ m。G:用表达两种SLUG shRNA中的一种或乱序(SCR) shRNA的慢病毒感染的第5代的扩增的胰岛细胞的免疫印迹分析。UTR，未处理的细胞。H:用表达两种SLUG shRNA中的一种或乱序shRNA的慢病毒感染并用RC处理4天的第5代的扩增的胰岛细胞中的胰岛素转录子的qPCR分析。数值为相对于未处理的细胞的平均值土SE (η =
3-6个供体)，并相对于人类RPLPO或GAPDH标准化。p-值为相对于SCR的。UI，用RC处理的未感染的细胞。图1lA-H分别示出了 B⑶细胞再分化包括胰腺和胰岛祖细胞转录因子S0X9和NGN3的表达。A:扩增的胰岛细胞(第6代)的RC处理导致激素表达细胞而非胰岛素表达细胞的生成。用RC处理细胞8天并用对于指定的激素的抗体染色(通过对C-肽的染色鉴定产胰岛素细胞)。数值为平均值土 SE (η = 4个供体)，基于从每个供体计数> 500个细胞。绿色的数值指示了在与来自6个供体的谱系示踪细胞的平行实验中评分的共1736个激素阳性的eGFP+细胞中对于每种激素呈阳性的细胞的百分比。B-D:再分化期间的S0X9激活。用RC处理第5代的胰岛细胞8天。B:S0X9的上调的动力学的qPCR分析。数值为相对于未处理的细胞(第O天)的平均值土 SE (η = 4个供体)，并相对于人类RPLPO或GAPDH标准化。*ρ < 0.05。C:通过免疫荧光分析对S0X9+细胞的定量。数值为平均值土SD，基于每个时间点从3个供体中的每个中计数> 500个细胞。( 0.01, ( 0.001,相对于未处理的细胞(第O天)。D:左侧，免疫荧光分析检测单独的波形蛋白或S0X9染色的细胞，以及双阳性的细胞。右侧，C-肽和S0X9染色是互斥的。线条=IOym0 E:利用表达两种SLUG shRNA中的一种或乱序的sh RNA的慢病毒感染并用RC处理4天，第5代的扩增的胰岛细胞中S0X9转录子的qPCR分析。数值为相对于未处理的细胞的平均值土SE (η =4-6个供体)，并相对于人类RPLPO或GAPDH标准化。UI，RC处理的未感染的细胞。F:再分化期间激活了 NGN3。人类胎儿胰腺细胞(左图)和利用RC处理的胰岛细胞处理8天后第5代的扩增的胰岛细胞(右图)中NGN3mRNA表达的原位杂交分析。线条=25 μ m。G-H:胰岛细胞去分化期间S0X9的瞬时激活。G:所示的传代的扩增的胰岛细胞的qPCR分析。数值为相对于未培养的胰岛的平均值土 SE (η = 3个供体)并相对于人类RPLPO标准化。*p
<0.05。H:从未培养的胰岛和所示的传代数目的扩增的胰岛细胞中提取的蛋白的免疫印迹分析。图12A-B示出了 β细胞中RIP-CreER转基因表达的特异性。利用RIP-CreER病毒感染人类胰岛细胞并在感染后2-3天对Cre蛋白和4种胰岛激素共染色(胰岛素+细胞通过对C-肽的染色而鉴定)。数值为平均值土 SD (η = 3个供体；基于从每个供体计数400个细胞)。图13Α-Β示出了 RC处理期间胰岛祖细胞基因的上调的动力学。用RC处理所示的天数的第5代的扩增的胰岛细胞的qPCR分析。数值为相对于未处理的细胞(第O天)的平均值土SE (η = 4个供体)，并相对于人类GAPDH标准化，*p < 0.05，#p ( 0.01，***p ^ 0.001。图14示出了 RC处理后INSMl的上调。在用RC处理8天后第5代的扩增的胰岛细胞中的INSMl转录子的qPCR分析。数值为相对于未处理的细胞的平均值土SE (η = 4个供体)，并相对于人类RPLPO标准化。发明具体实施方式
的描述本发明，在其一些实施方案中，涉及在成体胰岛β细胞中增加胰岛素含量的方法。在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，应理解，本发明的应用不必限于以下描述中所列出的或通过实施例所示例的细节。本发明能够以其他实施方案或能够以多种方式实践或进行。因此，根据本发明的一方面，提供了离体提高成体胰岛β细胞中胰岛素含量的方法，所述方法包括将成体胰岛β细胞暴露于含烟酰胺、exendin-4、激活素A和葡萄糖的培养基，所述培养基不含血清，从而提高成体胰岛β细胞中的胰岛素含量。如本文所用的短语“离体(ex-vivo) ”指从活的生物体中移出并在生物体外(例如，在试管中)培养的细胞。如本文所用的，短语“成体胰岛β细胞”指出生后的(例如，非胚胎的)胰岛内分泌细胞，其能够响应于增高的葡萄糖浓度分泌胰岛素并表达典型的β细胞标志物。β细胞标志物的例子包括,但不限于,胰岛素和Pdx。本发明的该方面的分离的成体胰岛β细胞可以是同种性质的或异种性质的(homogeneous or heterogeneous nature)。因此，例如，本发明的该方面的成体胰岛β细胞可被包括在分离的胰岛中。胰岛细胞可包括以下:1)产生胰岛素的β细胞；2)产生胰高血糖素的α细胞；3)产生生长激素抑制素的S细胞(或D细胞)；和/或产生胰多肽的F细胞。这些细胞中的多肽激素(胰岛素、胰高血糖素、生长激素抑制素和胰多肽)以分泌颗粒的形式贮存于分泌囊泡中。分离胰岛的方法是本领域中熟知的。 例如，可利用胶原酶和ficoll梯度从胰腺组织中分离胰岛。优选地将本发明的成体胰岛β细胞分散成单细胞悬液-例如，通过添加胰酶或通过研磨。可将成体胰岛β细胞进一步分离，使其基本上不含在其体内环境中存在的其他物质(例如，其他细胞、蛋白、核酸等)，例如，通过FAC分选来分离。成体胰岛β细胞可获自任何自体的或非自体的(即，同种异体的或异种的)哺乳动物供体。例如，细胞可从人类尸体中分离。成体胰岛β细胞的去分化可通过扩增(即，培养)延长的传代数目而进行，-例如，在CMRL培养基中。如本文所用的，术语“扩增(expanding) ”指通过细胞分裂的过程而非简单地通过过度生长而扩大,增加本发明的成体胰岛β细胞的数目和总量。根据一个实施方案，细胞在含约IO-1OOmM葡萄糖，更优选地为10_50mM，更优选地为10-25mM，比如例如25mM浓度的葡萄糖的Mesencult XF培养基中扩增。优选地扩增细胞至少6代、7代、8代、9代、10代、11代、12代、13代、14代、15代、或至少16代。根据一个具体的实施方案，扩增在粘附条件下进行，所述粘附条件包括在选自由层粘连蛋白、纤连蛋白、基质月父和Mesencult XF粘附基质组成的组的粘附培养基上鮮育。
根据另一个实施方案，成体胰岛β细胞的去分化可通过利用已知生成诱导性多能干细胞(iPS)细胞的基因转染细胞来实现。已将Oct-3/4和Sox基因家族的某些成员(Soxl、Sox2、Sox3和Soxl5)鉴定为参与诱导过程的关键转录调控子，其缺失使诱导不可能。然而，已鉴定包括Klf家族的某些成员0(1€1、1(1€2、1(1€4和1(1€5)、1^(3家族的某些成员(C-myc、L-myc和N_myc)、Nanog和LIN28的另外的基因提高诱导效率。根据一个实施方案，通过以下使细胞再分化:(a)在含烟酰胺、exendin-4、激活素A和10_50mM葡萄糖的培养基中孵育成体胰岛β细胞，该培养基不含血清；和随后(b)在含烟酰胺、exendin-4和0.5-10mM葡萄糖的另外的培养基中孵育成体胰岛β细胞。烟酰胺的示例性的浓度范围包括Ι-lOOmM，更优选地为l_50mM、更优选地为l-20mM,比如例如10mM。exendin 4的示例性的浓度范围包括1-lOOnM，更优选地为1_50ηΜ，更优选地为1-20ηΜ,比如例如8nM。激活素A的示例性的浓度范围包括1-lOOnM，更优选地为1_50ηΜ，更优选地为1-20ηΜ,比如例如8nM。对于步骤A，葡萄糖的示例性的浓度范围包括lO-lOOmM，更优选地为10_50mM，更优选地为10-25mM，比如例如25mM。对于步骤B，葡萄糖的示例性的浓度范围包括0.5-10mM,更优选地为l_10mM，更优选地为2.5-7.5mM,比如例如5.6mM。利用本文描述的方法获得的细胞能够以葡萄糖响应方式分泌胰岛素并典型地表达β细胞特异性基因(例如rox-1)。根据一个特定的实施方案，根据本文描述的方法生成的分离的群体的细胞的至少10%是由β细胞再分化的细胞。根据一个特定的实施方案，根据本文描述的方法生成的分离的群体的细胞的至少20%是由β细胞再分化的细胞。根据一个特定的实施方案，根据本文描述的方法生成的分离的群体的细胞的至少30%是由β细胞再分化的细胞。根据一个特定的实施方案，根据本文描述的方法生成的分离的群体的细胞的至少40%是由β细胞再分化的细胞。根据又一个另外的实施方案，根据本文描述的方法生成的分离的群体的细胞的至少20%分泌胰岛素。根据又一个另外的实施方案，根据本文描述的方法生成的分离的群体的细胞的至少30%分泌胰岛素。根据又一个另外的实施方案，根据本文描述的方法生成的分离的群体的细胞的至少40%分泌胰岛素。根据又一个另外的实施方案，根据本文描述的方法生成的分离的群体的细胞的至少50%分泌胰岛素。优选地，本文所描述的群体中的细胞中的大多数表达Η)Χ1、ΝΚΧ2.2、NKX6.1、IAPP和PCI/3和β细胞功能必需的其他蛋白。优选地，如通过RT-PCR所测量的，与非再分化的β细胞相比较，细胞表达增加的量的β细胞转录因子(例 如，HBLX9、NEUROD, ΝΚΧ2.2和ΝΚΧ6.1)。可以在本文所描述的分离的群体中被上调的其他基因包括KIR6.2、SURl和GCK。本发明人已显示，以上所描述的再分化方案导致了称作SLUG(snail同源物2，编码具有Swiss prot编号043623的蛋白)的基因-GenBankTM登录号BC014890的下调。将理解的是，本发明涵盖用于该再分化方案(或任何另外的再分化方案)的下调SLUG的另外的方式(例如，通过利用特异性地针对该蛋白的剂，比如通过利用抗体或SiRNA剂)。以下是能够下调SLUG的表达水平和/或活性的剂的列表。能够下调SLUG的剂的一个例子是能够特异性地结合SLUG的抗体或抗体片段。优选地，该抗体特异性地结合SLUG的至少一个表位。如本文所用的，术语“表位”指抗原上与抗体的互补位结合的任何抗原决定簇。如本发明所用的术语“抗体”包括完整的分子以及能够与巨噬细胞结合的其功能性片段，比如Fab、F(ab' )2和Fv。这些功能性抗体片段如下所定义:(I)Fab，含有抗体分子的单价抗原结合片段的片段，可通过用木瓜蛋白酶消化整个抗体生成完整的轻链和一个重链的部分而产生；(2)Fab'，可通过用胃蛋白酶处理整个抗体，然后还原，产生完整的轻链和重链的部分而获得的抗体分子的片段；每个抗体分子获得两个Fab'片段；(3)(Fab' )2，可通过用胃蛋白酶处理整个抗体而不进行随后的还原而获得的抗体的片段；F(ab' )2是通过两个二硫键保持在一起的两个Fab'片段的二聚体；(4)Fv，定义为含表达为两个链的轻链的可变区和重链的可变区的遗传工程化的片段；和(5)单链抗体(“SCA”)，含轻链的可变区和重链的可变区的遗传工程化的分子，通过适宜的多肽连接物连接作为遗传融合的单链分子。
SLUG的下调还可通过RNA沉默来实现。如本文所用的，短语“ RNA沉默”指由RNA分子所介导的一组调控机制[例如，RNA干扰(RNAi)、转录基因沉默(TGS)、转录后基因沉默(PTGS)、压制、共抑制和翻译阻抑]，导致对应的蛋白编码基因的表达的抑制或“沉默”。已在包括植物、动物和真菌的许多类型的生物体中观察到RNA沉默。如本文所用的，术语“RNA沉默剂”指能够特异性地抑制或“沉默”靶基因的表达的RNA。在某些实施方案中，RNA沉默剂能够通过转录后沉默机制阻止mRNA分子的完全加工(例如，完整的翻译和/或表达)。RNA沉默剂包括非编码RNA分子，例如包括成对的链的RNA双链体，以及前体RNA，可由其生成小的非编码RNA。示例性的RNA沉默剂包括dsRNA诸如siRNA、miRNA和shRNA。在一个实施方案中，RNA沉默剂能够诱导RNA干扰。在另一个实施方案中，RNA沉默剂能够介导翻译阻抑。根据本发明的一个实施方案，RNA沉默剂对于靶标RNA(例如，SLUG)是特异性的，且并不交叉抑制或沉默与靶基因表现99%或更小总体同源性的基因或剪接变体，所述更少总体同源性例如，与靶基因小于 98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81% 的总体同源性。RNA干扰指在动物中由短干扰RNA(SiRNA)介导的序列特异性转录后基因沉默的过程。在植物中对应的过程通常称作转录后基因沉默或RNA沉默，且在真菌中还被称作压制。转录后基因沉默的过程被认为是用于阻止外源基因表达的进化保守的细胞防卫机制，并通常为多种植物群(flora)和动物门(phyla)所共有。这种对于外源基因表达的阻止可经由特异性地破坏同源的单链RNA或病毒基因组RNA的细胞反应响应于双链RNA(dsRNA)的产生而演变，所述双链RNA来源于病毒感染或来自随机整合进入到宿主基因组中的转座子元件。细胞中的长dsRNA的存在刺激了称作dicer的核糖核酸酶III的活性。Dicer参与将dsRNA加工成称作短干 扰RNA(siRNA)的dsRNA的短片段。来源于dicer活性的短干扰RNA通常长度约21至约23个核苷酸，且包括约19个碱基对双链体。RNAi响应还以核酸内切酶复合物为特征，其通常称作RNA诱导的沉默复合物(RISC)，其介导具有与siRNA双链体的反义链互补的序列的单链RNA的切割。靶RNA的切割发生在与siRNA双链体的反义链互补的区域中部。因此,本发明的一些实施方案涵盖dsRNA用于下调从mRNA的蛋白表达的用途。根据一个实施方案，dsRNA大于30bp。长dsRNA (即，dsRNA大于30bp)的用途非常有限，由于认为这些双链RNA的较长的区域将导致干扰素的诱导和PKR应答。然而，使用长dsRNA可提供大量的优点，原因在于细胞可选择最佳沉默序列，减少了试验大量siRNA的必要；长dsRNA将允许沉默文库具有比siRNA必需的复杂性小的复杂性；并且，可能最重要的是，当用作治疗剂时，长dsRNA能够阻止病毒逃逸突变。多项研究证明长dsRNA可用于沉默基因表达，而不会诱导应激反应或导致显著的偏离IE标效应_参见例如[Strat等人，Nucleic Acids Research, 2006,卷34,第13号 3803-3810 ；Bhargava A 等人.Brain Res.Protoc.2004 ；13:115-125 ；Diallo Μ.，等人，Oligonucleotides.2003 ； 13:381-392 ；Paddison P.J.,等人，Proc.Natl Acad.Sc1.USA.2002 ；99:1443-1448 ；Tran N.，等人，FEBS Lett.2004 ；573:127-134]。具体地，本发明根据其一些实施方案涵盖导入长dsRNA (超过30个碱基转录子)以用于其中不激活干扰素途径的细胞(例如，胚细胞和卵母细胞)中的基因沉默，参见例如 Billy 等人,PNAS 2001,卷 98,第 14428-14433 页.和 Diallo 等人，Oligonucleotides,2003 年 10 月 I H,13(5):381-392.do1:10.1089/154545703322617069。本发明根据其一些实施方案还涵盖导入特别设计以不诱导干扰素和PKR途径的长dsRNA 以用于下调基因表达。例如，Shinagwa和 Ishii [Genes & Dev.17 (11): 1340-1345,2003]已开发了称作pDECAP的载体，以从RNA聚合酶II (Pol II)启动子表达长的双链RNA。由于来自pDECAP的转录子缺少协助ds-RNA输出到细胞质的5’ -帽结构和3’ -聚腺苷酸尾巴二者，来自pDECAP的长ds-RNA不会诱导干扰素应答。避开哺乳动物系统中的干扰素和PKR途径的另一种方法是通过经由转染或内源性表达而导入小抑制性RNA(siRNA)。术语“ siRNA”指诱导 RNA干扰(RNAi)途径的小抑制性RNA双链体(通常在18_30碱基对之间)。通常，siRNA是化学合成的21mer，具有中央的19bp双链体区域和对称的末端2-碱基3’ -悬突，虽然最近已描述，化学合成的25-30碱基长度的RNA双链体与在相同的位置的21mer相比较可具有多达100倍增高的效力。理论认为在触发RNAi时利用较长的RNA获得的所观察到的增高的效力起因于向Dicer提供了底物(27mer)而非产物(2Imer),且这提高了 siRNA双链体进入到RISC的速率或效率。已发现3’ -悬突的位置影响着siRNA的效力，且在反义链上具有3’ -悬突的不对称的双链体一般比在有义链上具有3’-悬突的那些更有效(Rose等人，2005)。这可归因于不对称的链载入到RISC中，因为当靶向反义转录子时观察到相反的效率模式。可连接双链干扰RNA (例如，siRNA)的链以形成发夹或茎-环结构(例如，shRNA)。因此，如所提到的，本发明的一些实施方案的RNA沉默剂还可以是短发夹RNA(shRNA)。如本文所用的，术语“ shRNA”指具有茎-环结构的RNA剂，包括具有互补序列的第一区域和第二区域，互补的程度和区域的方向足以使区域之间发生碱基配对，第一区域和第二区域通过环区域连接，环由环区域中的核苷酸(或核苷酸类似物)之间缺少碱基配对而引起。环中的核苷酸的数目是3至23、或5至15、或7至13、或4至9、或9至11之间并包括端点的数目。环中的某些核苷酸可参与与环中的另外的核苷酸的碱基配对相互作用。可用于形成环的寡核苷酸序列的例子包括5' -UUCAAGAGA-3' (Brummelkamp,T.R.等人.(2002) Science 296:550)和 5' -UUUGUGUAG-3' (Castanotto,D.等人.(2002) RNA 8:1454)。本领域技术人员将认识到，所得的单链寡核苷酸形成包括能够与RNAi机器(RNAimachinery)相互作用的双链区域的莖-环或发夹结构。根据另一个实施方案，RNA沉默剂可以是miRNA。miRNA是由编码不同大小的初级转录子的基因产生的小RNA。其已在动物和植物二者中被鉴定。初级转录子(称作“初级-miRNA”)经过多种核水解(nucleolytic)步骤被加工成较短的前体miRNA,或“前-miRNA”。前-miRNA以折叠的形式存在，从而最终的(成熟)miRNA以双链体存在，该两个链被称作miRNA (将最终与靶标碱基配对的链)。前-miRNA是将miRNA双链体从前体移除的dicer形式的底物，之后，与siRNA类似，双链体可被捕获到RISC复合物中。已证明miRNA可转基因地表达且通过前体形式而非整个初级形式的表达而生效。(Parizotto等人.(2004)Genes & Development 18:2237-2242 和 Guo 等人.(2005)Plant Cell 17:1376-1386)。
不同于siRNA, miRNA仅以部分互补性结合转录子序列(Zeng等人,2002, Molec.Cell 9 =1327-1333)并抑制翻译而不影响稳态的RNA水平(Lee等人，1993，Cell 75:843-854 ;Wightman 等人，1993，Cell 75:855-862)。miRNA 和 siRNA 二者被 Dicer 加工并与RNA诱导的沉默复合物的组分缔合(Hutvagner等人,2001, Science 293:834-838 ；Grishok等人，2001, Cell 106:23-34 ；Ketting 等人，2001, Genes Dev.15:2654-2659 !Williams等人，2002，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 99:6889-6894 ;Hammond 等人，2001，Science 293:1146-1150 ；Mourlatos 等人,2002, Genes Dev.16:720-728)。最近的报告(Hutvagner 等人，2002, Sciencexpress 297:2056-2060)假设，通过miRNA途径还是通过siRNA途径进行基因调控是仅由与靶转录子的互补性的程度来决定的。据推测，与mRNA靶标仅部分相同的siRNA将与miRNA相似地在翻译抑制而非触发RNA降解中起作用。适用于本发明的一些实施方案的RNA沉默剂的合成可按如下来进行。首先，在SLUG mRNA序列的AUG起始密码子的下游扫描AA 二核苷酸序列。将每个AA和3’邻近的19个核苷酸的存在记录为可能的siRNA靶位点。优选地，siRNA靶位点选自开放读码框，因为非翻译区(UTR)中调控蛋白结合位点较为丰富。UTR结合蛋白和/或翻译起始复合物可干扰siRNA核酸内切酶复合物的结合[Tuschl ChemBiochem.2 =239-245]。然而将理解的是，针对非翻译区的siRNA也可以是有效的，如对GATOH所证明的，其中针对5’UTR的siRNA介导了细胞GAPDH mRNA约90%的下降并完全消除了蛋白水平(www.ambion.com/techlib/tn/91/912.html)。其次，利用任何序列比对软件，诸如从NCBI服务器可获得的BLAST软件(www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST/),将可能的祀位点与适当的基因组数据库(例如，人类、小鼠、大鼠等)比较。过滤掉与另外的编码序列表现出显著同源性的推测的靶位点。选择符合条件的靶序列作为siRNA合成的模板。优选的序列是包括低G/C含量的那些序列，因为已证明这些序列与具有高于55%的G/C含量的那些序列相比较更有效地介导基因沉默。沿着靶基因的长度，优选选择多个靶位点用于评价。为了更好地评价所选择的siRNA，优选地共同使用阴性对照。阴性对照siRNA优选地包括与该siRNA相同的核苷酸组成，但与基因组无显著同源性。这样，优选地使用该siRNA的乱序的核苷酸序列，条件是其不会表现出与任何其他基因的任何显著的同源性。将理解的是，本发明的一些实施方案的RNA沉默剂不必限于仅含RNA的那些分子，而还包括化学修饰的核苷酸和非核苷酸。在一些实施方案中，本文提供的RNA沉默剂可在功能上与细胞渗透肽”结合。如本文所用的，“细胞渗透肽”是包括短(约12-30个残基)氨基酸序列或功能基序的肽，其赋予与膜可渗透复合物跨细胞的质膜和/或核膜的转运有关的不依赖能量的(即，非内吞作用)移位性质。本发明的一些实施方案的膜可渗透复合物中所用的细胞渗透肽优选地包括至少一个非功能的半胱氨酸残基，其是游离的或被衍生以与双链核糖核酸形成二硫键，所述双链核糖核酸已经被修饰以用于这样的键合。赋予这样的性质的代表性的氨基酸基序在美国专利第6，348，185号中列出，其内容在此通过引用明确地并入。本发明的一些实施方案的细胞渗透肽优选地包括但不限于，穿膜肽(penetratin)、转运素(transportan)、plsl、TAT (48-60)、pVEC、MTS、和 MAP。 能够下调SLUG的另一种剂是能够特异性地切割SLUG的mRNA转录子或DNA序列的脱氧核酶(DNAzyme)分子。脱氧核酶是单链的多核苷酸，其能够切割单链的和双链的靶序列二者(Breaker, R.R.和 Joyce, GChemistry and Biologyl995 ；2:655 ；Santoro, S.W.&Joyce, G.F.Proc.Natl, Acad.Sc1.USA 1997 ；943:4262)。已提出了脱氧核酶的一般模型(“10-23”模型)。“10-23”脱氧核酶具有15个脱氧核糖核苷酸的催化域，侧翼为各7至9个脱氧核糖核苷酸的两个底物识别域。该类型的脱氧核酶可在嘌呤:嘧啶连接处有效地切割其底物RNA(Santoro, S.W.& Joyce,G.F.Proc.Natl, Acad.Sc1.USA 199 ;关于脱氧核酶的综述参见 Khachigian，LM[Curr Opin Mol Ther 4:119-21(2002)]。Joyce等人的美国专利第6，326，174号中公开了识别单链和双链祀切割位点的合成的、工程化的脱氧核酶的构建和扩增的实例。最近观察到相似设计的针对人类尿激酶受体的脱氧核酶抑制尿激酶受体表达，且成功地在体内抑制结肠癌细胞转移(Itoh等人，20002, Abstract 409, Ann Meeting Am Soc Gen Ther www.asgt.0rg)。在另一个应用中，与bcr-abl癌基因互补的脱氧核酶成功地在白血病细胞中抑制癌基因表达，并在CML和ALL病例中的自体骨髓 移植中减少了复发率。SLUG的下调还可通过利用能够与编码SLUG的mRNA转录子特异性地杂交的反义多核苷酸来进行。能够下调SLUG的另一种剂是能够特异性地切割编码SLUG的mRNA转录子的核酶分子。核酶正在被越来越多地用于通过切割编码感兴趣的蛋白的mRNA而序列特异性抑制基因表达[Welch等人，Curr Opin Biotechnol.9:486-96 (1998)]。设计核酶以切割任何特定的靶RNA的可能性使其成为基础研究和治疗应用中有价值的工具。调控细胞中SLUG基因的表达的另一种方法是经由三链体形成寡核苷酸(TFO)。最近的研究已显示，可设计能够以序列特异性的方式识别并结合双链螺旋DNA中的多嘌呤/多卩密唳区域的TFO0这些识别规则由以下所概述:Maher III, L.J.,等人，Science, 1989 ；245:725-730 ；Moser, H.E.，等人，Science, 1987 ；238:645-630 ；Beal, P.A.，等人 Science,1992 ；251:1360-1363 ；Cooney, Μ.，等人，Science, 1988 ；241:456-459 ;和 Hogan，Μ.Ε.，等人，欧洲公布375408。对寡核苷酸的修饰，诸如引入嵌入剂和骨架取代，以及优化结合条件(pH和阳离子浓度)，已帮助克服了对TFO活性的固有障碍，比如电荷排斥和不稳定性，且最近已显示可使合成的寡核苷酸祀向特定的序列(关于最近的综述参见Seidman和Glazer,J Clin Invest 2003;112:487-94)。一般，三链体形成寡核苷酸具有序列对应:寡核苷酸3' —A G G T双链体5' —A G C T双链体3' -T C G A然而，已显示A-AT和G-GC三链体具有最大的三螺旋稳定性(Reither和Jeltsch，BMC Biochem, 2002,9 ^ 12日，电子出版)。相同的作者已证明，根据A-AT和G-GC规则设计的TFO不会形成非特异性三链体，表明三链体形成确实是序列特异性的。 因此对于SLUG调控区域中的任何给定的序列，可设计三链体形成序列。三链体形成寡核苷酸长度优选地为至少15bp，更优选地为25bp，更加优选地为30bp或更多核苷酸，长达 50bp 或 IOObp。用TFO转染细胞(例如，经由阳离子脂质体)，且与靶DNA形成三螺旋结构诱导了空间的和功能的改变，阻断了转录起始和延伸，允许在内源性的DNA中导入所需的序列改变并导致基因表达的特异性下调。这种在用TFO处理的细胞中抑制基因表达的例子包括哺乳动物细胞中的游离体supFGl基因和内源性HPRT基因的敲除(Vasquez等人，Nucl AcidsRes.1999 ；27:1176_81，和 Puri，等人，J Biol Chem, 2001 ；276:28991-98)，和在前列腺病因中重要的Ets2转录因子(Carbone，等人，Nucl Acid Res.2003 ;31:833-43)，以及促炎性ICAM-1基因(Besch等人，J Biol Chem, 2002 ；277 =32473-79)的表达的序列和靶标特异性下调。此外，Vuyisich和Beal最近已显不,序列特异性的TFO能够与dsRNA结合,抑制dsRNA依赖性酶诸如RNA依赖性激酶的活性(Vuyisich和Beal，Nuc.Acids Res 2000 ；28:2369-74)。此外，根据上述原则设计的TFO可诱导能够实现DNA修复的定向诱变，从而提供了内源性基因的表达的下调和上调二者(Seidman和Glazer，J Clin Invest 2003 ；112:487-94)。有效的TFO的设计、合成和施用的详细描述可见于Froehler等人的美国专利申请第 2003 017068 号和第 2003 0096980 号、和 Emanuele 等人的第 2002 0128218 号和第 20020123476号、和Lawn的美国专利第5，721，138号。能够下调SLUG的另一种剂可以是与SLUG结合和/或切割SLUG的任何分子。这样的分子可以是SLUG拮抗剂、或SLUG抑制肽。将理解的是，SLUG的至少催化部分或结合部分的非功能类似物也可用作下调SLUG的剂。可与本发明的一 些实施方案一起使用以下调SLUG的另一种剂是阻止SLUG激活或DNA结合的分子。还可进一步修饰(例如，遗传修饰)本发明的成体胰岛β细胞的群体以表达药齐U，诸如治疗剂、端粒酶基因、减少免疫介导的排斥的剂或标志物基因。预期治疗剂诸如抗代谢物(例如，嘌呤类似物、嘧啶类似物)、酶抑制剂和肽模拟物在本发明中通常可以是有用的。可减少免疫介导的排斥的基因的例子是子宫珠蛋白基因。子宫珠蛋白是在孕期表达的蛋白，其赋予免疫耐受性并阻止炎症反应。上文描述了遗传修饰本发明的成体胰岛β细胞的方法。根据一个实施方案，再分化之后，将β细胞与胰岛中存在的其他胰腺细胞分离。这可利用锌结合染料诸如新点绿来进行(参见Parnaud G,等人.Proliferation of sortedhuman and rat beta cells.Diabetologia 2008.51:91-100)或利用抗 NCAM 抗体来进行(参见 Banerjee M, Otonkoski T.A simple two-step protocol for the purificationof human pancreatic beta cells.Diabetologia 2009.52:621-625.)。因为本发明的成体胰岛细胞以葡萄糖响应方式贮存和分泌胰岛素，其可用于治疗与胰岛素缺乏相关的疾病比如糖尿病。因此，根据本发明的另一方面，提供了在受治疗者中治疗糖尿病的方法，所述方法包括将治疗有效量的本发明的离体扩增和再分化的成体胰岛β细胞的群体移植到受治疗者中，从而治疗糖尿病。如本文所用的，“糖尿病”指在生物体中由因为胰岛素的生物合成或产生的缺陷所致的胰岛素的绝对缺乏引起(I型糖尿病)或由存在胰岛素抵抗即受损的胰岛素作用的胰岛素的相对缺乏引起(2型糖尿病)的疾病。因此糖尿病患者具有绝对的胰岛素缺乏或相对的胰岛素缺乏，并除其他症状和病征外表现出增高的血糖浓度、尿中葡萄糖的存在和排尿过多。短语“治疗”指在患有或诊断为疾病、疾患或病症的个体中抑制或阻止疾病、疾患或病症的发展和/或导致疾病、疾患或病症的减少、减轻或消退。本领域技术人员将知道可用于评估疾病、疾患或病症的发展的多种方法和测定，和类似地，可用于评估疾病、疾患或病症的减少、减轻或消退的多种方法和测定。如本文所用的，“移植”指利用任何适宜的途径提供本发明的再分化的成体胰岛β细胞。虽然设想了其他施用方法，通常，β细胞治疗通过利用导管注射到肝的门静脉中而实现。如上所述，本发明的成体胰岛β细胞可来源于自体来源或来源于同种异体来源诸如人类尸体或供体。因为当非自体细胞被施用于身体时可能诱导免疫反应，已开发了一些方法来减少非自体细胞的排斥的可能性。这些方法包括抑制接受者的免疫系统，或在移植前将非自体细胞胶囊化到免疫隔离的半渗透性膜中。胶囊化技术通常分类为包括小球形囊泡的微囊化和包括较大的平面片和中空纤维膜的巨囊化(Uludag, H.等人.Technology of mammalian cell encapsulation.AdvDrug Deliv Rev.2000 ；42:29-64)。制备微胶囊的方法是本领域中已知的，且包括例如以下中所公开的:Lu MZ,等人，Cell encapsulation with alginate and alpha-phenoxycinnamylidene-acetylated poly (allylamine).Biotechnol Bioeng.2000,70:479-83, Chang TM 和 PrakashS.Procedures for microencapsulation of enzymes,cells and genetically engineeredmicroorganisms.Mol Biotechnol.2001,17:249-60,和 Lu MZ,等人，A novel cellencapsulation method using photosensitive poly (allylamine alpha-cyanocinnamylideneacetate).J Microencapsul.2000,17:245-51。
例如，微胶囊的制备是通过将改性的胶原与2-甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)、甲基丙烯酸(MAA)和甲基丙烯酸甲酯(MMA)的三元聚合物壳复合，生成2-5 μ m厚的胶囊。这样的微胶囊可利用另外的2-5 μ m的三元聚合物壳进一步胶囊化以赋予带负电荷的平滑表面并使血楽■蛋白吸附最小化(Chia, S.M.等人.Mult1-layered microcapsules for cellencapsulation Biomaterials.2002 23:849-56)。其他微胶囊是基于海洋多糖藻酸盐(Sambanis, A.Encapsulated islets indiabetes treatment.Diabetes Thechnol.Ther.2003, 5:665-8)或其衍生物。例如，微胶囊可通过在氯化钙存在下在聚阴离子藻酸钠和硫酸纤维素钠与聚阳离子聚(亚甲基-共-胍)盐酸盐之间的聚合电解质络合来制备。将理解的是，当使用较小的胶囊时，细胞胶囊化得以改进。因此，当胶囊尺寸从Imm降低到400 μ m时，胶囊化的细胞的质量控制、机械稳定性、扩散性质和体外活性提高了(Canaple L.等人，Improving cell encapsulation through size control.J BiomaterSci Polym Ed.2002 ; 13:783-96)。并且，发现具有良好控制的小至7nm的孔径、定制的表面化学和精确的微结构的纳米孔生物胶囊成功地免疫隔离了细胞的微环境(WilliamsD.Small is beautiful:microparticle and nanoparticle technology in medicaldevices.Med Device Technol.1999,10:6~9 ；Desai, T.A.Microfabrication technologyfor pancreatic cell encapsulation.Expert Opin Biol Ther.2002, 2:633-46)。免疫抑制剂的例子包括但不限于，氨甲蝶呤、环磷酰胺、环孢素、环孢霉素A、氯喹、轻氯喹、硫氮磺胺批唳(sulphasalazopyrine)、金盐、D-青霉胺、来氟米特、硫唑嘌呤、阿那白滞素、英夫利昔单抗(REMICADE.sup.R)、靶向炎性细胞因子的生物剂TNFa阻断剂依那西普、和非留体类抗炎药(NSAID)。NSAID的例子包括但不限于，乙酰水杨酸、胆碱水杨酸镁、二氟尼柳、水杨酸镁、双水杨酯、水杨酸钠、双氯芬酸、依托度酸、非诺洛芬、氟吡洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、甲氧胺苯酸钠、萘普生、萘丁美酮、保泰松、吡罗昔康、舒林酸、托美汀、扑热息痛、布洛芬、Cox-2抑制剂和曲马多。可将本发明的成体胰岛β细胞本身，或在其中其与适宜的运载体(carrier)或赋形剂混合的药物组合物中移植到人类受治疗者中。如本文所用的“药物组合物”指本文所描述的一种或多种活性成分与其他化学组分诸如生理上适宜的运载体和赋形剂的制品。药物组合物的目的是为了协助将化合物施用到生物体。本文中术语“活性成分”指负责生物效应的本发明的成体胰岛β细胞。下文中，短语“生理学上可接受的运载体”和“药学上可接受的运载体”可互换地使用，指不会对生物体产生显著的刺激和不会消除所施用的化合物的生物活性和性质的运载体或稀释剂。这些短语中包括佐剂(adjuvant)。
本文中术语“赋形剂”指添加到药物组合物中以进一步协助活性成分的施用的惰性物质。非限制地，赋形剂的例子包括碳酸钙、磷酸钙、多种糖类和淀粉类型、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。本发明的药物组合物可通过本领域中熟知的方法来制造，例如，通过常规的混合、溶解、粒化、制造糖衣药丸、磨细、乳化、胶囊化、包埋(entrapping)或冻干工艺。因此用于根据本发明的用途的药物组合物可以常规的方式利用一种或多种生理学上可接受的运载体来配制，所述生理学上可接受的运载体包括赋形剂和助剂，其协助将活性成分加工为可用于药学应用的制品。合适的制剂取决于所选择的施用途径。对于注射，药物组合物的活性成分可在水溶液中配制，优选地在生理学相容的缓冲液诸如汉克氏溶液、林格氏溶液或生理盐缓冲液。适用于本发明中的药物组合物包括其中含有有效实现预期目的的量的活性成分的组合物。更具体地，治疗有效量意为有效预防、减轻或改善疾患(例如，糖尿病)的症状或延长被治疗的受治疗者的生存的活性成分(产胰岛素细胞)的量。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力之内，尤其是根据本文提供的详细的公开内容。对于本发明的方法中所用的任何制品，可从动物模型(例如，STZ糖尿病小鼠)估计治疗有效量或剂量以达到想要的浓度或效价。这样的信息可用于更准确地确定在人类中有效的剂量。本文所描述的活性成分的毒性和治疗效力可在实验动物中通过标准的药学方案来确定。可将从这些动物研究中获得的数据用于配制一系列用于人类的剂量。根据所用的剂型和所用的施用途径，剂量可以是不同的。确切的制剂、施用途径和剂量可由每个医师参照患者的状况来选择。(参见，例如，Fingl,等人，1975,于"The Pharmacological Basisof Therapeutics ",中第 I 章第 I 页)。施药量和间隔可单独地调整以提供足以诱导血糖量正常的细胞数(最低有效浓度，MEC)。对于每种制品，MEC将是不同的，但可从体外数据来估计。获得MEC所必需的剂量将取决于个体的特征和施用的途径。可使用检测测定来确定血浆浓度。当然，待施用的组合物的量将取决于被治疗的受治疗者、疾病的严重度、施用的方式、处方医师的判断等。若需要，本发明的组合物可存在于包装或分配器装置中，比如FDA批准的药盒，其可含有一种或多种含活性成分的单位剂型。包装可以，例如，包括金属箔或塑料箔，比如泡罩包装。包装或分配器装置可附有施用说明书。包装或分配器还可设有与容器一起的须知，该须知为监管药物的制造、使用或销售的政府机构指定的形式，其反映了组合物的形式或人类施用或兽医施用获机构批准。这样的须知，例如，可以是关于处方药由美国食品与药物管理局批准的标签，或批准的产品内页。还可制备在相容的药物运载体中配制的包括本发明的制剂的组合物，并将其置于适当的容器中，并贴上关于适应症(indicated condition)的治疗的标签，如以上所详述。术语“包含(comprises)”、“包含(comprising) ”、“包括(includes) ”、“包括(including) ”、“具有(having) ”和其同根词意为“包括但不限于”。术语“由......组成”意为“包括且限于”。术语“基本上由......组成”意为该组合物、方法或结构可包括另外的成分、步骤 和/或部件不会实质性地改变所请求保护的组合物、方法或结构的基本的和新颖的特征。如本文所用的，除非文中另外清楚地规定，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the) ”包括复数指代对象。例如，术语“化合物”或“至少一种化合物”可包括多种化合物，包括其混合物。遍及本申请，本发明的多种实施方案可以范围形式来呈现。应理解的是，范围形式的描述仅为方便和简洁，并不应解释为对本发明的范围的硬性限制。因此，应认为范围的描述具体地公开了该范围中的所有可能的子范围以及单独的数值。例如，应认为比如从I至6的范围的描述具体地公开了子范围比如从I至3、从I至4、从I至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及该范围中的单独的数目，例如，1、2、3、4、5和6。无论范围的宽度如何其均适用。当本文指定了数值范围时，其意在包括该指定的范围中的任何引用的数字(分数或整数)。短语第一指定数字和第二指定数字“之间的范围(ranging)/范围(ranges) ”和短语第一指定数字“至”第二指定数字“之间的范围(ranging)/范围(ranges) ”在本文可互换地使用，且意为包括第二和第二指定的数字和其间的所有分数和整数。如本文所用的术语“方法”指用于实现给定的任务的方式、工具、技术和方案，包括但不限于，化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域中的专业人员已知的或易于从其已知的方式、工具、技术和方案中开发的那些方式、工具、技术和方案。如本文所用的，术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减缓或逆转病症的发展，基本上减轻病症的临床上的或美学上的症状，或基本上阻止病症的临床上或美学上的症状的出现。
应理解的是，为清楚起见而在分开的实施方案中描述的本发明的某些特征，也可在单一的实施方案中组合地提供。相反地，为简便起见而在单一的实施方案中描述的本发明的多种特征，也可分开来提供，或以任何适宜的子组合来提供，或在本发明的任何其他所描述的实施方案中适宜地提供。多个实施方案中描述的某些特征不应被认为是那些实施方案的必要特征，除非无那些元素时该实施方案不生效。如上文所描绘和以下权利要求书部分中所请求保护的本发明的多个实施方案和方面在以下的实施例中得到实验支持。
实施例现参考以下实施例，其连同以上描述以非限制的方式示出了本发明的一些实施方案。一般，本文所用的名称和本发明中所用的实验室方案包括分子技术、生物化学技术、微生物技术和重组DNA技术。文献中充分地解释了这些技术。参见，例如，“Molecular Cloning:A laboratory Manual，，Sambrook等人，(1989) ；uCurrent Protocolsin Molecular Biology” 卷 1-1II Ausubel, R.M.，编(1994) ；Ausubel 等人，“CurrentProtocols in Molecular Biology”，John Wiley and Sons, Baltimore,Maryland(1989)；Perbal, iiA Practical Guide to Molecular Cloning，，，John Wiley & Sons，NewYork (1988) ;Watson 等人，“Recombinant DNA”，Scientific American Books，New York ；Birren 等人.(编)“Genome Analysis:A Laboratory Manual Series”，卷 1-4，ColdSpring Harbor Laboratory Press, New York(1998);如以下中所列出的方法:美国专利第 4，666，828 号；第 4，683，202 号；第 4，801，531 号；第 5，192，659 号和第 5，272，057 号；“Cell Biology:ALaboratory Handbook，，，卷 1-1II Cellis，J.E.，编(1994) ;Freshney 的“Culture of Animal Cells-A Manual of Basic Technique, Wiley-Liss,N.Y.(1994)，第三版；“Current Protocols in Immunology”卷 1-1II Coligan J.E.，编(1994) ;Stites 等人.(编)，“Basic and Clinical Immunology，，(第八片反)，Appleton & Lange, Norwalk,CT (1994) ；Mishell 和 Shiigi (编)，“Selected Methods in Cellular Immunology”，W.H.Freeman and C0.，New York (1980);可获得的免疫测定在专利和科学文献中广泛地描述，参见，例如，美国专利第3，791，932号；第3，839，153号；第3，850，752号；第3，850，578号；第 3，853，987 号；第 3，867，517 号；第 3，879，262 号；第 3，901，654 号；第 3，935，074号；第 3，984，533 号；第 3，996，345 号；第 4，034，074 号；第 4，098，876 号；第 4，879，219号；第 5，011，771 号和第 5，281，521 号,Oligonucleotide Synthesis”Gait，Μ.J.，编(1984) ；iiNucleic Acid Hybridization”Hames，B.D.，和 Higgins S.J.，编.(1985)；“Transcription and Translation” Hames，B.D.，和 Higgins S.J.，编(1984) ;“AnimalCell CulturenFreshney,R.1.，编(1986) Immobilized Cells and Enzymes^IRL Press,(1986) ;“A Practical Guide to Molecular Cloning” Perbal，B.，(1984)和“Methodsin Enzymology，，卷 1-317，Academic Press ;“PCR Protoeols:A Guide To Methods AndApplicatiohs”，Academic Press，San Diego, CA(1990) ;Marshak 等人，“Strategies forProtein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual，，CSHLPress (1996);其全部通过引用并入，如同其在本文中完全列出。遍及本文提供了其他一般参考文献。其中的方案被认为是本领域中熟知的，并为方便读者而提供。其中所含的全部信息通过引用并入本文。实施例1作为胰岛素来源的扩增的β细胞材料和方法无外源条件下的扩增:将成体人类胰岛细胞铺板到包被有MesenCult XF附着基质(Stem Cell Technology, Canada)的平板中并在 MesenCult XF 培养基(Stem CellTechnology, Canada)中扩增。在可溶性因子混合物中的再分化:再分化方案基于超低附着平板中的无血清培养基(SFM)中的细胞的群集，并以2个步骤暴露于可溶性因子的混合物:步骤1:在含25mM葡萄糖并补充有I % BSA级分V、100U/ml青霉素、100 μ g/ml链霉素、ITS (胰岛素、铁传递蛋白、硒)、N2补充物、B27补充物、IOmM烟酰胺、8nM exendin-4和8nM激活素A的CMRL 1066培养基中孵育6天。步骤2:在含5.6mM葡萄糖并补充有I % BSA级分V、100U/ml青霉素、100 μ g/ml链霉素、ITS、N2补充物、B27补充物、IOmM烟酰胺和8nM exendin-4的CMRL 1066培养基中孵
育2天。新点绿(NG):将再分化的细胞经胰酶消化成单细胞悬液，在PBS中2.5 μ M NG中与0.00125%普朗尼克F-127 —起孵育10分钟，并进行FACS分析。结果诱导细胞以与血清存在时细胞生长的速率相当的速率进行复制(图1Α)。如通过Ki67染色所判断的(图1B)，显示谱系示踪β细胞来源的(BCD)细胞在这些条件下复制。与试验的所有其他组合相比，再分化方案导致了最高水平的胰岛素mRNA(图2)。这些水平与组合中的一些相比是其4倍以上。步骤2中葡萄糖浓度的降低不仅导致了较高的胰岛素mRNA水平，还导致了其他胰岛激素的较低的mRNA水平(图3)。利用我们的谱系示踪方法，本发明人已显示该处理导致了 BCD细胞的特异性再分化，这与来自存在于胰岛制品中的其他细胞类型的细胞不同。在获自4个不同的人类供体的细胞中，再分化后C-肽阳性细胞的百分比为9.1 ±3.5%。因为β细胞占原代胰岛细胞群体的约40% (43±3%)，且BCD细胞的比例在扩增期间保持稳定，C-肽阳性细胞的百分比代表BCD细胞中约23%再分化。使用了报告子RIP-DsRed2慢病毒以允许通过追寻活细胞中红色荧光的出现而优化再分化方案(图4)。该标记方法还允许在步骤2结束时分选再分化的胰岛素阳性细胞。DsRed2阳性细胞含胰岛素mRNA水平为人类胰岛中发现的胰岛素mRNA水平的52% (图5A)。人类C-肽含量为374±160ng/106细胞，代表其在人类胰岛中的水平的8% (图5B)。胰岛素原含量为171±22ng/106细胞,表不85.6%的胰岛素原被加工为成熟的胰岛素。再分化方案重复地对来自所有供体的细胞起作用。显示响应于该处理的目前最近的传代为第12代，代表着4096倍扩增。
新点绿(NG)，已知与Zn++离子结合的一种荧光染料，用于标记β细胞，β细胞在胰岛素囊泡中含Zn++离子。已显示该染料与细胞生存力和功能完全相容。如图6Α中所见，被标记的细胞可易于与未标记的细胞区分和通过FACS分选。分选导致胰岛素阳性细胞的大量富集(图6B)。实施例2B⑶细胞再分化的条件的开发材料和方法 细胞培养:分离后2.8±1.2天收到人类胰岛。如通过双硫腙染色所确定的，胰岛纯度为83±9%。将来自单独的供体的胰岛(参见表I中的供体列表)分散为单细胞，如先前所描述(1-4)的标记β细胞并在含5.6mM葡萄糖和补充有10% FCS、青霉素(50单位/ml)和链霉素(50 μ g/ml)(均来自Gibco-1nvitrogen)的CMRL 1066培养基(除另指明外，组织培养试剂来自 Biological Industries, Israel)中扩增。表I
权利要求
1.一种离体提高表达SLUG的祖细胞中的胰岛素含量的方法，所述方法包括下调所述祖细胞中的所述SLUG的量或活性,从而提高所述祖细胞中的胰岛素含量。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述祖细胞选自由去分化的成体胰岛β细胞、间充质干细胞和从β细胞去分化的诱导性多能干细胞组成的组。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述下调通过利用多核苷酸剂来进行。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述下调通过利用针对所述SLUG的抗体来进行。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述多核苷酸剂包括针对所述SLUG的siRNA剂或shRNA 剂。
6.如权利要求2所述的方法，其中所述下调通过将所述去分化的成体胰岛β细胞暴露于含烟酰胺、exendin-4、激活素A和葡萄糖的培养基来进行，所述培养基不含血清。
7.如权利要求6所述的方法，包括: (a)将所述成体胰岛β细胞暴露于含 所述烟酰胺、所述exendin-4、所述激活素A的培养基，其中所述葡萄糖以IO-1OOmM的浓度存在；和随后 (b)将所述成体胰岛β细胞暴露于含所述烟酰胺和所述exendin-4的另外的培养基，其中所述葡萄糖以0.5-10mM的浓度存在。
8.如权利要求6或7所述的方法，其中所述烟酰胺以1-1OOmM的浓度存在。
9.如权利要求6或7所述的方法,其中所述exendin-4以1-1OOmM的浓度存在。
10.如权利要求6或7所述的方法，其中所述激活素A以1-1OOnM的浓度存在。
11.如权利要求7所述的方法，其中所述另外的培养基不含激活素A。
12.如权利要求6或7所述的方法，其中所述培养基不含β细胞素。
13.如权利要求7所述的方法，其中所述另外的培养基不含β细胞素。
14.如权利要求2或6所述的方法，其中所述去分化的成体胰岛β细胞通过培养所述成体胰岛β细胞至少10代而生成。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述培养在CMRL培养基中进行。
16.如权利要求7所述的方法，还包括在步骤(a)之前扩增所述胰岛β细胞。
17.如权利要求7所述的方法，其中步骤(a)进行6天。
18.如权利要求7所述的方法，其中步骤(b)进行2天。
19.如权利要求7所述的方法，还包括在步骤(b)之后分离所述成体胰岛β细胞。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述分离利用锌结合染料来进行。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述锌结合染料包括新点绿。
22.如权利要求19所述的方法，其中所述分离利用抗NCAM抗体来进行。
23.如权利要求2所述的方法，其中用胰酶消化所述去分化的成体胰岛β细胞。
24.一种离体提高成体胰岛β细胞中的胰岛素含量的方法，所述方法包括将所述成体胰岛β细胞暴露于含烟酰胺、exendin-4、激活素A和葡萄糖的培养基，所述培养基不含血清，从而提高所述成体胰岛β细胞中的胰岛素含量。
25.如权利要求24所述的方法，包括: (a)将所述成体胰岛β细胞暴露于含所述烟酰胺、所述exendin-4、所述激活素A的培养基，其中所述葡萄糖以IO-1OOmM的浓度存在；和随后 (b)将所述成体胰岛β细胞暴露于含所述烟酰胺和所述exendin-4的另外的培养基，其中所述葡萄糖以0.5-10mM的浓度存在。
26.如权利要求24所述的方法，其中所述烟酰胺以1-1OOmM的浓度存在。
27.如权利要求24所述的方法，其中所述exendin-4以1-1OOnM的浓度存在。
28.如权利要求24所述的方法，其中所述激活素A以1-1OOnM的浓度存在。
29.如权利要求25所述的方法，其中所述另外的培养基不含激活素A。
30.如权利要求24所述的方法，其中所述培养基不含β细胞素。
31.如权利要求25所述的方法，其中所述另外的培养基不含β细胞素。
32.如权利要求24所述的方法，其中所述成体胰岛β细胞包括去分化的成体胰岛β细胞。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述去分化的成体胰岛β细胞包括从β细胞生成的诱导性多能干细胞。
34.如权利要求32所述的方法，其中所述去分化的成体胰岛β细胞通过培养所述成体胰岛β细胞至少10代而生成。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述培养在CMRL培养基中进行。
36.如权利要求25所述的方法，还包括在步骤(a)之前扩增所述胰岛β细胞。
37.如权利要求25所述的方法，其中步骤(a)进行6天。
38.如权利要求25所述的方法，其中步骤(b)进行2天。
39.如权利要求25所述的方法，还包括在步骤(b)之后分离所述成体胰岛β细胞。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述分离利用锌结合染料来进行。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述锌结合染料包括新点绿。
42.如权利要求39所述的方法，其中所述分离利用抗NCAM抗体来进行。
43.如权利要求24所述的方法，其中用胰酶消化所述成体胰岛β细胞。
44.如权利要求24所述的方法,还包括将所述成体胰岛β细胞与下调SLUG的量或活性的剂接触。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述接触在所述暴露之后进行。
46.一种细胞的分离的群体，包含下调SLUG的siRNA，其中所述细胞分泌胰岛素。
47.一种细胞的分离的群体，根据权利要求24-45中任一项所述的方法生成。
48.一种在受治疗者中治疗糖尿病的方法，所述方法包括将治疗有效量的权利要求46或47所述的成体胰岛β细胞的群体移植到所述受治疗者中，从而治疗糖尿病。
49.权利要求46或47所述的成体胰岛β细胞的群体用于在受治疗者中治疗糖尿病的用途。
50.如权利要求46或47所述的分离的成体胰岛β细胞的群体，所述成体胰岛β细胞经遗传修饰以表达药剂。
51.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求46或47所述的成体胰岛β细胞的群体作为活性成分和药学上可接受的运载体。
全文摘要
本发明提供了离体提高表达SLUG的祖细胞中的胰岛素含量的方法。该方法包括使祖细胞中的SLUG的量或活性下调。还提供了从而生成的细胞的群体和其用途。
文档编号C12N5/071GK103210082SQ201180054714
公开日2013年7月17日 申请日期2011年9月15日 优先权日2010年9月15日
发明者西蒙·埃弗拉特, 霍尔格·A·鲁斯 申请人:雷蒙特亚特特拉维夫大学有限公司
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