新型表达载体的制作方法
专利名称：新型表达载体的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及载体及其在基因表达或基因调节分析中的用途。更具体而言，本发明提供了表达载体和/或报道载体，其蛋白质表达动力学具有改善的时间相关的启动子活性。本发明特别提供用于调节基因表达、鉴定和分析调节序列的新型载体和细胞系，用于治疗性干预人类疾病及药物筛选的新的靶标和试剂。
背景技术：
在本说明书中按作者引用的出版物的参考文献细节汇集于说明书末尾。
此处参考的现有技术，包括任何一份或多份现有技术文件，不应视为是认可或提示该现有技术属于当前技术水平。
重组DNA技术日益精深，极大促进了医疗及相关健康领域的研究和开发。利用表达载体研究基因表达是特别重要的研究领域。然而迄今为止，缺少合适设计的载体限制了对基因表达的实时分析。
报道分子分析可以了解是什么控制目的基因表达，例如DNA序列、转录因子、RNA序列、RNA结合蛋白质、信号转导途径以及特定的刺激物。
此外，报道分子分析可用于鉴定基因调节因素，作为治疗性干预人类疾病的新靶标。报道分子测定可潜在用于筛选能够改变基因表达的药物。然而，现有报道分析系统所需费用和时间，加之过长的反应时间，限制了其应用。
基因组序列一般在编码区上游具有启动子序列，决定细胞的转录特异性和可诱导性，从而影响蛋白质产物的表达水平。
特定的序列元件一般富含核苷酸碱基A和U，并常位于基因的3’-UTR，影响mRNA的稳定性，因而影响蛋白质产物的表达水平。RNA结合蛋白质与某些mRNA序列结合，从而调节mRNA稳定性和蛋白质表达。其它序列调节翻译效率。
报道基因分析常用于研究调节转录的DNA序列。这些序列一般位于转录起始位点5’端的启动子区域。将上述DNA元件克隆到报道质粒的相似位点进行测试，使其驱动和/或调节转录，从而表达报道蛋白质。报道蛋白质应该可以同内源性蛋白质相区分，并易于定量。使用了多种报道蛋白质，最常用的是萤光素酶、氯霉素转移酶(CAT)以及β半乳糖苷酶(β-gal)。
利用合适的分析定量报道蛋白质，经常相对于普通启动子(例如SV40启动子)驱动的对照报道分子的水平而表示。对照报道分子必须可以与待测报道分子相区分，并包含于与待测载体共转染的独立载体中，用于控制转染效率。上述分析根据的前提是，细胞按比例摄取等量的两种载体。质粒载体的瞬时转染最常使用。
上述分析用于鉴定启动子区或启动子内部特定元件。另外用于研究启动子或调节元件对各种刺激物的反应。某些应用将报道构建体或转染的细胞置于生物体中，在体内研究启动子的功能。
报道分子分析的另一应用在于研究或测定特定启动子上游的信号转导途径。例如，可以将依赖有丝分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)转录的启动子连接到报道构建体，用于测定细胞中MAPK活化的水平(或MAPK依赖的转录)。该技术可与多种信息性启动子或增强子利用，并应用于细胞或活生物体，例如转基因小鼠。例如，可以使用光子成像仪测定在包含与目的启动子相连的萤光素酶报道分子的整个小鼠中萤光素酶报道分子的活性(Contag等人，1997)。
萤光素酶是迄今最常用的报道分子体外分析系统。双萤光素酶分析(DLA；Promega，Madison，WI，USA)是对其它萤光素酶系统的改进，即待测和对照报道分子可以基本上在同一分析中进行测定。下文提供当前使用的典型DLA方案的实例将推定的启动子元件克隆到萤火虫萤光素酶报道基因上游，使之驱动其表达。将该质粒与包含SV40启动子驱动的肾海鳃萤光素酶基因的对照质粒一起瞬时转染细胞系。～2-50％的细胞摄取质粒并表达报道分子～3天。表达动力学包括在最初24小时升高，积累萤光素酶蛋白质，随后～48小时下降，细胞内质粒数目减少。转染24-48小时以后，收集细胞并裂解。细胞裂解物与萤火虫萤光素酶特异性底物温育，使用发光计测定活性(发光)(96孔板或单个样品)。然后加入失活萤火虫萤光素酶但允许肾海鳃萤光素酶发光的另外底物。从而测定肾海鳃萤光素酶活性。
萤火虫萤光素酶活性水平不仅依赖于启动子活性，而且依赖于转染效率。根据DNA数量、DNA制剂的质量和细胞状态，其变化很大。共转染的对照质粒(SV40启动子驱动的肾海鳃萤光素酶)用于修正这些变数，依据的前提是，肾海鳃萤光素酶活性与细胞摄取的萤火虫萤光素酶质粒的数量成正比。数值可以表示为萤火虫萤光素酶活性/肾海鳃萤光素酶活性。
双萤光素酶分析的缺点如下(i)试剂昂贵、易变质，必须新鲜制备。
(ii)该分析一般包括细胞裂解物的制备，耗时并引入误差，例如裂解期间的细胞损失、移液误差、残留缓冲液/培养基使体积改变。
(iii)每个样品只得到细胞群体总活性的一个数据点。不能获得表达报道分子细胞的百分比以及每一细胞的表达量的有关信息。
(iv)转染对照(肾海鳃)并不总能修正转染效率的极大变动，这是因为a.某些DNA制剂转染/表达较差(也许由于超螺旋DNA的比例减少)，但并不引起共转染的对照质粒的数量相应下降。
b.有证据表明，这两个质粒的启动子之间串扰(cross-talk)，使对照报道分子的活性有赖于共转染的构建体，例如肾海鳃萤光素酶在与包含强启动子的质粒共转染时似乎表达最高。启动子之间的干扰若不加防止，也限制表达待测与对照两种报道分子的单个质粒的使用。
c.转录和转录后研究常用于测定各种刺激物(例如PMA、EGF、激素)的活化/抑制。不巧的是，SV40、RSV、TK以及可能许多其它普遍表达的启动子可由多种刺激物活化。由于这些启动子用于驱动转染的对照报道分子(肾海鳃)的表达，这些报道分子不能真实反映经上述处理后的转染效率。(Ibrahim等人2000)。
d.萤火虫与肾海鳃萤光素酶蛋白质、也可能mRNA的半衰期差异使整个系统具有很强的时间敏感性。
e.发光迅速减弱，特别是肾海鳃萤光素酶，要求测定时间绝对精确。
f.萤光素酶蛋白质和mRNA相对较长的半衰期可有效掩盖转录的时间变化(例如在各种刺激物或处理以后)。
在现有的转录后/mRNA稳定性报道分子分析中，将据认为影响mRNA稳定性的候选元件克隆到由组成型启动子例如SV40或RSV驱动的报道载体(例如萤火虫萤光素酶)的相应区域。假定相对于空载体(无目的元件的相同载体)的表达变化为改变mRNA稳定性的结果。与初步描述的转染分析相同，将转染对照质粒(例如，组成型启动子(例如SV40或RSV)驱动的肾海鳃萤光素酶)共转染，以修正转染效率。这些分析具有以下其它缺点(i).现有载体并未设计用于转录后研究，也未意在阻断转录。
(ii).这些方案的目的是研究候选mRNA元件的转录后影响。然而，这些元件还可以在DNA水平影响报道分子的转录。此外，由于并未使用目的基因的内源性启动子，所观察到的任何转录影响可能几乎没有生理意义。
存在用于研究mRNA稳定性的系统，但涉及直接测定mRNA，而非报道蛋白质。由于定量mRNA的方法具有工作量大的特点，上述系统相当耗时。
例如，一种系统利用c-fos启动子通过短暂的突发转录(abrief burst of transcription)响应血清诱导。将推定的不稳定性元件克隆到β球蛋白(BBB)构建体的3-UTR，该构建体在血清诱导型启动子(c-fos)控制下表达非常稳定的mRNA。转染的细胞(一般是NIH 3T3细胞)首先经受血清饥饿，然后接触包含血清的培养基。转录反应的短暂特性使得报道分子mRNA降解的动力学按时间过程进行。这些测定具有以下缺点(i).该分析非常耗时，因而不适用于快速筛选。
(ii).只能用于支持c-fos启动子的血清诱导性的细胞中。例如，许多肿瘤细胞系在无血清时仍维持c-fos启动子活性。
(iii).在诸如NIH 3T3等具有所需血清反应的细胞中，去除血清导致细胞周期阻断，随后加入血清则使细胞同步解除阻断。因此，只能在细胞周期的特定阶段测定mRNA稳定性。
(iv).除活化c-fos启动子之外，血清活化许多其它途径，引入了不必要的变数，并妨碍对更特异性刺激物的研究。
在另一分析中，利用药物例如抑制所有基因转录的放线菌素D处理细胞。按时间过程测定mRNA水平，确定mRNA降解速率。该系统用于研究内源性基因，并具有以下缺点(i).转录抑制物在所需剂量下毒性极大，以致mRNA稳定性经常在压力或垂死细胞中进行测定。
(ii).转录抑制物具有许多不必要的活性，包括稳定某些mRNA。
(iii).该方法阻断所有基因的转录，因而阻断许多信号转导级联，而活化另外一些。因此，结果可能没有生理意义。
(iv).该技术工作量极大。
(v).该技术在测定内或测定间变动极大。
(vi).该技术对于瞬时转染的报道分子分析，尤其在转染效率低的细胞中，经常不够敏感。
因此有必要开发改进的载体和系统，用于进行基因表达分析，特别是翻译后和转录后分析以及能更实时测定基因表达变化的分析。
发明概述贯穿本说明书，除非上下文需要，否则单词包含(comprise)及其变体(例如comprises和comprising)应当理解为，是指包含所述整体或步骤、或整体或步骤组，但不排除任何其它的整体或步骤、或整体或步骤组。本发明范围不受此处所述特定实施方案的限制，其仅仅用于例证目的。如此处所述，功能性等价产物、组合物和方法显然位于本发明范围之内。
根据本发明，本发明人已经开发了能调节和测定转录本稳定性和/或改善的基因表达的实时测定的一系列载体和方法。
通过序列识别号(SEQ ID NO)提及核苷酸序列。SEQ ID NOs以编号对应序列标识符<400>1、<400>2等。在权利要求书之后提供序列表。
本发明一方面涉及包含可转录多核苷酸的表达载体，其中包含调节相应于所述可转录多核苷酸的转录本稳定性的RNA元件的编码核苷酸序列。此处所用转录本稳定性可相当于转录本的半衰期。
本发明另一方面涉及包含可转录多核苷酸的表达载体，其包含编码可调节相应于所述可转录多核苷酸的转录本稳定性的RNA元件的核苷酸序列；其中该RNA元件是降低所述转录本稳定性的去稳定性元件。
在相关的实施方案中，本发明涉及包含可转录多核苷酸的表达载体，其包含编码可调节相应于所述可转录多核苷酸的转录本稳定性的RNA元件的核苷酸序列；其中该RNA元件是提高所述转录本稳定性的稳定性元件。
本发明另一方面涉及包含可转录多核苷酸的表达载体，其包含编码RNA元件的核苷酸序列，其中该RNA元件是降低相应于所述可转录多核苷酸的转录本稳定性的去稳定性元件，并且其中所述可转录多核苷酸包含目的多核苷酸并编码多肽。
本发明再一方面涉及包含可转录多核苷酸的表达载体，其包含编码RNA元件的核苷酸序列，其中该RNA元件是降低相应于所述可转录多核苷酸的转录本稳定性的去稳定性元件，并且其中所述可转录多核苷酸包含目的多核苷酸并编码报道多肽。
本发明又一方面涉及包含可转录多核苷酸的表达载体，其包含编码RNA元件的核苷酸序列，其中该RNA元件是降低所述转录本稳定性的去稳定性元件，并且其中所述可转录多核苷酸包含编码报道多肽的核苷酸序列。
本发明另一方面涉及包含可转录多核苷酸的表达载体，其包含编码可调节相应于所述可转录多核苷酸的转录本稳定性的RNA元件的核苷酸序列；其中该RNA元件是降低相应于所述可转录多核苷酸转录本稳定性的去稳定性元件，并且其中该载体包含一种或多种选自以下的成分(i)用于引入核苷酸序列的多克隆位点；(ii)报道基因；(iii)用于调节所述可转录多核苷酸表达的启动子和/或增强子；(iv)多腺苷酸化序列；(v)选择性标记基因；以及(vi)复制起点。
本发明另一个方面涉及包含本发明载体的细胞，其包含可转录多核苷酸，其中包含编码可调节相应于所述可转录多核苷酸的转录本稳定性的RNA元件的核苷酸序列。
本发明另一方面涉及包含本发明载体的细胞，其包含可转录的多核苷酸，其中包含编码可调节相应于所述可转录多核苷酸的转录本稳定性的RNA元件的核苷酸序列；其中该RNA元件是降低该转录本稳定性的去稳定性元件。
本发明相关方面涉及包含可转录多核苷酸的遗传改变的非人生物体，其包含编码可调节相应于所述可转录多核苷酸的转录本稳定性的RNA元件的核苷酸序列；其中该RNA元件是降低所述转录本稳定性的去稳定性元件。
本发明另一实施方案涉及测定目的多核苷酸表达的方法，该方法包含在足以发生RNA和蛋白质合成的时间和条件下于表达载体中表达所述目的多核苷酸，该载体包含可转录的多核苷酸，其中包含目的多核苷酸以及编码可调节相应于所述可转录多核苷酸的转录本稳定性的RNA元件的核苷酸序列；并且其中该表达载体包含选自以下的一种或多种成分(i)用于引入核苷酸序列的多克隆位点；(ii)报道基因；(iii)用于调节所述可转录多核苷酸表达的启动子和/或增强子；(iv)多腺苷酸化序列；(v)选择性标记基因；以及(vi)复制起点。
并测定可转录多核苷酸的表达产物与对照相比随时间变化的水平和/或功能活性，其中所述元件可增强有效连接所述可转录多核苷酸的启动子和/或增强子的活性与表达产物的水平和/或功能活性之间的时间相关性。
在另一实施方案中，本发明涉及鉴定编码可调节RNA转录本稳定性的RNA元件的核苷酸序列的方法，该方法包含将待测核苷酸序列引入表达载体，使该核苷酸序列连接编码报道蛋白质的多核苷酸，形成有效连接启动子和/或增强子的可转录多核苷酸；在足以发生RNA和蛋白质合成的时间的条件下表达该可转录多核苷酸；并且其中该表达载体包含选自以下的一种或多种成分(i)用于引入该待测核苷酸序列的多克隆位点；(ii)多腺苷酸化序列；(iii)选择性标记基因；以及(iv)复制起点；并测定所述可转录多核苷酸的表达产物与不含该核苷酸序列的对照载体相比，随时间变化的水平和/或功能活性，其中水平和/或功能活性随时间不同于对照载体，表明存在编码所述RNA元件的核苷酸序列。
附图简述
图1是编码去稳定性mRNA的表达载体的示意图。
图2是转录报道载体的示意图；图2a显示载体系列2；图2b显示载体系列3，图2c显示载体系列4。
图3是双向转录报道载体的示意图；图3a显示载体系列5，图3b显示载体系列6。
图4是用于研究转录后调节的报道载体的示意图。图4a显示载体系列7，图4b显示载体系列8。
图5图示按转染DNA的数量测定的报道分子活性。将编码萤火虫萤光素酶质粒的单一DNA制剂与编码肾海鳃萤光素酶的单个质粒按30∶1的比例混合。在分光光度测定(OD260/280)以及溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶中，两种DNA制剂表现正常(数据未显示)。将不同体积的该混合物转染细胞，使DNA的总量为1、2或3μg，但保持萤火虫与肾海鳃质粒的比例相同。
图5A图示肾海鳃萤光素酶活性依赖于转染DNA的数量。然而，萤火虫萤光素酶活性(图5B)不随DNA数量的增加而增加，也许是由于萤火虫DNA制剂的质量差。因此，一般用于测定萤火虫启动子活性的萤火虫/肾海鳃比例(图5C)，依赖于所用DNA的数量而显著变化。这些数据证明，与肾海鳃质粒共转染并不足以作为萤火虫质粒转染效率的对照。
图6图示使用双萤光素酶分析的多种启动子系统的报道活性。将6种不同的启动子片段(编号1-6)克隆到pGL3萤火虫萤光素酶质粒中。1μg每个克隆与30ng由SV40启动子驱动的肾海鳃(转染对照)质粒共转染。使用双萤光素酶测定(Promega，Madison，WI，USA)测定萤火虫和肾海鳃萤光素酶活性。结果可以表示为肾海鳃萤光素酶活性(A)、萤火虫萤光素酶活性(B)以及萤火虫除以肾海鳃活性(C)。在至少使用两种不同的每种构建体制剂的多重实验中，观察到类似结果。
肾海鳃萤光素酶活性(图6A)用作转染对照，只分析该结果提示转染效率的变化非常高。例如，肾海鳃萤光素酶与构建体4共转染较之与构建体3共转染的活性高3.5倍。单独的DNA制剂观察到同样的特征(数据未显示)，因而DNA质量变化或DNA定量误差似乎不是误差原因。
萤火虫萤光素酶活性(图6B)受转染效率以及启动子1-6之间差异的影响。差异特征与肾海鳃所见类似(图6A)。例如，3和6低，而4和5高。然而构建体之间的差异对于萤火虫更为显著(例如，构建体4比构建体3高12倍)，提示启动子1-6的活性有些影响肾海鳃的表达(或反之亦然)。
萤火虫/肾海鳃(图6C)被认为是测量修正转染效率(肾海鳃)之后的萤火虫启动子真实活性(1-6)。再次观察到类似特征，提示3和6的确是最弱的启动子，而4和5最强。虽然有可能启动子活性(图6C)与转染效率(图6A)一致相关，但由多种不同构建体以及相同构建体的多种不同制剂获得类似结果，似乎非常不太可能得出这种可能性。似乎更有可能的是，肾海鳃萤光素酶的表达水平受与其共转染的启动子构建体的强度影响。因此，启动子1-6之间的表观差异很可能低估了真实差异。
图7图示BTL、BTG2、BTG1和BTG1N4表达载体在阻断转录以后随时间过程的不同报道分子水平。利用分别包含连接报道基因的TRE启动子的下列报道质粒转染Tet-Off HeLa细胞BTL(萤光素酶)、BTG2(d2EGFP)、BTG1(d1EGFP)和BIG1N4(与BTG1相同，但在3’UTR编码区存在九聚物UUAUUUAUU的4个拷贝)。转染10小时后，将每瓶细胞分到多个小平板中。转染24小时后(零时)，加入强力霉素(1μg/ml)，以阻断报道基因的转录。如实施例14所述，于此时以及后续时间点测定报道分子水平(荧光或发光)，按零时的百分比表示。在10小时过程中未观察到萤光素酶活性(BTL)下降。半衰期2小时的EGFP构建体(BTG2)对强力霉素诱导的转录阻断显示中度反应，半衰期1小时的EGFP(BTG1)则快速反应。但包含九聚体(BTG1N4)的构建体显示迄今为止对转录阻断的最快反应。
图8图示按线性刻度表示的图7数据。BTG1在约6.5小时以后，强力霉素诱导的转录阻断可检测为阻断50％的报道分子水平。但是，包含九聚体(BTG1N4)使其减少到不及3个小时。
图9图示不同数目(1、2或4)的九聚体RNA去稳定性元件的影响。时间-过程分析如图7所述进行，只是将加入强力霉素后4小时定义为零点，以消除药物作用滞后的影响。存在单个九聚体(BTG1N1)足以提高″有效衰减率″，观察到2个九聚体(BTG1N2)和4个九聚体(BTG1N4)逐步产生更强的影响。后一构建体显示″有效半衰期″为～1小时20分钟，略高于单独蛋白质的1小时半衰期。
图10图示在没有转录阻断情况下，报道分子水平随时间的变化。如图7所述进行时间-过程分析。但是，所示数据代表未经强力霉素处理的样品，于转染后24小时(开始)或34小时(结束)测定。只观察到BTG1N4一致的表达水平。
图11图示在没有转录阻断的情况下，报道分子水平随时间的变化。如图7所述进行时间-过程分析。BTG1fos包含c-fos ARE。这些数据证明，不同类型的mRNA去稳定性元件可用于达到相同的效果。
图12图示使用RNA去稳定性元件测定使用萤光素酶报道蛋白质时的表达。应可预期，使用萤光素酶报道蛋白质和蛋白质去稳定性元件进一步增强表达。使用两个萤光素酶表达构建体，如图7所述进行时间-过程分析。BTL包含标准萤火虫萤光素酶编码区和3’UTR(来源于pGL3-Basic；Promega)，而BTLN6的3’UTR包含6个拷贝的九聚体UUAUUUAUU。
图13图示使用由RNA去稳定性元件和蛋白质去稳定性元件去稳定性的DsRed，随时间变化的报道分子水平。如图7和实施例14所述进行时间-过程分析。该构建体使用DsRed2(BTR)、DsRed-MODC(BTR1)以及3’UTR包含4个UUAUUUAUU九聚体(BTR1N4)的DsRed-MODC。利用强力霉素阻断转录以后，所有构建体的红色荧光持续升高。蛋白质去稳定性元件使其基本减少，而mRNA去稳定性元件使其进一步减少。
图14图示如图7所述进行的时间-过程分析。与对照(BTG1)相比，所测全部mRNA去稳定性元件可非常有效地提高衰变率。这些数据表明，c-myc ARE是有效的去稳定性元件(BTGlmyc)，联合mycARE和4个九聚体(BTG1N4myc)可以适度增加去稳定性活性。6个九聚体(BTG1N6)的去稳定性也一定程度强于4个九聚体(BTG1N4)。
优选实施方案详述定义″3’UTR″是指 多核苷酸的蛋白质编码区终止密码子下游的多核苷酸区域，不翻译产生蛋白质。
″5’UTR″是指 mRNA的5’(上游)非翻译区。也用来指编码mRNA 5’UTR的DNA区域。
″大约″是指 数目、水平、数值、尺寸、大小或数量相比参照的数目、水平、数值、尺寸、大小或数量，改变30％、优选20％、更优选10％。
″ARE″是指 mRNA中富含AU的元件，即包含高比例腺嘌呤和尿嘧啶核苷酸的序列。也用来指编码该mRNA元件的DNA区。
″生物学活性片 全长参考多核苷酸或多肽的片段，其分别段″是指 保持该参考多核苷酸或多肽的活性。
″c-fos″是指即早期基因，由促有丝分裂信号短暂诱导。
″CAT″是指氯霉素乙酰转移酶。一种经常用作报道分子的细菌酶。
″d1EGFP″是指 融合突变的PEST序列的EGFP变体，因而其半衰期仅为约1小时。类似地，也可获得d1ECFP和d1EYFP。按相同方法可以产生DsRed的去稳定性变体。从此称为d1DsRed。
″d2EGFP″是指 融合PEST序列的EGFP变体的突变形式，因而其半衰期仅为2小时。类似地，也可获得d2ECFP(青色)和d2EYFP(黄色)。
按相同方法可能产生DsRed的去稳定性变体。从此称为d2DsRed。
″dEGFP″是指 形成的所有EGFP去稳定性变体(包括所有颜色)的通称。(Li等人)。
″DNA″是指 脱氧核糖核酸。
″衍生物″是指例如通过本领域应当理解的缀合或复合其它化学部分、或者转录后或翻译后修饰技术，分别来源于参考多核苷酸或多肽的多核苷酸或多肽。
″DsRed″是指 从IndoPacific海葵亲缘的珊瑚海葵(Discosoma species)中分离的红色荧光蛋白。
″ECFP″是指 激发/发射光谱改变的发青色荧光的EGFP突变体形式。
″EGF″是指 表皮生长因子″EGFP″是指 增强的绿色荧光蛋白质。荧光增强的GFP的突变体形式。(Cormack等人)。
″ELISA″是指 酶联免疫吸附测定法″ErbB2″是指 表皮生长因子受体家族的第二个成员。亦称HER-2″外显子″是指作为mRNA分子一部分的RNA初级转录本序列，或编码该序列的DNA。初级转录本中相邻外显子由内含子分隔。
″表达载体″是指 允许所克隆的DNA片段在细胞内表达的载体。
″EYFP″是指 激发/发射光谱改变的发黄色荧光的EGFP突变体形式。
″萤火虫萤光 来源于从萤火虫中克隆的luc基因的酶。
素酶″是指在氧和Mg++存在下，利用D-萤光素和ATP催化反应，引起发光。经常用作报道分子。
″流式细胞术″是指一种方法，其中将活细胞或固定细胞的悬浮液上样流式细胞仪，逐个测定悬浮液中细胞所结合的可检测标记的活性或特性。
例如，可以通过荧光化合物或共价附着于特定荧光化合物的抗体进行细胞标记。可以同时检测若干不同的激发/发射波长，以测定不同类型的荧光。可以分选(gated)具有目的特征(荧光、细胞大小)的细胞亚群，以便只对分选的细胞进行进一步的统计分析。配备细胞分类选件的流式细胞仪可以物理分离具有目的荧光的细胞，并在与剩余的原始细胞群体分开的管中回收这些(活)细胞。也称为FACS(荧光活化的细胞分类)。
″基因″是指 编码RNA分子的DNA片段。术语″基因″有时并不一定包括启动子区。
″GFP″是指 分离自水母Aequoria victoria的荧光蛋白质(Tsien等人)，可用作报道蛋白质。
可以在哺乳动物细胞中表达编码GFP的DNA构建体，利用特定波长激发时，使细胞发绿色荧光。此处所用术语″GFP″是指所有的同系物和类似物，包括颜色变体以及来源于Aequoria victoria以外生物体的荧光蛋白质(例如，DSRed，Clonetech；hrGFP，Stratagene)。
″半衰期″是指去除分子的一半活性、数量或数目所用的时间。
″内含子″是指 基因或其初级转录本内的非编码序列，从初级转录本中去除，而不存在于相应mRNA分子中。
″萤光素酶″是指催化发光反应的常用报道酶。加入外源底物，使用发光计定量该反应。萤火虫和肾海鳃萤光素酶所需底物不同，使得在双萤光素酶测定(Promega，Madison，WI，USA)中可以区分这两者。
″MAPK″是指有丝分裂原活化的蛋白激酶。包括参与引起生长或凋亡(细胞死亡)的细胞内信号转导途径的若干不同激酶。术语″MAPK″有时用于指两种特定的MAPK，Erk1和Erk2(细胞外调节的激酶1和2)。
″MCMV″是指最小CMV启动子。其自身不活化转录，连接TRE可以产生四环素(和强力霉素)依赖性转录。
″MCS″是指 多克隆位点。包含可插DNA片段的唯一限制酶识别位点的DNA载体区域。此处所用术语″MCS″也包括帮助DNA片段插入载体中的任何其它位点。例如，能直接插入聚合酶链式反应(PCR)产生的片段的T突出端(Promega，Madison，WI，USA)。
″mRNA″是指信使RNA。使用本身编码蛋白质的DNA为模板，在细胞中产生的″转录本″。mRNA一般由5’UTR、蛋白质编码区和3’UTR组成。mRNA在细胞中的半衰期有限，部分取决于稳定性元件，特别是3’UTR内、还有5’UTR和蛋白质编码区内的稳定性元件。
″MODC″是指 包含PEST序列的小鼠鸟氨酸脱羧酶或其部分和/或衍生物。
″调节″是指 直接或间接地提高或降低目的分子的稳定性。
″有效连接″等按功能关系连接多核苷酸元件。一个核酸是指 当与另一核酸序列置于功能关系时是″有效连接的″。例如，启动子或增强子若影响编码序列的转录，则与该编码序列有效连接。有效连接是指核酸序列一般连续相接，必要时连续并在阅读框架内连接两个蛋白质编码区。如果RNA聚合酶将两个编码序列转录为单个mRNA，然后翻译为具有来源于两个编码序列的氨基酸的单个多肽，则该编码序列与另一编码序列″有效连接″。只要表达序列最终能产生目的蛋白质，编码序列不必互相邻接。启动子与可转录多核苷酸″有效连接″是指，将可转录多核苷酸(例如，编码蛋白质的多核苷酸或其它转录本)置于启动子的调节控制之下，然后控制该多核苷酸的转录并任选控制其翻译。在异源启动子/结构基因组合的构建体中，一般优选将启动子或其变体置于远离可转录多核苷酸的转录起始位点，大约与其天然情形(即该启动子所来源的基因)中该启动子及其控制的基因之间的距离相同。如本领域已知，可以调节距离的一些变化，而不损失功能。类似地，调节序列元件(例如操纵子、增强子等)相对于置于其控制之下的可转录多核苷酸的优选定位，按该元件在其天然情形(即其来源的基因)中的定位而定。
术语″pA″是指此处图示中用于表示多腺苷酸化位点。用作终止转录位点并给不成熟mRNA添加polyA尾的DNA序列。来自SV40病毒基因或β半乳糖苷酶基因或其它来源的各种pA序列，包括合成的多腺苷酸化位点，可为此目的用于表达载体。
术语″PEST″是指 富含氨基酸脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)的氨基酸序列。包含PEST序列的蛋白质半衰期缩短。
″质粒″是指 环状DNA载体。质粒包含复制起点，可使细菌(时或真核生物)细胞产生质粒的多个拷贝，而无需质粒整合到宿主细胞DNA中。
″多核苷酸″或″ 核苷酸的线性序列，包括DNA或RNA，可核酸″是指以是双链或单链。
″多肽″、″肽″ 由肽键按特定顺序连接的氨基酸多聚体。
或″蛋白质″是指″启动子″是指一般位于mRNA编码区上游(5’)的DNA区域，可控制转录起始和转录水平。该术语的内涵也包括可诱导型、可抑制型以及组成型启动子。
″PMA″是指 豆蔻酰佛波醇乙酯″肾海鳃萤光素来源于海洋三色堇(sea pansy)(肾海鳃酶″是指 (Renilla reniformis))，利用氧和腔肠动物萤光素(腔肠萤光素(coelenterazine))发光。
″报道载体″是指包含″报道基因″的表达载体，编码易于分析的蛋白质或多肽(或mRNA)。报道基因一般连接待测其功能或活性的调节序列。
″报道分子″是指由报道基因编码并在报道分析中测定的分子，一般是蛋白质或多肽。现有系统一般利用酶学报道分子，并测定报道分子活性。
″RNA″是指 核糖核酸。
″rtTA″是指只在四环素或强力霉素存在下结合TRE并活化转录的反向tTA(参见下文)。
″SEAP″是指分泌型碱性磷酸酶报道基因。
″SKBR3″是指 过表达ErbB2的人乳腺癌细胞系。
″严谨条件″是指只有具有高频率互补碱基的核苷酸序列能够杂交的温度和离子条件。严谨性要求具有核苷酸序列依赖性，并取决于在杂交和后续洗涤期间存在的各种成分以及这些过程的允许时间。为了使杂交率最高，一般选择非严谨性杂交条件比热解链温度(Tm)低约20-25℃。Tm是在限定的离子强度和pH的溶液中，50％的特定靶序列与完全互补的探针杂交的温度。为了要求杂交序列具有至少约85％的核苷酸互补性，一般选择低于Tm约5-15℃的高严谨性洗涤条件。为了要求杂交序列具有至少约70％的核苷酸互补性，选择低于Tm约15-30℃的中度严谨性洗涤条件。高许可性(低严谨性)洗涤条件可能低于Tm50℃，可产生杂交序列之间的高错配水平。本领域技术人员应当承认，还可以改变杂交和洗涤阶段的其它物理和化学参数，以影响靶序列和探针序列之间的特定同源性水平杂交信号的结果。
″SV40/CMV/RSV″是指分别来源于猿猴病毒、巨细胞病毒和劳氏肉瘤病毒的启动子元件。一般认为这些启动子在哺乳动物细胞中具有组成型活性。
″TetO″是指来源于大肠杆菌四环素抗性操纵子的Tet操纵子DNA序列。
″Tet-Off细胞 稳定表达tTA的细胞系，以致四环素或强系″是指力霉素可以关闭TRE启动子的转录。
″Tet-On细胞稳定表达rtTA的细胞系，以致四环素或系″是指强力霉素可以开启TRE启动子的转录。
″转录″是指合成与DNA模板互补的RNA分子的过程。
″转染″是指将质粒或DNA片段插入真核细胞中的过程。一般2-50％的细胞摄有质粒，在质粒DNA不整合到细胞染色体的情况下表达蛋白产物～3天(＝瞬时转染)。小部分细胞最终整合质粒DNA到其基因组中，永久表达蛋白产物(＝稳定转染)。
″翻译″是指以mRNA分子为模板进行蛋白质合成的过程。
″TRE″是指 此处定义为通常与最小启动子相连的任何四环素效应元件(Gossen等人)，只有通过外源因子(例如tTA或rtTA)与TRE结合才能发生转录。本发明的优选实施方案利用由连接最小CMV启动子(mCMV)的7个重复的tetO序列组成的TRE(ClontechLaboratories Inc.，Palo Alto，CA，
USA)。
″tTA″是指 四环素控制的反式激活因子(transactivator)，由Tet抑制蛋白质(TetR)和VP16激活结构域组成，使其只有在缺少四环素或强力霉素的情况下结合TRE并激活转录。
″TS″是指血栓烷合酶启动子。
″变体″是指 显示分别与参考的多核苷酸或多肽基本序列一致性的多核苷酸或多肽。多核苷酸变体也包括在严谨条件下与参考序列杂交的多核苷酸。这些术语也包括通过添加、缺失或替换至少一个核苷酸而不同于参考多核苷酸的多核苷酸。在这方面，本领域相当理解，可以对参考多核苷酸进行某些改变，包括突变、添加、缺失和替换，该改变的多核苷酸保持参考多核苷酸的生物功能或活性。术语″多核苷酸变体″和″变体″也包括天然存在的等位基因变体。例如关于多肽变体，本领域相当理解，某些氨基酸可能改变为其它具有大致相似特性的氨基酸，而不改变该多肽的天然活性(保守性替换)。
″载体″是指 供外源DNA序列插入宿主细胞和/或在支持该载体复制的细胞中扩增该DNA序列的运载体。最一般而言，质粒还可以是噬菌粒、噬菌体、腺病毒或逆病毒。
″vEGFP″、″EGFP EGFP的不同颜色的变体和/或不同半衰期变体″或″EGFP的 的变体。
变体″是指
″vGFP″是指所有的GFP变体；包括同系物和类似物，例如DsRed，也包括EGFP变体或去稳定的GFP变体。
本发明特别提供调节转录本稳定性、从而调节载体所产生的蛋白质数量的表达载体。虽然本发明显然包含可提高转录本稳定性的表达载体，但特别优选的实施方案关注去稳定性的转录本。此处通过给可转录的多核苷酸添加一个或多个去稳定性元件、或去除一个或多个稳定性元件(例如poly A尾)，可以降低转录本稳定性。与现有表达载体相比，本发明的载体例如通过减少在降低的启动子活性和降低的相应表达产物的水平之间的时间延迟(lag)，而提供了具有对启动子活性改善的时间相关的蛋白质表达动力学。
因此，本发明一方面涉及包含可转录多核苷酸的表达载体，其中包含调节相应于所述可转录多核苷酸的转录本稳定性的RNA元件的编码核苷酸序列。
转录本稳定性上下文中的术语″调节″是指提高或降低转录本的稳定性，以及根据特定应用优化调节量。在不限制本发明于任一特定理论或工作方式的情况下，如果RNA元件是使转录本去稳定的核苷酸序列，则认为该元件直接或间接靶向转录本降解。
此处所用术语″去稳定性元件″是指在细胞内分别降低蛋白质或转录本半衰期的氨基酸或核苷酸序列。因此，″RNA去稳定性元件″包含降低RNA转录本细胞内半衰期的核苷酸序列，而″蛋白质去稳定性元件″包含降低蛋白质细胞内半衰期的氨基酸序列。
所要求降低的程度取决于特定的应用。在优选实施方案中，与没有去稳定性元件的载体相比，RNA去稳定性的程度显著提高了启动子活性和表达载体中报道分子水平或活性之间的时间相关性。就提高转录本稳定性而言，稳定性的最佳水平也取决于应用。
″RNA稳定性元件″是提高细胞内半衰期的核苷酸序列。
″RNA″分子包括所有RNA分子，例如mRNA、核不均一RNA(hnRNA)、核小RNA(snRNA)、核仁小RNA(snoRNA)、胞质小RNA(scRNA)、核糖体RNA(rRNA)、翻译控制RNA(tcRNA)、转运RNA(tRNA)、eRNA、干扰信使RNA的互补RNA(micRNA)或干扰RNA(iRNA)和线粒体RNA(mtRNA)。
信使RNA(mRNA)是优选的RNA形式。
在降低选自RNA转录本或所编码目的蛋白质的分子的细胞内半衰期的情况下，一般选择(a)一种或多种去稳定性元件和/或(b)一种或多种稳定性元件，以增加该分子的降解水平，从而使该分子的细胞内半衰期减少到适当少于约24小时、更优选少于约10小时、更加优选少于约5小时、更加优选少于约3小时、更加优选少于约1小时、更加优选少于约30分钟、更加优选少于约15分钟、更加优选少于约10分钟、更加优选少于约5分钟、以及更加优选少于约3分钟。RNA转录本或所编码目的蛋白质的半衰期优选相当于可提供至少10倍于该转录本或所编码蛋白质最小可检测水平的稳定状态表达水平的最低半衰期。
细胞内或类细胞内条件优选该细胞类型的生理条件。细胞内或类细胞内条件的温度优选该细胞类型的生理温度。哺乳动物细胞典型的温度适当为约30℃-42℃，优选约35℃-37℃。
RNA转录本或多肽增加的核醣核酸或蛋白水解降解，至少分别是指核醣核酸或蛋白水解降解水平超过缺少去稳定性元件或存在稳定性元件的RNA转录本或多肽的至少约5％、优选至少约10％、更优选至少约20％、更加优选至少约40％、更加优选至少约50％、更加优选至少约60％、更加优选至少约70％、更加优选至少约80％、更加优选至少约90％、更加优选至少约100％、更加优选至少约150％、更加优选至少约200％、更加优选至少约400％、更加优选至少约600％、更加优选至少约1,000％、更加优选至少约2,000％、更加优选至少约4,000％、更加优选至少约6,000％、更加优选至少约8,000％、优选至少约10,000％、还更加优选至少约12,000％。测定RNA降解的分析方法为本领域技术人员已知。例如，可以使用例如Ross，J(1995)或Liu，J等人(JBC 2000)所公开的很多分析方法测定RNA降解，其基于利用转录抑制因子(放线菌素D、DRB、蛹虫草菌素、α-鹅膏蕈碱)、脉冲标记(放射性核苷)、无细胞衰减法(多核糖体、胞质溶胶或网织红细胞)、或短期启动子激活(fos启动子，参见下文)。测定蛋白质水解降解的方法也为本领域技术人员已知。例如，可能使用哺乳动物细胞裂解物测定，包括但不限于Bachmair等人美国专利系列5,646,017的网织红细胞裂解物测定，体外测定蛋白质降解。另外，可能使用例如Vazhappilly，R和Sucher，N(2002)或Saito，T等人(1998)公开的放线菌酮或脉冲追踪方法，测定蛋白质降解。
RNA去稳定性元件可以来源于任何来源，特别是通常包含去稳定性序列的短寿mRNA的3’UTR或5’UTR区。此处所用术语″来源于″应当用来表示来源于指定种类的特定整体或整体群，但不一定直接得自该指定来源。
所述RNA去稳定性序列可能克隆自短寿的RNA，例如c-fos、c-jun、c-myc、GM-CSF、IL-3、TNF-α、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、尿激酶、bcl-2、SGLT1(Na(+)-偶联的葡萄糖转运子)、Cox-2(环加氧酶2)、IL-8、PAI-2(纤溶酶原激活物抑制剂2型)、β1-肾上腺素能受体、GAP43(5’UTR和3’UTR)。
富含AU元件(AREs)和/或富含U元件(UREs)包括但不限于单个、串联或多个或重叠拷贝的九聚体UUAUUUA(U/A)(U/A)(其中U/A是A或U)(Lagnado等人1994)和/或五聚体AUUUA(Xu等人1997)和/或四聚体AUUU(Zubiaga等人1995)。
例如也描述了磷酸烯醇丙酮酸羧激酶mRNA(PEPCK)、果蝇Bicoid基因、人硫氧还蛋白基因、耐热抗原和大豆10A5基因的RNA去稳定性元件。
铁效应元件和铁调节蛋白质结合位点也可以有利地引入本发明载体中，以调节RNA稳定性、特别是翻译效率。组蛋白RNAs、尤其是其3’UTRs，可特别用于以细胞周期依赖性方式调节RNA稳定性。
本发明也包括上列元件的修饰或改变。术语″串联拷贝″允许一个或多个外侧的核苷酸复制和/或非复制。例如，五聚体AUUUA的串联拷贝包括序列诸如AUUUAUUUAUUUA和AUUUAAUUUAAUUUA。
使用计算方法和数据库分析(Dandekar T等人)可能鉴定RNA去稳定性元件和/或使其产生改变。
因此，本发明包含所提及的去稳定性元件的生物学活性片段以及变体和衍生物。
本发明包括真核表达载体。
在相关的实施方案中，本发明涉及包含可转录多核苷酸的表达载体，其包含编码可调节相应于所述可转录多核苷酸的转录本稳定性的RNA元件的核苷酸序列；其中该RNA元件是提高所述转录本稳定性的稳定性元件。
在另一相关实施方案中，本发明包括包含可转录多核苷酸的表达载体，其包含编码可调节相应于所述可转录多核苷酸转录本稳定性的RNA元件的核苷酸序列；其中该RNA元件是提高该转录本稳定性的稳定性元件，其中该稳定性元件是或来源于选自长寿mRNA的实例α2球蛋白、α1球蛋白、β球蛋白、或生长激素的基因。此处所用下划线或斜体字的基因名称应该表示基因，而不同于由没有下划线或斜体字的基因名称表示的其蛋白质产物。例如，″α2球蛋白″应指α2球蛋白基因，而″α2球蛋白″应表示″α2球蛋白″基因的蛋白质产物。
能够使转录本去稳定性并减少细胞产生的蛋白质数量，显然应该具有广泛应用。
本发明另一方面涉及包含可转录多核苷酸的表达载体，其包含编码可调节相应于所述可转录多核苷酸的转录本稳定性的RNA元件的核苷酸序列；其中该RNA元件是降低所述转录本稳定性的去稳定性元件。
另一方面，本发明涉及包含可转录多核苷酸的表达载体，其包含编码调节相应于可转录多核苷酸转录本稳定性的RNA元件的核苷酸序列；其中该RNA元件是降低所述转录本稳定性的去稳定性元件，其中编码该去稳定性元件的核苷酸序列是或来源于选自c-fos、c-jun、c-myc、GM-CSF、IL-3、TNF-α、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、尿激酶、bcl-2、SGLT1(Na(+)-偶联的葡萄糖转运子)、Cox-2(环加氧酶2)、IL-8、PAI-2(纤溶酶原激活物抑制剂2型)、β1-肾上腺素能受体或GAP43的基因。
在特定的实施方案中，编码RNA去稳定性元件的多核苷酸序列连接编码目的蛋白质的序列，其依次连接优选可调节(即可诱导或可抑制)的目的启动子，以便开启表达然后关闭调节。在此应用中，RNA去稳定性元件一般用来缩短功能性mRNA或蛋白质的表达时间。可应用于体外或体内。例如，细胞周期特异性启动子可以结合RNA不稳定性元件，以专门在细胞周期的某些阶段表达目的蛋白质。该目的蛋白质可能是功能性蛋白质或报道蛋白质。在后一例子中，该报道分子的水平可以用作细胞周期阶段或细胞增殖的指示。
本发明另一方面涉及包含可转录多核苷酸的表达载体，其包含编码调节相应于所述可转录多核苷酸转录本稳定性的RNA元件的核苷酸序列；其中该RNA元件是降低所述转录本稳定性的去稳定性元件，其中编码该去稳定性元件的核苷酸序列选自任一SEQ ID NO 1-23、或其生物学活性片段、或变体或衍生物。
本发明另一方面涉及包含可转录多核苷酸的表达载体，其包含编码调节相应于所述可转录多核苷酸转录本稳定性的RNA元件的核苷酸序列；其中该RNA元件是降低所述转录本稳定性的去稳定性元件，其中编码该去稳定性元件的核苷酸序列列于SEQ ID NO 1、2或22、或其生物学活性片段或其变体或衍生物。
本发明另一方面涉及包含可转录多核苷酸的表达载体，其包含编码RNA元件的核苷酸序列，其中该RNA元件是降低所述转录本稳定性的去稳定性元件，并且其中所述可转录多核苷酸包含目的多核苷酸并编码多肽。
特定应用之一在于测定基因表达领域。具体而言，通过减少细胞中产生的转录本数量，有可能更准确测定启动子或增强子活性。在此应用中，使用报道基因直接、或与由载体中调节元件调节其表达的另一多肽的融合蛋白质间接测定启动子活性。
在一个实施方案中，将RNA去稳定性序列引入报道mRNA 3’-UTR编码区。另外或此外，将去稳定性元件引入5’-UTR和/或蛋白质编码区，其优选对所编码蛋白质的选择活性并不必要或不产生干扰。
在相关实施方案中，例如当需要精确监控或降低其表达时，利用RNA去稳定性序列使目的基因去稳定性。一般对于该应用而言，联合使用RNA去稳定性元件与报道蛋白质去稳定性元件。
所述表达载体可应用于多种基因表达系统，优选其具有短期的mRNA或蛋白质表达，或优选其启动子活性变化及所致mRNA/蛋白质水平变化之间的时间延迟最小。
因此，本发明再一方面涉及包含可转录多核苷酸的表达载体，其包含编码RNA元件的核苷酸序列，其中该RNA元件是降低所述转录本稳定性的去稳定性元件，并且其中所述可转录多核苷酸包含目的多核苷酸并编码报道多肽。
本发明又一方面涉及包含可转录多核苷酸的表达载体，其包含编码RNA元件的核苷酸序列，其中该RNA元件是降低所述转录本稳定性的去稳定性元件，并且其中所述可转录多核苷酸包含编码报道多肽的核苷酸序列。
设计供真核细胞系统使用的表达载体。然而应当指出，RNA去稳定性元件可能用于大量真核和/或植物系统，包括确定为酵母、昆虫、线虫、鱼、鸟或哺乳动物的细胞、组织或整个生物体。用于植物时，可能使用不同的启动子、可能不同的报道分子以及RNA去稳定性元件(例如DST序列)。
预期本发明的表达载体将引入标准的蛋白质报道分子或去稳定的报道蛋白质分子。标准的报道分子为本领域公知。
本发明另一方面涉及蛋白质去稳定性元件(例如编码可能选自目的多肽氨基末端的去稳定性氨基酸、PEST区或泛素的细胞内蛋白质降解信号或降解决定子(degron)的DNA/RNA序列)以及mRNA去稳定性元件(例如多拷贝的九聚体UUAUUUAUU)的组合，以便使mRNA和蛋白质两者都去稳定。例如，一个该实施方案将PEST序列以及4个九聚体分别引入表达载体中翻译终止密码子紧上游和终止密码子下游(优选离终止密码子20nt或以上)。
按这种方法，报道蛋白质可能在蛋白质水平和mRNA水平都去稳定。
该去稳定的报道蛋白质可能是任何合适的蛋白质。例如，去稳定的GFP蛋白质较为合适，例如包含MODC的d1突变体的d1EGFP、d1EYFP和d1ECFP。该去稳定的萤光素酶蛋白质如Leclerc G.等人所述。使用MODC PEST序列。也包括d1EGFP的MODC。
本发明包括使目的多肽去稳定的任何方法。例如，目的多肽可以改变为其氨基端包括去稳定性氨基酸，使该蛋白质按照例如Bachmair等人美国专利系列号5,093,242以及Varshavsky等人美国专利系列号5,122,463所公开的N端规则途径进行改变。在优选的该类实施方案中，去稳定性的氨基酸选自异亮氨酸和谷氨酸，更优选自组氨酸、酪氨酸和谷氨酰胺，更加优选自天冬氨酸、天门冬酰胺、苯丙氨酸、亮氨酸、色氨酸和赖氨酸。在特别优选的实施方案中，该去稳定性的氨基酸是精氨酸。某些蛋白质的氨基端由于蛋白质的构象(即三级或四级结构)而不明确。在这些情况下，为使蛋白质遵循N端规则途径，可能需要更多改变氨基端。例如，由于氨基端难以接近，简单添加或替换单个氨基端残基是不够的，可能添加若干氨基酸(包括赖氨酸，泛素连接到底物蛋白质的部位)到原始的氨基端，以提高改造的氨基端的可接近性和/或片段活动性。
可以在基因水平进行蛋白质氨基端的改变或设计。可以使用定点诱变的常规技术，在分离或合成的编码抗原的多核苷酸的5’端添加或替换合适的密码子，以提供该编码蛋白质所需的氨基端结构。例如，可以将去稳定性氨基酸的合适密码子插入或构建到蛋白质编码序列的氨基端，以使所表达蛋白质的氨基端具有所需氨基酸。必要时，可以修饰编码蛋白质氨基端区域的核酸序列，在适当位置引入赖氨酸残基。这可以利用编码″通用去稳定性片段″的DNA构建体最方便地实现。通用去稳定性片段包含编码优选具有片段活动的、包含一个或多个赖氨酸残基的多肽结构的核酸构建体，赖氨酸残基的密码子位于构建体内部，以便将该构建体插入编码抗原的多核苷酸的编码序列后，该赖氨酸残基能够空间上充分接近该编码蛋白质的氨基端，而作为完整氨基端降解信号的第二个决定簇。将该构建体插入编码抗原的多核苷酸的5’部分，将会提供编码蛋白质在合适位置用于去稳定性的一个(或多个)赖氨酸残基。
在另一实施方案中，将目的多肽修饰为包含富含选自脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸和苏氨酸的氨基酸的PEST区，该区任选侧接包含正电侧链的氨基酸。在此方面，已知细胞内半衰期少于2小时的蛋白质的氨基酸序列包含一个或多个富含脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)的区域，例如Rogers等人(1986，Science 234(4774)364-368)所示。在另一实施方案中，该目的多肽缀合泛素或其生物学活性片段，产生的修饰多肽相对于未修饰的多肽而言，其细胞内蛋白水解降解速率提高、增强或上升。
本发明另一方面涉及包含可转录多核苷酸的表达载体，其包含编码调节相应于所述可转录多核苷酸转录本稳定性的RNA元件的核苷酸序列；其中该RNA元件是降低所述转录本稳定性的去稳定性元件，其中该报道蛋白质选自萤光素酶、绿色荧光蛋白质、红色荧光蛋白质、SEAP、CAT、或其生物学活性片段、或变体或衍生物。
这种载体可用于筛选改变其启动子活性的药物或处理。与现有报道载体相比，可以几乎″实时″测定药物作用。
本发明再一方面涉及包含可转录多核苷酸的表达载体，其包含编码可调节相应于所述可转录多核苷酸的转录本稳定性的RNA元件的核苷酸序列；其中该RNA元件是降低所述转录本稳定性的去稳定性元件，并且其中该载体包含任意顺序的一种或多种选自以下的成分(i)供引入核苷酸序列的多克隆位点，优选该位点可以酶学或化学断裂，以提供可以直接克隆PCR扩增产物的线性化的载体(例如Ec1HK1位点)；(ii)报道基因；
(iii)用于调节所述可转录多核苷酸表达的启动子和/或增强子；(iv)多腺苷酸化序列；(v)选择性标记基因；以及(vi)复制起点。
本发明另一方面涉及载体或成套载体，特别而不仅仅是质粒，用于研究、或测定、或监控基因表达(例如启动子活性)。还可以使用其它许多载体，例如病毒、人工染色体及其它非质粒载体。
一个实施方案涉及成对或成套质粒，各自包含引入编码去稳定性的报道蛋白质例如d1EGFP、d1EYFP、d1ECFP或d1DsRed的构建体中的一个或多个上述mRNA去稳定性序列。每对或每套质粒之一(对照)含有报道分子编码区启动子5’。该启动子包含可通过外源处理(例如TRE与最小启动子例如mCMV相结合；参见图2c)而调节(即可诱导或可抑制)的元件。另外使用组成型活性启动子，例如TS、SV40、CMV、TK或RSV(参见图2b)。在植物系统中，Top-ten启动子可以代替TRE，花椰菜花叶病毒35S启动子可以代替SV40等。根癌农杆菌可用于促进植物基因转移。成对或成套质粒中的其它质粒与对照质粒相同，只是克隆位点(MCS)取代了启动子，报道分子编码区编码与对照的报道分子类似但并不相同的报道分子(参见图2a)。在优选实施方案中，对照质粒编码EGFP的去稳定性变体(例如d1EGFP、d1EYFP或d1ECFP)，其它载体(待测载体)各自编码同一列表(相同的蛋白质半衰期)的不同颜色变体。
在其它实施方案中，将对照和一个待测报道分子引入单个载体、例如双向质粒中(参见图3)。
在上述实施方案中，对照和待测质粒都编码去稳定性的mRNA，其随后编码去稳定的蛋白质。因此，降低的启动子活性和降低的报道蛋白质水平之间的时间延迟较之现有构建体显著下降。同样，由于预先存在的mRNA和蛋白质的水平下降，提高的启动子活性可更为容易和快速的检测。使用因只有少数小突变而互不相同的荧光蛋白质，使可导致误差的对照和待测构建体之间的其它差异最小化。相比基于萤光素酶或其它酶的分析方法，此处所述荧光报道分子具有其它若干优点，包括·可以在相同的细胞或样品中测定几种不同的报道分子。
·可以测定活细胞，允许相同样品多个时间点、或测定后的进一步操作，例如测定在药物处理前后的相同细胞。
·可以通过荧光显微术观察成功转染的细胞。因此，仅仅在显微镜下观看细胞，无需另外投入资源，便可以鉴定较差的转染。
·不需要底物，因此该方法技术要求低、快速、廉价并更为准确。
·可以利用流式细胞术同时测定对照和待测报道分子的表达(参见下文流式细胞术的优点)。
·利用TREs为对照启动子的实施方案只能用于Tet-On或Tet-Off细胞系，但相比其它对照启动子，显示来自或针对待测启动子的干扰更少，并更少受到用于检测待测启动子可诱导性的各种刺激物的影响。因此，可以更精确测定转染效率以及待测启动子的相对活性。可以按需开启或关闭对照报道分子的表达，并用于证实没有启动子的串扰、或者若有则进行补偿。
·在另一实施方案中，将上述对照和一个待测报道分子引入单个载体、优选双向质粒。在对照启动子中使用TREs，使原双启动子载体的主要缺点两个启动子之间的干扰减至最小。这种单一载体系统防止了共转染研究的不准确性。
本发明也提供将信息性启动子或启动子片段置于报道分子编码区上游的载体。本发明提供了更简单、快速和低成本的报道系统，用于这种使用EGFP变体而非萤光素酶或其它酶为报道分子的分析。此外，包含mRNA不稳定性元件允许进行近乎实时的分析。
信息性启动子包括但不限于细胞周期依赖性启动子(例如细胞周期蛋白A、B、或D1，组蛋白或拓扑异构酶I启动子)、凋亡(细胞死亡)活化的启动子途径以及促有丝分裂信号有关联的启动子/片段(表1)。可以使用的信息性增强子的实例包括Clontech’s MercuryPathway Profiling Systems所用的增强子。Clontech’s Mercury体内激酶分析试剂盒代表了怎样使用本发明的另一实例。此例中的启动子元件是TRE，可结合细胞内嵌合的TetR反式激活因子蛋白质，其只有在特定激酶活化时才允许从TRE转录，并磷酸化融合蛋白质的反式激活因子结构域。因此，本发明可用于更实时测定特定激酶活性。
本发明另一方面涉及利用本发明载体转染或转导的细胞，该载体包含可转录多核苷酸，其中包含编码调节相应于所述可转录多核苷酸转录本稳定性的RNA元件的核苷酸序列。
在某些应用中，将表达载体或表达报道分子构建体的细胞插入生物体中，以便测定体内报道分子活性。在其中某些应用中，优选的报道分子可能是去稳定的萤光素酶，而非去稳定的EGFP变体。例如，在信息性启动子控制下表达去稳定萤光素酶的转基因小鼠可用于利用光子成像仪测定该启动子在活鼠组织中的活性(光子成像仪分析如Contag等人，1997所述)。mRNA去稳定序列用来提高启动子活性和报道分子水平之间的时间相关性，从而受益于启动子活性的近乎实时测定，而显著改善诸如药物筛选等应用。
在某些应用中，希望在基于细胞的系统中体外表达、或哺乳动物系统中体内表达报道分子和功能基因产物。这可能涉及各包含mRNA去稳定性元件的两个独立mRNA。另外，可能将mRNA去稳定性元件引入可产生两个独立蛋白质、或由报道分子和功能基因产物组成的融合蛋白质的单个去稳定的转录本中(例如使用内部核糖体进入位点；IRES)。
本发明也提供稳定表达这些载体的细胞系(有或没有对照)。该细胞可应用于诸如药物筛选等领域。例如，包含MAPK依赖性报道载体的细胞可提供快速廉价方法，用于测定设计为抑制该细胞MAPK或位于MAPK依赖性转录上游的任何途径的药物效果。例如在SKBR3人乳腺癌细胞中，MAPK活性依赖于来自过表达ErbB2蛋白质的信号。因此，抑制ErbB2的药物应导致包含该构建体的SKBR3细胞的荧光下降，缺少ErbB2的细胞则不然。另外，可以加减通过不同途径引起MAPK活化的药物以及特定配基或处理，测试细胞，以便监控对该途径的抑制。稳定表达连接细胞周期调节性启动子的载体的细胞系(或生物体)可用于快速、简便、廉价测定细胞周期进展或细胞增殖的方法。该细胞系显然可用于药物筛选，并包含于本发明之内。易于获得细胞周期调节性启动子的实例，例如(Lee，H等人1995)、(Stein，J等人1996)和(Huet，X等人1996)。
本发明另一实施方案包括供研究转录后调节、特别是mRNA稳定性的载体。例如该报道分子是EGFP的去稳定变体(例如d1EGFP、d1EYFP、d1ECFP)，在每个单独载体中具有不同颜色的变体。TRE(与最小启动子例如mCMV连接)位于报道分子编码区的5’，以四环素(或强力霉素)依赖性方式驱动转录。还可以使用其它诱导型启动子系统。
在一个实施方案中，不包括上述mRNA不稳定性元件，MCSs取而代之，主要位于3’-UTR(参见图4a)，在某些特定实施方案中也位于5’-UTR和/或编码区。可以将据认为影响mRNA稳定性的序列克隆到包含单色变体载体的合适克隆位点，利用四环素或强力霉素阻断转录后，测定报道分子水平的减少率，从而对其进行测试(参见图7)。如果需要，可以比较相同细胞中″待测载体″和″对照载体″(编码不同颜色EGFP变体、而不包含待测序列)之间的衰变率。
MCS可有利地包含或联用允许直接克隆具有突出端的PCR产物的限制性内切酶位点(参见下文)。
在本发明另一相关实施方案中，包括一种或多种mRNA不稳定性元件，以帮助科学家明确寻找mRNA稳定性元件。同样，其它实施方案包括mRNA稳定性元件，以帮助科学家明确寻找mRNA去稳定性元件。
在其它实施方案中，将对照和一个待测报道分子共同引入单个载体、优选双向质粒中(参见图4b)。
例如，蛋白质纯化期间要求高水平蛋白质或者启动子较弱时，稳定性元件可用于提高所表达蛋白质的水平。
使用TRE或类似元件驱动两种报道分子，并通过加入强力霉素(或四环素)关闭该载体转录以后，测定报道分子水平，可以防止两个启动子之间的干扰以及该元件或各种待测刺激物的转录影响。
本发明另一方面涉及利用本发明载体转染或转导的细胞，该载体包含可转录的多核苷酸，其中包含编码调节相应于所述可转录多核苷酸转录本稳定性的RNA元件的核苷酸序列；其中该RNA元件是降低该转录本稳定性的去稳定性元件。
本发明相关方面涉及包含可转录多核苷酸的遗传修饰的非人生物体，其包含编码可调节相应于所述可转录多核苷酸转录本稳定性的RNA元件的核苷酸序列；其中该RNA元件是降低所述转录本稳定性的去稳定性元件。
本发明另一实施方案涉及测定目的多核苷酸表达的方法，该方法包含在足以发生RNA和蛋白质合成的时间和条件下于报道分子表达载体中表达该目的多核苷酸，该载体包含可转录的多核苷酸，其中包含编码转录元件的核苷酸序列和目的多核苷酸，该可转录元件调节相应于所述可转录多核苷酸的转录本稳定性；并且其中该表达载体以任意顺序包含选自以下的一种或多种成分(i)用于引入该目的多核苷酸的多克隆位点；(ii)报道基因；(iii)调节所述目的多核苷酸和/或报道基因表达的启动子，该启动子优选可调节型启动子(例如使用四环素反应性元件(TRE))；(iv)多腺苷酸化序列；(v)选择性标记基因；以及(vi)复制起点；并测定与对照相比，该报道分子随时间变化的水平或活性，其中所述去稳定性元件可增强在启动子或增强子活性和报道分子水平或活性之间的时间相关性。
此处涉及联合作用的不同RNA去稳定性元件的组合。
本发明通过非限制性实施例进一步描述。
实施例1将DNA元件克隆到载体中使用MCS中的限制酶位点，或者若载体的MCS中具有″T突出端″，则直接连接PCR产物，按照现有方法进行克隆。然而，转录后的报道载体在3’-UTR或其它区域包含MCS是对设计用于转录或其它研究、但在这些位置不包含方便的克隆位点的现有载体的显著改进。
实施例2转染按现有方法(例如Fugene[Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany]或电穿孔)进行对照和待测载体的共转染，上述单个(例如双向)载体系统除外，其只需要一个载体，从而消除与共转染有关的不准确性。
实施例3测定报道分子表达vGFP系统的直接优点在于，简单通过在荧光显微镜下观察组织培养板或培养瓶，便可以直接观察活细胞中的报道分子表达。因此，可以鉴定并丢弃较差的转染，而无需浪费任何额外时间。使用荧光计(例如96孔板格式)进行定量测定，因为可以测定活细胞，所以可以重复测定相同的样品，例如在时间过程中。
与萤光素酶及其它基于酶的分析方法相比，另外的优点在于，还可以使用流式细胞术测定报道分子的水平。
实施例4使用流式细胞术测定报道分子水平的优点i.可以按每秒＞2,000个细胞的速度，逐一测定每个细胞中两种或更多的报道分子(对照和待测)以及其它参数。因此，在此应用中，该方法每种试样产生数千到无数个数据点，相比现有萤光素酶分析只产生一个数据点。
ii.精确测定转染效率这可用于优化转染方案。除了可以比较不同方法之外，也可能测定每个细胞的表达以及表达的细胞比例。这有助于研究人员确定任何问题的起因。
iii.确认共转染误差共转染研究基于以下前提，即细胞摄取并表达一定量的对照报道分子，与该细胞摄取的待测质粒的数量成比例的。情况并不总是如此。使用此处所述流式细胞术，有可能使相同样品中不同细胞的待测与对照的表达水平相关。在待测与对照报道分子水平之间缺少良好线性关系，即鉴定为无效样品。现有方法无法留意这种误差。
iv.同时测定其它参数可使用荧光标记抗体按细胞定量细胞上的蛋白质，并与报道分子水平相关联，以确定该蛋白质是否通过克隆到报道构建体中的元件影响基因表达。另外，可以通过转染合适的表达载体(可诱导型或非诱导型)，将目的蛋白质表达为vGFP融合蛋白质(目的蛋白质与GFP变体融合)。该特定蛋白质的水平因而与连接目的调节元件的不同GFP变体的表达相关联(共转染或在不同时间转染)。在第三个应用中，vGFP报道分子与据认为是细胞周期特异性的调节元件(例如启动子)相连接。利用荧光DNA染料例如碘化丙啶染色转染的细胞，以测定其DNA含量，其与报道分子的表达相关。原则上可以共表达此处所述各包含不同vGFP的若干DNA构建体，并独立进行测定。此外，其它荧光标志可以用于连接这些载体(单个或多个)。
v.细胞分类使用细胞分类仪有可能将表达vGFP的活细胞与未表达细胞分离。该技术可用于选择稳定表达的细胞或在开始分析之前去除未表达细胞。类似地，有可能去除vGFP表达水平极低和/或极高的细胞。这可以用于产生更均一的群体和/或去除可能不具有生理意义、或可能干扰正常细胞功能、和/或可能对从此处所述DNA载体所获数据产生不利影响的高表达水平细胞。
重要的是注意到，表达载体的瞬时和稳定转染产生表达水平非常不均一的细胞群体。一般而言，最高和最低表达细胞之间具有一千倍差异并不罕见。本发明不仅提供用于必要时选择均一性群体的方法(参见上述v)，也利用不均一性而有利于科学家。例如，确认共转染误差。另一例子与上述(iv)有关。为确定蛋白质X是否影响启动子Y的转录，利用在启动子Y控制下表达d1EGFP的报道构建体转染细胞。如果需要，可以使用细胞分选分离瞬时或稳定表达合适水平d1EGFP的细胞。接下来利用表达蛋白质X-EYFP融合蛋白质的载体瞬时转染这些细胞。在流式细胞术中，一个轴图示EGFP，另一轴图示EYFP。正相关表示蛋白质X增强启动子Y的转录，而负相关表示蛋白质X抑制启动子Y的转录。
目前，科学家选择蛋白质X高和低表达子的若干不同克隆，试图建立这种相关性。然后分别利用启动子Y-萤光素酶构建体转染各个克隆，并测定萤光素酶活性。使用细胞克隆需要数月准备，并带来许多变数，包括已有的宿主细胞不均一性以及载体整合的不同位点(载体DNA可能干扰整合位点处的特定基因，并且该位点对于每个克隆各不相同)。此外，该方法产生很少的数据点，每个数据点得自不同克隆的不同转染。因此，新系统比现有方法不仅更加通用，而且更快速、准确。
实施例5激光扫描细胞计量术(LSC)不同于流式细胞术，LSC测定玻片上细胞的多色荧光和光散射，并记录所分析的每一细胞的测定位置和时间。该技术提供的数据与流式细胞术相当，但具有基于显微镜载玻片的优点(Darzynkiewicz等人，1999；Kamentsky等人，1997)。由于利用GFP及其变体的荧光，流式细胞术所述技术也适用于LSC。
实施例6用于转录后分析的特定方法使用旨在确定特定3’-UTR片段是否影响mRNA稳定性的研究实例，对此进行了充分概述。尽管该实例是一种瞬时表达，但也可以使用稳定转染。
(i).将3’-UTR片段连接到待测载体的3’-UTR克隆位点，与对照载体共转染Tet-Off细胞系。就双向载体而言，不需要对照载体。实际上，由于可以测定来自同一转染的样品的衰减速率，典型应用不需要对照报道分子或载体。将5’-UTR片段插入载体的5’-UTR克隆位点进行测试。
(ii).细胞在没有强力霉素(或四环素)的存在下生长6-48小时，使两个载体表达。另外，细胞在低剂量强力霉素(或四环素)下生长6-48小时，以阻断转录，然后转到无强力霉素(或四环素)的培养基中2-12小时，使转录短暂突发。
(iii).然后应用高剂量强力霉素(或四环素)关闭两个载体的转录。
(iv).(利用流式细胞术、荧光测定法或LSC)按时间过程测定在加入强力霉素(或四环素)以后两个报道分子的荧光。
如果该克隆元件赋予mRNA不稳定性，将观察到″待测″荧光比相同细胞或样品的″对照″荧光下降更快。可使用类似研究测试mRNA元件对某些刺激物的反应，或者在不同细胞、或表达不同数量特定蛋白质(例如RNA结合蛋白质)的细胞中的作用。在强力霉素之后应用刺激物，确定已有转录本是否受该刺激物影响。在不同位置(例如5’-UTR、3’-UTR)插入所述元件，确定其功能是否依赖于所处位置。在载体的报道分子编码区插入蛋白质/多肽的编码序列(框架内)，可用于确定该序列对mRNA和蛋白质稳定性的影响。
可以从转染细胞中提取RNA，用于直接测定报道mRNA。
实施例7转录报道载体所述载体是适于在大肠杆菌中扩增、并在真核细胞中表达荧光报道分子的质粒。所述质粒可能成套使用。每套载体由一种或多种″对照″载体和一种或多种″待测″载体组成。每套中的每一载体都表达相似的去稳定mRNA以及相似的去稳定荧光报道蛋白质。除了此类质粒的标准特征(氨苄青霉素抗性、复制起点等)之外，每个质粒包含下列构建体(也参见图2和3)5’----MCS/启动子----转录起始位点----5’UTR---ATG--vEGFP编码区-终止密码子-带有mRNA去稳定性元件的3’-UTR---多腺苷酸化信号其中MCS/启动子代表多克隆位点(待测载体；参见图2a)，或组成型活性启动子，例如SV40(对照载体；参见图2b)，或诱导型启动子，例如TRE-mCMV(对照载体；参见图2c)。
ATG代表翻译起始密码子。
终止密码子代表翻译终止密码子。
5’UTR代表5’非翻译区。
带有mRNA去稳定性元件的3’UTR代表包含一个或多个所述mRNA去稳定性元件的3’非翻译区。
vEGFP代表EGFP的去稳定性变体。为每种去稳定性修饰(例如，1小时半衰期、2小时半衰期)提供一套质粒。在每套质粒中，为每种不同颜色变体提供一个载体。例如，一套质粒包含表达d1EGFP、d1EYFP、d1ECFP的载体，而另一套表达d2变体。
在其它实例中，将对照和一种上述待测报道分子共同引入单个载体、优选双向质粒中(参见图3)。
实施例8转录后报道载体与包含TRE-mCMV启动子的转录报道″对照″载体类似，只是3’-UTR的mRNA去稳定性元件替换为MCS(参见图4a)。在某些实施方案中，MCS也位于5’UTR和/或编码区。
这种构建体可用作″待测″或″对照″载体，用于此处所述转录后分析。
在其它实例中，将对照和一种上述待测报道分子共同引入单个载体、优选双向质粒中(参见图4b)。
实施例9
供分析特定途径的报道载体与此处所述载体类似，其中已在MCS中插入调节元件，以供研究或测定该调节元件的功能。例如，与此处所述转录报道质粒类似的质粒，只是在MCS中包含对诸如表I所示途径具有反应性的启动子、或启动子元件、或增强子，和/或包含如Clontech’s Mercury PathwayProfiling Systems所述的任何下列顺式作用增强子元件AP1、CRE、E2F、GRE、HSE、ISRE、Myc、NFAT、NFκB、p53、Rb、SRE。该报道分子优选GFP、萤光素酶或SEAP的去稳定形式。
供分析特定途径的细胞系和小鼠此处描述了稳定表达一种或多种载体的细胞系或遗传修饰的小鼠。
实施例10使用方法除此处所述新方法以外，基本上按与其所取代的现有载体相同的方法使用本发明所述载体进行实验。
构建方法使用标准克隆技术组建此处所述载体和DNA构建体。易于在多种常用载体中获得此处所述SV40和TRE-mCMV启动子以及更标准化的质粒载体成分(例如复制起点、抗生素抗性或另一选择基因)。编码EGFP的去稳定变体(例如d1EGFP、d1EYFP、d1ECFP以及d2EGFP、d2EYFP、d2ECFP)的DNA序列可得自Clontech(ClontechLaboratories Inc.，Palo Alto，CA，USA)。将编码短寿蛋白质降解结构域(或其突变体)的序列融合到DsRed编码区的3’端，构建编码去稳定DsRed变体的DNA序列。例如，小鼠鸟氨酸脱羧酶的422-461氨基酸，其中包含PEST序列。这种序列可能来源于现有dEGFP变体。
实施例11总结总之，目前可获得所示载体和方法
·引入一种或多种mRNA不稳定性元件、以便提供相对短寿的mRNA的表达载体或其部分。与现有表达载体相比，此处要求保护的载体提供了与启动子活性更紧密相关的蛋白质表达动力学。例如，显著降低了在降低的启动子活性与降低的mRNA和蛋白水平之间的时间延迟。
·编码去稳定mRNA、随后编码去稳定蛋白质的表达载体或其部分。与现有表达载体相比，此处要求保护的载体提供了与启动子活性更紧密相关的蛋白质表达动力学。
·表达载体或其部分，其中mRNA去稳定性元件由克隆自诸如c-fos等短寿mRNAs的序列组成，短寿mRNAs的例子包括；c-fos、c-myc、GM-CSF、IL-3、TNF-α、IL-2、IL-6、IL-8、尿激酶、bcl-2、SGLT1(Na(+)-偶联的葡萄糖转运蛋白)、Cox-2(环加氧酶2)、IL-8、PAI-2(纤溶酶原激活物抑制剂2型)、β1-肾上腺素能受体、GAP43(5’UTR和3’UTR)、富含AU的元件(AREs)和/或富含U的元件，包括但不限于单个、串联、或多个、或重叠拷贝的九聚体UUAUUUA(U/A)(U/A)(其中U/A是A或U)(Lagnado等人1994)、和/或五聚体AUUUA(Xu等人1997)、和/或四聚体AUUU(Zubiaga等人1995)。也包括上列元件的微小修饰或改变。术语″串联拷贝″允许一个或多个外侧的核苷酸复制和/或非复制。例如，五聚体AUUUA的串联拷贝包括序列诸如AUUUAUUUAUUUA和AUUUAAUUUAAUUUA。短寿mRNAs的3’UTR或5’UTR区通常包含去稳定性序列。
·表达载体或其部分，使用此处所述载体鉴定或确认其中mRNA去稳定性元件，该载体提供了显著改进的鉴定这种元件的方法。
·表达载体或其部分，其中该去稳定mRNA编码短寿的报道蛋白质，例如EGFP或萤光素酶的去稳定变体。与现有报道载体相比，此处要求保护的载体提供了与启动子活性更紧密相关的报道分子表达动力学。例如，显著降低了在降低的启动子活性与降低的mRNA和蛋白水平之间的时间延迟。
·成套的报道载体或其部分，其类似地编码去稳定mRNAs(与同一套中其它载体类似)，随后类似地编码(与同一套中其它载体类似)EGFP或DsRed或其它荧光标志的去稳定变体。每套中的一种或多种载体(对照载体)包含组成型启动子(例如SV40、CMV、RSV、TK、TS；参见图2b)、或诱导型启动子(例如TRE-mCMV；参见图2c)，而每套中的其它载体(待测载体)包含克隆位点(例如，MCS)，而非启动子(例如，参见图2a)。这些载体的应用包括但不限于研究或测定启动子活性。例如，可以将目的启动子元件克隆到编码d1EGFP的待测载体的MCS中，相对于表达d1EYFP的对照载体测定报道分子表达。本发明还要求保护详细描述的各个载体，例如双向载体或在同一载体中引入待测和对照报道分子构建体的其它单个载体系统(例如，图3a和图3b)。与现有成套的报道载体相比，此处要求保护的成套载体具有下列优点a).更近乎实时的测定启动子活性。
b).因对照和待测构建体之间密切相似而降低误差。
c).降低由待测启动子与对照启动子之间的串扰所致误差。利用对照载体中的诱导型启动子，通过在有和没有诱导的情况下测定，使这种串扰最小化和/或鉴定并修正。
d).可与所述流式细胞术/LSC方法联用。
·报道载体、或成套报道载体、或其部分，利用诱导型启动子，优选而不只是四环素反应性元件(TRE)，以便驱动去稳定荧光报道蛋白质(优选而不只是去稳定EGFP变体)的表达。该载体的3’UTR(例如图4a)和/或5’-UTR和/或报道分子编码区包含克隆位点，以便将调节元件或推定的调节元件克隆到表达单色荧光报道分子的载体中，如果需要，则与表达不同颜色报道分子、但并不包含目的元件的对照载体相比较。由于可以利用诱导型启动子按需关闭转录，该载体可应用于研究或测定转录后调节。这些载体具有的优点包括b-d中所列、能够将转录后影响与转录影响分开，以及a).引入其它载体所没有的方便的克隆位点；以及b).该技术比任何现有方法更为快速。
·单载体系统，其基本上连接一个待测和一个对照构建体(例如图4b)。待测和对照报道分子均由诱导型启动子驱动，克隆位点可以将调节元件只连入待测构建体。除所述载体的优点之外，单载体系统消除了与分开的待测和对照载体的共转染有关的问题和不准确性。
·使用流式细胞术或LSC测定由所述载体表达的2种或更多荧光报道分子的水平。在此应用中，该方法每种试样产生成千上万个数据点，相比之下，现有基于酶的分析只产生一个数据点。可以逐一测定每个细胞中两种或更多报道分子(对照和待测)以及其它参数(例如DNA含量、其它蛋白质的水平)。本发明也包括使用流式细胞术使相同样品的多个细胞中的2种或更多的报道分子水平相关，并利用该数据优化转染方案和/或确定与共转染有关的问题。例如，在待测与对照报道分子水平之间缺少良好线性关系，即确定为无效样品。现有方法无法注意这种误差。
·本发明要求保护利用转录后报道载体的方法。使用旨在确定特定3’-UTR片段是否影响mRNA稳定性的研究实例，对这些方法进行了充分概述。尽管该实例属于瞬时表达，但其可以使用稳定转染。
(i).将3’-UTR片段连接到待测载体的3’-UTR克隆位点，与对照载体共转染Tet-Off细胞系。就单载体系统而言，不需要对照载体。将5’-UTR片段插入载体的5’-UTR克隆位点进行测试。
(ii).细胞在没有强力霉素(或四环素)的存在下生长6-48小时，使两个载体表达。另外，细胞在低剂量强力霉素(或四环素)下生长6-48小时，以阻断转录，然后转到无强力霉素(或四环素)的培养基中2-12小时，使转录短暂突发。
(iii).然后应用高剂量强力霉素(或四环素)关闭两个载体的转录。
(iv).(利用流式细胞术、荧光测定或LSC)按时间过程测定在加入强力霉素(或四环素)以后，两个报道分子的荧光。
如果该克隆元件赋予mRNA不稳定性，将观察到″待测″荧光比相同细胞或样品的″对照″荧光下降更快。可使用类似研究测试mRNA元件对某些刺激物的反应，或者在不同细胞、或表达不同数量特定蛋白质(例如RNA结合蛋白质)的细胞中的作用。在强力霉素之后应用刺激物，将确定已有转录本是否受该刺激物影响。在不同位置(例如5’-UTR、3’-UTR)插入该元件，将确定其功能是否依赖于所处位置。在载体的报道蛋白质编码区插入蛋白质/多肽的编码序列(框架内)，可用于确定该序列对mRNA和蛋白质稳定性的影响。
可以从转染细胞中提取RNA，用于直接测定报道mRNA。
·本发明要求保护瞬时或稳定表达一种或多种表达构建体或其部分的细胞系。
·本发明要求保护瞬时或稳定表达一种或多种表达构建体或其部分的细胞系，其中该表达构建体包含可作为与人类疾病和/或对药物处理反应有关的信号转导途径的活化标志的调节元件。该途径包括但不限于表1所列以及本文另外所示(例如CRE、SRE、AP1、细胞周期蛋白A、B和D1启动子)。
·本发明要求保护表达一种或多种表达构建体或其部分的转基因小鼠、敲入(khock-in)小鼠或其它遗传修饰的小鼠。
·本发明要求保护表达一种或多种表达构建体或其部分的转基因小鼠、敲入小鼠或其它遗传修饰的小鼠，其中该表达构建体包含可作为与人类疾病和/或对药物处理反应有关的信号转导途径的活化标志的调节元件。该途径包括但不限于表1所列。
·DsRed的去稳定性变体或突变的DsRedl-E5。其通过将来自多种不稳定蛋白质的降解结构域(或其突变体)与DsRed的C端融合进行构建。例如，小鼠鸟氨酸脱羧酶的422-461氨基酸，其中包含PEST序列(Li等人1998)。还可以添加其它的去稳定性元件。本发明也涉及编码DsRed的去稳定变体的DNA构建体。
·编码所述DsRed的去稳定变体的载体，包括还包含所述mRNA不稳定性元件的载体。
·以下用于产生Tet-Off或Tet-On细胞系的方法使用标准技术将tTA或rtTA表达载体、优选逆病毒、腺病毒或质粒，在目的细胞系中稳定表达，通过抗药性标志分离表达细胞。然后利用TRE-vGFP构建体瞬时转染这些细胞，经过几轮流式细胞术的细胞分类。例如，良好的Tet-Off细胞在强力霉素存在下应当不显示荧光，并因而分选。进一步在没有强力霉素的情况下5-48小时以后，分选绿色细胞。最后，细胞在没有强力霉素的情况下生长一周或更长时间，进行最后一次分选，去除稳定转染的(绿色)细胞。
实施例12引入mRNA和蛋白质去稳定性元件的载体目的编码区(例如诸如EGFP或萤光素酶等报道分子)可以包括蛋白质去稳定性元件(例如，MODC的d1突变体；Clontech，并且包括其它PEST序列或其它蛋白质去稳定性元件，例如泛素化位点)以及mRNA去稳定性元件(例如，富含AU的元件)的组合序列。
例如，将萤光素酶和DsRed的终止密码子替换为Hind3位点(AAGCTT)，以便添加序列AAGCTTAGCCATGGCTTCCCGCCGGCGGTGGCGGCGCAGGATGATGGCACGCTGCCCATGTCTTGTGCCCAGGAGAGCGGGATGGACCGTCACCCTGCAGCCTGTGCTTCTGCTAGGATCAATGTGTAG，这是Clontech MODC的d1突变体，其使EGFP的半衰期为1小时。其后是接头(成为3’UTR的一部分)，然后UUAUUUAUU GGCGG UUAUUUAUU CGGCG UUAUUUAUU GCGCG UUAUUUAUUACTAG，其中包含4个九聚体，也在处于3’UTR、但更下游的位置与亲本载体(pGL3；Promega)的Xbal位点相连。
实施例13PCR产物的直接连接在载体的MCS中包含两个分开而又靠近的RE识别位点，在利用一个或多个RE切割时，在遗留载体的两端产生单个核苷酸T的3’突出端。例如，Ec1HK1的识别序列是GACNNN，NNGTC(在5’的第3和第4个N之间切割，在每个末端留下单个N的3’突出端)。将这些位点中的两个引入MCS中，以便利用Ec1HK1消化释放两者之间的较短区域，产生每端带有单个N的3’突出端的线性化载体。此例中，上游识别序列应当为5’GACNNTNNGTC3’，下游序列为5’GACNNANNGTC3’。利用Ec1HK1切割以后，大的载体片段的两端包含单个3’T突出端(类似于Promega pGEM-T Easy载体)。这便于直接连接由诸如Taq等产生5’A突出端的聚合酶所产生的PCR产物。这相比标准MCS有了显著改善，如果没有包含RE位点的PCR引物以及PCR产物的随后消化，标准MCS便不支持PCR产物的直接连接。这相比pGEM-T Easy载体也具有显著改善，pGEM-T Easy载体不能扩增(以线性形式供应)，并只能用于亚克隆(即，一般将PCR产物连接到pGEM-T Easy、扩增，然后利用RE消化移出，接着克隆到目的表达载体)。因此，所示MCS允许直接连接PCR产物，而无需利用RE消化(经常出问题)或亚克隆到中间载体。
实施例14去稳定的报道模型显示改进的实时分析使用标准克隆技术，在pGL3-Basic(Promega)主链中(氨苄青霉素抗性基因等)装配质粒报道载体。将来源于Clontech pTRE-d2EGFP载体的四环素反应性元件(TRE)插入MCS中。在某些构建体中，将萤光素酶编码区替换为Clontech的d1EGFP或d2EGFP编码序列(包括Kozak序列)。使用具有方便的5’侧翼RE位点的合适引物，通过PCR完成。在某些构建体中，将特定的mRNA去稳定性元件克隆到3’UTR编码区。这些序列一般通过合成、然后使有义和反义序列杂交而制备。侧翼序列提供突出″粘端″，其与3’UTR编码区经特定限制酶切割产生的末端匹配。利用这些酶消化载体并随之纯化以后，使用标准技术将杂交的寡聚物连接入载体。使用合适来源的基因组DNA或cDNA的PCR，作为获得诸如c-myc-ARE等大的去稳定性元件的另一方法。将很小的元件(例如1或2个九聚体)引入反向PCR引物，其中包含5’侧翼RE位点以及与载体模板中已有的3’UTR互补的3’侧翼区。利用合适的正向引物(与蛋白质编码区互补，并与内源性RE位点重叠)进行PCR以后，使用合适的RE位点消化PCR产物，并连接到原始载体中。
符号说明B＝来源于Promega pGL3-Basic的载体主链T＝来源于Clontech pTRE-d2EGFP载体的四环素反应性元件(TRE)，用作驱动报道分子转录的启动子。
G1＝用作报道分子的半衰期为1小时的GFP，即Clontech所定义的d1EGFP蛋白质编码序列。
G2＝用作报道分子的半衰期为2小时的GFP，即Clontech所定义的d2EGFP蛋白质编码序列。
L＝用作报道分子的萤光素酶，即来自pGL3-Basic(Promega)的荧火虫萤光素酶编码序列。
R＝用作报道分子的DsRed2R1＝羧基端融合与d1EGFP中相同的MODC突变体的DsRedN6＝插入3’UTR编码区的6个拷贝的TTATTTATT九聚体(SEQ IDNO1)。
N4＝插入3’UTR编码区的4个拷贝的TTATTTATT九聚体。
N2＝插入3’UTR编码区的2个拷贝的TTATTTATT九聚体。
N1＝插入3’UTR编码区的1个拷贝的TTATTTATT九聚体。
fos＝插入3’UTR编码区的、由Shyu等人(1989)所确定的c-fos ARE，即5’AAAACGTTTTATTGTGTTTTTAATTTATTTATTAAGATGGATTCTCAGATATTTATATTTTTATTTTATTTTTTT3’.(SEQ ID NO2).
myc＝如下定义的myc ARE5’ATGCATGATCAAATGCAACCTCACAACCTTGGCTGAGTCTTGAGACTGAAAGATTTAGCCATAATGTAAACTGCCTCAAATTGGACTTTGGGCATAAAAGAACTTTTTTATGCTTACCATCTTTTTTTTTTCTTTAACAGATTTGTATTTAAGAATTGTTTTTAAAAAATTTTAAGATTTACACAATGTTTCTCTGTAAATATTGCCATTAAATGTAAATAACTTT3’(SEQ ID NO21)方法使用Fugene试剂(Roche)，将5μg大量制备质量的DNA转染10cm培养瓶中～50％铺满的HeLa Tet-Off细胞(Clontech)。～10小时以后，培养瓶中细胞各分为～12个小皿(6cm)，然后培养过夜(～12-14小时)。此时间点(一般指定为零时或T0)，在大部分平皿的培养基中加入强力霉素，终浓度为1μg/ml。在当前以及随后的时间点，利用胰蛋白酶处理细胞并收集。对于表达GFP的构建体而言，使用标准FITC滤光片，通过流式细胞术分析这些样品。通过分选出非转染细胞(只有本底荧光)测定总的GFP荧光，然后将每个细胞的平均荧光(减去本底荧光)乘以阳性细胞数。使用合适的滤光片，类似测定RFP荧光(DsRed)。裂解利用萤光素酶编码载体转染的细胞，使用Promega双萤光素酶分析方法和试剂在发光计中测定。
数据一般表示为相对于零时的剩余报道分子(荧光或发光)的百分比。
由于零时加入的强力霉素引起报道分子的转录阻断，报道分子水平的降低速率可表示在改变的转录和改变的报道分子/蛋白质水平之间的时间延迟。本发明的首要目的在于降低该时间延迟，图7、8、9和11-14表明此目的已达到。
作为本发明的应用实例，制药公司可能希望筛选可降低疾病相关基因转录的药物。四环素/强力霉素诱导的TRE启动子转录阻断即是该系统的一种模式。图7和8显示利用标准萤光素酶报道载体，按10小时内萤光素酶活性的下降甚至检测不到总的转录阻断(使用强力霉素)。检测到去稳定EGFP突变体总的转录阻断为EGFP荧光在11小时(d2EGFP；BTG2)或7小时(d1EGFP；BTG1)内下降50％，因而其显示了改善。然而，当后一报道分子结合诸如4个拷贝的九聚体UUAUUUAUU(BTG1N4)等mRNA去稳定性元件时，检测到报道分子水平在3小时内下降50％。由此可见，利用包含去稳定性的构建体也可以很快检测到转录增加(Roth，1995)。
当然，强力霉素的作用并不迅速，由于该药物诱导100％的转录阻断需要时间，而致部分时间延迟。因此，在加入强力霉素后4小时的时间点之后并相对于该时间点绘制数据点，测定″有效衰变速率″(图9)。有效衰变速率从而排除了药物作用的延迟，乃蛋白质和mRNA半衰期的综合效应。图9显示利用包含1、2或4个九聚体的构建体的有效衰变速率。这些数据表明，4个九聚体比2个更有效，2个比1个更有效。此外，这些数据表明，将半衰期1小时的蛋白质(d1EGFP)与4个九聚体组合，可以达到约1小时20分的有效衰变速率。这非常接近于半衰期1小时的蛋白质，并表明mRNA半衰期极短。组合2个或多个不同的mRNA不稳定性元件，可以实现进一步下降(图13)。然而，大部分应用可能并不需要如此。需要更适度去稳定性效应的应用可以利用1个或2个九聚体，而非4个。
利用标准的萤光素酶报道分子，在加入强力霉素后，荧光实际上增强了。这点在按线性标度表示数据时(图8)最为明显，可以部分解释为强力霉素作用的延迟。然而，即使上溯4个小时，衰变也不明显，表明该报道分子不适用于测定转录随时间的变化。图10揭示了该载体的另一个问题。这些数据涉及在无任何处理或药物的情况下，报道分子水平随时间的变化(转染后24-34小时)。报道分子水平一般在转染后头24小时内提高，此时质粒进入细胞并开始表达。一般在约48小时观察到下降，此时质粒从细胞中排出。因此，一般在24-48小时进行测定。在无药物或处理时，包含不稳定性元件的新载体(BTG1N4)显示极好的报道分子水平稳定性。相比之下，萤光素酶载体的表达水平显然尚在猛升。具有中度稳定性的构建体(例如BTG1)显示中间结果。显而易见，半衰期较长的mRNA和蛋白质报道分子将经历较长的上升期，如图10所示。观察到在24-34小时的临界期内，新的构建体具有更稳定的表达水平，这便于精确测定，因而代表本发明的另一优点。
可以比较其报道mRNA序列不同(例如3’UTR)、但编码相同蛋白质或具有相同半衰期的不同蛋白质(例如d2EGFP、d2EYFP)的两种或多种构建体之间报道分子水平的下降速率。在这方面，衰变速率的差别表明改变的mRNA序列对mRNA稳定性的影响。例如，在3’UTR中存在4个以DNA为TTATTTATT(SEQ ID NO1)的UUAUUUAUU九聚体(图7-9)或c-fos ARE(图11)(SEQ ID NO2)，可显著提高mRNA的衰变速率。除了证明这些元件的有效性之外，所用方法和载体也代表了用于检测其它顺式作用mRNA稳定性/不稳定性元件的显著改进的系统，此处也包含了这种方法。
如图12-14所示，mRNA去稳定性元件与萤光素酶、GFP和DsRed一起作用，这些报道分子之间没有低水平的同源性。DsRed与EGFP只具有23％同源性。如图14所示，myc ARE(SEQ ID NO21)是有效的，与不同的去稳定性元件联用也有效。
实施例15mRNA去稳定性元件根据本发明，RNA去稳定性元件可以特别来源于下列基因的3’UTR。在大多数情况下，可以使用全长的3’UTR。然而，常常可单独使用富含U和/或富含AU的元件。
a)磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)mRNA去稳定性元件，如Laterza OF等人所述。位于3’UTR的3’部分的区域称为JW6和JW7，即GTATGTTTAAATTATTTTTATACACTGCC CTTTCTTACCTTTCTTTACATAATTGAAATAGGTATCCTGACCA(SEQ ID NO4)。
b)果蝇(Drosophila melanogaster)Bicoid基因3’UTR的前43nt包含mRNA去稳定性元件(Surdej P.等人)，该元件可特别用于使昆虫细胞中的mRNA去稳定性。
c)人硫氧还蛋白还原酶基因(Gasdaska，JR等人)。完整的3’UTR。1933-3690位核苷酸(包含6个富含AU的元件)。包含3个上游AU重复的片段(1975-3360位核苷酸)。nt 1933-2014处还有不富含AU的去稳定性元件。
d)热稳定抗原(HSA)基因，如Zhou，Q等人所述。例如，3’UTR中的1465-1625位核苷酸。
e)粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)ARE，如Chyi-Ying，A等人所述。AGUAAUAUUUAUAUAUUUAUAUUUUUAA AAUAUUUAUUUAUUUAUUUAUUUAA，即DNAAGTAAUATTTATATA TTTATATTTTTAAAATATTTATTTATTTA TTTATTTAA(SEQ ID NO5)。
f)c-fos全长3’UTR、或其部分、或ARE，由Shyu等人确定的5’AAAACGTTTTATTGTGTTTTTAATTTATTTATTAAGATGGATTCTCAGATATTTATATTTTTATTTTATTTTTTT3’(SEQ ID NO2)。
或由Peng，S等人确定的5’TTTTATTGTGTTTTTAATTT ATTTATTAAGATGGATTCTCAGATATTTATATTTTTATTTTATTTTTTTT3’(SEQ ID NO6)。
g)c-jun ARE，如Peng，S等人所述。5’UUUCGUUAACUGUGUAUGUACAUAUAUAUAUUUUUUAAUUUGAUUAAAGCUGAUUACUGUGAAUAAACAGCUUCAUGCCUUUGUAAGUU3’，DNA序列5’TTTCGTTAACTGTGTATGTACATATATATATTTTTTAATTTGATTAAAGCTGATTACTGTG AATAAACAGCTTCATGCCTTTGTAAGTT3’(SEQ ID NO7)。
或其不包含多腺苷酸化(AAUAAA)信号的突变体，即5’UUUCGUUAACUGUGUAUGUACAUAUAUAUAUUUUUUAAUUUGAUUAAAGCUGAUUACUGUGgAUccACAGCUUCAUGCCUUUGUAAGUU3’or as DNA 5’TTTCGTTAACTGTGTATGTACATATATATATTTTTTAATTTGATTAAAGCTGATTACTGTGgATccACAGCTTCATGCCTTTGTAAGTT3’(SEQ ID NO8)。
h)来自下列基因、包括其各自ARE成分的序列，如Henics，T.等人所述；IFN-γARE5’UCUAUUUAUUAAUAUUUAACAUUAUUUAUAUAUGGG3’，或DNA为5’TCTATTTATTAATATTTAACATTATTTATATATGGG3’(SEQ ID NO9)。
i)IL-2 ARE5’CUCUAUUUAUUUAAAUAUUUAACUUUAAUUUAUUUUUGGAUGUAUUGUUUACUAACUUUUAGUGCUUCCCACUUAAAACAUAUCAGGCUUCUAUUUAUUUAAAUAUUUAAAUUUUAUAUUUAUU3’，或DNA为5’CTCTATTTATTTAAATATTTAACTTTAATTTATTTTTGGATGTATTGTTTACTAACTTTTAGTGCTTCCCACTTAAAACATATCAGGCTTCTATTTATTTAAATATTTA AATTTTATATTTATT3’(SEQ ID NO10)。
j)c-myc ARE(也参见SEO ID NO21)5’AUAAACCCUAAUUUUUUUUAUUUAAGUACAUUUUGCUUUUAAAGUU3’，或DNA为5’ATAAACCCTAATTTTTTTTATTTAAGTACATTTTGCTTTTAAAG TT3’(SEQ ID NO11)。
k)IL-105’UAGAAUAUUUAUUACCUCUGAUACCUCAACCCCCAUUUCUAUUUAUUUACUGAGCUUCUCUGUGAACGAUUUAGAAAGAAGCCCAAUAUUAUAAUUUUUUUCAAUAUUUAUUAUUUUCA3’，或DNA为5’TAGAATATTTATTACCTCTGATACCTCAACCCCCATTTCTATTTATTTACTGAGCTTCTCTGTGAACGATTTAGAAAGAAGCCCAATATTATAATTTTTTTCAATATTTATTAT TTTCA3’(SEQ ID NO12)。
1)bcl-2来自bcl-2 3’UTR、包含全部或部分bcl-2 ARE的序列，如Schiavone，N等人确定，5’UCAGCUAUUUACUGCCAAAGGGAAAUAUCAUUUAUUUUUUACAUUAUUAAGAAAAAAGAUUUAUUUAUUUAAGACAGUCCCAUCAAAACUCCGUCUUUGGAAAUC3’(来自nt 2371-2475的M13994)，或DNA为5’TCAGCTATTTACTGCCAAAGGGAAATATCATTTATTTTTTACATTATTAAGAAAAAAGATTTATTTATTTAAGACAGTCCCATCAAA ACTCCGTCTTTGGAAATC3’(SEQ IDNO13)。
m)TNF ARE，如Xu，N等人所述，5’AUUAUUUAUUAUUUAUUUAUUAUUUAUUUAUUUA3’，或DNA为5’ATTATTTATTATTTATTTATTATTTATTTATTTA3’(SEQ ID NO14)。
n)IL3 ARE，如Xu，N等人所述，5’UAUUUUAUUCCAUUAAGGCUAUUUAUUUAUGUAUUUAUGUAUUUAUUUAUUUAUU3’，或DNA为5’TATTTTATTCCATTAAGGCTATTTATTTATGTATTTATGTATTTATTTATTTATT3’(SEQ ID NO15)。
o)九聚体UUAUUUAUU，DNA为TTATTTATT(SEQ ID NO1)，如Zubiaga，A等人所述。
p)九聚体UUAUUUA(U/A)(U/A)，DNA为TTATTTA(T/A)(T/A)(SEQ ID NO3)，如Lagnado，C等人所述。
q)五聚体AUUUA，如Xu，N等人所述，或DNA为ATTTA(SEQ IDNO16)。
r)四聚体AUUU，或DNA为ATTT(SEQ ID NO17)。
一般既为I型又为II型的富含AU元件(AREs)，如Chen，C和Shyu，A所述。
具有作为去稳定性元件的DST(下游序列)的植物。DST序列由Newnan，T等人确定。提议的DST共有序列为GGAgN2-9cATAGATTaN3-8(A/C)(T/A)(A/T)TttGTA(T/C)s)这是基于9个不同DST序列的比较。
黑体＝在9/9的基因中保守的。
大写＝在至少7/9的基因中保守的。
N2-9＝2-9个核苷酸的长度可变区；平均＝5。
N3-8＝3-8个核苷酸的长度可变区；平均＝6。
距终止密码子的距离＝19-83nt。
DST序列的其它实例包括大豆10A5基因；5’GGAGN5CATAGATTAN8AAATTTGTAC3’(SEQ ID NO18)。
拟南芥SAURAC1基因；5’GGAAN9CATAGATCGN8CAATGCGTAT3’(SEQ ID NO19)。
DST序列是供植物使用的富含AU元件的替换物。富含AU元件和DST序列均使植物中的转录本去稳定性。
t)铁效应性元件(IRE)Thomson，A等人，1999。
IREs的发夹环中包含共有序列CAGUG。
实例铁蛋白IRE；GUUCUUGCUUCAACAGUGUUUGAACGGAAC，或DNA为GTTCTTGCTTCAACAGTGTTTGAACGGAAC(SEQ ID NO20)。
转铁蛋白受体IRE；GAUUAUCGGGAGCAGUGUCUUCCAUAAUC，或DNA为GATTATCGGGAGCAGTGTCTTCCATAATC(SEQ ID NO21)。
铁调节蛋白(IRPs；例如IRP1和2)以铁依赖性方式结合IREs。也通过其它多种刺激物和处理(例如，氧化压力、一氧化氮、红细胞生成素、甲状腺激素或PKCs的磷酸化作用)调节结合。
IREs可以调节翻译效率和mRNA稳定性。例如，铁蛋白mRNA的5’UTR IRE只有在结合IRP时，才阻断翻译。转铁蛋白受体mRNA3’UTR的IREs在结合IRP时抑制mRNA衰变。因此，可以将IREs插入表达载体的5’UTR或3’UTR，以便可以通过调节铁水平或其它刺激物来控制表达。
去稳定性元件可以使用Clontech’s Mercury PathwayProfiling载体以及体内激酶分析试剂盒。Clontech出产3种不同的蛋白质去稳定性元件，均包含PEST序列，并均来源于MODC基因。位于EGFP羧基端的不同MODCs突变体可提供1、2和4小时的半衰期的蛋白质。可以使用本发明的mRNA去稳定性元件连接上述或其它任何蛋白质去稳定性元件(例如，泛素化信号)。
u)c-myc ARE也可确定为5’ATGCATGATCAAATGCAACCTCACAACCTTGGCTGAGTCTTGAGACTGAAAGATTTAGCCATAATGTAAACTGCCTCAAATTGGACTTTGGGCATAAAAGAACTTTTTTATGCTTACCATCTTTTTTTTTTCTTTAACAGATTTGTATTTAAGAATTGTTTTTAAAAAATTTTAAGATTTACACAATGTTTCTCTGTAAATATTGCCATTAAATGTAAATAACTTT3’(SEQ ID NO22)。
另一可用的mRNA元件可以得自组蛋白mRNA，具体而言，包括共有序列茎环结构的3’UTR序列，如Gallie，D等人所述TGA-N20-40-CCAAAGGYYYUUYUNARRRCCACCCA，其中Y＝嘧啶，R＝嘌呤，N＝任何核苷酸，或DNA为TGA-N20-40-CCAAAGGYYYTTYTNARRRCCACCCA(SEQ ID NO23)。
该序列可以提高翻译效率。此外，它们能够在S期之外特定引起mRNA衰变。本发明涉及包含细胞周期特异性启动子、连同mRNA去稳定性元件的报道构建体，作为引导细胞周期特异性表达(例如报道分子)的工具。组蛋白3’UTR元件在G2期引导的mRNA衰变强于S期，从而进一步限制蛋白质表达于S期，因此提供了可供S期或晚G1期特异性启动子使用的另一选择。
表达载体中的3’UTR元件的另一用途在于，特异性定位嵌合mRNA。例如，营养不良蛋白相关蛋白(utrophin)3’UTR能够引导报道mRNA到达结合细胞骨架的多聚核糖体。该3’UTR也包含mRNA稳定性元件(Gramolini，A等人)。
实施例16mRNA稳定性元件以及编码稳定的mRNA的表达载体稳定性序列可能包含富含CT元件和/或来源于长寿mRNAs(特别是3’UTR区)的序列。
富含CT元件可能包含(C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC，如Holcik和Liebhaber，1997所述。
富含CT元件可能包含下列元件CCTCCTGCCCGCTGGGCCTCCCAACGGGCCCTCCTCCCCTCCTTGC或其部分，包括CCTCC，CCTCCTGCC或CCCTCCTCCCCTGG本发明也涉及来自Yu和Russell所述人β-球蛋白3’UTR的14nt富含嘧啶区，用作稳定性元件。
稳定性元件所来源的长寿mRNAs的例子包括；α2球蛋白、α1球蛋白、β球蛋白。来自人、小鼠、兔或其它物种的牛生长激素3’UTR。
此处所述mRNA不稳定性元件一般主要作用于使嵌合基因去稳定性。由此可见，mRNA稳定性元件常常隐性作用。例如，在兔β-球蛋白基因中插入c-fos ARE，尽管依旧存在mRNA稳定性元件，仍产生去稳定性的转录本(Shyu，A等人1989)。α和β-球蛋白mRNAs均包含定位于各自3’UTRs的稳定性元件，但δ-球蛋白mRNA缺少这些元件，较不稳定。将δ-球蛋白3’UTR替换为α球蛋白mRNA的3’UTR，几乎使mRNA稳定性倍增(Russell，J等人1998)。然而，该元件不能稳定所有的转录本。因此，为产生表达稳定mRNA的表达载体，取决于所需稳定的原始mRNA而具有不同的要求。为产生这种载体，一般优选包括来自诸如α或β-球蛋白等稳定基因的大片段。这些例子中，该片段优选应包括完整的球蛋白3’UTR来替换内源性3’UTR。例如对δ-球蛋白而言，这往往足够了。然而常常需要另外引入蛋白质编码和/或5’UTR序列。一般而言，优选替换那些可能作为主要去稳定性元件的任何内源性富含AU或U的区域(可以使用此处所述方法进行鉴定)。可以将位于5’UTR或3’UTR中的这种区域简单替换为相同对应位置的α或β-球蛋白序列。可以通过同义密码子突变而使编码区不稳定性元件没有功能性。可以将球蛋白编码区引入目的基因的编码区，以便产生N端或C端融合蛋白质。但是这样常常并不理想，将球蛋白编码区(和3’UTR)定位于嵌合基因的3’UTR中，一般而言足矣。这样可以从更稳定的转录本表达目的蛋白质，因而显著提高了该蛋白质的水平。如果目的蛋白质是报道分子、或与报道分子融合、或容易与内源性蛋白质相区分，则此处所述TRE载体系统(参见图7)非常便于测试嵌合构建体的mRNA稳定性。
本领域技术人员应当知道，除明确描述的以外，此处所述本发明可能变化和改变。应当理解，此处所述本发明包括所有这类变化和改变。本发明也包括本说明书涉及或表明的所有这类方法、特征、组合物和化合物，不论单个或全体，以及任何两个或多个所述方法或特征的任何及所有组合。
表1可用于本发明的信号转导蛋白质信号转导蛋白质AKT(也称为PKB)Fas L/BIDJAK 7 StatMKK-47/JNKMTOR/p70 s6激酶NFκBp38PKA/Rap 1 B-rafRas/RafWnt/GSK3Erk 1&2
参考文献Chen，C and Shyu，A.Trends Biochem.Sci.1995vol 20 465-470.
Chyi-Ying，A et al. MCB 1995vol 15(10)5777-5788.
Contag，et al.Non-invasive localization of a light-emitting conjugate in a mammal UnitedStates Patent 5,650,135.July 22，1997.
Cormack，et al.FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein(GFP)United StatesPatent 5,804,387.September 8，1998.
Dandekar T et al Bioinformation 199814(3)271-278.
Darzynkiewicz.Laser-scanning cytometryA new instrumentation with many applications.Exp Cell Res 1999；2491-12.
Gallie，D et al.Nucleic Acids Res.1996vol24(10)；1954-1962.
Gasdaska，JR et al.JBC 1999vol 274(36)；25379-25385.
Gossen，et al.Tight control of gene expression in eucaryotic cells by tetracycline-responsivepromoters.United States Patent 5,464,758.November 7，1995.
Gramolini，A，et al.JBC 2001vol 154(6)1173-1183.
Henics，T.et al JBC 1999vol 274(24)17318-17324.
Holcik and Liebhaber，1997，PNAS vol 94 pp2410-2414.
Huet，X et al.Mol Cell Biol.1996；vol 16(7)3789-3798.
Ibrahim，et al.Pitfall of an internal control plasmidResponse of Renilla luciferase(pRL-TK)plasmid to dihydrotestosterone and dexamethasone.Biotechniques 2000；29682-684.
Kamentsky et al.Slide-based laser scanning cytometry.Acta Cytol 1997；41123-43.Li，et al.Generation of destabilised green fluorescent protein as a transcription reporter.J BiolChem 1998；27334970-34975.
Lagnado C et al，MCB，147984-7995，1994.
Laterza，OF et al Am J Physiol Renal Physiol.2000vol 279(5)F866-F873.
Leclerc G et al，Biotechniques 2000，29(3)590-595.
Lee，H et al.Gene Expr 1995；vol 4(3)95-109.
Li，et al.Rapidly degrading GFP-fusion proteins.United States Patent 6,130,313 October 10，2000.
Liu，J et al.JBC 2000；vol 275(16)11846-11851.
Newnan，T et al.The Plant Cell 1993vol 5；701-714.
Peng，S et al.MCB 1996vol 6(4)1490-1499.
Ross，J.Microbiological Reviews.1995vol 59(3)423-450.
Saito，T et al.Biochem Biophys Res Commun.1998；vol 252(3)775-778.
Schiavone，N et al.FASEB J.2000vol 14 174-184.
Shyu et al 1989Genes & Dev.Vol 3，pp60-72.
Stein，J et al.Int J Obes Relat Metab Disord.1996 Mar；20 Suppl 3S84-90.
Surdej，P and Jacobs-Lorena，M.MCB 1998 vol 18(5)2892-2900.
Thomson，A et al.Int.J Biochem Cell Biol.1999vol 31；1139-1152.
Tsien，et al.Modified green fluorescent proteins.United States Patent 5,625,048.April 29，1997.
Tsien，et al.Modified green fluorescent proteins United States Patent 5,777,079.July 7，1998.
Vazhappilly，R and Sucher，N.Neurosci Lett.2002；vol 318(3)153-157.
Xu W et al，MCB，17(8)4611-4621，1997.
Yu and Russell MCB Sept 2001 5879-88.
Zhou，Q et al.MCB 1998vol 18(2)815-826.
Zubiaga et al.MCB 1995；152219-30.
序列表<110>Gene Stream Pty Ltd<120>新型表达载体<130>2510548/VPA<160>23<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>9<212>DNA<213>萤火虫<400>1ttatttatt 9<210>2<211>75<212>DNA<213>哺乳动物<400>2aaaacgtttt attgtgtttt taatttattt attaagatgg attctcagat atttatattt60ttattttatt ttttt75<210>3<211>9<212>DNA<213>哺乳动物<400>3ttatttaww 9<210>4<211>73<212>DNA<213>哺乳动物<400>4gtatgtttaa attattttta tacactgccc tttcttacct ttctttacat aattgaaata60ggtatcctga cca 73<210>5<211>53<212>DNA<213>哺乳动物<400> 5agtaatattt atatatttat atttttaaaa tatttattta tttatttatt taa 53
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<221>misc_特征<223>Y是嘧啶R是嘌呤N是任何核苷酸<400>23ccaaaggyyy ttytnarrrc caccca 2权利要求
1.包含可转录多核苷酸的表达载体，其包含调节相应于所述可转录多核苷酸的转录本稳定性的RNA元件的编码核苷酸序列。
2.权利要求1的表达载体，其中所述的RNA元件是降低所述转录本稳定性的去稳定性元件。
3.权利要求1的表达载体，其中所述的RNA元件是提高所述转录本稳定性的稳定性元件。
4.权利要求2的表达载体，其中所述的可转录的多核苷酸包含目的多核苷酸，并编码多肽。
5.权利要求4的表达载体，其中所述的多肽包含报道蛋白质。
6.权利要求2的表达载体，其中所述的可转录的多核苷酸包含编码报道蛋白质的核苷酸序列。
7.权利要求1或2的载体，其包含选自以下的一种或多种成分(i)用于引入核苷酸序列的多克隆位点；(ii)报道基因(iii)用于调节所述可转录多核苷酸表达的启动子和/或增强子；(iv)多腺苷酸化序列；(v)选择性标记基因；以及(vi)复制起点。
8.权利要求7的载体，其另外包含至少一个可由酶学或生物化学方法断裂的位点，以提供可直接克隆PCR扩增产物的线性化载体。
9.权利要求2的载体，其中编码所述去稳定性元件的核苷酸序列是或来源于选自c-fos、c-jun、c-myc、GM-CSF、IL-3、TNF-α、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、尿激酶、bcl-2、SGL T1(Na(+)-偶联的葡萄糖转运子)、Cox-2(环加氧酶2)、IL-8、PAI-2(纤溶酶原激活物抑制剂2型)、β1-肾上腺素能受体或GAP43的基因。
10.权利要求3的载体，其中编码所述的稳定性元件的核苷酸序列是或来源于选自α2球蛋白、α1球蛋白、β球蛋白或生长激素、红细胞生成素、核糖核苷酸还原酶R1或m1毒蕈碱性乙酰胆碱的基因。
11.权利要求5的载体，其中编码所述的去稳定性元件的核苷酸序列选自任一SEQ ID NO 1-23、或其生物学活性片段，或变体或衍生物。
12.权利要求11的载体，其中编码所述去稳定性元件的核苷酸序列选自SEQ ID NO1、2或22、或其生物学活性片段，或变体或衍生物。
13.权利要求5或6的载体，其中所述报道蛋白质选自萤光素酶、绿色荧光蛋白质、红色荧光蛋白质、SEAP、CAT、或其生物学活性片段，或变体或衍生物。
14.权利要求4的表达载体，其中所述多肽包含蛋白质去稳定性元件。
15.权利要求13的表达载体，其中所述报道蛋白质包含蛋白质去稳定性元件。
16.权利要求14或15的载体，其中所述蛋白质去稳定性元件由编码PEST序列、或泛素、或其生物学活性片段、或变体或衍生物的核苷酸序列编码。
17.包含一种或多种上述权利要求中任一项的载体的细胞。
18.权利要求17的细胞，其中所述细胞是真核细胞。
19.权利要求18的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
20.权利要求19的细胞，其中所述细胞是人类细胞。
21.遗传修饰的非人生物体，其包含一种或多种权利要求1-16中任一项的载体。
22.测定目的多核苷酸表达的方法，该方法包含在足以发生RNA和蛋白质合成的时间和条件下于表达载体中表达该目的多核苷酸，所述载体包含可转录的多核苷酸，其包含目的多核苷酸以及编码可调节相应于所述可转录多核苷酸的转录本稳定性的RNA元件的核苷酸序列；并且其中所述表达载体包含选自以下的一种或多种成分(i)用于引入核苷酸序列的多克隆位点；(ii)报道基因(iii)用于调节所述可转录多核苷酸表达的启动子和/或增强子；(iv)多腺苷酸化序列；(v)选择性标记基因；以及(vi)复制起点。并测定可转录多核苷酸的表达产物与对照相比随时间变化的水平和/或功能活性，其中所述元件可增强有效连接所述可转录多核苷酸的启动子和/或增强子的活性与表达产物的水平和/或功能活性之间的时间相关性。
23.权利要求22的方法，其中包含编码所述RNA去稳定性元件的核苷酸序列的可转录多核苷酸是或来源于选自c-fos、c-jun、c-myc、GM-CSF、IL-3、TNF-α、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、尿激酶、bcl-2、SGLT1(Na(+)-偶联的葡萄糖转运子)、Cox-2(环加氧酶2)、IL-8、PAI-2(纤溶酶原激活物抑制剂2型)、β1-肾上腺素能受体或GAP43的基因。
24.权利要求22的方法，其中编码所述RNA去稳定性元件的可转录多核苷酸包含SEQ ID NO 1-23中任何一个所示的核苷酸序列、或其生物学活性片段、或变体或衍生物。
25.权利要求22的方法，其中编码所述RNA去稳定性元件的可转录多核苷酸包含SEQ ID NO1、2或22所示序列、或其生物学活性片段，或变体或衍生物。
26.鉴定编码可调节RNA转录本稳定性的RNA元件的核苷酸序列的方法，该方法包含将待测核苷酸序列引入表达载体，使该核苷酸序列连接编码报道蛋白质的多核苷酸，形成有效连接启动子和/或增强子的可转录多核苷酸；在足以发生RNA和蛋白质合成的时间和条件下表达该可转录多核苷酸；并且其中该表达载体包含选自以下的一种或多种成分(i)用于引入该待测核苷酸序列的多克隆位点；(ii)多腺苷酸化序列；(iii)选择性标记基因；以及(iv)复制起点。并测定所述可转录多核苷酸的表达产物与不含该核苷酸序列的对照载体相比随时间变化的水平和/或功能活性，其中水平和/或功能活性随时间不同于对照载体，表明该核苷酸序列编码所述RNA元件。
27.权利要求26的方法，其中所述启动子是可调节型。
28.权利要求27的方法，其中所述启动子是可诱导型。
29.权利要求27的方法，其中所述启动子是可抑制型。
30.权利要求26的方法，其中测定其水平和/或功能活性的表达产物是所述报道蛋白质。
31.权利要求26的方法，其中所述报道蛋白质选自萤光素酶、绿色荧光蛋白质、红色荧光蛋白质、SEAP、CAT、或其生物学活性片段，或变体或衍生物。
32.权利要求31的方法，其中所述报道蛋白质包含蛋白质去稳定性元件。
33.权利要求32的方法，其中所述蛋白质去稳定性元件由编码PEST序列、或泛素、或其生物学活性片段、或变体或衍生物的核苷酸序列编码。
全文摘要
本发明一般涉及表达载体及其在基因表达或基因调节分析中的用途。具体而言，本发明提供了表达载体和/或报道载体，其蛋白质表达动力学具有改善的时间相关的启动子活性。更具体而言，本发明提供了包含可转录多核苷酸的表达载体，其中包含调节相应于所述可转录多核苷酸的转录本稳定性的RNA元件的编码核苷酸序列。本发明特别提供用于鉴定和分析顺式和反式调节序列/因子的新载体，以及特别用于药物筛选和药物发现的载体和遗传改变的细胞系或生物体。
文档编号C12N15/09GK1503844SQ02808253
公开日2004年6月9日 申请日期2002年3月8日 优先权日2001年3月9日
发明者J·戴利, J 戴利 申请人:基因流股份有限公司
技术领域：
本发明一般涉及载体及其在基因表达或基因调节分析中的用途。更具体而言，本发明提供了表达载体和/或报道载体，其蛋白质表达动力学具有改善的时间相关的启动子活性。本发明特别提供用于调节基因表达、鉴定和分析调节序列的新型载体和细胞系，用于治疗性干预人类疾病及药物筛选的新的靶标和试剂。
背景技术：
在本说明书中按作者引用的出版物的参考文献细节汇集于说明书末尾。
此处参考的现有技术，包括任何一份或多份现有技术文件，不应视为是认可或提示该现有技术属于当前技术水平。
重组DNA技术日益精深，极大促进了医疗及相关健康领域的研究和开发。利用表达载体研究基因表达是特别重要的研究领域。然而迄今为止，缺少合适设计的载体限制了对基因表达的实时分析。
报道分子分析可以了解是什么控制目的基因表达，例如DNA序列、转录因子、RNA序列、RNA结合蛋白质、信号转导途径以及特定的刺激物。
此外，报道分子分析可用于鉴定基因调节因素，作为治疗性干预人类疾病的新靶标。报道分子测定可潜在用于筛选能够改变基因表达的药物。然而，现有报道分析系统所需费用和时间，加之过长的反应时间，限制了其应用。
基因组序列一般在编码区上游具有启动子序列，决定细胞的转录特异性和可诱导性，从而影响蛋白质产物的表达水平。
特定的序列元件一般富含核苷酸碱基A和U，并常位于基因的3’-UTR，影响mRNA的稳定性，因而影响蛋白质产物的表达水平。RNA结合蛋白质与某些mRNA序列结合，从而调节mRNA稳定性和蛋白质表达。其它序列调节翻译效率。
报道基因分析常用于研究调节转录的DNA序列。这些序列一般位于转录起始位点5’端的启动子区域。将上述DNA元件克隆到报道质粒的相似位点进行测试，使其驱动和/或调节转录，从而表达报道蛋白质。报道蛋白质应该可以同内源性蛋白质相区分，并易于定量。使用了多种报道蛋白质，最常用的是萤光素酶、氯霉素转移酶(CAT)以及β半乳糖苷酶(β-gal)。
利用合适的分析定量报道蛋白质，经常相对于普通启动子(例如SV40启动子)驱动的对照报道分子的水平而表示。对照报道分子必须可以与待测报道分子相区分，并包含于与待测载体共转染的独立载体中，用于控制转染效率。上述分析根据的前提是，细胞按比例摄取等量的两种载体。质粒载体的瞬时转染最常使用。
上述分析用于鉴定启动子区或启动子内部特定元件。另外用于研究启动子或调节元件对各种刺激物的反应。某些应用将报道构建体或转染的细胞置于生物体中，在体内研究启动子的功能。
报道分子分析的另一应用在于研究或测定特定启动子上游的信号转导途径。例如，可以将依赖有丝分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)转录的启动子连接到报道构建体，用于测定细胞中MAPK活化的水平(或MAPK依赖的转录)。该技术可与多种信息性启动子或增强子利用，并应用于细胞或活生物体，例如转基因小鼠。例如，可以使用光子成像仪测定在包含与目的启动子相连的萤光素酶报道分子的整个小鼠中萤光素酶报道分子的活性(Contag等人，1997)。
萤光素酶是迄今最常用的报道分子体外分析系统。双萤光素酶分析(DLA；Promega，Madison，WI，USA)是对其它萤光素酶系统的改进，即待测和对照报道分子可以基本上在同一分析中进行测定。下文提供当前使用的典型DLA方案的实例将推定的启动子元件克隆到萤火虫萤光素酶报道基因上游，使之驱动其表达。将该质粒与包含SV40启动子驱动的肾海鳃萤光素酶基因的对照质粒一起瞬时转染细胞系。～2-50％的细胞摄取质粒并表达报道分子～3天。表达动力学包括在最初24小时升高，积累萤光素酶蛋白质，随后～48小时下降，细胞内质粒数目减少。转染24-48小时以后，收集细胞并裂解。细胞裂解物与萤火虫萤光素酶特异性底物温育，使用发光计测定活性(发光)(96孔板或单个样品)。然后加入失活萤火虫萤光素酶但允许肾海鳃萤光素酶发光的另外底物。从而测定肾海鳃萤光素酶活性。
萤火虫萤光素酶活性水平不仅依赖于启动子活性，而且依赖于转染效率。根据DNA数量、DNA制剂的质量和细胞状态，其变化很大。共转染的对照质粒(SV40启动子驱动的肾海鳃萤光素酶)用于修正这些变数，依据的前提是，肾海鳃萤光素酶活性与细胞摄取的萤火虫萤光素酶质粒的数量成正比。数值可以表示为萤火虫萤光素酶活性/肾海鳃萤光素酶活性。
双萤光素酶分析的缺点如下(i)试剂昂贵、易变质，必须新鲜制备。
(ii)该分析一般包括细胞裂解物的制备，耗时并引入误差，例如裂解期间的细胞损失、移液误差、残留缓冲液/培养基使体积改变。
(iii)每个样品只得到细胞群体总活性的一个数据点。不能获得表达报道分子细胞的百分比以及每一细胞的表达量的有关信息。
(iv)转染对照(肾海鳃)并不总能修正转染效率的极大变动，这是因为a.某些DNA制剂转染/表达较差(也许由于超螺旋DNA的比例减少)，但并不引起共转染的对照质粒的数量相应下降。
b.有证据表明，这两个质粒的启动子之间串扰(cross-talk)，使对照报道分子的活性有赖于共转染的构建体，例如肾海鳃萤光素酶在与包含强启动子的质粒共转染时似乎表达最高。启动子之间的干扰若不加防止，也限制表达待测与对照两种报道分子的单个质粒的使用。
c.转录和转录后研究常用于测定各种刺激物(例如PMA、EGF、激素)的活化/抑制。不巧的是，SV40、RSV、TK以及可能许多其它普遍表达的启动子可由多种刺激物活化。由于这些启动子用于驱动转染的对照报道分子(肾海鳃)的表达，这些报道分子不能真实反映经上述处理后的转染效率。(Ibrahim等人2000)。
d.萤火虫与肾海鳃萤光素酶蛋白质、也可能mRNA的半衰期差异使整个系统具有很强的时间敏感性。
e.发光迅速减弱，特别是肾海鳃萤光素酶，要求测定时间绝对精确。
f.萤光素酶蛋白质和mRNA相对较长的半衰期可有效掩盖转录的时间变化(例如在各种刺激物或处理以后)。
在现有的转录后/mRNA稳定性报道分子分析中，将据认为影响mRNA稳定性的候选元件克隆到由组成型启动子例如SV40或RSV驱动的报道载体(例如萤火虫萤光素酶)的相应区域。假定相对于空载体(无目的元件的相同载体)的表达变化为改变mRNA稳定性的结果。与初步描述的转染分析相同，将转染对照质粒(例如，组成型启动子(例如SV40或RSV)驱动的肾海鳃萤光素酶)共转染，以修正转染效率。这些分析具有以下其它缺点(i).现有载体并未设计用于转录后研究，也未意在阻断转录。
(ii).这些方案的目的是研究候选mRNA元件的转录后影响。然而，这些元件还可以在DNA水平影响报道分子的转录。此外，由于并未使用目的基因的内源性启动子，所观察到的任何转录影响可能几乎没有生理意义。
存在用于研究mRNA稳定性的系统，但涉及直接测定mRNA，而非报道蛋白质。由于定量mRNA的方法具有工作量大的特点，上述系统相当耗时。
例如，一种系统利用c-fos启动子通过短暂的突发转录(abrief burst of transcription)响应血清诱导。将推定的不稳定性元件克隆到β球蛋白(BBB)构建体的3-UTR，该构建体在血清诱导型启动子(c-fos)控制下表达非常稳定的mRNA。转染的细胞(一般是NIH 3T3细胞)首先经受血清饥饿，然后接触包含血清的培养基。转录反应的短暂特性使得报道分子mRNA降解的动力学按时间过程进行。这些测定具有以下缺点(i).该分析非常耗时，因而不适用于快速筛选。
(ii).只能用于支持c-fos启动子的血清诱导性的细胞中。例如，许多肿瘤细胞系在无血清时仍维持c-fos启动子活性。
(iii).在诸如NIH 3T3等具有所需血清反应的细胞中，去除血清导致细胞周期阻断，随后加入血清则使细胞同步解除阻断。因此，只能在细胞周期的特定阶段测定mRNA稳定性。
(iv).除活化c-fos启动子之外，血清活化许多其它途径，引入了不必要的变数，并妨碍对更特异性刺激物的研究。
在另一分析中，利用药物例如抑制所有基因转录的放线菌素D处理细胞。按时间过程测定mRNA水平，确定mRNA降解速率。该系统用于研究内源性基因，并具有以下缺点(i).转录抑制物在所需剂量下毒性极大，以致mRNA稳定性经常在压力或垂死细胞中进行测定。
(ii).转录抑制物具有许多不必要的活性，包括稳定某些mRNA。
(iii).该方法阻断所有基因的转录，因而阻断许多信号转导级联，而活化另外一些。因此，结果可能没有生理意义。
(iv).该技术工作量极大。
(v).该技术在测定内或测定间变动极大。
(vi).该技术对于瞬时转染的报道分子分析，尤其在转染效率低的细胞中，经常不够敏感。
因此有必要开发改进的载体和系统，用于进行基因表达分析，特别是翻译后和转录后分析以及能更实时测定基因表达变化的分析。
发明概述贯穿本说明书，除非上下文需要，否则单词包含(comprise)及其变体(例如comprises和comprising)应当理解为，是指包含所述整体或步骤、或整体或步骤组，但不排除任何其它的整体或步骤、或整体或步骤组。本发明范围不受此处所述特定实施方案的限制，其仅仅用于例证目的。如此处所述，功能性等价产物、组合物和方法显然位于本发明范围之内。
根据本发明，本发明人已经开发了能调节和测定转录本稳定性和/或改善的基因表达的实时测定的一系列载体和方法。
通过序列识别号(SEQ ID NO)提及核苷酸序列。SEQ ID NOs以编号对应序列标识符<400>1、<400>2等。在权利要求书之后提供序列表。
本发明一方面涉及包含可转录多核苷酸的表达载体，其中包含调节相应于所述可转录多核苷酸的转录本稳定性的RNA元件的编码核苷酸序列。此处所用转录本稳定性可相当于转录本的半衰期。
本发明另一方面涉及包含可转录多核苷酸的表达载体，其包含编码可调节相应于所述可转录多核苷酸的转录本稳定性的RNA元件的核苷酸序列；其中该RNA元件是降低所述转录本稳定性的去稳定性元件。
在相关的实施方案中，本发明涉及包含可转录多核苷酸的表达载体，其包含编码可调节相应于所述可转录多核苷酸的转录本稳定性的RNA元件的核苷酸序列；其中该RNA元件是提高所述转录本稳定性的稳定性元件。
本发明另一方面涉及包含可转录多核苷酸的表达载体，其包含编码RNA元件的核苷酸序列，其中该RNA元件是降低相应于所述可转录多核苷酸的转录本稳定性的去稳定性元件，并且其中所述可转录多核苷酸包含目的多核苷酸并编码多肽。
本发明再一方面涉及包含可转录多核苷酸的表达载体，其包含编码RNA元件的核苷酸序列，其中该RNA元件是降低相应于所述可转录多核苷酸的转录本稳定性的去稳定性元件，并且其中所述可转录多核苷酸包含目的多核苷酸并编码报道多肽。
本发明又一方面涉及包含可转录多核苷酸的表达载体，其包含编码RNA元件的核苷酸序列，其中该RNA元件是降低所述转录本稳定性的去稳定性元件，并且其中所述可转录多核苷酸包含编码报道多肽的核苷酸序列。
本发明另一方面涉及包含可转录多核苷酸的表达载体，其包含编码可调节相应于所述可转录多核苷酸的转录本稳定性的RNA元件的核苷酸序列；其中该RNA元件是降低相应于所述可转录多核苷酸转录本稳定性的去稳定性元件，并且其中该载体包含一种或多种选自以下的成分(i)用于引入核苷酸序列的多克隆位点；(ii)报道基因；(iii)用于调节所述可转录多核苷酸表达的启动子和/或增强子；(iv)多腺苷酸化序列；(v)选择性标记基因；以及(vi)复制起点。
本发明另一个方面涉及包含本发明载体的细胞，其包含可转录多核苷酸，其中包含编码可调节相应于所述可转录多核苷酸的转录本稳定性的RNA元件的核苷酸序列。
本发明另一方面涉及包含本发明载体的细胞，其包含可转录的多核苷酸，其中包含编码可调节相应于所述可转录多核苷酸的转录本稳定性的RNA元件的核苷酸序列；其中该RNA元件是降低该转录本稳定性的去稳定性元件。
本发明相关方面涉及包含可转录多核苷酸的遗传改变的非人生物体，其包含编码可调节相应于所述可转录多核苷酸的转录本稳定性的RNA元件的核苷酸序列；其中该RNA元件是降低所述转录本稳定性的去稳定性元件。
本发明另一实施方案涉及测定目的多核苷酸表达的方法，该方法包含在足以发生RNA和蛋白质合成的时间和条件下于表达载体中表达所述目的多核苷酸，该载体包含可转录的多核苷酸，其中包含目的多核苷酸以及编码可调节相应于所述可转录多核苷酸的转录本稳定性的RNA元件的核苷酸序列；并且其中该表达载体包含选自以下的一种或多种成分(i)用于引入核苷酸序列的多克隆位点；(ii)报道基因；(iii)用于调节所述可转录多核苷酸表达的启动子和/或增强子；(iv)多腺苷酸化序列；(v)选择性标记基因；以及(vi)复制起点。
并测定可转录多核苷酸的表达产物与对照相比随时间变化的水平和/或功能活性，其中所述元件可增强有效连接所述可转录多核苷酸的启动子和/或增强子的活性与表达产物的水平和/或功能活性之间的时间相关性。
在另一实施方案中，本发明涉及鉴定编码可调节RNA转录本稳定性的RNA元件的核苷酸序列的方法，该方法包含将待测核苷酸序列引入表达载体，使该核苷酸序列连接编码报道蛋白质的多核苷酸，形成有效连接启动子和/或增强子的可转录多核苷酸；在足以发生RNA和蛋白质合成的时间的条件下表达该可转录多核苷酸；并且其中该表达载体包含选自以下的一种或多种成分(i)用于引入该待测核苷酸序列的多克隆位点；(ii)多腺苷酸化序列；(iii)选择性标记基因；以及(iv)复制起点；并测定所述可转录多核苷酸的表达产物与不含该核苷酸序列的对照载体相比，随时间变化的水平和/或功能活性，其中水平和/或功能活性随时间不同于对照载体，表明存在编码所述RNA元件的核苷酸序列。
附图简述
图1是编码去稳定性mRNA的表达载体的示意图。
图2是转录报道载体的示意图；图2a显示载体系列2；图2b显示载体系列3，图2c显示载体系列4。
图3是双向转录报道载体的示意图；图3a显示载体系列5，图3b显示载体系列6。
图4是用于研究转录后调节的报道载体的示意图。图4a显示载体系列7，图4b显示载体系列8。
图5图示按转染DNA的数量测定的报道分子活性。将编码萤火虫萤光素酶质粒的单一DNA制剂与编码肾海鳃萤光素酶的单个质粒按30∶1的比例混合。在分光光度测定(OD260/280)以及溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶中，两种DNA制剂表现正常(数据未显示)。将不同体积的该混合物转染细胞，使DNA的总量为1、2或3μg，但保持萤火虫与肾海鳃质粒的比例相同。
图5A图示肾海鳃萤光素酶活性依赖于转染DNA的数量。然而，萤火虫萤光素酶活性(图5B)不随DNA数量的增加而增加，也许是由于萤火虫DNA制剂的质量差。因此，一般用于测定萤火虫启动子活性的萤火虫/肾海鳃比例(图5C)，依赖于所用DNA的数量而显著变化。这些数据证明，与肾海鳃质粒共转染并不足以作为萤火虫质粒转染效率的对照。
图6图示使用双萤光素酶分析的多种启动子系统的报道活性。将6种不同的启动子片段(编号1-6)克隆到pGL3萤火虫萤光素酶质粒中。1μg每个克隆与30ng由SV40启动子驱动的肾海鳃(转染对照)质粒共转染。使用双萤光素酶测定(Promega，Madison，WI，USA)测定萤火虫和肾海鳃萤光素酶活性。结果可以表示为肾海鳃萤光素酶活性(A)、萤火虫萤光素酶活性(B)以及萤火虫除以肾海鳃活性(C)。在至少使用两种不同的每种构建体制剂的多重实验中，观察到类似结果。
肾海鳃萤光素酶活性(图6A)用作转染对照，只分析该结果提示转染效率的变化非常高。例如，肾海鳃萤光素酶与构建体4共转染较之与构建体3共转染的活性高3.5倍。单独的DNA制剂观察到同样的特征(数据未显示)，因而DNA质量变化或DNA定量误差似乎不是误差原因。
萤火虫萤光素酶活性(图6B)受转染效率以及启动子1-6之间差异的影响。差异特征与肾海鳃所见类似(图6A)。例如，3和6低，而4和5高。然而构建体之间的差异对于萤火虫更为显著(例如，构建体4比构建体3高12倍)，提示启动子1-6的活性有些影响肾海鳃的表达(或反之亦然)。
萤火虫/肾海鳃(图6C)被认为是测量修正转染效率(肾海鳃)之后的萤火虫启动子真实活性(1-6)。再次观察到类似特征，提示3和6的确是最弱的启动子，而4和5最强。虽然有可能启动子活性(图6C)与转染效率(图6A)一致相关，但由多种不同构建体以及相同构建体的多种不同制剂获得类似结果，似乎非常不太可能得出这种可能性。似乎更有可能的是，肾海鳃萤光素酶的表达水平受与其共转染的启动子构建体的强度影响。因此，启动子1-6之间的表观差异很可能低估了真实差异。
图7图示BTL、BTG2、BTG1和BTG1N4表达载体在阻断转录以后随时间过程的不同报道分子水平。利用分别包含连接报道基因的TRE启动子的下列报道质粒转染Tet-Off HeLa细胞BTL(萤光素酶)、BTG2(d2EGFP)、BTG1(d1EGFP)和BIG1N4(与BTG1相同，但在3’UTR编码区存在九聚物UUAUUUAUU的4个拷贝)。转染10小时后，将每瓶细胞分到多个小平板中。转染24小时后(零时)，加入强力霉素(1μg/ml)，以阻断报道基因的转录。如实施例14所述，于此时以及后续时间点测定报道分子水平(荧光或发光)，按零时的百分比表示。在10小时过程中未观察到萤光素酶活性(BTL)下降。半衰期2小时的EGFP构建体(BTG2)对强力霉素诱导的转录阻断显示中度反应，半衰期1小时的EGFP(BTG1)则快速反应。但包含九聚体(BTG1N4)的构建体显示迄今为止对转录阻断的最快反应。
图8图示按线性刻度表示的图7数据。BTG1在约6.5小时以后，强力霉素诱导的转录阻断可检测为阻断50％的报道分子水平。但是，包含九聚体(BTG1N4)使其减少到不及3个小时。
图9图示不同数目(1、2或4)的九聚体RNA去稳定性元件的影响。时间-过程分析如图7所述进行，只是将加入强力霉素后4小时定义为零点，以消除药物作用滞后的影响。存在单个九聚体(BTG1N1)足以提高″有效衰减率″，观察到2个九聚体(BTG1N2)和4个九聚体(BTG1N4)逐步产生更强的影响。后一构建体显示″有效半衰期″为～1小时20分钟，略高于单独蛋白质的1小时半衰期。
图10图示在没有转录阻断情况下，报道分子水平随时间的变化。如图7所述进行时间-过程分析。但是，所示数据代表未经强力霉素处理的样品，于转染后24小时(开始)或34小时(结束)测定。只观察到BTG1N4一致的表达水平。
图11图示在没有转录阻断的情况下，报道分子水平随时间的变化。如图7所述进行时间-过程分析。BTG1fos包含c-fos ARE。这些数据证明，不同类型的mRNA去稳定性元件可用于达到相同的效果。
图12图示使用RNA去稳定性元件测定使用萤光素酶报道蛋白质时的表达。应可预期，使用萤光素酶报道蛋白质和蛋白质去稳定性元件进一步增强表达。使用两个萤光素酶表达构建体，如图7所述进行时间-过程分析。BTL包含标准萤火虫萤光素酶编码区和3’UTR(来源于pGL3-Basic；Promega)，而BTLN6的3’UTR包含6个拷贝的九聚体UUAUUUAUU。
图13图示使用由RNA去稳定性元件和蛋白质去稳定性元件去稳定性的DsRed，随时间变化的报道分子水平。如图7和实施例14所述进行时间-过程分析。该构建体使用DsRed2(BTR)、DsRed-MODC(BTR1)以及3’UTR包含4个UUAUUUAUU九聚体(BTR1N4)的DsRed-MODC。利用强力霉素阻断转录以后，所有构建体的红色荧光持续升高。蛋白质去稳定性元件使其基本减少，而mRNA去稳定性元件使其进一步减少。
图14图示如图7所述进行的时间-过程分析。与对照(BTG1)相比，所测全部mRNA去稳定性元件可非常有效地提高衰变率。这些数据表明，c-myc ARE是有效的去稳定性元件(BTGlmyc)，联合mycARE和4个九聚体(BTG1N4myc)可以适度增加去稳定性活性。6个九聚体(BTG1N6)的去稳定性也一定程度强于4个九聚体(BTG1N4)。
优选实施方案详述定义″3’UTR″是指 多核苷酸的蛋白质编码区终止密码子下游的多核苷酸区域，不翻译产生蛋白质。
″5’UTR″是指 mRNA的5’(上游)非翻译区。也用来指编码mRNA 5’UTR的DNA区域。
″大约″是指 数目、水平、数值、尺寸、大小或数量相比参照的数目、水平、数值、尺寸、大小或数量，改变30％、优选20％、更优选10％。
″ARE″是指 mRNA中富含AU的元件，即包含高比例腺嘌呤和尿嘧啶核苷酸的序列。也用来指编码该mRNA元件的DNA区。
″生物学活性片 全长参考多核苷酸或多肽的片段，其分别段″是指 保持该参考多核苷酸或多肽的活性。
″c-fos″是指即早期基因，由促有丝分裂信号短暂诱导。
″CAT″是指氯霉素乙酰转移酶。一种经常用作报道分子的细菌酶。
″d1EGFP″是指 融合突变的PEST序列的EGFP变体，因而其半衰期仅为约1小时。类似地，也可获得d1ECFP和d1EYFP。按相同方法可以产生DsRed的去稳定性变体。从此称为d1DsRed。
″d2EGFP″是指 融合PEST序列的EGFP变体的突变形式，因而其半衰期仅为2小时。类似地，也可获得d2ECFP(青色)和d2EYFP(黄色)。
按相同方法可能产生DsRed的去稳定性变体。从此称为d2DsRed。
″dEGFP″是指 形成的所有EGFP去稳定性变体(包括所有颜色)的通称。(Li等人)。
″DNA″是指 脱氧核糖核酸。
″衍生物″是指例如通过本领域应当理解的缀合或复合其它化学部分、或者转录后或翻译后修饰技术，分别来源于参考多核苷酸或多肽的多核苷酸或多肽。
″DsRed″是指 从IndoPacific海葵亲缘的珊瑚海葵(Discosoma species)中分离的红色荧光蛋白。
″ECFP″是指 激发/发射光谱改变的发青色荧光的EGFP突变体形式。
″EGF″是指 表皮生长因子″EGFP″是指 增强的绿色荧光蛋白质。荧光增强的GFP的突变体形式。(Cormack等人)。
″ELISA″是指 酶联免疫吸附测定法″ErbB2″是指 表皮生长因子受体家族的第二个成员。亦称HER-2″外显子″是指作为mRNA分子一部分的RNA初级转录本序列，或编码该序列的DNA。初级转录本中相邻外显子由内含子分隔。
″表达载体″是指 允许所克隆的DNA片段在细胞内表达的载体。
″EYFP″是指 激发/发射光谱改变的发黄色荧光的EGFP突变体形式。
″萤火虫萤光 来源于从萤火虫中克隆的luc基因的酶。
素酶″是指在氧和Mg++存在下，利用D-萤光素和ATP催化反应，引起发光。经常用作报道分子。
″流式细胞术″是指一种方法，其中将活细胞或固定细胞的悬浮液上样流式细胞仪，逐个测定悬浮液中细胞所结合的可检测标记的活性或特性。
例如，可以通过荧光化合物或共价附着于特定荧光化合物的抗体进行细胞标记。可以同时检测若干不同的激发/发射波长，以测定不同类型的荧光。可以分选(gated)具有目的特征(荧光、细胞大小)的细胞亚群，以便只对分选的细胞进行进一步的统计分析。配备细胞分类选件的流式细胞仪可以物理分离具有目的荧光的细胞，并在与剩余的原始细胞群体分开的管中回收这些(活)细胞。也称为FACS(荧光活化的细胞分类)。
″基因″是指 编码RNA分子的DNA片段。术语″基因″有时并不一定包括启动子区。
″GFP″是指 分离自水母Aequoria victoria的荧光蛋白质(Tsien等人)，可用作报道蛋白质。
可以在哺乳动物细胞中表达编码GFP的DNA构建体，利用特定波长激发时，使细胞发绿色荧光。此处所用术语″GFP″是指所有的同系物和类似物，包括颜色变体以及来源于Aequoria victoria以外生物体的荧光蛋白质(例如，DSRed，Clonetech；hrGFP，Stratagene)。
″半衰期″是指去除分子的一半活性、数量或数目所用的时间。
″内含子″是指 基因或其初级转录本内的非编码序列，从初级转录本中去除，而不存在于相应mRNA分子中。
″萤光素酶″是指催化发光反应的常用报道酶。加入外源底物，使用发光计定量该反应。萤火虫和肾海鳃萤光素酶所需底物不同，使得在双萤光素酶测定(Promega，Madison，WI，USA)中可以区分这两者。
″MAPK″是指有丝分裂原活化的蛋白激酶。包括参与引起生长或凋亡(细胞死亡)的细胞内信号转导途径的若干不同激酶。术语″MAPK″有时用于指两种特定的MAPK，Erk1和Erk2(细胞外调节的激酶1和2)。
″MCMV″是指最小CMV启动子。其自身不活化转录，连接TRE可以产生四环素(和强力霉素)依赖性转录。
″MCS″是指 多克隆位点。包含可插DNA片段的唯一限制酶识别位点的DNA载体区域。此处所用术语″MCS″也包括帮助DNA片段插入载体中的任何其它位点。例如，能直接插入聚合酶链式反应(PCR)产生的片段的T突出端(Promega，Madison，WI，USA)。
″mRNA″是指信使RNA。使用本身编码蛋白质的DNA为模板，在细胞中产生的″转录本″。mRNA一般由5’UTR、蛋白质编码区和3’UTR组成。mRNA在细胞中的半衰期有限，部分取决于稳定性元件，特别是3’UTR内、还有5’UTR和蛋白质编码区内的稳定性元件。
″MODC″是指 包含PEST序列的小鼠鸟氨酸脱羧酶或其部分和/或衍生物。
″调节″是指 直接或间接地提高或降低目的分子的稳定性。
″有效连接″等按功能关系连接多核苷酸元件。一个核酸是指 当与另一核酸序列置于功能关系时是″有效连接的″。例如，启动子或增强子若影响编码序列的转录，则与该编码序列有效连接。有效连接是指核酸序列一般连续相接，必要时连续并在阅读框架内连接两个蛋白质编码区。如果RNA聚合酶将两个编码序列转录为单个mRNA，然后翻译为具有来源于两个编码序列的氨基酸的单个多肽，则该编码序列与另一编码序列″有效连接″。只要表达序列最终能产生目的蛋白质，编码序列不必互相邻接。启动子与可转录多核苷酸″有效连接″是指，将可转录多核苷酸(例如，编码蛋白质的多核苷酸或其它转录本)置于启动子的调节控制之下，然后控制该多核苷酸的转录并任选控制其翻译。在异源启动子/结构基因组合的构建体中，一般优选将启动子或其变体置于远离可转录多核苷酸的转录起始位点，大约与其天然情形(即该启动子所来源的基因)中该启动子及其控制的基因之间的距离相同。如本领域已知，可以调节距离的一些变化，而不损失功能。类似地，调节序列元件(例如操纵子、增强子等)相对于置于其控制之下的可转录多核苷酸的优选定位，按该元件在其天然情形(即其来源的基因)中的定位而定。
术语″pA″是指此处图示中用于表示多腺苷酸化位点。用作终止转录位点并给不成熟mRNA添加polyA尾的DNA序列。来自SV40病毒基因或β半乳糖苷酶基因或其它来源的各种pA序列，包括合成的多腺苷酸化位点，可为此目的用于表达载体。
术语″PEST″是指 富含氨基酸脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)的氨基酸序列。包含PEST序列的蛋白质半衰期缩短。
″质粒″是指 环状DNA载体。质粒包含复制起点，可使细菌(时或真核生物)细胞产生质粒的多个拷贝，而无需质粒整合到宿主细胞DNA中。
″多核苷酸″或″ 核苷酸的线性序列，包括DNA或RNA，可核酸″是指以是双链或单链。
″多肽″、″肽″ 由肽键按特定顺序连接的氨基酸多聚体。
或″蛋白质″是指″启动子″是指一般位于mRNA编码区上游(5’)的DNA区域，可控制转录起始和转录水平。该术语的内涵也包括可诱导型、可抑制型以及组成型启动子。
″PMA″是指 豆蔻酰佛波醇乙酯″肾海鳃萤光素来源于海洋三色堇(sea pansy)(肾海鳃酶″是指 (Renilla reniformis))，利用氧和腔肠动物萤光素(腔肠萤光素(coelenterazine))发光。
″报道载体″是指包含″报道基因″的表达载体，编码易于分析的蛋白质或多肽(或mRNA)。报道基因一般连接待测其功能或活性的调节序列。
″报道分子″是指由报道基因编码并在报道分析中测定的分子，一般是蛋白质或多肽。现有系统一般利用酶学报道分子，并测定报道分子活性。
″RNA″是指 核糖核酸。
″rtTA″是指只在四环素或强力霉素存在下结合TRE并活化转录的反向tTA(参见下文)。
″SEAP″是指分泌型碱性磷酸酶报道基因。
″SKBR3″是指 过表达ErbB2的人乳腺癌细胞系。
″严谨条件″是指只有具有高频率互补碱基的核苷酸序列能够杂交的温度和离子条件。严谨性要求具有核苷酸序列依赖性，并取决于在杂交和后续洗涤期间存在的各种成分以及这些过程的允许时间。为了使杂交率最高，一般选择非严谨性杂交条件比热解链温度(Tm)低约20-25℃。Tm是在限定的离子强度和pH的溶液中，50％的特定靶序列与完全互补的探针杂交的温度。为了要求杂交序列具有至少约85％的核苷酸互补性，一般选择低于Tm约5-15℃的高严谨性洗涤条件。为了要求杂交序列具有至少约70％的核苷酸互补性，选择低于Tm约15-30℃的中度严谨性洗涤条件。高许可性(低严谨性)洗涤条件可能低于Tm50℃，可产生杂交序列之间的高错配水平。本领域技术人员应当承认，还可以改变杂交和洗涤阶段的其它物理和化学参数，以影响靶序列和探针序列之间的特定同源性水平杂交信号的结果。
″SV40/CMV/RSV″是指分别来源于猿猴病毒、巨细胞病毒和劳氏肉瘤病毒的启动子元件。一般认为这些启动子在哺乳动物细胞中具有组成型活性。
″TetO″是指来源于大肠杆菌四环素抗性操纵子的Tet操纵子DNA序列。
″Tet-Off细胞 稳定表达tTA的细胞系，以致四环素或强系″是指力霉素可以关闭TRE启动子的转录。
″Tet-On细胞稳定表达rtTA的细胞系，以致四环素或系″是指强力霉素可以开启TRE启动子的转录。
″转录″是指合成与DNA模板互补的RNA分子的过程。
″转染″是指将质粒或DNA片段插入真核细胞中的过程。一般2-50％的细胞摄有质粒，在质粒DNA不整合到细胞染色体的情况下表达蛋白产物～3天(＝瞬时转染)。小部分细胞最终整合质粒DNA到其基因组中，永久表达蛋白产物(＝稳定转染)。
″翻译″是指以mRNA分子为模板进行蛋白质合成的过程。
″TRE″是指 此处定义为通常与最小启动子相连的任何四环素效应元件(Gossen等人)，只有通过外源因子(例如tTA或rtTA)与TRE结合才能发生转录。本发明的优选实施方案利用由连接最小CMV启动子(mCMV)的7个重复的tetO序列组成的TRE(ClontechLaboratories Inc.，Palo Alto，CA，
USA)。
″tTA″是指 四环素控制的反式激活因子(transactivator)，由Tet抑制蛋白质(TetR)和VP16激活结构域组成，使其只有在缺少四环素或强力霉素的情况下结合TRE并激活转录。
″TS″是指血栓烷合酶启动子。
″变体″是指 显示分别与参考的多核苷酸或多肽基本序列一致性的多核苷酸或多肽。多核苷酸变体也包括在严谨条件下与参考序列杂交的多核苷酸。这些术语也包括通过添加、缺失或替换至少一个核苷酸而不同于参考多核苷酸的多核苷酸。在这方面，本领域相当理解，可以对参考多核苷酸进行某些改变，包括突变、添加、缺失和替换，该改变的多核苷酸保持参考多核苷酸的生物功能或活性。术语″多核苷酸变体″和″变体″也包括天然存在的等位基因变体。例如关于多肽变体，本领域相当理解，某些氨基酸可能改变为其它具有大致相似特性的氨基酸，而不改变该多肽的天然活性(保守性替换)。
″载体″是指 供外源DNA序列插入宿主细胞和/或在支持该载体复制的细胞中扩增该DNA序列的运载体。最一般而言，质粒还可以是噬菌粒、噬菌体、腺病毒或逆病毒。
″vEGFP″、″EGFP EGFP的不同颜色的变体和/或不同半衰期变体″或″EGFP的 的变体。
变体″是指
″vGFP″是指所有的GFP变体；包括同系物和类似物，例如DsRed，也包括EGFP变体或去稳定的GFP变体。
本发明特别提供调节转录本稳定性、从而调节载体所产生的蛋白质数量的表达载体。虽然本发明显然包含可提高转录本稳定性的表达载体，但特别优选的实施方案关注去稳定性的转录本。此处通过给可转录的多核苷酸添加一个或多个去稳定性元件、或去除一个或多个稳定性元件(例如poly A尾)，可以降低转录本稳定性。与现有表达载体相比，本发明的载体例如通过减少在降低的启动子活性和降低的相应表达产物的水平之间的时间延迟(lag)，而提供了具有对启动子活性改善的时间相关的蛋白质表达动力学。
因此，本发明一方面涉及包含可转录多核苷酸的表达载体，其中包含调节相应于所述可转录多核苷酸的转录本稳定性的RNA元件的编码核苷酸序列。
转录本稳定性上下文中的术语″调节″是指提高或降低转录本的稳定性，以及根据特定应用优化调节量。在不限制本发明于任一特定理论或工作方式的情况下，如果RNA元件是使转录本去稳定的核苷酸序列，则认为该元件直接或间接靶向转录本降解。
此处所用术语″去稳定性元件″是指在细胞内分别降低蛋白质或转录本半衰期的氨基酸或核苷酸序列。因此，″RNA去稳定性元件″包含降低RNA转录本细胞内半衰期的核苷酸序列，而″蛋白质去稳定性元件″包含降低蛋白质细胞内半衰期的氨基酸序列。
所要求降低的程度取决于特定的应用。在优选实施方案中，与没有去稳定性元件的载体相比，RNA去稳定性的程度显著提高了启动子活性和表达载体中报道分子水平或活性之间的时间相关性。就提高转录本稳定性而言，稳定性的最佳水平也取决于应用。
″RNA稳定性元件″是提高细胞内半衰期的核苷酸序列。
″RNA″分子包括所有RNA分子，例如mRNA、核不均一RNA(hnRNA)、核小RNA(snRNA)、核仁小RNA(snoRNA)、胞质小RNA(scRNA)、核糖体RNA(rRNA)、翻译控制RNA(tcRNA)、转运RNA(tRNA)、eRNA、干扰信使RNA的互补RNA(micRNA)或干扰RNA(iRNA)和线粒体RNA(mtRNA)。
信使RNA(mRNA)是优选的RNA形式。
在降低选自RNA转录本或所编码目的蛋白质的分子的细胞内半衰期的情况下，一般选择(a)一种或多种去稳定性元件和/或(b)一种或多种稳定性元件，以增加该分子的降解水平，从而使该分子的细胞内半衰期减少到适当少于约24小时、更优选少于约10小时、更加优选少于约5小时、更加优选少于约3小时、更加优选少于约1小时、更加优选少于约30分钟、更加优选少于约15分钟、更加优选少于约10分钟、更加优选少于约5分钟、以及更加优选少于约3分钟。RNA转录本或所编码目的蛋白质的半衰期优选相当于可提供至少10倍于该转录本或所编码蛋白质最小可检测水平的稳定状态表达水平的最低半衰期。
细胞内或类细胞内条件优选该细胞类型的生理条件。细胞内或类细胞内条件的温度优选该细胞类型的生理温度。哺乳动物细胞典型的温度适当为约30℃-42℃，优选约35℃-37℃。
RNA转录本或多肽增加的核醣核酸或蛋白水解降解，至少分别是指核醣核酸或蛋白水解降解水平超过缺少去稳定性元件或存在稳定性元件的RNA转录本或多肽的至少约5％、优选至少约10％、更优选至少约20％、更加优选至少约40％、更加优选至少约50％、更加优选至少约60％、更加优选至少约70％、更加优选至少约80％、更加优选至少约90％、更加优选至少约100％、更加优选至少约150％、更加优选至少约200％、更加优选至少约400％、更加优选至少约600％、更加优选至少约1,000％、更加优选至少约2,000％、更加优选至少约4,000％、更加优选至少约6,000％、更加优选至少约8,000％、优选至少约10,000％、还更加优选至少约12,000％。测定RNA降解的分析方法为本领域技术人员已知。例如，可以使用例如Ross，J(1995)或Liu，J等人(JBC 2000)所公开的很多分析方法测定RNA降解，其基于利用转录抑制因子(放线菌素D、DRB、蛹虫草菌素、α-鹅膏蕈碱)、脉冲标记(放射性核苷)、无细胞衰减法(多核糖体、胞质溶胶或网织红细胞)、或短期启动子激活(fos启动子，参见下文)。测定蛋白质水解降解的方法也为本领域技术人员已知。例如，可能使用哺乳动物细胞裂解物测定，包括但不限于Bachmair等人美国专利系列5,646,017的网织红细胞裂解物测定，体外测定蛋白质降解。另外，可能使用例如Vazhappilly，R和Sucher，N(2002)或Saito，T等人(1998)公开的放线菌酮或脉冲追踪方法，测定蛋白质降解。
RNA去稳定性元件可以来源于任何来源，特别是通常包含去稳定性序列的短寿mRNA的3’UTR或5’UTR区。此处所用术语″来源于″应当用来表示来源于指定种类的特定整体或整体群，但不一定直接得自该指定来源。
所述RNA去稳定性序列可能克隆自短寿的RNA，例如c-fos、c-jun、c-myc、GM-CSF、IL-3、TNF-α、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、尿激酶、bcl-2、SGLT1(Na(+)-偶联的葡萄糖转运子)、Cox-2(环加氧酶2)、IL-8、PAI-2(纤溶酶原激活物抑制剂2型)、β1-肾上腺素能受体、GAP43(5’UTR和3’UTR)。
富含AU元件(AREs)和/或富含U元件(UREs)包括但不限于单个、串联或多个或重叠拷贝的九聚体UUAUUUA(U/A)(U/A)(其中U/A是A或U)(Lagnado等人1994)和/或五聚体AUUUA(Xu等人1997)和/或四聚体AUUU(Zubiaga等人1995)。
例如也描述了磷酸烯醇丙酮酸羧激酶mRNA(PEPCK)、果蝇Bicoid基因、人硫氧还蛋白基因、耐热抗原和大豆10A5基因的RNA去稳定性元件。
铁效应元件和铁调节蛋白质结合位点也可以有利地引入本发明载体中，以调节RNA稳定性、特别是翻译效率。组蛋白RNAs、尤其是其3’UTRs，可特别用于以细胞周期依赖性方式调节RNA稳定性。
本发明也包括上列元件的修饰或改变。术语″串联拷贝″允许一个或多个外侧的核苷酸复制和/或非复制。例如，五聚体AUUUA的串联拷贝包括序列诸如AUUUAUUUAUUUA和AUUUAAUUUAAUUUA。
使用计算方法和数据库分析(Dandekar T等人)可能鉴定RNA去稳定性元件和/或使其产生改变。
因此，本发明包含所提及的去稳定性元件的生物学活性片段以及变体和衍生物。
本发明包括真核表达载体。
在相关的实施方案中，本发明涉及包含可转录多核苷酸的表达载体，其包含编码可调节相应于所述可转录多核苷酸的转录本稳定性的RNA元件的核苷酸序列；其中该RNA元件是提高所述转录本稳定性的稳定性元件。
在另一相关实施方案中，本发明包括包含可转录多核苷酸的表达载体，其包含编码可调节相应于所述可转录多核苷酸转录本稳定性的RNA元件的核苷酸序列；其中该RNA元件是提高该转录本稳定性的稳定性元件，其中该稳定性元件是或来源于选自长寿mRNA的实例α2球蛋白、α1球蛋白、β球蛋白、或生长激素的基因。此处所用下划线或斜体字的基因名称应该表示基因，而不同于由没有下划线或斜体字的基因名称表示的其蛋白质产物。例如，″α2球蛋白″应指α2球蛋白基因，而″α2球蛋白″应表示″α2球蛋白″基因的蛋白质产物。
能够使转录本去稳定性并减少细胞产生的蛋白质数量，显然应该具有广泛应用。
本发明另一方面涉及包含可转录多核苷酸的表达载体，其包含编码可调节相应于所述可转录多核苷酸的转录本稳定性的RNA元件的核苷酸序列；其中该RNA元件是降低所述转录本稳定性的去稳定性元件。
另一方面，本发明涉及包含可转录多核苷酸的表达载体，其包含编码调节相应于可转录多核苷酸转录本稳定性的RNA元件的核苷酸序列；其中该RNA元件是降低所述转录本稳定性的去稳定性元件，其中编码该去稳定性元件的核苷酸序列是或来源于选自c-fos、c-jun、c-myc、GM-CSF、IL-3、TNF-α、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、尿激酶、bcl-2、SGLT1(Na(+)-偶联的葡萄糖转运子)、Cox-2(环加氧酶2)、IL-8、PAI-2(纤溶酶原激活物抑制剂2型)、β1-肾上腺素能受体或GAP43的基因。
在特定的实施方案中，编码RNA去稳定性元件的多核苷酸序列连接编码目的蛋白质的序列，其依次连接优选可调节(即可诱导或可抑制)的目的启动子，以便开启表达然后关闭调节。在此应用中，RNA去稳定性元件一般用来缩短功能性mRNA或蛋白质的表达时间。可应用于体外或体内。例如，细胞周期特异性启动子可以结合RNA不稳定性元件，以专门在细胞周期的某些阶段表达目的蛋白质。该目的蛋白质可能是功能性蛋白质或报道蛋白质。在后一例子中，该报道分子的水平可以用作细胞周期阶段或细胞增殖的指示。
本发明另一方面涉及包含可转录多核苷酸的表达载体，其包含编码调节相应于所述可转录多核苷酸转录本稳定性的RNA元件的核苷酸序列；其中该RNA元件是降低所述转录本稳定性的去稳定性元件，其中编码该去稳定性元件的核苷酸序列选自任一SEQ ID NO 1-23、或其生物学活性片段、或变体或衍生物。
本发明另一方面涉及包含可转录多核苷酸的表达载体，其包含编码调节相应于所述可转录多核苷酸转录本稳定性的RNA元件的核苷酸序列；其中该RNA元件是降低所述转录本稳定性的去稳定性元件，其中编码该去稳定性元件的核苷酸序列列于SEQ ID NO 1、2或22、或其生物学活性片段或其变体或衍生物。
本发明另一方面涉及包含可转录多核苷酸的表达载体，其包含编码RNA元件的核苷酸序列，其中该RNA元件是降低所述转录本稳定性的去稳定性元件，并且其中所述可转录多核苷酸包含目的多核苷酸并编码多肽。
特定应用之一在于测定基因表达领域。具体而言，通过减少细胞中产生的转录本数量，有可能更准确测定启动子或增强子活性。在此应用中，使用报道基因直接、或与由载体中调节元件调节其表达的另一多肽的融合蛋白质间接测定启动子活性。
在一个实施方案中，将RNA去稳定性序列引入报道mRNA 3’-UTR编码区。另外或此外，将去稳定性元件引入5’-UTR和/或蛋白质编码区，其优选对所编码蛋白质的选择活性并不必要或不产生干扰。
在相关实施方案中，例如当需要精确监控或降低其表达时，利用RNA去稳定性序列使目的基因去稳定性。一般对于该应用而言，联合使用RNA去稳定性元件与报道蛋白质去稳定性元件。
所述表达载体可应用于多种基因表达系统，优选其具有短期的mRNA或蛋白质表达，或优选其启动子活性变化及所致mRNA/蛋白质水平变化之间的时间延迟最小。
因此，本发明再一方面涉及包含可转录多核苷酸的表达载体，其包含编码RNA元件的核苷酸序列，其中该RNA元件是降低所述转录本稳定性的去稳定性元件，并且其中所述可转录多核苷酸包含目的多核苷酸并编码报道多肽。
本发明又一方面涉及包含可转录多核苷酸的表达载体，其包含编码RNA元件的核苷酸序列，其中该RNA元件是降低所述转录本稳定性的去稳定性元件，并且其中所述可转录多核苷酸包含编码报道多肽的核苷酸序列。
设计供真核细胞系统使用的表达载体。然而应当指出，RNA去稳定性元件可能用于大量真核和/或植物系统，包括确定为酵母、昆虫、线虫、鱼、鸟或哺乳动物的细胞、组织或整个生物体。用于植物时，可能使用不同的启动子、可能不同的报道分子以及RNA去稳定性元件(例如DST序列)。
预期本发明的表达载体将引入标准的蛋白质报道分子或去稳定的报道蛋白质分子。标准的报道分子为本领域公知。
本发明另一方面涉及蛋白质去稳定性元件(例如编码可能选自目的多肽氨基末端的去稳定性氨基酸、PEST区或泛素的细胞内蛋白质降解信号或降解决定子(degron)的DNA/RNA序列)以及mRNA去稳定性元件(例如多拷贝的九聚体UUAUUUAUU)的组合，以便使mRNA和蛋白质两者都去稳定。例如，一个该实施方案将PEST序列以及4个九聚体分别引入表达载体中翻译终止密码子紧上游和终止密码子下游(优选离终止密码子20nt或以上)。
按这种方法，报道蛋白质可能在蛋白质水平和mRNA水平都去稳定。
该去稳定的报道蛋白质可能是任何合适的蛋白质。例如，去稳定的GFP蛋白质较为合适，例如包含MODC的d1突变体的d1EGFP、d1EYFP和d1ECFP。该去稳定的萤光素酶蛋白质如Leclerc G.等人所述。使用MODC PEST序列。也包括d1EGFP的MODC。
本发明包括使目的多肽去稳定的任何方法。例如，目的多肽可以改变为其氨基端包括去稳定性氨基酸，使该蛋白质按照例如Bachmair等人美国专利系列号5,093,242以及Varshavsky等人美国专利系列号5,122,463所公开的N端规则途径进行改变。在优选的该类实施方案中，去稳定性的氨基酸选自异亮氨酸和谷氨酸，更优选自组氨酸、酪氨酸和谷氨酰胺，更加优选自天冬氨酸、天门冬酰胺、苯丙氨酸、亮氨酸、色氨酸和赖氨酸。在特别优选的实施方案中，该去稳定性的氨基酸是精氨酸。某些蛋白质的氨基端由于蛋白质的构象(即三级或四级结构)而不明确。在这些情况下，为使蛋白质遵循N端规则途径，可能需要更多改变氨基端。例如，由于氨基端难以接近，简单添加或替换单个氨基端残基是不够的，可能添加若干氨基酸(包括赖氨酸，泛素连接到底物蛋白质的部位)到原始的氨基端，以提高改造的氨基端的可接近性和/或片段活动性。
可以在基因水平进行蛋白质氨基端的改变或设计。可以使用定点诱变的常规技术，在分离或合成的编码抗原的多核苷酸的5’端添加或替换合适的密码子，以提供该编码蛋白质所需的氨基端结构。例如，可以将去稳定性氨基酸的合适密码子插入或构建到蛋白质编码序列的氨基端，以使所表达蛋白质的氨基端具有所需氨基酸。必要时，可以修饰编码蛋白质氨基端区域的核酸序列，在适当位置引入赖氨酸残基。这可以利用编码″通用去稳定性片段″的DNA构建体最方便地实现。通用去稳定性片段包含编码优选具有片段活动的、包含一个或多个赖氨酸残基的多肽结构的核酸构建体，赖氨酸残基的密码子位于构建体内部，以便将该构建体插入编码抗原的多核苷酸的编码序列后，该赖氨酸残基能够空间上充分接近该编码蛋白质的氨基端，而作为完整氨基端降解信号的第二个决定簇。将该构建体插入编码抗原的多核苷酸的5’部分，将会提供编码蛋白质在合适位置用于去稳定性的一个(或多个)赖氨酸残基。
在另一实施方案中，将目的多肽修饰为包含富含选自脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸和苏氨酸的氨基酸的PEST区，该区任选侧接包含正电侧链的氨基酸。在此方面，已知细胞内半衰期少于2小时的蛋白质的氨基酸序列包含一个或多个富含脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)的区域，例如Rogers等人(1986，Science 234(4774)364-368)所示。在另一实施方案中，该目的多肽缀合泛素或其生物学活性片段，产生的修饰多肽相对于未修饰的多肽而言，其细胞内蛋白水解降解速率提高、增强或上升。
本发明另一方面涉及包含可转录多核苷酸的表达载体，其包含编码调节相应于所述可转录多核苷酸转录本稳定性的RNA元件的核苷酸序列；其中该RNA元件是降低所述转录本稳定性的去稳定性元件，其中该报道蛋白质选自萤光素酶、绿色荧光蛋白质、红色荧光蛋白质、SEAP、CAT、或其生物学活性片段、或变体或衍生物。
这种载体可用于筛选改变其启动子活性的药物或处理。与现有报道载体相比，可以几乎″实时″测定药物作用。
本发明再一方面涉及包含可转录多核苷酸的表达载体，其包含编码可调节相应于所述可转录多核苷酸的转录本稳定性的RNA元件的核苷酸序列；其中该RNA元件是降低所述转录本稳定性的去稳定性元件，并且其中该载体包含任意顺序的一种或多种选自以下的成分(i)供引入核苷酸序列的多克隆位点，优选该位点可以酶学或化学断裂，以提供可以直接克隆PCR扩增产物的线性化的载体(例如Ec1HK1位点)；(ii)报道基因；
(iii)用于调节所述可转录多核苷酸表达的启动子和/或增强子；(iv)多腺苷酸化序列；(v)选择性标记基因；以及(vi)复制起点。
本发明另一方面涉及载体或成套载体，特别而不仅仅是质粒，用于研究、或测定、或监控基因表达(例如启动子活性)。还可以使用其它许多载体，例如病毒、人工染色体及其它非质粒载体。
一个实施方案涉及成对或成套质粒，各自包含引入编码去稳定性的报道蛋白质例如d1EGFP、d1EYFP、d1ECFP或d1DsRed的构建体中的一个或多个上述mRNA去稳定性序列。每对或每套质粒之一(对照)含有报道分子编码区启动子5’。该启动子包含可通过外源处理(例如TRE与最小启动子例如mCMV相结合；参见图2c)而调节(即可诱导或可抑制)的元件。另外使用组成型活性启动子，例如TS、SV40、CMV、TK或RSV(参见图2b)。在植物系统中，Top-ten启动子可以代替TRE，花椰菜花叶病毒35S启动子可以代替SV40等。根癌农杆菌可用于促进植物基因转移。成对或成套质粒中的其它质粒与对照质粒相同，只是克隆位点(MCS)取代了启动子，报道分子编码区编码与对照的报道分子类似但并不相同的报道分子(参见图2a)。在优选实施方案中，对照质粒编码EGFP的去稳定性变体(例如d1EGFP、d1EYFP或d1ECFP)，其它载体(待测载体)各自编码同一列表(相同的蛋白质半衰期)的不同颜色变体。
在其它实施方案中，将对照和一个待测报道分子引入单个载体、例如双向质粒中(参见图3)。
在上述实施方案中，对照和待测质粒都编码去稳定性的mRNA，其随后编码去稳定的蛋白质。因此，降低的启动子活性和降低的报道蛋白质水平之间的时间延迟较之现有构建体显著下降。同样，由于预先存在的mRNA和蛋白质的水平下降，提高的启动子活性可更为容易和快速的检测。使用因只有少数小突变而互不相同的荧光蛋白质，使可导致误差的对照和待测构建体之间的其它差异最小化。相比基于萤光素酶或其它酶的分析方法，此处所述荧光报道分子具有其它若干优点，包括·可以在相同的细胞或样品中测定几种不同的报道分子。
·可以测定活细胞，允许相同样品多个时间点、或测定后的进一步操作，例如测定在药物处理前后的相同细胞。
·可以通过荧光显微术观察成功转染的细胞。因此，仅仅在显微镜下观看细胞，无需另外投入资源，便可以鉴定较差的转染。
·不需要底物，因此该方法技术要求低、快速、廉价并更为准确。
·可以利用流式细胞术同时测定对照和待测报道分子的表达(参见下文流式细胞术的优点)。
·利用TREs为对照启动子的实施方案只能用于Tet-On或Tet-Off细胞系，但相比其它对照启动子，显示来自或针对待测启动子的干扰更少，并更少受到用于检测待测启动子可诱导性的各种刺激物的影响。因此，可以更精确测定转染效率以及待测启动子的相对活性。可以按需开启或关闭对照报道分子的表达，并用于证实没有启动子的串扰、或者若有则进行补偿。
·在另一实施方案中，将上述对照和一个待测报道分子引入单个载体、优选双向质粒。在对照启动子中使用TREs，使原双启动子载体的主要缺点两个启动子之间的干扰减至最小。这种单一载体系统防止了共转染研究的不准确性。
本发明也提供将信息性启动子或启动子片段置于报道分子编码区上游的载体。本发明提供了更简单、快速和低成本的报道系统，用于这种使用EGFP变体而非萤光素酶或其它酶为报道分子的分析。此外，包含mRNA不稳定性元件允许进行近乎实时的分析。
信息性启动子包括但不限于细胞周期依赖性启动子(例如细胞周期蛋白A、B、或D1，组蛋白或拓扑异构酶I启动子)、凋亡(细胞死亡)活化的启动子途径以及促有丝分裂信号有关联的启动子/片段(表1)。可以使用的信息性增强子的实例包括Clontech’s MercuryPathway Profiling Systems所用的增强子。Clontech’s Mercury体内激酶分析试剂盒代表了怎样使用本发明的另一实例。此例中的启动子元件是TRE，可结合细胞内嵌合的TetR反式激活因子蛋白质，其只有在特定激酶活化时才允许从TRE转录，并磷酸化融合蛋白质的反式激活因子结构域。因此，本发明可用于更实时测定特定激酶活性。
本发明另一方面涉及利用本发明载体转染或转导的细胞，该载体包含可转录多核苷酸，其中包含编码调节相应于所述可转录多核苷酸转录本稳定性的RNA元件的核苷酸序列。
在某些应用中，将表达载体或表达报道分子构建体的细胞插入生物体中，以便测定体内报道分子活性。在其中某些应用中，优选的报道分子可能是去稳定的萤光素酶，而非去稳定的EGFP变体。例如，在信息性启动子控制下表达去稳定萤光素酶的转基因小鼠可用于利用光子成像仪测定该启动子在活鼠组织中的活性(光子成像仪分析如Contag等人，1997所述)。mRNA去稳定序列用来提高启动子活性和报道分子水平之间的时间相关性，从而受益于启动子活性的近乎实时测定，而显著改善诸如药物筛选等应用。
在某些应用中，希望在基于细胞的系统中体外表达、或哺乳动物系统中体内表达报道分子和功能基因产物。这可能涉及各包含mRNA去稳定性元件的两个独立mRNA。另外，可能将mRNA去稳定性元件引入可产生两个独立蛋白质、或由报道分子和功能基因产物组成的融合蛋白质的单个去稳定的转录本中(例如使用内部核糖体进入位点；IRES)。
本发明也提供稳定表达这些载体的细胞系(有或没有对照)。该细胞可应用于诸如药物筛选等领域。例如，包含MAPK依赖性报道载体的细胞可提供快速廉价方法，用于测定设计为抑制该细胞MAPK或位于MAPK依赖性转录上游的任何途径的药物效果。例如在SKBR3人乳腺癌细胞中，MAPK活性依赖于来自过表达ErbB2蛋白质的信号。因此，抑制ErbB2的药物应导致包含该构建体的SKBR3细胞的荧光下降，缺少ErbB2的细胞则不然。另外，可以加减通过不同途径引起MAPK活化的药物以及特定配基或处理，测试细胞，以便监控对该途径的抑制。稳定表达连接细胞周期调节性启动子的载体的细胞系(或生物体)可用于快速、简便、廉价测定细胞周期进展或细胞增殖的方法。该细胞系显然可用于药物筛选，并包含于本发明之内。易于获得细胞周期调节性启动子的实例，例如(Lee，H等人1995)、(Stein，J等人1996)和(Huet，X等人1996)。
本发明另一实施方案包括供研究转录后调节、特别是mRNA稳定性的载体。例如该报道分子是EGFP的去稳定变体(例如d1EGFP、d1EYFP、d1ECFP)，在每个单独载体中具有不同颜色的变体。TRE(与最小启动子例如mCMV连接)位于报道分子编码区的5’，以四环素(或强力霉素)依赖性方式驱动转录。还可以使用其它诱导型启动子系统。
在一个实施方案中，不包括上述mRNA不稳定性元件，MCSs取而代之，主要位于3’-UTR(参见图4a)，在某些特定实施方案中也位于5’-UTR和/或编码区。可以将据认为影响mRNA稳定性的序列克隆到包含单色变体载体的合适克隆位点，利用四环素或强力霉素阻断转录后，测定报道分子水平的减少率，从而对其进行测试(参见图7)。如果需要，可以比较相同细胞中″待测载体″和″对照载体″(编码不同颜色EGFP变体、而不包含待测序列)之间的衰变率。
MCS可有利地包含或联用允许直接克隆具有突出端的PCR产物的限制性内切酶位点(参见下文)。
在本发明另一相关实施方案中，包括一种或多种mRNA不稳定性元件，以帮助科学家明确寻找mRNA稳定性元件。同样，其它实施方案包括mRNA稳定性元件，以帮助科学家明确寻找mRNA去稳定性元件。
在其它实施方案中，将对照和一个待测报道分子共同引入单个载体、优选双向质粒中(参见图4b)。
例如，蛋白质纯化期间要求高水平蛋白质或者启动子较弱时，稳定性元件可用于提高所表达蛋白质的水平。
使用TRE或类似元件驱动两种报道分子，并通过加入强力霉素(或四环素)关闭该载体转录以后，测定报道分子水平，可以防止两个启动子之间的干扰以及该元件或各种待测刺激物的转录影响。
本发明另一方面涉及利用本发明载体转染或转导的细胞，该载体包含可转录的多核苷酸，其中包含编码调节相应于所述可转录多核苷酸转录本稳定性的RNA元件的核苷酸序列；其中该RNA元件是降低该转录本稳定性的去稳定性元件。
本发明相关方面涉及包含可转录多核苷酸的遗传修饰的非人生物体，其包含编码可调节相应于所述可转录多核苷酸转录本稳定性的RNA元件的核苷酸序列；其中该RNA元件是降低所述转录本稳定性的去稳定性元件。
本发明另一实施方案涉及测定目的多核苷酸表达的方法，该方法包含在足以发生RNA和蛋白质合成的时间和条件下于报道分子表达载体中表达该目的多核苷酸，该载体包含可转录的多核苷酸，其中包含编码转录元件的核苷酸序列和目的多核苷酸，该可转录元件调节相应于所述可转录多核苷酸的转录本稳定性；并且其中该表达载体以任意顺序包含选自以下的一种或多种成分(i)用于引入该目的多核苷酸的多克隆位点；(ii)报道基因；(iii)调节所述目的多核苷酸和/或报道基因表达的启动子，该启动子优选可调节型启动子(例如使用四环素反应性元件(TRE))；(iv)多腺苷酸化序列；(v)选择性标记基因；以及(vi)复制起点；并测定与对照相比，该报道分子随时间变化的水平或活性，其中所述去稳定性元件可增强在启动子或增强子活性和报道分子水平或活性之间的时间相关性。
此处涉及联合作用的不同RNA去稳定性元件的组合。
本发明通过非限制性实施例进一步描述。
实施例1将DNA元件克隆到载体中使用MCS中的限制酶位点，或者若载体的MCS中具有″T突出端″，则直接连接PCR产物，按照现有方法进行克隆。然而，转录后的报道载体在3’-UTR或其它区域包含MCS是对设计用于转录或其它研究、但在这些位置不包含方便的克隆位点的现有载体的显著改进。
实施例2转染按现有方法(例如Fugene[Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany]或电穿孔)进行对照和待测载体的共转染，上述单个(例如双向)载体系统除外，其只需要一个载体，从而消除与共转染有关的不准确性。
实施例3测定报道分子表达vGFP系统的直接优点在于，简单通过在荧光显微镜下观察组织培养板或培养瓶，便可以直接观察活细胞中的报道分子表达。因此，可以鉴定并丢弃较差的转染，而无需浪费任何额外时间。使用荧光计(例如96孔板格式)进行定量测定，因为可以测定活细胞，所以可以重复测定相同的样品，例如在时间过程中。
与萤光素酶及其它基于酶的分析方法相比，另外的优点在于，还可以使用流式细胞术测定报道分子的水平。
实施例4使用流式细胞术测定报道分子水平的优点i.可以按每秒＞2,000个细胞的速度，逐一测定每个细胞中两种或更多的报道分子(对照和待测)以及其它参数。因此，在此应用中，该方法每种试样产生数千到无数个数据点，相比现有萤光素酶分析只产生一个数据点。
ii.精确测定转染效率这可用于优化转染方案。除了可以比较不同方法之外，也可能测定每个细胞的表达以及表达的细胞比例。这有助于研究人员确定任何问题的起因。
iii.确认共转染误差共转染研究基于以下前提，即细胞摄取并表达一定量的对照报道分子，与该细胞摄取的待测质粒的数量成比例的。情况并不总是如此。使用此处所述流式细胞术，有可能使相同样品中不同细胞的待测与对照的表达水平相关。在待测与对照报道分子水平之间缺少良好线性关系，即鉴定为无效样品。现有方法无法留意这种误差。
iv.同时测定其它参数可使用荧光标记抗体按细胞定量细胞上的蛋白质，并与报道分子水平相关联，以确定该蛋白质是否通过克隆到报道构建体中的元件影响基因表达。另外，可以通过转染合适的表达载体(可诱导型或非诱导型)，将目的蛋白质表达为vGFP融合蛋白质(目的蛋白质与GFP变体融合)。该特定蛋白质的水平因而与连接目的调节元件的不同GFP变体的表达相关联(共转染或在不同时间转染)。在第三个应用中，vGFP报道分子与据认为是细胞周期特异性的调节元件(例如启动子)相连接。利用荧光DNA染料例如碘化丙啶染色转染的细胞，以测定其DNA含量，其与报道分子的表达相关。原则上可以共表达此处所述各包含不同vGFP的若干DNA构建体，并独立进行测定。此外，其它荧光标志可以用于连接这些载体(单个或多个)。
v.细胞分类使用细胞分类仪有可能将表达vGFP的活细胞与未表达细胞分离。该技术可用于选择稳定表达的细胞或在开始分析之前去除未表达细胞。类似地，有可能去除vGFP表达水平极低和/或极高的细胞。这可以用于产生更均一的群体和/或去除可能不具有生理意义、或可能干扰正常细胞功能、和/或可能对从此处所述DNA载体所获数据产生不利影响的高表达水平细胞。
重要的是注意到，表达载体的瞬时和稳定转染产生表达水平非常不均一的细胞群体。一般而言，最高和最低表达细胞之间具有一千倍差异并不罕见。本发明不仅提供用于必要时选择均一性群体的方法(参见上述v)，也利用不均一性而有利于科学家。例如，确认共转染误差。另一例子与上述(iv)有关。为确定蛋白质X是否影响启动子Y的转录，利用在启动子Y控制下表达d1EGFP的报道构建体转染细胞。如果需要，可以使用细胞分选分离瞬时或稳定表达合适水平d1EGFP的细胞。接下来利用表达蛋白质X-EYFP融合蛋白质的载体瞬时转染这些细胞。在流式细胞术中，一个轴图示EGFP，另一轴图示EYFP。正相关表示蛋白质X增强启动子Y的转录，而负相关表示蛋白质X抑制启动子Y的转录。
目前，科学家选择蛋白质X高和低表达子的若干不同克隆，试图建立这种相关性。然后分别利用启动子Y-萤光素酶构建体转染各个克隆，并测定萤光素酶活性。使用细胞克隆需要数月准备，并带来许多变数，包括已有的宿主细胞不均一性以及载体整合的不同位点(载体DNA可能干扰整合位点处的特定基因，并且该位点对于每个克隆各不相同)。此外，该方法产生很少的数据点，每个数据点得自不同克隆的不同转染。因此，新系统比现有方法不仅更加通用，而且更快速、准确。
实施例5激光扫描细胞计量术(LSC)不同于流式细胞术，LSC测定玻片上细胞的多色荧光和光散射，并记录所分析的每一细胞的测定位置和时间。该技术提供的数据与流式细胞术相当，但具有基于显微镜载玻片的优点(Darzynkiewicz等人，1999；Kamentsky等人，1997)。由于利用GFP及其变体的荧光，流式细胞术所述技术也适用于LSC。
实施例6用于转录后分析的特定方法使用旨在确定特定3’-UTR片段是否影响mRNA稳定性的研究实例，对此进行了充分概述。尽管该实例是一种瞬时表达，但也可以使用稳定转染。
(i).将3’-UTR片段连接到待测载体的3’-UTR克隆位点，与对照载体共转染Tet-Off细胞系。就双向载体而言，不需要对照载体。实际上，由于可以测定来自同一转染的样品的衰减速率，典型应用不需要对照报道分子或载体。将5’-UTR片段插入载体的5’-UTR克隆位点进行测试。
(ii).细胞在没有强力霉素(或四环素)的存在下生长6-48小时，使两个载体表达。另外，细胞在低剂量强力霉素(或四环素)下生长6-48小时，以阻断转录，然后转到无强力霉素(或四环素)的培养基中2-12小时，使转录短暂突发。
(iii).然后应用高剂量强力霉素(或四环素)关闭两个载体的转录。
(iv).(利用流式细胞术、荧光测定法或LSC)按时间过程测定在加入强力霉素(或四环素)以后两个报道分子的荧光。
如果该克隆元件赋予mRNA不稳定性，将观察到″待测″荧光比相同细胞或样品的″对照″荧光下降更快。可使用类似研究测试mRNA元件对某些刺激物的反应，或者在不同细胞、或表达不同数量特定蛋白质(例如RNA结合蛋白质)的细胞中的作用。在强力霉素之后应用刺激物，确定已有转录本是否受该刺激物影响。在不同位置(例如5’-UTR、3’-UTR)插入所述元件，确定其功能是否依赖于所处位置。在载体的报道分子编码区插入蛋白质/多肽的编码序列(框架内)，可用于确定该序列对mRNA和蛋白质稳定性的影响。
可以从转染细胞中提取RNA，用于直接测定报道mRNA。
实施例7转录报道载体所述载体是适于在大肠杆菌中扩增、并在真核细胞中表达荧光报道分子的质粒。所述质粒可能成套使用。每套载体由一种或多种″对照″载体和一种或多种″待测″载体组成。每套中的每一载体都表达相似的去稳定mRNA以及相似的去稳定荧光报道蛋白质。除了此类质粒的标准特征(氨苄青霉素抗性、复制起点等)之外，每个质粒包含下列构建体(也参见图2和3)5’----MCS/启动子----转录起始位点----5’UTR---ATG--vEGFP编码区-终止密码子-带有mRNA去稳定性元件的3’-UTR---多腺苷酸化信号其中MCS/启动子代表多克隆位点(待测载体；参见图2a)，或组成型活性启动子，例如SV40(对照载体；参见图2b)，或诱导型启动子，例如TRE-mCMV(对照载体；参见图2c)。
ATG代表翻译起始密码子。
终止密码子代表翻译终止密码子。
5’UTR代表5’非翻译区。
带有mRNA去稳定性元件的3’UTR代表包含一个或多个所述mRNA去稳定性元件的3’非翻译区。
vEGFP代表EGFP的去稳定性变体。为每种去稳定性修饰(例如，1小时半衰期、2小时半衰期)提供一套质粒。在每套质粒中，为每种不同颜色变体提供一个载体。例如，一套质粒包含表达d1EGFP、d1EYFP、d1ECFP的载体，而另一套表达d2变体。
在其它实例中，将对照和一种上述待测报道分子共同引入单个载体、优选双向质粒中(参见图3)。
实施例8转录后报道载体与包含TRE-mCMV启动子的转录报道″对照″载体类似，只是3’-UTR的mRNA去稳定性元件替换为MCS(参见图4a)。在某些实施方案中，MCS也位于5’UTR和/或编码区。
这种构建体可用作″待测″或″对照″载体，用于此处所述转录后分析。
在其它实例中，将对照和一种上述待测报道分子共同引入单个载体、优选双向质粒中(参见图4b)。
实施例9
供分析特定途径的报道载体与此处所述载体类似，其中已在MCS中插入调节元件，以供研究或测定该调节元件的功能。例如，与此处所述转录报道质粒类似的质粒，只是在MCS中包含对诸如表I所示途径具有反应性的启动子、或启动子元件、或增强子，和/或包含如Clontech’s Mercury PathwayProfiling Systems所述的任何下列顺式作用增强子元件AP1、CRE、E2F、GRE、HSE、ISRE、Myc、NFAT、NFκB、p53、Rb、SRE。该报道分子优选GFP、萤光素酶或SEAP的去稳定形式。
供分析特定途径的细胞系和小鼠此处描述了稳定表达一种或多种载体的细胞系或遗传修饰的小鼠。
实施例10使用方法除此处所述新方法以外，基本上按与其所取代的现有载体相同的方法使用本发明所述载体进行实验。
构建方法使用标准克隆技术组建此处所述载体和DNA构建体。易于在多种常用载体中获得此处所述SV40和TRE-mCMV启动子以及更标准化的质粒载体成分(例如复制起点、抗生素抗性或另一选择基因)。编码EGFP的去稳定变体(例如d1EGFP、d1EYFP、d1ECFP以及d2EGFP、d2EYFP、d2ECFP)的DNA序列可得自Clontech(ClontechLaboratories Inc.，Palo Alto，CA，USA)。将编码短寿蛋白质降解结构域(或其突变体)的序列融合到DsRed编码区的3’端，构建编码去稳定DsRed变体的DNA序列。例如，小鼠鸟氨酸脱羧酶的422-461氨基酸，其中包含PEST序列。这种序列可能来源于现有dEGFP变体。
实施例11总结总之，目前可获得所示载体和方法
·引入一种或多种mRNA不稳定性元件、以便提供相对短寿的mRNA的表达载体或其部分。与现有表达载体相比，此处要求保护的载体提供了与启动子活性更紧密相关的蛋白质表达动力学。例如，显著降低了在降低的启动子活性与降低的mRNA和蛋白水平之间的时间延迟。
·编码去稳定mRNA、随后编码去稳定蛋白质的表达载体或其部分。与现有表达载体相比，此处要求保护的载体提供了与启动子活性更紧密相关的蛋白质表达动力学。
·表达载体或其部分，其中mRNA去稳定性元件由克隆自诸如c-fos等短寿mRNAs的序列组成，短寿mRNAs的例子包括；c-fos、c-myc、GM-CSF、IL-3、TNF-α、IL-2、IL-6、IL-8、尿激酶、bcl-2、SGLT1(Na(+)-偶联的葡萄糖转运蛋白)、Cox-2(环加氧酶2)、IL-8、PAI-2(纤溶酶原激活物抑制剂2型)、β1-肾上腺素能受体、GAP43(5’UTR和3’UTR)、富含AU的元件(AREs)和/或富含U的元件，包括但不限于单个、串联、或多个、或重叠拷贝的九聚体UUAUUUA(U/A)(U/A)(其中U/A是A或U)(Lagnado等人1994)、和/或五聚体AUUUA(Xu等人1997)、和/或四聚体AUUU(Zubiaga等人1995)。也包括上列元件的微小修饰或改变。术语″串联拷贝″允许一个或多个外侧的核苷酸复制和/或非复制。例如，五聚体AUUUA的串联拷贝包括序列诸如AUUUAUUUAUUUA和AUUUAAUUUAAUUUA。短寿mRNAs的3’UTR或5’UTR区通常包含去稳定性序列。
·表达载体或其部分，使用此处所述载体鉴定或确认其中mRNA去稳定性元件，该载体提供了显著改进的鉴定这种元件的方法。
·表达载体或其部分，其中该去稳定mRNA编码短寿的报道蛋白质，例如EGFP或萤光素酶的去稳定变体。与现有报道载体相比，此处要求保护的载体提供了与启动子活性更紧密相关的报道分子表达动力学。例如，显著降低了在降低的启动子活性与降低的mRNA和蛋白水平之间的时间延迟。
·成套的报道载体或其部分，其类似地编码去稳定mRNAs(与同一套中其它载体类似)，随后类似地编码(与同一套中其它载体类似)EGFP或DsRed或其它荧光标志的去稳定变体。每套中的一种或多种载体(对照载体)包含组成型启动子(例如SV40、CMV、RSV、TK、TS；参见图2b)、或诱导型启动子(例如TRE-mCMV；参见图2c)，而每套中的其它载体(待测载体)包含克隆位点(例如，MCS)，而非启动子(例如，参见图2a)。这些载体的应用包括但不限于研究或测定启动子活性。例如，可以将目的启动子元件克隆到编码d1EGFP的待测载体的MCS中，相对于表达d1EYFP的对照载体测定报道分子表达。本发明还要求保护详细描述的各个载体，例如双向载体或在同一载体中引入待测和对照报道分子构建体的其它单个载体系统(例如，图3a和图3b)。与现有成套的报道载体相比，此处要求保护的成套载体具有下列优点a).更近乎实时的测定启动子活性。
b).因对照和待测构建体之间密切相似而降低误差。
c).降低由待测启动子与对照启动子之间的串扰所致误差。利用对照载体中的诱导型启动子，通过在有和没有诱导的情况下测定，使这种串扰最小化和/或鉴定并修正。
d).可与所述流式细胞术/LSC方法联用。
·报道载体、或成套报道载体、或其部分，利用诱导型启动子，优选而不只是四环素反应性元件(TRE)，以便驱动去稳定荧光报道蛋白质(优选而不只是去稳定EGFP变体)的表达。该载体的3’UTR(例如图4a)和/或5’-UTR和/或报道分子编码区包含克隆位点，以便将调节元件或推定的调节元件克隆到表达单色荧光报道分子的载体中，如果需要，则与表达不同颜色报道分子、但并不包含目的元件的对照载体相比较。由于可以利用诱导型启动子按需关闭转录，该载体可应用于研究或测定转录后调节。这些载体具有的优点包括b-d中所列、能够将转录后影响与转录影响分开，以及a).引入其它载体所没有的方便的克隆位点；以及b).该技术比任何现有方法更为快速。
·单载体系统，其基本上连接一个待测和一个对照构建体(例如图4b)。待测和对照报道分子均由诱导型启动子驱动，克隆位点可以将调节元件只连入待测构建体。除所述载体的优点之外，单载体系统消除了与分开的待测和对照载体的共转染有关的问题和不准确性。
·使用流式细胞术或LSC测定由所述载体表达的2种或更多荧光报道分子的水平。在此应用中，该方法每种试样产生成千上万个数据点，相比之下，现有基于酶的分析只产生一个数据点。可以逐一测定每个细胞中两种或更多报道分子(对照和待测)以及其它参数(例如DNA含量、其它蛋白质的水平)。本发明也包括使用流式细胞术使相同样品的多个细胞中的2种或更多的报道分子水平相关，并利用该数据优化转染方案和/或确定与共转染有关的问题。例如，在待测与对照报道分子水平之间缺少良好线性关系，即确定为无效样品。现有方法无法注意这种误差。
·本发明要求保护利用转录后报道载体的方法。使用旨在确定特定3’-UTR片段是否影响mRNA稳定性的研究实例，对这些方法进行了充分概述。尽管该实例属于瞬时表达，但其可以使用稳定转染。
(i).将3’-UTR片段连接到待测载体的3’-UTR克隆位点，与对照载体共转染Tet-Off细胞系。就单载体系统而言，不需要对照载体。将5’-UTR片段插入载体的5’-UTR克隆位点进行测试。
(ii).细胞在没有强力霉素(或四环素)的存在下生长6-48小时，使两个载体表达。另外，细胞在低剂量强力霉素(或四环素)下生长6-48小时，以阻断转录，然后转到无强力霉素(或四环素)的培养基中2-12小时，使转录短暂突发。
(iii).然后应用高剂量强力霉素(或四环素)关闭两个载体的转录。
(iv).(利用流式细胞术、荧光测定或LSC)按时间过程测定在加入强力霉素(或四环素)以后，两个报道分子的荧光。
如果该克隆元件赋予mRNA不稳定性，将观察到″待测″荧光比相同细胞或样品的″对照″荧光下降更快。可使用类似研究测试mRNA元件对某些刺激物的反应，或者在不同细胞、或表达不同数量特定蛋白质(例如RNA结合蛋白质)的细胞中的作用。在强力霉素之后应用刺激物，将确定已有转录本是否受该刺激物影响。在不同位置(例如5’-UTR、3’-UTR)插入该元件，将确定其功能是否依赖于所处位置。在载体的报道蛋白质编码区插入蛋白质/多肽的编码序列(框架内)，可用于确定该序列对mRNA和蛋白质稳定性的影响。
可以从转染细胞中提取RNA，用于直接测定报道mRNA。
·本发明要求保护瞬时或稳定表达一种或多种表达构建体或其部分的细胞系。
·本发明要求保护瞬时或稳定表达一种或多种表达构建体或其部分的细胞系，其中该表达构建体包含可作为与人类疾病和/或对药物处理反应有关的信号转导途径的活化标志的调节元件。该途径包括但不限于表1所列以及本文另外所示(例如CRE、SRE、AP1、细胞周期蛋白A、B和D1启动子)。
·本发明要求保护表达一种或多种表达构建体或其部分的转基因小鼠、敲入(khock-in)小鼠或其它遗传修饰的小鼠。
·本发明要求保护表达一种或多种表达构建体或其部分的转基因小鼠、敲入小鼠或其它遗传修饰的小鼠，其中该表达构建体包含可作为与人类疾病和/或对药物处理反应有关的信号转导途径的活化标志的调节元件。该途径包括但不限于表1所列。
·DsRed的去稳定性变体或突变的DsRedl-E5。其通过将来自多种不稳定蛋白质的降解结构域(或其突变体)与DsRed的C端融合进行构建。例如，小鼠鸟氨酸脱羧酶的422-461氨基酸，其中包含PEST序列(Li等人1998)。还可以添加其它的去稳定性元件。本发明也涉及编码DsRed的去稳定变体的DNA构建体。
·编码所述DsRed的去稳定变体的载体，包括还包含所述mRNA不稳定性元件的载体。
·以下用于产生Tet-Off或Tet-On细胞系的方法使用标准技术将tTA或rtTA表达载体、优选逆病毒、腺病毒或质粒，在目的细胞系中稳定表达，通过抗药性标志分离表达细胞。然后利用TRE-vGFP构建体瞬时转染这些细胞，经过几轮流式细胞术的细胞分类。例如，良好的Tet-Off细胞在强力霉素存在下应当不显示荧光，并因而分选。进一步在没有强力霉素的情况下5-48小时以后，分选绿色细胞。最后，细胞在没有强力霉素的情况下生长一周或更长时间，进行最后一次分选，去除稳定转染的(绿色)细胞。
实施例12引入mRNA和蛋白质去稳定性元件的载体目的编码区(例如诸如EGFP或萤光素酶等报道分子)可以包括蛋白质去稳定性元件(例如，MODC的d1突变体；Clontech，并且包括其它PEST序列或其它蛋白质去稳定性元件，例如泛素化位点)以及mRNA去稳定性元件(例如，富含AU的元件)的组合序列。
例如，将萤光素酶和DsRed的终止密码子替换为Hind3位点(AAGCTT)，以便添加序列AAGCTTAGCCATGGCTTCCCGCCGGCGGTGGCGGCGCAGGATGATGGCACGCTGCCCATGTCTTGTGCCCAGGAGAGCGGGATGGACCGTCACCCTGCAGCCTGTGCTTCTGCTAGGATCAATGTGTAG，这是Clontech MODC的d1突变体，其使EGFP的半衰期为1小时。其后是接头(成为3’UTR的一部分)，然后UUAUUUAUU GGCGG UUAUUUAUU CGGCG UUAUUUAUU GCGCG UUAUUUAUUACTAG，其中包含4个九聚体，也在处于3’UTR、但更下游的位置与亲本载体(pGL3；Promega)的Xbal位点相连。
实施例13PCR产物的直接连接在载体的MCS中包含两个分开而又靠近的RE识别位点，在利用一个或多个RE切割时，在遗留载体的两端产生单个核苷酸T的3’突出端。例如，Ec1HK1的识别序列是GACNNN，NNGTC(在5’的第3和第4个N之间切割，在每个末端留下单个N的3’突出端)。将这些位点中的两个引入MCS中，以便利用Ec1HK1消化释放两者之间的较短区域，产生每端带有单个N的3’突出端的线性化载体。此例中，上游识别序列应当为5’GACNNTNNGTC3’，下游序列为5’GACNNANNGTC3’。利用Ec1HK1切割以后，大的载体片段的两端包含单个3’T突出端(类似于Promega pGEM-T Easy载体)。这便于直接连接由诸如Taq等产生5’A突出端的聚合酶所产生的PCR产物。这相比标准MCS有了显著改善，如果没有包含RE位点的PCR引物以及PCR产物的随后消化，标准MCS便不支持PCR产物的直接连接。这相比pGEM-T Easy载体也具有显著改善，pGEM-T Easy载体不能扩增(以线性形式供应)，并只能用于亚克隆(即，一般将PCR产物连接到pGEM-T Easy、扩增，然后利用RE消化移出，接着克隆到目的表达载体)。因此，所示MCS允许直接连接PCR产物，而无需利用RE消化(经常出问题)或亚克隆到中间载体。
实施例14去稳定的报道模型显示改进的实时分析使用标准克隆技术，在pGL3-Basic(Promega)主链中(氨苄青霉素抗性基因等)装配质粒报道载体。将来源于Clontech pTRE-d2EGFP载体的四环素反应性元件(TRE)插入MCS中。在某些构建体中，将萤光素酶编码区替换为Clontech的d1EGFP或d2EGFP编码序列(包括Kozak序列)。使用具有方便的5’侧翼RE位点的合适引物，通过PCR完成。在某些构建体中，将特定的mRNA去稳定性元件克隆到3’UTR编码区。这些序列一般通过合成、然后使有义和反义序列杂交而制备。侧翼序列提供突出″粘端″，其与3’UTR编码区经特定限制酶切割产生的末端匹配。利用这些酶消化载体并随之纯化以后，使用标准技术将杂交的寡聚物连接入载体。使用合适来源的基因组DNA或cDNA的PCR，作为获得诸如c-myc-ARE等大的去稳定性元件的另一方法。将很小的元件(例如1或2个九聚体)引入反向PCR引物，其中包含5’侧翼RE位点以及与载体模板中已有的3’UTR互补的3’侧翼区。利用合适的正向引物(与蛋白质编码区互补，并与内源性RE位点重叠)进行PCR以后，使用合适的RE位点消化PCR产物，并连接到原始载体中。
符号说明B＝来源于Promega pGL3-Basic的载体主链T＝来源于Clontech pTRE-d2EGFP载体的四环素反应性元件(TRE)，用作驱动报道分子转录的启动子。
G1＝用作报道分子的半衰期为1小时的GFP，即Clontech所定义的d1EGFP蛋白质编码序列。
G2＝用作报道分子的半衰期为2小时的GFP，即Clontech所定义的d2EGFP蛋白质编码序列。
L＝用作报道分子的萤光素酶，即来自pGL3-Basic(Promega)的荧火虫萤光素酶编码序列。
R＝用作报道分子的DsRed2R1＝羧基端融合与d1EGFP中相同的MODC突变体的DsRedN6＝插入3’UTR编码区的6个拷贝的TTATTTATT九聚体(SEQ IDNO1)。
N4＝插入3’UTR编码区的4个拷贝的TTATTTATT九聚体。
N2＝插入3’UTR编码区的2个拷贝的TTATTTATT九聚体。
N1＝插入3’UTR编码区的1个拷贝的TTATTTATT九聚体。
fos＝插入3’UTR编码区的、由Shyu等人(1989)所确定的c-fos ARE，即5’AAAACGTTTTATTGTGTTTTTAATTTATTTATTAAGATGGATTCTCAGATATTTATATTTTTATTTTATTTTTTT3’.(SEQ ID NO2).
myc＝如下定义的myc ARE5’ATGCATGATCAAATGCAACCTCACAACCTTGGCTGAGTCTTGAGACTGAAAGATTTAGCCATAATGTAAACTGCCTCAAATTGGACTTTGGGCATAAAAGAACTTTTTTATGCTTACCATCTTTTTTTTTTCTTTAACAGATTTGTATTTAAGAATTGTTTTTAAAAAATTTTAAGATTTACACAATGTTTCTCTGTAAATATTGCCATTAAATGTAAATAACTTT3’(SEQ ID NO21)方法使用Fugene试剂(Roche)，将5μg大量制备质量的DNA转染10cm培养瓶中～50％铺满的HeLa Tet-Off细胞(Clontech)。～10小时以后，培养瓶中细胞各分为～12个小皿(6cm)，然后培养过夜(～12-14小时)。此时间点(一般指定为零时或T0)，在大部分平皿的培养基中加入强力霉素，终浓度为1μg/ml。在当前以及随后的时间点，利用胰蛋白酶处理细胞并收集。对于表达GFP的构建体而言，使用标准FITC滤光片，通过流式细胞术分析这些样品。通过分选出非转染细胞(只有本底荧光)测定总的GFP荧光，然后将每个细胞的平均荧光(减去本底荧光)乘以阳性细胞数。使用合适的滤光片，类似测定RFP荧光(DsRed)。裂解利用萤光素酶编码载体转染的细胞，使用Promega双萤光素酶分析方法和试剂在发光计中测定。
数据一般表示为相对于零时的剩余报道分子(荧光或发光)的百分比。
由于零时加入的强力霉素引起报道分子的转录阻断，报道分子水平的降低速率可表示在改变的转录和改变的报道分子/蛋白质水平之间的时间延迟。本发明的首要目的在于降低该时间延迟，图7、8、9和11-14表明此目的已达到。
作为本发明的应用实例，制药公司可能希望筛选可降低疾病相关基因转录的药物。四环素/强力霉素诱导的TRE启动子转录阻断即是该系统的一种模式。图7和8显示利用标准萤光素酶报道载体，按10小时内萤光素酶活性的下降甚至检测不到总的转录阻断(使用强力霉素)。检测到去稳定EGFP突变体总的转录阻断为EGFP荧光在11小时(d2EGFP；BTG2)或7小时(d1EGFP；BTG1)内下降50％，因而其显示了改善。然而，当后一报道分子结合诸如4个拷贝的九聚体UUAUUUAUU(BTG1N4)等mRNA去稳定性元件时，检测到报道分子水平在3小时内下降50％。由此可见，利用包含去稳定性的构建体也可以很快检测到转录增加(Roth，1995)。
当然，强力霉素的作用并不迅速，由于该药物诱导100％的转录阻断需要时间，而致部分时间延迟。因此，在加入强力霉素后4小时的时间点之后并相对于该时间点绘制数据点，测定″有效衰变速率″(图9)。有效衰变速率从而排除了药物作用的延迟，乃蛋白质和mRNA半衰期的综合效应。图9显示利用包含1、2或4个九聚体的构建体的有效衰变速率。这些数据表明，4个九聚体比2个更有效，2个比1个更有效。此外，这些数据表明，将半衰期1小时的蛋白质(d1EGFP)与4个九聚体组合，可以达到约1小时20分的有效衰变速率。这非常接近于半衰期1小时的蛋白质，并表明mRNA半衰期极短。组合2个或多个不同的mRNA不稳定性元件，可以实现进一步下降(图13)。然而，大部分应用可能并不需要如此。需要更适度去稳定性效应的应用可以利用1个或2个九聚体，而非4个。
利用标准的萤光素酶报道分子，在加入强力霉素后，荧光实际上增强了。这点在按线性标度表示数据时(图8)最为明显，可以部分解释为强力霉素作用的延迟。然而，即使上溯4个小时，衰变也不明显，表明该报道分子不适用于测定转录随时间的变化。图10揭示了该载体的另一个问题。这些数据涉及在无任何处理或药物的情况下，报道分子水平随时间的变化(转染后24-34小时)。报道分子水平一般在转染后头24小时内提高，此时质粒进入细胞并开始表达。一般在约48小时观察到下降，此时质粒从细胞中排出。因此，一般在24-48小时进行测定。在无药物或处理时，包含不稳定性元件的新载体(BTG1N4)显示极好的报道分子水平稳定性。相比之下，萤光素酶载体的表达水平显然尚在猛升。具有中度稳定性的构建体(例如BTG1)显示中间结果。显而易见，半衰期较长的mRNA和蛋白质报道分子将经历较长的上升期，如图10所示。观察到在24-34小时的临界期内，新的构建体具有更稳定的表达水平，这便于精确测定，因而代表本发明的另一优点。
可以比较其报道mRNA序列不同(例如3’UTR)、但编码相同蛋白质或具有相同半衰期的不同蛋白质(例如d2EGFP、d2EYFP)的两种或多种构建体之间报道分子水平的下降速率。在这方面，衰变速率的差别表明改变的mRNA序列对mRNA稳定性的影响。例如，在3’UTR中存在4个以DNA为TTATTTATT(SEQ ID NO1)的UUAUUUAUU九聚体(图7-9)或c-fos ARE(图11)(SEQ ID NO2)，可显著提高mRNA的衰变速率。除了证明这些元件的有效性之外，所用方法和载体也代表了用于检测其它顺式作用mRNA稳定性/不稳定性元件的显著改进的系统，此处也包含了这种方法。
如图12-14所示，mRNA去稳定性元件与萤光素酶、GFP和DsRed一起作用，这些报道分子之间没有低水平的同源性。DsRed与EGFP只具有23％同源性。如图14所示，myc ARE(SEQ ID NO21)是有效的，与不同的去稳定性元件联用也有效。
实施例15mRNA去稳定性元件根据本发明，RNA去稳定性元件可以特别来源于下列基因的3’UTR。在大多数情况下，可以使用全长的3’UTR。然而，常常可单独使用富含U和/或富含AU的元件。
a)磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)mRNA去稳定性元件，如Laterza OF等人所述。位于3’UTR的3’部分的区域称为JW6和JW7，即GTATGTTTAAATTATTTTTATACACTGCC CTTTCTTACCTTTCTTTACATAATTGAAATAGGTATCCTGACCA(SEQ ID NO4)。
b)果蝇(Drosophila melanogaster)Bicoid基因3’UTR的前43nt包含mRNA去稳定性元件(Surdej P.等人)，该元件可特别用于使昆虫细胞中的mRNA去稳定性。
c)人硫氧还蛋白还原酶基因(Gasdaska，JR等人)。完整的3’UTR。1933-3690位核苷酸(包含6个富含AU的元件)。包含3个上游AU重复的片段(1975-3360位核苷酸)。nt 1933-2014处还有不富含AU的去稳定性元件。
d)热稳定抗原(HSA)基因，如Zhou，Q等人所述。例如，3’UTR中的1465-1625位核苷酸。
e)粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)ARE，如Chyi-Ying，A等人所述。AGUAAUAUUUAUAUAUUUAUAUUUUUAA AAUAUUUAUUUAUUUAUUUAUUUAA，即DNAAGTAAUATTTATATA TTTATATTTTTAAAATATTTATTTATTTA TTTATTTAA(SEQ ID NO5)。
f)c-fos全长3’UTR、或其部分、或ARE，由Shyu等人确定的5’AAAACGTTTTATTGTGTTTTTAATTTATTTATTAAGATGGATTCTCAGATATTTATATTTTTATTTTATTTTTTT3’(SEQ ID NO2)。
或由Peng，S等人确定的5’TTTTATTGTGTTTTTAATTT ATTTATTAAGATGGATTCTCAGATATTTATATTTTTATTTTATTTTTTTT3’(SEQ ID NO6)。
g)c-jun ARE，如Peng，S等人所述。5’UUUCGUUAACUGUGUAUGUACAUAUAUAUAUUUUUUAAUUUGAUUAAAGCUGAUUACUGUGAAUAAACAGCUUCAUGCCUUUGUAAGUU3’，DNA序列5’TTTCGTTAACTGTGTATGTACATATATATATTTTTTAATTTGATTAAAGCTGATTACTGTG AATAAACAGCTTCATGCCTTTGTAAGTT3’(SEQ ID NO7)。
或其不包含多腺苷酸化(AAUAAA)信号的突变体，即5’UUUCGUUAACUGUGUAUGUACAUAUAUAUAUUUUUUAAUUUGAUUAAAGCUGAUUACUGUGgAUccACAGCUUCAUGCCUUUGUAAGUU3’or as DNA 5’TTTCGTTAACTGTGTATGTACATATATATATTTTTTAATTTGATTAAAGCTGATTACTGTGgATccACAGCTTCATGCCTTTGTAAGTT3’(SEQ ID NO8)。
h)来自下列基因、包括其各自ARE成分的序列，如Henics，T.等人所述；IFN-γARE5’UCUAUUUAUUAAUAUUUAACAUUAUUUAUAUAUGGG3’，或DNA为5’TCTATTTATTAATATTTAACATTATTTATATATGGG3’(SEQ ID NO9)。
i)IL-2 ARE5’CUCUAUUUAUUUAAAUAUUUAACUUUAAUUUAUUUUUGGAUGUAUUGUUUACUAACUUUUAGUGCUUCCCACUUAAAACAUAUCAGGCUUCUAUUUAUUUAAAUAUUUAAAUUUUAUAUUUAUU3’，或DNA为5’CTCTATTTATTTAAATATTTAACTTTAATTTATTTTTGGATGTATTGTTTACTAACTTTTAGTGCTTCCCACTTAAAACATATCAGGCTTCTATTTATTTAAATATTTA AATTTTATATTTATT3’(SEQ ID NO10)。
j)c-myc ARE(也参见SEO ID NO21)5’AUAAACCCUAAUUUUUUUUAUUUAAGUACAUUUUGCUUUUAAAGUU3’，或DNA为5’ATAAACCCTAATTTTTTTTATTTAAGTACATTTTGCTTTTAAAG TT3’(SEQ ID NO11)。
k)IL-105’UAGAAUAUUUAUUACCUCUGAUACCUCAACCCCCAUUUCUAUUUAUUUACUGAGCUUCUCUGUGAACGAUUUAGAAAGAAGCCCAAUAUUAUAAUUUUUUUCAAUAUUUAUUAUUUUCA3’，或DNA为5’TAGAATATTTATTACCTCTGATACCTCAACCCCCATTTCTATTTATTTACTGAGCTTCTCTGTGAACGATTTAGAAAGAAGCCCAATATTATAATTTTTTTCAATATTTATTAT TTTCA3’(SEQ ID NO12)。
1)bcl-2来自bcl-2 3’UTR、包含全部或部分bcl-2 ARE的序列，如Schiavone，N等人确定，5’UCAGCUAUUUACUGCCAAAGGGAAAUAUCAUUUAUUUUUUACAUUAUUAAGAAAAAAGAUUUAUUUAUUUAAGACAGUCCCAUCAAAACUCCGUCUUUGGAAAUC3’(来自nt 2371-2475的M13994)，或DNA为5’TCAGCTATTTACTGCCAAAGGGAAATATCATTTATTTTTTACATTATTAAGAAAAAAGATTTATTTATTTAAGACAGTCCCATCAAA ACTCCGTCTTTGGAAATC3’(SEQ IDNO13)。
m)TNF ARE，如Xu，N等人所述，5’AUUAUUUAUUAUUUAUUUAUUAUUUAUUUAUUUA3’，或DNA为5’ATTATTTATTATTTATTTATTATTTATTTATTTA3’(SEQ ID NO14)。
n)IL3 ARE，如Xu，N等人所述，5’UAUUUUAUUCCAUUAAGGCUAUUUAUUUAUGUAUUUAUGUAUUUAUUUAUUUAUU3’，或DNA为5’TATTTTATTCCATTAAGGCTATTTATTTATGTATTTATGTATTTATTTATTTATT3’(SEQ ID NO15)。
o)九聚体UUAUUUAUU，DNA为TTATTTATT(SEQ ID NO1)，如Zubiaga，A等人所述。
p)九聚体UUAUUUA(U/A)(U/A)，DNA为TTATTTA(T/A)(T/A)(SEQ ID NO3)，如Lagnado，C等人所述。
q)五聚体AUUUA，如Xu，N等人所述，或DNA为ATTTA(SEQ IDNO16)。
r)四聚体AUUU，或DNA为ATTT(SEQ ID NO17)。
一般既为I型又为II型的富含AU元件(AREs)，如Chen，C和Shyu，A所述。
具有作为去稳定性元件的DST(下游序列)的植物。DST序列由Newnan，T等人确定。提议的DST共有序列为GGAgN2-9cATAGATTaN3-8(A/C)(T/A)(A/T)TttGTA(T/C)s)这是基于9个不同DST序列的比较。
黑体＝在9/9的基因中保守的。
大写＝在至少7/9的基因中保守的。
N2-9＝2-9个核苷酸的长度可变区；平均＝5。
N3-8＝3-8个核苷酸的长度可变区；平均＝6。
距终止密码子的距离＝19-83nt。
DST序列的其它实例包括大豆10A5基因；5’GGAGN5CATAGATTAN8AAATTTGTAC3’(SEQ ID NO18)。
拟南芥SAURAC1基因；5’GGAAN9CATAGATCGN8CAATGCGTAT3’(SEQ ID NO19)。
DST序列是供植物使用的富含AU元件的替换物。富含AU元件和DST序列均使植物中的转录本去稳定性。
t)铁效应性元件(IRE)Thomson，A等人，1999。
IREs的发夹环中包含共有序列CAGUG。
实例铁蛋白IRE；GUUCUUGCUUCAACAGUGUUUGAACGGAAC，或DNA为GTTCTTGCTTCAACAGTGTTTGAACGGAAC(SEQ ID NO20)。
转铁蛋白受体IRE；GAUUAUCGGGAGCAGUGUCUUCCAUAAUC，或DNA为GATTATCGGGAGCAGTGTCTTCCATAATC(SEQ ID NO21)。
铁调节蛋白(IRPs；例如IRP1和2)以铁依赖性方式结合IREs。也通过其它多种刺激物和处理(例如，氧化压力、一氧化氮、红细胞生成素、甲状腺激素或PKCs的磷酸化作用)调节结合。
IREs可以调节翻译效率和mRNA稳定性。例如，铁蛋白mRNA的5’UTR IRE只有在结合IRP时，才阻断翻译。转铁蛋白受体mRNA3’UTR的IREs在结合IRP时抑制mRNA衰变。因此，可以将IREs插入表达载体的5’UTR或3’UTR，以便可以通过调节铁水平或其它刺激物来控制表达。
去稳定性元件可以使用Clontech’s Mercury PathwayProfiling载体以及体内激酶分析试剂盒。Clontech出产3种不同的蛋白质去稳定性元件，均包含PEST序列，并均来源于MODC基因。位于EGFP羧基端的不同MODCs突变体可提供1、2和4小时的半衰期的蛋白质。可以使用本发明的mRNA去稳定性元件连接上述或其它任何蛋白质去稳定性元件(例如，泛素化信号)。
u)c-myc ARE也可确定为5’ATGCATGATCAAATGCAACCTCACAACCTTGGCTGAGTCTTGAGACTGAAAGATTTAGCCATAATGTAAACTGCCTCAAATTGGACTTTGGGCATAAAAGAACTTTTTTATGCTTACCATCTTTTTTTTTTCTTTAACAGATTTGTATTTAAGAATTGTTTTTAAAAAATTTTAAGATTTACACAATGTTTCTCTGTAAATATTGCCATTAAATGTAAATAACTTT3’(SEQ ID NO22)。
另一可用的mRNA元件可以得自组蛋白mRNA，具体而言，包括共有序列茎环结构的3’UTR序列，如Gallie，D等人所述TGA-N20-40-CCAAAGGYYYUUYUNARRRCCACCCA，其中Y＝嘧啶，R＝嘌呤，N＝任何核苷酸，或DNA为TGA-N20-40-CCAAAGGYYYTTYTNARRRCCACCCA(SEQ ID NO23)。
该序列可以提高翻译效率。此外，它们能够在S期之外特定引起mRNA衰变。本发明涉及包含细胞周期特异性启动子、连同mRNA去稳定性元件的报道构建体，作为引导细胞周期特异性表达(例如报道分子)的工具。组蛋白3’UTR元件在G2期引导的mRNA衰变强于S期，从而进一步限制蛋白质表达于S期，因此提供了可供S期或晚G1期特异性启动子使用的另一选择。
表达载体中的3’UTR元件的另一用途在于，特异性定位嵌合mRNA。例如，营养不良蛋白相关蛋白(utrophin)3’UTR能够引导报道mRNA到达结合细胞骨架的多聚核糖体。该3’UTR也包含mRNA稳定性元件(Gramolini，A等人)。
实施例16mRNA稳定性元件以及编码稳定的mRNA的表达载体稳定性序列可能包含富含CT元件和/或来源于长寿mRNAs(特别是3’UTR区)的序列。
富含CT元件可能包含(C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC，如Holcik和Liebhaber，1997所述。
富含CT元件可能包含下列元件CCTCCTGCCCGCTGGGCCTCCCAACGGGCCCTCCTCCCCTCCTTGC或其部分，包括CCTCC，CCTCCTGCC或CCCTCCTCCCCTGG本发明也涉及来自Yu和Russell所述人β-球蛋白3’UTR的14nt富含嘧啶区，用作稳定性元件。
稳定性元件所来源的长寿mRNAs的例子包括；α2球蛋白、α1球蛋白、β球蛋白。来自人、小鼠、兔或其它物种的牛生长激素3’UTR。
此处所述mRNA不稳定性元件一般主要作用于使嵌合基因去稳定性。由此可见，mRNA稳定性元件常常隐性作用。例如，在兔β-球蛋白基因中插入c-fos ARE，尽管依旧存在mRNA稳定性元件，仍产生去稳定性的转录本(Shyu，A等人1989)。α和β-球蛋白mRNAs均包含定位于各自3’UTRs的稳定性元件，但δ-球蛋白mRNA缺少这些元件，较不稳定。将δ-球蛋白3’UTR替换为α球蛋白mRNA的3’UTR，几乎使mRNA稳定性倍增(Russell，J等人1998)。然而，该元件不能稳定所有的转录本。因此，为产生表达稳定mRNA的表达载体，取决于所需稳定的原始mRNA而具有不同的要求。为产生这种载体，一般优选包括来自诸如α或β-球蛋白等稳定基因的大片段。这些例子中，该片段优选应包括完整的球蛋白3’UTR来替换内源性3’UTR。例如对δ-球蛋白而言，这往往足够了。然而常常需要另外引入蛋白质编码和/或5’UTR序列。一般而言，优选替换那些可能作为主要去稳定性元件的任何内源性富含AU或U的区域(可以使用此处所述方法进行鉴定)。可以将位于5’UTR或3’UTR中的这种区域简单替换为相同对应位置的α或β-球蛋白序列。可以通过同义密码子突变而使编码区不稳定性元件没有功能性。可以将球蛋白编码区引入目的基因的编码区，以便产生N端或C端融合蛋白质。但是这样常常并不理想，将球蛋白编码区(和3’UTR)定位于嵌合基因的3’UTR中，一般而言足矣。这样可以从更稳定的转录本表达目的蛋白质，因而显著提高了该蛋白质的水平。如果目的蛋白质是报道分子、或与报道分子融合、或容易与内源性蛋白质相区分，则此处所述TRE载体系统(参见图7)非常便于测试嵌合构建体的mRNA稳定性。
本领域技术人员应当知道，除明确描述的以外，此处所述本发明可能变化和改变。应当理解，此处所述本发明包括所有这类变化和改变。本发明也包括本说明书涉及或表明的所有这类方法、特征、组合物和化合物，不论单个或全体，以及任何两个或多个所述方法或特征的任何及所有组合。
表1可用于本发明的信号转导蛋白质信号转导蛋白质AKT(也称为PKB)Fas L/BIDJAK 7 StatMKK-47/JNKMTOR/p70 s6激酶NFκBp38PKA/Rap 1 B-rafRas/RafWnt/GSK3Erk 1&2
参考文献Chen，C and Shyu，A.Trends Biochem.Sci.1995vol 20 465-470.
Chyi-Ying，A et al. MCB 1995vol 15(10)5777-5788.
Contag，et al.Non-invasive localization of a light-emitting conjugate in a mammal UnitedStates Patent 5,650,135.July 22，1997.
Cormack，et al.FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein(GFP)United StatesPatent 5,804,387.September 8，1998.
Dandekar T et al Bioinformation 199814(3)271-278.
Darzynkiewicz.Laser-scanning cytometryA new instrumentation with many applications.Exp Cell Res 1999；2491-12.
Gallie，D et al.Nucleic Acids Res.1996vol24(10)；1954-1962.
Gasdaska，JR et al.JBC 1999vol 274(36)；25379-25385.
Gossen，et al.Tight control of gene expression in eucaryotic cells by tetracycline-responsivepromoters.United States Patent 5,464,758.November 7，1995.
Gramolini，A，et al.JBC 2001vol 154(6)1173-1183.
Henics，T.et al JBC 1999vol 274(24)17318-17324.
Holcik and Liebhaber，1997，PNAS vol 94 pp2410-2414.
Huet，X et al.Mol Cell Biol.1996；vol 16(7)3789-3798.
Ibrahim，et al.Pitfall of an internal control plasmidResponse of Renilla luciferase(pRL-TK)plasmid to dihydrotestosterone and dexamethasone.Biotechniques 2000；29682-684.
Kamentsky et al.Slide-based laser scanning cytometry.Acta Cytol 1997；41123-43.Li，et al.Generation of destabilised green fluorescent protein as a transcription reporter.J BiolChem 1998；27334970-34975.
Lagnado C et al，MCB，147984-7995，1994.
Laterza，OF et al Am J Physiol Renal Physiol.2000vol 279(5)F866-F873.
Leclerc G et al，Biotechniques 2000，29(3)590-595.
Lee，H et al.Gene Expr 1995；vol 4(3)95-109.
Li，et al.Rapidly degrading GFP-fusion proteins.United States Patent 6,130,313 October 10，2000.
Liu，J et al.JBC 2000；vol 275(16)11846-11851.
Newnan，T et al.The Plant Cell 1993vol 5；701-714.
Peng，S et al.MCB 1996vol 6(4)1490-1499.
Ross，J.Microbiological Reviews.1995vol 59(3)423-450.
Saito，T et al.Biochem Biophys Res Commun.1998；vol 252(3)775-778.
Schiavone，N et al.FASEB J.2000vol 14 174-184.
Shyu et al 1989Genes & Dev.Vol 3，pp60-72.
Stein，J et al.Int J Obes Relat Metab Disord.1996 Mar；20 Suppl 3S84-90.
Surdej，P and Jacobs-Lorena，M.MCB 1998 vol 18(5)2892-2900.
Thomson，A et al.Int.J Biochem Cell Biol.1999vol 31；1139-1152.
Tsien，et al.Modified green fluorescent proteins.United States Patent 5,625,048.April 29，1997.
Tsien，et al.Modified green fluorescent proteins United States Patent 5,777,079.July 7，1998.
Vazhappilly，R and Sucher，N.Neurosci Lett.2002；vol 318(3)153-157.
Xu W et al，MCB，17(8)4611-4621，1997.
Yu and Russell MCB Sept 2001 5879-88.
Zhou，Q et al.MCB 1998vol 18(2)815-826.
Zubiaga et al.MCB 1995；152219-30.
序列表<110>Gene Stream Pty Ltd<120>新型表达载体<130>2510548/VPA<160>23<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>9<212>DNA<213>萤火虫<400>1ttatttatt 9<210>2<211>75<212>DNA<213>哺乳动物<400>2aaaacgtttt attgtgtttt taatttattt attaagatgg attctcagat atttatattt60ttattttatt ttttt75<210>3<211>9<212>DNA<213>哺乳动物<400>3ttatttaww 9<210>4<211>73<212>DNA<213>哺乳动物<400>4gtatgtttaa attattttta tacactgccc tttcttacct ttctttacat aattgaaata60ggtatcctga cca 73<210>5<211>53<212>DNA<213>哺乳动物<400> 5agtaatattt atatatttat atttttaaaa tatttattta tttatttatt taa 53
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<221>misc_特征<223>Y是嘧啶R是嘌呤N是任何核苷酸<400>23ccaaaggyyy ttytnarrrc caccca 2权利要求
1.包含可转录多核苷酸的表达载体，其包含调节相应于所述可转录多核苷酸的转录本稳定性的RNA元件的编码核苷酸序列。
2.权利要求1的表达载体，其中所述的RNA元件是降低所述转录本稳定性的去稳定性元件。
3.权利要求1的表达载体，其中所述的RNA元件是提高所述转录本稳定性的稳定性元件。
4.权利要求2的表达载体，其中所述的可转录的多核苷酸包含目的多核苷酸，并编码多肽。
5.权利要求4的表达载体，其中所述的多肽包含报道蛋白质。
6.权利要求2的表达载体，其中所述的可转录的多核苷酸包含编码报道蛋白质的核苷酸序列。
7.权利要求1或2的载体，其包含选自以下的一种或多种成分(i)用于引入核苷酸序列的多克隆位点；(ii)报道基因(iii)用于调节所述可转录多核苷酸表达的启动子和/或增强子；(iv)多腺苷酸化序列；(v)选择性标记基因；以及(vi)复制起点。
8.权利要求7的载体，其另外包含至少一个可由酶学或生物化学方法断裂的位点，以提供可直接克隆PCR扩增产物的线性化载体。
9.权利要求2的载体，其中编码所述去稳定性元件的核苷酸序列是或来源于选自c-fos、c-jun、c-myc、GM-CSF、IL-3、TNF-α、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、尿激酶、bcl-2、SGL T1(Na(+)-偶联的葡萄糖转运子)、Cox-2(环加氧酶2)、IL-8、PAI-2(纤溶酶原激活物抑制剂2型)、β1-肾上腺素能受体或GAP43的基因。
10.权利要求3的载体，其中编码所述的稳定性元件的核苷酸序列是或来源于选自α2球蛋白、α1球蛋白、β球蛋白或生长激素、红细胞生成素、核糖核苷酸还原酶R1或m1毒蕈碱性乙酰胆碱的基因。
11.权利要求5的载体，其中编码所述的去稳定性元件的核苷酸序列选自任一SEQ ID NO 1-23、或其生物学活性片段，或变体或衍生物。
12.权利要求11的载体，其中编码所述去稳定性元件的核苷酸序列选自SEQ ID NO1、2或22、或其生物学活性片段，或变体或衍生物。
13.权利要求5或6的载体，其中所述报道蛋白质选自萤光素酶、绿色荧光蛋白质、红色荧光蛋白质、SEAP、CAT、或其生物学活性片段，或变体或衍生物。
14.权利要求4的表达载体，其中所述多肽包含蛋白质去稳定性元件。
15.权利要求13的表达载体，其中所述报道蛋白质包含蛋白质去稳定性元件。
16.权利要求14或15的载体，其中所述蛋白质去稳定性元件由编码PEST序列、或泛素、或其生物学活性片段、或变体或衍生物的核苷酸序列编码。
17.包含一种或多种上述权利要求中任一项的载体的细胞。
18.权利要求17的细胞，其中所述细胞是真核细胞。
19.权利要求18的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
20.权利要求19的细胞，其中所述细胞是人类细胞。
21.遗传修饰的非人生物体，其包含一种或多种权利要求1-16中任一项的载体。
22.测定目的多核苷酸表达的方法，该方法包含在足以发生RNA和蛋白质合成的时间和条件下于表达载体中表达该目的多核苷酸，所述载体包含可转录的多核苷酸，其包含目的多核苷酸以及编码可调节相应于所述可转录多核苷酸的转录本稳定性的RNA元件的核苷酸序列；并且其中所述表达载体包含选自以下的一种或多种成分(i)用于引入核苷酸序列的多克隆位点；(ii)报道基因(iii)用于调节所述可转录多核苷酸表达的启动子和/或增强子；(iv)多腺苷酸化序列；(v)选择性标记基因；以及(vi)复制起点。并测定可转录多核苷酸的表达产物与对照相比随时间变化的水平和/或功能活性，其中所述元件可增强有效连接所述可转录多核苷酸的启动子和/或增强子的活性与表达产物的水平和/或功能活性之间的时间相关性。
23.权利要求22的方法，其中包含编码所述RNA去稳定性元件的核苷酸序列的可转录多核苷酸是或来源于选自c-fos、c-jun、c-myc、GM-CSF、IL-3、TNF-α、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、尿激酶、bcl-2、SGLT1(Na(+)-偶联的葡萄糖转运子)、Cox-2(环加氧酶2)、IL-8、PAI-2(纤溶酶原激活物抑制剂2型)、β1-肾上腺素能受体或GAP43的基因。
24.权利要求22的方法，其中编码所述RNA去稳定性元件的可转录多核苷酸包含SEQ ID NO 1-23中任何一个所示的核苷酸序列、或其生物学活性片段、或变体或衍生物。
25.权利要求22的方法，其中编码所述RNA去稳定性元件的可转录多核苷酸包含SEQ ID NO1、2或22所示序列、或其生物学活性片段，或变体或衍生物。
26.鉴定编码可调节RNA转录本稳定性的RNA元件的核苷酸序列的方法，该方法包含将待测核苷酸序列引入表达载体，使该核苷酸序列连接编码报道蛋白质的多核苷酸，形成有效连接启动子和/或增强子的可转录多核苷酸；在足以发生RNA和蛋白质合成的时间和条件下表达该可转录多核苷酸；并且其中该表达载体包含选自以下的一种或多种成分(i)用于引入该待测核苷酸序列的多克隆位点；(ii)多腺苷酸化序列；(iii)选择性标记基因；以及(iv)复制起点。并测定所述可转录多核苷酸的表达产物与不含该核苷酸序列的对照载体相比随时间变化的水平和/或功能活性，其中水平和/或功能活性随时间不同于对照载体，表明该核苷酸序列编码所述RNA元件。
27.权利要求26的方法，其中所述启动子是可调节型。
28.权利要求27的方法，其中所述启动子是可诱导型。
29.权利要求27的方法，其中所述启动子是可抑制型。
30.权利要求26的方法，其中测定其水平和/或功能活性的表达产物是所述报道蛋白质。
31.权利要求26的方法，其中所述报道蛋白质选自萤光素酶、绿色荧光蛋白质、红色荧光蛋白质、SEAP、CAT、或其生物学活性片段，或变体或衍生物。
32.权利要求31的方法，其中所述报道蛋白质包含蛋白质去稳定性元件。
33.权利要求32的方法，其中所述蛋白质去稳定性元件由编码PEST序列、或泛素、或其生物学活性片段、或变体或衍生物的核苷酸序列编码。
全文摘要
本发明一般涉及表达载体及其在基因表达或基因调节分析中的用途。具体而言，本发明提供了表达载体和/或报道载体，其蛋白质表达动力学具有改善的时间相关的启动子活性。更具体而言，本发明提供了包含可转录多核苷酸的表达载体，其中包含调节相应于所述可转录多核苷酸的转录本稳定性的RNA元件的编码核苷酸序列。本发明特别提供用于鉴定和分析顺式和反式调节序列/因子的新载体，以及特别用于药物筛选和药物发现的载体和遗传改变的细胞系或生物体。
文档编号C12N15/09GK1503844SQ02808253
公开日2004年6月9日 申请日期2002年3月8日 优先权日2001年3月9日
发明者J·戴利, J 戴利 申请人:基因流股份有限公司
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