细胞表层结合性蛋白质及其应用的制作方法
专利名称：细胞表层结合性蛋白质及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞表层结合性蛋白质，具有糖链结合蛋白质区域，且该糖链结合蛋白质区域至少N末端侧或C末端侧结合有其它蛋白质。
背景技术：
细胞表层定位蛋白质是存在并固定于细胞表层的蛋白质。例如α-或a-凝集素，它是一种酵母的絮凝蛋白。这种蛋白质具有分泌信号序列，在这一点上与分泌蛋白相同，但是这种蛋白质通过GPI锚固定在细胞膜上进行输送，在这一点上又与分泌蛋白不同。一般情况下，细胞表层定位蛋白质在C末端侧具有GPI锚定区域。细胞表层定位蛋白质在通过细胞膜时，该区域的一部分(即，GPI锚附着识别信号序列)被选择性切断，新突出的C末端部分与GPI锚结合在细胞膜上，从而固定在细胞膜上。接着，通过磷脂酰肌醇依赖性磷脂酶C(PI-PLC)将GPI锚的根部切断。然后，由细胞膜使断开的蛋白质嵌入细胞壁中，固定在细胞表层，而定位于细胞表层。其中，GPI锚是指被称为葡糖基磷脂酰肌醇(GPI)的以乙醇胺磷酸-6甘露糖α1-2甘露糖α1-6甘露糖α1-4葡糖胺α1-6肌醇磷脂质为基本结构的糖脂。
GPI锚定区域通常位于细胞表层定位蛋白质的C末端或其附近。例如，在对α-凝集素的C末端起320个氨基酸序列进行编码的序列中，除GPI锚附着识别信号序列以外，还具有4个糖链结合部位。GPI锚用PI-PLC切断后，通过这些糖链与构成细胞壁的多糖类形成共价键，使得α-凝集素的C末端序列部分与细胞壁结合，而将α-凝集素保留在细胞表层。
利用这种GPI锚定区域，本发明人成功地在细胞表层表达了脂肪酶(特开平11-290078号公报)。即，在对GPI锚定区域进行编码的DNA的上游设置脂肪酶的结构基因，再在上游设置分泌信号序列，使脂肪酶在细胞表层表达，其N末端侧位于细胞的外侧。
发明内容
这样表达的蛋白质只要在N末端侧具有活性中心，就能够在细胞表层显示充分的活性。但是，当活性中心位于C末端侧时，活性中心距细胞表层过近，以致有可能引起立体位阻，而不能显示充分的活性。
因此，本发明人研究了各种使蛋白质在细胞表层进行表达的方法，结果出乎意料地发现，即使丧失了以前认为必须的GPI锚定区域的功能时，GPI锚定蛋白也能保持在细胞表层，从而完成了本发明。也就是说，只要至少含有GPI锚定蛋白的絮凝功能区域，通过构筑可使所需蛋白质在其N末端侧或C末端侧任意一方，或者既在N末端侧又在C末端侧表达的质粒，就能够使所需的蛋白质在细胞表层表达。
本发明提供一种细胞表层结合性蛋白质，它具有糖链结合蛋白质区域，该糖链结合蛋白质区域至少N末端侧或C末端侧结合有其它蛋白质。
在优选实施方式中，上述糖链结合蛋白质区域是至少含有GPI锚定蛋白的絮凝功能区域部分。
在优选实施方式中，上述GPI锚定蛋白是絮凝蛋白。
在优选实施方式中，所述絮凝蛋白是选自FLO1、FLO2、FLO4、FLO5、FLO9、FLO10和FLO11的蛋白质。
在另一优选实施方式中，上述其它蛋白质结合在上述糖链结合蛋白质区域的N末端侧。
在更优选实施方式中，上述其它蛋白质结合在上述糖链结合蛋白质区域的C末端侧。
在进一步的优选实施方式中，上述其它蛋白质为脂肪酶。
在优选实施方式中，上述其它蛋白质为抗体。
在优选实施方式中，上述糖链结合蛋白质区域的N末端侧和C末端侧结合有相同或不同的其它蛋白质。
本发明还提供对上述细胞表层结合性蛋白质进行编码的DNA。
本发明还提供含有上述DNA的质粒。
本发明还提供引入上述DNA或者上述质粒，在细胞表层表达上述其它蛋白质的细胞。
在优选实施方式中，上述细胞为酵母。
在优选实施方式中，上述其它蛋白质为酶。
本发明还提供上述细胞的使用方法，使上述其它蛋白质与基质接触，以便与该基质结合，或者将该基质转变成其它物质。
本发明还提供含有上述细胞的酶剂。
图1为制作质粒pWIFSpmROL的示意图。
图2为各种细胞表层具有脂肪酶的酵母的繁殖以及脂肪酶活性示意图。
图3是为表达短型FLO1脂肪酶的酵母MT8-1-short和表达长型FLO1脂肪酶的酵母MT8-1-long的甲醇分解反应活性示意图。
具体实施例方式
在本发明中，细胞表层结合性蛋白质是指至少含有糖链结合蛋白质区域以及其它蛋白质的融合蛋白，该蛋白质通过糖链结合蛋白质区域固定在细胞表层。
在本发明中，糖链结合蛋白质区域是指具有多个糖链，且该糖链能够通过与细胞壁中的糖链的相互作用或者相互缠绕而留在细胞表层的区域。例如，外源凝血素、类外源凝血素蛋白质等的糖链结合部位等。其中有代表性的可以列举出GPI锚定蛋白的絮凝功能区域。GPI锚定蛋白的絮凝功能区域是指位于GPI锚定区域N末端侧，具有多个糖链，且被认为是与絮凝相关的区域。
在本发明中，GPI锚定蛋白一般是指细胞表层定位蛋白质，该蛋白质能够通过存在于细胞膜上的GPI锚而结合在细胞膜上。GPI锚定蛋白在N末端具有分泌信号序列，并在C末端具有GPI锚定区域。例如，GPI锚定蛋白，可以举出酵母的絮凝蛋白(α-凝集素、a-凝集素、FLO蛋白质)、碱性磷酸酶等，但是并不限于此。作为特别适用于本发明的絮凝蛋白，可以举出FLO蛋白质，如FLO1、FLO2、FLO4、FLO5、FLO9、FLO10和FLO11。
在本发明中，GPI锚定区域是指细胞壁锚定区域以及GPI锚附着识别信号序列。通常位于细胞表层定位蛋白质的C末端或其附近。例如，酵母的α-凝集素中，是C末端起320个氨基酸的序列。
GPI锚定区域中GPI锚附着识别信号序列是识别细胞膜上的GPI锚的部分。将C末端的GPI锚附着识别信号序列切断后，GPI锚与新突出的C末端结合。接着，结合的GPI锚的根部通过PI-PLC切断，由此蛋白质与细胞膜分离并嵌入细胞壁中。其中，存在于细胞壁锚定区域的糖链与细胞壁中的糖链结合，由此将蛋白质固定在细胞表层。
本发明的细胞表层结合性蛋白质包括(1)在糖链结合蛋白质区域的N末端侧与其它蛋白质结合的融合蛋白，(2)在糖链结合蛋白质区域的C末端侧与其它蛋白质结合的融合蛋白，以及(3)在糖链结合蛋白质区域的N末端侧和C末端侧这两处结合相同或不同蛋白质的融合蛋白。其它蛋白质可以直接结合在糖链结合蛋白质区域，也可以通过接头结合。另外，最靠近N末端侧结合有分泌信号序列。
构成本发明的细胞表层结合性蛋白质的其它蛋白质没有特别的限定，优选本来并非定位于细胞表层的蛋白质，而是以固定在细胞表层为目的而设置的蛋白质。例如，可以举出分泌性蛋白质、抗体等。作为分泌性蛋白质，可以举出脂肪酶、淀粉酶类(葡糖淀粉酶、α-淀粉酶等)、纤维素酶类、荧光蛋白、A蛋白及其衍生物等。
这种酶可以根据其特性决定在N末端侧融合还是在C末端侧融合。特别是在C末端侧具有活性中心的蛋白质，如脂肪酶，优选结合在糖链结合蛋白质区域的C末端侧。该蛋白质可直接结合在糖链结合蛋白质区域的C末端侧，也可以通过GPI锚定区域的一部分结合。
在N末端侧进行融合时，蛋白质优选为在分泌信号序列与糖链结合蛋白质区域之间融合。另外，例如，在糖链结合蛋白质区域的C末端侧还可能含有一部分GPI锚定区域。但是，这时不含有GPI锚附着识别信号，因此表达的融合蛋白并不是通过GPI锚固定在细胞表层。
分泌信号序列是一种氨基酸序列，它一般结合在分泌到细胞外(包括胞质)的蛋白质(分泌性蛋白质)的N末端，且含有大量强疏水性氨基酸，通常，在分泌性蛋白质由细胞内通过细胞膜分泌到细胞外时被除去。
在本发明中，可使用任何分泌信号序列，只要是能够将表达的融合蛋白导入细胞膜的分泌信号序列即可，而不用考虑来源。例如，作为分泌信号序列，适于使用葡萄糖淀粉酶的分泌信号序列、酵母的α-或a-凝集素信号序列、脂肪酶的分泌信号序列等。只要不影响细胞表层结合性蛋白质融合的其它蛋白质的活性，分泌信号序列及部分或全部前序列也可以残留在N末端。
在本说明书中，脂肪酶是指具有能够使脂肪酸从油脂游离的活性的蛋白质(酶)。其中，油脂是指脂肪酸结合在甘油上得到的物质。只要具有这种活性，脂肪酶的来源并没有特别的限定，一般可以使用来源于微生物、植物和动物(例如猪胰脏)的脂肪酶。另外，脂肪酶可以是1，3-特异性的脂肪酶，也可以是非特异性脂肪酶。通过例如使脂肪酶在絮凝性酵母的细胞表层表达，可以由废油等制造生物柴油燃料(biodiesel fuel)。
在本说明书中，淀粉酶类是指使淀粉水解的酶。代表性地可以举出葡糖淀粉酶和α-淀粉酶，此外还可以举出β-淀粉酶、异淀粉酶等。
在本说明书中，葡糖淀粉酶是指将葡萄糖单元由淀粉的非还原末端切断的外切型水解酶。只要具有这种活性，其来源并没有限定，可以使用来源于根霉菌属(Rhizopus)和曲霉菌属(Aspergillus)等霉菌的葡糖淀粉酶。例如，如植田等人(Appl.Environ.Microbiol.631362-1366(1997))所述，优选使用来源于米根霉(Rhizopus oryzae)的葡糖淀粉酶。例如通过使葡糖淀粉酶在酵母表层进行表达，能够在淀粉存在下有效制造乙醇。
在本发明中，α-淀粉酶是指仅水解淀粉的α1，4-糖苷键的内切型酶。只要具有这种活性，其来源并没有限定，可以使用例如来源于动物(唾液、胰脏等)、植物(麦芽等)以及微生物的α-淀粉酶。例如通过使α-淀粉酶在酵母表层进行表达，能够在淀粉存在下有效制造乙醇。如果与上述葡糖淀粉酶组合进行表达，则能够有效进行酒精发酵。
纤维素酶类一般是指内切β1，4-葡聚糖酶，在本发明中是指内切β1，4-葡聚糖酶以及将产生的β1，4-糖苷键切断而由纤维素产生葡萄糖的一组酶(例如纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase)、β-糖苷酶)，称为纤维素酶。作为纤维素酶类，可以举出内切β1，4-葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-糖苷酶、羧甲基纤维素酶等。只要具有这种活性，其来源并没有限定，例如优选使用来源于微生物的酶。
通过使纤维素酶类单独或组合在酵母表层进行表达，能够由木质材料，例如纸、纸浆或这些物质的废弃材料，有效进行酒精发酵。
在本发明中，使蛋白质在细胞表层进行表达的细胞只要是细菌、真菌、植物细胞等具有细胞壁的细胞，就没有特别的限定。优选使用酵母。
本发明中所用的细胞是导入DNA进行转化、以便在细胞表层提供所需蛋白质的细胞。导入的DNA至少包括分泌信号序列、糖链结合蛋白质区域以及编码所需蛋白质的序列。而且，也可以含有编码所需的另1种蛋白质的序列。
包括上述各种序列的DNA的合成以及结合可以按照本领域技术人员通常可以采用的技术进行。
上述DNA优选是质粒的形态。基于使DNA的获得更为简便的观点，优选为与大肠杆菌形成的穿梭载体。该DNA的原料更优选具有例如酵母的2μm质粒的复制起点(Ori)和ColE1的复制起点，而且还具有酵母选择标记(例如耐药基因、TRP、LEU2等)以及大肠杆菌的选择标记(耐药基因等)。另外，为了使蛋白质的结构基因进行表达，优选还含有调节该基因表达的操纵基因、启动子、终止子、增强子等所谓的调节序列。例如可以举出GAPDH(甘油醛3’-磷酸脱氢酶)启动子以及GAPDH终止子。作为这种原料的质粒的实例，可以举出含有GAPDH(甘油醛3’-磷酸脱氢酶)启动子序列以及GAPDH终止子序列的质粒pYGA2270或pYE22m，或者含有UPR-ICL(异柠檬酸脂肪酶上游区域)序列以及Term-ICL(异柠檬酸脂肪酶的终止子区域)序列的质粒pWI3等。
如果在质粒pYGA2270或pYE22m的GAPDH启动子序列和GAPDH终止子序列之间，或者质粒pWI3的UPR-ICL序列和Term-ICL序列之间，插入编码所需蛋白质的DNA，可以制造用于导入酵母的质粒。在本发明中，优选使用多拷贝型的质粒pWIFS或pWIFL，制造例如pWIFSpmROL或pWIFLpmROL。
作为宿主的酵母，可以使用任何酵母，从反应后分离简单的方面、或者为了简单固定能够进行连续反应的方面考虑，优选絮凝性酵母。或者，作为糖链结合蛋白质区域，使用絮凝功能区域时，能够对任何酵母赋予强絮凝性。
作为絮凝性酵母，可以举出糖化糖酵母(Saccharomyces diastaticus)ATCC60715、糖化糖酵母ATCC60712、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)IFO1953、酿酒酵母CG1945、酿酒酵母HF7C等。另外，也可以构筑新的絮凝性酵母。例如，如下述实施例1所示，按照M.D.Rose等人(Methods in Yeast Genetics，1990，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)的方法，由絮凝性酵母ATCC60712和非絮凝性酵母W303-1B接合而成的二倍体，能够得到絮凝性酵母YF207以及与其具有相同性质的酵母。本发明人等获得的絮凝性酵母YF207株，质粒的稳定性优良，而且发酵能力非常强。因此，为了使所需的蛋白质，例如α-淀粉酶和葡糖淀粉酶单独或两者在细胞表层进行表达，使用重组的絮凝性酵母YF207株时，由淀粉进行酒精发酵的效率变得非常高。
本发明的方法中使用的细胞可以通过将上述DNA导入细胞中得到。DNA的导入是指将DNA导入细胞中使之表达。DNA的导入方法有转化、转导、转染、共转染、电穿孔等方法，具体有使用醋酸锂的方法、原生质体法等。
导入的DNA可以是上述质粒的形态，也可以插入宿主的基因中，或与宿主的基因进行同宗重组并入染色体中。
导入了DNA的细胞可以通过用选择标记(例如TRP)选择，测定表达的蛋白质活性进行选择。蛋白质固定在细胞表层可以通过使用抗蛋白质抗体与FITC标记抗IgG抗体的免疫抗体法确认。
本发明中使用的细胞也可以固定在载体上。例如为酵母时，如果进行了固定，就便于在反复分次发酵或连续发酵中使用。
在本说明书中，载体是指能够固定细胞的物质，优选对水或某种特定溶剂不溶的物质。作为本发明中能够使用的载体材料，优选聚乙烯醇、泡沫聚氨酯、泡沫聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇缩甲醛树脂多孔体、泡沫硅氧烷、纤维素多孔体等发泡体或树脂。如果考虑繁殖以及活性低的细胞或死细胞的脱落等，优选多孔性的载体。多孔体的开口部大小根据细胞有所不同，优选细胞能够充分进入，且能够繁殖的大小。优选为50μm～1000μm，但是对此并没有限定。
另外，不问载体的形状如何。如果考虑载体的强度、培养效率等，优选为球状或立方体状，关于其大小，在球状的场合，优选直径为2mm～50mm，在立方体的场合，优选边长为2mm～50mm。
在本说明书中，细胞的固定化是指细胞处于非游离的状态，例如细胞结合或附着在载体上或者嵌入载体内部的状态等。细胞的固定可以适用例如载体结合法、交联法、掺入法(包括法)等本领域技术人员通常采用的方法。其中，对于絮凝性酵母的固定，载体结合法最为合适。载体结合法包括使之吸附在离子交换性树脂上的化学吸附法或者物理吸附法。
例如，本发明中可以使用的絮凝性酵母具有尽管固定在载体上仍然能够繁殖、而且如果活性降低就自然脱落的性质。因此，结合在载体上的酵母具有活菌数能够几乎保持一定、活性高的特征。如果考虑这一特征，对载体的结合最优选物理吸附。物理吸附不需要特别的手段。通过将絮凝性或粘附性的细胞与上述多孔性的载体简单混合进行培养，就可使细胞进入多孔体的开口部而附着在载体上。
在本说明书中，絮凝性是指浮游或分散在液体中的酵母等细胞聚集成块(聚集体)的性质，粘附性是指细胞之间粘附或结合形成聚集体的性质。
在本说明书中，活性降低是指虽然细胞本身没有死亡但是细胞整体的活性减弱的状态，或者例如絮凝所涉及的活性降低、或在对涉及絮凝的酶编码的DNA水平上活性减弱等不能絮凝的状态。
另外，在本发明中，絮凝性或粘附性酵母也可以是通过导入与絮凝或粘附有关的基因而得到絮凝性或粘附性的酵母。
絮凝或粘附的相关基因是指与絮凝或粘附有关的物质，例如可以举出对酵母的壳多糖、外源凝血素等进行编码的结构基因，作为絮凝性的相关基因，可以举出FLO1〔J.Watari等，Agric.Biol.Chem.，551547(1991)；G.G.Stewart等，Can.J.Microbiol.，23441(1977)；I.Russell等，J.Inst.Brew.，86120(1980)；C.W.Lewis等，J.Inst.Brew.，82158(1976)〕、FLO5〔I.Russell等，J.Inst.Brew.，8595(1979)〕、FLO8〔I.Yamashita等，Agric.Biol.Chem.，48131(1984)〕等基因。
这些絮凝或粘附相关基因整合到上述原料的质粒中，与为了在细胞表层提供所需蛋白质而设计的DNA一起导入细胞中。
这样得到的固定后的细胞也能够以附着在载体上的状态、游离状态进行培养，或者填充到柱等中，用作生物反应器。即使在连续或分次(批)反复进行培养和反应时，由于活性降低或死细胞脱落，作为细胞的活性也不会降低，而能够有效利用。
如上所述得到的本发明的细胞，可以用于使在细胞表层表达的蛋白质与基质接触而与该基质结合，或者使该基质转变成其它物质。例如，当蛋白质为酶时，该细胞也可以作为包含表达酶的细胞的酶剂提供。具体而言，作为本发明的酶剂，可以举出含有本发明的细胞以及能够维持细胞的培养基的悬浊液，和将本发明的细胞冷冻保存或冷冻干燥以及低温干燥的物质。
而且，本发明的细胞也可以通过将各种随机引入变异的蛋白质表现在其它细胞表层而用作组合文库。也能够由这种文库，迅速且简便地选择具有符合目的的最适性质的克隆体。这里所说的组合文库是指在基因水平随机引入变异，人为扩大蛋白质的多样性而得到的各种变异体的集合。
以下，结合实施例说明本发明，但是本发明并不受这些实施例的限定。
(实施例1依次具有FLO1的5’区域以及脂肪酶原结构基因的DNA的制作)AFLO1的5’区域(信号序列以及絮凝功能区域)基因的获得如下所述获得FLO1的基因。首先，由酿酒酵母(S.cerevisiae)ATCC 60715提取染色体DNA。接着，将其作为模板，使用序列号1和序列号2记载的核苷酸序列作为引物，进行PCR放大，用BamHI和BglII消化，得到约3300bp长度的BamHI-BglII片段(BamHI-BglIIFLO1 3300bp片段)。可认为该3300bp片段具有FLO1的5’侧的序列(分泌信号序列以及FLO1絮凝功能区域)。
B脂肪酶基因的获得如下所述，获得米根霉的脂肪酶基因。简单来说，首先由R.oryzae(米根霉)IFO4697提取染色体DNA。接着，以其作为模板，使用序列号3和序列号4记载的核苷酸序列作为引物，进行PCR放大，用BamHI和SalI消化，得到约1100bp长度的BamHI-SalI片段(BamHI-SalI脂肪酶片段)。该脂肪酶片段具有脂肪酶的前序列和成熟蛋白质序列，与Beer等的报告(Biochim Biophys Acta，1399173-180 1998)中记载的序列几乎一致。
C依次具有FLO的5’区域以及脂肪酶原结构基因的质粒的制作具有目的DNA的质粒可以通过将上述由A得到的FLO1的5’区域基因以及由上述B得到的脂肪酶原基因连接得到。为了制作FLO1衍生物与脂肪酶的融合蛋白，进行以下操作。制作的示意图如图1所示。
首先，用BglII将多拷贝型质粒pWI3消化，脱磷酸化后，插入上述由A得到的BamHI-BglII FLO1 3300bp片段，得到质粒pWIFS。接着，用BglII和XhoI将该质粒pWIFS消化，插入由上述B得到的BamHI-SalI脂肪酶片段，得到pWIFSpmROL。将由插入该质粒pWIFSpmROL中的基因表达的蛋白质命名为短(short)型FLO1脂肪酶。
(实施例2依次具有包含细胞壁锚定区域的FLO1的5’区域以及脂肪酶原结构基因的DNA的制作)与上述实施例1同样，提取FLO1的染色体DNA。以其作为模板，使用序列号1和序列号5记载的核苷酸序列作为引物，进行PCR放大，用BamHI和BglII消化，得到约4500bp长度的BamHI-BglII片段(BamHI-BglII FLO1 4500bp片段)。可认为该4500bp片段具有FLO1的5’侧的序列(分泌信号序列和FLO1絮凝功能区域)。
使用得到的BamHI-BglII FLO1 4500bp片段，进行与实施例1同样的操作。即，不是将实施例1的BamHI-BglII FLO1 3300bp片段而是将该4500bp片段插入pWI3中，得到质粒pWIFL。接着，与实施例1同样将上述BamHI-SalI脂肪酶片段插入该质粒pWIFL中，得到pWIFLpmROL。将由插入该质粒pWIFLpmROL中的基因表达的蛋白质命名为长(long)型FLO1脂肪酶。
(实施例3细胞表层具有脂肪酶的酵母的制作)使用絮凝性酵母中的糖化糖酵母ATCC60712(MATa leu2-3，112his2 lys2 stal FLO8)以及非絮凝性酵母W303-1B(MATαura3-52 trp1Δ2 leu2-3，112 his3-11 ade2-1 can1-100)，按照M.D.Rose等人(如上所述)的方法，得到色氨酸营养需求型的新絮凝性菌株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YF207(MATa ura3-52 trp1Δ2 his ade2-1can1-100 stal FLO8)。
按照使用Yeast Maker(Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA)的醋酸锂法，将由上述实施例1得到的质粒pWIFSpmROL以及实施例2得到的质粒pWIFLpmROL导入非絮凝性酵母酿酒酵母(S.cerevisiae)MT8-1(MATa ade his3 leu2 trp1 ura3)(Tajima等，Yeast，167-77，1985)以及絮凝性酵母YF207中。使用不含有L-色氨酸且补充了适当氨基酸和碱基的SD-W琼脂选择培养基(6.7％Yeast nitrogen base w/o aminoacids(Difco Laboratories制)，2％葡萄糖，2％琼脂粉末)对其进行培养。选择繁殖的酵母，将表达短(short)型FLO1脂肪酶的酵母分别命名为MT8-1-short和YF207-short，并将表达长(long)型FLO1脂肪酶的酵母分别命名为MT8-1-long和YF207-long。
用SDC液体培养基培养得到的酵母，离心分离，分成培养基和菌体，分别测定脂肪酶活性。作为对照，使用分别在酿酒酵母(S.cerevisiae)MT8-1中导入了质粒pWI3的酵母。结果，关于对照，确认培养基和菌体均没有脂肪酶活性。另外，在转化体MT8-1-short、YF207-short、MT8-1-long和YF207-long的培养上清液中几乎见不到脂肪酶活性，但是这些酵母菌体本身均具有脂肪酶活性(图2)。另外，脂肪酶活性的测定使用脂肪酶试剂盒S(大日本制药制)进行。
(实施例4细胞表层具有脂肪酶的酵母的功能确认)对于实施例3得到的表达短(short)型FLO1脂肪酶的酵母MT8-1-short和YF207-short，以及表达长(long)型FLO1脂肪酶的酵母MT8-1-long和YF207-long，分别通过波长600nm处的吸光度测定菌体的繁殖。可以得知任何一种酵母均在培养基中与对照相同程度地顺利繁殖(未显示数据)。
接着，测定表达短(short)型FLO1脂肪酶的酵母MT8-1-short和表达长(long)型FLO1脂肪酶的酵母MT8-1-long的甲醇分解反应活性。在30ml小瓶中，向由培养基100ml收集的各酵母中加入反应液(0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)2ml，大豆油9.65g，甲醇0.35g)，在35℃下每分钟振荡150次，按照Kaieda等的方法(J.Biosci.Bioeng.，88627-631，1999)测定甲酯的产量。其结果如图3所示。
任何一种酵母与以前的酵母(α-凝集素的N末端侧结合脂肪酶在细胞表层进行表达的酵母(特开平11-290078号公报))相比，均产生了更多的甲酯。特别是如图3所示，表达短(short)型FLO1脂肪酶的菌株MT8-1-short(○)以及表达长(long)型FLO1脂肪酶的酵母MT8-1-long(△)，甲酯的生产活性非常高。
另外，对于这些菌株，按照Smit等的方法(Smit等，Appl.Environ.Microbiol.，583709-3714(1992))测定其絮凝能力。结果，对于絮凝型的菌株，与导入质粒前相比，表达长(long)型FLO1脂肪酶的菌株显示与转化前同样强的絮凝能力。但是，表达短(short)型FLO1脂肪酶的菌株，絮凝能力变弱。可认为这是由于短(short)型FLO1脂肪酶没有细胞壁锚定区域，而是絮凝区域埋入细胞壁中，因此不能充分发挥絮凝功能。
(实施例5随机变异脂肪酶的组合文库的构建及其利用)对于对由上述实施例1B得到的米根霉的脂肪酶的前序列以及成熟蛋白质序列(366个氨基酸的脂肪酶原(ProROL))进行编码的1098bp的基因，采用Error-prone PCR法，随机引入变异，使之包含约3个碱基的变异(每1分子ProROL引入1个氨基酸的变异)，得到各种引入了变异的脂肪酶基因。与上述实施例1C时同样，将得到的引入了变异的脂肪酶基因分别插入具有FLO1的5’区域的质粒pWIFS中，得到pWIFSProROL文库。将这些质粒与实施例3同样地分别导入酵母YF207株，制作由在细胞表层表现具有各种变异的脂肪酶的713株构成的酵母组合文库。
如下所述，由得到的酵母组合文库选择具有酯交换活性的克隆体。将713株的文库在SD板(0.67％Yeast nitrogen base w/o amino acids，0.5％葡萄糖和2％琼脂粉末)上培养3天。接着，在该板上叠加高压灭菌后保持在45℃下的含有荧光色素的软琼脂SD培养基(SD培养基+2.5％大豆油、0.001％若丹明B、50％甲醇和0.8％琼脂粉末)。1天后，对板进行紫外线照射，选择菌体周围显出橙色荧光的克隆体，得到在甲醇分解反应基质，即甲醇存在下生存的克隆体(80克隆体)。
这些克隆体的脂肪酶活性，与上述实施例4同样，利用甲醇分解反应测定酯交换活性的初速度，并利用脂肪酶试剂盒S(大日本制药制)测定水解活性而测得。其中，与表达未引入变异的脂肪酶的菌株(野生型菌株)相比，可以见到酯交换活性以及水解活性改变的菌株，其结果如表1所示。
表1
可观察到S334T株具有比野生型菌株稍高的酯交换活性。另外，由酯交换活性与水解活性的比值可以得知，P2S/F293Y株显示出独特的水解反应高催化能力，而K326R株则显示出酯交换反应高催化能力。由这些结果可以得知，能够在酵母细胞表层制作组合文库，筛选符合目的的变异体。
产业实用性本发明的细胞表层结合性蛋白质能够在细胞表层表达所需的蛋白质。该所需的蛋白质能够根据活性中心的位置，使其相反侧与糖链结合蛋白质区域融合，由此进行表达，使之显示出充分的活性。因此，特别是在细胞表层表达C末端侧具有活性的蛋白质时，非常有用。另外，能在糖链结合蛋白质区域的两端结合相同或不同的蛋白质，从而可以有效地表达更多的蛋白质。可利用这种细胞表层的蛋白质的有效表达，在细胞表层上制作改性蛋白质的组合文库，并容易进行筛选。
序列表<110>关西化学机械制作株式会社<120>细胞表层结合性蛋白质及其应用<130>P2-01K02245<160>5<210>1<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>1acatggatcc atgacaatgc ctcatcgcta tatgtttttg 40<210>2<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>2gatagatctg gtgatttgtc ctgaagatga tgatgacaaa 40<210>3<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>3ctccggatcc atggttcctg tttctggtaa atctggatct 40<210>4<211>25
<212>DNA<213>人工序列<400>4cgatgtcgac ttacaaacag cttcc 25<210>5<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>5aatgcctcga gttaaataat tgccagcaat aaggacgcaa tgaag 4权利要求
1.一种细胞表层结合性蛋白质，其特征在于，具有糖链结合蛋白质区域，且所述糖链结合蛋白质区域的至少N末端侧或C末端侧结合有其它蛋白质。
2.如权利要求1所述的细胞表层结合性蛋白质，其特征在于，所述糖链结合蛋白质区域是至少含有GPI锚定蛋白的絮凝功能区域部分。
3.如权利要求2所述的细胞表层结合性蛋白质，其特征在于，所述GPI锚定蛋白是絮凝蛋白。
4.如权利要求3所述的细胞表层结合性蛋白质，其特征在于，所述絮凝蛋白是选自FLO1、FLO2、FLO4、FLO5、FLO9、FLO10和FLO11的蛋白质。
5.如权利要求1～4任一项所述的细胞表层结合性蛋白质，其特征在于，所述其它蛋白质结合在所述糖链结合蛋白质区域的N末端侧。
6.如权利要求1～4任一项所述的细胞表层结合性蛋白质，其特征在于，所述其它蛋白质结合在所述糖链结合蛋白质区域的C末端侧。
7.如权利要求1～4任一项所述的细胞表层结合性蛋白质，其特征在于，所述糖链结合蛋白质区域的N末端侧和C末端侧结合有相同或不同的其它蛋白质。
8.对权利要求1～7任一项所述的细胞表层结合性蛋白质进行编码的DNA。
9.含有权利要求8所述的DNA的质粒。
10.引入权利要求8所述的DNA或者权利要求9所述的质粒，在细胞表层表达上述其它蛋白质的细胞。
11.如权利要求10所述的细胞，其特征在于，所述细胞为酵母。
12.如权利要求10或11所述的细胞，其特征在于，所述其它蛋白质为酶。
13.如权利要求10～12任一项所述的细胞的使用方法，其特征在于，使所述其它蛋白质与基质接触而与该基质结合，或者将所述基质转变成其它物质。
14.含有权利要求12所述细胞的酶剂。
全文摘要
为表达糖链结合蛋白质区域与所需蛋白质的融合蛋白质，构筑质粒，引入细胞，而在细胞表层表达该蛋白质。特别适用于在细胞表层表达C末端侧具有活性的蛋白质。
文档编号C12N1/15GK1708510SQ0280830
公开日2005年12月14日 申请日期2002年3月22日 优先权日2001年4月19日
发明者福田秀树, 近藤昭彦, 松本健史, 野田秀夫 申请人:关西化学机械制作株式会社
技术领域：
本发明涉及一种细胞表层结合性蛋白质，具有糖链结合蛋白质区域，且该糖链结合蛋白质区域至少N末端侧或C末端侧结合有其它蛋白质。
背景技术：
细胞表层定位蛋白质是存在并固定于细胞表层的蛋白质。例如α-或a-凝集素，它是一种酵母的絮凝蛋白。这种蛋白质具有分泌信号序列，在这一点上与分泌蛋白相同，但是这种蛋白质通过GPI锚固定在细胞膜上进行输送，在这一点上又与分泌蛋白不同。一般情况下，细胞表层定位蛋白质在C末端侧具有GPI锚定区域。细胞表层定位蛋白质在通过细胞膜时，该区域的一部分(即，GPI锚附着识别信号序列)被选择性切断，新突出的C末端部分与GPI锚结合在细胞膜上，从而固定在细胞膜上。接着，通过磷脂酰肌醇依赖性磷脂酶C(PI-PLC)将GPI锚的根部切断。然后，由细胞膜使断开的蛋白质嵌入细胞壁中，固定在细胞表层，而定位于细胞表层。其中，GPI锚是指被称为葡糖基磷脂酰肌醇(GPI)的以乙醇胺磷酸-6甘露糖α1-2甘露糖α1-6甘露糖α1-4葡糖胺α1-6肌醇磷脂质为基本结构的糖脂。
GPI锚定区域通常位于细胞表层定位蛋白质的C末端或其附近。例如，在对α-凝集素的C末端起320个氨基酸序列进行编码的序列中，除GPI锚附着识别信号序列以外，还具有4个糖链结合部位。GPI锚用PI-PLC切断后，通过这些糖链与构成细胞壁的多糖类形成共价键，使得α-凝集素的C末端序列部分与细胞壁结合，而将α-凝集素保留在细胞表层。
利用这种GPI锚定区域，本发明人成功地在细胞表层表达了脂肪酶(特开平11-290078号公报)。即，在对GPI锚定区域进行编码的DNA的上游设置脂肪酶的结构基因，再在上游设置分泌信号序列，使脂肪酶在细胞表层表达，其N末端侧位于细胞的外侧。
发明内容
这样表达的蛋白质只要在N末端侧具有活性中心，就能够在细胞表层显示充分的活性。但是，当活性中心位于C末端侧时，活性中心距细胞表层过近，以致有可能引起立体位阻，而不能显示充分的活性。
因此，本发明人研究了各种使蛋白质在细胞表层进行表达的方法，结果出乎意料地发现，即使丧失了以前认为必须的GPI锚定区域的功能时，GPI锚定蛋白也能保持在细胞表层，从而完成了本发明。也就是说，只要至少含有GPI锚定蛋白的絮凝功能区域，通过构筑可使所需蛋白质在其N末端侧或C末端侧任意一方，或者既在N末端侧又在C末端侧表达的质粒，就能够使所需的蛋白质在细胞表层表达。
本发明提供一种细胞表层结合性蛋白质，它具有糖链结合蛋白质区域，该糖链结合蛋白质区域至少N末端侧或C末端侧结合有其它蛋白质。
在优选实施方式中，上述糖链结合蛋白质区域是至少含有GPI锚定蛋白的絮凝功能区域部分。
在优选实施方式中，上述GPI锚定蛋白是絮凝蛋白。
在优选实施方式中，所述絮凝蛋白是选自FLO1、FLO2、FLO4、FLO5、FLO9、FLO10和FLO11的蛋白质。
在另一优选实施方式中，上述其它蛋白质结合在上述糖链结合蛋白质区域的N末端侧。
在更优选实施方式中，上述其它蛋白质结合在上述糖链结合蛋白质区域的C末端侧。
在进一步的优选实施方式中，上述其它蛋白质为脂肪酶。
在优选实施方式中，上述其它蛋白质为抗体。
在优选实施方式中，上述糖链结合蛋白质区域的N末端侧和C末端侧结合有相同或不同的其它蛋白质。
本发明还提供对上述细胞表层结合性蛋白质进行编码的DNA。
本发明还提供含有上述DNA的质粒。
本发明还提供引入上述DNA或者上述质粒，在细胞表层表达上述其它蛋白质的细胞。
在优选实施方式中，上述细胞为酵母。
在优选实施方式中，上述其它蛋白质为酶。
本发明还提供上述细胞的使用方法，使上述其它蛋白质与基质接触，以便与该基质结合，或者将该基质转变成其它物质。
本发明还提供含有上述细胞的酶剂。
图1为制作质粒pWIFSpmROL的示意图。
图2为各种细胞表层具有脂肪酶的酵母的繁殖以及脂肪酶活性示意图。
图3是为表达短型FLO1脂肪酶的酵母MT8-1-short和表达长型FLO1脂肪酶的酵母MT8-1-long的甲醇分解反应活性示意图。
具体实施例方式
在本发明中，细胞表层结合性蛋白质是指至少含有糖链结合蛋白质区域以及其它蛋白质的融合蛋白，该蛋白质通过糖链结合蛋白质区域固定在细胞表层。
在本发明中，糖链结合蛋白质区域是指具有多个糖链，且该糖链能够通过与细胞壁中的糖链的相互作用或者相互缠绕而留在细胞表层的区域。例如，外源凝血素、类外源凝血素蛋白质等的糖链结合部位等。其中有代表性的可以列举出GPI锚定蛋白的絮凝功能区域。GPI锚定蛋白的絮凝功能区域是指位于GPI锚定区域N末端侧，具有多个糖链，且被认为是与絮凝相关的区域。
在本发明中，GPI锚定蛋白一般是指细胞表层定位蛋白质，该蛋白质能够通过存在于细胞膜上的GPI锚而结合在细胞膜上。GPI锚定蛋白在N末端具有分泌信号序列，并在C末端具有GPI锚定区域。例如，GPI锚定蛋白，可以举出酵母的絮凝蛋白(α-凝集素、a-凝集素、FLO蛋白质)、碱性磷酸酶等，但是并不限于此。作为特别适用于本发明的絮凝蛋白，可以举出FLO蛋白质，如FLO1、FLO2、FLO4、FLO5、FLO9、FLO10和FLO11。
在本发明中，GPI锚定区域是指细胞壁锚定区域以及GPI锚附着识别信号序列。通常位于细胞表层定位蛋白质的C末端或其附近。例如，酵母的α-凝集素中，是C末端起320个氨基酸的序列。
GPI锚定区域中GPI锚附着识别信号序列是识别细胞膜上的GPI锚的部分。将C末端的GPI锚附着识别信号序列切断后，GPI锚与新突出的C末端结合。接着，结合的GPI锚的根部通过PI-PLC切断，由此蛋白质与细胞膜分离并嵌入细胞壁中。其中，存在于细胞壁锚定区域的糖链与细胞壁中的糖链结合，由此将蛋白质固定在细胞表层。
本发明的细胞表层结合性蛋白质包括(1)在糖链结合蛋白质区域的N末端侧与其它蛋白质结合的融合蛋白，(2)在糖链结合蛋白质区域的C末端侧与其它蛋白质结合的融合蛋白，以及(3)在糖链结合蛋白质区域的N末端侧和C末端侧这两处结合相同或不同蛋白质的融合蛋白。其它蛋白质可以直接结合在糖链结合蛋白质区域，也可以通过接头结合。另外，最靠近N末端侧结合有分泌信号序列。
构成本发明的细胞表层结合性蛋白质的其它蛋白质没有特别的限定，优选本来并非定位于细胞表层的蛋白质，而是以固定在细胞表层为目的而设置的蛋白质。例如，可以举出分泌性蛋白质、抗体等。作为分泌性蛋白质，可以举出脂肪酶、淀粉酶类(葡糖淀粉酶、α-淀粉酶等)、纤维素酶类、荧光蛋白、A蛋白及其衍生物等。
这种酶可以根据其特性决定在N末端侧融合还是在C末端侧融合。特别是在C末端侧具有活性中心的蛋白质，如脂肪酶，优选结合在糖链结合蛋白质区域的C末端侧。该蛋白质可直接结合在糖链结合蛋白质区域的C末端侧，也可以通过GPI锚定区域的一部分结合。
在N末端侧进行融合时，蛋白质优选为在分泌信号序列与糖链结合蛋白质区域之间融合。另外，例如，在糖链结合蛋白质区域的C末端侧还可能含有一部分GPI锚定区域。但是，这时不含有GPI锚附着识别信号，因此表达的融合蛋白并不是通过GPI锚固定在细胞表层。
分泌信号序列是一种氨基酸序列，它一般结合在分泌到细胞外(包括胞质)的蛋白质(分泌性蛋白质)的N末端，且含有大量强疏水性氨基酸，通常，在分泌性蛋白质由细胞内通过细胞膜分泌到细胞外时被除去。
在本发明中，可使用任何分泌信号序列，只要是能够将表达的融合蛋白导入细胞膜的分泌信号序列即可，而不用考虑来源。例如，作为分泌信号序列，适于使用葡萄糖淀粉酶的分泌信号序列、酵母的α-或a-凝集素信号序列、脂肪酶的分泌信号序列等。只要不影响细胞表层结合性蛋白质融合的其它蛋白质的活性，分泌信号序列及部分或全部前序列也可以残留在N末端。
在本说明书中，脂肪酶是指具有能够使脂肪酸从油脂游离的活性的蛋白质(酶)。其中，油脂是指脂肪酸结合在甘油上得到的物质。只要具有这种活性，脂肪酶的来源并没有特别的限定，一般可以使用来源于微生物、植物和动物(例如猪胰脏)的脂肪酶。另外，脂肪酶可以是1，3-特异性的脂肪酶，也可以是非特异性脂肪酶。通过例如使脂肪酶在絮凝性酵母的细胞表层表达，可以由废油等制造生物柴油燃料(biodiesel fuel)。
在本说明书中，淀粉酶类是指使淀粉水解的酶。代表性地可以举出葡糖淀粉酶和α-淀粉酶，此外还可以举出β-淀粉酶、异淀粉酶等。
在本说明书中，葡糖淀粉酶是指将葡萄糖单元由淀粉的非还原末端切断的外切型水解酶。只要具有这种活性，其来源并没有限定，可以使用来源于根霉菌属(Rhizopus)和曲霉菌属(Aspergillus)等霉菌的葡糖淀粉酶。例如，如植田等人(Appl.Environ.Microbiol.631362-1366(1997))所述，优选使用来源于米根霉(Rhizopus oryzae)的葡糖淀粉酶。例如通过使葡糖淀粉酶在酵母表层进行表达，能够在淀粉存在下有效制造乙醇。
在本发明中，α-淀粉酶是指仅水解淀粉的α1，4-糖苷键的内切型酶。只要具有这种活性，其来源并没有限定，可以使用例如来源于动物(唾液、胰脏等)、植物(麦芽等)以及微生物的α-淀粉酶。例如通过使α-淀粉酶在酵母表层进行表达，能够在淀粉存在下有效制造乙醇。如果与上述葡糖淀粉酶组合进行表达，则能够有效进行酒精发酵。
纤维素酶类一般是指内切β1，4-葡聚糖酶，在本发明中是指内切β1，4-葡聚糖酶以及将产生的β1，4-糖苷键切断而由纤维素产生葡萄糖的一组酶(例如纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase)、β-糖苷酶)，称为纤维素酶。作为纤维素酶类，可以举出内切β1，4-葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-糖苷酶、羧甲基纤维素酶等。只要具有这种活性，其来源并没有限定，例如优选使用来源于微生物的酶。
通过使纤维素酶类单独或组合在酵母表层进行表达，能够由木质材料，例如纸、纸浆或这些物质的废弃材料，有效进行酒精发酵。
在本发明中，使蛋白质在细胞表层进行表达的细胞只要是细菌、真菌、植物细胞等具有细胞壁的细胞，就没有特别的限定。优选使用酵母。
本发明中所用的细胞是导入DNA进行转化、以便在细胞表层提供所需蛋白质的细胞。导入的DNA至少包括分泌信号序列、糖链结合蛋白质区域以及编码所需蛋白质的序列。而且，也可以含有编码所需的另1种蛋白质的序列。
包括上述各种序列的DNA的合成以及结合可以按照本领域技术人员通常可以采用的技术进行。
上述DNA优选是质粒的形态。基于使DNA的获得更为简便的观点，优选为与大肠杆菌形成的穿梭载体。该DNA的原料更优选具有例如酵母的2μm质粒的复制起点(Ori)和ColE1的复制起点，而且还具有酵母选择标记(例如耐药基因、TRP、LEU2等)以及大肠杆菌的选择标记(耐药基因等)。另外，为了使蛋白质的结构基因进行表达，优选还含有调节该基因表达的操纵基因、启动子、终止子、增强子等所谓的调节序列。例如可以举出GAPDH(甘油醛3’-磷酸脱氢酶)启动子以及GAPDH终止子。作为这种原料的质粒的实例，可以举出含有GAPDH(甘油醛3’-磷酸脱氢酶)启动子序列以及GAPDH终止子序列的质粒pYGA2270或pYE22m，或者含有UPR-ICL(异柠檬酸脂肪酶上游区域)序列以及Term-ICL(异柠檬酸脂肪酶的终止子区域)序列的质粒pWI3等。
如果在质粒pYGA2270或pYE22m的GAPDH启动子序列和GAPDH终止子序列之间，或者质粒pWI3的UPR-ICL序列和Term-ICL序列之间，插入编码所需蛋白质的DNA，可以制造用于导入酵母的质粒。在本发明中，优选使用多拷贝型的质粒pWIFS或pWIFL，制造例如pWIFSpmROL或pWIFLpmROL。
作为宿主的酵母，可以使用任何酵母，从反应后分离简单的方面、或者为了简单固定能够进行连续反应的方面考虑，优选絮凝性酵母。或者，作为糖链结合蛋白质区域，使用絮凝功能区域时，能够对任何酵母赋予强絮凝性。
作为絮凝性酵母，可以举出糖化糖酵母(Saccharomyces diastaticus)ATCC60715、糖化糖酵母ATCC60712、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)IFO1953、酿酒酵母CG1945、酿酒酵母HF7C等。另外，也可以构筑新的絮凝性酵母。例如，如下述实施例1所示，按照M.D.Rose等人(Methods in Yeast Genetics，1990，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)的方法，由絮凝性酵母ATCC60712和非絮凝性酵母W303-1B接合而成的二倍体，能够得到絮凝性酵母YF207以及与其具有相同性质的酵母。本发明人等获得的絮凝性酵母YF207株，质粒的稳定性优良，而且发酵能力非常强。因此，为了使所需的蛋白质，例如α-淀粉酶和葡糖淀粉酶单独或两者在细胞表层进行表达，使用重组的絮凝性酵母YF207株时，由淀粉进行酒精发酵的效率变得非常高。
本发明的方法中使用的细胞可以通过将上述DNA导入细胞中得到。DNA的导入是指将DNA导入细胞中使之表达。DNA的导入方法有转化、转导、转染、共转染、电穿孔等方法，具体有使用醋酸锂的方法、原生质体法等。
导入的DNA可以是上述质粒的形态，也可以插入宿主的基因中，或与宿主的基因进行同宗重组并入染色体中。
导入了DNA的细胞可以通过用选择标记(例如TRP)选择，测定表达的蛋白质活性进行选择。蛋白质固定在细胞表层可以通过使用抗蛋白质抗体与FITC标记抗IgG抗体的免疫抗体法确认。
本发明中使用的细胞也可以固定在载体上。例如为酵母时，如果进行了固定，就便于在反复分次发酵或连续发酵中使用。
在本说明书中，载体是指能够固定细胞的物质，优选对水或某种特定溶剂不溶的物质。作为本发明中能够使用的载体材料，优选聚乙烯醇、泡沫聚氨酯、泡沫聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇缩甲醛树脂多孔体、泡沫硅氧烷、纤维素多孔体等发泡体或树脂。如果考虑繁殖以及活性低的细胞或死细胞的脱落等，优选多孔性的载体。多孔体的开口部大小根据细胞有所不同，优选细胞能够充分进入，且能够繁殖的大小。优选为50μm～1000μm，但是对此并没有限定。
另外，不问载体的形状如何。如果考虑载体的强度、培养效率等，优选为球状或立方体状，关于其大小，在球状的场合，优选直径为2mm～50mm，在立方体的场合，优选边长为2mm～50mm。
在本说明书中，细胞的固定化是指细胞处于非游离的状态，例如细胞结合或附着在载体上或者嵌入载体内部的状态等。细胞的固定可以适用例如载体结合法、交联法、掺入法(包括法)等本领域技术人员通常采用的方法。其中，对于絮凝性酵母的固定，载体结合法最为合适。载体结合法包括使之吸附在离子交换性树脂上的化学吸附法或者物理吸附法。
例如，本发明中可以使用的絮凝性酵母具有尽管固定在载体上仍然能够繁殖、而且如果活性降低就自然脱落的性质。因此，结合在载体上的酵母具有活菌数能够几乎保持一定、活性高的特征。如果考虑这一特征，对载体的结合最优选物理吸附。物理吸附不需要特别的手段。通过将絮凝性或粘附性的细胞与上述多孔性的载体简单混合进行培养，就可使细胞进入多孔体的开口部而附着在载体上。
在本说明书中，絮凝性是指浮游或分散在液体中的酵母等细胞聚集成块(聚集体)的性质，粘附性是指细胞之间粘附或结合形成聚集体的性质。
在本说明书中，活性降低是指虽然细胞本身没有死亡但是细胞整体的活性减弱的状态，或者例如絮凝所涉及的活性降低、或在对涉及絮凝的酶编码的DNA水平上活性减弱等不能絮凝的状态。
另外，在本发明中，絮凝性或粘附性酵母也可以是通过导入与絮凝或粘附有关的基因而得到絮凝性或粘附性的酵母。
絮凝或粘附的相关基因是指与絮凝或粘附有关的物质，例如可以举出对酵母的壳多糖、外源凝血素等进行编码的结构基因，作为絮凝性的相关基因，可以举出FLO1〔J.Watari等，Agric.Biol.Chem.，551547(1991)；G.G.Stewart等，Can.J.Microbiol.，23441(1977)；I.Russell等，J.Inst.Brew.，86120(1980)；C.W.Lewis等，J.Inst.Brew.，82158(1976)〕、FLO5〔I.Russell等，J.Inst.Brew.，8595(1979)〕、FLO8〔I.Yamashita等，Agric.Biol.Chem.，48131(1984)〕等基因。
这些絮凝或粘附相关基因整合到上述原料的质粒中，与为了在细胞表层提供所需蛋白质而设计的DNA一起导入细胞中。
这样得到的固定后的细胞也能够以附着在载体上的状态、游离状态进行培养，或者填充到柱等中，用作生物反应器。即使在连续或分次(批)反复进行培养和反应时，由于活性降低或死细胞脱落，作为细胞的活性也不会降低，而能够有效利用。
如上所述得到的本发明的细胞，可以用于使在细胞表层表达的蛋白质与基质接触而与该基质结合，或者使该基质转变成其它物质。例如，当蛋白质为酶时，该细胞也可以作为包含表达酶的细胞的酶剂提供。具体而言，作为本发明的酶剂，可以举出含有本发明的细胞以及能够维持细胞的培养基的悬浊液，和将本发明的细胞冷冻保存或冷冻干燥以及低温干燥的物质。
而且，本发明的细胞也可以通过将各种随机引入变异的蛋白质表现在其它细胞表层而用作组合文库。也能够由这种文库，迅速且简便地选择具有符合目的的最适性质的克隆体。这里所说的组合文库是指在基因水平随机引入变异，人为扩大蛋白质的多样性而得到的各种变异体的集合。
以下，结合实施例说明本发明，但是本发明并不受这些实施例的限定。
(实施例1依次具有FLO1的5’区域以及脂肪酶原结构基因的DNA的制作)AFLO1的5’区域(信号序列以及絮凝功能区域)基因的获得如下所述获得FLO1的基因。首先，由酿酒酵母(S.cerevisiae)ATCC 60715提取染色体DNA。接着，将其作为模板，使用序列号1和序列号2记载的核苷酸序列作为引物，进行PCR放大，用BamHI和BglII消化，得到约3300bp长度的BamHI-BglII片段(BamHI-BglIIFLO1 3300bp片段)。可认为该3300bp片段具有FLO1的5’侧的序列(分泌信号序列以及FLO1絮凝功能区域)。
B脂肪酶基因的获得如下所述，获得米根霉的脂肪酶基因。简单来说，首先由R.oryzae(米根霉)IFO4697提取染色体DNA。接着，以其作为模板，使用序列号3和序列号4记载的核苷酸序列作为引物，进行PCR放大，用BamHI和SalI消化，得到约1100bp长度的BamHI-SalI片段(BamHI-SalI脂肪酶片段)。该脂肪酶片段具有脂肪酶的前序列和成熟蛋白质序列，与Beer等的报告(Biochim Biophys Acta，1399173-180 1998)中记载的序列几乎一致。
C依次具有FLO的5’区域以及脂肪酶原结构基因的质粒的制作具有目的DNA的质粒可以通过将上述由A得到的FLO1的5’区域基因以及由上述B得到的脂肪酶原基因连接得到。为了制作FLO1衍生物与脂肪酶的融合蛋白，进行以下操作。制作的示意图如图1所示。
首先，用BglII将多拷贝型质粒pWI3消化，脱磷酸化后，插入上述由A得到的BamHI-BglII FLO1 3300bp片段，得到质粒pWIFS。接着，用BglII和XhoI将该质粒pWIFS消化，插入由上述B得到的BamHI-SalI脂肪酶片段，得到pWIFSpmROL。将由插入该质粒pWIFSpmROL中的基因表达的蛋白质命名为短(short)型FLO1脂肪酶。
(实施例2依次具有包含细胞壁锚定区域的FLO1的5’区域以及脂肪酶原结构基因的DNA的制作)与上述实施例1同样，提取FLO1的染色体DNA。以其作为模板，使用序列号1和序列号5记载的核苷酸序列作为引物，进行PCR放大，用BamHI和BglII消化，得到约4500bp长度的BamHI-BglII片段(BamHI-BglII FLO1 4500bp片段)。可认为该4500bp片段具有FLO1的5’侧的序列(分泌信号序列和FLO1絮凝功能区域)。
使用得到的BamHI-BglII FLO1 4500bp片段，进行与实施例1同样的操作。即，不是将实施例1的BamHI-BglII FLO1 3300bp片段而是将该4500bp片段插入pWI3中，得到质粒pWIFL。接着，与实施例1同样将上述BamHI-SalI脂肪酶片段插入该质粒pWIFL中，得到pWIFLpmROL。将由插入该质粒pWIFLpmROL中的基因表达的蛋白质命名为长(long)型FLO1脂肪酶。
(实施例3细胞表层具有脂肪酶的酵母的制作)使用絮凝性酵母中的糖化糖酵母ATCC60712(MATa leu2-3，112his2 lys2 stal FLO8)以及非絮凝性酵母W303-1B(MATαura3-52 trp1Δ2 leu2-3，112 his3-11 ade2-1 can1-100)，按照M.D.Rose等人(如上所述)的方法，得到色氨酸营养需求型的新絮凝性菌株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YF207(MATa ura3-52 trp1Δ2 his ade2-1can1-100 stal FLO8)。
按照使用Yeast Maker(Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA)的醋酸锂法，将由上述实施例1得到的质粒pWIFSpmROL以及实施例2得到的质粒pWIFLpmROL导入非絮凝性酵母酿酒酵母(S.cerevisiae)MT8-1(MATa ade his3 leu2 trp1 ura3)(Tajima等，Yeast，167-77，1985)以及絮凝性酵母YF207中。使用不含有L-色氨酸且补充了适当氨基酸和碱基的SD-W琼脂选择培养基(6.7％Yeast nitrogen base w/o aminoacids(Difco Laboratories制)，2％葡萄糖，2％琼脂粉末)对其进行培养。选择繁殖的酵母，将表达短(short)型FLO1脂肪酶的酵母分别命名为MT8-1-short和YF207-short，并将表达长(long)型FLO1脂肪酶的酵母分别命名为MT8-1-long和YF207-long。
用SDC液体培养基培养得到的酵母，离心分离，分成培养基和菌体，分别测定脂肪酶活性。作为对照，使用分别在酿酒酵母(S.cerevisiae)MT8-1中导入了质粒pWI3的酵母。结果，关于对照，确认培养基和菌体均没有脂肪酶活性。另外，在转化体MT8-1-short、YF207-short、MT8-1-long和YF207-long的培养上清液中几乎见不到脂肪酶活性，但是这些酵母菌体本身均具有脂肪酶活性(图2)。另外，脂肪酶活性的测定使用脂肪酶试剂盒S(大日本制药制)进行。
(实施例4细胞表层具有脂肪酶的酵母的功能确认)对于实施例3得到的表达短(short)型FLO1脂肪酶的酵母MT8-1-short和YF207-short，以及表达长(long)型FLO1脂肪酶的酵母MT8-1-long和YF207-long，分别通过波长600nm处的吸光度测定菌体的繁殖。可以得知任何一种酵母均在培养基中与对照相同程度地顺利繁殖(未显示数据)。
接着，测定表达短(short)型FLO1脂肪酶的酵母MT8-1-short和表达长(long)型FLO1脂肪酶的酵母MT8-1-long的甲醇分解反应活性。在30ml小瓶中，向由培养基100ml收集的各酵母中加入反应液(0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)2ml，大豆油9.65g，甲醇0.35g)，在35℃下每分钟振荡150次，按照Kaieda等的方法(J.Biosci.Bioeng.，88627-631，1999)测定甲酯的产量。其结果如图3所示。
任何一种酵母与以前的酵母(α-凝集素的N末端侧结合脂肪酶在细胞表层进行表达的酵母(特开平11-290078号公报))相比，均产生了更多的甲酯。特别是如图3所示，表达短(short)型FLO1脂肪酶的菌株MT8-1-short(○)以及表达长(long)型FLO1脂肪酶的酵母MT8-1-long(△)，甲酯的生产活性非常高。
另外，对于这些菌株，按照Smit等的方法(Smit等，Appl.Environ.Microbiol.，583709-3714(1992))测定其絮凝能力。结果，对于絮凝型的菌株，与导入质粒前相比，表达长(long)型FLO1脂肪酶的菌株显示与转化前同样强的絮凝能力。但是，表达短(short)型FLO1脂肪酶的菌株，絮凝能力变弱。可认为这是由于短(short)型FLO1脂肪酶没有细胞壁锚定区域，而是絮凝区域埋入细胞壁中，因此不能充分发挥絮凝功能。
(实施例5随机变异脂肪酶的组合文库的构建及其利用)对于对由上述实施例1B得到的米根霉的脂肪酶的前序列以及成熟蛋白质序列(366个氨基酸的脂肪酶原(ProROL))进行编码的1098bp的基因，采用Error-prone PCR法，随机引入变异，使之包含约3个碱基的变异(每1分子ProROL引入1个氨基酸的变异)，得到各种引入了变异的脂肪酶基因。与上述实施例1C时同样，将得到的引入了变异的脂肪酶基因分别插入具有FLO1的5’区域的质粒pWIFS中，得到pWIFSProROL文库。将这些质粒与实施例3同样地分别导入酵母YF207株，制作由在细胞表层表现具有各种变异的脂肪酶的713株构成的酵母组合文库。
如下所述，由得到的酵母组合文库选择具有酯交换活性的克隆体。将713株的文库在SD板(0.67％Yeast nitrogen base w/o amino acids，0.5％葡萄糖和2％琼脂粉末)上培养3天。接着，在该板上叠加高压灭菌后保持在45℃下的含有荧光色素的软琼脂SD培养基(SD培养基+2.5％大豆油、0.001％若丹明B、50％甲醇和0.8％琼脂粉末)。1天后，对板进行紫外线照射，选择菌体周围显出橙色荧光的克隆体，得到在甲醇分解反应基质，即甲醇存在下生存的克隆体(80克隆体)。
这些克隆体的脂肪酶活性，与上述实施例4同样，利用甲醇分解反应测定酯交换活性的初速度，并利用脂肪酶试剂盒S(大日本制药制)测定水解活性而测得。其中，与表达未引入变异的脂肪酶的菌株(野生型菌株)相比，可以见到酯交换活性以及水解活性改变的菌株，其结果如表1所示。
表1
可观察到S334T株具有比野生型菌株稍高的酯交换活性。另外，由酯交换活性与水解活性的比值可以得知，P2S/F293Y株显示出独特的水解反应高催化能力，而K326R株则显示出酯交换反应高催化能力。由这些结果可以得知，能够在酵母细胞表层制作组合文库，筛选符合目的的变异体。
产业实用性本发明的细胞表层结合性蛋白质能够在细胞表层表达所需的蛋白质。该所需的蛋白质能够根据活性中心的位置，使其相反侧与糖链结合蛋白质区域融合，由此进行表达，使之显示出充分的活性。因此，特别是在细胞表层表达C末端侧具有活性的蛋白质时，非常有用。另外，能在糖链结合蛋白质区域的两端结合相同或不同的蛋白质，从而可以有效地表达更多的蛋白质。可利用这种细胞表层的蛋白质的有效表达，在细胞表层上制作改性蛋白质的组合文库，并容易进行筛选。
序列表<110>关西化学机械制作株式会社<120>细胞表层结合性蛋白质及其应用<130>P2-01K02245<160>5<210>1<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>1acatggatcc atgacaatgc ctcatcgcta tatgtttttg 40<210>2<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>2gatagatctg gtgatttgtc ctgaagatga tgatgacaaa 40<210>3<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>3ctccggatcc atggttcctg tttctggtaa atctggatct 40<210>4<211>25
<212>DNA<213>人工序列<400>4cgatgtcgac ttacaaacag cttcc 25<210>5<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>5aatgcctcga gttaaataat tgccagcaat aaggacgcaa tgaag 4权利要求
1.一种细胞表层结合性蛋白质，其特征在于，具有糖链结合蛋白质区域，且所述糖链结合蛋白质区域的至少N末端侧或C末端侧结合有其它蛋白质。
2.如权利要求1所述的细胞表层结合性蛋白质，其特征在于，所述糖链结合蛋白质区域是至少含有GPI锚定蛋白的絮凝功能区域部分。
3.如权利要求2所述的细胞表层结合性蛋白质，其特征在于，所述GPI锚定蛋白是絮凝蛋白。
4.如权利要求3所述的细胞表层结合性蛋白质，其特征在于，所述絮凝蛋白是选自FLO1、FLO2、FLO4、FLO5、FLO9、FLO10和FLO11的蛋白质。
5.如权利要求1～4任一项所述的细胞表层结合性蛋白质，其特征在于，所述其它蛋白质结合在所述糖链结合蛋白质区域的N末端侧。
6.如权利要求1～4任一项所述的细胞表层结合性蛋白质，其特征在于，所述其它蛋白质结合在所述糖链结合蛋白质区域的C末端侧。
7.如权利要求1～4任一项所述的细胞表层结合性蛋白质，其特征在于，所述糖链结合蛋白质区域的N末端侧和C末端侧结合有相同或不同的其它蛋白质。
8.对权利要求1～7任一项所述的细胞表层结合性蛋白质进行编码的DNA。
9.含有权利要求8所述的DNA的质粒。
10.引入权利要求8所述的DNA或者权利要求9所述的质粒，在细胞表层表达上述其它蛋白质的细胞。
11.如权利要求10所述的细胞，其特征在于，所述细胞为酵母。
12.如权利要求10或11所述的细胞，其特征在于，所述其它蛋白质为酶。
13.如权利要求10～12任一项所述的细胞的使用方法，其特征在于，使所述其它蛋白质与基质接触而与该基质结合，或者将所述基质转变成其它物质。
14.含有权利要求12所述细胞的酶剂。
全文摘要
为表达糖链结合蛋白质区域与所需蛋白质的融合蛋白质，构筑质粒，引入细胞，而在细胞表层表达该蛋白质。特别适用于在细胞表层表达C末端侧具有活性的蛋白质。
文档编号C12N1/15GK1708510SQ0280830
公开日2005年12月14日 申请日期2002年3月22日 优先权日2001年4月19日
发明者福田秀树, 近藤昭彦, 松本健史, 野田秀夫 申请人:关西化学机械制作株式会社
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