进料混合装置及其用途的制作方法
专利名称：进料混合装置及其用途的制作方法
进料混合装置及其用途
在本文中报道了一种进料混合装置，其允许将具有非生理性PH值的两种或两种以上进料溶液同时进料给培养基，借此在加入培养基之前，在进料混合装置内将总进料溶液的PH值调整至例如，生理性pH值。
发明背景
为了在哺乳动物细胞的培养中增加产物产量或者培养时间，将进料溶液加入到培养基，以使必需的培养基组分的浓度维持在临界水平或者临界水平之上。
具有与培养基不同物理性质的水溶液的进料将影响培养基的物理参数，如渗透性或PH值。由于不同组分差的溶解度或者所需的稳定性，所以有时不得不将进料溶液的pH值改变成非生理性值。
Luan, Y.T.，等人报·道了在培养中延长杂交瘤的寿命，并提高单克隆抗体的产量的策略(Biotechnol.Lett.9 (1987) 691-696)。Dempsey, J.，等人报道了用于表达人抗体和谷氨酰胺合成酶的NSO细胞系的改进的发酵工艺(Biotechnol.Prog.19 (2003)175-178)。Bibila, T.A.,等人报道了使用培养基浓缩物进行的单克隆抗体方法的研发(Biotechnol.Prog.10 (1994) 87-96)。
在W02008/013809中报道了细胞培养方法。在US2006/0003448中报道了干粉细胞和细胞培养试剂以及其产生的方法。在US5，081，036中报道了用于细胞培养的方法和设备。在US5，681，748中报道了培养基浓缩技术。在US6，924，124中报道了用于细胞培养的进料策略。
在W02009/132616中报道了供应系统。在W02010/045168中报道了使用商业规模的生物反应器生产乙醇和糖的方法和设备。在US2003/0092652中报道了用于核酸分子的保护性单瓶制剂(protected one-vial formulation)、通过线内混合制备用于核酸分子的保护性单瓶制剂的方法，以及相关的产品和方法。
发明概述
使用如在本文中所报道的进料混合装置，可以例如在具有使组分具有好溶解度和/或好稳定性的PH值的溶液中提供进料组分，从而pH值可以不同于培养基的pH值，即溶液具有小于PH6.5或者大于pH7.5的彼此相互独立的pH值。与在例如进料溶液的pH值被限制在培养基的PH值附近很小范围的培养相比较，这允许更灵活地进行培养。
如在本文中所报道的一方面是用于将各自具有非生理性pH值的至少两种溶液加入细胞培养容器的装置，所述装置包含在将溶液加入到细胞培养容器之前，用于混合溶液的小室。
在一个实施方案中，用于混合溶液的小室的体积与培养容器中培养基的体积的比例为0.8ml/l至L2ml/1。在一个实施方案中，该比例为0.9ml/l至1.lml/1。在一个实施方案中，该比例为约lml/1。在一个实施方案中，该比例为0.95ml/l。在一个实施方案中，培养基的体积是在起始培养时，培养容器中液体的体积。
在一个实施方案中，各自具有非生理性pH值的至少两种溶液，至少一种是酸性溶液并且至少一种是碱性溶液。在一个实施方案中，各自具有非生理性pH值的至少两种溶液具有相互独立的小于pH6.5或者大于pH7.5的pH值。在一个实施方案中，各自具有非生理性pH的至少两种溶液具有相互独立的pHO至pH6.49或者pH7.51至pH14的pH值。在一个实施方案中，酸性和碱性溶液的pH值与培养基的pH值相差至少0.5个pH单位。在一个实施方案中，酸性溶液具有PH6.5或更低的pH值。在一个实施方案中，酸性溶液具有PH4.0或更低的pH值。在一个实施方案中，碱性溶液具有pH8.0或更高的pH值。在一个实施方案中，碱性溶液具有10.0或更高的pH值。在一个实施方案中，将该装置用于加入具有非生理性pH值的两种至四种单独的溶液，其中任选地至少一种是酸性溶液，并且至少一种是碱性溶液。在一个实施方案中，每种溶液都是包含选自氨基酸、糖、维生素、微量元素、乳酸和生长因子的至少一种化合物的进料溶液。在一个实施方案中，用于混合溶液的小室与培养容器是分离的，并且所述小室包含进入到培养容器的内部的出口。在一个实施方案中，小室在培养容器的外部或者在培养容器的内部。在一个实施方案中，小室具有0.1ml至50，OOOml的体积。在一个实施方案中，小室具有0.25ml至30，OOOml 的体积。在一个实施方案中，小室具有0.5ml至1，OOOml的体积。在一个实施方案中，小室具有约1.15ml、或者约8ml、或者约80ml、或者约200ml、或者约400ml、或者约800ml、或者约1.61、或者约41、或者约81、或者约161、或者约401的体积。在一个实施方案中，在加入到培养容器之前立即混合。在一个实施方案中，用于混合溶液的小室包含用于每种溶液的各个连接器的入□。在一个实施方案中，该装置是可灭菌的。如在本文中所报道的另一方面是如在本文中所报道的装置在细胞的补料分批或者连续培养中的用途。如在本文中所报道的又一方面是包含如在本文中所报道的装置的培养容器。如在本文中所报道的一个方面是用于产生多肽的方法，其包括以下步骤:-在包含如在本文中所报道的装置的培养容器中以补料分批或连续培养的方式培养包含编码多肽的核酸的细胞，由此在培养期间加入至少一种酸性进料溶液和至少一种碱性进料溶液，和-从培养基或细胞中回收多肽，从而产生多肽。在一个实施方案中，当加入到培养容器中时，混合的进料溶液具有pH4.5至pH9.5的pH值。在一个实施方案中，当加入到培养容器中时，混合的进料溶液具有pH6.5至pH7.5的pH值。在一个实施方案中，培养容器具有约21、或者101、或者201、或者1001、或者2501、或者 5001、或者 I, 0001、或者 2，0001、或者 5，0001、或者 10，0001、或者 20，0001、或者50，0001的体积。在一个实施方案中，培养基的体积为约1.21、或者约81、或者约161、或者约801、或者约2001、或者约4001、或者约8001、或者约1，6001、或者约4，0001、或者约8，0001、或者约 16，0001、或者约 40，0001。
在一个实施方案中，如在本文中所报道的装置在室温运行。
如在本文中所报道的又一方面是用于获得具有减少的G(O)糖形和/或增加的Gd)糖形的多肽的方法，其包括以下步骤:
-在包含如在本文中所报道的装置的培养容器中以补料分批或连续培养的方式培养包含编码多肽的核酸的细胞，由此在培养期间加入至少一种酸性进料溶液和至少一种碱性进料溶液，和
-从培养基或细胞中回收多肽，从而获得具有减少的G(O)糖形和/或增加的G(I)糖形的多肽。
其中当加入到培养容器中时，混合的进料溶液具有pH4.0至pH6.0的pH值。
在一个实施方案中，多肽是抗体或者Fe-融合的多肽。
发明详述
广泛地用于生产治疗性多肽或生物质的方式是补料分批发酵。在补料分批发酵中，哺乳动物细胞培养物的细胞密度通常超过100*105个细胞/ml，由于某些物质或者物质种类的低溶解度和/或受损的稳定性，导致了在提供足够量的所需培养物质中的挑战。
因此，通常的方法是使用具有非生理性pH值的进料溶液，来溶解或者稳定所需量的这些物质。例如，由于酪氨酸的低溶解度，所以通过液体进料溶液很难在PH7左右的pH值足够地供应氨基酸酪氨酸。然而，·在该情况下，高的非生理性pH值增加了溶解度，这使得进料策略匹配了在补料分批方法中总体的酪氨酸消耗与非生理性PH值的进料溶液。特别地，连续进料策略需要稳定的进料溶液。因此，进料组分的贮藏期限必须至少超过进料时间。
此外，具有非生理性pH值，即碱性或酸性pH值的进料溶液的加入触发了培养装置的pH控制机制的响应。这导致了酸或碱增加的和不期望的加入，以补偿由具有非生理性pH值的进料溶液的加入诱导的PH改变。
为了避免具有非生理性pH的进料溶液，例如具有高或低pH值的那些进料溶液的使用产生的影响，可以使用如在本文中所报道的进料混合装置，其能恰好在加入到培养容器中之前连续混合至少两种进料溶液。通过使用如在本文中所报道的进料混合装置，可以在进料组分具有好的溶解度和/或好的稳定性的pH值溶解进料组分，由此可以使该pH值明显不同于培养基的PH值，即不同于生理性pH值。因为现在可以在加入到培养基和细胞悬浮液之前直接调整PH值，这允许进料溶液具有更灵活的pH值。
如在本文中所报道的装置是用于细胞培养(例如补料分批培养或者连续培养)的进料混合装置，在所述细胞培养期间必须加入化合物。使用如在本文中所报道的进料混合装置，培养可以在至少一个额外的自由度下进行，因此更具灵活性。使用如在本文中所报道的进料混合装置，有可能使用非生理性PH值和/或高化合物浓度的进料溶液。例如为稳定pH敏感的进料组分，需要非生理性pH值。在加入到培养容器，并因此加入到培养基中之前，可以调整任何PH值。这允许以非连续或者连续的进料方法加入确定量的化合物。例如，通过加入确定量的离子，可以调整预定的渗透性。
有可能通过使用如在本文中所报道的装置获得的进料溶液的pH值的变化性，可以使用具有任意PH值(即碱性、中性或酸性溶液)和具有任意浓度的各个组分的进料溶液。与不使用如在本文中所报道的装置的常规进料策略相比较，也有可能在加入的进料中运用pH梯度，借此也可以加入基本上相同量的物质。因此，甚至可以使用具有这样的组分的进料溶液，所述组分由于其低溶解度或受损的稳定性，必须以极端的碱性或酸性，即非生理性PH值提供。离开进料混合装置并被加入到培养基中的混合进料溶液的pH值取决于各个进料的体积混合比和在混合室内的停留时间，因此所述PH值取决于各个进料溶液的体积流量。在一个实施方案中，经进料混合装置流入到培养容器的总体积为I至1.5g/h/l。在一个实施方案中，体积流量为1.15g/h/l至1.35g/h/l。在一个实施方案中，体积流量为约1.25g/h/l。单位g/h/1表不进料的质量/培养时间/培养体积。在一个实施方案中，培养体积为在起始培养时培养容器中流体的体积。通过将如在本文中所报道的装置用于混合进料溶液，培养的细胞的生活力可以在预定水平以上维持更长的时期，因此允许更长的总培养时间。同时，可以降低乳酸浓度和葡萄糖消耗。
图1中显示了细胞培养的pH值的一般进程。接种后(图1，“1”)，培养的pH值降低并接近预定PH范围的下缘(图1，“2”)。这归因于培养基中乳酸的的形成和二氧化碳的积累。通过加入碱，使用的PH控制机制确保pH值维持在预定pH范围的下缘。继续加入碱，直到细胞代谢改变，并且重新代谢培养基中的乳酸和/或去除积累的二氧化碳(图1，“3”)。然后，PH值增加，直到达到预 定pH范围的上缘(图1，“4”)。通过加入酸，pH控制机制维持pH值在该上缘值。在例如不使用pH控制机制的情况下，碱进料溶液可以使培养基的pH值维持在预定PH范围的下缘之上。因此，通过使用如在本文中所报道的进料混合装置来改变加入到培养基中的两种或多种进料溶液的各个体积流速比，可以抵消培养容器中PH值的改变。因此，使用如在本文中所报道的装置，可以分别废弃或者可以减少PH控制机制或者至少使用其的时间(以及同样地，酸和碱的加入量)。通过使用具有各个加料速度的碱性进料溶液和酸性进料溶液，以及如在本文中所报道的进料混合装置，可以将组合的进料溶液的PH值调整至任意靶值。通过在培养过程中改变各个加料速度和/或进料溶液，可以在培养期间改变组合的进料溶液的PH值。因此，有可能依据培养的细胞的代谢，来改变和/或控制PH值。可以将组合进料溶液的可变pH值用于支持或替换用于调整培养PH值的其他方法。通过使用如在本文中所报道的进料混合装置，可以连续组合两种或多种进料溶液。进料溶液可以包含任一化合物。例如，可以在(高)非生理性PH值稳定的化合物如维生素。使用如在本文中所述的进料混合装置，在加入到培养基中之前，将PH值调整至生理性范围的PH值。因此，减少了进料化合物维持在稳定性受损的pH值的时间。通过使用一种或多种碱性溶液和一种或多种酸性溶液，有可能进行可变的pH值调整。使用如在本文中所报道的装置，通过调整进料溶液的速度和各个流速，可以在线控制培养基的pH值(图1，“5”)。通过使用具有不同性质的进料溶液，有可能进行例如离子浓度、pH值、渗透性、化合物比例、粘度、表面张力、电导率、可湿性、电阻率和/或密度的时间依赖性调整。通过使用在线传感器，有可能使用如在本文中所报道的装置组合具有不同物理和/或化学性质的不同进料溶液。因此，可以根据预定计划改变不同的参数。
通过使用如在本文中所报道的装置，有可能将固体、分散体和几乎不可混溶的化合物/溶液用作进料溶液。进料溶液的化学和/或物理性质可以是不同的。
通过使用如在本文中所报道的进料混合装置，在培养期间可以施行所加入的混合进料溶液的PH梯度。
相互独立的各个进料可以是分散体、乳剂或溶液。可以通过使用常规泵或者任意其他已知的机械或流动机械方法，将溶液运输至进料混合装置。如果进料不是真正的溶液，那么例如可以通过使用机械运输方法加入所述进料。
进料混合装置的规模是可变的，因此，可以与任意类型和大小的培养装置，例如与培养容器(搅拌罐)、研碎式反应器(chip reactor)或流管式反应器一起使用该装置。
当使用如在本文中所报道的装置时，尽管在加入到培养基中之前显著改变了进料溶液的PH值，但在混合各个进料溶液时，在混合室中几乎没有沉淀形成。
与使用单一的碱进料并且不使用如在本文中所报道的装置的培养相比，通过使用如在本文中所报道的装置，并因此将分离的进料调整至组合的(酸性)进料可以减少产生的多肽，特别是产生的免疫球蛋白的G(O)糖形。同样地，与使用单一的碱性进料并且不使用如在本文中所报道的装置的培养相比，通过使用如在本文中所报道的装置并将分离的进料调整至混合的酸性进料可以增加G(I)糖形。
通过调整细胞培养条件，可以改变在下游加工前培养基中宿主细胞蛋白质的含量。这通过使用特定的进料溶液应当是·可能的。因此，使用包含具有确定的质子浓度，即确定PH值的pH经调整的进料溶液的经调整的进料策略，可以加入相同的或者至少相似量的进料组分，并且同时可以降低为了校正培养基的PH值所需要的碱或酸的量，并且同时还可以降低培养上清液中宿主细胞蛋白质含量。
因此，在一个实施方案中，可以将如在本文中所报道的进料混合装置用于降低细胞培养上清液中宿主细胞蛋白质含量。
提供了以下实施例和附图，以帮助理解本发明，在所附权利要求中给出了本发明的真正的范围。理解的是，在不背离本发明精神的情况下，可以对给出的方法进行修改。
附图描述
图1细胞培养的pH值的一般进程图。
图2存活的细胞密度的进程:空心:单一进料(进料I);实心:分离的进料(进料2和进料3);环形:具有氯化钾；正方形:具有氯化钠。
图3生活力的进程:空心:单一进料(进料I);实心:分离的进料(进料2和进料3);环形:具有氯化钾；正方形:具有氯化钠。可以看出，通过使用如在本文中所报道的混合装置，生活力在大于90%的值处保持更长。
图4pH值的进程:空心:单一进料(进料I);实心:分离的进料(进料2和进料3)；环形:具有氯化钾；正方形:具有氯化钠。在进料开始(72小时后)前，进程都是类似的。
图5葡萄糖消耗的进程:空心:单一进料(进料I);实心:分离的进料(进料2和进料3);环形:具有氯化钾；正方形:具有氯化钠。当使用如在本文中所报道的混合装置时，葡萄糖消耗是降低的。
图6乳酸形成的进程:空心:单一进料(进料I);实心:分离的进料(进料2和进料3);环形:具有氯化钾；正方形:具有氯化钠。当使用如在本文中所报道的混合装置时，改善了乳酸形成和重新代谢的起始。图7谷氨酰胺消耗的进程:空心:单一进料(进料I);实心:分离的进料(进料2和进料3);环形:具有氯化钾；正方形:具有氯化钠。图8氨积累的进程:空心:单一进料(进料I);实心:分离的进料(进料2和进料3);环形:具有氯化钾；正方形:具有氯化钠。图9酸性峰级分:左边:使用如在本文中所报道的装置；黑色右边:没有使用如在本文中所报道的装置。图10加入的碱的所需量(培养14天后)对进料溶液的pH值的依赖性；环形:没有使用如在本文中所报道的装置；正方形:使用如在本文中所报道的装置。图11乳酸形成(培养14天后)对进料溶液的pH值的依赖性；环形:没有使用如在本文中所报道的装置；正方形:使用如在本文中所报道的装置。图12培养基中谷氨酰胺浓度(培养14天后)对进料溶液的pH值的依赖性；环形:没有使用如在本文中所报道的装置；正方形:使用如在本文中所报道的装置。图13培养基中的渗透性(培养14天后)对进料溶液的pH值的依赖性；环形:没有使用如在本文中所报道的装置；正方形:使用如在本文中所报道的装置。图14溶解的二氧化碳( 培养14天后)对进料溶液的pH值的依赖性；环形:没有使用如在本文中所报道的装置；正方形:使用如在本文中所报道的装置。图15存活细胞的密度(培养14天后)对进料溶液的pH值的依赖性；环形:没有使用如在本文中所报道的装置；正方形:使用如在本文中所报道的装置。图16G (0)级分对进料溶液的pH值的依赖性。图17G (I)级分对进料溶液的pH值的依赖性。图18+19如在本文中所报道的装置的示例性图。图20宿主细胞蛋白质含量对进料溶液的pH值的依赖性。
实施例材料抗体在如在本文中所报道的方法和实施例中使用的示例性抗体是如在W02010/034443中所报道的抗-1L17抗体(将其并入本文作为参考)。进料溶液进料1:该溶液包含pH值约9.5的全部进料组分(氨基酸和丙酮酸)。进料2:该溶液包含双倍浓度的在约pHl.5的酸性pH值的可溶的组分。进料3:该溶液包含双倍浓度的在约pHIO的碱性pH值的可溶的组分。在该设置中，确保加入的进料I的浓度和组分的数目以及体积与进料2和进料3的组合后一样。进料I的PH值为约pH9.5，并且组合的进料2和3的pH值为约pH7.2。进料混合装置尺寸用于混合进料溶液的小室的体积:1.146ml使用21-培养容器开始培养时，培养基的体积:1.21经进料混合装置的进料流量:36g/d实施例1
用在相同的摇瓶中预培养的接种溶液平行接种4个21-培养容器(SartoriusBiostat B-DQJ Quad, Sartorius, Goettingen,德国)。两个培养容器包含如在本文中所报道的装置，而另外两个培养容器包含具有Luer fitting但没有混合室的两个单独的常规进料装置。
在整个培养期间，全部培养都以恒定的通气速率、恒定的温度和恒定的搅拌速度进行。基于起始工作体积计算全部加料速度，并以每天每次发酵起始体积的进料体积给出。
72小时培养时间后，用进料2和进料3以具有相同体积流量的连续进料开始在包含进料混合装置的培养容器中的进料。在进料混合装置中合并进料，并在混合后加入到培养基中。
72小时培养时间后，用进料I以两倍于相应的用进料混合装置培养的体积流量的体积流量开始在包含常规进料装置的培养容器中的进料。
因此，在全部四个培养中全部进料组分的加入体积和加入量都是相同的(参见表I和2)。
表权利要求
1.用于将各自具有非生理性PH值的至少两种进料溶液加入到细胞培养容器中的装置，所述装置包含用于进料溶液的单独的入口、用于混合进料溶液的小室和用于将混合的进料溶液加入到细胞培养容器中的单个出口，由此用于混合进料溶液的小室的体积与培养容器中培养基的体积的比例为0.8ml/l至1.2ml/l。
2.根据权利要求1的装置，其特征在于所述比例为约lml/1。
3.根据前述权利要求任一项的装置，其特征在于所述装置与所述培养容器分离，并且所述出口通往所述培养容器的内部。
4.根据前述权利要求任一项的装置，其特征在于所述进料混合装置在所述培养容器的外部或者在所述培养容器的内部。
5.根据前述权利要求任一项的装置，其特征在于用于混合所述进料溶液的所述小室具有0.5ml至1，OOOml的体积。
6.根据前述权利要求任一项的装置，其特征在于所述装置由可灭菌材料制成。
7.细胞培养设备，其包含 a)细胞培养容器， b)气体供应， c)用于各自具有非生理性pH值的进料溶液的至少两个液体储存器， d)用于测定细胞培养容器中的pH值的至少一个传感器，和 e)根据权利要求1至6任一项的装置。
8.根据权利要求1至6任一项的装置或者根据权利要求7的设备在细胞的补料分批或连续培养中的用途。
9.用于产生多肽的方法，其包括以下步骤 -使用包含根据权利要求1至6任一项的装置的培养容器或权利要求7的设备以补料分批或连续培养的方式培养包含编码所述多肽的核酸的细胞，其中将各自具有非生理性pH值的至少两种进料溶液加入到所述培养基中，和 -从所述培养基或所述细胞中回收所述多肽。
10.根据权利要求9的方法，其特征在于 -任一酸性进料溶液具有PH6.5或更低的pH值，和/或任一碱性进料溶液具有pH8.0或更高的pH值，并且 -所述混合的进料溶液具有PH7至pH7.5的pH值。
11.根据权利要求9至10任一项的方法，其特征在于在加入到所述培养容器之前立即进行所述混合。
12.根据权利要求9至11任一项的方法，其特征在于任一酸性进料溶液具有pH4.5或更低的PH值，和/或任一碱性进料溶液具有ρΗΙΟ.0或更高pH值。
13.根据权利要求9至12任一项的方法，其特征在于在加入到所述培养基中的两种至四种单独的进料溶液中的至少一种是酸性进料溶液且至少一种是碱性进料溶液。
14.根据权利要求9至13任一项的方法，其特征在于每种所述碱性或酸性进料溶液包含选自氨基酸、糖、维生素、微量元素、乳酸和生长因子的至少一种化合物。
15.用于获得具 有减少的G(O)糖形和/或增加的G(I)糖形的多肽的方法，其包括以下步骤:-用包含根据权利要求1至6任一项的装置的培养容器或者根据权利要求7的设备以补料分批或连续培养的方式培养包含编码所述多肽的核酸的细胞，其中将至少一种酸性进料溶液和至少一种碱性进料溶液加入到所述培养基中，和-从所述培养基或所述细胞中回收所述多肽， 其中当加入到所述培养容器 中时，所述混合的进料溶液具有PH4.0至pH6.0的pH值。
全文摘要
在本文中报道了用于将具有非生理性pH值的进料溶液加入到细胞培养容器的进料混合装置及其用途，所述装置包含在将进料溶液加入到所述细胞培养容器之前用于混合进料溶液的小室。使用如在本文中所报道的进料混合装置，可以在进料组分具有好的溶解度和/或好的稳定性的pH的溶液中提供进料组分，由此可以使该pH值明显不同于培养基的pH值，即不同于生理性pH值。与进料溶液的pH值被限制在培养的pH值附近很小范围的培养相比，这允许更灵活地进行培养。
文档编号C12N5/00GK103221534SQ201180055657
公开日2013年7月24日 申请日期2011年12月5日 优先权日2010年12月7日
发明者S·鲍曼, J·霍夫曼, A·约克尔, C·克灵格尔, T·特洛布斯 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司
进料混合装置及其用途
在本文中报道了一种进料混合装置，其允许将具有非生理性PH值的两种或两种以上进料溶液同时进料给培养基，借此在加入培养基之前，在进料混合装置内将总进料溶液的PH值调整至例如，生理性pH值。
发明背景
为了在哺乳动物细胞的培养中增加产物产量或者培养时间，将进料溶液加入到培养基，以使必需的培养基组分的浓度维持在临界水平或者临界水平之上。
具有与培养基不同物理性质的水溶液的进料将影响培养基的物理参数，如渗透性或PH值。由于不同组分差的溶解度或者所需的稳定性，所以有时不得不将进料溶液的pH值改变成非生理性值。
Luan, Y.T.，等人报·道了在培养中延长杂交瘤的寿命，并提高单克隆抗体的产量的策略(Biotechnol.Lett.9 (1987) 691-696)。Dempsey, J.，等人报道了用于表达人抗体和谷氨酰胺合成酶的NSO细胞系的改进的发酵工艺(Biotechnol.Prog.19 (2003)175-178)。Bibila, T.A.,等人报道了使用培养基浓缩物进行的单克隆抗体方法的研发(Biotechnol.Prog.10 (1994) 87-96)。
在W02008/013809中报道了细胞培养方法。在US2006/0003448中报道了干粉细胞和细胞培养试剂以及其产生的方法。在US5，081，036中报道了用于细胞培养的方法和设备。在US5，681，748中报道了培养基浓缩技术。在US6，924，124中报道了用于细胞培养的进料策略。
在W02009/132616中报道了供应系统。在W02010/045168中报道了使用商业规模的生物反应器生产乙醇和糖的方法和设备。在US2003/0092652中报道了用于核酸分子的保护性单瓶制剂(protected one-vial formulation)、通过线内混合制备用于核酸分子的保护性单瓶制剂的方法，以及相关的产品和方法。
发明概述
使用如在本文中所报道的进料混合装置，可以例如在具有使组分具有好溶解度和/或好稳定性的PH值的溶液中提供进料组分，从而pH值可以不同于培养基的pH值，即溶液具有小于PH6.5或者大于pH7.5的彼此相互独立的pH值。与在例如进料溶液的pH值被限制在培养基的PH值附近很小范围的培养相比较，这允许更灵活地进行培养。
如在本文中所报道的一方面是用于将各自具有非生理性pH值的至少两种溶液加入细胞培养容器的装置，所述装置包含在将溶液加入到细胞培养容器之前，用于混合溶液的小室。
在一个实施方案中，用于混合溶液的小室的体积与培养容器中培养基的体积的比例为0.8ml/l至L2ml/1。在一个实施方案中，该比例为0.9ml/l至1.lml/1。在一个实施方案中，该比例为约lml/1。在一个实施方案中，该比例为0.95ml/l。在一个实施方案中，培养基的体积是在起始培养时，培养容器中液体的体积。
在一个实施方案中，各自具有非生理性pH值的至少两种溶液，至少一种是酸性溶液并且至少一种是碱性溶液。在一个实施方案中，各自具有非生理性pH值的至少两种溶液具有相互独立的小于pH6.5或者大于pH7.5的pH值。在一个实施方案中，各自具有非生理性pH的至少两种溶液具有相互独立的pHO至pH6.49或者pH7.51至pH14的pH值。在一个实施方案中，酸性和碱性溶液的pH值与培养基的pH值相差至少0.5个pH单位。在一个实施方案中，酸性溶液具有PH6.5或更低的pH值。在一个实施方案中，酸性溶液具有PH4.0或更低的pH值。在一个实施方案中，碱性溶液具有pH8.0或更高的pH值。在一个实施方案中，碱性溶液具有10.0或更高的pH值。在一个实施方案中，将该装置用于加入具有非生理性pH值的两种至四种单独的溶液，其中任选地至少一种是酸性溶液，并且至少一种是碱性溶液。在一个实施方案中，每种溶液都是包含选自氨基酸、糖、维生素、微量元素、乳酸和生长因子的至少一种化合物的进料溶液。在一个实施方案中，用于混合溶液的小室与培养容器是分离的，并且所述小室包含进入到培养容器的内部的出口。在一个实施方案中，小室在培养容器的外部或者在培养容器的内部。在一个实施方案中，小室具有0.1ml至50，OOOml的体积。在一个实施方案中，小室具有0.25ml至30，OOOml 的体积。在一个实施方案中，小室具有0.5ml至1，OOOml的体积。在一个实施方案中，小室具有约1.15ml、或者约8ml、或者约80ml、或者约200ml、或者约400ml、或者约800ml、或者约1.61、或者约41、或者约81、或者约161、或者约401的体积。在一个实施方案中，在加入到培养容器之前立即混合。在一个实施方案中，用于混合溶液的小室包含用于每种溶液的各个连接器的入□。在一个实施方案中，该装置是可灭菌的。如在本文中所报道的另一方面是如在本文中所报道的装置在细胞的补料分批或者连续培养中的用途。如在本文中所报道的又一方面是包含如在本文中所报道的装置的培养容器。如在本文中所报道的一个方面是用于产生多肽的方法，其包括以下步骤:-在包含如在本文中所报道的装置的培养容器中以补料分批或连续培养的方式培养包含编码多肽的核酸的细胞，由此在培养期间加入至少一种酸性进料溶液和至少一种碱性进料溶液，和-从培养基或细胞中回收多肽，从而产生多肽。在一个实施方案中，当加入到培养容器中时，混合的进料溶液具有pH4.5至pH9.5的pH值。在一个实施方案中，当加入到培养容器中时，混合的进料溶液具有pH6.5至pH7.5的pH值。在一个实施方案中，培养容器具有约21、或者101、或者201、或者1001、或者2501、或者 5001、或者 I, 0001、或者 2，0001、或者 5，0001、或者 10，0001、或者 20，0001、或者50，0001的体积。在一个实施方案中，培养基的体积为约1.21、或者约81、或者约161、或者约801、或者约2001、或者约4001、或者约8001、或者约1，6001、或者约4，0001、或者约8，0001、或者约 16，0001、或者约 40，0001。
在一个实施方案中，如在本文中所报道的装置在室温运行。
如在本文中所报道的又一方面是用于获得具有减少的G(O)糖形和/或增加的Gd)糖形的多肽的方法，其包括以下步骤:
-在包含如在本文中所报道的装置的培养容器中以补料分批或连续培养的方式培养包含编码多肽的核酸的细胞，由此在培养期间加入至少一种酸性进料溶液和至少一种碱性进料溶液，和
-从培养基或细胞中回收多肽，从而获得具有减少的G(O)糖形和/或增加的G(I)糖形的多肽。
其中当加入到培养容器中时，混合的进料溶液具有pH4.0至pH6.0的pH值。
在一个实施方案中，多肽是抗体或者Fe-融合的多肽。
发明详述
广泛地用于生产治疗性多肽或生物质的方式是补料分批发酵。在补料分批发酵中，哺乳动物细胞培养物的细胞密度通常超过100*105个细胞/ml，由于某些物质或者物质种类的低溶解度和/或受损的稳定性，导致了在提供足够量的所需培养物质中的挑战。
因此，通常的方法是使用具有非生理性pH值的进料溶液，来溶解或者稳定所需量的这些物质。例如，由于酪氨酸的低溶解度，所以通过液体进料溶液很难在PH7左右的pH值足够地供应氨基酸酪氨酸。然而，·在该情况下，高的非生理性pH值增加了溶解度，这使得进料策略匹配了在补料分批方法中总体的酪氨酸消耗与非生理性PH值的进料溶液。特别地，连续进料策略需要稳定的进料溶液。因此，进料组分的贮藏期限必须至少超过进料时间。
此外，具有非生理性pH值，即碱性或酸性pH值的进料溶液的加入触发了培养装置的pH控制机制的响应。这导致了酸或碱增加的和不期望的加入，以补偿由具有非生理性pH值的进料溶液的加入诱导的PH改变。
为了避免具有非生理性pH的进料溶液，例如具有高或低pH值的那些进料溶液的使用产生的影响，可以使用如在本文中所报道的进料混合装置，其能恰好在加入到培养容器中之前连续混合至少两种进料溶液。通过使用如在本文中所报道的进料混合装置，可以在进料组分具有好的溶解度和/或好的稳定性的pH值溶解进料组分，由此可以使该pH值明显不同于培养基的PH值，即不同于生理性pH值。因为现在可以在加入到培养基和细胞悬浮液之前直接调整PH值，这允许进料溶液具有更灵活的pH值。
如在本文中所报道的装置是用于细胞培养(例如补料分批培养或者连续培养)的进料混合装置，在所述细胞培养期间必须加入化合物。使用如在本文中所报道的进料混合装置，培养可以在至少一个额外的自由度下进行，因此更具灵活性。使用如在本文中所报道的进料混合装置，有可能使用非生理性PH值和/或高化合物浓度的进料溶液。例如为稳定pH敏感的进料组分，需要非生理性pH值。在加入到培养容器，并因此加入到培养基中之前，可以调整任何PH值。这允许以非连续或者连续的进料方法加入确定量的化合物。例如，通过加入确定量的离子，可以调整预定的渗透性。
有可能通过使用如在本文中所报道的装置获得的进料溶液的pH值的变化性，可以使用具有任意PH值(即碱性、中性或酸性溶液)和具有任意浓度的各个组分的进料溶液。与不使用如在本文中所报道的装置的常规进料策略相比较，也有可能在加入的进料中运用pH梯度，借此也可以加入基本上相同量的物质。因此，甚至可以使用具有这样的组分的进料溶液，所述组分由于其低溶解度或受损的稳定性，必须以极端的碱性或酸性，即非生理性PH值提供。离开进料混合装置并被加入到培养基中的混合进料溶液的pH值取决于各个进料的体积混合比和在混合室内的停留时间，因此所述PH值取决于各个进料溶液的体积流量。在一个实施方案中，经进料混合装置流入到培养容器的总体积为I至1.5g/h/l。在一个实施方案中，体积流量为1.15g/h/l至1.35g/h/l。在一个实施方案中，体积流量为约1.25g/h/l。单位g/h/1表不进料的质量/培养时间/培养体积。在一个实施方案中，培养体积为在起始培养时培养容器中流体的体积。通过将如在本文中所报道的装置用于混合进料溶液，培养的细胞的生活力可以在预定水平以上维持更长的时期，因此允许更长的总培养时间。同时，可以降低乳酸浓度和葡萄糖消耗。
图1中显示了细胞培养的pH值的一般进程。接种后(图1，“1”)，培养的pH值降低并接近预定PH范围的下缘(图1，“2”)。这归因于培养基中乳酸的的形成和二氧化碳的积累。通过加入碱，使用的PH控制机制确保pH值维持在预定pH范围的下缘。继续加入碱，直到细胞代谢改变，并且重新代谢培养基中的乳酸和/或去除积累的二氧化碳(图1，“3”)。然后，PH值增加，直到达到预 定pH范围的上缘(图1，“4”)。通过加入酸，pH控制机制维持pH值在该上缘值。在例如不使用pH控制机制的情况下，碱进料溶液可以使培养基的pH值维持在预定PH范围的下缘之上。因此，通过使用如在本文中所报道的进料混合装置来改变加入到培养基中的两种或多种进料溶液的各个体积流速比，可以抵消培养容器中PH值的改变。因此，使用如在本文中所报道的装置，可以分别废弃或者可以减少PH控制机制或者至少使用其的时间(以及同样地，酸和碱的加入量)。通过使用具有各个加料速度的碱性进料溶液和酸性进料溶液，以及如在本文中所报道的进料混合装置，可以将组合的进料溶液的PH值调整至任意靶值。通过在培养过程中改变各个加料速度和/或进料溶液，可以在培养期间改变组合的进料溶液的PH值。因此，有可能依据培养的细胞的代谢，来改变和/或控制PH值。可以将组合进料溶液的可变pH值用于支持或替换用于调整培养PH值的其他方法。通过使用如在本文中所报道的进料混合装置，可以连续组合两种或多种进料溶液。进料溶液可以包含任一化合物。例如，可以在(高)非生理性PH值稳定的化合物如维生素。使用如在本文中所述的进料混合装置，在加入到培养基中之前，将PH值调整至生理性范围的PH值。因此，减少了进料化合物维持在稳定性受损的pH值的时间。通过使用一种或多种碱性溶液和一种或多种酸性溶液，有可能进行可变的pH值调整。使用如在本文中所报道的装置，通过调整进料溶液的速度和各个流速，可以在线控制培养基的pH值(图1，“5”)。通过使用具有不同性质的进料溶液，有可能进行例如离子浓度、pH值、渗透性、化合物比例、粘度、表面张力、电导率、可湿性、电阻率和/或密度的时间依赖性调整。通过使用在线传感器，有可能使用如在本文中所报道的装置组合具有不同物理和/或化学性质的不同进料溶液。因此，可以根据预定计划改变不同的参数。
通过使用如在本文中所报道的装置，有可能将固体、分散体和几乎不可混溶的化合物/溶液用作进料溶液。进料溶液的化学和/或物理性质可以是不同的。
通过使用如在本文中所报道的进料混合装置，在培养期间可以施行所加入的混合进料溶液的PH梯度。
相互独立的各个进料可以是分散体、乳剂或溶液。可以通过使用常规泵或者任意其他已知的机械或流动机械方法，将溶液运输至进料混合装置。如果进料不是真正的溶液，那么例如可以通过使用机械运输方法加入所述进料。
进料混合装置的规模是可变的，因此，可以与任意类型和大小的培养装置，例如与培养容器(搅拌罐)、研碎式反应器(chip reactor)或流管式反应器一起使用该装置。
当使用如在本文中所报道的装置时，尽管在加入到培养基中之前显著改变了进料溶液的PH值，但在混合各个进料溶液时，在混合室中几乎没有沉淀形成。
与使用单一的碱进料并且不使用如在本文中所报道的装置的培养相比，通过使用如在本文中所报道的装置，并因此将分离的进料调整至组合的(酸性)进料可以减少产生的多肽，特别是产生的免疫球蛋白的G(O)糖形。同样地，与使用单一的碱性进料并且不使用如在本文中所报道的装置的培养相比，通过使用如在本文中所报道的装置并将分离的进料调整至混合的酸性进料可以增加G(I)糖形。
通过调整细胞培养条件，可以改变在下游加工前培养基中宿主细胞蛋白质的含量。这通过使用特定的进料溶液应当是·可能的。因此，使用包含具有确定的质子浓度，即确定PH值的pH经调整的进料溶液的经调整的进料策略，可以加入相同的或者至少相似量的进料组分，并且同时可以降低为了校正培养基的PH值所需要的碱或酸的量，并且同时还可以降低培养上清液中宿主细胞蛋白质含量。
因此，在一个实施方案中，可以将如在本文中所报道的进料混合装置用于降低细胞培养上清液中宿主细胞蛋白质含量。
提供了以下实施例和附图，以帮助理解本发明，在所附权利要求中给出了本发明的真正的范围。理解的是，在不背离本发明精神的情况下，可以对给出的方法进行修改。
附图描述
图1细胞培养的pH值的一般进程图。
图2存活的细胞密度的进程:空心:单一进料(进料I);实心:分离的进料(进料2和进料3);环形:具有氯化钾；正方形:具有氯化钠。
图3生活力的进程:空心:单一进料(进料I);实心:分离的进料(进料2和进料3);环形:具有氯化钾；正方形:具有氯化钠。可以看出，通过使用如在本文中所报道的混合装置，生活力在大于90%的值处保持更长。
图4pH值的进程:空心:单一进料(进料I);实心:分离的进料(进料2和进料3)；环形:具有氯化钾；正方形:具有氯化钠。在进料开始(72小时后)前，进程都是类似的。
图5葡萄糖消耗的进程:空心:单一进料(进料I);实心:分离的进料(进料2和进料3);环形:具有氯化钾；正方形:具有氯化钠。当使用如在本文中所报道的混合装置时，葡萄糖消耗是降低的。
图6乳酸形成的进程:空心:单一进料(进料I);实心:分离的进料(进料2和进料3);环形:具有氯化钾；正方形:具有氯化钠。当使用如在本文中所报道的混合装置时，改善了乳酸形成和重新代谢的起始。图7谷氨酰胺消耗的进程:空心:单一进料(进料I);实心:分离的进料(进料2和进料3);环形:具有氯化钾；正方形:具有氯化钠。图8氨积累的进程:空心:单一进料(进料I);实心:分离的进料(进料2和进料3);环形:具有氯化钾；正方形:具有氯化钠。图9酸性峰级分:左边:使用如在本文中所报道的装置；黑色右边:没有使用如在本文中所报道的装置。图10加入的碱的所需量(培养14天后)对进料溶液的pH值的依赖性；环形:没有使用如在本文中所报道的装置；正方形:使用如在本文中所报道的装置。图11乳酸形成(培养14天后)对进料溶液的pH值的依赖性；环形:没有使用如在本文中所报道的装置；正方形:使用如在本文中所报道的装置。图12培养基中谷氨酰胺浓度(培养14天后)对进料溶液的pH值的依赖性；环形:没有使用如在本文中所报道的装置；正方形:使用如在本文中所报道的装置。图13培养基中的渗透性(培养14天后)对进料溶液的pH值的依赖性；环形:没有使用如在本文中所报道的装置；正方形:使用如在本文中所报道的装置。图14溶解的二氧化碳( 培养14天后)对进料溶液的pH值的依赖性；环形:没有使用如在本文中所报道的装置；正方形:使用如在本文中所报道的装置。图15存活细胞的密度(培养14天后)对进料溶液的pH值的依赖性；环形:没有使用如在本文中所报道的装置；正方形:使用如在本文中所报道的装置。图16G (0)级分对进料溶液的pH值的依赖性。图17G (I)级分对进料溶液的pH值的依赖性。图18+19如在本文中所报道的装置的示例性图。图20宿主细胞蛋白质含量对进料溶液的pH值的依赖性。
实施例材料抗体在如在本文中所报道的方法和实施例中使用的示例性抗体是如在W02010/034443中所报道的抗-1L17抗体(将其并入本文作为参考)。进料溶液进料1:该溶液包含pH值约9.5的全部进料组分(氨基酸和丙酮酸)。进料2:该溶液包含双倍浓度的在约pHl.5的酸性pH值的可溶的组分。进料3:该溶液包含双倍浓度的在约pHIO的碱性pH值的可溶的组分。在该设置中，确保加入的进料I的浓度和组分的数目以及体积与进料2和进料3的组合后一样。进料I的PH值为约pH9.5，并且组合的进料2和3的pH值为约pH7.2。进料混合装置尺寸用于混合进料溶液的小室的体积:1.146ml使用21-培养容器开始培养时，培养基的体积:1.21经进料混合装置的进料流量:36g/d实施例1
用在相同的摇瓶中预培养的接种溶液平行接种4个21-培养容器(SartoriusBiostat B-DQJ Quad, Sartorius, Goettingen,德国)。两个培养容器包含如在本文中所报道的装置，而另外两个培养容器包含具有Luer fitting但没有混合室的两个单独的常规进料装置。
在整个培养期间，全部培养都以恒定的通气速率、恒定的温度和恒定的搅拌速度进行。基于起始工作体积计算全部加料速度，并以每天每次发酵起始体积的进料体积给出。
72小时培养时间后，用进料2和进料3以具有相同体积流量的连续进料开始在包含进料混合装置的培养容器中的进料。在进料混合装置中合并进料，并在混合后加入到培养基中。
72小时培养时间后，用进料I以两倍于相应的用进料混合装置培养的体积流量的体积流量开始在包含常规进料装置的培养容器中的进料。
因此，在全部四个培养中全部进料组分的加入体积和加入量都是相同的(参见表I和2)。
表权利要求
1.用于将各自具有非生理性PH值的至少两种进料溶液加入到细胞培养容器中的装置，所述装置包含用于进料溶液的单独的入口、用于混合进料溶液的小室和用于将混合的进料溶液加入到细胞培养容器中的单个出口，由此用于混合进料溶液的小室的体积与培养容器中培养基的体积的比例为0.8ml/l至1.2ml/l。
2.根据权利要求1的装置，其特征在于所述比例为约lml/1。
3.根据前述权利要求任一项的装置，其特征在于所述装置与所述培养容器分离，并且所述出口通往所述培养容器的内部。
4.根据前述权利要求任一项的装置，其特征在于所述进料混合装置在所述培养容器的外部或者在所述培养容器的内部。
5.根据前述权利要求任一项的装置，其特征在于用于混合所述进料溶液的所述小室具有0.5ml至1，OOOml的体积。
6.根据前述权利要求任一项的装置，其特征在于所述装置由可灭菌材料制成。
7.细胞培养设备，其包含 a)细胞培养容器， b)气体供应， c)用于各自具有非生理性pH值的进料溶液的至少两个液体储存器， d)用于测定细胞培养容器中的pH值的至少一个传感器，和 e)根据权利要求1至6任一项的装置。
8.根据权利要求1至6任一项的装置或者根据权利要求7的设备在细胞的补料分批或连续培养中的用途。
9.用于产生多肽的方法，其包括以下步骤 -使用包含根据权利要求1至6任一项的装置的培养容器或权利要求7的设备以补料分批或连续培养的方式培养包含编码所述多肽的核酸的细胞，其中将各自具有非生理性pH值的至少两种进料溶液加入到所述培养基中，和 -从所述培养基或所述细胞中回收所述多肽。
10.根据权利要求9的方法，其特征在于 -任一酸性进料溶液具有PH6.5或更低的pH值，和/或任一碱性进料溶液具有pH8.0或更高的pH值，并且 -所述混合的进料溶液具有PH7至pH7.5的pH值。
11.根据权利要求9至10任一项的方法，其特征在于在加入到所述培养容器之前立即进行所述混合。
12.根据权利要求9至11任一项的方法，其特征在于任一酸性进料溶液具有pH4.5或更低的PH值，和/或任一碱性进料溶液具有ρΗΙΟ.0或更高pH值。
13.根据权利要求9至12任一项的方法，其特征在于在加入到所述培养基中的两种至四种单独的进料溶液中的至少一种是酸性进料溶液且至少一种是碱性进料溶液。
14.根据权利要求9至13任一项的方法，其特征在于每种所述碱性或酸性进料溶液包含选自氨基酸、糖、维生素、微量元素、乳酸和生长因子的至少一种化合物。
15.用于获得具 有减少的G(O)糖形和/或增加的G(I)糖形的多肽的方法，其包括以下步骤:-用包含根据权利要求1至6任一项的装置的培养容器或者根据权利要求7的设备以补料分批或连续培养的方式培养包含编码所述多肽的核酸的细胞，其中将至少一种酸性进料溶液和至少一种碱性进料溶液加入到所述培养基中，和-从所述培养基或所述细胞中回收所述多肽， 其中当加入到所述培养容器 中时，所述混合的进料溶液具有PH4.0至pH6.0的pH值。
全文摘要
在本文中报道了用于将具有非生理性pH值的进料溶液加入到细胞培养容器的进料混合装置及其用途，所述装置包含在将进料溶液加入到所述细胞培养容器之前用于混合进料溶液的小室。使用如在本文中所报道的进料混合装置，可以在进料组分具有好的溶解度和/或好的稳定性的pH的溶液中提供进料组分，由此可以使该pH值明显不同于培养基的pH值，即不同于生理性pH值。与进料溶液的pH值被限制在培养的pH值附近很小范围的培养相比，这允许更灵活地进行培养。
文档编号C12N5/00GK103221534SQ201180055657
公开日2013年7月24日 申请日期2011年12月5日 优先权日2010年12月7日
发明者S·鲍曼, J·霍夫曼, A·约克尔, C·克灵格尔, T·特洛布斯 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司
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