腈水合酶和生产酰胺的方法
专利名称：腈水合酶和生产酰胺的方法
技术领域：
本发明涉及新颖的腈水合酶(nitrile hydratase)和使用该腈水合酶从腈化合物生产酰胺化合物的方法。
背景技术：
为了提高腈水合酶的表达水平，已经检验了利用遗传工程在微生物细胞中过量表达腈水合酶的方法和使用这些细胞转化腈化合物为对应的酰胺化合物的方法。例如，已知的腈水合酶是源于下列微生物的。所有腈水合酶都是由两种类型的异种亚单位组成的酶。
红球菌(Rhodococcus)属(已审日本专利申请公报(JP-B)NO.平3-54558)红球菌属(未审日本专利申请公报(JP-A)NO.平2-119778)假单胞菌(Pseudomonas)属(JP-A平3-251184)紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)属(欧洲专利申请NO.455646)不过，在所有情况下，利用大肠杆菌所得腈水合酶活性的表达水平都不是足够高的，该大肠杆菌是用含有任意如这些专利申请所述腈水合酶基因的插入片段的表达质粒所转化的；每重量份转化体细胞的腈水合活性低于作为基因来源的原始微生物(Ikehata，O.，Nishiyama，M.，Horinouchi，S.and Beppu，T.″Primary structure of nitrile hydratase deducedfrom the nucleotide sequence of a Rhodococcus speices N-774 and itsexpression in Escherichia coli″Eur.J.Biochem.181(1989)，563-570；Nishiyama，M.，Horinouchi，S.，Kobayashi，M.，Nagasawa，T.，Yamada，H.and Beppu，″Cloning and Characterization of Genes Responsible forMetabolism of Nitrile Compounds from Pseudomonas chlororaphis B23″Journal of bacteriology 173(1991)2465-2472；Kobayashi，M.，Nishiyama，M.，Nagasawa，T.，Horinouchi，S.，Beppu，T.and Yamada，H.″Cloningnucleotide sequence and expression in Escherichia coli of twocobalt-containing nitrile hydratase genes from Rhodococcus rhodochrousJl″Biochimica et Biophysica Acta.1129(1991)23-33)。
如上所述，已经有可能利用基因重组技术在大肠杆菌中表达腈水合酶活性本身。不过，迄今尚不存在可利用的转化体，它具有如此高的腈水合活性，以便用于酰胺的工业生产。
另一方面，在干燥无色杆菌(IFO 12668)中已经见到腈水合酶，它表现非常高的腈水合活性，还已经克隆了编码该酶的基因。进而，使用表达质粒向大肠杆菌引入该基因，利用所得转化体过度产生了腈水合酶(JP-A平8-266277)。这份报道仅显示了丙烯酰胺和α-羟基异丁酰胺的生产实例，因而在该报道中没有关于这种酶对2-羟基-4-甲硫基丁腈的活性的说明。
因而，关于能够使用2-羟基-4-甲硫基丁腈(methylthiobutyronitrile)(以下缩写为HMBN)作为底物的腈水合酶知之甚少。此外，尚无使用大肠杆菌从2-羟基-4-甲硫基丁腈生产2-羟基-4-甲硫基丁酰胺(methylthiobutylamides)(以下缩写为HMBAm)的现有方法，该大肠杆菌是用含有腈水合酶基因作为插入片段的表达质粒所转化的。
另一方面，关于由微生物生产α-羟基酰胺，存在一种已知的方法，使用属于芽孢杆菌属、炭疽芽孢杆菌属(the genus Bacteridium)、微球菌(Micrococcus)属或短杆菌(Brevibacterium)属的微生物从乳腈、羟乙腈、α-羟基甲硫基丁腈等生产对应的酰胺(参见JP-B昭62-21519)。另外，还存在一种从氰醇(cyanohydrin)生产扁桃酰胺(mandelamide)的公知方法(参见JP-A平4-222591；JP-A平8-89267)。
不过，具有腈水合酶活性、能够转化腈化合物为酰胺化合物的酶具有这样一个问题，由于原料腈化合物或产物酰胺化合物的存在，这些酶容易丧失它们固有的酶活性。如果为了增加酰胺化作用的速率而升高腈化合物的浓度，那么腈水合酶容易在短时间内失活，从而难以在所需时间内得到反应产物酰胺化合物。另外，产物酰胺化合物也容易使腈水合酶失活，从而难以得到高浓度的酰胺化合物。
此外，在不同程度上取决于化合物的类型，已知α-羟基腈在极性溶剂中部分分解为对应的醛和氢氰酸(V.Okano et al.，J.Am.Chem.Soc.，Vol.98，4201(1976))。一般而言，醛与蛋白质连接，能够使酶活性失活(Chemical Modification of Proteins，G.E.Means et al.，Holden-Day，125(1971))。进而，象醛一样，氢氰酸(氰化物)也能够抑制性地作用于很多酶。因而，从原料α-羟基腈所产生的醛和氰化物能够成为降低酶活性的原因。由于在酶水合作用或α-羟基腈水解作用中，酶在短时间内失活这一问题，难以以高生产率得到高浓度的α-羟基酰胺。
为了防止酶活性的丧失，已经试验了各种增加酶活性或抑制酶活性丧失(失活)的方法。这样的努力例如包括如下在凝固点至15℃的更低温度下进行反应(JP-B昭56-38118)；从多个供给口连续供给更低浓度的底物(JP-B昭57-1234)；将微生物或其加工产物用有机溶剂处理(JP-A平5-308980)；在不饱和高级脂肪酸的存在下进行反应(JP-A平7-265090)；使微生物细胞受到戊二醛的交联处理等(JP-A平7-265091；JP-A平8-154691)；利用化学方法降低污染腈化合物的氢氰酸的浓度，然后使腈水合酶与腈化合物反应(JP-A平11-123098)；利用亚硫酸离子、酸式亚硫酸离子或连二亚硫酸离子的存在实现酶活性的长期稳定化(JP-A平8-89267)；加入醛(JP-A平4-222591)。
这些方法没有一个在工业应用上具有实际的效果。尽管有些方法是有效的，不过它们仍有经济性或实用性改善的空间。例如，上述加入醛的方法需要大量的醛作为原料，是氰醇的1-5倍摩尔量，因而该方法并非经济的解决方案。类似地，加入亚硫酸离子、酸式亚硫酸离子或连二亚硫酸离子的方法要求加入离子的量等于或大于原料，因而该方法不实用。
本发明的一个目的是提供具有很高腈水合活性的腈水合酶。本发明的另一个目的是提供稳定的腈水合酶，它能够在长时间内保持很高的酶活性。另外，本发明的另一个重要目的是提供也能够使用2-羟基-4-甲硫基丁腈作为底物的腈水合酶。
此外，本发明的另一个目的是提供编码具有很高腈水合活性的腈水合酶的基因、含有该基因的重组质粒和含有该重组质粒的转化体。另外，本发明的另外一个目的是提供使用表达很高腈水合活性的该转化体从腈生产对应的酰胺的方法。
发明内容
本发明人为达到上述目的而进行了艰苦的研究，在属于红球菌属的微生物(Rhodococcus sp.)中发现了具有非常高腈水合活性的腈水合酶。然后，发明人确认了该腈水合酶是一种新颖的酶，可用于达到上述目的，从而完成了本发明。
发明人然后利用重组DNA技术克隆了编码该酶的基因，制备了用包含表达载体的表达质粒转化的大肠杆菌，该表达载体含有所分离的基因作为插入片段。进而，本发明人成功地利用所得转化体大规模生产该腈水合酶，从而完成了本发明。
也就是说，本发明提供了下列腈水合酶、编码该酶的多核苷酸、生产该酶的方法和使用本发明的酶生产酰胺的方法。
本发明的腈水合酶具有下列物理化学性质(a)和(b)(a)作用于腈化合物的腈基，使腈基水合，将其转化为酰胺基；(b)是氰化物耐受性的。
本发明中，使腈化合物的腈基水合和将其转化为酰胺基的活性被称为“腈水合酶活性”。优选地，能够作用于下式(1)化合物并生成式(3)酰胺化合物的酶被称为“腈水合酶”。
式(1) 式(3) (其中R代表取代或未取代的烷基、取代或未取代的链烯基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、取代或未取代的饱和或不饱和杂环基)。
优选地，本发明的腈水合酶能够作用于2-羟基-4-甲硫基丁腈，产生2-羟基-4-甲硫基丁酰胺。
本发明的腈水合酶活性如下得以确认。首先，向0.1M磷酸钾缓冲液(pH 6.5)加入酶样本，缓冲液含有10％v/v 2-羟基-4-甲硫基丁腈(HMBN)作为底物。也可使用微生物细胞和粗酶(crude enzyme)代替酶样本。加入酶后，将溶液在20℃下培育15分钟。然后将反应溶液与过量体积的0.1％(v/v)磷酸盐溶液混合，剧烈摇动混合物以终止反应。可以利用HPLC分析反应产物。
按照这种测定方法，1U腈水合酶被定义为在20℃具有标准组成的反应溶液中1分钟能够产生1μmol烟酰胺的酶的量；1U被定义为在20℃具有标准组成的反应溶液中1分钟能够产生1μmol HMBAm的酶的量。
具体而言，例如可以利用实施例所述工艺测定酶活性。进而，使用来自Bio-Rad的蛋白质测定试剂盒，利用染剂结合法进行蛋白质的量化。
另一方面，本文所用的“氰化物耐受性”意味着在20℃下用1mM氰化物离子处理30分钟后，酶保留40％或更多的腈水合酶活性。作为替代选择，如果在20℃下用5mM氰化物离子处理30分钟后，酶保留10％或更多的腈水合酶活性，那么可以认为该酶是氰化物耐受性的。
进而，本发明提供具有下列物理化学性质(1)-(7)的腈水合酶(1)分子量在用凝胶过滤法测定时，分子量大约是110,000Da；利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法将酶分离为26.8kDa和29.5kDa的两个亚单位。
(2)作用该酶作用于腈化合物的腈基。
(3)最佳pH使腈基水合的活性在pH 5.5-6.5下最大。
(4)最佳温度使腈基水合的活性在40-45℃下最大。
(5)pH稳定性该酶在pH 4-9内是稳定的。
(6)热稳定性在50℃下热处理30分钟后，该酶保留70％或更多的活性。
(7)抑制剂
该酶被HgCl2、AgNO3、羟胺或苯肼所抑制。
进而，除了上述物理化学性质(a)和(b)或(1)-(7)以外，本发明提供具有下列物理化学性质(c)和/或(d)的腈水合酶。
(c)底物特异性该酶使用2-羟基-4-甲硫基丁腈作为底物，产生2-羟基-4-甲硫基丁酰胺。
(d)稳定性该酶被二价金属离子所稳定。
本发明中，腈水合酶的底物特异性可以利用上述试验腈水合酶活性的方法加以测定。进而，本文所用的“被二价金属离子所稳定”意味着即使在二价金属离子的存在下酶与1.8w/w％2-羟基-4-甲硫基丁腈培育20分钟，酶活性也基本上没有减少。在本发明的优选实施方式中，本发明的腈水合酶能够在这些条件下保持110％或更高的活性。
本发明中，上述二价金属离子包括镍离子和钴离子。这些二价金属离子在0.1mM-1M、一般为0.5-100mM、优选为1-10mM的浓度下提高本发明腈水合酶的酶活性。
利用常用的蛋白质纯化方法，可以从能够产生该酶的微生物中纯化本发明的腈水合酶。可以将上述微生物培养在标准的细菌培养基中。可以向培养基加入一些诱导腈水合酶表达的化合物。例如，腈化合物或酰胺化合物的加入能够提高腈水合酶的活性。更具体而言，乙腈、乙酰胺等可以用作酶诱导剂。
使能够产生该酶的微生物充分生长，然后收获细胞。在适当的缓冲液中溶解细胞，制备无细胞的提取物。缓冲液可以含有还原剂，例如2-巯基乙醇，蛋白酶抑制剂，例如苯甲磺酰氟(PMFS)。利用基于蛋白质溶解度的分离法和各种色谱工艺的适当组合，可以从无细胞的提取物纯化腈水合酶。
作为基于蛋白质溶解度的分离法，例如可以使用有机溶剂沉淀法，例如丙酮和二甲基亚砜，或硫酸铵盐析法。另一方面，已知的色谱方法包括阳离子交换色谱、阴离子交换色谱、凝胶过滤、疏水性色谱以及很多使用染剂、抗体及其他的亲合色谱工艺。更具体而言，本发明的腈水合酶可以被纯化为电泳上同种的多肽，例如使用苯基-TOYOPEARL的疏水性色谱、使用DEAE-琼脂糖的阴离子交换色谱、使用丁基-TOYOPEARL的疏水性色谱、使用蓝-琼脂糖的亲合色谱、使用Superdex200的凝胶过滤和其他。
能够用于此目的的微生物例如包括属于红球菌属(Rhodococcus sp.)的那些。更具体而言，Rhodococcus sp.Cr4是适合于生产本发明腈水合酶的微生物。Rhodococcus sp.Cr4已被保藏在International PatentOrganism Depositary中，入藏号FERM BP-6596。
Rhodococcus sp.Cr4的国际保藏(a)保藏机构的名称和地址名称International Patent Organism Depositary，National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology(AIST)，IndependentAdministrative Institution(原名The National Institute of Bioscience andHuman-Technology，The Agency of Industrial Science and Technology，TheMinistry of International Trade and Industry)地址Chuo 6，1-1，Higashi l-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566Japan(b)保藏日期(原始保藏日期)1998年12月8日(c)保藏号FERM BP-6596本发明的腈水合酶是可以从Rhodococcus sp.得到的。Cr4是一种新颖的酶，具有上述物理化学性质(a)-(d)和(1)-(7)。结构特征是上述物理化学性质(1)；根据SDS-PAGE的测定，该酶是由26.8kDa的α-亚单位和29.5kDa的β-亚单位组成的杂二聚多肽。α-亚单位的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示(226个氨基酸残基)，β-亚单位的氨基酸序列如SEQID NO4所示(207个氨基酸残基)。也就是说，本发明提供下列具有腈水合酶活性的基本上纯的蛋白质复合体。
本发明涉及在包含氨基酸序列SEQ ID NO2的多肽与包含氨基酸序列SEQ ID NO4的多肽之间的、基本上纯的蛋白质复合体。进而，本发明包括在包含氨基酸序列SEQ ID NO2的多肽与包含氨基酸序列SEQ ID NO4的多肽之间的蛋白质复合体的同系物。
本文关于给定蛋白质、多肽或蛋白质复合体所用的术语“基本上纯”意味着该蛋白质、多肽或蛋白质复合体基本上不含其他生物大分子。基本上纯的蛋白质、多肽或蛋白质复合体是至少75％(例如至少80、85、95或99％)纯的，以干重计。纯度可以利用本领域已知的任意适当标准方法加以测量，例如柱色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析。
本发明的蛋白质复合体是这样一种腈水合酶，它能够被使用所分离的编码本发明腈水合酶的多核苷酸的基因重组技术所表达。编码本发明腈水合酶的多核苷酸例如可以利用下列方法分离。
由本发明所提供的腈水合酶由如(A)-(E)任意一个所示多核苷酸所编码的α-亚单位和如(a)-(e)任意一个所示多核苷酸所编码的β-亚单位组成，是具有下列物理化学性质(i)和(ii)的蛋白质复合体。
(i)作用作用于腈化合物的腈基，使腈基水合，将其转化为酰胺基；(ii)底物特异性该酶使用2-羟基-4-甲硫基丁腈作为底物，产生2-羟基-4-甲硫基丁酰胺。
如下列(A)-(E)任意一个所示多核苷酸可以用作编码构成本发明蛋白质复合体的α-亚单位的基因。本发明中，如(A)-(E)任意一个所示多核苷酸可用于表达本发明腈水合酶的α-亚单位(A)包含核苷酸序列SEQ ID NO1的多核苷酸；(B)编码包含氨基酸序列SEQ ID NO2的多肽的多核苷酸；(C)编码包含氨基酸序列SEQ ID NO2的多肽的多核苷酸，它含有一个或多个氨基酸取代、缺失、插入和/或加入；(D)能够在严格条件下与包含核苷酸序列SEQ ID NO1的多核苷酸杂交的多核苷酸；(E)编码与氨基酸序列SEQ ID NO2具有70％或更高同一性的多肽的多核苷酸。
而且，如下列(a)-(e)任意一个所示多核苷酸可以用作编码构成本发明蛋白质复合体的β-亚单位的基因。本发明中，如(a)-(e)任意一个所示多核苷酸可用于表达本发明腈水合酶的β-亚单位(a)包含核苷酸序列SEQ ID NO3的多核苷酸；(b)编码包含氨基酸序列SEQ ID NO4的多肽的多核苷酸；(c)编码包含氨基酸序列SEQ ID NO4的多肽的多核苷酸，它含有一个或多个氨基酸取代、缺失、插入和/或加入；(d)能够在严格条件下与包含核苷酸序列SEQ ID NO3的多核苷酸杂交的多核苷酸；(e)编码与氨基酸序列SEQ ID NO4具有70％或更高同一性的多肽的多核苷酸。
本发明涉及所分离的编码腈水合酶亚单位的多核苷酸及其同系物。
本文所用的“所分离的多核苷酸”是这样一种多核苷酸，它的结构不等同于任意天然存在的多核苷酸或任意跨越三个以上单独基因的天然存在的基因组多核苷酸片段。该术语因此例如包括(a)DNA，它具有天然存在于生物基因组中的基因组DNA分子部分的序列，在该生物中是天然存在的；(b)掺入载体或原核生物或真核生物基因组DNA中的多核苷酸，其方式以便所得分子不等同于任意天然存在的载体或基因组DNA；(c)单独的分子，例如cDNA、基因组片段、由聚合酶链反应(PCR)生成的片段或限制酶切片段；(d)重组核苷酸序列，它是杂种基因的一部分，也就是编码融合多肽的基因。具体从这种定义中排除在外的是这样的DNA分子的多核苷酸，它们存在于不同的(i)DNA分子、(ii)转染细胞或(iii)细胞克隆体的混合物中；例如它们存在于DNA文库中，例如cDNA或基因组DNA文库。
因此，本发明在一方面提供所分离的多核苷酸，它编码本文所述的多肽或其片段。优选地，所分离的多核苷酸包括至少60％等同于如SEQID NO1或3所示核苷酸序列的核苷酸序列。更优选地，所分离的核酸分子至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多等同于如SEQ ID NO1或3所示核苷酸序列。在所分离的多核苷酸长度长于或等于参照序列、例如SEQID NO1或3的情况下，利用全长参照序列进行对比。若所分离的多核苷酸短于参照序列，例如短于SEQ ID NO1或3，则对相同长度的参照序列节段(排除同源性计算所需的所有环)进行对比。
编码本发明腈水合酶α-亚单位与β-亚单位的多核苷酸的核苷酸序列以及被这些核苷酸序列编码的氨基酸序列都是新颖的。基于由本发明揭示的核苷酸序列的信息，可以从上述保藏的微生物得到有关基因。可以利用PCR或杂交技术筛选得到这些基因。还可以利用化学DNA合成得到全长基因。
进而，基于上述核苷酸序列的信息，有可能得到源于其他生物的腈水合酶。例如，使用上述核苷酸序列或其部分序列作为探针，在严格条件下与从其他生物制备的多核苷酸进行杂交，可以分离源于各种生物的腈水合酶基因。
术语“能够在严格条件下杂交的多核苷酸”表示能够与作为探针的多核苷酸杂交的多核苷酸，前者具有选自核苷酸序列SEQ ID NO1(α-亚单位)和SEQ ID NO3(β-亚单位)的核苷酸序列，例如在手册所述条件下(在42℃下用含有0.5×SSC的初步洗涤缓冲液洗涤)利用ECL直接核酸标记与检测系统(Amersham Pharmacia Biotech)。还包括在本发明中的是在高严格条件下与本文所述核苷酸序列SEQ ID NO1或其片段杂交的多核苷酸。“高严格条件”表示在约45℃下在6×SSC中杂交，然后在65℃下用0.2×SSC，0.1％SDS洗涤一次或多次。构成探针多核苷酸的核苷酸序列可以被制成一种或多种任意组成的序列，但是具有至少20个连续的核苷酸，优选至少30个连续的核苷酸，例如40、60或100个连续的核苷酸，选自上述核苷酸序列。
进而，基于关于上述核苷酸序列的信息，可以从表现高同源性的区域设计PCR引物。使用这样的引物和染色体DNA或cDNA作为模板，利用PCR可以从各种生物分离编码腈水合酶的基因。
在本发明的方法中，有可能不仅使用天然的酶，而且使用包含天然酶的氨基酸序列的酶，其中一个或多个氨基酸已被取代、删去和/或插入，只要该酶能够构成具有上述物理化学性质(a)与(b)或(1)至(7)的蛋白质复合体即可。本领域技术人员可以修饰该多肽的结构，例如通过位点特异性诱变引入适当取代、缺失、插入和/或加入的突变(Nucleic Acid Res.10，pp.6487(1982)；Methods in Enzymol.100，pp.448(1983)；MolecularCloning 2nd Edt.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；PCR，APractical Approach IRL Press pp.200(1991))等。进而，氨基酸突变可以自然发生。因而，不仅具有人工氨基酸突变的酶、而且含有自发性氨基酸突变的酶都能够用在本发明的方法中。
被突变的氨基酸的数量没有特别的限制，只要该酶能够构成具有上述物理化学性质(a)与(b)或(1)至(7)的蛋白质复合体即可。正常情况下，它在50个氨基酸以内，优选在30个氨基酸以内，更优选在10个氨基酸以内，进而更优选在3个氨基酸以内。突变的位点可以是任意位点，只要该酶能够构成具有上述物理化学性质(a)与(b)或(1)至(7)的蛋白质复合体即可。
氨基酸取代优选地被突变成不同的氨基酸，其中保存了氨基酸侧链的性质。“保守性氨基酸取代”是属于下列具有化学相似侧链的小组之一的一个氨基酸残基被同组另一个氨基酸代替。具有相似侧链的氨基酸残基小组在本领域中已有定义。这些小组包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
另外，在本发明的方法中，编码与腈水合酶每种亚单位的氨基酸序列具有同源性的多肽的基因也可以用于本发明，只要该产物能够构成具有上述物理化学性质(a)与(b)或(1)至(7)的蛋白质复合体即可。利用蛋白质同源性检索可以得到这些基因。这类同源性检索例如可以使用下列公知的数据库进行关于蛋白质的氨基酸序列数据库，例如SWISS-PROT和PIR，DNA数据库，例如DNA Databank of JAPAN(DDBJ)、EMBL和GenBank，从DNA序列推导的氨基酸序列数据库，同源性检索程序，例如FASTA程序和BLAST程序。
进而，在互联网上也可获得检索上述数据库的数据库检索服务。利用这种类型的服务可以找到用在本发明中的腈水合酶。
与氨基酸序列SEQ ID NO2(α-亚单位)或SEQ ID NO4(β-亚单位)具有至少85％、优选90％或更高、更优选95％或更高同一性的多肽是本发明优选的多肽，构成用在本发明中的腈水合酶。本文所用的“同一性百分率(percent identity)”例如表示利用BLAST程序所得“阳性(Positive)”同一性百分率的值。具体而言，两种氨基酸序列或两种核酸的“同一性百分率”是利用Karlin和Altschul的算法测定的(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268，1990)，这种算法也被Karlin和Altschul修正过(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877，1993)。将这样一种算法结合到Altschul等的NBLAST与XBLAST程序中(J.Mol.Biol.215403-410，1990)。BLAST核苷酸检索是用NBLAST程序进行的，分值＝100，字长＝12。蛋白质的同源性检索是容易进行的，例如在DNADatabank of JAPAN(DDBJ)中，利用FASTA程序、BLAST程序等。BLAST蛋白质检索是用XBLAST程序进行的，分值＝50，字长＝3。若在两个序列之间存在间隙，则采用有间隙的BLAST，如Altsuchl等所述(NucleicAcids Res.253389-3402，1997)。若采用BLAST和有间隙的BLAST程序，则使用各程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。
本发明中，若打算使用包含氨基酸序列SEQ ID NO2的突变α-亚单位和包含氨基酸序列SEQ ID NO4的突变β-亚单位制备蛋白质复合体，二者在它们的氨基酸序列中都具有突变，则它们之一或之二可以是突变的多肽。进而，不同来源的亚单位可以彼此结合，生成本发明的蛋白质复合体。若两个亚单位之一打算是突变的，则应当选择能够与其他亚单位构成具有上述物理化学性质(1)和(2)的蛋白质复合体者。
进而，若α-亚单位和β-亚单位都打算是突变体，则将一种突变体与另一种结合，并且选择能够构成具有上述物理化学性质(i)和(ii)的蛋白质复合体的突变体。在这种情况下，首先，试验突变的亚单位，以评估它在与其他具有野生型氨基酸序列的亚单位结合后是否产生所需的物理化学性质。若结果是阳性的，则选择另一种产生所需物理化学性质的突变体作为配偶亚单位，用于与第一突变体结合；因而这些突变体是容易选择的。本发明可取的突变体具有上述物理化学性质(a)与(b)或(1)-(7)以及上述物理化学性质(i)与(ii)。
本发明优选的酶活性材料包括同种或异种宿主的转化体，该宿主表达编码腈水合酶的基因，已经利用基因重组技术制备，再处理其产物。
不存在关于用于转化作用以表达本发明腈水合酶基因的生物的限制，只要该生物能够用含有编码构成具有腈水合酶活性的蛋白质复合体的各亚单位的多核苷酸的重组载体转化、并且能够表达腈水合酶活性即可。编码各亚单位的多核苷酸可以保留在单一的载体中。各亚单位的多核苷酸还可以被分别插入在两种类型的载体中；通过载体的共同转化作用，可以表达本发明的蛋白质复合体。进而，有可能通过使各自表达单一亚单位的转化体结合，体外得到有关蛋白质复合体。可利用的微生物是其宿主-载体系统是可利用的那些，例如包括细菌，例如埃希氏杆菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、沙雷氏菌属、短杆菌属、棒杆菌属、链球菌属和乳杆菌属；放线菌，例如红球菌属和链霉菌属；酵母，例如酵母属、克鲁维氏酵母属、裂殖糖酵母属、接合糖酵母属、Yarrowia属、毛孢子菌属、红孢子菌属、毕赤氏酵母属和假丝酵母属；真菌，例如链孢霉属(Neurospora)、曲霉属、头孢子菌属(Cephalosporium)和木霉属等。
适合于宿主的转化体的制备工艺和重组载体的构建工艺可以采用分子生物学、生物工程和遗传工程领域中常用的技术(例如参见Sambrook et al.，″Molecular Cloning″，Cold Spring Harbor Laboratories)。为了在微生物中表达编码本发明腈水合酶的基因，有必要向在微生物中稳定的质粒载体或噬菌体载体引入多核苷酸，并使遗传信息转录和转译。为此，在本发明多核苷酸5’-末端上游放置启动子，即用于调节转录和转译的单元，并且优选地在多核苷酸3’-末端下游方式终止子。启动子和终止子应当在被用作宿主的微生物中是功能性的。可用于上述各种微生物的载体、启动子和终止子详细描述在″Fundamental Course inMicrobiology(8)Genetic Engineering″，Kyoritsu Shuppan中，具体关于酵母，见″Adv.Biochem.Eng.43，75-102(1990)″和″Yeast 8，423-488(1992)″。
例如，关于埃希氏杆菌属，确切地关于大肠杆菌，可利用的质粒包括pBR系列和pUC系列的质粒；可利用的启动子包括源于lac(源于β-半乳糖苷酶基因)、trp(源于色氨酸操纵子)、tac与trc(它们是lac和trp的嵌合体)、λ噬菌体的PL与PR等的启动子。可利用的终止子源于trpA、噬菌体、rrnB核糖体RNA等。其中，可以优选地使用载体pSE420D(描述在未审日本专利申请公报No.(JP-A)2000-189170中)，它是通过部分地修饰商业上可得到的pSE420(Invitrogen)的多克隆位点所构建的。
关于芽孢杆菌属，可利用的载体是pUB110系列和pC194系列的质粒；载体可以被整合到宿主染色体中。可利用的启动子和终止子源于apr(碱性蛋白酶)、npr(中性蛋白酶)、amy(α-淀粉酶)等。
关于假单胞菌属，存在为恶臭假单胞菌和洋葱假单胞菌开发的宿主-载体系统。适用广泛宿主的载体pKT240(含有自主复制所需的源于RSF1010的基因)是可利用的，它基于TOL质粒，参与甲苯化合物的分解；源于脂肪酶基因的启动子和终止子(JP-A平5-284973)是可利用的。
关于短杆菌属，确切地关于乳发酵短杆菌，可利用的质粒载体包括pAJ43(Gene 39，281(1985))。可以采用用于大肠杆菌的启动子和终止子，无需为短杆菌属进行任何修饰。
关于棒杆菌属，确切地关于谷氨酸棒杆菌，质粒载体是可利用的，例如pCS11(JP-A昭57-183799)和pCB101(Mol.Gen.Genet.196，175(1984))。
关于链球菌属，可以使用质粒载体，例如pHV1301(FEMS Microbiol.Lett.26，239(1985))和pGK1(Appl.Environ.Microbiol.50，94(1985))。
关于乳杆菌属，可以采用质粒载体，例如pAMβ1(J.Bacteriol.137，614(1979))，它是为链球菌属开发的；用于大肠杆菌的启动子也是可用的。
关于红球菌属，从紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)分离的质粒载体是可利用的(J.Gen.Microbiol.138，1003(1992))。
关于链霉菌属，可以按照Hopwood等在″Genetic Manipulation ofStreptomycesA Laboratory Manual″(Cold Spring Harbor Laboratories(1985))中所述方法构建质粒。确切地关于浅青紫链霉菌，pIJ486(Mol.Gen.Genet.203，468-478，1986)、pKC1064(Gene 103，97-99(1991))和pUWL-KS(Gene 165，149-150(1995))是可用的。相同的质粒也可用于弗吉尼亚链霉菌(Actinomycetol.11，46-53(1997))。
关于酵母属，确切地关于酿酒酵母，YRp系列、YEp系列、YCp系列和YIp系列的质粒是可利用的；整合载体(参照EP 537456等)经由与多拷贝核糖体基因的同源性重组而被整合到染色体中，可以引入有关基因的多个拷贝，所掺入的基因被稳定地保持在微生物中；因而，这些类型的载体是非常有用的。可利用的启动子和终止子源于编码ADH(醇脱氢酶)、GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、PHO(酸性磷酸酶)、GAL(β-半乳糖苷酶)、PGK(磷酸甘油酯激酶)、ENO(烯醇化酶)等的基因。
关于克鲁维氏酵母属，确切地关于乳克鲁维氏酵母，可利用的质粒例如源于酿酒酵母的2-μm质粒、pKD1系列质粒(J.Bacteriol.145，382-390(1981))、源于pGK11并参与杀死活性的质粒、KARS(克鲁维氏酵母属自主复制序列)质粒和能够经由与核糖体DNA的重组而被整合到染色体中的质粒(参照EP537456等)。源于ADH、PGK等的启动子和终止子是可利用的。
关于裂殖糖酵母属，有可能使用这样的质粒载体，它们包含源于粟酒裂殖糖酵母的ARS(自主复制序列)和源于酿酒酵母的营养缺陷-补充性可选择的标记(Mol.Cell.Biol.6，80(1986))。可用的启动子例如源于粟酒裂殖糖酵母的ADH启动子(EMBO J.6，729(1987))。确切而言，pAUR224在商业上可从TaKaRa Shuzo获得。
关于接合糖酵母属，例如源于Zygosaccharomyces rouxii的pSB3质粒(Nucleic Acids Res.13，4267(1985))是可利用的；有可能使用源于酿酒酵母的PHO5启动子和源于Zygosaccharomyces rouxii的GAP-Zr(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)启动子(Agri.Biol.Chem.54，2521(1990))。
关于毕赤氏酵母属，已经开发了宿主-载体系统，其中参与自主复制的源于毕赤氏酵母的基因(PARS1和PARS2)被用在巴斯德毕赤氏酵母等中(Mol.Cell.Biol.5，3376(1985))，因而高密度培养和强启动子是可用的，例如甲醇可诱导的AOX(Nucleic Acids Res.15，3859(1987))。在毕赤氏酵母属中，已经为Pichia angusta(以前称Hansenula polymorpha)开发了宿主-载体系统。可用的载体包括参与自主复制的源于Pichiaangusta的基因(HARS1和HARS2)，但是它们是相对不稳定的。因此，向染色体整合该基因的多个拷贝是有效的(Yeast 7，431-443(1991))。AOX(醇氧化酶)和FDH(甲酸脱氢酶)的启动子也是可利用的，它们受甲醇的诱导。还已经开发了另一种宿主-载体系统，其中参与自主复制的源于毕赤氏酵母的基因(PARS1和PARS2)被用在巴斯德毕赤氏酵母等中(Mol.Cell.Biol.5，3376(1985))，因而高密度培养和强启动子是可用的，例如甲醇可诱导的AOX(Nucleic Acids Res.15，3859(1987))。
关于假丝酵母属，已经为麦芽糖假丝酵母、白色假丝酵母、热带假丝酵母、产朊假丝酵母等开发了宿主-载体系统。已经克隆了来源于麦芽糖假丝酵母的自主复制序列(Agri.Biol.Chem.51，51，1587(1987))，已经为麦芽糖假丝酵母开发了使用这些序列的载体。进而，已经为产朊假丝酵母开发了具有高效启动子单元的染色体-整合载体(JP-A平08-173170)。
关于曲霉属，已经集中研究了真菌中的黑曲霉和米曲霉，因而质粒载体和染色体整合载体是可利用的，以及源于细胞外蛋白酶基因和淀粉酶基因的启动子(Trends in Biotechnology 7，283-287(1989))。
关于木霉属，已经为Trichoderma reesei开发了宿主-载体系统，可利用的启动子例如源于细胞外纤维素酶基因的那些(Biotechnology 7，596-603(1989))。
除了微生物以外，还存在各种为植物和动物开发的宿主-载体系统；确切而言，这些系统包括昆虫，例如蚕(Nature 315，592-594(1985))，和植物，例如油菜籽、玉蜀黍、马铃薯等。转化体的培养和从转化体纯化腈水合酶可以利用本领域技术人员已知的方法进行。
本发明的编码用作载体插入片段的腈水合酶的多核苷酸例如包括如(A)-(E)所示任意一种上述多核苷酸和如(a)-(e)所示任意一种上述多核苷酸。
在本发明的载体中编码腈水合酶α-亚单位和β-亚单位的多核苷酸优选地是前后连接的。术语“优选地前后(in tandem)连接”表示这样的连接，普通的调节区域指向这些亚单位的表达。这样一种排列预期能够更有效地表达亚单位和更有效地生成具有酶活性的蛋白质复合体。作为替代选择，各亚单位的多核苷酸还可以分别被插入在两种类型的载体中；通过两种载体的共同转化作用，可以表达蛋白质复合体。
本发明还涉及以可表达的方式保留载体的本发明转化体。本发明的载体可以被转化到任意宿主中，只要宿主能够以功能性方式保留载体即可。这样一种可用于该目的的宿主例如包括大肠杆菌。
本发明的腈水合酶、产生该腈水合酶的微生物、本发明的蛋白质复合体、产生该蛋白质复合体的转化体及其处理产物可用于使用腈化合物作为底物生产酰胺的方法。也就是说，本发明提供生产酰胺的方法，该方法包含使腈化合物与酶活性材料接触、再回收酰胺的步骤，酶活性材料选自由本发明的腈水合酶、产生该腈水合酶的微生物、本发明的蛋白质复合体、产生该蛋白质复合体的转化体及其加工产物组成的组。
本文所用的术语“腈水合酶(nitrile hydratase)”表示具有上述物理化学性质(a)和(b)的酶或具有上述物理化学性质(1)-(7)的酶。进而，能够产生该酶的微生物包括菌株Rhodococcus sp.Cr4(该酶即源于此)、产生本发明酶的属于红球菌属的微生物和含有编码该酶的多核苷酸的转化宿主微生物。进而，术语“转化宿主微生物”表示能够表达编码上述α-亚单位的多核苷酸(A)-(E)和/或编码β-亚单位的多核苷酸(a)-(e)的宿主微生物。上述宿主微生物能够产生由本发明α-亚单位和β-亚单位组成的本发明蛋白质复合体。
进而，微生物的处理产物具体包括已用洗涤剂或有机溶剂(例如甲苯)处理而改变细胞膜渗透性的微生物、用玻璃珠粒或酶处理而溶解细胞所得无细胞提取物和从该提取物部分纯化的材料等。作为替代选择，酶的处理产物包括与不溶性载体或水性载体分子连接的酶和通过固定包埋而制备的固定化酶分子等。
本发明中，酶活性材料包括所有具有本发明腈水合酶活性的材料。因此，只要材料具有所需的酶活性，它就包括在酶活性材料中，而不管它的酶纯度和溶解度。
构成本发明酰胺生产方法的酶反应可以这样进行，使上述酶活性材料与反应溶液接触，后者含有腈化合物作为底物。具体而言，酶活性材料可以与底物在水性溶剂、由水性溶剂与水溶性有机溶剂组成的混合溶剂或含有水不溶性溶剂的两相系统中接触。水性溶剂包括在中性pH下具有缓冲作用的缓冲液，例如磷酸盐缓冲液和Tris-HCl缓冲液。作为替代选择，若在反应期间使用酸和碱使pH变化能够在可取的范围内，则不需要缓冲液。与水不可混溶的有机溶剂例如包括乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、氯仿、正己烷和异辛烷等。反应可以在混合溶剂中进行，其由水性溶剂和有机溶剂组成，后者例如乙醇、丙酮、二甲基亚砜和乙腈。
在两相系统中，酶活性材料存在于水相中，其中在使用该材料时无需任何其他溶剂或者与水或缓冲液混合。底物化合物可以溶解在水性溶剂中，例如水、缓冲液和乙醇，并供应到反应系统中。在这种情况下，与酶活性材料一起，底物构成单相反应系统。另外，本发明的反应可以利用固定化酶、膜反应釜等进行。此外，本发明的转化体可以使用培养物、通过过滤、离心等从培养基分离的细胞或者在离心分离和洗涤之后悬浮在缓冲液、水等中的细胞的形式。所分离的细胞可以使用回收时的状态、破裂的状态、用丙酮或甲苯处理后的状态或冻干产物的状态。若酶是被细胞外产生的，则还可以在利用通常方法从转化体分离后使用转化体的培养基。使酶活性材料与反应溶液接触的方式不限于这些实施例。反应溶液表示由溶解在适当溶剂中的底物组成的溶液，该溶剂提供适合于酶活性表达的环境。
关于用在使用本发明腈水合酶生产酰胺的方法中的腈化合物的类型没有限制。例如，下列腈化合物可以用在本发明的方法中。
饱和单腈乙腈、丙腈、丁腈、异丁腈、戊腈、异戊腈、己腈等。
饱和二腈丙二腈、琥珀腈、戊二腈、己二腈等。
α-氨基腈α-氨基丙腈、α-氨基甲硫基丁腈、α-氨基丁腈、氨基乙腈等。
具有羧基的腈氰基乙酸等。
β-氨基腈氨基-3-丙腈等。
不饱和腈丙烯腈、异丁烯腈(methacrylonitrile)、氰基烯丙基、巴豆腈等。
芳族腈苄腈、邻-、间-与对-氯苄腈、邻-、间-与对-氟苄腈、邻-、间-与对-硝基苄腈、对-氨基苄腈、4-氰基苯酚、邻-、间-与对-甲苯基腈(tolunitrile)、2，4-二氯苄腈、2，6-二氯苄腈、2，6-二氟苄腈、茴香腈、α-萘甲腈、β-萘甲腈、邻苯二甲腈、间苯二腈、对苯二腈、氰基苄基、苯乙腈等。
α-羟基腈。
本发明中，特别优选的腈化合物包括α-羟基腈化合物。在本发明的酰胺生产方法中，关于α-羟基腈化合物的类型没有限制。更具体而言，例如可以使用由上式(1)代表的化合物。
式中，R代表取代或未取代的烷基、取代或未取代的链烯基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳氧基、取代或未取代的饱和或不饱和的杂环基。从α-羟基腈化合物可以生产α-羟基酰胺。
杂环基包括具有至少一个氮、氧和硫作为杂原子的基团。进而，取代基例如包括烷基、烷氧基、酰基、芳基、芳氧基、卤素(例如氯和溴)、羟基、氨基、硝基、巯基等。
具体而言，例如可以使用下列化合物或其取代产物。本文所用的取代产物表示具有上面例证的取代基的化合物。
乳腈α-羟基-正丙腈α-羟基-正丁腈α-羟基-异丁腈α-羟基-正己腈α-羟基-正庚腈α-羟基-正辛腈α，γ-二羟基-β，β-二甲基丁腈丙烯醛氰醇(acroleincyanohydrin)异丁烯醛氰醇3-氯乙腈4-甲硫基-α-羟基丁腈α-羟基-α-苯基丙酰另外，具有芳族环和杂环的底物化合物包括下列例证性化合物及其取代产物。
扁桃腈(Mandelonitrile)2-噻吩甲醛氰醇2-吡啶甲醛氰醇
2-吡咯甲醛氰醇2-呋喃甲醛氰醇2-萘甲醛氰醇很多由式(1)α-羟基腈化合物代表的腈化合物在极性溶剂中分解为醛和氢氰酸。例如，式(1)α-羟基腈化合物转化为上式(2)醛和氢氰酸。由于在这些化合物之间建立了平衡状态，α-羟基腈化合物被酶反应所消耗使平衡向α-羟基腈化合物移动。
另一方面，源于氢氰酸的氰化物和醛可以对酶多肽造成一定损害。因此，由于酶活性降低，以前已知的腈水合酶不能使足量的α-羟基腈化合物水合，从而不会提供足够产量的产物。不过，本发明的腈水合酶即使在氰化物或醛的存在下也保留了酶活性。因而，该酶能够采用从醛和氢氰酸产生的腈化合物作为底物。因此，利用生产α-羟基酰胺的本发明方法，可以从由上式(2)代表的醛化合物和氢氰酸供应式(1)化合物。
本发明的酰胺生产方法优选地是在二价金属离子的存在下进行的。二价金属离子有助于本发明腈水合酶的活性。优选的二价金属离子包括镍离子和钴离子。可以向反应溶液加入这些离子的适当的含水盐。具体而言，可以加入该离子的氯化物盐。
本发明中，腈化合物的水合作用或水解作用可以这样实现，使本发明的酶活性材料与底物化合物或由式(2)代表的醛与氢氰酸混合物接触，该混合物能够在水性溶剂(例如水或缓冲液)中转化为底物化合物。反应溶液优选地含有二价金属离子。
本文所用的术语“水合作用”表示水分子附加于腈基的反应。与“水合作用”相对照，术语“水解作用”表示这样的反应，其中从取代基与腈基连接的化合物中，取代基被水解作用裂解除去。两种反应都包括在本发明的酰胺生产方法中。
关于反应溶液中底物化合物的浓度没有限制。为了防止酶活性被底物化合物所抑制，在α-羟基腈的情况下，浓度例如可以相当于0.1-10w/w％，这是一般而言，优选0.2-5.0w/w％。底物可以在反应开始时一次性加入，但是优选的是连续地或不连续地加入底物，以防止底物浓度过高。
若底物腈化合物在水性溶剂中的溶解度过低，则可以向反应溶液加入洗涤剂。可以使用0.1-5.0w/w％Triton X-100或Tween 60作为洗涤剂。为了增加底物溶解度，可以有效地使用含有有机溶剂的混合溶剂。具体而言，例如通过加入甲醇、乙醇、二甲基亚砜等可以提高反应效率。作为替代选择，本发明的反应可以在不溶于水的有机溶剂中或由水性溶剂与不溶于水的有机溶剂组成的两相系统中进行。可用的与水不可混溶的有机溶剂例如包括乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、氯仿、正己烷、环己烷、辛烷或1-辛醇等。
若底物浓度落在上述范围内，则使用本发明的腈水合酶能够实现有效的酶反应，酶浓度例如是1mU/mL-100U/mL，优选100mU/mL或更高。进而，若使用微生物细胞作为酶活性材料，微生物的用量相对于底物而言优选地从0.01至5.0w/w％，以干细胞计。酶活性材料、例如酶和细胞可以这样与底物接触，将它们溶解或分散在反应溶液中。作为替代选择，有可能使用被化学连接或包埋技术所固定的酶活性材料。进而，反应可以在这样一种状态中进行，其中底物溶液与酶活性材料是用多孔性膜隔离开的，该膜允许底物渗透，但是限制酶分子或细胞的渗透。
反应通常可以在凝固点至-50℃、优选10-30℃的温度下进行0.1-100小时。关于反应溶液的pH没有限制，只要能够维持酶活性即可。由于本发明腈水合酶的最佳pH是5.5至6.5，优选的是调节反应溶液的pH在该范围内。
因而，腈化合物被微生物的水合作用或水解作用转化为对应的酰胺，蓄积在反应溶液中。利用适当的方法可以从反应溶液回收和纯化所产生的酰胺。具体而言，例如联合采用典型方法可以回收和纯化酰胺，例如超滤、浓缩、柱色谱、萃取、活性炭处理、蒸馏等。
本发明提供在腈化合物的存在下使腈水合酶活性稳定的方法，其中该方法是以二价金属离子的共存为特征的。进而，本发明提供生产酰胺的方法，该方法包含在二价金属离子的存在下使腈水合酶与腈化合物反应、再回收所产生的酰胺的步骤。
本发明基于这样的发现，反应系统中二价金属离子的存在显著抑制腈水合酶活性的降低。本发明中，关于腈水合酶的来源没有限制。也就是说，可以使用任何酶，只要该酶具有作用于并使腈化合物腈基水合和转化腈基为酰胺基的活性即可。使α-羟基腈水合为对应的酰胺的腈水合酶是本发明中优选的酶。
可以假定，本发明的二价金属离子实现了抑制腈水合酶活性降低的效果，机理例如如下首先，金属离子与底物化合物的氰醇(cyanohydrin)结构结合，可以增强酶反应。其次，金属离子的结合可以防止氰醇离解。其结果是，减少了反应溶液中氰化物离子的浓度。由于减少了氰化物离子浓度也降低了对酶的抑制作用，也就提高了酶活性。
无论如何，假定这些现象不是特定腈水合酶所特有的，而是普遍见于具有氰醇结构的底物化合物的使用中。这就是为什么关于用在使本发明腈水合酶活性稳定的方法或生产酰胺的方法中的腈水合酶的来源没有限制的原因。
已知能够使腈化合物水合为对应酰胺的酶例如包括源于下列微生物的酶(参见JP-A平04-040899)。
红球菌属棒杆菌属假单胞菌属分节孢子菌属产碱杆菌属芽孢杆菌属炭疽芽孢杆菌(Bacteridium)属微球菌属短杆菌属诺卡氏菌属更具体而言，微生物例如包括如下紫红红球菌ATCC33278红串红球菌IFO12320Corynebacterium nitrilophilus ATCC21419假单胞菌SK87(FERMP-11311)节杆菌(Arthrobacter sp.)HR1(FERM BP-3323)产碱杆菌(Alcaligenes sp.)BC 16-2(FERM BP-3321)红球菌(Rhodococcus sp.)HT40-6(FERM P-11774)JP-B昭62-21519所述微生物其他微生物是公知的，可得自American Type Culture Collection(ATCC)；Institute of Applied Microbiology(IAM)，The University of Tokyo；Fermentation Research Institute，the Agency of Industrial Science andTechnology；KAKEN PHARMACEUTICAL Co.(KCC)；Institute forFermentation，Osaka(IFO)；RESEARCH CENTER FOR PATHOGENICFUNGI AND MICROBIAL TOXICOSES(IFM)，The University of Chiba。另外，能够从上述红球菌Cr4(FERMBP-6596)得到的本发明腈水合酶也是本发明优选的酶之一。
关于用在本发明酰胺生产方法中的腈化合物没有限制。更具体而言，优选的底物例如包括上面关于利用本发明腈水合酶生产α-羟基酰胺的方法所述化合物。
还有可能适宜地仅生产α-羟基酰胺或α-羟基酸的两种旋光活性异构体之一，在反应中使用能够立体定向性使腈水合或水解的酶或含有该酶的微生物。因而，利用本发明的方法，能够得到立体专一性α-羟基酰胺或α-羟基酸，要比以前通过旋光拆分或外消旋化步骤的生产方法更有利得多。
本发明中，腈化合物的水合作用或水解作用例如是这样进行的，使腈水合酶与由式(1)代表的α-羟基腈在水性溶剂中接触，溶剂例如水或缓冲液。若所用腈水合酶对氰化物和醛是耐受性的，反应还可以在由式(2)代表的醛和氢氰酸的存在下进行，它们可以转化为α-羟基腈。除了纯化的酶以外，腈水合酶还可以是能够产生该酶的微生物的溶胞产物、粗酶或使材料固定化所得产物。进而，在本发明中，可以在反应溶液中加入二价金属离子，浓度为0.1mM-1M，一般0.5-100mM，优选1-10mM。
关于用在本发明中的金属离子的类型没有限制，只要该离子能够有效保持腈水合酶的活性即可。例如，钴离子和镍离子是优选的金属离子，它们能够保持腈水合酶的高活性。可以在反应溶液中加入这些金属离子的盐，例如氯化物盐。
本发明中，可以适当调整反应条件，这取决于除了二价金属离子的存在以外，还与腈水合酶联合使用的底物化合物的性质。关于用在反应中的底物化合物的类型和反应条件没有限制。具体而言，例如可以基于使用上述本发明腈水合酶生产α-羟基酰胺的方法所述例证性条件调整反应系统。
本文引用的所有专利、专利申请和出版物都引用在此作为参考。
本文中，关于浓度的“％”表示重量/体积百分率，另有指定除外。
图1显示利用SDS-PAGE测定本发明腈水合酶的分子量。横坐标表示相对迁移率，纵坐标表示分子量(kDa)。
图2显示利用柱色谱、用丁基-Toyopearl650M洗脱本发明腈水合酶。白方形(□)代表OD280，实心圆(●)代表活性，连字符(-)代表(NH4)2SO4。
图3显示利用凝胶过滤测定本发明腈水合酶的分子量。横坐标表示保留时间(分钟)，纵坐标表示分子量(kDa)。
图4显示本发明腈水合酶关于HMBN的Km值，这是用S-V绘图测定的。
图5显示本发明腈水合酶关于HMBN的Km值，这是用Lineweaver-Burk绘图测定的。
图6显示本发明腈水合酶关于3-氰基吡啶的Km值，这是用S-V绘图测定的。
图7显示本发明腈水合酶关于3-氰基吡啶的Km值，这是用Lineweaver-Burk绘图测定的。
图8显示温度对本发明腈水合酶活性的影响。
图9显示本发明腈水合酶的热稳定性。
图10显示pH对本发明腈水合酶活性的影响。
图11显示本发明腈水合酶的pH稳定性。
图12显示红球菌Cr4中基因簇的组织化。由大写字母表示的核苷酸序列相当于ORF。由ORF编码的亚单位名称显示在核苷酸序列右侧。
图13显示在来自红球菌Cr4与紫红红球菌J1的腈水合酶α-亚单位之间的氨基酸对比。在红球菌Cr4(顶行；CrNH-α)与紫红红球菌J1(底行；J1 L-α)之间，相同的氨基酸由星号代表，不同的氨基酸由空格代表。
图14显示在来自红球菌Cr4与紫红红球菌J1的腈水合酶β-亚单位之间的氨基酸对比。在红球菌Cr4(顶行；CrNH-β)与紫红红球菌J1(底行；J1 L-β)之间，相同的氨基酸由星号代表，不同的氨基酸由空格代表。
具体实施例方式
下面参照实施例详细阐述本发明，但是本发明不被解释为仅限于此。
1、酶活性测定方法在下列实施例中采用腈水合酶活性的标准测定方法，如下。用于酶反应的反应溶液的标准组成如表1和2所示。加入3-氰基吡啶或2-羟基-4-甲硫基丁腈(HMBN)作为底物化合物，引发酶反应。在3-氰基吡啶的情况下，在20℃下培育10分钟，在HMBN的情况下，在20℃下培育15分钟。在反应中使用3-氰基吡啶时，向反应加入0.1ml 2N盐酸，剧烈摇动混合物以终止反应；在反应中使用HMBN时，将0.1ml反应溶液加入到0.9ml 0.1％(v/v)磷酸中，剧烈摇动混合物以终止反应。利用HPLC分析反应溶液。
表1含10％(v/v)HMBN的0.1M KPB(pH 6.5) 0.36ml0.1M KPB(pH 6.5)0.64ml酶溶液 0.10ml0.85％(w/v)NaCl水溶液 0.90ml总体积 2.00ml→加入10％(v/v)HMBN，引发反应。
→在摇动的同时，将混合物在20℃下培育10分钟。
→加入0.1％(v/v)H3PO4，终止反应。
→离心。
→HPLC分析。
表20.3M 3-氰基吡啶 1.00ml0.1M KPB(pH 7.0) 0.50ml酶溶液0.10ml0.85％(w/v)NaCl水溶液(NaClaq) 0.90ml
总体积 2.00ml→加入 0.3M 3-氰基吡啶，引发反应。
→在摇动的同时，将混合物在20℃下培育3分钟。
→加入2N HCl，终止反应。
→离心。
→HPLC分析。
用于反应溶液的HPLC分析条件用于HMBN的HPLC分析条件如下柱子 Spherisorb S5ODS2(4.6×150nm)移动相 0.1％(v/v)磷酸/乙腈＝9/1流速 1.0ml/min检测 UV 210nm柱温 40℃关于酶活性的HPLC分析利用HPLC量化所产生的烟酰胺或HMBAm，计算腈水合酶活性。关于HMBAm的HPLC测定条件与HMBN相同。1U被定义为在20℃下1分钟，用标准组成的反应溶液能够产生1μmol烟酰胺的酶量；或者1U被定义为在20℃下1分钟，用标准组成的溶液能够产生1μmolHMBAm的酶量。
蛋白质定量利用来自Bio-Rad的蛋白质测定试剂盒，按照Bradford法测定蛋白质的量(Bradford，M.，Anal，Biochem.，72，248(1976))。
试剂所用DEAE-Sephacel和丁基-Toyopearl 650M由Pharmacia提供；牛血清白蛋白来自Bio-Rad；用于SDS-PAGE的分子量标记来自Pharmacia；用于HPLC的分子量标记来自Oriental Yeast。除非另有指定，其他所用试剂是商业上可得到的专用试剂。
2、培养条件将组成如下的预培养基每5ml等量分配在每支试管(25×200mm)内；将硅酮塞置于试管内，然后高压灭菌。试管冷却后，用铂环接种菌株，然后在28℃下摇动培养两天。
预培养基(pH 7.0)聚胨 5.0g肉膏 5.0gNaCl 2.0g酵母提取物 0.5g蒸馏水 1.0L然后，将预培养物转移至在500ml Sakaguchi烧瓶内高压灭菌过的20ml主培养基。在主培养物中，在培养24小时后用加料针头加入0.75％(v/v)乙腈，然后继续在33℃下摇动培育两天。
主培养基(pH 7.0)乙酰胺 7.5g葡萄糖 10.0gC.S.L. 10.0g酵母提取物 1.0gMgSO4.7H2O 0.5gK2HPO41.0gCoCl2.6H2O 20.0mg蒸馏水 1.0L3、无细胞提取物的制备将相当于500ml培养液的细菌细胞以5倍高的细胞密度悬浮在50mM磷酸盐缓冲液/44mM正丁酸(pH 7.0)中。将所悬浮的细菌细胞在4℃或更低温度下用150W声波处理器201M(Kubota)匀化60分钟。然后，在13,000rpm下离心20分钟，将培养物分离为上清液和沉淀部分。上清液用作下列纯化中的无细胞提取物。
4、硫酸铵级分向无细胞提取物加入硫酸铵到30％饱和度。将混合物用10％(v/v)氨水中和至pH 7.0，然后在4℃下搅拌三小时。然后在13,000rpm下离心30分钟，将溶液分离为上清液和沉淀部分。向上清液部分加入硫酸铵到60％饱和度。将混合物中和至pH 7.0，然后在4℃下搅拌三小时。然后通过离心将溶液分离为上清液和沉淀部分。进而，向上清液部分加入硫酸铵到80％饱和度。搅拌后，将溶液分离为上清液和沉淀部分。将各沉淀悬浮在10mM磷酸盐缓冲液/44mM正丁酸(pH 7.0)中。使溶液对相同缓冲液透析三次。然后测定活性。
5、DEAE-Sephacel柱色谱将已被相同缓冲液充分透析的酶溶液上柱到用10mM磷酸盐缓冲液/44mM正丁酸(pH 7.0)充分平衡过的柱子(φ13×216mm)。然后将柱子用相同缓冲液洗涤。然后，用下列洗脱缓冲液进行洗脱，评估各部分的酶活性。在用10mM磷酸盐缓冲液/44mM正丁酸(pH 7.0)/0.3M KCl洗脱时，在第74-80号级分见到腈水合酶活性。每次所用洗脱缓冲液的体积大约是载体体积的3倍。
10mM磷酸盐缓冲液/44mM正丁酸(pH 7.0)/0.1M KCl10mM磷酸盐缓冲液/44mM正丁酸(pH 7.0)/0.2M KCl10mM磷酸盐缓冲液/44mM正丁酸(pH 7.0)/0.3M KCl10mM磷酸盐缓冲液/44mM正丁酸(pH 7.0)/0.4M KCl6、丁基-Toyopearl 650M柱色谱将含有丁基-Toyopearl的柱子(φ11×89mm)用含有20％饱和度硫酸铵的10mM磷酸盐/44mM正丁酸缓冲液(pH 7.0)充分平衡。向酶溶液加入20％饱和度硫酸铵，搅拌混合物。将酶溶液装上该柱子。将柱子用相同缓冲液洗涤。然后，用下列洗脱缓冲液进行洗脱，评估各部分的酶活性。在用10mM磷酸盐缓冲液/44mM正丁酸(pH 7.0)/15％饱和度硫酸铵洗脱时，在第58-66部分见到腈水合酶活性。每次所用洗脱缓冲液的体积大约是载体体积的3倍。
10mM磷酸盐缓冲液/44mM正丁酸(pH 7.0)/15％饱和度硫酸铵10mM磷酸盐缓冲液/44mM正丁酸(pH 7.0)/10％饱和度硫酸铵10mM磷酸盐缓冲液/44mM正丁酸(pH 7.0)/5％饱和度硫酸铵7、SDS-PAGE利用SDS-PAGE分析所得纯化的酶。SDS-PAGE是按照Laemmli的方法进行的(Laemmli，U.K.Nature，227，pp680，1970)。也就是说，在含有Tris/甘氨酸缓冲液的12％聚丙烯酰胺平板凝胶中进行电泳。将酶溶液与样本缓冲液的等体积混合物在90℃下加热处理约10分钟。将凝胶用库马斯艳蓝R-250染色；退色是用乙醇/乙酸/dH2O(体积比2/3/6)进行的。结果如图1所示。揭示了纯化的酶由α-亚单位(26.8kDa)和β-亚单位(29.5kDa)组成。
8、HPLC凝胶过滤按照上述方法纯化腈水合酶。首先，通过离心将匀化的细菌细胞悬液分离为上清液和沉淀部分。在上清液部分中含有活性，因而使用上清液作为无细胞提取物。将无细胞提取物用硫酸铵级分，其结果是在硫酸铵浓度为30-60％饱和度的级分中含有活性。对活性级分进行DEAE-Sephacel柱色谱。收集从DEAE-Sephacel柱洗脱的活性级分(No.74-80)，然后进行丁基-Toyopearl 650M柱色谱。使用从丁基-Toyopearl650M柱洗脱的活性级分(No.58-66)作为纯化的酶(图2)。
最后，关于红球菌Cr4的腈水合酶，总蛋白质含量为5.32mg；比活性477U/mg；收率44％；比活性13.9倍(表3)。纯化的酶被SDS-PAGE评估为同源的。在标准条件下，最终纯化的酶的比活性关于用作底物的HMBN是880U/mg，关于3-氰基吡啶是477U/mg。
表3步骤 总蛋白质 总活性 比活性 纯化 收率(mg) (U)(U/mg) (倍数) (％)1.无细胞提取物 167 5740 34.4 11002.(NH4)2SO4级分56.6 5220 92.2 2.68 913.DEAE-Sephacel18.7 4030 2156.25 704.丁基-Toyopearl 650M 5.32 2540 47713.9 441U酶被定义为在1分钟内，在标准条件下，从3-氰基吡啶(cyanopyridine)催化产生1μmol烟酰胺(nicotinamide)的量。
在表4所示条件下利用凝胶过滤分析约2.3μg纯化酶，以测定分子量；基于分子量标记的保留时间计算，推断酶在自然状态下的分子量为约112.5kDa(图3)。
HPLC凝胶过滤用于腈水合酶分子量的HPLC分析条件如表4所示。所用分子量标记来自Oriental Yeast。
表4
柱子TSK凝胶G-3000SW(0.75×60cm)溶剂0.1M KPB(pH 7.5)+0.2M KCl流速0.7ml/min注射5μl检测280nm9、底物浓度的影响(Km值)利用S-V绘图(图4)和Lineweaver-Burk绘图(图5)测定关于HMBN的Km值。向含有不同浓度HMBN的溶液加入0.0585U酶，在20℃下培育15分钟。利用HPLC分析反应。利用Lineweaver-Burk绘图测定关于HMBN的Km值为1.43mM，这表明酶对HMBN具有很高的亲合性。
另外，利用S-V绘图(图6)和Lineweaver-Burk绘图(图7)测定关于3-氰基吡啶的Km值。类似地，向含有不同浓度3-氰基吡啶的溶液加入0.0265U酶，在20℃下培育15分钟。利用HPLC分析反应。利用Lineweaver-Burk绘图测定关于3-氰基吡啶的Km值为1.38mM，这表明酶对3-氰基吡啶也具有很高的亲合性。
10、温度的影响评价了纯化酶的最佳温度和热稳定性。利用如表1所示标准组成的反应溶液，将2.92U酶在每种温度下(10、20、30、35、40、45、50、55、60或65℃)培育15分钟，以评估最佳温度(图8)。在45℃下，酶反应速率最大。进而，将2.92U酶在每种温度下(10、20、30、40、50或60℃)加热处理30分钟，然后在标准反应条件下评估热稳定性。将酶在50℃下处理后，剩余活性为77％(图9)。
11、pH的影响评价了纯化酶的最佳pH和pH稳定性。利用如表1所示标准组成的反应溶液，将2.92U酶在20℃每种缓冲液中(柠檬酸钠或Tris-HCl缓冲液，最终浓度为50mM)培育15分钟，代替磷酸盐缓冲液，以测定最佳pH。最佳pH为6.0(图10)。
进而，将2.92U酶在20℃每种缓冲液中(柠檬酸钠、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl、甘氨酸/NaOH或Na2HPO4/NaOH缓冲液，最终浓度为50mM)培育30分钟，然后在标准反应条件下测定剩余活性，以评估pH稳定性。将酶在pH 4.0-9.0下处理30分钟后，剩余活性几乎为100％(图11)。
12、底物特异性检查了酶的底物特异性。利用如表2所示标准组成反应溶液，将2.92U酶与各种类型底物培育，代替3-氰基吡啶；利用HPLC分析反应溶液中酰胺的产生。因而，测定相对活性。所加入的底物化合物类型、其最终浓度、反应时间和用于分析对应于各底物的产物的HPLC条件如表6所示。HPLC条件(1)-(9)列在表6之后。
纯化的腈水合酶显示底物特异性，与休息细胞反应非常相似；丙二腈、正丁腈和2-氰基吡啶是适合的底物。关于HMBN的相对活性是154％，关于3-氰基吡啶的活性被视为100％(表5)。
表5底物 相对活性(％) 底物 相对活性(％)3-氰基吡啶 1003-氰基吡啶*76.52-氰基吡啶 223正丁腈*3794-氰基吡啶 127异丁腈*40.9丙烯腈 114正戊腈*118异丁烯腈 93.7 异戊腈*2.71巴豆腈 87.4 正己腈*18.1乙腈 14.6 3-吲哚基乙腈*2.33丙腈 173苄腈*138HMBN 154邻-氯苄腈*58.6KCN0 间-氯苄腈*7.18丙二腈 673对-氯苄腈*28.46.162-氰基乙酰胺 46.3氰基吡嗪 114反应在20℃下进行，酶的用量为2.92U。星号“*”表示加入甲醇以提高底物溶解度(最终浓度＝20％v/v)。
表6底物 最终浓度(mM) 反应时间(min) HPLC条件
3-氰基吡啶15015(1)3-氰基吡啶*15015(1)2-氰基吡啶12510(1)4-氰基吡啶12510(1)丙烯腈2503 (5)异丁烯腈 1505 (1)巴豆腈1505 (1)乙腈 25010(4)丙腈 1505 (4)正丁腈*15010(2)苄腈*50 10(3)邻-氯苄腈*25 5 (3)间-氯苄腈*25 5 (3)对-氯苄腈*25 5 (3)丙二腈2503 (6)异丁腈*15010(7)正戊腈*15010(7)异戊腈*15010(7)正己腈*15010(9)氰基吡嗪 15010(8)3-吲哚基乙腈*50 5 (9)HPLC条件如下(1)柱子Waters Spherisorb 5μODS2(4.6×150mm)；溶剂10mM KH2PO4(pH 2.8)/乙腈(v/v)＝9∶1；流速1.0ml/min；检测230nm；注射体积5μl。
(2)柱子Waters Spherisorb 5μODS2(4.6×150mm)；溶剂10mM KH2PO4(pH 2.8)/乙腈(v/v)＝9∶1；流速1.0ml/min；检测230nm；
注射体积5μl。
(3)柱子Waters Spherisorb 5μODS2(4.6×150mm)；溶剂5mM KH2PO4(pH 2.8)/乙腈(v/v)＝12∶7；流速1.0ml/min；检测230nm；注射体积5μl。
(4)柱子Waters Spherisorb 5μODS2(4.6×150mm)；溶剂10mM KH2PO4(pH 2.5)/乙腈(v/v)＝99∶1；流速1.0ml/min；检测210nm；注射体积5μl。
(5)柱子Waters Spherisorb 5μODS2(4.6×150mm)；溶剂10mM KH2PO4(pH 2.5)/乙腈(v/v)＝99∶1；流速1.0ml/min；检测230nm；注射体积5μl。
(6)柱子Spherisorb S5ODS2(4.6×150mm)；溶剂0.1％(v/v)磷酸盐/乙腈(v/v)＝99∶1；流速1.0ml/min；检测210nm；注射体积5μl。
(7)柱子Spherisorb S5ODS2(4.6×150mm)；溶剂0.1％(v/v)磷酸盐/乙腈(v/v)＝9∶1；流速1.0ml/min；检测210nm；注射体积5μl；温度40℃。
(8)柱子Spherisorb S5ODS2(4.6×150mm)；溶剂0.1％(v/v)磷酸盐/乙腈(v/v)＝9∶1；流速1.0ml/min；检测230nm；
注射体积5μl；温度40℃。
(9)柱子Spherisorb S5ODS2(4.6×150mm)；溶剂5mM KH2PO4(pH 2.8)/乙腈(v/v)＝12∶7；流速1.0ml/min；检测210nm；注射体积5μl；温度40℃。
13、抑制剂对酶活性的影响研究了酶的抑制剂。利用如表1所示标准组成的反应溶液，向含有2.92U酶的溶液加入各种抑制剂，最终浓度为1.0mM或0.1mM；将混合物在20℃下培育10分钟后，进行15分钟反应。酶活性显著被羰基试剂所抑制，例如苯肼和羟胺(表7)。
表7各种化合物对腈水合酶活性的影响化合物(1.0mM) 相对活性(％)游离 100碘乙酸酯 97.0N-乙基马来酰亚胺 101对-氯汞基苯甲酸酯 97.75-5’-dithiobis(0.1mM)99.1羟胺 62.1苯肼 8.19半胱胺106D-环丝氨酸94.8EDTA 101钛试剂(Tiron) 132二硫代氨基甲酸二乙酯 97.7尿素 95.7NaN398.5二硫苏糖醇93.4
将酶与各种化合物在20℃下培育20分钟，测定酶活性。
14、金属离子对酶活性的影响研究了金属离子对酶反应的影响。利用如表1所示标准组成的反应溶液，向含有2.92U酶的溶液加入各种金属离子，最终浓度为1.0mM；将混合物在20℃下培育10分钟后，进行15分钟反应。酶活性显著被重金属离子所抑制，例如能够特异性相互作用于SH基的Ag+和Hg++离子。相反，Ni++或Co++离子的加入提高酶活性(表8)。
表8金属离子对腈水合酶活性的影响金属(1.0mM) 相对活性(％)游离100CaCl296.4MnCl296.7NiCl2196CoCl2154ZnSO484.1CuSO4109FeSO478.9FeCl3100AgNO37.85HgCl27.48将酶与金属离子在20℃下培育10分钟，测定酶活性。
15、共存的Ni++和Co++离子对酶活性的影响已经揭示了向反应系统加入Ni++或Co++离子可提高酶活性。利用如表1所示标准组成的反应溶液，向含有2.92U酶的溶液加入Ni++或Co++离子，浓度为0-8.0mM；研究它对酶活性的影响。在加入1.0-2.0mM浓度的Ni++或Co++离子时，酶活性提高2倍或1.5倍。随着加入高于上述浓度的金属离子，这种提高作用削弱了(表9和10)。
表9钴离子对腈水合酶活性的影响CoCl2(mM) 相对活性(％)
0 1000.5 1291.0 1502.0 1534.0 1436.0 1368.0 127将酶与镍离子在20℃下培育5分钟，测定酶活性。
表10NiCl2(mM)相对活性(％)0 1000.5 1711.0 1972.0 1964.0 1956.0 1848.0 185将酶与镍离子在20℃下培育5分钟，测定酶活性。
16、共存Ni++离子的影响如表10所示，向反应系统加入1.0mM浓度的Ni++离子可提高两倍本发明腈水合酶的酶活性。然后，利用如表2所示标准组成的反应溶液，向含有2.92U酶的溶液加入各种类型底物，代替3-氰基吡啶，以研究它们对活性的影响。在使用HMBN或扁桃腈作为底物时，活性仅提高两倍。假定在底物是α-羟基腈时，Ni++离子的加入特异性地提高反应效率(表11)。
表11底物 游离 NiCl2(1mM)HMBN 100 1963-氰基吡啶 100 992-氰基吡啶 100 974-氰基吡啶 100 99
正丁腈 100 94巴豆腈 100 103(chlotononitrilile)扁桃腈 100 201(manderonitlile)乙烯氰醇 100 91氨基乙腈 00羟乙腈 003-氨基丙腈 100 97β-氨基巴豆腈00使用2.92U酶，在20℃下延长培育10分钟。
17、N-末端氨基酸序列的测定在Applied Biosystem的470A型Procise序列分析仪中分析来自红球菌Cr4菌株的腈水合酶的α-亚单位和β-亚单位的N-末端氨基酸序列。α-亚单位的N-末端15个残基是TAHNPVQGTFPRSNE(SEQ ID NO5)，β-亚单位的是MDGIHDLGGRAGLGP(SEQ ID NO6)。
与来自紫红红球菌J1菌株的低分子量腈水合酶对比，α-亚单位的N-末端15个残基序列表现93％同一性，β-亚单位的表现100％同一性(表12/α-亚单位；表13/β-亚单位)。
表12菌株N-末端氨基酸序列 同一性(％)红球菌Cr4 1 TAHNPVQGTFPRSNE 15 -紫红红球菌J1(低)1 TAHNPVQGTLPRSNE 15 93枯草芽孢杆菌211 VVSNPLAGSRPRSND 225 47表13菌株N-末端氨基酸序列 同一性(％)红球菌Cr4 1 MDGIHDLGGRAGLGP 15 -紫红红球菌J1(低)1 MDGIHDLGGRAGLGP 15 100紫红红球菌J1(高)1 MDGIHDTGGMTGYGP 15 73恶臭假单胞菌1 MNGIHDTGGAHGYGP 15 67绿针假单胞菌B23 1 MDGFHDLGGFQGFGK 15 67
19、共存的NiCl2和CoCl2对休息细胞反应(resting cell reaction)的影响将下列组成的预培养基每5ml等量分配到每支试管(25×200mm)内；将硅酮塞置于试管内，然后高压灭菌。
预培养基(pH 7.0)聚胨 5.0g肉膏 5.0gNaCl 2.0g酵母提取物 0.5g蒸馏水 1.0L试管冷却后，将红球菌Cr4或紫红红球菌ATCC 332878菌株用铂环接种在预培养基中，然后在28℃下摇动培养两天。然后，将红球菌Cr4的预培养物转移至主培养基1；将紫红红球菌ATCC 332878的预培养物转移至主培养基2。将二者在33℃下摇动培养两天。收获细菌细胞，洗涤，然后进行如表14所示反应，以研究所加入的NiCl2和CoCl2的影响。
在向反应系统加入1mM最终浓度的NiCl2或CoCl2时，见表15，共存的NiCl2或CoCl2提高腈水合酶活性，因而这些离子的加入具有积极影响。
主培养基1(用于红球菌Cr4)(pH 7.0)乙酰胺7.5g葡萄糖10.0gC.S.L.10.0g酵母提取物1.0gMgSO4.7H2O 0.5gK2HPO41.0gCoCl2.6H2O 10.0mgFeSO4.7H2O 10.0mg蒸馏水1L主培养基2(用于紫红红球菌ATCC 332878)(pH 7.0)ε-己内酰胺 5.0g葡萄糖10.0g
C.S.L.10.0g酵母提取物1.0gMgSO4.7H2O 0.5gK2HPO41.0gCoCl2.6H2O 20.0mg蒸馏水1L将每种培养基每20ml等量分配到500ml Sakaguchi烧瓶内，在高压灭菌后使用。
表14含10％(v/v)HMBN的0.1M KPB(pH 6.5) 0.36ml0.1M KPB(pH 6.5) 0.64ml细胞悬浮溶液(最终0.5倍) 0.10ml0.85％(w/v)NaCl水溶液 0.90，0.80ml20mM NiCl2或CoCl20.00，0.10ml总体积 2.00ml→加入HMBN(反应开始)。
→将混合物在20℃下摇动培育15分钟。
→加入0.1％(v/v)H3PO4(反应终止)。
→离心。
→HPLC分析。
表15相对活性(％)红球菌Cr4 ATCC 332878游离 100*100**NiCl2186 193CoCl2137 123*118μmol/ml/min**30.5μmol/ml/min在休息细胞反应中，加入NiCl2或CoCl2也提高了酶活性。
20、氰化物离子的影响研究了氰化物离子对源于红球菌Cr4的本发明腈水合酶和源于紫红红球菌J1的已知腈水合酶(Biochimica et Biophysica Acta.1129(1991)23-33)的影响。利用下列标准组成的反应溶液，向反应系统加入0mM-20mM氰化物离子(KCN)。在没有底物(3-氰基吡啶)的存在下，将反应溶液在20℃下培育30分钟后，向其中加入底物，引发酶反应。酶在20℃下反应10分钟后，向其中加入0.1ml 2N盐酸，剧烈摇动混合物，以终止反应。利用与第1节所述相同的方法，用HPLC分析反应溶液。
标准反应溶液0.5M 3-氰基吡啶 0.5ml0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.5) 0.25ml酶溶液 0.1ml总体积 1.0ml在红球菌Cr4腈水合酶的情况下，酶的用量为288U/ml；在紫红红球菌J1腈水合酶的情况下，酶的用量为61U/ml。见表16，紫红红球菌J1的腈水合酶在lmM氰化物离子的存在下被完全抑制了，但是红球菌Cr4的腈水合酶在1mM氰化物离子的存在下保留47％的活性，在5mM氰化物离子的存在下保留17％的活性。
表16KCN(mM) Cr4J10 100％ 100％1 47 05 17 01011 0158 0203 021、N-末端氨基酸序列的测定对从红球菌Cr4纯化的腈水合酶进行SDS-PAGE。将蛋白质用AE6678-P型Horiz-Blot电泳仪(ATTO)电转移至PVDF膜上，然后用酰胺黑染色。切下对应于α-亚单位和β-亚单位的部分，在473A型气相肽序列分析仪(Applied Biosystem)中对每种亚单位蛋白质进行自动埃德曼降解，从而得到PTH氨基酸衍生物。在120A型PTH氨基酸衍生物分析仪(Applied Biosystem)中分析α-亚单位和β-亚单位的N-末端氨基酸序列。
α-亚单位的N-末端序列是TAHNPVQGTFPRSNE(SEQ ID NO5)；β-亚单位的是MDGIHDLGGRAGLGPI(SEQ ID NO7)。与来自紫红红球菌J1的低分子量腈水合酶的α-亚单位的N-末端序列对比，α-亚单位的序列表现93％的同一性(L位于J1中的氨基酸残基10)；β-亚单位与来自紫红红球菌J1的等价物表现100％的同一性。
因而，来自紫红红球菌J1的腈水合酶α-亚单位和β-亚单位的N-末端氨基酸序列几乎等同于来自红球菌Cr4的。进而，已知前人报道的腈水合酶的α-亚单位共享高度同源性一级结构。因而，使用来自紫红红球菌J1腈水合酶α-亚单位的基因片段作为探针DNA，进行Rhodococcus sp.Cr4的腈水合酶基因的克隆。进而，来自紫红红球菌J1腈水合酶β-亚单位的基因片段用于评价红球菌Cr4腈水合酶基因的完整区域是否被成功地克隆。
22、探针DNA的制备在紫红红球菌J1中存在两种类型的腈水合酶，也就是低分子量形式和高分子量形式。因此，首先选择紫红红球菌J1中低分子量腈水合酶基因的一级结构区域，其序列不同于高分子量形式的对应区域。具体而言，所选择的各氨基酸序列如下所述。
α-亚单位有义引物区(sense primer region)QGTLPRSN(SEQ ID NO8)反义引物区(antisense primer region)PDPDVEIR(SEQ ID NO9)β-亚单位有义引物区PHDYLTSQ(SEQ ID NO10)反义引物区PNVVNHID(SEQ ID NO11)然后，基于氨基酸序列，真正设计用于特异性扩增一部分低分子量腈水合酶基因的PCR引物。最后，设计包含下列核苷酸序列的引物。
用于扩增的α-亚单位基因片段有义引物5′-cagggcacgttgccacgatcg-3′(SEQ ID NO12)反义引物5′-cggatctcgacgtcagggtcg-3′(SEQ ID NO13)
用于扩增的β-亚单位基因片段有义引物5′-cgcacgactacctgacctcgc-3′(SEQ ID NO14)反义引物5′-cgatgtgattgactacgttcgg-3′(SEQ ID NO15)然后，按照Ausbel等的方法从紫红红球菌J1制备基因组DNA(Ausbel，FM et alUNIT 2.4，Preparation of Genomic DNA from Bacteria inCurrent Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons，New York)1987)。进而，利用相同的方法还从红球菌Cr4的培养细胞制备基因组DNA。
利用PCR扩增紫红红球菌J1的一部分低分子量腈水合酶基因，使用Taq DNA 30(Takara Shuzo)和下列循环在94℃下变性1分钟，在60℃下退火90秒钟，在72℃下延长90秒钟，使用10ng所得基因组DNA作为模板。对扩增后的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳，然后使用RECOCHIP(Takara Shuzo)从凝胶收集之。
使用用于α-亚单位基因片段扩增的引物进行PCR扩增，并使用来自紫红红球菌J1和红球菌Cr4的基因组DNA作为模板，从两种菌株得到约450bp的扩增产物。不过，在使用来自红球菌Cr4的基因组DNA作为模板时，PCR扩增的效率较低。因而，使用紫红红球菌J1的基因组DNA作为模板扩增的片段用作随后实验的探针DNA。
利用DIG标记试剂盒(Boehringer Manheim)，按照随机启动法将所扩增的源于紫红红球菌J1的DNA片段用地高辛配基标记。被地高辛配基标记的DNA片段在随后的DNA印迹分析和集落杂交中用作探针DNA。
23、DNA印迹分析将红球菌Cr4的基因组DNA用各种限制酶消化，使用来自源于紫红红球菌J1的腈水合酶α-亚单位的探针DNA进行DNA印迹分析。将10μg来自红球菌Cr4的基因组DNA用PstI、SphI和BanIII(Toyobo)完全消化，然后使1μg等份消化产物在0.8％琼脂糖凝胶上电泳。按照随附手册的指导，在785型真空印迹仪(Bio-Rad)中，将DNA转移至尼龙膜NY13N(Schleicher & Schuel)上。在自动交联仪CL-1000(BMEquipment)中，将DNA固定在膜上。使所得膜与探针DNA在60℃下杂交过夜，然后在室温下洗涤5分钟，然后在60℃下洗涤15分钟。按照随附手册的指导，将由CDP-Star所致化学发光在Fuji RX胶片上曝光，利用DIG检测试剂盒(Boehringer Manheim)检测信号。
DNA印迹分析揭示了3.2kb、4.2kb和7.8kb的单一谱带分别在来自用PstI、SphI和BanIII消化的红球菌Cr4的基因组DNA栏中。发现Rhodococcus sp.Cr4的腈水合酶基因是单拷贝基因。从由PstI消化产物所制备的基因组文库克隆Rhodococcus sp.Cr4的腈水合酶基因。
24、红球菌Cr4基因组文库的制备和集落杂交将质粒pBluescript II SK(+)(Stratagene)用PstI消化，然后利用细菌碱性磷酸酶(Takara Shuzo)脱磷酸化。将红球菌Cr4的基因组DNA用PstI消化，然后利用T4 DNA连接酶(Takara Shuzo)连接到上述pBluescript IISK(+)上。然后，利用上述载体转化大肠杆菌DH5α。
按照Sambrook等的方法进行集落杂交(Molecular cloning(ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor)1989)。具体而言，将硝基纤维素膜置于含有50μg/ml氨苄西林的LB琼脂平板上，将所得转化体涂铺其上。将平板在37℃下培育过夜。有集落生成后，将备好的复制滤膜(replica filter)置于琼脂平板上，在其上培养。在复制滤膜上生成集落后，将滤膜转移至含有200μg/ml氯霉素的琼脂平板上。将平板在37℃下培育24小时。将滤膜用SDS和碱处理，以溶解集落。然后，在与DNA印迹分析所用相同的条件下进行集落杂交。因而，从大约2000个集落得到阳性克隆。
25、阳性克隆的分析培养阳性克隆后，利用碱-SDS法制备质粒；该质粒名为pNHCr4P。质粒pNHCr4P含有约3.2kb的DNA插入片段。
为了确认pNHCr4P的DNA插入片段含有β-亚单位基因，利用PCR制备探针DNA，其中使用用于β-亚单位基因片段扩增的引物，并使用紫红红球菌J1的基因组DNA作为模板。利用这种探针DNA，利用DNA印迹分析pNHCr4P。结果确认约3.2kb的插入片段含有β-亚单位基因。
使用377A型DNA序列分析仪(Applied Biosystem)和Taq引物循环测序试剂盒(Applied Biosystem)，利用二脱氧链终止法分析pNHCr4P中DNA插入片段(约3.2kb)的核苷酸序列。所测定的核苷酸序列如SEQID NO16所示。测序结果显示，pNHCr4P中PstI DNA插入片段的大小为3205bp，并且存在ORF(图12)。红球菌Cr4中基因簇的组织化与紫红红球菌J1中含有低分子量腈水合酶基因的区域非常相似(Komeda et alProc Natl Acad Sci USA 9436-41，1997)。
26、一级结构的分析从PstI片段核苷酸245-2100的区域推导的α-亚单位和β-亚单位的一级结构分别如SEQ ID NO2和SEQ ID NO4所示。α-亚单位和β-亚单位的N-末端氨基酸序列与利用蛋白质测序仪测定的结果完全一致。另外，α-亚单位和β-亚单位与来自紫红红球菌J1的腈水合酶都表现最大程度的同源性。
表17α β紫红红球菌J1(低分子量型) 92％ 87％红球菌 65％ 45％恶臭假单胞菌 59％ 37％芽孢杆菌BR44960％ 38％Mesorhizobium loti 56％ 38％苜蓿中华根瘤菌 55％ 39％红球菌(Rhodococcus sp.)M852％ 37％紫红红球菌J1(高分子量型) 52％ 37％红串红球菌(R.erythropolis) 50％ 35％绿针假单胞菌B23 50％ 31％Brevibacterium sp.R312 50％ ？专利WO 95/04828 42％ 34％腈水合酶α-亚单位的207个残基中有17个氨基酸残基在红球菌Cr4(SEQ ID NO2)与紫红红球菌J1(SEQ ID NO18)之间是不同的。进而，腈水合酶β-亚单位的227个残基中有29个氨基酸残基在红球菌Cr4(SEQ ID NO4)与紫红红球菌J1(SEQ ID NO19)之间是不同的(图13和14)。
工业实用性本发明提供能够从作为底物的2-羟基-4-甲硫基丁腈产生2-羟基-4-甲硫基丁酰胺的腈水合酶。2-羟基-4-甲硫基丁酰胺作为饲料添加剂是一种有用的化合物(甲硫氨酸代用品)。
本发明不仅提供能够通过酶作用产生2-羟基-4-甲硫基丁酰胺的腈水合酶，而且在本发明中还克隆了编码基因。本发明的腈水合酶能够在适当用编码由本发明所提供的腈水合酶的基因转化的宿主细胞中被高水平地表达。因而，可以按照本发明获得的转化体本身或者从转化体得到的酶蛋白质可用于通过酶作用产生2-羟基-4-甲硫基丁酰胺。很多已知通过基因重组生产的腈水合酶不能达到很高的酶活性，而本发明的腈水合酶的优异之处在于即使是基因重组体也保留很高的活性。
进而，本发明的腈水合酶在氰化物或醛的存在下仍保留很高的酶活性。在极性溶剂中，作为底物化合物的α-羟基腈分解为氢氰酸和醛。氢氰酸转化为氰化物，这经常减少酶的活性。醛也对蛋白质造成损害，减少酶的活性。已知的腈水合酶不是工业上可实用的原因之一是这些氰化物和醛减少酶的活性。
本发明的水合酶即使在氰化物或醛的存在下也保留酶活性。因此，从醛和氢氰酸产生的α-羟基腈可以用作底物。因而，本发明的腈水合酶可用于使用α-羟基腈作为原料生产酰胺的方法。
序列表<110>大赛璐化学工业株式会社(DAICEL CHEMICAL INDUSTRIES，LTD.)<120>腈水合酶和生产酰胺的方法<130>D1-A0102Y1P<140>
<141>
<150>JP 2001-59023<151>2001-03-02<150>JP 2002-16222<151>2002-01-24<160>18<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>681<212>DNA<213>红球菌(Rhodococcus sp.)<220>
<221>CDS<222>(1)..(681)<400>1atg gat ggt atc cac gat ctg ggc ggg cgc gcc ggt ctg ggg ccg gtc 48Met Asp Gly Ile His Asp Leu Gly Gly Arg Ala Gly Leu Gly Pro Val1 5 10 15aat ccc gaa ccc ggt gag ccg gtc ttt cat tct cgt tgg gag cgg tcg 96Asn Pro Glu Pro Gly Glu Pro Val Phe His Ser Arg Trp Glu Arg Ser20 25 30gtt ttg acg atg ttt ccg gcc atg gcg tta gcc ggg gcg ttc aac ctc 144Val Leu Thr Met Phe Pro Ala Met Ala Leu Ala Gly Ala Phe Asn Leu35 40 45gac cag ttc cgg ggc gcg atg gaa cag att ccc ccg cac gac tat ctg 192
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tggactcgta cagagcgcca gcggctggca tcggttgtcg gcgccgtcgt gatcctgcat 2520gtattgggcg tggccctgta tgtgggatac tccggtaatc cagcagccgc cggaggcctc 2580gccggatccg gtgtgctcgc ctacgtgctc ggcgtccgcc acgcattcga cgccgatcac 2640ctcgctgcca tcgatgacac cacgcgcctg atgctgttgc gcggacgccg tccggtcggg 2700gtcgggttct tcttcgcgat gggacactcg accgtcgtca ttgtccttgc tctggtcgtg 2760gcgctgggcg ccagctccct gaccacgagt gagctcgagg gggtccagga gatcggcgga 2820atggtcgcga cggtcgtcgc cgtagccttc ttgctggtcg tcgccggact caacagcgtg 2880gtcctgcgca atctgctctc cctggcccga cgggtgcgga ccggggcgga catcgcaggt 2940gatctcgaga gcagcctcag cgagcgtggg ttgttcgccc ggctgctcgg tgcccgctgg 3000cgtggactga ttcgttcgtc ctggcacatg tatccggtcg ggctgttgat ggggctcggg 3060ctcgagaccg catccgaggt caccctgctc actctcactg cttcggcggt gaccgggggc 3120accttgtccg tggctgcagc gggctcacgg acggatcggc cgccagatag tcgctcgcgg 3180tgcgcgccag atgccagttc tgcag 3205<210>17<211>207<212>PRT<213>紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)<400>17Met Thr Ala His Asn Pro Val Gln Gly Thr Leu Pro Arg Ser Asn Glu1 5 10 15Glu Ile Ala Ala Arg Val Lys Ala Met Glu Ala Ile Leu Val Asp Lys20 25 30Gly Leu Ile Ser Thr Asp Ala Ile Asp His Met Ser Ser Val Tyr Glu35 40 45Asn Glu Val Gly Pro Gln Leu Gly Ala Lys Ile Val Ala Arg Ala Trp50 55 60Val Asp Pro Glu Phe Lys Gln Arg Leu Leu Thr Asp Ala Thr Ser Ala65 70 75 80Cys Arg Glu Met Gly Val Gly Gly Met Gln Gly Glu Glu Met Val Val85 90 95Leu Glu Asn Thr Gly Thr Val His Asn Met Val Val Cys Thr Leu Cys100 105 110Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Val Leu Gly Leu Pro Pro Asn Trp Tyr Lys115 120 125
Tyr Pro Ala Tyr Arg Ala Arg Ala Val Arg Asp Pro Arg Gly Val Leu130 135 140Ala Glu Phe Gly Tyr Thr Pro Asp Pro Asp Val Glu Ile Arg Ile Trp145 150 155 160Asp Ser Ser Ala Glu Leu Arg Tyr Trp Val Leu Pro Gln Arg Pro Ala165 170 175Gly Thr Glu Asn Phe Thr Glu Glu Gln Leu Ala Asp Leu Val Thr Arg180 185 190Asp Ser Leu Ile Gly Val Ser Val Pro Thr Thr Pro Ser Lys Ala195 200 205<210>18<211>226<212>PRT<213>紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)<400>18Met Asp Gly Ile His Asp Leu Gly Gly Arg Ala Gly Leu Gly Pro Ile1 5 10 15Lys Pro Glu Ser Asp Glu Pro Val Phe His Ser Asp Trp Glu Arg Ser20 25 30Val Leu Thr Met Phe Pro Ala Met Ala Leu Ala Gly Ala Phe Asn Leu35 40 45Asp Gln Phe Arg Gly Ala Met Glu Gln Ile Pro Pro His Asp Tyr Leu50 55 60Thr Ser Gln Tyr Tyr Glu His Trp Met His Ala Met Ile His His Gly65 70 75 80Ile Glu Ala Gly Ile Phe Asp Ser Asp Glu Leu Asp Arg Arg Thr Gln85 90 95Tyr Tyr Met Asp His Pro Asp Asp Thr Thr Pro Thr Arg Gln Asp Pro100 105 110
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1.具有下列物理化学性质的腈水合酶(a)作用于腈化合物的腈基，水合腈基并将其转化为酰胺基；和(b)是氰化物耐受性的。
2.具有下列物理化学性质的腈水合酶(1)在用凝胶过滤法测定时，分子量大约是110,000Da，利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法可分离为26.8kDa和29.5kDa的两个亚单位；(2)作用于腈化合物的腈基，使腈基水合，将其转化为酰胺基；(3)使腈基水合的活性最大的最佳pH在pH5.5至6.5；(4)使腈基水合的活性最大的最佳温度在40至45℃；(5)酶的pH稳定性在pH4至9内；(6)热稳定性，以便在50℃下热处理30分钟后，该酶保留70％或更多的活性；(7)被HgCl2、AgNO3、羟胺或苯肼所抑制。
3.根据权利要求1和2任意一项的腈水合酶，其中所述腈水合酶进一步具有下列物理化学性质(c)底物特异性，其中该酶使用2-羟基-4-甲硫基丁腈作为底物，产生2-羟基-4-甲硫基丁酰胺。
4.根据权利要求1和2任意一项的腈水合酶，其中所述腈水合酶进一步具有下列物理化学性质(d)稳定性，其中该酶被二价金属离子所稳定。
5.根据权利要求1和2任意一项的腈水合酶，其中所述腈水合酶是源于已被保藏的红球菌Cr4菌株的，入藏号为FERM BP-6596。
6.生产根据权利要求1和2任意一项的腈水合酶的方法，所述方法包含培养已被保藏的红球菌Cr4菌株的步骤，入藏号为FERMBP-6596。
7.蛋白质复合体，由被下列多核苷酸(A)至(E)任意一个所编码的α-亚单位和被下列多核苷酸(a)至(e)任意一个所编码的β-亚单位组成，其中所述蛋白质复合体具有下列物理化学性质(i)和(ii)(i)作用于腈化合物的腈基，使腈基水合，将其转化为酰胺基；(ii)底物特异性，其中该酶使用2-羟基-4-甲硫基丁腈作为底物，产生2-羟基-4-甲硫基丁酰胺；α-亚单位(A)包含核苷酸序列SEQ ID NO1的多核苷酸；(B)编码包含氨基酸序列SEQ ID NO2的蛋白质的多核苷酸；(C)编码包含氨基酸序列SEQ ID NO2的蛋白质的多核苷酸，它含有一个或多个氨基酸取代、缺失、插入和/或添加；(D)能够在严格条件下与包含核苷酸序列SEQ ID NO1的多核苷酸杂交的多核苷酸；(E)编码与氨基酸序列SEQ ID NO2具有70％或更高同一性的蛋白质的多核苷酸；β-亚单位(a)包含核苷酸序列SEQ ID NO3的多核苷酸；(b)编码包含氨基酸序列SEQ ID NO4的蛋白质的多核苷酸；(c)编码包含氨基酸序列SEQ ID NO4的蛋白质的多核苷酸，它含有一个或多个氨基酸取代、缺失、插入和/或添加；(d)能够在严格条件下与包含核苷酸序列SEQ ID NO3的多核苷酸杂交的多核苷酸；(e)编码与氨基酸序列SEQ ID NO4具有70％或更高同一性的蛋白质的多核苷酸。
8.根据权利要求7的蛋白质复合体，其中该α-亚单位包含氨基酸序列SEQ ID NO2。
9.根据权利要求7的蛋白质复合体，其中该β-亚单位包含氨基酸序列SEQ ID NO4。
10.编码根据权利要求7的蛋白质复合体的α-亚单位的多核苷酸，其中所述多核苷酸选自下组(A)包含核苷酸序列SEQ ID NO1的多核苷酸；(B)编码包含氨基酸序列SEQ ID NO2的蛋白质的多核苷酸；(C)编码包含氨基酸序列SEQ ID NO2的蛋白质的多核苷酸，它含有一个或多个氨基酸取代、缺失、插入和/或添加；(D)能够在严格条件下与包含核苷酸序列SEQ ID NO1的多核苷酸杂交的多核苷酸；(E)编码与氨基酸序列SEQ ID NO2具有70％或更高同一性的蛋白质的多核苷酸。
11.编码根据权利要求7的蛋白质复合体的α-亚单位的多核苷酸，其中所述多核苷酸选自下组(a)包含核苷酸序列SEQ ID NO1的多核苷酸；(b)编码包含氨基酸序列SEQ ID NO2的蛋白质的多核苷酸；(c)编码包含氨基酸序列SEQ ID NO2的蛋白质的多核苷酸，它含有一个或多个氨基酸取代、缺失、插入和/或添加；(d)能够在严格条件下与包含核苷酸序列SEQ ID NO1的多核苷酸杂交的多核苷酸；(e)编码与氨基酸序列SEQ ID NO2具有70％或更高同一性的蛋白质的多核苷酸。
12.被根据权利要求10和11任意一项的多核苷酸所编码的蛋白质。
13.重组载体，其中已经插入根据权利要求10的多核苷酸和/或根据权利要求11的多核苷酸。
14.用根据权利要求13的重组载体转化宿主所得到的转化体。
15.根据权利要求14的转化体，其中该宿主是微生物。
16.生产腈水合酶或其亚单位的方法，其中所述方法包含培养根据权利要求14的转化体的步骤。
17.生产酰胺的方法，其中所述方法包含下列步骤使腈化合物与选自下组的酶活性材料接触根据权利要求1和2任意一项的腈水合酶；产生根据权利要求1和2任意一项的腈水合酶的微生物；根据权利要求7的蛋白质复合体；根据权利要求14的转化体；及其加工产物，并且回收所产生的酰胺。
18.根据权利要求17的方法，其中该腈化合物是α-羟基腈化合物，该酰胺是α-羟基酰胺。
19.根据权利要求18的方法，其中该α-羟基腈化合物是由下式(1)代表的化合物，该产物是由下式(3)代表的α-羟基酰胺化合物式(1) 式(3) 其中R代表取代或未取代的烷基、取代或未取代的链烯基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、取代或未取代的饱和或不饱和杂环基。
20.根据权利要求19的方法，其中所述方法包含在一种混合物中产生由上式(1)代表的化合物的步骤，该混合物包含由下式(2)代表的醛和氢氰酸R-CHO (2)其中R代表取代或未取代的烷基、取代或未取代的链烯基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、取代或未取代的饱和或不饱和杂环基。
21.根据权利要求17的方法，其中所述酶活性材料是在二价金属离子的存在下与所述腈化合物反应的。
22.根据权利要求21的方法，其中该二价金属离子是镍离子和/或钴离子。
23.在腈化合物的存在下使腈水合酶活性稳定的方法，其中所述方法包含使腈水合酶与二价金属离子接触的步骤。
24.生产酰胺的方法，其中所述方法包含下列步骤在二价金属离子的存在下使腈水合酶与腈化合物反应；和回收所产生的酰胺。
25.根据权利要求24的方法，其中该腈化合物是α-羟基腈，该酰胺是α-羟基酰胺。
26.根据权利要求23或24的方法，其中该二价金属离子是镍离子和/或钴离子。
全文摘要
本发明的目的是提供能够产生2－羟基－4－甲硫基丁酰胺的腈水合酶。本发明提供新颖的腈水合酶，它使用α－羟基腈作为底物产生α－羟基酰胺，还提供其编码DNA。该酶可以从红球菌获得。进而，该酶的酶活性在反应期间得以稳定地保持。本发明提供生产酰胺化合物的方法，该方法使这种酶与腈化合物反应的步骤。按照本发明，从羟基腈化合物可以通过生物化学作用生产对应的酰胺化合物，而不会减少腈水合酶的酶活性。
文档编号C12N15/60GK1571843SQ0280875
公开日2005年1月26日 申请日期2002年3月1日 优先权日2001年3月2日
发明者长泽透, 松山彰收 申请人:大赛璐化学工业株式会社
技术领域：
本发明涉及新颖的腈水合酶(nitrile hydratase)和使用该腈水合酶从腈化合物生产酰胺化合物的方法。
背景技术：
为了提高腈水合酶的表达水平，已经检验了利用遗传工程在微生物细胞中过量表达腈水合酶的方法和使用这些细胞转化腈化合物为对应的酰胺化合物的方法。例如，已知的腈水合酶是源于下列微生物的。所有腈水合酶都是由两种类型的异种亚单位组成的酶。
红球菌(Rhodococcus)属(已审日本专利申请公报(JP-B)NO.平3-54558)红球菌属(未审日本专利申请公报(JP-A)NO.平2-119778)假单胞菌(Pseudomonas)属(JP-A平3-251184)紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)属(欧洲专利申请NO.455646)不过，在所有情况下，利用大肠杆菌所得腈水合酶活性的表达水平都不是足够高的，该大肠杆菌是用含有任意如这些专利申请所述腈水合酶基因的插入片段的表达质粒所转化的；每重量份转化体细胞的腈水合活性低于作为基因来源的原始微生物(Ikehata，O.，Nishiyama，M.，Horinouchi，S.and Beppu，T.″Primary structure of nitrile hydratase deducedfrom the nucleotide sequence of a Rhodococcus speices N-774 and itsexpression in Escherichia coli″Eur.J.Biochem.181(1989)，563-570；Nishiyama，M.，Horinouchi，S.，Kobayashi，M.，Nagasawa，T.，Yamada，H.and Beppu，″Cloning and Characterization of Genes Responsible forMetabolism of Nitrile Compounds from Pseudomonas chlororaphis B23″Journal of bacteriology 173(1991)2465-2472；Kobayashi，M.，Nishiyama，M.，Nagasawa，T.，Horinouchi，S.，Beppu，T.and Yamada，H.″Cloningnucleotide sequence and expression in Escherichia coli of twocobalt-containing nitrile hydratase genes from Rhodococcus rhodochrousJl″Biochimica et Biophysica Acta.1129(1991)23-33)。
如上所述，已经有可能利用基因重组技术在大肠杆菌中表达腈水合酶活性本身。不过，迄今尚不存在可利用的转化体，它具有如此高的腈水合活性，以便用于酰胺的工业生产。
另一方面，在干燥无色杆菌(IFO 12668)中已经见到腈水合酶，它表现非常高的腈水合活性，还已经克隆了编码该酶的基因。进而，使用表达质粒向大肠杆菌引入该基因，利用所得转化体过度产生了腈水合酶(JP-A平8-266277)。这份报道仅显示了丙烯酰胺和α-羟基异丁酰胺的生产实例，因而在该报道中没有关于这种酶对2-羟基-4-甲硫基丁腈的活性的说明。
因而，关于能够使用2-羟基-4-甲硫基丁腈(methylthiobutyronitrile)(以下缩写为HMBN)作为底物的腈水合酶知之甚少。此外，尚无使用大肠杆菌从2-羟基-4-甲硫基丁腈生产2-羟基-4-甲硫基丁酰胺(methylthiobutylamides)(以下缩写为HMBAm)的现有方法，该大肠杆菌是用含有腈水合酶基因作为插入片段的表达质粒所转化的。
另一方面，关于由微生物生产α-羟基酰胺，存在一种已知的方法，使用属于芽孢杆菌属、炭疽芽孢杆菌属(the genus Bacteridium)、微球菌(Micrococcus)属或短杆菌(Brevibacterium)属的微生物从乳腈、羟乙腈、α-羟基甲硫基丁腈等生产对应的酰胺(参见JP-B昭62-21519)。另外，还存在一种从氰醇(cyanohydrin)生产扁桃酰胺(mandelamide)的公知方法(参见JP-A平4-222591；JP-A平8-89267)。
不过，具有腈水合酶活性、能够转化腈化合物为酰胺化合物的酶具有这样一个问题，由于原料腈化合物或产物酰胺化合物的存在，这些酶容易丧失它们固有的酶活性。如果为了增加酰胺化作用的速率而升高腈化合物的浓度，那么腈水合酶容易在短时间内失活，从而难以在所需时间内得到反应产物酰胺化合物。另外，产物酰胺化合物也容易使腈水合酶失活，从而难以得到高浓度的酰胺化合物。
此外，在不同程度上取决于化合物的类型，已知α-羟基腈在极性溶剂中部分分解为对应的醛和氢氰酸(V.Okano et al.，J.Am.Chem.Soc.，Vol.98，4201(1976))。一般而言，醛与蛋白质连接，能够使酶活性失活(Chemical Modification of Proteins，G.E.Means et al.，Holden-Day，125(1971))。进而，象醛一样，氢氰酸(氰化物)也能够抑制性地作用于很多酶。因而，从原料α-羟基腈所产生的醛和氰化物能够成为降低酶活性的原因。由于在酶水合作用或α-羟基腈水解作用中，酶在短时间内失活这一问题，难以以高生产率得到高浓度的α-羟基酰胺。
为了防止酶活性的丧失，已经试验了各种增加酶活性或抑制酶活性丧失(失活)的方法。这样的努力例如包括如下在凝固点至15℃的更低温度下进行反应(JP-B昭56-38118)；从多个供给口连续供给更低浓度的底物(JP-B昭57-1234)；将微生物或其加工产物用有机溶剂处理(JP-A平5-308980)；在不饱和高级脂肪酸的存在下进行反应(JP-A平7-265090)；使微生物细胞受到戊二醛的交联处理等(JP-A平7-265091；JP-A平8-154691)；利用化学方法降低污染腈化合物的氢氰酸的浓度，然后使腈水合酶与腈化合物反应(JP-A平11-123098)；利用亚硫酸离子、酸式亚硫酸离子或连二亚硫酸离子的存在实现酶活性的长期稳定化(JP-A平8-89267)；加入醛(JP-A平4-222591)。
这些方法没有一个在工业应用上具有实际的效果。尽管有些方法是有效的，不过它们仍有经济性或实用性改善的空间。例如，上述加入醛的方法需要大量的醛作为原料，是氰醇的1-5倍摩尔量，因而该方法并非经济的解决方案。类似地，加入亚硫酸离子、酸式亚硫酸离子或连二亚硫酸离子的方法要求加入离子的量等于或大于原料，因而该方法不实用。
本发明的一个目的是提供具有很高腈水合活性的腈水合酶。本发明的另一个目的是提供稳定的腈水合酶，它能够在长时间内保持很高的酶活性。另外，本发明的另一个重要目的是提供也能够使用2-羟基-4-甲硫基丁腈作为底物的腈水合酶。
此外，本发明的另一个目的是提供编码具有很高腈水合活性的腈水合酶的基因、含有该基因的重组质粒和含有该重组质粒的转化体。另外，本发明的另外一个目的是提供使用表达很高腈水合活性的该转化体从腈生产对应的酰胺的方法。
发明内容
本发明人为达到上述目的而进行了艰苦的研究，在属于红球菌属的微生物(Rhodococcus sp.)中发现了具有非常高腈水合活性的腈水合酶。然后，发明人确认了该腈水合酶是一种新颖的酶，可用于达到上述目的，从而完成了本发明。
发明人然后利用重组DNA技术克隆了编码该酶的基因，制备了用包含表达载体的表达质粒转化的大肠杆菌，该表达载体含有所分离的基因作为插入片段。进而，本发明人成功地利用所得转化体大规模生产该腈水合酶，从而完成了本发明。
也就是说，本发明提供了下列腈水合酶、编码该酶的多核苷酸、生产该酶的方法和使用本发明的酶生产酰胺的方法。
本发明的腈水合酶具有下列物理化学性质(a)和(b)(a)作用于腈化合物的腈基，使腈基水合，将其转化为酰胺基；(b)是氰化物耐受性的。
本发明中，使腈化合物的腈基水合和将其转化为酰胺基的活性被称为“腈水合酶活性”。优选地，能够作用于下式(1)化合物并生成式(3)酰胺化合物的酶被称为“腈水合酶”。
式(1) 式(3) (其中R代表取代或未取代的烷基、取代或未取代的链烯基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、取代或未取代的饱和或不饱和杂环基)。
优选地，本发明的腈水合酶能够作用于2-羟基-4-甲硫基丁腈，产生2-羟基-4-甲硫基丁酰胺。
本发明的腈水合酶活性如下得以确认。首先，向0.1M磷酸钾缓冲液(pH 6.5)加入酶样本，缓冲液含有10％v/v 2-羟基-4-甲硫基丁腈(HMBN)作为底物。也可使用微生物细胞和粗酶(crude enzyme)代替酶样本。加入酶后，将溶液在20℃下培育15分钟。然后将反应溶液与过量体积的0.1％(v/v)磷酸盐溶液混合，剧烈摇动混合物以终止反应。可以利用HPLC分析反应产物。
按照这种测定方法，1U腈水合酶被定义为在20℃具有标准组成的反应溶液中1分钟能够产生1μmol烟酰胺的酶的量；1U被定义为在20℃具有标准组成的反应溶液中1分钟能够产生1μmol HMBAm的酶的量。
具体而言，例如可以利用实施例所述工艺测定酶活性。进而，使用来自Bio-Rad的蛋白质测定试剂盒，利用染剂结合法进行蛋白质的量化。
另一方面，本文所用的“氰化物耐受性”意味着在20℃下用1mM氰化物离子处理30分钟后，酶保留40％或更多的腈水合酶活性。作为替代选择，如果在20℃下用5mM氰化物离子处理30分钟后，酶保留10％或更多的腈水合酶活性，那么可以认为该酶是氰化物耐受性的。
进而，本发明提供具有下列物理化学性质(1)-(7)的腈水合酶(1)分子量在用凝胶过滤法测定时，分子量大约是110,000Da；利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法将酶分离为26.8kDa和29.5kDa的两个亚单位。
(2)作用该酶作用于腈化合物的腈基。
(3)最佳pH使腈基水合的活性在pH 5.5-6.5下最大。
(4)最佳温度使腈基水合的活性在40-45℃下最大。
(5)pH稳定性该酶在pH 4-9内是稳定的。
(6)热稳定性在50℃下热处理30分钟后，该酶保留70％或更多的活性。
(7)抑制剂
该酶被HgCl2、AgNO3、羟胺或苯肼所抑制。
进而，除了上述物理化学性质(a)和(b)或(1)-(7)以外，本发明提供具有下列物理化学性质(c)和/或(d)的腈水合酶。
(c)底物特异性该酶使用2-羟基-4-甲硫基丁腈作为底物，产生2-羟基-4-甲硫基丁酰胺。
(d)稳定性该酶被二价金属离子所稳定。
本发明中，腈水合酶的底物特异性可以利用上述试验腈水合酶活性的方法加以测定。进而，本文所用的“被二价金属离子所稳定”意味着即使在二价金属离子的存在下酶与1.8w/w％2-羟基-4-甲硫基丁腈培育20分钟，酶活性也基本上没有减少。在本发明的优选实施方式中，本发明的腈水合酶能够在这些条件下保持110％或更高的活性。
本发明中，上述二价金属离子包括镍离子和钴离子。这些二价金属离子在0.1mM-1M、一般为0.5-100mM、优选为1-10mM的浓度下提高本发明腈水合酶的酶活性。
利用常用的蛋白质纯化方法，可以从能够产生该酶的微生物中纯化本发明的腈水合酶。可以将上述微生物培养在标准的细菌培养基中。可以向培养基加入一些诱导腈水合酶表达的化合物。例如，腈化合物或酰胺化合物的加入能够提高腈水合酶的活性。更具体而言，乙腈、乙酰胺等可以用作酶诱导剂。
使能够产生该酶的微生物充分生长，然后收获细胞。在适当的缓冲液中溶解细胞，制备无细胞的提取物。缓冲液可以含有还原剂，例如2-巯基乙醇，蛋白酶抑制剂，例如苯甲磺酰氟(PMFS)。利用基于蛋白质溶解度的分离法和各种色谱工艺的适当组合，可以从无细胞的提取物纯化腈水合酶。
作为基于蛋白质溶解度的分离法，例如可以使用有机溶剂沉淀法，例如丙酮和二甲基亚砜，或硫酸铵盐析法。另一方面，已知的色谱方法包括阳离子交换色谱、阴离子交换色谱、凝胶过滤、疏水性色谱以及很多使用染剂、抗体及其他的亲合色谱工艺。更具体而言，本发明的腈水合酶可以被纯化为电泳上同种的多肽，例如使用苯基-TOYOPEARL的疏水性色谱、使用DEAE-琼脂糖的阴离子交换色谱、使用丁基-TOYOPEARL的疏水性色谱、使用蓝-琼脂糖的亲合色谱、使用Superdex200的凝胶过滤和其他。
能够用于此目的的微生物例如包括属于红球菌属(Rhodococcus sp.)的那些。更具体而言，Rhodococcus sp.Cr4是适合于生产本发明腈水合酶的微生物。Rhodococcus sp.Cr4已被保藏在International PatentOrganism Depositary中，入藏号FERM BP-6596。
Rhodococcus sp.Cr4的国际保藏(a)保藏机构的名称和地址名称International Patent Organism Depositary，National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology(AIST)，IndependentAdministrative Institution(原名The National Institute of Bioscience andHuman-Technology，The Agency of Industrial Science and Technology，TheMinistry of International Trade and Industry)地址Chuo 6，1-1，Higashi l-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566Japan(b)保藏日期(原始保藏日期)1998年12月8日(c)保藏号FERM BP-6596本发明的腈水合酶是可以从Rhodococcus sp.得到的。Cr4是一种新颖的酶，具有上述物理化学性质(a)-(d)和(1)-(7)。结构特征是上述物理化学性质(1)；根据SDS-PAGE的测定，该酶是由26.8kDa的α-亚单位和29.5kDa的β-亚单位组成的杂二聚多肽。α-亚单位的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示(226个氨基酸残基)，β-亚单位的氨基酸序列如SEQID NO4所示(207个氨基酸残基)。也就是说，本发明提供下列具有腈水合酶活性的基本上纯的蛋白质复合体。
本发明涉及在包含氨基酸序列SEQ ID NO2的多肽与包含氨基酸序列SEQ ID NO4的多肽之间的、基本上纯的蛋白质复合体。进而，本发明包括在包含氨基酸序列SEQ ID NO2的多肽与包含氨基酸序列SEQ ID NO4的多肽之间的蛋白质复合体的同系物。
本文关于给定蛋白质、多肽或蛋白质复合体所用的术语“基本上纯”意味着该蛋白质、多肽或蛋白质复合体基本上不含其他生物大分子。基本上纯的蛋白质、多肽或蛋白质复合体是至少75％(例如至少80、85、95或99％)纯的，以干重计。纯度可以利用本领域已知的任意适当标准方法加以测量，例如柱色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析。
本发明的蛋白质复合体是这样一种腈水合酶，它能够被使用所分离的编码本发明腈水合酶的多核苷酸的基因重组技术所表达。编码本发明腈水合酶的多核苷酸例如可以利用下列方法分离。
由本发明所提供的腈水合酶由如(A)-(E)任意一个所示多核苷酸所编码的α-亚单位和如(a)-(e)任意一个所示多核苷酸所编码的β-亚单位组成，是具有下列物理化学性质(i)和(ii)的蛋白质复合体。
(i)作用作用于腈化合物的腈基，使腈基水合，将其转化为酰胺基；(ii)底物特异性该酶使用2-羟基-4-甲硫基丁腈作为底物，产生2-羟基-4-甲硫基丁酰胺。
如下列(A)-(E)任意一个所示多核苷酸可以用作编码构成本发明蛋白质复合体的α-亚单位的基因。本发明中，如(A)-(E)任意一个所示多核苷酸可用于表达本发明腈水合酶的α-亚单位(A)包含核苷酸序列SEQ ID NO1的多核苷酸；(B)编码包含氨基酸序列SEQ ID NO2的多肽的多核苷酸；(C)编码包含氨基酸序列SEQ ID NO2的多肽的多核苷酸，它含有一个或多个氨基酸取代、缺失、插入和/或加入；(D)能够在严格条件下与包含核苷酸序列SEQ ID NO1的多核苷酸杂交的多核苷酸；(E)编码与氨基酸序列SEQ ID NO2具有70％或更高同一性的多肽的多核苷酸。
而且，如下列(a)-(e)任意一个所示多核苷酸可以用作编码构成本发明蛋白质复合体的β-亚单位的基因。本发明中，如(a)-(e)任意一个所示多核苷酸可用于表达本发明腈水合酶的β-亚单位(a)包含核苷酸序列SEQ ID NO3的多核苷酸；(b)编码包含氨基酸序列SEQ ID NO4的多肽的多核苷酸；(c)编码包含氨基酸序列SEQ ID NO4的多肽的多核苷酸，它含有一个或多个氨基酸取代、缺失、插入和/或加入；(d)能够在严格条件下与包含核苷酸序列SEQ ID NO3的多核苷酸杂交的多核苷酸；(e)编码与氨基酸序列SEQ ID NO4具有70％或更高同一性的多肽的多核苷酸。
本发明涉及所分离的编码腈水合酶亚单位的多核苷酸及其同系物。
本文所用的“所分离的多核苷酸”是这样一种多核苷酸，它的结构不等同于任意天然存在的多核苷酸或任意跨越三个以上单独基因的天然存在的基因组多核苷酸片段。该术语因此例如包括(a)DNA，它具有天然存在于生物基因组中的基因组DNA分子部分的序列，在该生物中是天然存在的；(b)掺入载体或原核生物或真核生物基因组DNA中的多核苷酸，其方式以便所得分子不等同于任意天然存在的载体或基因组DNA；(c)单独的分子，例如cDNA、基因组片段、由聚合酶链反应(PCR)生成的片段或限制酶切片段；(d)重组核苷酸序列，它是杂种基因的一部分，也就是编码融合多肽的基因。具体从这种定义中排除在外的是这样的DNA分子的多核苷酸，它们存在于不同的(i)DNA分子、(ii)转染细胞或(iii)细胞克隆体的混合物中；例如它们存在于DNA文库中，例如cDNA或基因组DNA文库。
因此，本发明在一方面提供所分离的多核苷酸，它编码本文所述的多肽或其片段。优选地，所分离的多核苷酸包括至少60％等同于如SEQID NO1或3所示核苷酸序列的核苷酸序列。更优选地，所分离的核酸分子至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多等同于如SEQ ID NO1或3所示核苷酸序列。在所分离的多核苷酸长度长于或等于参照序列、例如SEQID NO1或3的情况下，利用全长参照序列进行对比。若所分离的多核苷酸短于参照序列，例如短于SEQ ID NO1或3，则对相同长度的参照序列节段(排除同源性计算所需的所有环)进行对比。
编码本发明腈水合酶α-亚单位与β-亚单位的多核苷酸的核苷酸序列以及被这些核苷酸序列编码的氨基酸序列都是新颖的。基于由本发明揭示的核苷酸序列的信息，可以从上述保藏的微生物得到有关基因。可以利用PCR或杂交技术筛选得到这些基因。还可以利用化学DNA合成得到全长基因。
进而，基于上述核苷酸序列的信息，有可能得到源于其他生物的腈水合酶。例如，使用上述核苷酸序列或其部分序列作为探针，在严格条件下与从其他生物制备的多核苷酸进行杂交，可以分离源于各种生物的腈水合酶基因。
术语“能够在严格条件下杂交的多核苷酸”表示能够与作为探针的多核苷酸杂交的多核苷酸，前者具有选自核苷酸序列SEQ ID NO1(α-亚单位)和SEQ ID NO3(β-亚单位)的核苷酸序列，例如在手册所述条件下(在42℃下用含有0.5×SSC的初步洗涤缓冲液洗涤)利用ECL直接核酸标记与检测系统(Amersham Pharmacia Biotech)。还包括在本发明中的是在高严格条件下与本文所述核苷酸序列SEQ ID NO1或其片段杂交的多核苷酸。“高严格条件”表示在约45℃下在6×SSC中杂交，然后在65℃下用0.2×SSC，0.1％SDS洗涤一次或多次。构成探针多核苷酸的核苷酸序列可以被制成一种或多种任意组成的序列，但是具有至少20个连续的核苷酸，优选至少30个连续的核苷酸，例如40、60或100个连续的核苷酸，选自上述核苷酸序列。
进而，基于关于上述核苷酸序列的信息，可以从表现高同源性的区域设计PCR引物。使用这样的引物和染色体DNA或cDNA作为模板，利用PCR可以从各种生物分离编码腈水合酶的基因。
在本发明的方法中，有可能不仅使用天然的酶，而且使用包含天然酶的氨基酸序列的酶，其中一个或多个氨基酸已被取代、删去和/或插入，只要该酶能够构成具有上述物理化学性质(a)与(b)或(1)至(7)的蛋白质复合体即可。本领域技术人员可以修饰该多肽的结构，例如通过位点特异性诱变引入适当取代、缺失、插入和/或加入的突变(Nucleic Acid Res.10，pp.6487(1982)；Methods in Enzymol.100，pp.448(1983)；MolecularCloning 2nd Edt.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；PCR，APractical Approach IRL Press pp.200(1991))等。进而，氨基酸突变可以自然发生。因而，不仅具有人工氨基酸突变的酶、而且含有自发性氨基酸突变的酶都能够用在本发明的方法中。
被突变的氨基酸的数量没有特别的限制，只要该酶能够构成具有上述物理化学性质(a)与(b)或(1)至(7)的蛋白质复合体即可。正常情况下，它在50个氨基酸以内，优选在30个氨基酸以内，更优选在10个氨基酸以内，进而更优选在3个氨基酸以内。突变的位点可以是任意位点，只要该酶能够构成具有上述物理化学性质(a)与(b)或(1)至(7)的蛋白质复合体即可。
氨基酸取代优选地被突变成不同的氨基酸，其中保存了氨基酸侧链的性质。“保守性氨基酸取代”是属于下列具有化学相似侧链的小组之一的一个氨基酸残基被同组另一个氨基酸代替。具有相似侧链的氨基酸残基小组在本领域中已有定义。这些小组包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
另外，在本发明的方法中，编码与腈水合酶每种亚单位的氨基酸序列具有同源性的多肽的基因也可以用于本发明，只要该产物能够构成具有上述物理化学性质(a)与(b)或(1)至(7)的蛋白质复合体即可。利用蛋白质同源性检索可以得到这些基因。这类同源性检索例如可以使用下列公知的数据库进行关于蛋白质的氨基酸序列数据库，例如SWISS-PROT和PIR，DNA数据库，例如DNA Databank of JAPAN(DDBJ)、EMBL和GenBank，从DNA序列推导的氨基酸序列数据库，同源性检索程序，例如FASTA程序和BLAST程序。
进而，在互联网上也可获得检索上述数据库的数据库检索服务。利用这种类型的服务可以找到用在本发明中的腈水合酶。
与氨基酸序列SEQ ID NO2(α-亚单位)或SEQ ID NO4(β-亚单位)具有至少85％、优选90％或更高、更优选95％或更高同一性的多肽是本发明优选的多肽，构成用在本发明中的腈水合酶。本文所用的“同一性百分率(percent identity)”例如表示利用BLAST程序所得“阳性(Positive)”同一性百分率的值。具体而言，两种氨基酸序列或两种核酸的“同一性百分率”是利用Karlin和Altschul的算法测定的(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268，1990)，这种算法也被Karlin和Altschul修正过(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877，1993)。将这样一种算法结合到Altschul等的NBLAST与XBLAST程序中(J.Mol.Biol.215403-410，1990)。BLAST核苷酸检索是用NBLAST程序进行的，分值＝100，字长＝12。蛋白质的同源性检索是容易进行的，例如在DNADatabank of JAPAN(DDBJ)中，利用FASTA程序、BLAST程序等。BLAST蛋白质检索是用XBLAST程序进行的，分值＝50，字长＝3。若在两个序列之间存在间隙，则采用有间隙的BLAST，如Altsuchl等所述(NucleicAcids Res.253389-3402，1997)。若采用BLAST和有间隙的BLAST程序，则使用各程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。
本发明中，若打算使用包含氨基酸序列SEQ ID NO2的突变α-亚单位和包含氨基酸序列SEQ ID NO4的突变β-亚单位制备蛋白质复合体，二者在它们的氨基酸序列中都具有突变，则它们之一或之二可以是突变的多肽。进而，不同来源的亚单位可以彼此结合，生成本发明的蛋白质复合体。若两个亚单位之一打算是突变的，则应当选择能够与其他亚单位构成具有上述物理化学性质(1)和(2)的蛋白质复合体者。
进而，若α-亚单位和β-亚单位都打算是突变体，则将一种突变体与另一种结合，并且选择能够构成具有上述物理化学性质(i)和(ii)的蛋白质复合体的突变体。在这种情况下，首先，试验突变的亚单位，以评估它在与其他具有野生型氨基酸序列的亚单位结合后是否产生所需的物理化学性质。若结果是阳性的，则选择另一种产生所需物理化学性质的突变体作为配偶亚单位，用于与第一突变体结合；因而这些突变体是容易选择的。本发明可取的突变体具有上述物理化学性质(a)与(b)或(1)-(7)以及上述物理化学性质(i)与(ii)。
本发明优选的酶活性材料包括同种或异种宿主的转化体，该宿主表达编码腈水合酶的基因，已经利用基因重组技术制备，再处理其产物。
不存在关于用于转化作用以表达本发明腈水合酶基因的生物的限制，只要该生物能够用含有编码构成具有腈水合酶活性的蛋白质复合体的各亚单位的多核苷酸的重组载体转化、并且能够表达腈水合酶活性即可。编码各亚单位的多核苷酸可以保留在单一的载体中。各亚单位的多核苷酸还可以被分别插入在两种类型的载体中；通过载体的共同转化作用，可以表达本发明的蛋白质复合体。进而，有可能通过使各自表达单一亚单位的转化体结合，体外得到有关蛋白质复合体。可利用的微生物是其宿主-载体系统是可利用的那些，例如包括细菌，例如埃希氏杆菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、沙雷氏菌属、短杆菌属、棒杆菌属、链球菌属和乳杆菌属；放线菌，例如红球菌属和链霉菌属；酵母，例如酵母属、克鲁维氏酵母属、裂殖糖酵母属、接合糖酵母属、Yarrowia属、毛孢子菌属、红孢子菌属、毕赤氏酵母属和假丝酵母属；真菌，例如链孢霉属(Neurospora)、曲霉属、头孢子菌属(Cephalosporium)和木霉属等。
适合于宿主的转化体的制备工艺和重组载体的构建工艺可以采用分子生物学、生物工程和遗传工程领域中常用的技术(例如参见Sambrook et al.，″Molecular Cloning″，Cold Spring Harbor Laboratories)。为了在微生物中表达编码本发明腈水合酶的基因，有必要向在微生物中稳定的质粒载体或噬菌体载体引入多核苷酸，并使遗传信息转录和转译。为此，在本发明多核苷酸5’-末端上游放置启动子，即用于调节转录和转译的单元，并且优选地在多核苷酸3’-末端下游方式终止子。启动子和终止子应当在被用作宿主的微生物中是功能性的。可用于上述各种微生物的载体、启动子和终止子详细描述在″Fundamental Course inMicrobiology(8)Genetic Engineering″，Kyoritsu Shuppan中，具体关于酵母，见″Adv.Biochem.Eng.43，75-102(1990)″和″Yeast 8，423-488(1992)″。
例如，关于埃希氏杆菌属，确切地关于大肠杆菌，可利用的质粒包括pBR系列和pUC系列的质粒；可利用的启动子包括源于lac(源于β-半乳糖苷酶基因)、trp(源于色氨酸操纵子)、tac与trc(它们是lac和trp的嵌合体)、λ噬菌体的PL与PR等的启动子。可利用的终止子源于trpA、噬菌体、rrnB核糖体RNA等。其中，可以优选地使用载体pSE420D(描述在未审日本专利申请公报No.(JP-A)2000-189170中)，它是通过部分地修饰商业上可得到的pSE420(Invitrogen)的多克隆位点所构建的。
关于芽孢杆菌属，可利用的载体是pUB110系列和pC194系列的质粒；载体可以被整合到宿主染色体中。可利用的启动子和终止子源于apr(碱性蛋白酶)、npr(中性蛋白酶)、amy(α-淀粉酶)等。
关于假单胞菌属，存在为恶臭假单胞菌和洋葱假单胞菌开发的宿主-载体系统。适用广泛宿主的载体pKT240(含有自主复制所需的源于RSF1010的基因)是可利用的，它基于TOL质粒，参与甲苯化合物的分解；源于脂肪酶基因的启动子和终止子(JP-A平5-284973)是可利用的。
关于短杆菌属，确切地关于乳发酵短杆菌，可利用的质粒载体包括pAJ43(Gene 39，281(1985))。可以采用用于大肠杆菌的启动子和终止子，无需为短杆菌属进行任何修饰。
关于棒杆菌属，确切地关于谷氨酸棒杆菌，质粒载体是可利用的，例如pCS11(JP-A昭57-183799)和pCB101(Mol.Gen.Genet.196，175(1984))。
关于链球菌属，可以使用质粒载体，例如pHV1301(FEMS Microbiol.Lett.26，239(1985))和pGK1(Appl.Environ.Microbiol.50，94(1985))。
关于乳杆菌属，可以采用质粒载体，例如pAMβ1(J.Bacteriol.137，614(1979))，它是为链球菌属开发的；用于大肠杆菌的启动子也是可用的。
关于红球菌属，从紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)分离的质粒载体是可利用的(J.Gen.Microbiol.138，1003(1992))。
关于链霉菌属，可以按照Hopwood等在″Genetic Manipulation ofStreptomycesA Laboratory Manual″(Cold Spring Harbor Laboratories(1985))中所述方法构建质粒。确切地关于浅青紫链霉菌，pIJ486(Mol.Gen.Genet.203，468-478，1986)、pKC1064(Gene 103，97-99(1991))和pUWL-KS(Gene 165，149-150(1995))是可用的。相同的质粒也可用于弗吉尼亚链霉菌(Actinomycetol.11，46-53(1997))。
关于酵母属，确切地关于酿酒酵母，YRp系列、YEp系列、YCp系列和YIp系列的质粒是可利用的；整合载体(参照EP 537456等)经由与多拷贝核糖体基因的同源性重组而被整合到染色体中，可以引入有关基因的多个拷贝，所掺入的基因被稳定地保持在微生物中；因而，这些类型的载体是非常有用的。可利用的启动子和终止子源于编码ADH(醇脱氢酶)、GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、PHO(酸性磷酸酶)、GAL(β-半乳糖苷酶)、PGK(磷酸甘油酯激酶)、ENO(烯醇化酶)等的基因。
关于克鲁维氏酵母属，确切地关于乳克鲁维氏酵母，可利用的质粒例如源于酿酒酵母的2-μm质粒、pKD1系列质粒(J.Bacteriol.145，382-390(1981))、源于pGK11并参与杀死活性的质粒、KARS(克鲁维氏酵母属自主复制序列)质粒和能够经由与核糖体DNA的重组而被整合到染色体中的质粒(参照EP537456等)。源于ADH、PGK等的启动子和终止子是可利用的。
关于裂殖糖酵母属，有可能使用这样的质粒载体，它们包含源于粟酒裂殖糖酵母的ARS(自主复制序列)和源于酿酒酵母的营养缺陷-补充性可选择的标记(Mol.Cell.Biol.6，80(1986))。可用的启动子例如源于粟酒裂殖糖酵母的ADH启动子(EMBO J.6，729(1987))。确切而言，pAUR224在商业上可从TaKaRa Shuzo获得。
关于接合糖酵母属，例如源于Zygosaccharomyces rouxii的pSB3质粒(Nucleic Acids Res.13，4267(1985))是可利用的；有可能使用源于酿酒酵母的PHO5启动子和源于Zygosaccharomyces rouxii的GAP-Zr(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)启动子(Agri.Biol.Chem.54，2521(1990))。
关于毕赤氏酵母属，已经开发了宿主-载体系统，其中参与自主复制的源于毕赤氏酵母的基因(PARS1和PARS2)被用在巴斯德毕赤氏酵母等中(Mol.Cell.Biol.5，3376(1985))，因而高密度培养和强启动子是可用的，例如甲醇可诱导的AOX(Nucleic Acids Res.15，3859(1987))。在毕赤氏酵母属中，已经为Pichia angusta(以前称Hansenula polymorpha)开发了宿主-载体系统。可用的载体包括参与自主复制的源于Pichiaangusta的基因(HARS1和HARS2)，但是它们是相对不稳定的。因此，向染色体整合该基因的多个拷贝是有效的(Yeast 7，431-443(1991))。AOX(醇氧化酶)和FDH(甲酸脱氢酶)的启动子也是可利用的，它们受甲醇的诱导。还已经开发了另一种宿主-载体系统，其中参与自主复制的源于毕赤氏酵母的基因(PARS1和PARS2)被用在巴斯德毕赤氏酵母等中(Mol.Cell.Biol.5，3376(1985))，因而高密度培养和强启动子是可用的，例如甲醇可诱导的AOX(Nucleic Acids Res.15，3859(1987))。
关于假丝酵母属，已经为麦芽糖假丝酵母、白色假丝酵母、热带假丝酵母、产朊假丝酵母等开发了宿主-载体系统。已经克隆了来源于麦芽糖假丝酵母的自主复制序列(Agri.Biol.Chem.51，51，1587(1987))，已经为麦芽糖假丝酵母开发了使用这些序列的载体。进而，已经为产朊假丝酵母开发了具有高效启动子单元的染色体-整合载体(JP-A平08-173170)。
关于曲霉属，已经集中研究了真菌中的黑曲霉和米曲霉，因而质粒载体和染色体整合载体是可利用的，以及源于细胞外蛋白酶基因和淀粉酶基因的启动子(Trends in Biotechnology 7，283-287(1989))。
关于木霉属，已经为Trichoderma reesei开发了宿主-载体系统，可利用的启动子例如源于细胞外纤维素酶基因的那些(Biotechnology 7，596-603(1989))。
除了微生物以外，还存在各种为植物和动物开发的宿主-载体系统；确切而言，这些系统包括昆虫，例如蚕(Nature 315，592-594(1985))，和植物，例如油菜籽、玉蜀黍、马铃薯等。转化体的培养和从转化体纯化腈水合酶可以利用本领域技术人员已知的方法进行。
本发明的编码用作载体插入片段的腈水合酶的多核苷酸例如包括如(A)-(E)所示任意一种上述多核苷酸和如(a)-(e)所示任意一种上述多核苷酸。
在本发明的载体中编码腈水合酶α-亚单位和β-亚单位的多核苷酸优选地是前后连接的。术语“优选地前后(in tandem)连接”表示这样的连接，普通的调节区域指向这些亚单位的表达。这样一种排列预期能够更有效地表达亚单位和更有效地生成具有酶活性的蛋白质复合体。作为替代选择，各亚单位的多核苷酸还可以分别被插入在两种类型的载体中；通过两种载体的共同转化作用，可以表达蛋白质复合体。
本发明还涉及以可表达的方式保留载体的本发明转化体。本发明的载体可以被转化到任意宿主中，只要宿主能够以功能性方式保留载体即可。这样一种可用于该目的的宿主例如包括大肠杆菌。
本发明的腈水合酶、产生该腈水合酶的微生物、本发明的蛋白质复合体、产生该蛋白质复合体的转化体及其处理产物可用于使用腈化合物作为底物生产酰胺的方法。也就是说，本发明提供生产酰胺的方法，该方法包含使腈化合物与酶活性材料接触、再回收酰胺的步骤，酶活性材料选自由本发明的腈水合酶、产生该腈水合酶的微生物、本发明的蛋白质复合体、产生该蛋白质复合体的转化体及其加工产物组成的组。
本文所用的术语“腈水合酶(nitrile hydratase)”表示具有上述物理化学性质(a)和(b)的酶或具有上述物理化学性质(1)-(7)的酶。进而，能够产生该酶的微生物包括菌株Rhodococcus sp.Cr4(该酶即源于此)、产生本发明酶的属于红球菌属的微生物和含有编码该酶的多核苷酸的转化宿主微生物。进而，术语“转化宿主微生物”表示能够表达编码上述α-亚单位的多核苷酸(A)-(E)和/或编码β-亚单位的多核苷酸(a)-(e)的宿主微生物。上述宿主微生物能够产生由本发明α-亚单位和β-亚单位组成的本发明蛋白质复合体。
进而，微生物的处理产物具体包括已用洗涤剂或有机溶剂(例如甲苯)处理而改变细胞膜渗透性的微生物、用玻璃珠粒或酶处理而溶解细胞所得无细胞提取物和从该提取物部分纯化的材料等。作为替代选择，酶的处理产物包括与不溶性载体或水性载体分子连接的酶和通过固定包埋而制备的固定化酶分子等。
本发明中，酶活性材料包括所有具有本发明腈水合酶活性的材料。因此，只要材料具有所需的酶活性，它就包括在酶活性材料中，而不管它的酶纯度和溶解度。
构成本发明酰胺生产方法的酶反应可以这样进行，使上述酶活性材料与反应溶液接触，后者含有腈化合物作为底物。具体而言，酶活性材料可以与底物在水性溶剂、由水性溶剂与水溶性有机溶剂组成的混合溶剂或含有水不溶性溶剂的两相系统中接触。水性溶剂包括在中性pH下具有缓冲作用的缓冲液，例如磷酸盐缓冲液和Tris-HCl缓冲液。作为替代选择，若在反应期间使用酸和碱使pH变化能够在可取的范围内，则不需要缓冲液。与水不可混溶的有机溶剂例如包括乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、氯仿、正己烷和异辛烷等。反应可以在混合溶剂中进行，其由水性溶剂和有机溶剂组成，后者例如乙醇、丙酮、二甲基亚砜和乙腈。
在两相系统中，酶活性材料存在于水相中，其中在使用该材料时无需任何其他溶剂或者与水或缓冲液混合。底物化合物可以溶解在水性溶剂中，例如水、缓冲液和乙醇，并供应到反应系统中。在这种情况下，与酶活性材料一起，底物构成单相反应系统。另外，本发明的反应可以利用固定化酶、膜反应釜等进行。此外，本发明的转化体可以使用培养物、通过过滤、离心等从培养基分离的细胞或者在离心分离和洗涤之后悬浮在缓冲液、水等中的细胞的形式。所分离的细胞可以使用回收时的状态、破裂的状态、用丙酮或甲苯处理后的状态或冻干产物的状态。若酶是被细胞外产生的，则还可以在利用通常方法从转化体分离后使用转化体的培养基。使酶活性材料与反应溶液接触的方式不限于这些实施例。反应溶液表示由溶解在适当溶剂中的底物组成的溶液，该溶剂提供适合于酶活性表达的环境。
关于用在使用本发明腈水合酶生产酰胺的方法中的腈化合物的类型没有限制。例如，下列腈化合物可以用在本发明的方法中。
饱和单腈乙腈、丙腈、丁腈、异丁腈、戊腈、异戊腈、己腈等。
饱和二腈丙二腈、琥珀腈、戊二腈、己二腈等。
α-氨基腈α-氨基丙腈、α-氨基甲硫基丁腈、α-氨基丁腈、氨基乙腈等。
具有羧基的腈氰基乙酸等。
β-氨基腈氨基-3-丙腈等。
不饱和腈丙烯腈、异丁烯腈(methacrylonitrile)、氰基烯丙基、巴豆腈等。
芳族腈苄腈、邻-、间-与对-氯苄腈、邻-、间-与对-氟苄腈、邻-、间-与对-硝基苄腈、对-氨基苄腈、4-氰基苯酚、邻-、间-与对-甲苯基腈(tolunitrile)、2，4-二氯苄腈、2，6-二氯苄腈、2，6-二氟苄腈、茴香腈、α-萘甲腈、β-萘甲腈、邻苯二甲腈、间苯二腈、对苯二腈、氰基苄基、苯乙腈等。
α-羟基腈。
本发明中，特别优选的腈化合物包括α-羟基腈化合物。在本发明的酰胺生产方法中，关于α-羟基腈化合物的类型没有限制。更具体而言，例如可以使用由上式(1)代表的化合物。
式中，R代表取代或未取代的烷基、取代或未取代的链烯基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳氧基、取代或未取代的饱和或不饱和的杂环基。从α-羟基腈化合物可以生产α-羟基酰胺。
杂环基包括具有至少一个氮、氧和硫作为杂原子的基团。进而，取代基例如包括烷基、烷氧基、酰基、芳基、芳氧基、卤素(例如氯和溴)、羟基、氨基、硝基、巯基等。
具体而言，例如可以使用下列化合物或其取代产物。本文所用的取代产物表示具有上面例证的取代基的化合物。
乳腈α-羟基-正丙腈α-羟基-正丁腈α-羟基-异丁腈α-羟基-正己腈α-羟基-正庚腈α-羟基-正辛腈α，γ-二羟基-β，β-二甲基丁腈丙烯醛氰醇(acroleincyanohydrin)异丁烯醛氰醇3-氯乙腈4-甲硫基-α-羟基丁腈α-羟基-α-苯基丙酰另外，具有芳族环和杂环的底物化合物包括下列例证性化合物及其取代产物。
扁桃腈(Mandelonitrile)2-噻吩甲醛氰醇2-吡啶甲醛氰醇
2-吡咯甲醛氰醇2-呋喃甲醛氰醇2-萘甲醛氰醇很多由式(1)α-羟基腈化合物代表的腈化合物在极性溶剂中分解为醛和氢氰酸。例如，式(1)α-羟基腈化合物转化为上式(2)醛和氢氰酸。由于在这些化合物之间建立了平衡状态，α-羟基腈化合物被酶反应所消耗使平衡向α-羟基腈化合物移动。
另一方面，源于氢氰酸的氰化物和醛可以对酶多肽造成一定损害。因此，由于酶活性降低，以前已知的腈水合酶不能使足量的α-羟基腈化合物水合，从而不会提供足够产量的产物。不过，本发明的腈水合酶即使在氰化物或醛的存在下也保留了酶活性。因而，该酶能够采用从醛和氢氰酸产生的腈化合物作为底物。因此，利用生产α-羟基酰胺的本发明方法，可以从由上式(2)代表的醛化合物和氢氰酸供应式(1)化合物。
本发明的酰胺生产方法优选地是在二价金属离子的存在下进行的。二价金属离子有助于本发明腈水合酶的活性。优选的二价金属离子包括镍离子和钴离子。可以向反应溶液加入这些离子的适当的含水盐。具体而言，可以加入该离子的氯化物盐。
本发明中，腈化合物的水合作用或水解作用可以这样实现，使本发明的酶活性材料与底物化合物或由式(2)代表的醛与氢氰酸混合物接触，该混合物能够在水性溶剂(例如水或缓冲液)中转化为底物化合物。反应溶液优选地含有二价金属离子。
本文所用的术语“水合作用”表示水分子附加于腈基的反应。与“水合作用”相对照，术语“水解作用”表示这样的反应，其中从取代基与腈基连接的化合物中，取代基被水解作用裂解除去。两种反应都包括在本发明的酰胺生产方法中。
关于反应溶液中底物化合物的浓度没有限制。为了防止酶活性被底物化合物所抑制，在α-羟基腈的情况下，浓度例如可以相当于0.1-10w/w％，这是一般而言，优选0.2-5.0w/w％。底物可以在反应开始时一次性加入，但是优选的是连续地或不连续地加入底物，以防止底物浓度过高。
若底物腈化合物在水性溶剂中的溶解度过低，则可以向反应溶液加入洗涤剂。可以使用0.1-5.0w/w％Triton X-100或Tween 60作为洗涤剂。为了增加底物溶解度，可以有效地使用含有有机溶剂的混合溶剂。具体而言，例如通过加入甲醇、乙醇、二甲基亚砜等可以提高反应效率。作为替代选择，本发明的反应可以在不溶于水的有机溶剂中或由水性溶剂与不溶于水的有机溶剂组成的两相系统中进行。可用的与水不可混溶的有机溶剂例如包括乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、氯仿、正己烷、环己烷、辛烷或1-辛醇等。
若底物浓度落在上述范围内，则使用本发明的腈水合酶能够实现有效的酶反应，酶浓度例如是1mU/mL-100U/mL，优选100mU/mL或更高。进而，若使用微生物细胞作为酶活性材料，微生物的用量相对于底物而言优选地从0.01至5.0w/w％，以干细胞计。酶活性材料、例如酶和细胞可以这样与底物接触，将它们溶解或分散在反应溶液中。作为替代选择，有可能使用被化学连接或包埋技术所固定的酶活性材料。进而，反应可以在这样一种状态中进行，其中底物溶液与酶活性材料是用多孔性膜隔离开的，该膜允许底物渗透，但是限制酶分子或细胞的渗透。
反应通常可以在凝固点至-50℃、优选10-30℃的温度下进行0.1-100小时。关于反应溶液的pH没有限制，只要能够维持酶活性即可。由于本发明腈水合酶的最佳pH是5.5至6.5，优选的是调节反应溶液的pH在该范围内。
因而，腈化合物被微生物的水合作用或水解作用转化为对应的酰胺，蓄积在反应溶液中。利用适当的方法可以从反应溶液回收和纯化所产生的酰胺。具体而言，例如联合采用典型方法可以回收和纯化酰胺，例如超滤、浓缩、柱色谱、萃取、活性炭处理、蒸馏等。
本发明提供在腈化合物的存在下使腈水合酶活性稳定的方法，其中该方法是以二价金属离子的共存为特征的。进而，本发明提供生产酰胺的方法，该方法包含在二价金属离子的存在下使腈水合酶与腈化合物反应、再回收所产生的酰胺的步骤。
本发明基于这样的发现，反应系统中二价金属离子的存在显著抑制腈水合酶活性的降低。本发明中，关于腈水合酶的来源没有限制。也就是说，可以使用任何酶，只要该酶具有作用于并使腈化合物腈基水合和转化腈基为酰胺基的活性即可。使α-羟基腈水合为对应的酰胺的腈水合酶是本发明中优选的酶。
可以假定，本发明的二价金属离子实现了抑制腈水合酶活性降低的效果，机理例如如下首先，金属离子与底物化合物的氰醇(cyanohydrin)结构结合，可以增强酶反应。其次，金属离子的结合可以防止氰醇离解。其结果是，减少了反应溶液中氰化物离子的浓度。由于减少了氰化物离子浓度也降低了对酶的抑制作用，也就提高了酶活性。
无论如何，假定这些现象不是特定腈水合酶所特有的，而是普遍见于具有氰醇结构的底物化合物的使用中。这就是为什么关于用在使本发明腈水合酶活性稳定的方法或生产酰胺的方法中的腈水合酶的来源没有限制的原因。
已知能够使腈化合物水合为对应酰胺的酶例如包括源于下列微生物的酶(参见JP-A平04-040899)。
红球菌属棒杆菌属假单胞菌属分节孢子菌属产碱杆菌属芽孢杆菌属炭疽芽孢杆菌(Bacteridium)属微球菌属短杆菌属诺卡氏菌属更具体而言，微生物例如包括如下紫红红球菌ATCC33278红串红球菌IFO12320Corynebacterium nitrilophilus ATCC21419假单胞菌SK87(FERMP-11311)节杆菌(Arthrobacter sp.)HR1(FERM BP-3323)产碱杆菌(Alcaligenes sp.)BC 16-2(FERM BP-3321)红球菌(Rhodococcus sp.)HT40-6(FERM P-11774)JP-B昭62-21519所述微生物其他微生物是公知的，可得自American Type Culture Collection(ATCC)；Institute of Applied Microbiology(IAM)，The University of Tokyo；Fermentation Research Institute，the Agency of Industrial Science andTechnology；KAKEN PHARMACEUTICAL Co.(KCC)；Institute forFermentation，Osaka(IFO)；RESEARCH CENTER FOR PATHOGENICFUNGI AND MICROBIAL TOXICOSES(IFM)，The University of Chiba。另外，能够从上述红球菌Cr4(FERMBP-6596)得到的本发明腈水合酶也是本发明优选的酶之一。
关于用在本发明酰胺生产方法中的腈化合物没有限制。更具体而言，优选的底物例如包括上面关于利用本发明腈水合酶生产α-羟基酰胺的方法所述化合物。
还有可能适宜地仅生产α-羟基酰胺或α-羟基酸的两种旋光活性异构体之一，在反应中使用能够立体定向性使腈水合或水解的酶或含有该酶的微生物。因而，利用本发明的方法，能够得到立体专一性α-羟基酰胺或α-羟基酸，要比以前通过旋光拆分或外消旋化步骤的生产方法更有利得多。
本发明中，腈化合物的水合作用或水解作用例如是这样进行的，使腈水合酶与由式(1)代表的α-羟基腈在水性溶剂中接触，溶剂例如水或缓冲液。若所用腈水合酶对氰化物和醛是耐受性的，反应还可以在由式(2)代表的醛和氢氰酸的存在下进行，它们可以转化为α-羟基腈。除了纯化的酶以外，腈水合酶还可以是能够产生该酶的微生物的溶胞产物、粗酶或使材料固定化所得产物。进而，在本发明中，可以在反应溶液中加入二价金属离子，浓度为0.1mM-1M，一般0.5-100mM，优选1-10mM。
关于用在本发明中的金属离子的类型没有限制，只要该离子能够有效保持腈水合酶的活性即可。例如，钴离子和镍离子是优选的金属离子，它们能够保持腈水合酶的高活性。可以在反应溶液中加入这些金属离子的盐，例如氯化物盐。
本发明中，可以适当调整反应条件，这取决于除了二价金属离子的存在以外，还与腈水合酶联合使用的底物化合物的性质。关于用在反应中的底物化合物的类型和反应条件没有限制。具体而言，例如可以基于使用上述本发明腈水合酶生产α-羟基酰胺的方法所述例证性条件调整反应系统。
本文引用的所有专利、专利申请和出版物都引用在此作为参考。
本文中，关于浓度的“％”表示重量/体积百分率，另有指定除外。
图1显示利用SDS-PAGE测定本发明腈水合酶的分子量。横坐标表示相对迁移率，纵坐标表示分子量(kDa)。
图2显示利用柱色谱、用丁基-Toyopearl650M洗脱本发明腈水合酶。白方形(□)代表OD280，实心圆(●)代表活性，连字符(-)代表(NH4)2SO4。
图3显示利用凝胶过滤测定本发明腈水合酶的分子量。横坐标表示保留时间(分钟)，纵坐标表示分子量(kDa)。
图4显示本发明腈水合酶关于HMBN的Km值，这是用S-V绘图测定的。
图5显示本发明腈水合酶关于HMBN的Km值，这是用Lineweaver-Burk绘图测定的。
图6显示本发明腈水合酶关于3-氰基吡啶的Km值，这是用S-V绘图测定的。
图7显示本发明腈水合酶关于3-氰基吡啶的Km值，这是用Lineweaver-Burk绘图测定的。
图8显示温度对本发明腈水合酶活性的影响。
图9显示本发明腈水合酶的热稳定性。
图10显示pH对本发明腈水合酶活性的影响。
图11显示本发明腈水合酶的pH稳定性。
图12显示红球菌Cr4中基因簇的组织化。由大写字母表示的核苷酸序列相当于ORF。由ORF编码的亚单位名称显示在核苷酸序列右侧。
图13显示在来自红球菌Cr4与紫红红球菌J1的腈水合酶α-亚单位之间的氨基酸对比。在红球菌Cr4(顶行；CrNH-α)与紫红红球菌J1(底行；J1 L-α)之间，相同的氨基酸由星号代表，不同的氨基酸由空格代表。
图14显示在来自红球菌Cr4与紫红红球菌J1的腈水合酶β-亚单位之间的氨基酸对比。在红球菌Cr4(顶行；CrNH-β)与紫红红球菌J1(底行；J1 L-β)之间，相同的氨基酸由星号代表，不同的氨基酸由空格代表。
具体实施例方式
下面参照实施例详细阐述本发明，但是本发明不被解释为仅限于此。
1、酶活性测定方法在下列实施例中采用腈水合酶活性的标准测定方法，如下。用于酶反应的反应溶液的标准组成如表1和2所示。加入3-氰基吡啶或2-羟基-4-甲硫基丁腈(HMBN)作为底物化合物，引发酶反应。在3-氰基吡啶的情况下，在20℃下培育10分钟，在HMBN的情况下，在20℃下培育15分钟。在反应中使用3-氰基吡啶时，向反应加入0.1ml 2N盐酸，剧烈摇动混合物以终止反应；在反应中使用HMBN时，将0.1ml反应溶液加入到0.9ml 0.1％(v/v)磷酸中，剧烈摇动混合物以终止反应。利用HPLC分析反应溶液。
表1含10％(v/v)HMBN的0.1M KPB(pH 6.5) 0.36ml0.1M KPB(pH 6.5)0.64ml酶溶液 0.10ml0.85％(w/v)NaCl水溶液 0.90ml总体积 2.00ml→加入10％(v/v)HMBN，引发反应。
→在摇动的同时，将混合物在20℃下培育10分钟。
→加入0.1％(v/v)H3PO4，终止反应。
→离心。
→HPLC分析。
表20.3M 3-氰基吡啶 1.00ml0.1M KPB(pH 7.0) 0.50ml酶溶液0.10ml0.85％(w/v)NaCl水溶液(NaClaq) 0.90ml
总体积 2.00ml→加入 0.3M 3-氰基吡啶，引发反应。
→在摇动的同时，将混合物在20℃下培育3分钟。
→加入2N HCl，终止反应。
→离心。
→HPLC分析。
用于反应溶液的HPLC分析条件用于HMBN的HPLC分析条件如下柱子 Spherisorb S5ODS2(4.6×150nm)移动相 0.1％(v/v)磷酸/乙腈＝9/1流速 1.0ml/min检测 UV 210nm柱温 40℃关于酶活性的HPLC分析利用HPLC量化所产生的烟酰胺或HMBAm，计算腈水合酶活性。关于HMBAm的HPLC测定条件与HMBN相同。1U被定义为在20℃下1分钟，用标准组成的反应溶液能够产生1μmol烟酰胺的酶量；或者1U被定义为在20℃下1分钟，用标准组成的溶液能够产生1μmolHMBAm的酶量。
蛋白质定量利用来自Bio-Rad的蛋白质测定试剂盒，按照Bradford法测定蛋白质的量(Bradford，M.，Anal，Biochem.，72，248(1976))。
试剂所用DEAE-Sephacel和丁基-Toyopearl 650M由Pharmacia提供；牛血清白蛋白来自Bio-Rad；用于SDS-PAGE的分子量标记来自Pharmacia；用于HPLC的分子量标记来自Oriental Yeast。除非另有指定，其他所用试剂是商业上可得到的专用试剂。
2、培养条件将组成如下的预培养基每5ml等量分配在每支试管(25×200mm)内；将硅酮塞置于试管内，然后高压灭菌。试管冷却后，用铂环接种菌株，然后在28℃下摇动培养两天。
预培养基(pH 7.0)聚胨 5.0g肉膏 5.0gNaCl 2.0g酵母提取物 0.5g蒸馏水 1.0L然后，将预培养物转移至在500ml Sakaguchi烧瓶内高压灭菌过的20ml主培养基。在主培养物中，在培养24小时后用加料针头加入0.75％(v/v)乙腈，然后继续在33℃下摇动培育两天。
主培养基(pH 7.0)乙酰胺 7.5g葡萄糖 10.0gC.S.L. 10.0g酵母提取物 1.0gMgSO4.7H2O 0.5gK2HPO41.0gCoCl2.6H2O 20.0mg蒸馏水 1.0L3、无细胞提取物的制备将相当于500ml培养液的细菌细胞以5倍高的细胞密度悬浮在50mM磷酸盐缓冲液/44mM正丁酸(pH 7.0)中。将所悬浮的细菌细胞在4℃或更低温度下用150W声波处理器201M(Kubota)匀化60分钟。然后，在13,000rpm下离心20分钟，将培养物分离为上清液和沉淀部分。上清液用作下列纯化中的无细胞提取物。
4、硫酸铵级分向无细胞提取物加入硫酸铵到30％饱和度。将混合物用10％(v/v)氨水中和至pH 7.0，然后在4℃下搅拌三小时。然后在13,000rpm下离心30分钟，将溶液分离为上清液和沉淀部分。向上清液部分加入硫酸铵到60％饱和度。将混合物中和至pH 7.0，然后在4℃下搅拌三小时。然后通过离心将溶液分离为上清液和沉淀部分。进而，向上清液部分加入硫酸铵到80％饱和度。搅拌后，将溶液分离为上清液和沉淀部分。将各沉淀悬浮在10mM磷酸盐缓冲液/44mM正丁酸(pH 7.0)中。使溶液对相同缓冲液透析三次。然后测定活性。
5、DEAE-Sephacel柱色谱将已被相同缓冲液充分透析的酶溶液上柱到用10mM磷酸盐缓冲液/44mM正丁酸(pH 7.0)充分平衡过的柱子(φ13×216mm)。然后将柱子用相同缓冲液洗涤。然后，用下列洗脱缓冲液进行洗脱，评估各部分的酶活性。在用10mM磷酸盐缓冲液/44mM正丁酸(pH 7.0)/0.3M KCl洗脱时，在第74-80号级分见到腈水合酶活性。每次所用洗脱缓冲液的体积大约是载体体积的3倍。
10mM磷酸盐缓冲液/44mM正丁酸(pH 7.0)/0.1M KCl10mM磷酸盐缓冲液/44mM正丁酸(pH 7.0)/0.2M KCl10mM磷酸盐缓冲液/44mM正丁酸(pH 7.0)/0.3M KCl10mM磷酸盐缓冲液/44mM正丁酸(pH 7.0)/0.4M KCl6、丁基-Toyopearl 650M柱色谱将含有丁基-Toyopearl的柱子(φ11×89mm)用含有20％饱和度硫酸铵的10mM磷酸盐/44mM正丁酸缓冲液(pH 7.0)充分平衡。向酶溶液加入20％饱和度硫酸铵，搅拌混合物。将酶溶液装上该柱子。将柱子用相同缓冲液洗涤。然后，用下列洗脱缓冲液进行洗脱，评估各部分的酶活性。在用10mM磷酸盐缓冲液/44mM正丁酸(pH 7.0)/15％饱和度硫酸铵洗脱时，在第58-66部分见到腈水合酶活性。每次所用洗脱缓冲液的体积大约是载体体积的3倍。
10mM磷酸盐缓冲液/44mM正丁酸(pH 7.0)/15％饱和度硫酸铵10mM磷酸盐缓冲液/44mM正丁酸(pH 7.0)/10％饱和度硫酸铵10mM磷酸盐缓冲液/44mM正丁酸(pH 7.0)/5％饱和度硫酸铵7、SDS-PAGE利用SDS-PAGE分析所得纯化的酶。SDS-PAGE是按照Laemmli的方法进行的(Laemmli，U.K.Nature，227，pp680，1970)。也就是说，在含有Tris/甘氨酸缓冲液的12％聚丙烯酰胺平板凝胶中进行电泳。将酶溶液与样本缓冲液的等体积混合物在90℃下加热处理约10分钟。将凝胶用库马斯艳蓝R-250染色；退色是用乙醇/乙酸/dH2O(体积比2/3/6)进行的。结果如图1所示。揭示了纯化的酶由α-亚单位(26.8kDa)和β-亚单位(29.5kDa)组成。
8、HPLC凝胶过滤按照上述方法纯化腈水合酶。首先，通过离心将匀化的细菌细胞悬液分离为上清液和沉淀部分。在上清液部分中含有活性，因而使用上清液作为无细胞提取物。将无细胞提取物用硫酸铵级分，其结果是在硫酸铵浓度为30-60％饱和度的级分中含有活性。对活性级分进行DEAE-Sephacel柱色谱。收集从DEAE-Sephacel柱洗脱的活性级分(No.74-80)，然后进行丁基-Toyopearl 650M柱色谱。使用从丁基-Toyopearl650M柱洗脱的活性级分(No.58-66)作为纯化的酶(图2)。
最后，关于红球菌Cr4的腈水合酶，总蛋白质含量为5.32mg；比活性477U/mg；收率44％；比活性13.9倍(表3)。纯化的酶被SDS-PAGE评估为同源的。在标准条件下，最终纯化的酶的比活性关于用作底物的HMBN是880U/mg，关于3-氰基吡啶是477U/mg。
表3步骤 总蛋白质 总活性 比活性 纯化 收率(mg) (U)(U/mg) (倍数) (％)1.无细胞提取物 167 5740 34.4 11002.(NH4)2SO4级分56.6 5220 92.2 2.68 913.DEAE-Sephacel18.7 4030 2156.25 704.丁基-Toyopearl 650M 5.32 2540 47713.9 441U酶被定义为在1分钟内，在标准条件下，从3-氰基吡啶(cyanopyridine)催化产生1μmol烟酰胺(nicotinamide)的量。
在表4所示条件下利用凝胶过滤分析约2.3μg纯化酶，以测定分子量；基于分子量标记的保留时间计算，推断酶在自然状态下的分子量为约112.5kDa(图3)。
HPLC凝胶过滤用于腈水合酶分子量的HPLC分析条件如表4所示。所用分子量标记来自Oriental Yeast。
表4
柱子TSK凝胶G-3000SW(0.75×60cm)溶剂0.1M KPB(pH 7.5)+0.2M KCl流速0.7ml/min注射5μl检测280nm9、底物浓度的影响(Km值)利用S-V绘图(图4)和Lineweaver-Burk绘图(图5)测定关于HMBN的Km值。向含有不同浓度HMBN的溶液加入0.0585U酶，在20℃下培育15分钟。利用HPLC分析反应。利用Lineweaver-Burk绘图测定关于HMBN的Km值为1.43mM，这表明酶对HMBN具有很高的亲合性。
另外，利用S-V绘图(图6)和Lineweaver-Burk绘图(图7)测定关于3-氰基吡啶的Km值。类似地，向含有不同浓度3-氰基吡啶的溶液加入0.0265U酶，在20℃下培育15分钟。利用HPLC分析反应。利用Lineweaver-Burk绘图测定关于3-氰基吡啶的Km值为1.38mM，这表明酶对3-氰基吡啶也具有很高的亲合性。
10、温度的影响评价了纯化酶的最佳温度和热稳定性。利用如表1所示标准组成的反应溶液，将2.92U酶在每种温度下(10、20、30、35、40、45、50、55、60或65℃)培育15分钟，以评估最佳温度(图8)。在45℃下，酶反应速率最大。进而，将2.92U酶在每种温度下(10、20、30、40、50或60℃)加热处理30分钟，然后在标准反应条件下评估热稳定性。将酶在50℃下处理后，剩余活性为77％(图9)。
11、pH的影响评价了纯化酶的最佳pH和pH稳定性。利用如表1所示标准组成的反应溶液，将2.92U酶在20℃每种缓冲液中(柠檬酸钠或Tris-HCl缓冲液，最终浓度为50mM)培育15分钟，代替磷酸盐缓冲液，以测定最佳pH。最佳pH为6.0(图10)。
进而，将2.92U酶在20℃每种缓冲液中(柠檬酸钠、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl、甘氨酸/NaOH或Na2HPO4/NaOH缓冲液，最终浓度为50mM)培育30分钟，然后在标准反应条件下测定剩余活性，以评估pH稳定性。将酶在pH 4.0-9.0下处理30分钟后，剩余活性几乎为100％(图11)。
12、底物特异性检查了酶的底物特异性。利用如表2所示标准组成反应溶液，将2.92U酶与各种类型底物培育，代替3-氰基吡啶；利用HPLC分析反应溶液中酰胺的产生。因而，测定相对活性。所加入的底物化合物类型、其最终浓度、反应时间和用于分析对应于各底物的产物的HPLC条件如表6所示。HPLC条件(1)-(9)列在表6之后。
纯化的腈水合酶显示底物特异性，与休息细胞反应非常相似；丙二腈、正丁腈和2-氰基吡啶是适合的底物。关于HMBN的相对活性是154％，关于3-氰基吡啶的活性被视为100％(表5)。
表5底物 相对活性(％) 底物 相对活性(％)3-氰基吡啶 1003-氰基吡啶*76.52-氰基吡啶 223正丁腈*3794-氰基吡啶 127异丁腈*40.9丙烯腈 114正戊腈*118异丁烯腈 93.7 异戊腈*2.71巴豆腈 87.4 正己腈*18.1乙腈 14.6 3-吲哚基乙腈*2.33丙腈 173苄腈*138HMBN 154邻-氯苄腈*58.6KCN0 间-氯苄腈*7.18丙二腈 673对-氯苄腈*28.46.162-氰基乙酰胺 46.3氰基吡嗪 114反应在20℃下进行，酶的用量为2.92U。星号“*”表示加入甲醇以提高底物溶解度(最终浓度＝20％v/v)。
表6底物 最终浓度(mM) 反应时间(min) HPLC条件
3-氰基吡啶15015(1)3-氰基吡啶*15015(1)2-氰基吡啶12510(1)4-氰基吡啶12510(1)丙烯腈2503 (5)异丁烯腈 1505 (1)巴豆腈1505 (1)乙腈 25010(4)丙腈 1505 (4)正丁腈*15010(2)苄腈*50 10(3)邻-氯苄腈*25 5 (3)间-氯苄腈*25 5 (3)对-氯苄腈*25 5 (3)丙二腈2503 (6)异丁腈*15010(7)正戊腈*15010(7)异戊腈*15010(7)正己腈*15010(9)氰基吡嗪 15010(8)3-吲哚基乙腈*50 5 (9)HPLC条件如下(1)柱子Waters Spherisorb 5μODS2(4.6×150mm)；溶剂10mM KH2PO4(pH 2.8)/乙腈(v/v)＝9∶1；流速1.0ml/min；检测230nm；注射体积5μl。
(2)柱子Waters Spherisorb 5μODS2(4.6×150mm)；溶剂10mM KH2PO4(pH 2.8)/乙腈(v/v)＝9∶1；流速1.0ml/min；检测230nm；
注射体积5μl。
(3)柱子Waters Spherisorb 5μODS2(4.6×150mm)；溶剂5mM KH2PO4(pH 2.8)/乙腈(v/v)＝12∶7；流速1.0ml/min；检测230nm；注射体积5μl。
(4)柱子Waters Spherisorb 5μODS2(4.6×150mm)；溶剂10mM KH2PO4(pH 2.5)/乙腈(v/v)＝99∶1；流速1.0ml/min；检测210nm；注射体积5μl。
(5)柱子Waters Spherisorb 5μODS2(4.6×150mm)；溶剂10mM KH2PO4(pH 2.5)/乙腈(v/v)＝99∶1；流速1.0ml/min；检测230nm；注射体积5μl。
(6)柱子Spherisorb S5ODS2(4.6×150mm)；溶剂0.1％(v/v)磷酸盐/乙腈(v/v)＝99∶1；流速1.0ml/min；检测210nm；注射体积5μl。
(7)柱子Spherisorb S5ODS2(4.6×150mm)；溶剂0.1％(v/v)磷酸盐/乙腈(v/v)＝9∶1；流速1.0ml/min；检测210nm；注射体积5μl；温度40℃。
(8)柱子Spherisorb S5ODS2(4.6×150mm)；溶剂0.1％(v/v)磷酸盐/乙腈(v/v)＝9∶1；流速1.0ml/min；检测230nm；
注射体积5μl；温度40℃。
(9)柱子Spherisorb S5ODS2(4.6×150mm)；溶剂5mM KH2PO4(pH 2.8)/乙腈(v/v)＝12∶7；流速1.0ml/min；检测210nm；注射体积5μl；温度40℃。
13、抑制剂对酶活性的影响研究了酶的抑制剂。利用如表1所示标准组成的反应溶液，向含有2.92U酶的溶液加入各种抑制剂，最终浓度为1.0mM或0.1mM；将混合物在20℃下培育10分钟后，进行15分钟反应。酶活性显著被羰基试剂所抑制，例如苯肼和羟胺(表7)。
表7各种化合物对腈水合酶活性的影响化合物(1.0mM) 相对活性(％)游离 100碘乙酸酯 97.0N-乙基马来酰亚胺 101对-氯汞基苯甲酸酯 97.75-5’-dithiobis(0.1mM)99.1羟胺 62.1苯肼 8.19半胱胺106D-环丝氨酸94.8EDTA 101钛试剂(Tiron) 132二硫代氨基甲酸二乙酯 97.7尿素 95.7NaN398.5二硫苏糖醇93.4
将酶与各种化合物在20℃下培育20分钟，测定酶活性。
14、金属离子对酶活性的影响研究了金属离子对酶反应的影响。利用如表1所示标准组成的反应溶液，向含有2.92U酶的溶液加入各种金属离子，最终浓度为1.0mM；将混合物在20℃下培育10分钟后，进行15分钟反应。酶活性显著被重金属离子所抑制，例如能够特异性相互作用于SH基的Ag+和Hg++离子。相反，Ni++或Co++离子的加入提高酶活性(表8)。
表8金属离子对腈水合酶活性的影响金属(1.0mM) 相对活性(％)游离100CaCl296.4MnCl296.7NiCl2196CoCl2154ZnSO484.1CuSO4109FeSO478.9FeCl3100AgNO37.85HgCl27.48将酶与金属离子在20℃下培育10分钟，测定酶活性。
15、共存的Ni++和Co++离子对酶活性的影响已经揭示了向反应系统加入Ni++或Co++离子可提高酶活性。利用如表1所示标准组成的反应溶液，向含有2.92U酶的溶液加入Ni++或Co++离子，浓度为0-8.0mM；研究它对酶活性的影响。在加入1.0-2.0mM浓度的Ni++或Co++离子时，酶活性提高2倍或1.5倍。随着加入高于上述浓度的金属离子，这种提高作用削弱了(表9和10)。
表9钴离子对腈水合酶活性的影响CoCl2(mM) 相对活性(％)
0 1000.5 1291.0 1502.0 1534.0 1436.0 1368.0 127将酶与镍离子在20℃下培育5分钟，测定酶活性。
表10NiCl2(mM)相对活性(％)0 1000.5 1711.0 1972.0 1964.0 1956.0 1848.0 185将酶与镍离子在20℃下培育5分钟，测定酶活性。
16、共存Ni++离子的影响如表10所示，向反应系统加入1.0mM浓度的Ni++离子可提高两倍本发明腈水合酶的酶活性。然后，利用如表2所示标准组成的反应溶液，向含有2.92U酶的溶液加入各种类型底物，代替3-氰基吡啶，以研究它们对活性的影响。在使用HMBN或扁桃腈作为底物时，活性仅提高两倍。假定在底物是α-羟基腈时，Ni++离子的加入特异性地提高反应效率(表11)。
表11底物 游离 NiCl2(1mM)HMBN 100 1963-氰基吡啶 100 992-氰基吡啶 100 974-氰基吡啶 100 99
正丁腈 100 94巴豆腈 100 103(chlotononitrilile)扁桃腈 100 201(manderonitlile)乙烯氰醇 100 91氨基乙腈 00羟乙腈 003-氨基丙腈 100 97β-氨基巴豆腈00使用2.92U酶，在20℃下延长培育10分钟。
17、N-末端氨基酸序列的测定在Applied Biosystem的470A型Procise序列分析仪中分析来自红球菌Cr4菌株的腈水合酶的α-亚单位和β-亚单位的N-末端氨基酸序列。α-亚单位的N-末端15个残基是TAHNPVQGTFPRSNE(SEQ ID NO5)，β-亚单位的是MDGIHDLGGRAGLGP(SEQ ID NO6)。
与来自紫红红球菌J1菌株的低分子量腈水合酶对比，α-亚单位的N-末端15个残基序列表现93％同一性，β-亚单位的表现100％同一性(表12/α-亚单位；表13/β-亚单位)。
表12菌株N-末端氨基酸序列 同一性(％)红球菌Cr4 1 TAHNPVQGTFPRSNE 15 -紫红红球菌J1(低)1 TAHNPVQGTLPRSNE 15 93枯草芽孢杆菌211 VVSNPLAGSRPRSND 225 47表13菌株N-末端氨基酸序列 同一性(％)红球菌Cr4 1 MDGIHDLGGRAGLGP 15 -紫红红球菌J1(低)1 MDGIHDLGGRAGLGP 15 100紫红红球菌J1(高)1 MDGIHDTGGMTGYGP 15 73恶臭假单胞菌1 MNGIHDTGGAHGYGP 15 67绿针假单胞菌B23 1 MDGFHDLGGFQGFGK 15 67
19、共存的NiCl2和CoCl2对休息细胞反应(resting cell reaction)的影响将下列组成的预培养基每5ml等量分配到每支试管(25×200mm)内；将硅酮塞置于试管内，然后高压灭菌。
预培养基(pH 7.0)聚胨 5.0g肉膏 5.0gNaCl 2.0g酵母提取物 0.5g蒸馏水 1.0L试管冷却后，将红球菌Cr4或紫红红球菌ATCC 332878菌株用铂环接种在预培养基中，然后在28℃下摇动培养两天。然后，将红球菌Cr4的预培养物转移至主培养基1；将紫红红球菌ATCC 332878的预培养物转移至主培养基2。将二者在33℃下摇动培养两天。收获细菌细胞，洗涤，然后进行如表14所示反应，以研究所加入的NiCl2和CoCl2的影响。
在向反应系统加入1mM最终浓度的NiCl2或CoCl2时，见表15，共存的NiCl2或CoCl2提高腈水合酶活性，因而这些离子的加入具有积极影响。
主培养基1(用于红球菌Cr4)(pH 7.0)乙酰胺7.5g葡萄糖10.0gC.S.L.10.0g酵母提取物1.0gMgSO4.7H2O 0.5gK2HPO41.0gCoCl2.6H2O 10.0mgFeSO4.7H2O 10.0mg蒸馏水1L主培养基2(用于紫红红球菌ATCC 332878)(pH 7.0)ε-己内酰胺 5.0g葡萄糖10.0g
C.S.L.10.0g酵母提取物1.0gMgSO4.7H2O 0.5gK2HPO41.0gCoCl2.6H2O 20.0mg蒸馏水1L将每种培养基每20ml等量分配到500ml Sakaguchi烧瓶内，在高压灭菌后使用。
表14含10％(v/v)HMBN的0.1M KPB(pH 6.5) 0.36ml0.1M KPB(pH 6.5) 0.64ml细胞悬浮溶液(最终0.5倍) 0.10ml0.85％(w/v)NaCl水溶液 0.90，0.80ml20mM NiCl2或CoCl20.00，0.10ml总体积 2.00ml→加入HMBN(反应开始)。
→将混合物在20℃下摇动培育15分钟。
→加入0.1％(v/v)H3PO4(反应终止)。
→离心。
→HPLC分析。
表15相对活性(％)红球菌Cr4 ATCC 332878游离 100*100**NiCl2186 193CoCl2137 123*118μmol/ml/min**30.5μmol/ml/min在休息细胞反应中，加入NiCl2或CoCl2也提高了酶活性。
20、氰化物离子的影响研究了氰化物离子对源于红球菌Cr4的本发明腈水合酶和源于紫红红球菌J1的已知腈水合酶(Biochimica et Biophysica Acta.1129(1991)23-33)的影响。利用下列标准组成的反应溶液，向反应系统加入0mM-20mM氰化物离子(KCN)。在没有底物(3-氰基吡啶)的存在下，将反应溶液在20℃下培育30分钟后，向其中加入底物，引发酶反应。酶在20℃下反应10分钟后，向其中加入0.1ml 2N盐酸，剧烈摇动混合物，以终止反应。利用与第1节所述相同的方法，用HPLC分析反应溶液。
标准反应溶液0.5M 3-氰基吡啶 0.5ml0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.5) 0.25ml酶溶液 0.1ml总体积 1.0ml在红球菌Cr4腈水合酶的情况下，酶的用量为288U/ml；在紫红红球菌J1腈水合酶的情况下，酶的用量为61U/ml。见表16，紫红红球菌J1的腈水合酶在lmM氰化物离子的存在下被完全抑制了，但是红球菌Cr4的腈水合酶在1mM氰化物离子的存在下保留47％的活性，在5mM氰化物离子的存在下保留17％的活性。
表16KCN(mM) Cr4J10 100％ 100％1 47 05 17 01011 0158 0203 021、N-末端氨基酸序列的测定对从红球菌Cr4纯化的腈水合酶进行SDS-PAGE。将蛋白质用AE6678-P型Horiz-Blot电泳仪(ATTO)电转移至PVDF膜上，然后用酰胺黑染色。切下对应于α-亚单位和β-亚单位的部分，在473A型气相肽序列分析仪(Applied Biosystem)中对每种亚单位蛋白质进行自动埃德曼降解，从而得到PTH氨基酸衍生物。在120A型PTH氨基酸衍生物分析仪(Applied Biosystem)中分析α-亚单位和β-亚单位的N-末端氨基酸序列。
α-亚单位的N-末端序列是TAHNPVQGTFPRSNE(SEQ ID NO5)；β-亚单位的是MDGIHDLGGRAGLGPI(SEQ ID NO7)。与来自紫红红球菌J1的低分子量腈水合酶的α-亚单位的N-末端序列对比，α-亚单位的序列表现93％的同一性(L位于J1中的氨基酸残基10)；β-亚单位与来自紫红红球菌J1的等价物表现100％的同一性。
因而，来自紫红红球菌J1的腈水合酶α-亚单位和β-亚单位的N-末端氨基酸序列几乎等同于来自红球菌Cr4的。进而，已知前人报道的腈水合酶的α-亚单位共享高度同源性一级结构。因而，使用来自紫红红球菌J1腈水合酶α-亚单位的基因片段作为探针DNA，进行Rhodococcus sp.Cr4的腈水合酶基因的克隆。进而，来自紫红红球菌J1腈水合酶β-亚单位的基因片段用于评价红球菌Cr4腈水合酶基因的完整区域是否被成功地克隆。
22、探针DNA的制备在紫红红球菌J1中存在两种类型的腈水合酶，也就是低分子量形式和高分子量形式。因此，首先选择紫红红球菌J1中低分子量腈水合酶基因的一级结构区域，其序列不同于高分子量形式的对应区域。具体而言，所选择的各氨基酸序列如下所述。
α-亚单位有义引物区(sense primer region)QGTLPRSN(SEQ ID NO8)反义引物区(antisense primer region)PDPDVEIR(SEQ ID NO9)β-亚单位有义引物区PHDYLTSQ(SEQ ID NO10)反义引物区PNVVNHID(SEQ ID NO11)然后，基于氨基酸序列，真正设计用于特异性扩增一部分低分子量腈水合酶基因的PCR引物。最后，设计包含下列核苷酸序列的引物。
用于扩增的α-亚单位基因片段有义引物5′-cagggcacgttgccacgatcg-3′(SEQ ID NO12)反义引物5′-cggatctcgacgtcagggtcg-3′(SEQ ID NO13)
用于扩增的β-亚单位基因片段有义引物5′-cgcacgactacctgacctcgc-3′(SEQ ID NO14)反义引物5′-cgatgtgattgactacgttcgg-3′(SEQ ID NO15)然后，按照Ausbel等的方法从紫红红球菌J1制备基因组DNA(Ausbel，FM et alUNIT 2.4，Preparation of Genomic DNA from Bacteria inCurrent Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons，New York)1987)。进而，利用相同的方法还从红球菌Cr4的培养细胞制备基因组DNA。
利用PCR扩增紫红红球菌J1的一部分低分子量腈水合酶基因，使用Taq DNA 30(Takara Shuzo)和下列循环在94℃下变性1分钟，在60℃下退火90秒钟，在72℃下延长90秒钟，使用10ng所得基因组DNA作为模板。对扩增后的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳，然后使用RECOCHIP(Takara Shuzo)从凝胶收集之。
使用用于α-亚单位基因片段扩增的引物进行PCR扩增，并使用来自紫红红球菌J1和红球菌Cr4的基因组DNA作为模板，从两种菌株得到约450bp的扩增产物。不过，在使用来自红球菌Cr4的基因组DNA作为模板时，PCR扩增的效率较低。因而，使用紫红红球菌J1的基因组DNA作为模板扩增的片段用作随后实验的探针DNA。
利用DIG标记试剂盒(Boehringer Manheim)，按照随机启动法将所扩增的源于紫红红球菌J1的DNA片段用地高辛配基标记。被地高辛配基标记的DNA片段在随后的DNA印迹分析和集落杂交中用作探针DNA。
23、DNA印迹分析将红球菌Cr4的基因组DNA用各种限制酶消化，使用来自源于紫红红球菌J1的腈水合酶α-亚单位的探针DNA进行DNA印迹分析。将10μg来自红球菌Cr4的基因组DNA用PstI、SphI和BanIII(Toyobo)完全消化，然后使1μg等份消化产物在0.8％琼脂糖凝胶上电泳。按照随附手册的指导，在785型真空印迹仪(Bio-Rad)中，将DNA转移至尼龙膜NY13N(Schleicher & Schuel)上。在自动交联仪CL-1000(BMEquipment)中，将DNA固定在膜上。使所得膜与探针DNA在60℃下杂交过夜，然后在室温下洗涤5分钟，然后在60℃下洗涤15分钟。按照随附手册的指导，将由CDP-Star所致化学发光在Fuji RX胶片上曝光，利用DIG检测试剂盒(Boehringer Manheim)检测信号。
DNA印迹分析揭示了3.2kb、4.2kb和7.8kb的单一谱带分别在来自用PstI、SphI和BanIII消化的红球菌Cr4的基因组DNA栏中。发现Rhodococcus sp.Cr4的腈水合酶基因是单拷贝基因。从由PstI消化产物所制备的基因组文库克隆Rhodococcus sp.Cr4的腈水合酶基因。
24、红球菌Cr4基因组文库的制备和集落杂交将质粒pBluescript II SK(+)(Stratagene)用PstI消化，然后利用细菌碱性磷酸酶(Takara Shuzo)脱磷酸化。将红球菌Cr4的基因组DNA用PstI消化，然后利用T4 DNA连接酶(Takara Shuzo)连接到上述pBluescript IISK(+)上。然后，利用上述载体转化大肠杆菌DH5α。
按照Sambrook等的方法进行集落杂交(Molecular cloning(ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor)1989)。具体而言，将硝基纤维素膜置于含有50μg/ml氨苄西林的LB琼脂平板上，将所得转化体涂铺其上。将平板在37℃下培育过夜。有集落生成后，将备好的复制滤膜(replica filter)置于琼脂平板上，在其上培养。在复制滤膜上生成集落后，将滤膜转移至含有200μg/ml氯霉素的琼脂平板上。将平板在37℃下培育24小时。将滤膜用SDS和碱处理，以溶解集落。然后，在与DNA印迹分析所用相同的条件下进行集落杂交。因而，从大约2000个集落得到阳性克隆。
25、阳性克隆的分析培养阳性克隆后，利用碱-SDS法制备质粒；该质粒名为pNHCr4P。质粒pNHCr4P含有约3.2kb的DNA插入片段。
为了确认pNHCr4P的DNA插入片段含有β-亚单位基因，利用PCR制备探针DNA，其中使用用于β-亚单位基因片段扩增的引物，并使用紫红红球菌J1的基因组DNA作为模板。利用这种探针DNA，利用DNA印迹分析pNHCr4P。结果确认约3.2kb的插入片段含有β-亚单位基因。
使用377A型DNA序列分析仪(Applied Biosystem)和Taq引物循环测序试剂盒(Applied Biosystem)，利用二脱氧链终止法分析pNHCr4P中DNA插入片段(约3.2kb)的核苷酸序列。所测定的核苷酸序列如SEQID NO16所示。测序结果显示，pNHCr4P中PstI DNA插入片段的大小为3205bp，并且存在ORF(图12)。红球菌Cr4中基因簇的组织化与紫红红球菌J1中含有低分子量腈水合酶基因的区域非常相似(Komeda et alProc Natl Acad Sci USA 9436-41，1997)。
26、一级结构的分析从PstI片段核苷酸245-2100的区域推导的α-亚单位和β-亚单位的一级结构分别如SEQ ID NO2和SEQ ID NO4所示。α-亚单位和β-亚单位的N-末端氨基酸序列与利用蛋白质测序仪测定的结果完全一致。另外，α-亚单位和β-亚单位与来自紫红红球菌J1的腈水合酶都表现最大程度的同源性。
表17α β紫红红球菌J1(低分子量型) 92％ 87％红球菌 65％ 45％恶臭假单胞菌 59％ 37％芽孢杆菌BR44960％ 38％Mesorhizobium loti 56％ 38％苜蓿中华根瘤菌 55％ 39％红球菌(Rhodococcus sp.)M852％ 37％紫红红球菌J1(高分子量型) 52％ 37％红串红球菌(R.erythropolis) 50％ 35％绿针假单胞菌B23 50％ 31％Brevibacterium sp.R312 50％ ？专利WO 95/04828 42％ 34％腈水合酶α-亚单位的207个残基中有17个氨基酸残基在红球菌Cr4(SEQ ID NO2)与紫红红球菌J1(SEQ ID NO18)之间是不同的。进而，腈水合酶β-亚单位的227个残基中有29个氨基酸残基在红球菌Cr4(SEQ ID NO4)与紫红红球菌J1(SEQ ID NO19)之间是不同的(图13和14)。
工业实用性本发明提供能够从作为底物的2-羟基-4-甲硫基丁腈产生2-羟基-4-甲硫基丁酰胺的腈水合酶。2-羟基-4-甲硫基丁酰胺作为饲料添加剂是一种有用的化合物(甲硫氨酸代用品)。
本发明不仅提供能够通过酶作用产生2-羟基-4-甲硫基丁酰胺的腈水合酶，而且在本发明中还克隆了编码基因。本发明的腈水合酶能够在适当用编码由本发明所提供的腈水合酶的基因转化的宿主细胞中被高水平地表达。因而，可以按照本发明获得的转化体本身或者从转化体得到的酶蛋白质可用于通过酶作用产生2-羟基-4-甲硫基丁酰胺。很多已知通过基因重组生产的腈水合酶不能达到很高的酶活性，而本发明的腈水合酶的优异之处在于即使是基因重组体也保留很高的活性。
进而，本发明的腈水合酶在氰化物或醛的存在下仍保留很高的酶活性。在极性溶剂中，作为底物化合物的α-羟基腈分解为氢氰酸和醛。氢氰酸转化为氰化物，这经常减少酶的活性。醛也对蛋白质造成损害，减少酶的活性。已知的腈水合酶不是工业上可实用的原因之一是这些氰化物和醛减少酶的活性。
本发明的水合酶即使在氰化物或醛的存在下也保留酶活性。因此，从醛和氢氰酸产生的α-羟基腈可以用作底物。因而，本发明的腈水合酶可用于使用α-羟基腈作为原料生产酰胺的方法。
序列表<110>大赛璐化学工业株式会社(DAICEL CHEMICAL INDUSTRIES，LTD.)<120>腈水合酶和生产酰胺的方法<130>D1-A0102Y1P<140>
<141>
<150>JP 2001-59023<151>2001-03-02<150>JP 2002-16222<151>2002-01-24<160>18<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>681<212>DNA<213>红球菌(Rhodococcus sp.)<220>
<221>CDS<222>(1)..(681)<400>1atg gat ggt atc cac gat ctg ggc ggg cgc gcc ggt ctg ggg ccg gtc 48Met Asp Gly Ile His Asp Leu Gly Gly Arg Ala Gly Leu Gly Pro Val1 5 10 15aat ccc gaa ccc ggt gag ccg gtc ttt cat tct cgt tgg gag cgg tcg 96Asn Pro Glu Pro Gly Glu Pro Val Phe His Ser Arg Trp Glu Arg Ser20 25 30gtt ttg acg atg ttt ccg gcc atg gcg tta gcc ggg gcg ttc aac ctc 144Val Leu Thr Met Phe Pro Ala Met Ala Leu Ala Gly Ala Phe Asn Leu35 40 45gac cag ttc cgg ggc gcg atg gaa cag att ccc ccg cac gac tat ctg 192
Asp Gln Phe Arg Gly Ala Met Glu Gln Ile Pro Pro His Asp Tyr Leu50 55 60acc tcg cag tac tac gag cac tgg atg cac gcg atg atc cac tac ggc 240Thr Ser Gln Tyr Tyr Glu His Trp Met His Ala Met Ile His Tyr Gly65 70 75 80atc gag gcg ggc atc ttc gac ccg aac gag ctc gac cgt cgc acc cag 288Ile Glu Ala Gly Ile Phe Asp Pro Asn Glu Leu Asp Arg Arg Thr Gln85 90 95tac tac ctg gag cat ccg gac gaa gac ccg ccc ctg cgg cag gac ccg 336Tyr Tyr Leu Glu His Pro Asp Glu Asp Pro Pro Leu Arg Gln Asp Pro100 105 110cag ttg gtg gag acg atc tcg cag ttg atc atg cac gga gcc gac tac 384Gln Leu Val Glu Thr Ile Ser Gln Leu Ile Met His Gly Ala Asp Tyr115 120 125cga agg ccg acc gac gcc gag ggc gtc ttc gcg gtg ggc gac aag gtc 432Arg Arg Pro Thr Asp Ala Glu Gly Val Phe Ala Val Gly Asp Lys Val130 135 140gtt gtg cgg tcg gac gcc tcg ccg aac acc cac acc cgt cgc gcc ggc 480Val Val Arg Ser Asp Ala Ser Pro Asn Thr His Thr Arg Arg Ala Gly145 150 155 160tac atc cgt gga cgc acc ggt gag atc gtc gca gct cac ggc gcc tac 528Tyr Ile Arg Gly Arg Thr Gly Glu Ile Val Ala Ala His Gly Ala Tyr165 170 175gtt ttc ccg gac act aac gcc gtc ggc gcc ggc gaa cac ccc gaa cac 576Val Phe Pro Asp Thr Asn Ala Val Gly Ala Gly Glu His Pro Glu His180 185 190ctg tac acg gtg cgg ttc tcg gcg acc gag ttg tgg ggc gag acc gcc 624Leu Tyr Thr Val Arg Phe Ser Ala Thr Glu Leu Trp Gly Glu Thr Ala195 200 205acc tcc aac gcg gtc aac cac atc gac gtg ttc gaa ccc tac ctg ctg 672Thr Ser Asn Ala Val Asn His Ile Asp Val Phe Glu Pro Tyr Leu Leu210 215 220ccg gcc tga 681
Pro Ala225<210>2<211>226<212>PRT<213>红球菌(Rhodococcus sp.)<400>2Met Asp Gly Ile His Asp Leu Gly Gly Arg Ala Gly Leu Gly Pro Val1 5 10 15Asn Pro Glu Pro Gly Glu Pro Val Phe His Ser Arg Trp Glu Arg Ser20 25 30Val Leu Thr Met Phe Pro Ala Met Ala Leu Ala Gly Ala Phe Asn Leu35 40 45Asp Gln Phe Arg Gly Ala Met Glu Gln Ile Pro Pro His Asp Tyr Leu50 55 60Thr Ser Gln Tyr Tyr Glu His Trp Met His Ala Met Ile His Tyr Gly65 70 75 80Ile Glu Ala Gly Ile Phe Asp Pro Asn Glu Leu Asp Arg Arg Thr Gln85 90 95Tyr Tyr Leu Glu His Pro Asp Glu Asp Pro Pro Leu Arg Gln Asp Pro100 105 110Gln Leu Val Glu Thr Ile Ser Gln Leu Ile Met His Gly Ala Asp Tyr115 120 125Arg Arg Pro Thr Asp Ala Glu Gly Val Phe Ala Val Gly Asp Lys Val130 135 140Val Val Arg Ser Asp Ala Ser Pro Asn Thr His Thr Arg Arg Ala Gly145 150 155 160Tyr Ile Arg Gly Arg Thr Gly Glu Ile Val Ala Ala His Gly Ala Tyr165 170 175Val Phe Pro Asp Thr Asn Ala Val Gly Ala Gly Glu His Pro Glu His180 185 190Leu Tyr Thr Val Arg Phe Ser Ala Thr Glu Leu Trp Gly Glu Thr Ala195 200 205Thr Ser Asn Ala Val Asn His Ile Asp Val Phe Glu Pro Tyr Leu Leu210 215 220Pro Ala225<210>3<211>624
<212>DNA<213>红球菌(Rhodococcus sp.)<220>
<221>CDS<222>(1)..(624)<400>3atg acc gcc cac aat ccc gtc cag ggc acc ttc ccc cga tcg aac gag 48Met Thr Ala His Asn Pro Val Gln Gly Thr Phe Pro Arg Ser Asn Glu1 5 10 15gag atc gcc gcc cgc gtc aag gcc atg gag gcc atc ctc gtc gac aag 96Glu Ile Ala Ala Arg Val Lys Ala Met Glu Ala Ile Leu Val Asp Lys20 25 30ggc ctg atc tcc acc gac gcc atc gac tac atg tcc tcg gtc tac gag 144Gly Leu Ile Ser Thr Asp Ala Ile Asp Tyr Met Ser Ser Val Tyr Glu35 40 45aac gag gtc ggt cct cag ctc ggc gcc aag atc gcc gcc cat gcc tgg 192Asn Glu Val Gly Pro Gln Leu Gly Ala Lys Ile Ala Ala His Ala Trp50 55 60gtc gat ccc gag ttc aaa cag cgc ctg ctc gcc gac gca acc ggc gcc 240Val Asp Pro Glu Phe Lys Gln Arg Leu Leu Ala Asp Ala Thr Gly Ala65 70 75 80tgc aag gaa atg ggc gtc ggc ggg atg cag ggc gaa gaa atg gtc gtg 288Cys Lys Glu Met Gly Val Gly Gly Met Gln Gly Glu Glu Met Val Val85 90 95ctg gaa aac acc gac acc gtc aac aac atg gtc gtg tgc acc ctg tgc 336Leu Glu Asn Thr Asp Thr Val Asn Asn Met Val Val Cys Thr Leu Cys100 105 110tcg tgc tac ccg tgg ccg gtg ctc gga ttg ccg ccc aac tgg tac aag 384Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Val Leu Gly Leu Pro Pro Asn Trp Tyr Lys115 120 125tac ccc gcc tac cgc gcc cgc gcc gcc cgc gac ccg cga ggg gtg atg 432Tyr Pro Ala Tyr Arg Ala Arg Ala Ala Arg Asp Pro Arg Gly Val Met130 135 140
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165 170 175Gly Thr Glu Asn Phe Thr Glu Glu Gln Leu Ala Ala Leu Val Thr Arg180 185 190Asp Ser Leu Ile Gly Val Ser Val Pro Thr Ala Pro Asn Lys Ala195 200 205<210>5<211>15<212>PRT<213>红球菌(Rhodococcus sp.)<400>5Thr Ala His Asn Pro Val Gln Gly Thr Phe Pro Arg Ser Asn Glu1 5 10 15<210>6<211>15<212>PRT<213>红球菌(Rhodococcus sp.)<400>6Met Asp Gly Ile His Asp Leu Gly Gly Arg Ala Gly Leu Gly Pro1 5 10 15<210>7<211>16<212>PRT<213>红球菌(Rhodococcus sp.)<400>7Met Asp Gly Ile His Asp Leu Gly Gly Arg Ala Gly Leu Gly Pro Ile1 5 10 15<210>8<211>8<212>PRT<213>红球菌(Rhodococcus sp.)<400>8Gln Gly Thr Leu Pro Arg Ser Asn
15<210>9<211>8<212>PRT<213>红球菌(Rhodococcus sp.)<400>9Pro Asp Pro Asp Val Glu Ile Arg1 5<210>10<211>8<212>PRT<213>红球菌(Rhodococcus sp.)<400>10Pro His Asp Tyr Leu Thr Ser Gln1 5<210>11<211>8<212>PRT<213>红球菌(Rhodococcus sp.)<400>11Pro Asn Val Val Asn His Ile Asp1 5<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>12cagggcacgt tgccacgatc g 21
<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>13cggatctcga cgtcagggtc g 21<210>14<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>14cggatctcga cgtcagggtc g 21<210>15<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>15cgatgtgatt gactacgttc gg 22<210>16<211>3205<212>DNA
<213>红球菌(Rhodococcus sp.)<400>16ctgcagtgtg cgcggcccgg gacgagcgac ggggtctcga ggactcgtcc accatgctcg 60ccgatccggg gggcagacga aaagacaatg agttgagtga atgaggcgta actgaatcta 120gactagtggg ggcctgtcgg gttgtccaga gcgtgtcgtc gcgcgcagga aagcgtcaaa 180aatcaactgc cgcaacgttt gctccggaat gaggcagctc ccctgttgcg cccatgcggg 240ggagtctgcc ctctggatcc cccgtgcgag aggcaacaaa atcttaacag gtcacgaagt 300catgacctat tgacctatcg ggattgtggt gtttaaggtt ggtgacccaa gccacaagga 360ggcaatgcga tggatggtat ccacgatctg ggcgggcgcg ccggtctggg gccggtcaat 420cccgaacccg gtgagccggt ctttcattct cgttgggagc ggtcggtttt gacgatgttt 480ccggccatgg cgttagccgg ggcgttcaac ctcgaccagt tccggggcgc gatggaacag 540attcccccgc acgactatct gacctcgcag tactacgagc actggatgca cgcgatgatc 600cactacggca tcgaggcggg catcttcgac ccgaacgagc tcgaccgtcg cacccagtac 660tacctggagc atccggacga agacccgccc ctgcggcagg acccgcagtt ggtggagacg 720atctcgcagt tgatcatgca cggagccgac taccgaaggc cgaccgacgc cgagggcgtc 780ttcgcggtgg gcgacaaggt cgttgtgcgg tcggacgcct cgccgaacac ccacacccgt 840cgcgccggct acatccgtgg acgcaccggt gagatcgtcg cagctcacgg cgcctacgtt 900ttcccggaca ctaacgccgt cggcgccggc gaacaccccg aacacctgta cacggtgcgg 960ttctcggcga ccgagttgtg gggcgagacc gccacctcca acgcggtcaa ccacatcgac 1020gtgttcgaac cctacctgct gccggcctga ccggagcgtc cgatacaacc tcgctgatac 1080ccccactgcc ccgcctacgg aaacgagttc acccgatgac cgcccacaat cccgtccagg 1140gcaccttccc ccgatcgaac gaggagatcg ccgcccgcgt caaggccatg gaggccatcc 1200tcgtcgacaa gggcctgatc tccaccgacg ccatcgacta catgtcctcg gtctacgaga 1260acgaggtcgg tcctcagctc ggcgccaaga tcgccgccca tgcctgggtc gatcccgagt 1320tcaaacagcg cctgctcgcc gacgcaaccg gcgcctgcaa ggaaatgggc gtcggcggga 1380tgcagggcga agaaatggtc gtgctggaaa acaccgacac cgtcaacaac atggtcgtgt 1440gcaccctgtg ctcgtgctac ccgtggccgg tgctcggatt gccgcccaac tggtacaagt 1500accccgccta ccgcgcccgc gccgcccgcg acccgcgagg ggtgatggcc gagttcggct 1560atacccccgc ctcggacgtc gagatccggg tgtgggactc gagcgccgaa ctgcgctact 1620gggtgctgcc gcagcgcccc gccggcaccg agaacttcac cgaagagcag ctcgccgccc 1680tcgtcacccg cgactcgctc atcggcgtgt ccgtccccac cgcaccgaac aaggcctgac 1740atgccccaac tcaacgaaca acccagccag gacctcaagg accgcctcga cggcctggtg 1800cagaacctac cgttcaacga gcagattccc cggcgctccg gggaggtcgc cttcgaccat 1860gcctgggaga tccgcgcttt cagcatcgcc accgccctgc atgcccaggg ccggttcgag 1920tgggacgaat tccagtcccg cctgatcgac tcgatcaaac agtgggaaac cgaacacacc 1980accaccgagg agtggagcta ctacgagtgt tggatgctcg cactcgaaga gctggtgcgg 2040gacaaggggc tggtcgccgg tgatgaactc gagcaccgca ccgagcaggt gctggccacc 2100ccggccaacg cccaccacca acacgctgta cgcgacccca ttgccgtgca caccagcgaa 2160gtacctactg ctcagtactc ccggtagccc ctggggcctc gccttcacgg aggtggaact 2220ctcgtgtaaa ggctcctggg ctctgcgacg tagagatacc accgatcttt ctcttgggct 2280ccccaggagc cgaagacgca tccctgatat ggcaactcgg acctggccgg gcgcgcagac 2340acaacgtgcg agcgccccgg aacttccaag cctctggcgt attcggaaga cgctgcgaat 2400tagtcgaagg acaagggttt gaccagtacc gcaatgacac cgcaccgcat gggcggtgcg 2460
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Tyr Pro Ala Tyr Arg Ala Arg Ala Val Arg Asp Pro Arg Gly Val Leu130 135 140Ala Glu Phe Gly Tyr Thr Pro Asp Pro Asp Val Glu Ile Arg Ile Trp145 150 155 160Asp Ser Ser Ala Glu Leu Arg Tyr Trp Val Leu Pro Gln Arg Pro Ala165 170 175Gly Thr Glu Asn Phe Thr Glu Glu Gln Leu Ala Asp Leu Val Thr Arg180 185 190Asp Ser Leu Ile Gly Val Ser Val Pro Thr Thr Pro Ser Lys Ala195 200 205<210>18<211>226<212>PRT<213>紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)<400>18Met Asp Gly Ile His Asp Leu Gly Gly Arg Ala Gly Leu Gly Pro Ile1 5 10 15Lys Pro Glu Ser Asp Glu Pro Val Phe His Ser Asp Trp Glu Arg Ser20 25 30Val Leu Thr Met Phe Pro Ala Met Ala Leu Ala Gly Ala Phe Asn Leu35 40 45Asp Gln Phe Arg Gly Ala Met Glu Gln Ile Pro Pro His Asp Tyr Leu50 55 60Thr Ser Gln Tyr Tyr Glu His Trp Met His Ala Met Ile His His Gly65 70 75 80Ile Glu Ala Gly Ile Phe Asp Ser Asp Glu Leu Asp Arg Arg Thr Gln85 90 95Tyr Tyr Met Asp His Pro Asp Asp Thr Thr Pro Thr Arg Gln Asp Pro100 105 110
Gln Leu Val Glu Thr Ile Ser Gln Leu Ile Thr His Gly Ala Asp Tyr115 120 125Arg Arg Pro Thr Asp Thr Glu Ala Ala Phe Ala Val Gly Asp Lys Val130 135 140Ile Val Arg Ser Asp Ala Ser Pro Asn Thr His Thr Arg Arg Ala Gly145 150 155 160Tyr Val Arg Gly Arg Val Gly Glu Val Val Ala Thr His Gly Ala Tyr165 170 175Val Phe Pro Asp Thr Asn Ala Leu Gly Ala Gly Glu Ser Pro Glu His180 185 190Leu Tyr Thr Val Arg Phe Ser Ala Thr Glu Leu Trp Gly Glu Pro Ala195 200 205Ala Pro Asn Val Val Asn His Ile Asp Val Phe Glu Pro Tyr Leu Leu210 215 220Pro Ala22权利要求
1.具有下列物理化学性质的腈水合酶(a)作用于腈化合物的腈基，水合腈基并将其转化为酰胺基；和(b)是氰化物耐受性的。
2.具有下列物理化学性质的腈水合酶(1)在用凝胶过滤法测定时，分子量大约是110,000Da，利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法可分离为26.8kDa和29.5kDa的两个亚单位；(2)作用于腈化合物的腈基，使腈基水合，将其转化为酰胺基；(3)使腈基水合的活性最大的最佳pH在pH5.5至6.5；(4)使腈基水合的活性最大的最佳温度在40至45℃；(5)酶的pH稳定性在pH4至9内；(6)热稳定性，以便在50℃下热处理30分钟后，该酶保留70％或更多的活性；(7)被HgCl2、AgNO3、羟胺或苯肼所抑制。
3.根据权利要求1和2任意一项的腈水合酶，其中所述腈水合酶进一步具有下列物理化学性质(c)底物特异性，其中该酶使用2-羟基-4-甲硫基丁腈作为底物，产生2-羟基-4-甲硫基丁酰胺。
4.根据权利要求1和2任意一项的腈水合酶，其中所述腈水合酶进一步具有下列物理化学性质(d)稳定性，其中该酶被二价金属离子所稳定。
5.根据权利要求1和2任意一项的腈水合酶，其中所述腈水合酶是源于已被保藏的红球菌Cr4菌株的，入藏号为FERM BP-6596。
6.生产根据权利要求1和2任意一项的腈水合酶的方法，所述方法包含培养已被保藏的红球菌Cr4菌株的步骤，入藏号为FERMBP-6596。
7.蛋白质复合体，由被下列多核苷酸(A)至(E)任意一个所编码的α-亚单位和被下列多核苷酸(a)至(e)任意一个所编码的β-亚单位组成，其中所述蛋白质复合体具有下列物理化学性质(i)和(ii)(i)作用于腈化合物的腈基，使腈基水合，将其转化为酰胺基；(ii)底物特异性，其中该酶使用2-羟基-4-甲硫基丁腈作为底物，产生2-羟基-4-甲硫基丁酰胺；α-亚单位(A)包含核苷酸序列SEQ ID NO1的多核苷酸；(B)编码包含氨基酸序列SEQ ID NO2的蛋白质的多核苷酸；(C)编码包含氨基酸序列SEQ ID NO2的蛋白质的多核苷酸，它含有一个或多个氨基酸取代、缺失、插入和/或添加；(D)能够在严格条件下与包含核苷酸序列SEQ ID NO1的多核苷酸杂交的多核苷酸；(E)编码与氨基酸序列SEQ ID NO2具有70％或更高同一性的蛋白质的多核苷酸；β-亚单位(a)包含核苷酸序列SEQ ID NO3的多核苷酸；(b)编码包含氨基酸序列SEQ ID NO4的蛋白质的多核苷酸；(c)编码包含氨基酸序列SEQ ID NO4的蛋白质的多核苷酸，它含有一个或多个氨基酸取代、缺失、插入和/或添加；(d)能够在严格条件下与包含核苷酸序列SEQ ID NO3的多核苷酸杂交的多核苷酸；(e)编码与氨基酸序列SEQ ID NO4具有70％或更高同一性的蛋白质的多核苷酸。
8.根据权利要求7的蛋白质复合体，其中该α-亚单位包含氨基酸序列SEQ ID NO2。
9.根据权利要求7的蛋白质复合体，其中该β-亚单位包含氨基酸序列SEQ ID NO4。
10.编码根据权利要求7的蛋白质复合体的α-亚单位的多核苷酸，其中所述多核苷酸选自下组(A)包含核苷酸序列SEQ ID NO1的多核苷酸；(B)编码包含氨基酸序列SEQ ID NO2的蛋白质的多核苷酸；(C)编码包含氨基酸序列SEQ ID NO2的蛋白质的多核苷酸，它含有一个或多个氨基酸取代、缺失、插入和/或添加；(D)能够在严格条件下与包含核苷酸序列SEQ ID NO1的多核苷酸杂交的多核苷酸；(E)编码与氨基酸序列SEQ ID NO2具有70％或更高同一性的蛋白质的多核苷酸。
11.编码根据权利要求7的蛋白质复合体的α-亚单位的多核苷酸，其中所述多核苷酸选自下组(a)包含核苷酸序列SEQ ID NO1的多核苷酸；(b)编码包含氨基酸序列SEQ ID NO2的蛋白质的多核苷酸；(c)编码包含氨基酸序列SEQ ID NO2的蛋白质的多核苷酸，它含有一个或多个氨基酸取代、缺失、插入和/或添加；(d)能够在严格条件下与包含核苷酸序列SEQ ID NO1的多核苷酸杂交的多核苷酸；(e)编码与氨基酸序列SEQ ID NO2具有70％或更高同一性的蛋白质的多核苷酸。
12.被根据权利要求10和11任意一项的多核苷酸所编码的蛋白质。
13.重组载体，其中已经插入根据权利要求10的多核苷酸和/或根据权利要求11的多核苷酸。
14.用根据权利要求13的重组载体转化宿主所得到的转化体。
15.根据权利要求14的转化体，其中该宿主是微生物。
16.生产腈水合酶或其亚单位的方法，其中所述方法包含培养根据权利要求14的转化体的步骤。
17.生产酰胺的方法，其中所述方法包含下列步骤使腈化合物与选自下组的酶活性材料接触根据权利要求1和2任意一项的腈水合酶；产生根据权利要求1和2任意一项的腈水合酶的微生物；根据权利要求7的蛋白质复合体；根据权利要求14的转化体；及其加工产物，并且回收所产生的酰胺。
18.根据权利要求17的方法，其中该腈化合物是α-羟基腈化合物，该酰胺是α-羟基酰胺。
19.根据权利要求18的方法，其中该α-羟基腈化合物是由下式(1)代表的化合物，该产物是由下式(3)代表的α-羟基酰胺化合物式(1) 式(3) 其中R代表取代或未取代的烷基、取代或未取代的链烯基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、取代或未取代的饱和或不饱和杂环基。
20.根据权利要求19的方法，其中所述方法包含在一种混合物中产生由上式(1)代表的化合物的步骤，该混合物包含由下式(2)代表的醛和氢氰酸R-CHO (2)其中R代表取代或未取代的烷基、取代或未取代的链烯基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、取代或未取代的饱和或不饱和杂环基。
21.根据权利要求17的方法，其中所述酶活性材料是在二价金属离子的存在下与所述腈化合物反应的。
22.根据权利要求21的方法，其中该二价金属离子是镍离子和/或钴离子。
23.在腈化合物的存在下使腈水合酶活性稳定的方法，其中所述方法包含使腈水合酶与二价金属离子接触的步骤。
24.生产酰胺的方法，其中所述方法包含下列步骤在二价金属离子的存在下使腈水合酶与腈化合物反应；和回收所产生的酰胺。
25.根据权利要求24的方法，其中该腈化合物是α-羟基腈，该酰胺是α-羟基酰胺。
26.根据权利要求23或24的方法，其中该二价金属离子是镍离子和/或钴离子。
全文摘要
本发明的目的是提供能够产生2－羟基－4－甲硫基丁酰胺的腈水合酶。本发明提供新颖的腈水合酶，它使用α－羟基腈作为底物产生α－羟基酰胺，还提供其编码DNA。该酶可以从红球菌获得。进而，该酶的酶活性在反应期间得以稳定地保持。本发明提供生产酰胺化合物的方法，该方法使这种酶与腈化合物反应的步骤。按照本发明，从羟基腈化合物可以通过生物化学作用生产对应的酰胺化合物，而不会减少腈水合酶的酶活性。
文档编号C12N15/60GK1571843SQ0280875
公开日2005年1月26日 申请日期2002年3月1日 优先权日2001年3月2日
发明者长泽透, 松山彰收 申请人:大赛璐化学工业株式会社
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