利用聚酮合酶生产α-烯烃的制作方法
专利名称：利用聚酮合酶生产α-烯烃的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用聚酮合酶产生α -烯烃，因而涉及化学、微生物学和分子生物学领域。
背景技术：
I型聚酮合酶(PKS)是能够具有脂肪酸合酶(FAS)的所有催化能力的可编程的多功能酶。然而，与FAS酶反复延伸并完全还原每次延伸烃主链所产生的β-羰基不同，PKS系统每次延伸和还原新生链时利用分散排列的酶促结构域。这些通常被称为模块的排列能够引入导致不同侧链的多种延伸单元。它们还能够编码O至3个与FAS相关的还原结构域，其在生长的聚酮链的β位分别导致酮基、羟基、双键或完全饱和的碳(Hopwood andSherman.1990.Annual Review of Genetics24:37-66)。由于其模块性，PKS系统已被广泛开发用于产生“非天然的”天然产物(Weissmanand Leadlay.2005.Nature Reviews Microbiology3:925-936)。已经产生数百种这样的分子，范围从碱性内酯到修饰形式的药物和药物样化合物。发明概述本发明提供了能够合成α-烯烃的聚酮合酶(PKS)，用于产生所述聚酮合酶的重组表达载体，表达所述聚酮合酶并产生期望的α-烯烃的重组宿主细胞，制备α-烯烃的方法以及通过所述方法产生的α-烯烃。本发明的PKS不是天然存在的，因而被称为“重组的’TKS酶。在本发明的一些实施方案中，α-烯烃不是由天然存在的PKS合成的化合物。在本发明的一些实施方案中，PKS是包含来自两种、三种、四种或更多种天然存在的PKS的模块和/或其一部分的杂合PKS。杂合PKS可以含有来自两种或更多种天然存在的PKS的天然存在的模块和/或其可以含有一个或多个模块，所述模块由来自同一种天然存在的PKS或来自两种或更多种天然存在的PKS或以上两种情况的两个或更多个模块的一部分(包括完整的结构域)组成。在本发明的一些实施方案中，利用包含天然存在的或重组的CurM模块或其一部分的重组核酸。本发明提供了编码本发明PKS的重组核酸。重组核酸包括以下核酸:包含本发明的一部分或全部PKS的核酸，还包含调控序列如启动子和翻译起始和终止序列的核酸，以及还可包含促进在宿主细胞中稳定维持的序列(即，提供复制起始功能的序列或促进通过同源重组整合入宿主细胞染 色体DNA或其它DNA中的序列)的核酸。在一些实施方案中，重组核酸被稳定地整合入宿主细胞的染色体。在一些实施方案中，重组核酸是质粒。因此，本发明还提供了包含本发明重组核酸的载体，包括表达载体。本发明还提供了包含本发明的重组核酸和/或PKS中的任一种的宿主细胞。在一些实施方案中，当在合适的条件下培养时，宿主细胞能够产生α-烯烃。这些宿主细胞包括，例如但不限于原核生物以及真核生物，所述原核生物如肠杆菌(Ε.coli)、芽孢杆菌(Bacillus)属、链霉菌(Streptomyces)属、粘细菌(Myxobacterial)属,所述真核生物包括但不限于酵母和真菌菌株。因此，本发明提供了包含本发明的一种或多种重组核酸和/或PKS的多种宿主细胞。在一些实施方案中，当培养时，宿主细胞能够产生α-烯烃，在不存在本发明核酸的条件下，α-烯烃不会产生或以较低的水平产生。本发明提供了产生α -烯烃的方法，所述方法大体包括:提供本发明的宿主细胞，在合适的条件下，在合适的培养基中培养所述宿主细胞，使其产生α -烯烃。本发明还提供了组合物，所述组合物包含来自宿主细胞(其产生α-烯烃)的α -烯烃，并且在一些实施方案中，可以包含宿主细胞的痕量残留物和/或其它成分。这类痕量残留物和/或其它成分可以包括，例如，由宿主细胞裂解所产生的细胞物质。本发明还提供了纯化α-烯烃的方 法以及将所述α-烯烃转化成其它有用的产物的方法。
本领域技术人员由以下详细描述的示例性实施方案结合附图阅读时，将易于理解本发明的以上方面和实施方案以及其它方面。图1显示了根据本发明适于合成1-己烯的生物合成途径的模块构建的示例性实例。在该图中，推荐的模块来源于来自红霉素PKS的DEBSl的装载模块，来自制霉菌素PKSNysC的模块5和curacin PKS的CurM末端模块。在本发明的另一实施方案中，制霉菌素PKS模块5用来自茚满霉素(indanomyCin)PKS的模块9和10的一部分替代。这种可选择的实施方案实际上已用于产生1-己烯。图2显示了所用的模块类型和用于引入聚酮链的对应前体。装载模块被命名为S。尽管可以使用任何合适的装载结构域(诸如装载醋酸盐和苯甲酸的那些结构域)，但在该图中仅示出了两个实例。其余化合物代表利用延伸模块A - P引入生长的聚酮链中的结构。虚线指示通过克莱森(Claisen)缩合反应形成的C-C键；键右侧的原子和虚线左侧的C原子代表由所用模块决定的结构。R基代表在由模块决定引入之前已存在的酰基链。图3显示:㈧根据本发明可用于产生1-己烯的PKS系统，⑶可如何添加其它模块以产生更长的偶数链α-烯烃，以及(C)根据本发明的方法，如何改变引入醋酸盐(来自丙二酰辅酶Α)的装载模块来允许达到饱和的线性奇数链α-烯烃。图4显示了图解利用除虫菌素PKS装载模块的本发明的一实施方案。所示的侧链仅仅是实例，而并非构成可利用除虫菌素装载模块(或相似的装载模块)根据本发明的方法和教导引入的整个侧链库。图5在(A)部分中显示了 3-亚甲基-4-戊烯酸的示例性途径的实例，根据本发明的方法利用PKS获取羧化丁二烯衍生物的实例，以及二烯烃和羧酸部分之间的距离可如何通过使用其它PKS模块来增加。图5在(B)部分中显示了从jamaicamide途径生物合成环外亚甲基所提出的机制(参见Edwards et al.2004.Chem Biol.11 (6):817-33;通过引用并入本文)。
图6显示了根据本发明的方法产生丁二烯的PKS。尽管本发明不以任何方式受本文列举的或显示的任何所提出的作用机制的限制，但是该图为了简单的目的示例了羟基以水分子脱除，酶促机制利用硫酸盐作为离去基团。图7显示了根据本发明的方法产生丁二烯的PKS。(A)和⑶部分显示了利用修饰成接受丙烯酰辅酶A的DEBS丙酰辅酶A特异性装载结构域装载丙烯酰辅酶A。(C)部分显示了丙烯酸盐部分的硫转移至KS结构域。(D)部分显示了丙二酰辅酶A的结合并转移至ACP结构域。(E)部分显示了 KS催化部分的缩合并释放C02。(F)部分显示了 KR催化β_羰基基团的还原。(G)部分显示了终步骤以及丁二烯、CO2和水的释放(如图6，用水分子示例羟基基团的脱除，但是酶促机制利用硫酸盐作为离去基团)。图8显示了通过本发明的方法和材料产生丙烯酰辅酶A可获得的酶促途径，包括外源供给丙酸盐，并表达PrpE和酰基辅酶A脱氢酶活性。为包含该系统的宿主细胞提供丙酸盐，如果丙酸盐不是由所选择用于生产的宿主细胞内源产生的，则可以外源供给。图9显示了通过本发明的方法和材料产生丙烯酰辅酶A可获得的酶促途径，包括外源供给丙酸盐和葡萄糖。为包含该系统的宿主细胞提供丙酸盐和宿主细胞可以直接或间接转化成丙酮酸盐的合适的有机分子，所述丙酸盐通过外源供给或上文所述的丙酸盐生物合成途径引入。例如，如果宿主细胞是大肠杆菌，合适的有机分子可以是葡萄糖。该途径利用中心代谢的中间体丙酮酸盐通过乳酸脱氢酶产生乳酸盐。然后通过乳酸辅酶A转移酶利用丙酰辅酶A作为辅因子将乳酸盐转化成乳酰辅酶Α，并释放丙酸盐。然后利用乳酰辅酶A脱水酶使乳酰辅酶A脱水，以产生丙烯酰辅酶Α。本发明的一实施方案包括来自大肠杆菌的乳酸脱氢酶LdhA，来自丙酸梭菌的乳酸辅酶A转移酶Pct，以及来自丙酸梭菌的乳酰辅酶A脱水酶酶EI和EII。将该途径引入大肠杆菌或酵母中用于二烯烃(如丁二烯)生产代表了这些酶的新应用。本发明的一实施方案是将该途径用于基于PKS的丙烯酸盐生产的用途。图10显示了通过本发明的方法和材料从共有的代谢前体丙二酰辅酶A开始产生丙烯酰辅酶A可获得的酶促途径。该途径利用乙酰辅酶A羧化酶，乙酰辅酶A和CO2产生丙二酰辅酶A。然后，通过丙二酰辅酶A还原酶还原丙二酰辅酶A，并释放丙二酰半醛。利用底物特异的氧化还原酶将丙二酰半醛转化成3-羟基丙酸盐。3-羟基丙酸辅酶A连接酶催化3-羟基丙酰辅酶A的形成。然后， 该中间体通过3-羟基丙酰辅酶A水合酶的可逆反应脱水形成丙烯酰辅酶A。在本发明的一实施方案中，这些酶是来自大肠杆菌的乙酰辅酶A羧化酶复合物(AccA/AccD)，丙二酰辅酶A还原酶。将该途径引入大肠杆菌或酵母中用于二烯烃(如丁二烯)生产代表了这些酶的新应用，并且是本发明特有的实施方案。本发明的一实施方案是将该途径用于基于PKS的丙烯酸盐生产的用途。图11显示了通过本发明的方法和材料经由甲羟戊酸盐途径产生异戊二烯可获得的酶促途径。图12显示了本发明提供的用于产生异戊二烯的PKS可获得的示例性途径的实例。(A)显示了利用修饰成接受丙烯酰辅酶A的DEBS丙酰辅酶A特异性装载结构域装载丙烯酰辅酶A，并用丙二酰辅酶A延伸以形成β-酮酯酰ACP结合的中间体。(B)-(D)部分显示了利用来自枯草杆菌(Bacillus subtilis)PKSX(Bacillaene)集簇的PKS酶,用甲基取代β _擬基基团所涉及的HMG-辅酶A样机制(Butcher, et al.2007.Proc Natl Acad SciUS A.104(5):1506-9;通过引用并入本文)。本发明并不受本文所示的任何所提出机制的限制。在该实施方案中，倒数第二个产物作为游离酸释放，并随后根据本发明的方法通过脱羧酶或细胞外化学催化/热解而脱羧基形成异戊二烯。图13显示了本发明提供的用于产生伍)-1，3_戊二烯的？1 。该图示出了羟基基团以水分子脱除，但是酶促机制利用硫酸盐作为离去基团。图14显示了用于产生之前的附图中所描述的丙烯酰辅酶A和[2S]-甲基丙二酰辅酶A的大肠杆菌中的前体供应途径。所描述的每种酶均可以在宿主细胞中表达，其中每种酶可以独立地为宿主细胞内源的或天然的，或者被引入重组体。图15显示了本发明所提供的用于最大化大肠杆菌中前体供应途径的方法和材料。最大化丙烯酰辅酶A的途径可以包括“敲除”(消除或降低其表达)PrpC活性，敲除YgfH活性，外源供给丙酸盐(或内源产生丙酸盐)，过表达PrpE活性以增加丙酰辅酶A胞质库中的一种或多种。从该中间体，丙酰辅酶A羧化酶复合物(AccA/PccB)的引入将产生甲基丙二酰辅酶 A (Pfeifer，et al.Science.2001Mar2; 291 (5509):1790-2;通过引用并入本文)。该丙酰辅酶A库还可以用在图8和9所述的途径中。
图16显示了本发明所提供的产生3-羟基-1-辛烯的示例性PKS。PKS包含以下元件:(i)来自PikAl (苦霉素)的装载模块和KSl，随后为(ii)模块I和KS2:来自模块5的AT-ACP区段和来自制霉菌素PKS的KS6结构域，(iii)模块2:来自蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)ZmaA(双效菌素PKS)的羟基丙二酸盐特异性AT和邻近的ACP结构域，来自南昌霉素PKS模块2的DH, ER KR结构域，以及(iv)模块3 =CurM模块(curacinPKS)的AT-TE区段。为了产生前体羟基丙二酰-ACP，酶ZmaD，ZmaG和ZmaE也由宿主菌株产生或提供。该图示出了羟基基团以水分子脱除，然而，应当注意，酶促机制利用硫酸盐作为离去基团。图17显示了本发明所提供的产生1-癸烯的示例性PKS。PKS包含以下元件:(i)来自PikAl的装载模块和KSl，随后为(ii)模块I和KS2:来自模块5的AT - ACP区段和来自制霉菌素PKS的KS6结构域，(iii)模块2和KS3:来自模块15的AT-ACP区段和来自制霉菌素PKS的KS16结构域，(iv)模块3和KS4:来自模块3的AT - ACP区段和来自寡霉素PKS的K4结构域，以及(V)模块4:来自CurM的AT - TE区段。该图示出了羟基基团以水分子脱除，然而，应当注意，酶促机制利用硫酸盐作为离去基团。图18显示了本发明所提供的产生1-辛烯的示例性PKS。PKS包含以下元件:(i)来自PikAl的装载模块和KSl，随后为(ii)模块I和KS2:来自模块5的AT - ACP区段和来自制霉菌素PKS的KS6结构域，(iii)模块2和KS3:来自模块15的AT-ACP区段和来自制霉菌素PKS的KS16结构域，以及接着(iv)模块3:来自CurM模块的AT - TE区段。该图示出了羟基基团以水分子脱除，然而，应当注意，酶促机制利用硫酸盐作为离去基团。发明详述本发明并不限于所描述的具体实施方案，由此当然可以发生变化。本文所用的术语仅仅是为了描述具体实施方案的目的，而并非意图限制，因为本发明的范围仅受所附权利要求的限制。如果提供了数值范围，除非上下文明确指出并非如此，在该范围的上限和下限之间的每个中间值至下限单位的十分之一也被具体公开了。所述范围内的任何所述值或中间值之间的每个更小的范围以及该所述范围内的任何其它所述值或中间值都包括在本发明内。除非指明并非如此，本文所用的所有技术和科学术语都具有本发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的含义。尽管与本文所描述的相似或等同的任何方法和材料都可以用于实施本发明，但在此描述了合适的方法和材料。所引用的所有出版物通过引用并入本文，以便公开和描述其中的方法和/或材料和/或结果。如本文和所附权利要求中所用的单数形式“一 (a) ”、“一 (an) ”和“所述(the) ”包括复数形式，除非上下文明确指出并非如此。因此，例如，就“一种α-烯烃”而言，包括多种这样的α-烯烃，依此类推。术语“偶数链α-烯烃”指其碳主链(与任何官能团或取代基无关)具有偶数个碳原子的α-烯烃。术语“奇数链α-烯烃”指其碳主链(与任何官能团或取代基无关)具有奇数个碳原子的α-烯烃。术语“功能变体”描述这样的酶，该酶所具有的多肽序列与本文所述的酶至少70%，75%，80%, 85%，90%, 95%或99% —致。“功能变体”酶可以保留被认为是天然的酶保守的氨基酸残基和/或可以具有非保守的氨基酸残基。相对于天然的酶，氨基酸可以是取代的(不同的)，插入的，或缺失的，但是变体与本文所述的酶相比通常具有相似的酶活性。“功能变体”酶可以是天然存在的或可以是其基因改造的突变体(重组体)。在阅读完以下更全面描述的本发明的详述之后，本发明的目的、优势和特点对本领域技术人员而言将变得更加显而易见。聚酮合酶(PKS)本发明提供了能够合成α-烯烃的重组聚酮合酶(PKS)酶。本发明的PKS酶不是天然存在的PKS。在本发明的一些实施方案中，α-烯烃不是由天然存在的PKS合成的化合物。在本发明的一些实施方案中，PKS是包含来自两种或更多种PKS的模块、结构域和/或其一部分或者其功能变体的杂合PKS。这样的α -烯烃包括二酮和三酮，以及多于三个酮单元的聚酮，诸如4，5或6或更多个酮单元。α -烯烃除了表征它们的双键外，还可以包括一个或多个官能团。这类官能团包括但不限于，乙基、甲基和羟基侧链、内烯烃以及酮。在本发明的一些实施方案中，α -烯烃是具有以下化学结构的偶数链α _烯烃:
权利要求
1.非天然存在的聚酮合酶(PKS)或其功能变体，其能够合成a-烯烃。
2.如权利要求1所述的PKS，其中所述a-烯烃不是由天然存在的PKS所合成的化合物。
3.如权利要求1所述的PKS，其中所述PKS是包含来自两种或更多种PKS的模块，结构域和/或其一部分，或以上的功能变体的杂合PKS。
4.如权利要求3所述的PKS，其中所述PKS包含末端模块，所述末端模块包含巨大鞘丝藻(Lyngbya majuscula) CurM的ST和TE,或以上的功能变体。
5.如权利要求4所述的PKS，其中所述PKS包含末端模块，所述末端模块包含巨大鞘丝藻CurM的KR、ACP、ST和TE，或以上的功能变体。
6.如权利要求5所述的PKS，其中所述PKS包含末端模块，所述末端模块包含巨大鞘丝藻CurM的AT、KR、ACP、ST和TE，或以上的功能变体。
7.如权利要求3所述的PKS，其中所述PKS包含至少一个末端模块，所述末端模块包含表2-4所述的ST和TE，或以上的功能变体。
8.如权利要求3所述的PKS，其中所述PKS包含引入丙烯酰辅酶A的装载模块。
9.如权利要求3所述的PKS，其中所述PKS包含的装载模块是经修饰成接受丙烯酰辅酶A的DEBS丙酰辅酶A特 异性装载结构域。
10.如权利要求9所述的PKS，其中所述PKS包含其中的末端碳作为甲基基团被引入随后被氧化的模块。
11.如权利要求1所述的PKS，其中所述a-烯烃具有以下化学结构:
12.如权利要求11所述的PKS，其中所述α-烯烃是1-己烯、1-癸烯或(E)_l，5_癸二烯。
13.如权利要求1所述的PKS，其中所述α-烯烃是具有以下化学结构的芳香族α-烯烃:
14.如权利要求1所述的PKS，其中所述α-烯烃具有以下化学结构:
15.重组核酸，其编码权利要求1-13所述的聚酮合酶(PKS)。
16.包含重组核酸14的复制子，其中所述复制子能够被稳定地维持在宿主细胞中。
17.如权利要求16所述的复制子，其中所述复制子是质粒或载体。
18.如权利要求17所述的复制子，其中所述载体是表达载体。
19.宿主细胞，其包含权利要求15所述的重组核酸。
20.宿主细胞，其包含权利要求16-18所述的复制子。
21.如权利要求19或20所述的宿主细胞，其中培养所述宿主细胞时能产生所述α-烯烃。
22.如权利要求21所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含产生丁二烯的PKS，并且还包含编码丙酰辅酶A连接酶(合成酶)(EC6.2.1.17)和酰基辅酶A脱氢酶(哺乳动物)(EC1.3.99.3)或以上的功能变体的一种或多种核酸，所述PKS包含含有丙烯酰-ACP起始物的装载模块，其中当培养并任选地提供丙酸盐时，所述PKS能合成丙烯酰辅酶A并产生丁二烯。
23.如权利要求21所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含能产生丁二烯的PKS，并且还包含编码乳酸脱氢酶(EC6.2.1.17)，乳酸辅酶A转移酶(EC2.8.3.1)，丙酰辅酶A连接酶(合成酶)(EC6.2.1.17)和乳酰辅酶A脱水酶(EC4.2.164)或以上的功能变体的一种或多种核酸，所述PKS包含含有丙烯酰-ACP起始物的装载模块，其中当培养并任选地提供丙酸盐和葡萄糖时，所述PKS能合成丙烯酰辅酶A并产生丁二烯。
24.如权利要求21所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含能产生丁二烯的PKS，并且还包含编码乙酰辅酶A羧化酶(EC6.4.1.2)，丙二酰辅酶A还原酶(EC1.2.1.-)，3-羟基丙酸辅酶A连接酶和3-羟基丙酰辅酶A水合酶(EC4.2.1.17)或以上的功能变体的一种或多种核酸，所述PKS包含含有丙烯酰-ACP起始物的装载模块，其中当培养时，所述PKS能合成丙烯酰辅酶A并产生丁二烯。
25.如权利要求21所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含能产生丁二烯的PKS，并且还包含编码丙酰辅酶A连接酶(合成酶)(EC6.2.1.17) ,AccA/PccB基因产物和乳酰辅酶A脱水酶(EC4.2.164)，和乳酸脱氢酶(EC6.2.1.17)，乳酸辅酶A转移酶(EC2.8.3.1)，丙酰辅酶A连接酶(合成酶)(EC6.2.1.17)以及乳酰辅酶A脱水酶(EC4.2.164)或酰基辅酶A脱氢酶或以上的功能变体的一种或多种核酸，所述PKS包含含有丙烯酰-ACP起始物的装载模块，其中当培养并任选地提供丙酸盐时，所述PKS能合成丙烯酰辅酶A并产生丁二烯。
26.产生α-烯烃的方法，其包括产生权利要求21-25中任一项所述的宿主细胞，并在合适的培养基中培养所述宿主细胞使其产生α-烯烃。
27.如权利要求26所述的方法，其还包括将所述分离的α-烯烃分离。
28.如权利要求27所述的方法，其还包括使所述α-烯烃聚合以产生聚合物。
29.如权利要求26-28中任一项所述的方法，其中所述α-烯烃是聚烯烃。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述聚烯烃是丁二烯、异戊二烯或(E)-1，5-癸二烯。
31.组合物，其包含从权利要求21-25中任一项所述的宿主细胞分离的α-烯烃，以及所述宿主细胞的痕量残留物和/或污染物。
32.如权利要求31所述的组合物，其中所述α-烯烃是聚烯烃。
33.如权利要求32所述的组合物，其中所述聚烯烃是丁二烯、异戊二烯或(E)-1，5-癸二烯。
全文摘要
本发明提供了能合成α-烯烃如1-己烯或丁二烯的聚酮合酶(PKS)。本发明还提供了包含PKS且在培养时能够产生α-烯烃的宿主细胞。
文档编号C12P5/02GK103249837SQ201180054807
公开日2013年8月14日 申请日期2011年9月28日 优先权日2010年9月28日
发明者杰弗里·L·福特曼, 伦纳德·卡兹, 艾里克·J·斯蒂恩, 杰伊·D·基斯灵 申请人:加利福尼亚大学董事会
技术领域：
本发明涉及利用聚酮合酶产生α -烯烃，因而涉及化学、微生物学和分子生物学领域。
背景技术：
I型聚酮合酶(PKS)是能够具有脂肪酸合酶(FAS)的所有催化能力的可编程的多功能酶。然而，与FAS酶反复延伸并完全还原每次延伸烃主链所产生的β-羰基不同，PKS系统每次延伸和还原新生链时利用分散排列的酶促结构域。这些通常被称为模块的排列能够引入导致不同侧链的多种延伸单元。它们还能够编码O至3个与FAS相关的还原结构域，其在生长的聚酮链的β位分别导致酮基、羟基、双键或完全饱和的碳(Hopwood andSherman.1990.Annual Review of Genetics24:37-66)。由于其模块性，PKS系统已被广泛开发用于产生“非天然的”天然产物(Weissmanand Leadlay.2005.Nature Reviews Microbiology3:925-936)。已经产生数百种这样的分子，范围从碱性内酯到修饰形式的药物和药物样化合物。发明概述本发明提供了能够合成α-烯烃的聚酮合酶(PKS)，用于产生所述聚酮合酶的重组表达载体，表达所述聚酮合酶并产生期望的α-烯烃的重组宿主细胞，制备α-烯烃的方法以及通过所述方法产生的α-烯烃。本发明的PKS不是天然存在的，因而被称为“重组的’TKS酶。在本发明的一些实施方案中，α-烯烃不是由天然存在的PKS合成的化合物。在本发明的一些实施方案中，PKS是包含来自两种、三种、四种或更多种天然存在的PKS的模块和/或其一部分的杂合PKS。杂合PKS可以含有来自两种或更多种天然存在的PKS的天然存在的模块和/或其可以含有一个或多个模块，所述模块由来自同一种天然存在的PKS或来自两种或更多种天然存在的PKS或以上两种情况的两个或更多个模块的一部分(包括完整的结构域)组成。在本发明的一些实施方案中，利用包含天然存在的或重组的CurM模块或其一部分的重组核酸。本发明提供了编码本发明PKS的重组核酸。重组核酸包括以下核酸:包含本发明的一部分或全部PKS的核酸，还包含调控序列如启动子和翻译起始和终止序列的核酸，以及还可包含促进在宿主细胞中稳定维持的序列(即，提供复制起始功能的序列或促进通过同源重组整合入宿主细胞染 色体DNA或其它DNA中的序列)的核酸。在一些实施方案中，重组核酸被稳定地整合入宿主细胞的染色体。在一些实施方案中，重组核酸是质粒。因此，本发明还提供了包含本发明重组核酸的载体，包括表达载体。本发明还提供了包含本发明的重组核酸和/或PKS中的任一种的宿主细胞。在一些实施方案中，当在合适的条件下培养时，宿主细胞能够产生α-烯烃。这些宿主细胞包括，例如但不限于原核生物以及真核生物，所述原核生物如肠杆菌(Ε.coli)、芽孢杆菌(Bacillus)属、链霉菌(Streptomyces)属、粘细菌(Myxobacterial)属,所述真核生物包括但不限于酵母和真菌菌株。因此，本发明提供了包含本发明的一种或多种重组核酸和/或PKS的多种宿主细胞。在一些实施方案中，当培养时，宿主细胞能够产生α-烯烃，在不存在本发明核酸的条件下，α-烯烃不会产生或以较低的水平产生。本发明提供了产生α -烯烃的方法，所述方法大体包括:提供本发明的宿主细胞，在合适的条件下，在合适的培养基中培养所述宿主细胞，使其产生α -烯烃。本发明还提供了组合物，所述组合物包含来自宿主细胞(其产生α-烯烃)的α -烯烃，并且在一些实施方案中，可以包含宿主细胞的痕量残留物和/或其它成分。这类痕量残留物和/或其它成分可以包括，例如，由宿主细胞裂解所产生的细胞物质。本发明还提供了纯化α-烯烃的方 法以及将所述α-烯烃转化成其它有用的产物的方法。
本领域技术人员由以下详细描述的示例性实施方案结合附图阅读时，将易于理解本发明的以上方面和实施方案以及其它方面。图1显示了根据本发明适于合成1-己烯的生物合成途径的模块构建的示例性实例。在该图中，推荐的模块来源于来自红霉素PKS的DEBSl的装载模块，来自制霉菌素PKSNysC的模块5和curacin PKS的CurM末端模块。在本发明的另一实施方案中，制霉菌素PKS模块5用来自茚满霉素(indanomyCin)PKS的模块9和10的一部分替代。这种可选择的实施方案实际上已用于产生1-己烯。图2显示了所用的模块类型和用于引入聚酮链的对应前体。装载模块被命名为S。尽管可以使用任何合适的装载结构域(诸如装载醋酸盐和苯甲酸的那些结构域)，但在该图中仅示出了两个实例。其余化合物代表利用延伸模块A - P引入生长的聚酮链中的结构。虚线指示通过克莱森(Claisen)缩合反应形成的C-C键；键右侧的原子和虚线左侧的C原子代表由所用模块决定的结构。R基代表在由模块决定引入之前已存在的酰基链。图3显示:㈧根据本发明可用于产生1-己烯的PKS系统，⑶可如何添加其它模块以产生更长的偶数链α-烯烃，以及(C)根据本发明的方法，如何改变引入醋酸盐(来自丙二酰辅酶Α)的装载模块来允许达到饱和的线性奇数链α-烯烃。图4显示了图解利用除虫菌素PKS装载模块的本发明的一实施方案。所示的侧链仅仅是实例，而并非构成可利用除虫菌素装载模块(或相似的装载模块)根据本发明的方法和教导引入的整个侧链库。图5在(A)部分中显示了 3-亚甲基-4-戊烯酸的示例性途径的实例，根据本发明的方法利用PKS获取羧化丁二烯衍生物的实例，以及二烯烃和羧酸部分之间的距离可如何通过使用其它PKS模块来增加。图5在(B)部分中显示了从jamaicamide途径生物合成环外亚甲基所提出的机制(参见Edwards et al.2004.Chem Biol.11 (6):817-33;通过引用并入本文)。
图6显示了根据本发明的方法产生丁二烯的PKS。尽管本发明不以任何方式受本文列举的或显示的任何所提出的作用机制的限制，但是该图为了简单的目的示例了羟基以水分子脱除，酶促机制利用硫酸盐作为离去基团。图7显示了根据本发明的方法产生丁二烯的PKS。(A)和⑶部分显示了利用修饰成接受丙烯酰辅酶A的DEBS丙酰辅酶A特异性装载结构域装载丙烯酰辅酶A。(C)部分显示了丙烯酸盐部分的硫转移至KS结构域。(D)部分显示了丙二酰辅酶A的结合并转移至ACP结构域。(E)部分显示了 KS催化部分的缩合并释放C02。(F)部分显示了 KR催化β_羰基基团的还原。(G)部分显示了终步骤以及丁二烯、CO2和水的释放(如图6，用水分子示例羟基基团的脱除，但是酶促机制利用硫酸盐作为离去基团)。图8显示了通过本发明的方法和材料产生丙烯酰辅酶A可获得的酶促途径，包括外源供给丙酸盐，并表达PrpE和酰基辅酶A脱氢酶活性。为包含该系统的宿主细胞提供丙酸盐，如果丙酸盐不是由所选择用于生产的宿主细胞内源产生的，则可以外源供给。图9显示了通过本发明的方法和材料产生丙烯酰辅酶A可获得的酶促途径，包括外源供给丙酸盐和葡萄糖。为包含该系统的宿主细胞提供丙酸盐和宿主细胞可以直接或间接转化成丙酮酸盐的合适的有机分子，所述丙酸盐通过外源供给或上文所述的丙酸盐生物合成途径引入。例如，如果宿主细胞是大肠杆菌，合适的有机分子可以是葡萄糖。该途径利用中心代谢的中间体丙酮酸盐通过乳酸脱氢酶产生乳酸盐。然后通过乳酸辅酶A转移酶利用丙酰辅酶A作为辅因子将乳酸盐转化成乳酰辅酶Α，并释放丙酸盐。然后利用乳酰辅酶A脱水酶使乳酰辅酶A脱水，以产生丙烯酰辅酶Α。本发明的一实施方案包括来自大肠杆菌的乳酸脱氢酶LdhA，来自丙酸梭菌的乳酸辅酶A转移酶Pct，以及来自丙酸梭菌的乳酰辅酶A脱水酶酶EI和EII。将该途径引入大肠杆菌或酵母中用于二烯烃(如丁二烯)生产代表了这些酶的新应用。本发明的一实施方案是将该途径用于基于PKS的丙烯酸盐生产的用途。图10显示了通过本发明的方法和材料从共有的代谢前体丙二酰辅酶A开始产生丙烯酰辅酶A可获得的酶促途径。该途径利用乙酰辅酶A羧化酶，乙酰辅酶A和CO2产生丙二酰辅酶A。然后，通过丙二酰辅酶A还原酶还原丙二酰辅酶A，并释放丙二酰半醛。利用底物特异的氧化还原酶将丙二酰半醛转化成3-羟基丙酸盐。3-羟基丙酸辅酶A连接酶催化3-羟基丙酰辅酶A的形成。然后， 该中间体通过3-羟基丙酰辅酶A水合酶的可逆反应脱水形成丙烯酰辅酶A。在本发明的一实施方案中，这些酶是来自大肠杆菌的乙酰辅酶A羧化酶复合物(AccA/AccD)，丙二酰辅酶A还原酶。将该途径引入大肠杆菌或酵母中用于二烯烃(如丁二烯)生产代表了这些酶的新应用，并且是本发明特有的实施方案。本发明的一实施方案是将该途径用于基于PKS的丙烯酸盐生产的用途。图11显示了通过本发明的方法和材料经由甲羟戊酸盐途径产生异戊二烯可获得的酶促途径。图12显示了本发明提供的用于产生异戊二烯的PKS可获得的示例性途径的实例。(A)显示了利用修饰成接受丙烯酰辅酶A的DEBS丙酰辅酶A特异性装载结构域装载丙烯酰辅酶A，并用丙二酰辅酶A延伸以形成β-酮酯酰ACP结合的中间体。(B)-(D)部分显示了利用来自枯草杆菌(Bacillus subtilis)PKSX(Bacillaene)集簇的PKS酶,用甲基取代β _擬基基团所涉及的HMG-辅酶A样机制(Butcher, et al.2007.Proc Natl Acad SciUS A.104(5):1506-9;通过引用并入本文)。本发明并不受本文所示的任何所提出机制的限制。在该实施方案中，倒数第二个产物作为游离酸释放，并随后根据本发明的方法通过脱羧酶或细胞外化学催化/热解而脱羧基形成异戊二烯。图13显示了本发明提供的用于产生伍)-1，3_戊二烯的？1 。该图示出了羟基基团以水分子脱除，但是酶促机制利用硫酸盐作为离去基团。图14显示了用于产生之前的附图中所描述的丙烯酰辅酶A和[2S]-甲基丙二酰辅酶A的大肠杆菌中的前体供应途径。所描述的每种酶均可以在宿主细胞中表达，其中每种酶可以独立地为宿主细胞内源的或天然的，或者被引入重组体。图15显示了本发明所提供的用于最大化大肠杆菌中前体供应途径的方法和材料。最大化丙烯酰辅酶A的途径可以包括“敲除”(消除或降低其表达)PrpC活性，敲除YgfH活性，外源供给丙酸盐(或内源产生丙酸盐)，过表达PrpE活性以增加丙酰辅酶A胞质库中的一种或多种。从该中间体，丙酰辅酶A羧化酶复合物(AccA/PccB)的引入将产生甲基丙二酰辅酶 A (Pfeifer，et al.Science.2001Mar2; 291 (5509):1790-2;通过引用并入本文)。该丙酰辅酶A库还可以用在图8和9所述的途径中。
图16显示了本发明所提供的产生3-羟基-1-辛烯的示例性PKS。PKS包含以下元件:(i)来自PikAl (苦霉素)的装载模块和KSl，随后为(ii)模块I和KS2:来自模块5的AT-ACP区段和来自制霉菌素PKS的KS6结构域，(iii)模块2:来自蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)ZmaA(双效菌素PKS)的羟基丙二酸盐特异性AT和邻近的ACP结构域，来自南昌霉素PKS模块2的DH, ER KR结构域，以及(iv)模块3 =CurM模块(curacinPKS)的AT-TE区段。为了产生前体羟基丙二酰-ACP，酶ZmaD，ZmaG和ZmaE也由宿主菌株产生或提供。该图示出了羟基基团以水分子脱除，然而，应当注意，酶促机制利用硫酸盐作为离去基团。图17显示了本发明所提供的产生1-癸烯的示例性PKS。PKS包含以下元件:(i)来自PikAl的装载模块和KSl，随后为(ii)模块I和KS2:来自模块5的AT - ACP区段和来自制霉菌素PKS的KS6结构域，(iii)模块2和KS3:来自模块15的AT-ACP区段和来自制霉菌素PKS的KS16结构域，(iv)模块3和KS4:来自模块3的AT - ACP区段和来自寡霉素PKS的K4结构域，以及(V)模块4:来自CurM的AT - TE区段。该图示出了羟基基团以水分子脱除，然而，应当注意，酶促机制利用硫酸盐作为离去基团。图18显示了本发明所提供的产生1-辛烯的示例性PKS。PKS包含以下元件:(i)来自PikAl的装载模块和KSl，随后为(ii)模块I和KS2:来自模块5的AT - ACP区段和来自制霉菌素PKS的KS6结构域，(iii)模块2和KS3:来自模块15的AT-ACP区段和来自制霉菌素PKS的KS16结构域，以及接着(iv)模块3:来自CurM模块的AT - TE区段。该图示出了羟基基团以水分子脱除，然而，应当注意，酶促机制利用硫酸盐作为离去基团。发明详述本发明并不限于所描述的具体实施方案，由此当然可以发生变化。本文所用的术语仅仅是为了描述具体实施方案的目的，而并非意图限制，因为本发明的范围仅受所附权利要求的限制。如果提供了数值范围，除非上下文明确指出并非如此，在该范围的上限和下限之间的每个中间值至下限单位的十分之一也被具体公开了。所述范围内的任何所述值或中间值之间的每个更小的范围以及该所述范围内的任何其它所述值或中间值都包括在本发明内。除非指明并非如此，本文所用的所有技术和科学术语都具有本发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的含义。尽管与本文所描述的相似或等同的任何方法和材料都可以用于实施本发明，但在此描述了合适的方法和材料。所引用的所有出版物通过引用并入本文，以便公开和描述其中的方法和/或材料和/或结果。如本文和所附权利要求中所用的单数形式“一 (a) ”、“一 (an) ”和“所述(the) ”包括复数形式，除非上下文明确指出并非如此。因此，例如，就“一种α-烯烃”而言，包括多种这样的α-烯烃，依此类推。术语“偶数链α-烯烃”指其碳主链(与任何官能团或取代基无关)具有偶数个碳原子的α-烯烃。术语“奇数链α-烯烃”指其碳主链(与任何官能团或取代基无关)具有奇数个碳原子的α-烯烃。术语“功能变体”描述这样的酶，该酶所具有的多肽序列与本文所述的酶至少70%，75%，80%, 85%，90%, 95%或99% —致。“功能变体”酶可以保留被认为是天然的酶保守的氨基酸残基和/或可以具有非保守的氨基酸残基。相对于天然的酶，氨基酸可以是取代的(不同的)，插入的，或缺失的，但是变体与本文所述的酶相比通常具有相似的酶活性。“功能变体”酶可以是天然存在的或可以是其基因改造的突变体(重组体)。在阅读完以下更全面描述的本发明的详述之后，本发明的目的、优势和特点对本领域技术人员而言将变得更加显而易见。聚酮合酶(PKS)本发明提供了能够合成α-烯烃的重组聚酮合酶(PKS)酶。本发明的PKS酶不是天然存在的PKS。在本发明的一些实施方案中，α-烯烃不是由天然存在的PKS合成的化合物。在本发明的一些实施方案中，PKS是包含来自两种或更多种PKS的模块、结构域和/或其一部分或者其功能变体的杂合PKS。这样的α -烯烃包括二酮和三酮，以及多于三个酮单元的聚酮，诸如4，5或6或更多个酮单元。α -烯烃除了表征它们的双键外，还可以包括一个或多个官能团。这类官能团包括但不限于，乙基、甲基和羟基侧链、内烯烃以及酮。在本发明的一些实施方案中，α -烯烃是具有以下化学结构的偶数链α _烯烃:
权利要求
1.非天然存在的聚酮合酶(PKS)或其功能变体，其能够合成a-烯烃。
2.如权利要求1所述的PKS，其中所述a-烯烃不是由天然存在的PKS所合成的化合物。
3.如权利要求1所述的PKS，其中所述PKS是包含来自两种或更多种PKS的模块，结构域和/或其一部分，或以上的功能变体的杂合PKS。
4.如权利要求3所述的PKS，其中所述PKS包含末端模块，所述末端模块包含巨大鞘丝藻(Lyngbya majuscula) CurM的ST和TE,或以上的功能变体。
5.如权利要求4所述的PKS，其中所述PKS包含末端模块，所述末端模块包含巨大鞘丝藻CurM的KR、ACP、ST和TE，或以上的功能变体。
6.如权利要求5所述的PKS，其中所述PKS包含末端模块，所述末端模块包含巨大鞘丝藻CurM的AT、KR、ACP、ST和TE，或以上的功能变体。
7.如权利要求3所述的PKS，其中所述PKS包含至少一个末端模块，所述末端模块包含表2-4所述的ST和TE，或以上的功能变体。
8.如权利要求3所述的PKS，其中所述PKS包含引入丙烯酰辅酶A的装载模块。
9.如权利要求3所述的PKS，其中所述PKS包含的装载模块是经修饰成接受丙烯酰辅酶A的DEBS丙酰辅酶A特 异性装载结构域。
10.如权利要求9所述的PKS，其中所述PKS包含其中的末端碳作为甲基基团被引入随后被氧化的模块。
11.如权利要求1所述的PKS，其中所述a-烯烃具有以下化学结构:
12.如权利要求11所述的PKS，其中所述α-烯烃是1-己烯、1-癸烯或(E)_l，5_癸二烯。
13.如权利要求1所述的PKS，其中所述α-烯烃是具有以下化学结构的芳香族α-烯烃:
14.如权利要求1所述的PKS，其中所述α-烯烃具有以下化学结构:
15.重组核酸，其编码权利要求1-13所述的聚酮合酶(PKS)。
16.包含重组核酸14的复制子，其中所述复制子能够被稳定地维持在宿主细胞中。
17.如权利要求16所述的复制子，其中所述复制子是质粒或载体。
18.如权利要求17所述的复制子，其中所述载体是表达载体。
19.宿主细胞，其包含权利要求15所述的重组核酸。
20.宿主细胞，其包含权利要求16-18所述的复制子。
21.如权利要求19或20所述的宿主细胞，其中培养所述宿主细胞时能产生所述α-烯烃。
22.如权利要求21所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含产生丁二烯的PKS，并且还包含编码丙酰辅酶A连接酶(合成酶)(EC6.2.1.17)和酰基辅酶A脱氢酶(哺乳动物)(EC1.3.99.3)或以上的功能变体的一种或多种核酸，所述PKS包含含有丙烯酰-ACP起始物的装载模块，其中当培养并任选地提供丙酸盐时，所述PKS能合成丙烯酰辅酶A并产生丁二烯。
23.如权利要求21所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含能产生丁二烯的PKS，并且还包含编码乳酸脱氢酶(EC6.2.1.17)，乳酸辅酶A转移酶(EC2.8.3.1)，丙酰辅酶A连接酶(合成酶)(EC6.2.1.17)和乳酰辅酶A脱水酶(EC4.2.164)或以上的功能变体的一种或多种核酸，所述PKS包含含有丙烯酰-ACP起始物的装载模块，其中当培养并任选地提供丙酸盐和葡萄糖时，所述PKS能合成丙烯酰辅酶A并产生丁二烯。
24.如权利要求21所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含能产生丁二烯的PKS，并且还包含编码乙酰辅酶A羧化酶(EC6.4.1.2)，丙二酰辅酶A还原酶(EC1.2.1.-)，3-羟基丙酸辅酶A连接酶和3-羟基丙酰辅酶A水合酶(EC4.2.1.17)或以上的功能变体的一种或多种核酸，所述PKS包含含有丙烯酰-ACP起始物的装载模块，其中当培养时，所述PKS能合成丙烯酰辅酶A并产生丁二烯。
25.如权利要求21所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含能产生丁二烯的PKS，并且还包含编码丙酰辅酶A连接酶(合成酶)(EC6.2.1.17) ,AccA/PccB基因产物和乳酰辅酶A脱水酶(EC4.2.164)，和乳酸脱氢酶(EC6.2.1.17)，乳酸辅酶A转移酶(EC2.8.3.1)，丙酰辅酶A连接酶(合成酶)(EC6.2.1.17)以及乳酰辅酶A脱水酶(EC4.2.164)或酰基辅酶A脱氢酶或以上的功能变体的一种或多种核酸，所述PKS包含含有丙烯酰-ACP起始物的装载模块，其中当培养并任选地提供丙酸盐时，所述PKS能合成丙烯酰辅酶A并产生丁二烯。
26.产生α-烯烃的方法，其包括产生权利要求21-25中任一项所述的宿主细胞，并在合适的培养基中培养所述宿主细胞使其产生α-烯烃。
27.如权利要求26所述的方法，其还包括将所述分离的α-烯烃分离。
28.如权利要求27所述的方法，其还包括使所述α-烯烃聚合以产生聚合物。
29.如权利要求26-28中任一项所述的方法，其中所述α-烯烃是聚烯烃。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述聚烯烃是丁二烯、异戊二烯或(E)-1，5-癸二烯。
31.组合物，其包含从权利要求21-25中任一项所述的宿主细胞分离的α-烯烃，以及所述宿主细胞的痕量残留物和/或污染物。
32.如权利要求31所述的组合物，其中所述α-烯烃是聚烯烃。
33.如权利要求32所述的组合物，其中所述聚烯烃是丁二烯、异戊二烯或(E)-1，5-癸二烯。
全文摘要
本发明提供了能合成α-烯烃如1-己烯或丁二烯的聚酮合酶(PKS)。本发明还提供了包含PKS且在培养时能够产生α-烯烃的宿主细胞。
文档编号C12P5/02GK103249837SQ201180054807
公开日2013年8月14日 申请日期2011年9月28日 优先权日2010年9月28日
发明者杰弗里·L·福特曼, 伦纳德·卡兹, 艾里克·J·斯蒂恩, 杰伊·D·基斯灵 申请人:加利福尼亚大学董事会
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