具有降低的腺苷酸激酶活性并表现淀粉积累增加的转基因植物的制作方法

xiaoxiao2020-6-24  4

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专利名称:具有降低的腺苷酸激酶活性并表现淀粉积累增加的转基因植物的制作方法
技术领域
本发明涉及转基因植物,其由于内源性腺苷酸激酶(ADK)活性的降低而显示淀粉积累的增加和/或者淀粉贮存部位、组织或器官产量的增加。根据本发明,这样的降低可以通过向植物的基因组中引入外源核酸分子,如一段编码适宜的反义RNA的核酸分子而实现。而且,本发明还涉及重组的核酸分子和生产所公开的植物的方法。
在植物的淀粉贮存组织中,例如在马铃薯的块茎中,通过常规作物育种或者遗传操作策略增加淀粉的积累十分有意义(Schafer-Pregl等人,Genetics第97卷(1998),第834-846页;Stark等人,Science第258卷(1991),第287-292页;Trethewey等人,Plant J.第15卷(1998),第109-118页)。转基因方法一直主要关注于对蔗糖的异化作用(Sonnewald等人,Nature Biotech.第15卷(1997),第794-797页;Trethewey等人,在上述引文中)或者质体淀粉(plastidialstarch)的合成途径(Stark等人,在上述引文中;Tauberger等人,PlantJ.第23卷(2000),第43-53页)。目前仅有的成功转基因方法都是来自过量表达细菌的AGP酶(Stark等人,在上述引文中)或者拟南芥淀粉质体ATP/ADP转运蛋白(Tjaden等人,Plant J.第16卷(1998),第531-540页)。先前还有人尝试通过一条更有效的蔗糖降解途径,包含酵母的转化酶和细菌的葡萄糖激酶,来提高马铃薯块茎的淀粉产量(Trethewey等人,在上述引文中)。但是,与野生的块茎相比较而言,除了转基因块茎表现出蔗糖水平降低和磷酸己糖ATP和3-PGA水平升高的事实外,这项尝试也失败了。这个很有趣,因为磷酸己糖,ATP和3-PGA分别代表AGP酶的直接前体和激活物(请参阅综述Preiss,InThe Biochemistry of Plants,第14卷,AcademicPress,San Diego,California(1998),第181-254页)。而且,这些磷酸己糖以降低淀粉合成为代价与糖酵解分开并导致在这些株系中淀粉积累降低(Trethewey等人,在上述引文中)。当把这些研究综合起来看就可以发现淀粉合成的调节,如在马铃薯块茎中,比原先预期的更加复杂而且简单地增加前体的浓度不足以促进淀粉合成。
因此,仍然有必要寻找可以有效地在植物的淀粉贮存组织中大量增加淀粉积累的方法。
所以,本发明的技术问题是提供表现出淀粉增加的植物及其生产手段和方法。
这个技术问题由在权利要求中所表征的实施方案解决。
由此,本发明涉及转基因植物,其内源的腺苷酸激酶(ADK)的活性被降低了。
我们惊异地发现在马铃薯块茎中抑制定位于质体的腺苷酸激酶可以显著地增加块茎中淀粉的积累。由抑制ADK引起的进一步改进作用还包括增加的块茎产量(增加到184%),块茎的密度,腺苷酸含量和氨基酸含量,特别是必需氨基酸。在Tjaden(Plant J.第16卷(1998),第531-540页)中,我们知道在质体中ATP含量的升高可以导致淀粉积累的增加。这是通过过量表达质体的ATP/ADP转运蛋白来实现的。但是,出人意料的是抑制质体ADK对于在这些细胞器中腺苷酸含量有类似的影响。腺苷酸激酶(EC 2.7.4.3)催化了以下反应ATP+AMP<->2ADP.
根据本发明提供的降低活性的ADK可以具有任何可能的亚细胞定位。例如Moore曾经描述过细胞质内的ADK同功酶(Plant ScienceLetters第35卷(1984),第127-138页)。Kawai也描述了水稻的两个细胞质ADK同功酶的核苷酸序列(Plant J.第2卷(1992),第845-854页和Plant Mol.Biol.第27卷(1995),第943-951页)。定位于线粒体的ADK同功酶同样的可被应用在本发明的实施方案中。不过,优选具有质体定位的ADK,因为质体,特别是淀粉质体,是植物细胞中生物合成淀粉的地方。合适的质体ADK在一些文献中有所描述,例如玉米中的(Schiltz,Eur.J.Biochem.第222卷(1994),第949-954页)。此外发表的还有与上述编码ADK的核苷酸序列显著同源的所表达序列片段(expressed sequence tags,EST),例如一个来自Glycine max(GenBank EMBL数据库登录号BE 022879),两个来自拟南芥(GenBank EMBL数据库登录号N37538)和一个来自马铃薯的肿胀匍匐枝(登录号AW 905934)。在优选的实施方案中,以上提到的要降低活性的ADK由选自下列的多核苷酸编码(a)编码具有SEQ ID NO.2中所描述的氨基酸序列的多肽的多核苷酸;(b)包含SEQ ID NO.1中描述的核酸序列的多核苷酸;(c)同(a)或(b)中的多核苷酸的互补链杂交的多核苷酸;以及(d)多核苷酸其核苷酸序列由密码子简并性而衍生自(c)的多核苷酸的核苷酸序列。
具有SEQ ID NO.1中所示核苷酸序列的编码马铃薯质体ADK(StpADK)的cDNA按照所附实施例中的描述进行克隆以用于制备转基因反义马铃薯植物。本文中术语“杂交”指在常规的杂交条件下的杂交反应,优选在严紧条件下,就如在Sambrook等人,MolecularCloning,A Laboratory Manual,第二版(1989)Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY。在特别优选的实施方案中,术语“杂交”的意思是在以下条件下发生的杂交反应杂交反应缓冲液2×SSC,10×Denhardt溶液(Fikoll 400+PEG
+BSA;比例1∶1∶1);0.1%SDS,5mM EDTA;50mM磷酸氢二钠;250μg/ml鲱鱼精子DNA;50μg/ml tRNA或者0.25M磷酸钠缓冲液,pH7.2;1mM EDTA7%SDS杂交反应温度T=60℃洗涤缓冲液 2×SSC;0.1%SDS洗涤温度T=60℃有利的是,编码ADK的多核苷酸的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中的核苷酸序列有至少90%,优选至少95%,更优选至少98%且最优选至少99%的一致性。同样,这样的多核苷酸编码的多肽在氨基酸序列上与SEQ ID NO.2的氨基酸序列有至少80%优选至少90%,更优选至少95%,更加优选至少98%,且最优选至少99%的一致性。
术语“内源的腺苷酸激酶(ADK)活性”指植物细胞中任何可以催化上述反应的酶活性。优选,所述的活性位于质体内,如叶绿体,且尤其是淀粉质体,并且可以由此通过使用分离的质体来优选测定(参阅例如Haake(Plant J.第14卷(1998),第147-157页)以获得分离质体的适宜方法)。ADK的活性可以通过文献中描述的方法来测定,例如Kleczkowski(Plant Physiol.第81卷(1986),第1110-1114页)。术语“内源的”指在来源植物中存在的ADK活性,有利的是将野生型植物用作实施这里所述的实施方案的起始点。根据以上内容通过“ADK活性的降低”是指与来源植物中相应的内源ADK活性相比较,至少降低了20%,优选至少25%而最优选至少30%。同样的,内源的ADK活性的降低可以通过测量植物细胞中相应的ADK转录物或者蛋白的含量来测定。由此,与来源植物的相应转录物量相比,ADK转录物减少至少30%,优选至少50%到70%,且最优选至少70%到90%,即说明是根据本发明的转基因植物。在蛋白质水平上,与相应的来源植物相比,ADK多肽减少至少30%,优选至少50%到70%,最优选至少70%到90%,这才能够在本发明的转基因植物中提供有效的淀粉积累增加。
本文中术语“积累增加”指根据本发明的转基因植物与相应的未转化的野生型植物相比有增加的淀粉含量。优选,在植物的淀粉贮存部位,器官或者组织中淀粉含量有所增加。本文中,术语“增加”是指与相应的来源植物相比,优选与未转化的野生型植物相比,淀粉含量增加至少10%,优选至少20%,更优选至少40%,更加优选至少60%,特别优选至少80%。在一个特别优选的实施方案中,淀粉积累增加了2倍。
植物部位,器官或组织的淀粉含量可以根据本领域技术人员已知的方法进行测定,例如根据所附实施例或者在Morrell(Phytochemistry第25卷(1986),第1579-1585页)中描述的方法。
如上文所指出的,本发明的转基因植物与相应的来源植物相比,除了淀粉含量的升高以外,也可以优选表现出不同淀粉贮存器官或者植物其它部分,优选块茎,的氨基酸含量和其密度的增加。当考虑整体的氨基酸含量,即在植物组织中存在的不同氨基酸优选通常的蛋白质氨基酸的总量,这些氨基酸含量升高的范围是至少5%,有利的为至少10%而最优选至少20%。而且,单种氨基酸,特别是必需氨基酸,可以表现出相应的甚至是更强的增加。从这一方面看,特别优选在本发明的转基因植物中,亮氨酸,甲硫氨酸,和/或色氨酸的含量,有利的是所有这三种氨基酸的含量,当与相应的来源植物相比时增加了。淀粉贮存器官密度的增加值可以为相应的来源植物中不同器官密度的至少0.5%,优选至少1%。
用以测定氨基酸含量和植物组织密度的方法为本领域所已知,例如,可以按照所附实施例中的例子进行测定。
当以每棵植物的全部鲜重衡量时,在本发明的转基因植物中内源的ADK活性的降低可以导致植物淀粉贮存部位,器官或者组织的产量的显著升高。优选这种增加达到相对应的野生型植物每棵植物鲜重的至少110%,更优选至少120%,更加优选至少180%。具体而言,本发明的转基因植物如果是具有块茎的植物,优选马铃薯,则显示块茎产量,即每株植物所产块茎的总重量的增加。这种块茎产量的增加,优选达到相同环境条件下生长的相应野生型植物块茎产量的至少110%,更优选至少130%,更加优选甚至至少150%,特别优选至少160%,且最优选至少180%。而且,本发明的转基因植物也可表现每个植物的淀粉贮存器官,如块茎的数量的增加,优选达到相应野生型植物所得数量的至少110%。产量提高的另一个重要方面是每个植物可获得的淀粉量的增加。在本发明的转基因植物中,该产量参数优选增长至相应野生型植物每个植物的淀粉产量的至少110%,更优选至少120%,更加优选至少140%,且最优选至少180%。在更进一步的方面,每个可收获的淀粉贮存器官如块茎的鲜重,与相应野生植物相比有显著提高,优选达相应野生植物的淀粉贮存器官鲜重的至少120%,更优选至少140%。
本发明文中,术语“转基因”指细胞的基因组在结构上与相应的来源植物不同的植物,其中ADK的活性如上所述被降低了。这样结构上的差异是指编码ADK的基因,可以通过如基因缺失等方法而失活。现有技术提供了产生某一特定酶活性降低的转基因植物的手段和方法。作为一个优选的实施方案,本发明的转基因植物表征为存在外源的核酸分子。因此,这里所使用的术语“存在外源的核酸分子”指在转基因植物的细胞中存在而在相应的来源植物的细胞中不存在的任何核酸分子。从而,包含核酸分子,如基因序列,它们与相应的来源植物中的核酸分子由于至少一种突变(替换,插入,缺失至少一个核苷酸)而不同,其中这样的突变抑制受影响基因的表达或者降低了该基因产品的活性。而且,术语“外源的”包含核酸分子,其在来源植物细胞方面同源但是染色体定位不同或者由于如相对启动子的方向发生倒转。
原则上,外源的核酸分子可以具有任何可以想到的来源,如真核生物或原核生物。它可以来源于任何含有这种分子的有机体。而且,它可以通过修改其序列而合成或者衍生自天然存在的分子,即其可为天然分子的变体或衍生物。这样的变体或者衍生物包括但是并不局限于通过添加,缺失,突变一或多个核苷酸,或者通过重组由天然存在的分子衍生而来的分子。举例来说,这可能通过改变天然存在的分子的序列以符合植物优选的密码子使用,特别是对于那些要在其中表达该核酸分子的植物。
依靠引入外源核酸分子在目标植物中降低内源ADK活性可以通过现有技术中已知的合适方法来实现,其中优选使用反义,共抑制核酶或者RNA干涉作用或者通过体内突变,抗体表达或者通过表达显性失活突变体。这些方法在下面将详细说明。
因此,使用编码与植物ADK转录物互补的反义RNA的核酸分子是本发明的优选实施方案。为了表达所述的反义RNA,核酸分子有效连接允许其在植物中表达的启动子。术语“有效连接如在本说明书中普遍使用的,指在启动子和核酸分子之间的连接方式使得在适合启动子的条件下实现表达。由此,互补性并不意味着所编码的RNA一定100%互补。低程度的互补性就足够了,只要它足够高,可以在植物细胞中表达所述的RNA时抑制ADK的表达。转录的RNA优选与编码ADK的核酸分子的转录物有至少90%并且更优选有至少95%的互补性。为了在植物细胞的转录中起到反义效果,这样的RNA分子长度至少有15bp,优选长度要大于100bp,且最优选长度要多余500bp,但是通常少于5000bp,优选少于2500bp。在植物中达到反义效果的方法实例在例如Haake(Plant J.第14卷(1998),第147-157页),Tauberger(Plant J.第23卷(2000),第43-53页)和Tjaden(PlantJ.第16卷(1998),第531-540页)中描述过并且于此引入本发明的说明中。同样,反义效果也可以通过使用三螺旋方式实现,由此核酸分子与ADK基因的一个区域的互补,其按照在Lee(Nucl.Acids Res.第6卷(1979),第3073页);Cooney(Science第241卷(1998),第456页)或者Dervan(Science第251卷(1991),第1360页)中的原理所设计。
与反义RNA技术类似的效果可以通过产生能够表达适合的构建体而起到RNA干涉(RNAi)作用的转基因植物来实现。从而,双链RNA的形成导致以序列特异的方式抑制基因的表达。更详细地说,在RNAi构建体中,包含需要失活的基因的编码序列的有义部分(或者其中的一部分,有或者没有非翻译区域)之后接着相应的反义序列部分。在两部分之间,不一定来源于相同基因的内含子可以被插入其中。在转录后,RNAi构建体形成典型的发卡结构。与本发明的指导相一致,RNAi技术可以按照Smith(Nature第407卷(2000),第319-320页)或者Marx(Science第288卷(2000),第1370-1372页)所述实行。
在植物细胞中的表达,还可以使用DNA分子导致合成RNA,后者通过共抑制效果降低植物细胞中编码ADK核酸分子的表达。共抑制作用的原理和合成相应的DNA序列先前已经讨论过,例如在WO90/12048中。这样的DNA分子优选编码与编码ADK的基因的转录物高度同源的RNA。但是,该编码RNA并非完全必须可以翻译为蛋白。共抑制效果的原理对于本领域的技术人员是已知的并在例如Jorgensen,Trends Biotechnol.第8卷(1990),第340-344页;Niebel,Curr.Top.Microbiol.Immunol.第197卷(1995),第91-103页;Flavell,Curr.Top.Microbiol.Immunol.第197卷(1995),第43-36页;Palaqui和Vaucheret,Plant.Mol.Biol.第29卷(1995),第149-159页;Vaucheret,Mol.Gen.Genet.第248卷(1995),第311-317页;de Borme,Mol.Gen.Genet.第243卷(1994),第613-621页以及其它材料中都有描述。
同样,也可以使用编码具有特异切割ADK编码基因转录物的核酶活性RNA的DNA分子。核酶是具有催化活性的RNA分子,其可以切割RNA分子和特异的靶序列。通过重组DNA技术,有可能改变核酶的特异性。有不同类型的核酶。为了特异性切割某个基因转录物的实际应用,优选使用那些具有代表性的核酶类型,其属于I型内含子核酶类型或者那些以称作“锤头”的基序作为特征的核酶。对目标RNA分子的特异识别可以通过改变这个基序两侧的序列进行修改.通过与目标分子序列的碱基配对,这些序列决定了催化反应以及目标分子切割的发生位置。因为对于一次有效切割的序列要求低,原则上可能开发出实际针对每个目的RNA分子的特异核酶。为了产生编码可特异切割ADK编码序列转录物的核酶的DNA分子,举例来说,可以将编码核酶催化结构域的DNA序列在两侧都和编码目标蛋白ADK序列的互补序列相连接。编码催化结构域的序列可以是例如SCMo病毒的卫星DNA的催化结构域(Davies,Viology第177卷(1990),第216-224页和Steinecke,EMBO J.第11卷(1992),第1525-1530页)或者TobR病毒的卫星DNA的催化结构域(Haseloff和Gerlach,Nature第334卷(1988),第585-591页)。在细胞中为了降低某个蛋白的活性而表达核酶对于本领域的技术人员是已知的并且,例如,在EP-B1 0 321 201中已描述过。在植物细胞中表达核酶在例如Feyter(Mol.Gen.Genet.第250卷(1996),第329-338页)中描述过。
此外,在本发明的植物细胞中的腺苷酸激酶活性也可以通过所谓的“体内突变”来降低,也就是,通过将编码ADK的基因序列在它自身的染色体位置上进行改变的方法,例如通过使用同源重组的技术。这可以通过使用以转化的方法引入细胞的杂交体RNA-DNA寡聚核苷酸(“杂合体”)来实现(TIBTICH第15卷(1997)第441-447页;WO95/15972;Kren,Hepatology第25卷(1997),第1462-1468页;Cole-Strauss,Science第273卷(1996),第1386-1389页)。RNA-DNA寡聚核苷酸的DNA成分部分与目标ADK基因序列同源,但是,与这段序列比较,表现由同源序列包围的突变或者异源区域。通过同源区与目标序列的碱基配对,接着同源重组,可以将包含在RNA-DNA寡聚核苷酸的DNA成分中的突变或者异源区域转移到植物细胞的相应基因中。通过体内突变,可以失活ADK编码基因的任何部分,只要其导致内源的ADK活性的降低。这样,这可以关系到例如,启动子如RNA聚合酶结合位点,以及编码区域,特别是那些编码催化活性中心或者引导蛋白到合适的细胞区域的信号序列的部分。进一步的得到ADK编码基因被失活的转基因植物的方法包括筛选含有以例如T-DNA或者转座子标记引入的随机敲除突变的转基因植物系的文库。优选,这样的筛选基于基因型,即通过鉴定其中ADK编码基因的结构衍生自野生型的基因座的品系。适宜的方法在如Kumar(Meth.Enzymology第328卷(2000),第550-574)等文献中描述过。
此外,在植物中编码特异识别ADK,即该蛋白的特异片段或者抗原决定簇的抗体的核酸分子可以用于抑制这个蛋白的活性。这些抗体可以是单克隆抗体,多克隆抗体或者合成的抗体以及抗体的片段,如Fab,Fv或者scFv片段等等。单克隆抗体可以通过例如在Khler和Milstein(Nature第256卷(1975),第95页)和Galfré(Meth.Enzymol第73卷(1981),第3页)中首次描述的技术进行制备,其包括将小鼠骨髓瘤细胞与被免疫的哺乳动物的脾脏细胞进行融合。此外,上述提到的肽的抗体或其片段可以利用在Harlow和Lane“Antibodies,ALaboratory Manual”,CSH出版社,Cold Spring Harbour,1998中所描述的方法得到。在植物中抗体或者抗体样分子的表达可以通过本领域中熟知的方法进行,例如,完整大小的抗体(Düring,Plant.Mol.Biol.第15卷(1990),第281-293页;Hiatt,Nature第342卷(1989),第469-470页;Voss,Mol.Breeding第1卷(1995),第39-50页),Fab片段(De Neve,Transgenic Res.第2卷(1993),第227-237页),scFvs(Owen,Bio/Technology第10卷(1992),第790-794页;Zimmermann,Mol.Breeding第4卷,(1998),第369-379页;Tavladoraki,Nature第366卷(1993),第469-472页)和dAbs(Benvenuto,Plant Mol.Biol.第17卷(1991),第865-874页)已经成功地在烟草,马铃薯(Schouten,FEBS Lett.第415卷(1997),第235-241页)或者拟南芥中表达,表达水平达到了总蛋白的6.8%(Fiedler,Immunotechnology第3卷(1997),第205-216页)。
另外,编码ADK突变形式的核酸分子也可以用于干扰野生型蛋白的活性。这样的突变形式优选丧失其生物学活性,即激酶活性,并且可以通过在蛋白的氨基酸序列中进行氨基酸缺失,替换和/或添加而衍生自相应的野生型蛋白。这样的蛋白的突变形式除了丧失激酶活性以外,可以显示出增加的底物亲和力和/或提高的细胞内稳定性,例如,通过加入在细胞内环境内稳定蛋白的氨基酸。这些突变形式可以自然生成,或者优选,是基因工程突变体。
此外,对于本领域的技术人员非常明显,上述的反义,核酶,RNA干涉,共抑制,体内突变,抗体表达和显性失活突变作用也可以用于降低编码调节蛋白的基因表达,如那些控制ADK的表达的转录因子或者,例如对于激活ADK所必需的蛋白。
在本发明所公开的内容中,显然,上述策略的任何组合也可以用来产生转基因植物,其与相应的来源植物相比由于细胞中的一或者多种上述外源核酸分子表现出减弱的ADK活性。这种的组合可以这样来获得,如通过(共)转化相应的核酸分子进入植物细胞,植物组织或者植物或者通过将利用本发明中上述的不同实施方案的方法得到的转基因植物进行杂交。同样,通过本发明的方法得到的植物可以和其它的转基因植物杂交以得到淀粉积累增加和另外的基因工程特性的组合,例如抗逆性或者改良的淀粉生物合成。
对于上述的部分实施方案,外源核酸分子在本发明的转基因植物中表达,从而术语“表达”的意思是至少在植物的部分细胞中,核酸分子至少被转录,而且在一些实施方案中被翻译为蛋白质。在理论上外源的核酸分子可能在所有或者基本上所有的植物细胞中表达。但是,也可能只在某些部位,器官,细胞类型,组织等内部表达。而且,可能外源核酸分子的表达只在受到诱导或者在某一发育阶段发生。在一个优选的实施方案中,该核酸在淀粉贮存器官或者组织,例如在马铃薯块茎中表达。
为了表达,根据本发明包含在转基因植物中的外源核酸分子优选连接允许其在植物细胞中表达的启动子。
启动子可以是与植物同源或者异源。适宜的启动子为例如花椰菜花叶病毒的35S RNA的启动子(参阅如US-A-5352605)和可导致组成型表达的泛素启动子(参阅如US-A-5,614,399),可以在马铃薯的块茎中特异表达的patatin基因的启动子B33(Rocha-Sosa等人,EMBOJ.第8卷(1989),第23-29页),或者确保只在光合成活性组织中表达的启动子,例如ST-LS1启动子(Stockhaus等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA第84卷(1987),第7943-7947页;Stockhaus等人,EMBO J.第8卷(1989)第2445-2451页),Ca/b启动子(参阅如US-A-5,656,496,US-A-5,639,952,Bansal等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA第89卷(1992),第3654-3658页)和核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(Rubiso)SSU启动子(见例如US-A-5034322;US-A-496028)或者来自小麦的在胚乳中特异表达的谷蛋白启动子(HMW启动子)(Anderson,Theoretical and APPlied Genetics第96卷(1998),第568-576页;Thomas,Plant Cell第2卷(第12期),(1990),第1171-1180页),来自水稻的谷蛋白启动子(Takaiwa,Plant Mol.Biol.第30卷(第6期)(1996),第1207-1221页,Yoshihara,FEBS Lett.第383卷(1996),第213-218页,Yoshihara,Plang and Cell Physiology第37卷(1996),第107-111页),来自玉米的shrunken启动子(Maas,EMBO J.第8卷(第11期)(1990),第3447-3452页,Werr,Mol.Gen.Genet.第202卷(第3期)(1986),第471-475页,Werr,Mol.Gen.Genet.第212卷(第2期),(1988),第342-350页),USP启动子,菜豆蛋白启动子(Sengupta-Gopalan,Proc.Natl.Acad.Sci.USA第82卷(1985),第3320-3324页,Bustos,Plant Cell第1卷(第9期)(1989),第839-853页)或者来自玉米的玉米醇溶蛋白基因的启动子(Pedersen等人,Cell第29卷(1982),第1015-1026;Quatroccio等人,Plant Mol.Biol.第15卷(1990),第81-93页)。但是,每次只在由外界影响决定的时间点上才被激活的启动子也可以使用(参阅如WO 93/07279)。在这方面,只需要简单诱导的热休克蛋白的启动子特别有意义。而且,蚕豆(vicia faba)的种子特异的启动子如USP启动子,其在蚕豆和其它植物中确保种子特异的表达,也可以使用(Fiedler等人,Plant Mol.Biol.22(1993),669-679;Bumlein等,Mol.Gen.Genet.第225卷(1991),第459-467页)。而且,果实特异的启动子,如在WO 91/01373中所描述的,也可以被应用。优选确保稳定表达的启动子。
此外,外源的核酸分子可以连接终止序列,以正确地终止转录,并且在转录物上加入聚腺苷酸尾,这被认为具有稳定转录物的作用。这些元素在文献(参阅如Gielen等人,EMBO J.第8卷(1989),第23-29页)中已被描述过而且可以按照意愿进行替换。
如果外源核酸分子按照本发明在转基因植物中表达并产生多肽,在理论上合成的蛋白质可能定位在植物细胞的任何部位(例如在细胞质,质体,液泡,线粒体中)或者植物上(如在质外体中)。为了实现在特殊的部位定位,必要时编码区域必须连接到确保定位于相应部位的DNA序列上。使用的信号序列必须被安排在与编码酶的DNA序列相同的阅读框内。优选定位于质体。
为了确保能够定位到质体,可以考虑使用以下转运肽(transitpeptide)之一质体的铁氧化还原蛋白的NADP+菠菜的氧化还原酶(FNR),见Jansen等人(Current Genetics第13卷(1988),第517-522页)中。具体地,其中公布的cDNA的从-171到165位的核酸序列可被使用,它包含了5’非翻译区以及编码转运肽的序列。另外一个例子是玉米的蜡质蛋白的转运肽,其包括成熟蜡质蛋白的最初34个氨基酸残基(Klsgen等人,Mol.Gen.Genet.第217卷(1989),第155-161页)。也可能使用不含有成熟蛋白的最初34个氨基酸的转运肽。而且,二磷酸核酮糖羧化酶小亚基的信号肽(Wolter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA第85卷(1988),第846-850页;Nawrath等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA第91卷(1994),第12760-12764页),NADP苹果酸脱氢酶的信号肽(Gallardo等人,Planta第197卷(1995),第324-332页),谷胱甘肽还原酶的信号肽(Creissen等人,Plant J.第8卷,(1995),第167-175页)或者R1蛋白的信号肽(Lorberth等人,Nature Biotechnology第16卷(1998),第473-477页)也可以被使用。另外一个合适指向质体运输的信号肽是StpADK的信号肽,其包含了SEQ ID NO2的第1到78位的氨基酸序列。
为了确保定位到液泡,可以考虑使用以下转运肽之一patatin蛋白的N端序列(146个氨基酸)(Sonnewald等人,Plant J.第1卷(1991),第95-106页)或者由Matsuoka和Neuhaus(Journal ofExperimental Botany第50卷(1999),第165-174页);Chrispeels和Raikhel(Cell第68卷(1992),第613-616页);Matsuoka和Nakamura(Proc.Natl.Acad.Sci.USA第88卷(1991),第834-838页);Bednarek和Raikhel(Plant Cell第3卷(1991),第1195-1206页);和Nakamura和Matsuoka(Plant Phys.第101卷(1993),第1-5页)所描述的信号肽。
为了确保定位到线粒体,可以考虑使用例如由Braun(EMBO J.第11卷,(1992),第3219-3227页)等描述的转运肽。
为了确保定位到质外体,可以考虑使用下列转运肽之蛋白酶抑制剂II基因的信号序列(Keil等人,Nucleic Acid Res.第14卷(1986),第5641-5650页;von Schaewen等人,EMBO J.第9卷(1990),第30-33页),Erwinia amylovora的果聚糖蔗糖酶基因的信号序列(Geier和Geider,Phys.Mol.Plant Pathol.第42卷(1993),第387-404页),马铃薯(Solanum tubersum)的patatin基因B33的片段,它编码最初的33个氨基酸(Rosahl等人,Mol.Gen.Genet.第203卷,(1986),第214-220页)或者Oshima等人(Nucleic Acid Res.第18卷(1990),第181页)描述的一个信号序列。
根据本发明的转基因植物,在理论上,可以是任何植物物种,也就是说可以是单子叶植物和双子叶植物。优选,该植物是人工培育的用于提供营养或者服务于技术的,特别是工业目的有用植物。优选为贮存淀粉的植物,例如谷类(黑麦,大麦,燕麦,小麦,小米,西米等等),水稻,豌豆,marrow pea,木薯和马铃薯;西红柿,油菜,大豆,大麻,亚麻,向日葵,豇豆或竹芋,纤维成形植物(如亚麻,大麻,棉花),产油植物(如油菜,向日葵,大豆)和蛋白贮存植物(如豆类植物,谷类植物,大豆)。本发明也涉及果树和棕榈。而且,本发明涉及草料类植物(如草料和牧草,如紫花苜蓿,苜蓿,黑麦草)和蔬菜植物(如西红柿,生菜,菊苣)和观赏植物(如郁金香,风信子).优选蔗糖贮存和/或淀粉贮存植物。特别优选甘蔗和甜菜,玉米,水稻,小麦和西红柿,而最优选马铃薯。
根据本发明的转基因植物可以通过利用本领域技术人员熟知的方法将外源核酸分子引入植物细胞并将转化的细胞再新生成植物来制备。
大多数的将DNA插入植物宿主细胞的技术可以利用。这些技术包括使用根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或者发根病土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)作为转化剂的T-DNA,原生质体融合,DNA的注射和电穿孔,使用轰击(biolistic)方法插入DNA以及其它可能来转化植物细胞。
使用土壤杆菌介导的植物细胞转化已经过广泛研究并在EP120516;Hoekema,InThe Binary Plant Vector System,Offsetdrukkerij Kanters B.V.,Alblasserdam(1985),第五章;Fraley等人,Crit.Rev.Plant Sci.第4卷(1993),第1-46页和An等人,EMBO J.第4卷(1985),第277-287页中充分描述。关于马铃薯的转化请参阅例如Rochas-Sosa等人(EMBO J.第8卷(1989),第29-33页)。
利用基于土壤杆菌的载体转化单子叶植物也被描述过(Chan等人,Plant Mol.Biol.第22卷(1993),第491-506页;Hiei等人,Plant J.第6卷(1994)第271-282页;Deng等人,Science in China第33卷(1990),第28-34页;Wilmink等人,Plant Cell Reports第11卷(1992),第76-80页;May等人,Bio/Technology第13卷(1995),第486-492页;Conner和Dormisse,Int.J.Plant.Sci.第153卷(1992),第550-555页;Ritchie等人,Transgenic Res.第2卷(1993),第252-265页)。另一种用于转化单子叶植物的系统是通过轰击方法(Wan和Lemaux,Plant Physiol.第104卷(1994),第37-48页;Vasil等人,Bio/Technology第11卷(1993),第1553-1558页;Ritala等人,Plant Nol.Biol.第24卷(1994)第317-325页;Spencer等人,Theor.Appl.Genet.第79卷(1990),第625-631页)、原生质体转化、电转穿孔部分通透的细胞、使用玻璃纤维插入DNA来转化。特别地,玉米的转化在文献中已被多次提到(参阅例如WO95/06128,EP 0 513 849,EP 0 465 875,EP 29 24 35;Fromm等人,Biotechnology第8卷,(1990),第833-844页;Gordon-Kamm等人,Plant Cell第2卷(1990),第603-618卷;Koziel等人,Biotechnology第11卷(1993),第194-200页;Moroc等人,Theor.Appl.Genet.第80卷,(1990),第721-726页)。其它谷类的成功转化也被描述过,例如大麦(Wan和Lemaux,见上;Ritala等人,见上,Krens等人,Nature第296卷(1982),第72-74页)和小麦(Nehra等人,Plant J.第5卷(1994),第285-297页)。
本发明还涉及转基因植物细胞,其优选包含于根据本发明的转基因植物中,所述细胞特征为减弱的内源ADK活性。关于产生这样的转基因细胞的特点和方式,采用了与上述转基因植物详细介绍的相同的说明和实施方案。
本发明还涉及包含根据本发明的植物细胞的本发明的植物的繁殖材料。术语“繁殖材料”包含了适合通过无性或者有性繁殖产生后代的植物成分或者部分。无性繁殖的合适方式是例如插条,愈伤组织培养物,根茎或者块茎。其它繁殖材料包括例如果实,种子,幼苗,原生质体,细胞培养物等等。优选的繁殖材料是块茎和种子。本发明还涉及本发明的植物的可收获部分,如,举例来说,果实,种子,块茎或者根茎。
本发明还涉及重组的核酸分子,包括(a)确保在植物细胞中转录的启动子;并且被有效地连接;(b)核酸分子,当在植物细胞中转录时,导致在所述植物细胞中内源ADK活性的降低;和可选地(c)转录终止信号。
关于启动子,转录终止信号,在(b)中提到的核酸序列和由所述的核酸分子编码的蛋白的亚细胞定位的优选实施方案,同样采用了上述所提到的根据本发明的转基因植物相关的方案。
本发明还涉及含有本发明重组核酸分子的载体。优选可以转化植物细胞的载体而最优选可以将核酸分子稳定整合入植物基因组的载体,例如二元载体(binary vector)。这样的载体在文献中已经广泛描述并且可以购买到。
另外,本发明涉及了使用根据本发明的重组核酸分子制备包含和表达外源核酸分子的转基因植物,当外源分子在宿主细胞中转录时,能够在所述的植物细胞中引起内源ADK的mRNA水平的降低。
本发明还涉及了显示出淀粉积累增加和/或者淀粉贮存部位,器官或者组织的产量增加的转基因植物的生产方法,其步骤包括(a)将核酸分子引入宿主细胞中,其在所述植物细胞基因组中的存在导致植物细胞中内源ADK活性的降低;(b)将从步骤(a)中所生产的转化细胞再生为植物;和可选地(c)从在步骤(b)中所生产的转基因植物生产后代。
术语“淀粉贮存部位,器官或者组织的产量增长”指任何上述提到的与产量相关,并可以依据本发明的供应可获得的改进,特别指淀粉贮存部位,器官或者组织的产量的增长,尤其是块茎或者谷粒,按照每个植物的鲜重,以淀粉贮存器官的数量,以每个植物的淀粉的重量或者每种可收获淀粉贮存器官的鲜重或者这些方面的任何组合来进行限定。
关于步骤(a),要引入的核酸分子可以是重组的核酸分子或者根据本发明以上所述的载体。
步骤(b)可以根据本领域技术人员熟知的方法来实行。
依据该方法的步骤(c)来产生后代包括无性和有性生殖繁殖。
本发明还涉及由根据本发明的方法获得的或者可以获得的转基因植物。
另外,本发明涉及如上所述的重组核酸分子或者载体在产生可以显示出淀粉积累增加和/或者贮存淀粉的部位,器官和组织的产量增加的转基因植物或者转基因植物细胞。
这些以及其它实施方案被公布并对本领域技术人员显而易见,而且由大量的本发明的说明和实施例所支持。可用于本发明的上述有关方法、手段和应用的其它相关文献,可以从现有技术获得,例如利用电子手段从公共图书馆获得。这个和其它的目的可以通过公共数据库得到,如“medline”,可以通过因特网连接,其地址是http//www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html。本领域技术人员已知其它的数据库和地址并且其可以通过因特网获得,例如地址http//www.lycos.com。关于生物技术领域专利和专利应用的资源和信息的概述包括在Berks,TIBTECH第12卷(1994),第352-364页中。
另外,无论何时在这里出现的术语“和/或”包括了“和”、“或者”和“全部或者任何由该术语连系的所述元素的其它组合”的意思。
上述引用的所有专利、出版物和数据库的公开内容在这里都以相同程度完整详细地引作参考文献,就如同这样的每个单独专利、出版物或者条目都被详细单独地引作参考文献。


图1显示了载体pBinAR-Kan的图谱,包含了马铃薯质体腺苷酸激酶(StpADK)的cDNA序列,它以反义方向被克隆到组成型CaMV35S启动子(Franck,Cell第21卷(1980),第285-294页)和根癌土壤杆菌的章鱼碱合成酶基因的终止子(ocs)之间。
图2显示了在野生型和转基因株系的叶片中StpADK转录物水平的RNA印迹。探针是通过核糖探针(riboprobe)方法制备自编码StpADK的全长cDNA。
图3显示了转基因株系中的腺苷酸含量。数据以每个株系的六个不同植物的平均值±SE的方式出示。
图4显示了转基因株系的淀粉含量。淀粉使用在图3中用以分析腺苷酸的发育中块茎的相同的样品测定。数据以每个株系的六个不同植物的平均值±SE的方式出示。
下列的实施例用以进一步阐明本发明。
在这些实施例中使用了以下的材料和方法。
1.分子生物学技术除非另有说明,所有重组DNA技术都根据在Sambrook等人(1989),Molecular CloningA Laboratory Manual.Cold SpringHarbor Laboratory Press,NY或者在Ausubel等人(1994),CurrentProtocols in Molecular Biology,Current Protocol的卷1和卷2中所描述的实行。植物分子工作的标准材料和方法被记述于R.D.D.Croy的Plant Molecular Biology Labfase(1993),由BIOS ScientificPublication Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications共同出版。
2.植物材料马铃薯植物(Solaum tuberosum L.栽培种Desiree获自Saatzucht Lange AG,Bad Schwartau,德国)生长在组织培养条件下,以含有2%蔗糖的MS培养基(Murashige和Skoog,PhysiologiaPlantarum第15卷(1962),第473-497页),16小时日光,8小时暗的方式维持。在温室中,植物以相同光照方式生长,在22℃,每平方米每秒至少250μm光子。与本发明相关,术语“发育中的块茎”用于指在从健康的10周龄的植物上收获的块茎(大于10g FW);“成熟的块茎”用于指自衰老的植物上收获的块茎。
3.转基因反义株系的制备为了获得编码马铃薯质体腺苷酸激酶的cDNA,用从相应的玉米基因(Shen,Plant Mol.Biol.第26卷(1994),第1085-1101页)衍生的探针筛选按照在Kossmann(Mol.Gen.Genet.第230卷(1992),第39-44页)中所述制备的马铃薯块茎cDNA文库。探针由PCR扩增从玉米的基因组DNA制备,使用了40个循环的程序,以退火温度40℃和引物M-AdK5’(SEQ ID NO3)和M-AdK3’(SEQ IDNO4),得到从相应玉米cDNA序列(Genbank/EMBL数据库,登录号T25266)所期望的400bp片段。筛选cDNA文库的操作使用Denhardt’s缓冲液,在65℃洗3小时,挑出阳性噬菌体并将克隆在体内切出。这些然后用EcoRI消化以鉴定其为正确的阳性克隆。从筛选中获得的阳性cDNA克隆包含一个被克隆到pBluescriptSK载体EcoRI/XhoI位点间的大约900bp的片段(SEQ ID NO1),它经过用玉米基因进行同源鉴定被证明编码质体腺苷酸激酶。
这个cDNA片段在Asp 718/XbaI位点酶被切出并连接到载体pBinAR-Kan(Liu等人,Molecular and General Genetics第223卷(1990),第401-406页)的相应限制性位点上,位于CaMV 35S启动子和ocs终止子之间,如图1所示。这个载体由使用土壤杆菌介导的转化方法(Rocha-Sosa等人,EMBO J.第8卷(1989),第23-29页)引入马铃薯植物中。转基因植物在含有卡那霉素的培养基上进行筛选(Dietz等人,1995年,InGene transfer to plants XXII,Potrykus I.和Spangenberg,G.编,Berlin,Springer-Verlag,第24-29页)。最初对大约80个株系的筛选通过测定在温室条件3.5升培养罐中所生长的植物上所收获的块茎的密度和产量的来进行。第二次筛选用从第一轮温室中得到的九个株系中每个株系六个植物的块茎和叶子在转录物和酶活性水平进行。转录物的测定(图2)使用在Schenborn(Nucl.Acids Res.第13卷(1985),第6223页),Krieg(Meth.Enzymol.第155卷(1987),第397页)和Promega技术手册#016中所描述的核糖探针方法实行。
4.生物化学分析淀粉、糖、氨基酸和糖分解代谢物完全按照在Trethewey等人(Plant Cell and Environment第22卷(1999),第71-79)中所述测定,而核苷酸使用HPLC系统依据在Geigenberger等人(Planta第205卷(1999),第428-437页)所述进行。
在重复的分析中(实施例2),淀粉、糖、糖分解代谢物和核苷酸完全按照在Geigenberger等人(Planta第205卷(1998),第428-437页)所述测定,氨基酸则依据Geigenberger等人(Plant Cell andEnvirronment第19卷(1996),第43-55页)。腺苷酸激酶活性使用Kleczkowski和Randall的方法(Plant Physiol.第81卷(1986),第1110-1114页)在叶片和块茎样品中和使用Tauberger等人描述的方法(Plant J.第23卷(2000),第43-53页)分离的叶片叶绿体中测量。无论野生型或者转基因组织,由胞质内标记酶在制备过程中的污染没有超过10%。其它淀粉合成的酶按照在Fernie等人(Planta第213卷(2001),第418-426页)所述测量。
实施例1反义ADK转基因马铃薯植物的形态学和生物化学分析本工作的目的是确立在马铃薯块茎淀粉质体中质体腺苷酸激酶对于生物合成途径的重要性。为了这个目的,编码马铃薯腺苷酸激酶质体同工型(StpADK)的cDNA被克隆(SEQ ID NO1具有SEQ IDNO2中显示的推测的氨基酸序列)。它具有一个有功能的质体定位序列(SEQ ID NO2的第1到78位)。使用反义方法,依据上述方法产生的转基因植物显示出StpADK基因表达的降低。因此,这些株系展现出显著降低的整体腺苷酸激酶活性(下降至野生型活性的75%)。而且,可以证明损失的活性定位在质体。质体ADK活性降低的转化株系在形态上一般没有出现大的变化。但是,转基因植物的块茎的形态与野生植物的不同。具体来讲,块茎的密度比野生型植物显著增加(参阅表1)。
当分析转基因块茎中的代谢物时,淀粉含量非常明显地大大增加了(表2)。所有研究的转基因反义株系都显示出显著的淀粉积累升高,以微摩尔葡萄糖相对于鲜重(FW)来衡量,比野生型块茎升出达162%。而且,碳水化合物合成途径的中间代谢产物二磷酸尿苷葡萄糖(UDP glucose)、6-磷酸葡萄糖、3-磷酸甘油酸酯、磷酸丙糖和ADP-葡萄糖以及腺苷酸的含量都进行了测定(表3)。
最值得注意的是,腺苷酸(ANT)的总量大大增加了,考虑到ADK所催化的反应,这个结果出人意料。类似的,事先未预测到在转基因块茎中所观察到的ATP/ADP比例的降低。作为降低的ADK活性的进一步结果,氨基酸含量在转基因块茎中也显著升高了(表4)。所有研究的转基因植物都显示出氨基酸总含量的增加。某些氨基酸,在必需氨基酸中,如亮氨酸、甲硫氨酸和色氨酸,其含量尤其增高,而其它保持在与野生型块茎相当的范围内。综上,在质体ADK活性降低的植物中发现淀粉和氨基酸含量极大增加。淀粉和氨基酸的生物合成都非常依赖于对质体的ATP供应,由此这些结果表明腺苷酸激酶也在体内ATP消耗方面起作用。因此可以得出结论质体腺苷酸激酶必定代表了质体生物合成的能量的限制因素。
参数 WTAdK-2 AdK-4 Adk-14 AdK-20 AdK-24AdK-28块茎数量 10.3±0.8 9.0±0.48.8±1.9 12.0±1.514.0±3.8 7.5±1.1块茎产量 365±43 357±22 324±37 310±25 377±34275±30块茎平均鲜重(g) 35.4 397 36.830.2 25.8 26.9 36.7密度 1.086± 1.093± 1.098±1.091± 1.096± 1.091±1.091±0.006 0.004 0.002 0.001 0.0010.005 0.003表1.反义StpAdK转基因株系的产量、密度、平均块茎大小和数量。马铃薯植物在温室的3.5升培养罐中生长。用春季收获的每个株系10-15个植物对完全成熟植物的成熟的块茎测量转基因块茎产量(块茎的总鲜重),块茎数量和密度。数值为平均值±SE。 表示对于株系ADK-14只有一个植物进行了分析。
WT AdK-2 AdK-4 Adk-1 4AdK-20 AdK-24 AdK-28淀粉471±48678±81632±63693±37590±38752±47588±48表2.反义StpADK转基因块茎中的碳水化合物含量。马铃薯植物在温室的2.5升培养罐中生长。发育中的块茎在生长10周后在秋季收获并且对蔗糖、葡萄糖和淀粉含量进行了测定。数据以每克鲜重的葡萄糖微摩尔数(μmol葡萄糖gFW-1)表示并代表了每个株系六个植物测定的平均值±SE。
nmolgFW-1min-1WT AdK-2 AdK-4 Adk-14 AdK-20 AdK-24 AdK-28UDPglc88±2 85±11 71±10 93±6 86±5 89±9 74±5Glc-6-P 139±8 113±6 101±6 131±7 131±6 148±12 75±73-PGA 83±13 69±11 71±11 76±14 68±10 105±17 80±13Triose-P 5.4±1.24.0±0.52.6±0.4 4.6±1.5 2.2±0.3 3.2±0.44.3±0.8ATP 24±3 32±4 29±4 33±2 21±1 28±4 26±3ADP 13±1 24±5 25±2 25±2 19±1 20±1 26±2AMP 9.1±0.913.±1.613.±1.2 17.±2.3 14.±1.1 13.±1.712.±0.98 2 3 2 9 4Total ANTs46.±2.469.±6.570.±4.1 75.±3.4 54.±2.2 62.±2.863.±3.97 6 0 2 6 1 8ADPglc0.1±0.01.0±0.21.0±0.2 0.3±0.1 0.4±0.1 0.4±0.10.6±0.102 99 24 21 10 90 12比率ATP/ADP 2.0±0.31.5±0.21.0±0.1 1.4±0.1 1.1±0.0 1.4±0.21.0±0.127 04 62 02 82 66 67能量交换 0.6±0.00.6±0.00.6±0.0 0.6±0.0 0.5±0.0 0.6±0.00.6±0.063 23 13 13 71 14 12ADK常数 0.8±0.21.4±0.52.1±0.1 1.1±0.1 1.1±0.1 1.2±0.32.1±0.201 63 09 69 54 61 56表3.反义转基因块茎中的代谢物含量。马铃薯植物在温室的2.5升培养罐中生长。发育中的块茎在生长10周后在秋季收获并且对代谢物含量进行了测定。数据以每克鲜重纳摩尔数(nmol gFW-1)表示并代表了每个株系六个植物测定的平均值±SE。
(umolg FW-1) WT AdK-2 AdK-4 Adk-14 AdK-20 AdK-24 AdK-28丙氨酸 0.65±0.08 1.35±0.38 1.03±0.04 1.17±0.48 1.07±0.2 0.80±0.49 1.12±0.17精氨酸 2.55±0.43 4.01±0.34 3.47±0.2 3.18±0.82 3.54±0.80 3.85±0.60 2.81±0.11天冬酰胺28.3±1.05 32.8±3.55 32.6±3.03 33.1±8.7 37.7±10.1 33.7±5.1 36.7±5.21天冬氨酸2.10±0.07 1.87±0.25 2.17±0.23 1.99±0.41 1.89±0.46 2.07±0.25 1.96±0.11谷氨酸 3.89±0.40 4.57±0.54 5.14±0.48 4.90±0.89 4.64±0.81 4.64±0.81 5.03±0.33谷酰胺 9.21±1.04 9.24±0.95 10.5±1.63 8.27±2.61 8.30±2.19 8.64±1.71 8.65±1.03甘氨酸 0.25±0.02 0.32±0.04 0.29±0.02 0.30±0.05 0.28±0.04 0.28±0.04 0.26±0.02组氨酸 0.69±0.06 1.00±0.11 0.91±0.09 0.76±0.21 1.08±0.23 1.02±0.02 0.73±0.02异亮氨酸1.06±0.04 1.74±0.02 1.31±0.12 1.09±0.29 1.76±0.37 1.67±0.28 1.27±0.09亮氨酸 0.22±0.04 0.90±0.17 0.47±0.08 0.38±0.07 0.70±0.22 0.87±0.20 0.45±0.08甲硫氨酸0.85±0.05 1.44±0.12 1.17±0.13 1.22±0.34 1.37±0.26 1.29±0.19 1.51±0.18苯丙酸 0.79±0.03 1.45±0.21 1.07±0.12 0.98±0.27 1.51±0.35 1.42±0.28 1.21±0.09赖氨酸 1.22±0.15 2.28±0.20 1.48±0.17 1.25±0.29 2.03±0.41 2.16±0.35 1.65±0.14丝氨酸 0.72±0.06 1.10±0.17 0.94±0.07 0.73±0.17 0.84±0.17 0.93±0.11 1.04±0.07苏氨酸 0.47±0.04 0.44±0.04 0.48±0.03 0.41±0.10 0.50±0.10 0.46±0.07 0.45±0.02色氨酸 0.09±0.04 0.38±0.06 0.31±0.05 0.27±0.05 0.28±0.09 0.39±0.06 0.26±0.15酪氨酸 0.66±0.08 1.18±0.13 0.79±0.05 0.57±0.14 1.06±0.25 1.10±0.18 0.68±0.04缬氨酸 2.77±0.22 3.76±0.43 3.12±0.26 2.70±0.70 3.68±0.73 3.79±0.60 2.90±0.11γ氨基丁酸 5.88±0.41 5.08±0.84 5.50±0.25 4.91±1.35 5.78±0.88 4.73±0.57 4.65±0.3总氨基酸62.4±3.8 75.0±7.3 72.9±4.8 68.1±17.6 78.3±18.2 74.3±10.4 71.7±6.5
表4.反义转基因块茎中的氨基酸含量。马铃薯植物在温室的2.5升培养罐中生长。发育中的块茎在生长10周后在春季收获并且对氨基酸含量进行了测定。数据以每克鲜重微摩尔数(μmol gFW-1)表示并代表了每个株系六个植物测定的平均值±SE。
实施例2反义ADK转基因马铃薯植物在温室条件和在大田试验中的重复分析。
转基因株系AdK-20,-4,-2和-24再次生长于温室条件和大田并对其形态学和生物化学参数进行了研究和分析。
当转基因植物与野生型对照生长于温室中时,在株系AdK-20或者AdK-4中没有表型的变化,包括植物的空气中部分或者块茎的大小、数目或者形态,然而发现在株系AdK-2中块茎的总产量有显著增加并且在株系AdK-24中块茎数目和产量都有显著增加(表5)。而且块茎的具体密度在株系AdK-20,AdK-2,和AdK-24中升高了,这表明这些株系最有可能被鉴定为有更高的淀粉含量。
表5反义StpAdK植物的每个植物的产量、块茎数量、密度和淀粉产量。马铃薯植物生长在温室的2升培养罐中或者在大田条件下。在两种情况下都对完全成熟的植物进行检测。数据代表了每个株系六个植物(温室试验)或者每个株系八个植物(大田试验)测定的平均值±SE;粗体和有下划线的数据通过t-测试测定与野生型有显著差异(P<0.05)。n.m.=未测量。
参数 WTAdK-20 AdK-4 AdK-2 AdK-24温室试验1999块茎总产量(g) 309±37 287±28 327±41366±19 541±57块茎数量 8.3±1.0 7.2±1.4 10.4±0.9 11.9±2.1 16.6±3.3具体密度 1.087±0.005 1.091±0.007 1.093±0.003 1.096±0.002 1.099±0.010大田试验2001块茎总产量(g) 867±81 1460±74 1486±54 n.m. 1596±97块茎数量 7.9±0.8 11.2±0.310.6±0.4 n.m. 7.9±0.5具体密度 1.072±0.001 1.080±0.003 1.081±0.003 n.m. 1.081±0.002淀粉(克每植株) 106±11 202±10 209±9 n.m. 224±17在叶片中腺苷酸激酶的总活性被发现降低到野生型植物的67%,,在块茎中也达到类似的程度(表6)。
表6.在反义StpAdk转基因株系中的酶活性。活性是在6周的叶片或者10周龄的块茎中测定。数据代表了每个株系六个植物测定的平均值±SE(叶绿体只从每个株系的四个植物中分离)。粗体和有下划线的数值通过t-测试测定与野生型有显著差异(P<0.05)。n.m.=未测量,Sol.=可溶的和GB=颗粒物(granule bound)Φ。分枝酶的活性表示为糖原磷酸酶的激活倍数(μmolg FW-1min-1)WT AdK-20 AdK-4 AdK-2AdK-24腺苷酸激酶活性叶子21.3±3.217.2±1.4 17.4±0.6 15.7±2.214.4±1.8分离的叶绿体12.4±1.7n.m. 8.3±1.2 7.1±2.1 5.6±0.9块茎15.2±2.112.0±1.4 11.3±0.9 10.6±1.39.7±1.7其他块茎酶活性葡萄糖磷酸变位酶4117±320394±426 430±123 402±279 387±1921 7 11AGP酶 519±73 550±34637±23620±61 717±12Sol.淀粉合成酶 143±27 149±7 108±32158±32 109±21GB淀粉合成酶31±430±3 27±6 34±431±5分枝酶 6921±107732±478 582±129 724±202 784±32814 41 13 1此外,从野生型和转基因植物的叶片分离的叶绿体的腺苷酸激酶分析显示活性的丧失位于质体,这与根据亚细胞定位序列预测的相一致。淀粉生物合成途径中的其它酶的活性很少变化,只有株系AdK-24的AGP酶活性与野生型中的有显著差别(更高)。
StpAdK活性的降低导致了腺苷酸库的普遍增加。如上所述,腺苷酸激酶催化ATP、ADP和AMP之间的互相转化。为了分析降低的腺苷酸激酶活性对于腺苷酸库的影响,对所有三种直接介入反应的代谢物的稳定状态水平和ADP-葡萄糖进行测定。质体腺苷酸激酶活性的降低导致了不同的腺苷酸库水平的清晰变化(图3)。只在其中的一个抑制最强烈的株系中,如以增加的个别氨基酸库大小为基础预期的,块茎的氨基酸总含量也显示出增长的趋势,但是由于更大的变化,这种增长在统计学上并不显著。
序列表<110>Max-Planck-Gesellschaft zur Frderung der Wissenschaften e.V.
<120>具有降低的腺苷酸激酶活性并表现淀粉积累增加的转基因植物<130>F 1221 EP<140>
<141>
<160>4<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>888<212>DNA<213>马铃薯<220>
<221>CDS<222>(1)..(888)<400>1ctc cgg gag aat ttt ccg gca atg gcg gcc atg atc cgc ctg ttc aga 48Leu Arg Glu Asn Phe Pro Ala Met Ala Ala Met Ile Arg Leu Phe Arg1 5 10 15tct tca tca tct tcc tca tcc aat tca att tcc ctt atc agt aga tct 96Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asn Ser Ile Ser Leu Ile Ser Arg Ser20 25 30tta tct aca gca gct gca tct gag aca gtg aaa tcc caa tct tac cct 144Leu Ser Thr Ala Ala Ala Ser Glu Thr Val Lys Ser Gln Ser Tyr Pro35 40 45cat aat ccc cat tct aca agt gtt gat ccc aag gct aaa act gtc caa 192His Asn Pro His Ser Thr Ser Val Asp Pro Lys Ala Lys Thr Val Gln50 55 60tgg gtc ttt ttg ggt tgt ccc ggt gtc gga aaa ggt aca tat gct agc 240Trp Val Phe Leu Gly Cys Pro Gly Val Gly Lys Gly Thr Tyr Ala Ser65 70 75 80cgt ctt tca acc ctt tta ggc gtt cct cat att gct acc gga gat ctt 288Arg Leu Ser Thr Leu Leu Gly Val Pro His Ile Ala Thr Gly Asp Leu85 90 95gtt cgt gat gag ttg aaa tct tca ggt cct ttg tcg aaa caa ctt gca 336Val Arg Asp Glu Leu Lys Ser Ser Gly Pro Leu Ser Lys Gln Leu Ala100 105 110gag att gtc aac caa gga aaa ttg gtt tca gat gag att ata ctg aat 384Glu Ile Val Asn Gln Gly Lys Leu Val Ser Asp Glu Ile Ile Leu Asn115 120 125tta cta tct aaa agg ctc gag agt ggg gaa gct aag ggt gaa gct gga 432Leu Leu Ser Lys Arg Leu Glu Ser Gly Glu Ala Lys Gly Glu Ala Gly
130 135 140ttc ata ctt gat gga ttc cct aga act gtg aga caa gca gaa ata ctg 480Phe Ile Leu Asp Gly Phe Pro Arg Thr Val Arg Gln Ala Glu Ile Leu145 150 155 160act gag gtt aca gac ata gat ttg gtg gtt aat ctc aag ctt cca gag 528Thr Glu Val Thr Asp Ile Asp Leu Val Val Asn Leu Lys Leu Pro Glu165 170 175cgg gta ttg gtt gag aaa tgc ctt ggc cga agg atc tgc agt gaa tgt 576Arg Val Leu Val Glu Lys Cys Leu Gly Arg Arg Ile Cys Ser Glu Cys180 185 190gga aag aat ttc aac gtg gca tct ata gat gtc gct ggt gaa aat ggg 624Gly Lys Asn Phe Asn Val Ala Ser Ile Asp Val Ala Gly Glu Asn Gly195 200 205gct cct agg atc agc atg gct cgg ctt aac ccc ccc ttc aca gtg tgt 672Ala Pro Arg Ile Ser Met Ala Arg Leu Asn Pro Pro Phe Thr Val Cys210 215 220ttc aag tta atc act cga gca gat gat aca gaa gct att gtt aag gaa 720Phe Lys Leu Ile Thr Arg Ala Asp Asp Thr Glu Ala Ile Val Lys Glu225 230 235 240agg ctc agt ata tac tgg gat aag agt cag cct gtt gag gac ttc tac 768Arg Leu Ser Ile Tyr Trp Asp Lys Ser Gln Pro Val Glu Asp Phe Tyr245 250 255cgt agc caa gga aag tta ctg gaa ttt gat tta ccg gga ggc att cct 816Arg Ser Gln Gly Lys Leu Leu Glu Phe Asp Leu Pro Gly Gly Ile Pro260 265 270gaa tca tgg cct aag ttg ctg gaa gtt ctc aac ctt gat gaa cag gaa 864Glu Ser Trp Pro Lys Leu Leu Glu Val Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu275 280 285tat aaa ctg tct cct gca gct tag 888Tyr Lys Leu Ser Pro Ala Ala290 295<210>2<211>295<212>PRT<213>马铃薯<400>2Leu Arg Glu Asn Phe Pro Ala Met Ala Ala Met Ile Arg Leu Phe Arg1 5 10 15Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asn Ser Ile Ser Leu Ile Ser Arg Ser20 25 30Leu Ser Thr Ala Ala Ala Ser Glu Thr Val Lys Ser Gln Ser Tyr Pro35 40 45His Asn Pro His Ser Thr Ser Val Asp Pro Lys Ala Lys Thr Val Gln50 55 60Trp Val Phe Leu Gly Cys Pro Gly Val Gly Lys Gly Thr Tyr Ala Ser65 70 75 80Arg Leu Ser Thr Leu Leu Gly Val Pro His Ile Ala Thr Gly Asp Leu
85 90 95Val Arg Asp Glu Leu Lys Ser Ser Gly Pro Leu Ser Lys Gln Leu Ala100 105 110Glu Ile Val Asn Gln Gly Lys Leu Val Ser Asp Glu Ile Ile Leu Asn115 120 125Leu Leu Ser Lys Arg Leu Glu Ser Gly Glu Ala Lys Gly Glu Ala Gly130 135 140Phe Ile Leu Asp Gly Phe Pro Arg Thr Val Arg Gln Ala Glu Ile Leu145 150 155 160Thr Glu Val Thr Asp Ile Asp Leu Val Val Asn Leu Lys Leu Pro Glu165 170 175Arg Val Leu Val Glu Lys Cys Leu Gly Arg Arg Ile Cys Ser Glu Cys180 185 190Gly Lys Asn Phe Asn Val Ala Ser Ile Asp Val Ala Gly Glu Asn Gly195 200 205Ala Pro Arg Ile Ser Met Ala Arg Leu Asn Pro Pro Phe Thr Val Cys210 215 220Phe Lys Leu Ile Thr Arg Ala Asp Asp Thr Glu Ala Ile Val Lys Glu225 230 235 240Arg Leu Ser Ile Tyr Trp Asp Lys Ser Gln Pro Val Glu Asp Phe Tyr245 250 255Arg Ser Gln Gly Lys Leu Leu Glu Phe Asp Leu Pro Gly Gly Ile Pro260 265 270Glu Ser Trp Pro Lys Leu Leu Glu Val Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu275 280 285Tyr Lys Leu Ser Pro Ala Ala290 295<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>3atg aaa tta tca tca atc ttt tg23<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工序列<400>4ggt aga aac ctt cca aag g 19
权利要求
1.转基因植物,其特征在于内源的腺苷酸激酶的活性被降低了。
2.权利要求1的转基因植物,其中所述腺苷酸激酶具有质体定位。
3.权利要求1或2的转基因植物,其中所述腺苷酸激酶由选自下列的多核苷酸编码(a)编码含有SEQ ID NO.2中所述氨基酸序列的多肽的多核苷酸;(b)包含SEQ ID NO.1中所述核苷酸序列的多核苷酸;(c)与(a)和(b)中的多核苷酸的互补链杂交的多核苷酸;以及(d)多核苷酸,其核苷酸序列由密码子简并性衍生自(c)的多核苷酸。
4.权利要求1-3任意一项的转基因植物,其中由于在所述植物的基因组中存在外源核酸分子,所述内源腺苷酸激酶的活性降低。
5.权利要求4的转基因植物,其中所述降低的内源腺苷酸激酶活性由反义、共抑制、核酶或RNA干涉作用或者体内突变、抗体表达或由显性失活突变的表达来实现。
6.权利要求5的转基因植物,其中所述外源核酸分子与编码所述腺苷酸激酶的基因的转录物互补,其有效连接于允许在植物中表达的启动子。
7.权利要求6的转基因植物,其中启动子允许在植物细胞中的组成型表达。
8.权利要求1-7任何一项的转基因植物,其为淀粉贮存植物。
9.权利要求8的转基因植物,其为马铃薯植物。
10.转基因植物细胞,其中内源腺苷酸激酶活性降低了。
11.含有权利要求10的转基因植物细胞的权利要求1-9任何一项的转基因植物的繁殖材料或可收获部位。
12.重组核酸分子,包括(a)确保在植物中转录的启动子;并有效连接(b)核苷酸序列,当其在植物细胞中转录时,其在所述植物细胞中导致内源腺苷酸激酶活性降低;以及可选地(c)转录终止信号。
13.权利要求12的重组核酸分子,其中(b)中限定的核酸序列是权利要求1-7任何一项中限定的核酸分子的核酸序列。
14.显示淀粉积累增加和/或淀粉贮存部位、器官或组织的产量增加的转基因植物的生产方法,包括以下步骤(a)将核酸分子引入植物细胞,其在所述植物的基因组中的存在导致植物细胞中内源腺苷酸激酶活性降低;(b)将从在步骤(a)中生产的转化的细胞再生成植物;及可选地(c)从在步骤(b)中生产的转基因植物生产后代。
15.权利要求12或13的重组核酸分子在生产显示淀粉积累增加和/或淀粉贮存部位、器官或组织的产量增加的转基因植物中的用途。
全文摘要
这里所描述的是转基因植物由于植物细胞的内源腺苷酸激酶活性降低而表现出淀粉积累的增加和/或者淀粉贮存部位、器官或组织的产量增加。从而,这样的降低可以通过向植物基因组中转入核酸分子来达到,如一段编码合适的反义RNA的核酸分子。而且,产生这些植物的重组核酸分子和方法也作了描述。
文档编号C12N5/10GK1516736SQ02807992
公开日2004年7月28日 申请日期2002年4月9日 优先权日2001年4月9日
发明者B·雷吉尔, A·R·福尼, P·杰根伯格, J·卡斯曼, B 雷吉尔, 孤, 福尼 申请人:马普科技促进协会

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