乳蛋白的脱酰胺化方法和乳蛋白的变性方法

xiaoxiao2020-6-24  5

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专利名称:乳蛋白的脱酰胺化方法和乳蛋白的变性方法
技术领域
本发明涉及利用具有直接作用于蛋白质的酰氨基而没有肽键的断裂和蛋白质的交联的脱酰胺作用的酶的乳蛋白的脱酰胺化方法和脱酰胺化乳蛋白的制造方法。另外,还涉及使用该酶的乳蛋白的变性方法和蛋白质分解物的制造方法。
背景技术
一般来说,如果将蛋白质中的谷酰胺和天冬酰胺残基脱酰胺化产生羧基的话,该蛋白质的负电荷增加,结果等电点降低,水合力增加。而且造成由静电相斥力的上升带来的蛋白质间的相互作用的降低,即集合性的降低。由于这些变化,蛋白质的可溶性、水分散性大大增加。另外,蛋白质的负电荷的增加可以解开该蛋白质的折叠,改变高级结构,使埋在分子内部的疏水性区域露出到分子表面。因而,脱酰胺化蛋白质具有两亲的性质,成为理想的表面活性剂,蛋白质的乳化力、乳化稳定性、发泡性和泡沫稳定性大大提高。
这样,蛋白质的脱酰胺化造成蛋白质的各种功能特性的提高,该蛋白质的用途飞跃性增加(例如Molecular Approaches to ImprovingFood Quality and Safety,D.Chatnagar and T.E.Cleveland,eds.,Van Nostrand Reinhold,New York,1992,p.37)。
作为对蛋白质进行酶脱酰胺化的方法,已知在高pH(pH10)条件下的蛋白酶处理法(A.Kato,A.Tanaka,N.Matsudomi,and K.Kobayashi,J.Agric.Food Chem.,35,224,1987)、转谷氨酰胺酶法(M.Motoki,K.Seguro,A.Nio,and K.Takinami,Agric.Biol.Chem.,50,3025,1986)、肽谷氨酰胺酶法(UP 5082672A和J.S.Hamada,and W.E.Marshall,J.Food Sci.,54,598,1989)三个方法,但指出如下问题。
在蛋白酶法中,不可避免作为其本来反应的肽键的断裂,由此,由脱酰胺化期待的蛋白质的功能性的提高受到阻碍(特别是泡沫稳定性降低)。另外,也造成苦味的生成。
在转谷氨酰胺酶法中,为了抑制由作为其本来反应的谷氨酰胺和赖氨酸之间的异肽键的形成造成的交联反应,有必要预先化学保护赖氨酸残基的ε-氨基。因而,在用该方法生产食品用的脱酰胺化蛋白质的场合,在用可逆性保护基柠康酰基等保护后,将谷氨酰胺脱酰氨基,之后除去保护基,还必须进一步分离游离的柠康酸和脱酰胺化的蛋白质。这样,制造工序复杂,还有从成本方面来看,也是不优选的,离实用化还相当远。
另一方面,在肽谷氨酰胺酶法中,由于该酶是专门催化本来低分子化的肽的脱酰胺化的酶,所以不能对原本状态的蛋白质产生作用(M.Kikuchi,H.Haya shida,E.Nakano,and K.Sakaguchi,Biochemistry,10卷,1222-1229,1971和B.P.Gill,A.J.OShaughnessey,P.Henderson and D.R.Headon,Ir.J.Food Sci.Technol.,9卷,33-41,1985),需要使用蛋白质水解物(UP 5082672A和J.S.Hamada,and W.E.Marshall,J.Food Sci.,54,598,1989)。即不得已和蛋白酶合并使用,和上述蛋白酶法的场合一样,出现生成苦味肽、功能性、特别是泡沫稳定性降低这样的问题。
作为解决这些问题的方法,公开了使用具有直接作用于蛋白质进行脱酰胺的作用的酶(蛋白质脱酰胺酶)的蛋白质脱酰胺化方法(特开2000-50887号公报)。
另一方面,也已知通过热处理、变性剂的处理等使蛋白质变性的方法。使蛋白质变性的意义可以举出提高蛋白质分解酶敏感性、提高消化性或者提高乳化特性、泡沫特性、凝胶化特性等蛋白质的功能性等。在以往,一般用物理方法、化学方法进行蛋白质的变性。物理方法包括热处理、高压处理等。化学方法包括变性剂(脲、盐酸胍)、还原剂、氧化剂、酸处理、碱处理等。
发明公开如上所述,作为蛋白质的脱酰胺化的方法,提出了4种方法。其中,使用具有直接作用于蛋白质进行脱酰胺化的作用的酶(蛋白质脱酰胺酶)的脱酰胺化法,由于不需要对蛋白质预先进行分解处理或者化学修饰,可以使用原本状态的蛋白质进行脱酰胺化,所以与其它3种方法相比较,可以说是优良的方法。
但是,对该酶的作用进行研究,发现虽然可以作用于大部分蛋白质而进行脱酰胺化,但脱酰胺化速度和脱酰胺化率因蛋白质的种类而异,对于一部分蛋白质,不能得到充分的脱酰胺化效果。即,脱酰胺化速度和脱酰胺化率方面还有改善的余地。
本发明的第1个方面是鉴于以上课题而提出的,其目的在于,在使用具有直接作用于蛋白质中的酰氨基进行脱酰胺,而没有肽键的断裂和蛋白质的交联的作用的蛋白质的脱酰胺化方法中,改善脱酰胺化速度和脱酰胺化率。
另一方面,如上所述,蛋白质的变性方法一般使用物理方法或者化学方法。在物理或化学变性方法中,随着蛋白质的分解、蛋白质侧链的破坏或者蛋白质的凝集·不溶化,在食品工业等产业中利用时,经常成为问题。因此,正在摸索使用酶的蛋白质变性方法。使用酶的方法与物理·化学方法相比较,反应的选择性高,且可以在温和的条件下进行,所以没有不希望的副反应,再者,由于可以减少能量消耗等理由,因此可以说优于物理·化学方法。特别是,可以在温和的条件下进行的酶的变性方法可以期待没有不理想的副反应、过分的变性的优点,或者由于发挥乳化特性、泡沫特性等功能性而成为比较合适的变性状态,因此,在工业上具有非常大的利用价值。但是,目前还不知道适当的酶变性方法。
本发明的第2个方面是鉴于以上课题而提出的,其目的在于提供使用酶的蛋白质变性方法。
本发明人鉴于上述本发明的第1个方面的课题,进行了各种研究。首先,在使上述蛋白质脱酰胺酶直接产生作用的场合,把不能得到充分的脱酰胺化效果的蛋白质α-乳球蛋白作为对象,尝试提高脱酰胺化速度和脱酰胺化率。结果发现,脱酰胺化时,通过使用预先进行了变性处理的α-乳球蛋白,可以显著提高脱酰胺化速度和最终的脱酰胺化率。本发明的第1个方面是基于这种发现,其构成如下。即,一种蛋白质(乳蛋白等)的脱酰胺化方法,其特征在于,使酶作用于变性蛋白质(变性乳蛋白等),该酶具有直接作用于蛋白质的酰氨基进行脱酰胺而不伴有肽键的断裂和蛋白质的交联的作用。
另外,本发明人对用蛋白质脱酰胺酶进行脱酰胺化得到的蛋白质的性状进行了研究。而且,用分光光学手段分析的结果发现脱酰胺化的蛋白质3级结构被显著破坏,即发生了变性。另外还发现对于该脱酰胺化的蛋白质,与3级结构被破坏相对,2级结构得以保持。已知这样的变性状态对于发挥乳化特性、泡沫特性等功能性是比较好的结构(D.Panyam and A.Kilala,Trends in Food Sci.Tech.,Vol.7,120-125,1996)。而且发现脱酰胺化的蛋白质在对于蛋白质分解酶的敏感性方面显著得到改善。本发明的第2个方面是基于以上发现完成的,如下构成。即,一种蛋白质(乳蛋白等)的变性方法,其特征在于,使酶作用于蛋白质(乳蛋白等),该酶具有直接作用于蛋白质的酰氨基进行脱酰胺而不伴有肽键的断裂和蛋白质的交联的作用。


图1是表示实施例2的用变性状态和未变性状态的α-乳清蛋白的蛋白质脱酰胺酶进行脱酰胺化反应的时间过程的图。
●表示未变性的α-乳清蛋白,○表示变性的α-乳清蛋白。
图2是表示实施例3的脱酰胺化α-乳清蛋白的近紫外区域圆二色性分析光谱的图。
A是在2mM乙二胺四乙酸存在下的图,B是在2mM CaCl2存在下的图,Native表示未变性α-乳清蛋白,D20表示脱酰胺化率20%的脱酰胺化α-乳清蛋白,D55表示脱酰胺化率55%的脱酰胺化α-乳清蛋白,D61表示脱酰胺化率61%的脱酰胺化α-乳清蛋白。
图3是表示实施例3的脱酰胺化α-乳清蛋白的远紫外区域圆二色性分析光谱的图。
A是在2mM乙二胺四乙酸存在下的图,B是在2mM CaCl2存在下的图,Native表示未变性α-乳清蛋白,D20表示脱酰胺化率20%的脱酰胺化α-乳清蛋白,D55表示脱酰胺化率55%的脱酰胺化α-乳清蛋白,D61表示脱酰胺化率61%的脱酰胺化α-乳清蛋白。
图4是表示实施例4中的胰蛋白酶处理的脱酰胺化α-乳清蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳模式的时间过程的图。
A表示未处理的α-乳清蛋白,B表示脱酰胺化α-乳清蛋白。泳道1、2、3、4、5分别表示胰蛋白酶处理时间0.5、1、2、4、24小时的样品。
实施发明的最佳方式本发明的第1个方面是一种蛋白质(乳蛋白等)的脱酰胺化方法,其特征在于,使酶作用于变性蛋白质(变性乳蛋白等),该酶具有直接作用于蛋白质的酰氨基进行脱酰胺而不伴有肽键的断裂和蛋白质的交联的作用。
可以通过采用公知的变性方法使未变性的蛋白质变性来制备本发明的变性蛋白质。作为变性方法,可以举出例如物理变性方法即通过热、压力等的处理,化学变性方法即通过酸、碱、变性剂(脲、盐酸胍、表面活性剂等)、氧化剂、还原剂、螯合剂等的处理。不用说可以单独进行这些处理,也可以同时或者间隔时间进行任意选自其中的二种以上的处理。例如,将变性剂添加到蛋白质溶液中,进行加热。由此,可以同时进行变性剂引起的变性处理和热引起的变性处理。
另外,变性处理的方法可以考虑变性的蛋白质的种类、必要的变性程度等进行选择。
变性蛋白质的制备也可以和后面所述的蛋白质脱酰胺酶的反应同时进行。例如,将变性剂和后面所述的蛋白质脱酰胺酶添加到含有蛋白质的溶液中,在变性剂的存在下,进行后面所述的蛋白质脱酰胺酶的反应。
本说明书中的蛋白质不仅是只由氨基酸残基组成的单纯蛋白质,还包括和糖、脂质等的复合体即复合蛋白质等。另外,关于分子量,优选5000以上,特别优选10000~2000000。
例如,如果是植物性蛋白质,可以举出来自豆类、谷类的蛋白质,如果是动物性蛋白质,可以举出酪蛋白、β-乳球蛋白等乳蛋白、卵清蛋白等卵蛋白、肌球蛋白、肌动蛋白等肉蛋白、血清白蛋白等血液蛋白、明胶、胶原等腱蛋白质。另外,也可以是用酸、碱等进行处理的化学部分分解蛋白质,或者用蛋白酶等进行处理的酶部分分解蛋白质,或者用各种试剂进行化学修饰的蛋白质。
在本发明的方法中使用的酶(以下称为“蛋白质脱酰胺酶”)具有直接作用于蛋白质的酰氨基进行脱酰胺化而没有肽键的断裂和蛋白质的交联的作用(以下称为“蛋白质脱酰胺作用”)。只要具有该作用,对其种类没有特别的限定。
作为本发明中的蛋白质脱酰胺酶,优选使用对于分子量5000以上的蛋白质(变性蛋白质)具有脱酰胺化作用的酶,特别优选使用对于分子量10000以上~2000000的范围的蛋白质(变性蛋白质)具有脱酰胺化作用的酶。
对于蛋白质脱酰胺酶,可以使用用产生蛋白质脱酰胺酶的微生物的培养液制备的酶。对在蛋白质脱酰胺酶的制备中使用的微生物没有特别的限定,可以是在其培养液中产生该酶的微生物,例如,可以使用属于金黄杆菌(Chryseobacterium)属、黄杆菌(Flavobacterium)属、稳杆菌(Empedobacter)属、鞘氨醇杆菌(Sphingobacterum)属、金杆菌(Aureobacterium)属、Myroides属的微生物。特别优选在蛋白质脱酰胺酶的制备中使用属于金黄杆菌(Chryseobacterium)属的金黄杆菌菌种(Chryseobacterium sp.)No.9670。金黄杆菌菌种(Chryseobacterium sp.)No.9670以保藏号FERM BP-7351(基于2000年(平成12年)1月8日提交的移交请求,由保藏号FERM P-17664的国内保藏移交)保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(现在为经济产业省产业技术综合研究所生命工学工业技术研究所)中。
从上述微生物的培养液制备蛋白质脱酰胺酶的方法可以使用公知的蛋白质分离、纯化方法(离心分离、UF浓缩、盐析、采用离子交换树脂等的各种色谱法等)。例如,可离心分离培养液,除去菌体,之后组合盐析、色谱法等得到所需的酶。
在本发明中,使上述蛋白质脱酰胺酶作用于上述变性蛋白质。变性蛋白质以溶液或者浆状或者糊状供给反应中。另外,含有变性蛋白质的溶液等不限于水溶液,也可以是和油脂的乳液。而且,也可以往溶液中添加其它的蛋白质、盐类、糖类、香料、保湿剂、着色剂等。另外,可以通过在含有未变性蛋白质的溶液中使该蛋白质变性,或者预先制备变性蛋白质,然后将其溶解在适当的溶剂中制备含有变性蛋白质的溶液。
对蛋白质脱酰胺酶的反应条件(酶量、反应时间、温度、反应溶液的pH等)没有特别的限定,通常相对于1g蛋白质,为0.1~100Unit,优选1~10Unit,反应温度通常为5~80℃,优选20~60℃,反应溶液的pH通常为2~10,优选4~8,反应时间为10秒~48小时,优选10分钟~24小时。另外,可以根据所使用的酶的纯度或者变性蛋白质的种类、纯度等适当改变这些条件。
如上所述,通过使蛋白质脱酰胺酶作用于变性蛋白质,可以直接将变性蛋白质中的酰氨基脱酰胺化。结果,生成的脱酰胺化蛋白质是高度脱酰胺化的蛋白质,随着负电荷的增加,造成pI降低,水合力上升,以及静电相斥力上升。而且,由于蛋白质高级结构的变化,导致表面疏水性上升。由于这些效果,可溶性·分散性提高,发泡性·泡沫稳定性提高,乳化性·乳化稳定性提高等,蛋白质的功能性得到改善。
这样,功能性得到改善的蛋白质主要在食品领域中的用途大幅扩大。许多植物性蛋白质,特别是在通常的食品pH范围即弱酸性中,由于可溶性、分散性、乳化性等功能性缺乏,所以在许多食品例如咖啡·增白剂、果汁等酸性饮料、调味品、蛋黄酱、乳酪等中的使用受到限制。但是,用本发明的方法,通过将例如小麦谷蛋白等植物性难溶解性蛋白质脱酰胺化,可溶性、分散性增加,从而可以在目前不适于使用的这些食品中使用,另外,也可以用作分散性高的油炸用粉。
另外,为了改善焙烤·糖食食品中的面团的质地,也可以使用本发明的方法。例如谷蛋白含量高的面团,延展性低,在面团的操作性和机械特性方面存在问题,另外,制成的面包的体积和品质也存在问题。通过用本发明的方法将谷蛋白脱酰胺化,延展性提高,可以改善这些问题。另外,脱酰胺化的谷蛋白还显示出作为乳化剂的效果,由此提高保存期限、柔软性等焙烤特性。而且,由于含有脱酰胺化谷蛋白的面团可塑性低且延展性优良,所以适合于薄脆饼干、饼干、曲奇饼干、比萨饼或者馅饼的皮的制造,在它们的制造中也可以使用本发明的方法。
而且,用本发明的方法处理成为起因于食品中的蛋白质的变态反应、不耐症或者遗传疾病等的原因的蛋白质,可以除去、减少其毒性、变应原性。
进一步,用本发明的方法可以降低蛋白质的矿物质敏感性,提高蛋白质·矿物质溶液中的可溶性矿物质含量,提高矿物质在人体中的吸收性。一般已知使用有机酸或酪蛋白磷肽可以增溶钙,从而提高食品中的钙在人体中的吸收性。根据相同的机理,通过用本发明的方法将蛋白质脱酰胺化,可以大量增溶钙。使用该脱酰胺化蛋白质,也可以制造含有高矿物质(例如钙)的饮料或者矿物质(例如钙)的吸收促进剂。
而且,在氨基酸类调味剂(动物性蛋白质的水解物(HAP)、植物性蛋白质的水解物(HVP)或者豆酱·酱油的制造中,也可以减少苦味,提高蛋白酶的蛋白质分解率,增强谷氨酸含量等。一般来说,苦味的原因来自疏水性肽,这是众所周知的,由脱酰胺带来苦味肽的减少。也已知在N末端具有谷氨酸的肽具有遮盖苦味的效果。
而且,可在蛋白质的功能改变中利用本发明。脱酰胺化的蛋白质是酶的场合,可以改变该酶的酶化学、物理化学的性质。例如通过用本发明的方法,将酶蛋白质脱酰胺化,可降低酶蛋白质的等电点,改变pH稳定性。另外,通过改变活性部位的结构或电环境,可以改变该酶的基质亲和性、基质特异性、反应速度、pH依赖性、温度依赖性、温度稳定性等。
而且,还可以用于谷类、豆类蛋白质的提取·浓缩效率的提高等方面。一般来说,小麦、大豆等谷类和豆类的蛋白质大多是不溶于水的蛋白质,不容易提取蛋白质,但如果对小麦粉或者大豆粉的悬浊液应用本发明的方法使之溶解,就可以容易地提取蛋白质,还可以得到高含量的蛋白质分离物。
在大豆蛋白质的场合,一般在从脱脂大豆粉或者片(蛋白质含量约50%)提取蛋白质时,首先通过热处理、乙醇处理或者在pH4.5附近的等电点处理使蛋白质不溶解后,除去可溶性多糖,得到蛋白质含量约70%的大豆蛋白质浓缩物(concentrate)。希望进一步高纯度的蛋白质的场合,通过将大豆粉或浓缩物悬浊·溶解在稀释的碱中,使蛋白质溶解,除去不溶性的物质来制备。该物质含有约90%蛋白质,被称为大豆蛋白质分离物(isolate)。这些大豆蛋白质制品利用大豆蛋白质的乳化性、凝胶化特性、保水性等功能性和高营养价值,可用于以火腿·香肠和婴儿用食品为主的各种食品中。
如果在制造这些大豆蛋白质制品时应用本发明,通过提高蛋白质的溶解性,不仅可以提高收率,而且可以制造更高浓度的蛋白质制品。如此得到的蛋白质制品由于脱酰胺化而功能性优越。因而,在畜肉、鱼肉制品、面类等各种食品中使用时,显示出优良的效果,另外,还可以制造具有新的质地和功能的食品。
另外,本发明的第1个方面包括脱酰胺化蛋白质的制造方法,其特征在于,包括使蛋白质(乳蛋白等)变性的步骤,和使酶作用于前述步骤中得到的变性蛋白质(变性乳蛋白等),将前述变性蛋白质(变性乳蛋白等)脱酰胺化的步骤,其中所述酶具有直接作用于蛋白质的酰氨基进行脱酰胺化而不伴有肽键的断裂和蛋白质的交联的作用。
接下来就本发明的第2个方面进行说明。如上所述,本发明的第2个方面是一种蛋白质(乳蛋白等)的变性方法,其特征在于,使酶作用于蛋白质(乳蛋白等),所述酶具有直接作用于蛋白质的酰氨基进行脱酰胺而不伴有肽键的断裂和蛋白质的交联的作用。
在此所谓具有直接作用于蛋白质的酰氨基进行脱酰胺而不伴有肽键的断裂和蛋白质的交联的作用的酶,是指上述蛋白质脱酰胺酶,和本发明的第1个方面一样,优选使用对于分子量5000以上的蛋白质(变性蛋白质)具有脱酰胺化作用的酶,特别优选使用对于分子量10000以上~2000000的范围的蛋白质具有脱酰胺化作用的酶。对于蛋白质脱酰胺酶的作用、制备方法等,如上所述。
在本发明的第2个方面中,通过将该蛋白质脱酰胺酶作用于蛋白质,将蛋白质脱酰胺化而变性。其中的蛋白质和本发明的第1个方面的情况一样,不仅包括仅由氨基酸残基组成的单纯蛋白质,还包含和糖、脂质等的复合体即复合蛋白质等。另外,关于分子量,优选5000以上,特别优选10000~2000000。例如,如果是植物性蛋白质,可以举出来源于豆类、谷类的蛋白质,如果是动物性蛋白质,可以举出酪蛋白、β-乳球蛋白等乳蛋白、卵清蛋白等卵蛋白、肌球蛋白、肌动蛋白等肉蛋白、血清白蛋白等血液蛋白、明胶、胶原等腱蛋白质。另外,也可以是用酸、碱等进行处理的化学部分分解蛋白质,或者用蛋白酶等进行处理的酶部分分解蛋白质,或者用各种试剂进行化学修饰的蛋白质。
蛋白质以溶液或者浆状或者糊状供给反应中。另外,含有蛋白质的溶液等不限于水溶液,也可以是和油脂的乳液。而且,也可以往溶液中添加其它的蛋白质、盐类、糖类、香料、保湿剂、着色剂等。
对蛋白质脱酰胺酶的反应条件(酶量、反应时间、温度、反应溶液的pH等)没有特别的限定,通常相对于1g蛋白质,为0.1~100Unit,优选1~10Unit,反应温度通常为5~80℃,优选20~60℃,反应溶液的pH通常为2~10,优选4~8,反应时间为10秒~48小时,优选10分钟~24小时。另外,可以根据所使用的酶的纯度或者蛋白质的种类、纯度等适当改变这些条件。
如上所述,通过将蛋白质脱酰胺酶作用于蛋白质,可以进行蛋白质的变性。即,可以得到变性蛋白质。该变性蛋白质是对蛋白质分解酶敏感性高的酶。因而,如果使蛋白质分解酶作用于该变性蛋白质,就可以更有效地得到蛋白质分解物。这样的蛋白质分解物的制造方法也包括在本发明中,具体地说,蛋白质分解物的制造方法也包括在本发明中,该方法的特征在于,包括用上述方法将蛋白质变性的步骤,以及使蛋白质分解酶作用于前述步骤中得到的变性蛋白质的步骤。
作为蛋白质分解酶,可以使用胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等公知的蛋白质分解酶。使用的蛋白质分解酶可以考虑分解对象的蛋白质的种类、蛋白质分解物的性状等适当选择。蛋白质分解酶的反应条件(酶量、反应时间、温度、反应溶液的pH等)也一样可以考虑分解对象的蛋白质的种类、状态和量等适当设定。
本发明的第2个方面的方法和第1个方面的发明一样,目的在于提高食品中的蛋白质的可溶性、分散性、发泡性、泡沫稳定性、乳化性、乳化稳定性这样的功能,可适用于各种食品中。另外,也可用在焙烤·糖食食品中的蛋白质的变应原性的除去、降低。而且,还可用在氨基酸类调味剂等的味质的改良。
另一方面,如果应用本发明的第2个方面的方法,为了能够提高蛋白质对蛋白分解酶的敏感性,在酶的HAP(动物性蛋白质的水解物)、植物性蛋白质的水解物(HVP)制造中,也可以改善作为问题之一的低分解率。
下面,列举实施例说明本发明的第1和第2个方面,但本发明不受这些实施例的限定。
蛋白质脱酰胺酶的制备在LB Base培养基中,在25℃培养金黄杆菌菌种No.9670(通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所,保藏号FERM BP-7351)40小时,在4℃,以12000rpm(22200×g)离心分离培养液20分钟,从而除去菌体,用超滤膜(SEP-0013,旭化成制)将所得离心上清液浓缩至约25倍后,冷冻干燥,得到粗酶粉末。将其溶解在含有2.0M NaCl的10mM磷酸钠缓冲液(pH6.5)中,通过在4℃、10000rpm(12300×g)下离心分离15分钟除去不溶物后,将所得离心上清液供给用含有2.0M NaCl的10mM磷酸钠缓冲液(pH6.5)平衡化的苯基琼脂糖CL-6B柱(Pharmacia社制),用从2.0M到0M的NaCl线性浓度梯度洗脱吸附的蛋白质。
收集蛋白质脱酰胺活性级分,用超滤膜浓缩后,供给用含有0.6MNaCl和0.05%吐温20的10mM磷酸钠缓冲液(pH6.5)平衡化的sephacryl S-100柱,用同样的缓冲液洗脱。用下述方法测定各级分的酶活性,收集蛋白质脱酰胺活性级分,用超滤膜浓缩,得到蛋白质脱酰胺酶溶液。
用下述的测定法(把Z-Gln-Gly作为基质的方法和把酪蛋白作为基质的方法)测定活性,得到33.7单位/ml(把Z-Gln-Gly作为基质)、13.5单位/ml(把酪蛋白作为基质)的酶标准品。
酶活性测定法酶活性的测定如下所述,作为基质,使用Z-Gln-Gly和酪蛋白。
活性测定方法将酶溶液10μl添加到100μl含有10mM Z-Gln-Gly的176mM磷酸缓冲液(pH6.5)中,在37℃温育60分钟后,加入12%三氯乙酸溶液100μl,停止反应。离心分离(15000rpm,4℃,5分钟)后,如下使用F-kit氨(Boehringer Mannheim社制)对上清液进行测定(A1)。另外,用水代替酶溶液,同样测定(A2)。
将上清液10μl和水190μl加入到F-kit氨100μl试剂2中,在室温下放置5分钟后,用100μl,测定340nm处的吸光度(E1)。往剩余的200μl中加入1.0μl的试剂3(谷氨酸盐脱氢酶)后,再在室温下放置20分钟后,测定剩余的200μl在340nm处的吸光度(E2)。
在上述条件下,把每分钟游离1μmol氨的酶量作为1个单位,按照下面的公式求出。
U/ml=1.76×[A1(E1-E2)-A2(E1-E2)]作为基质,使用1%酪蛋白(Hammarsten,Merck社制)代替10mMZ-Gln-Gly,同样求出活性,确认对和蛋白质键合的酰氨基发生作用。
用蛋白质脱酰胺酶处理变性α-乳清蛋白以10mg/ml的浓度,将α-乳清蛋白(Sigma社制)溶解在20mMTris-HCl缓冲液(pH7.0)中,以1.82μg/ml的浓度添加实施例1中得到的蛋白质脱酰胺酶,在42℃振荡。为了使α-乳清蛋白变性,作为变性剂(螯合剂),添加5mM的乙二胺四乙酸(Matsumura等人,Food Hydrocol.,Vol.8,555-566,1994),进行脱酰胺化反应。反应的时间过程示于图1中。在该图中,脱酰胺化率(Degree ofdeamidation,%)表示蛋白质中的全部谷氨酰胺残基中的脱酰胺化的谷氨酰胺残基的比例。从α-乳清蛋白的全部氨基酸序列(Brew等人,J.Biol.Chem.,Vol.245,4570-4582,1970)求出全部谷氨酰胺残基数,从在反应中游离的氨量求出脱酰胺化的谷氨酰胺残基数。
这样,认为通过使α-乳清蛋白变性(成为熔化的小球状态),可以显著促进蛋白质脱酰胺酶的脱酰胺反应。即,天然α-乳清蛋白在4小时的脱酰胺化率为20%,在24小时为55%,与此相对,变性状态(熔化的小球状态)的α-乳清蛋白在4小时的脱酰胺化率为61%,在24小时为66%。脱酰胺化反应速度和最终的脱酰胺化率两者都得到改善。
实施了蛋白质脱酰胺酶处理的α-乳清蛋白的高级结构的变化对实施例2中得到的各种脱酰胺化率的脱酰胺化α-乳清蛋白(D20脱酰胺化率20%,D55脱酰胺化率55%,D61脱酰胺化率61%)的高级结构的变化进行近紫外区域CD(circular dichroizm,圆二色性)分析,结果示于图2中。分析在含有2mM乙二胺四乙酸(图2A)或者2mM CaCl2(图2B)的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.0)中进行。作为对照,使用没有脱酰胺化的α-乳清蛋白(天然)。结果,无论在哪种溶液中,脱酰胺化的α-乳清蛋白在270nm附近的光谱强度都减少了。认为该减少度随着脱酰胺化率上升而增加。该事实意味着通过脱酰胺化,α-乳清蛋白中的侧链的芳香环基团被脱离,即3级结构被破坏。而且可以看出,该3级结构的破坏程度随着脱酰胺化率增加而增加。另外,一般已知,α-乳清蛋白在乙二胺四乙酸存在下,成为3级结构被破坏的状态,在钙存在下,得到稳定化(Kuwajima等人,Biochemistry,Vol,29,8240-8249)。认为这是因为没有脱酰胺化的α-乳清蛋白(天然)的光谱在乙二胺四乙酸存在下,与CaCl2存在下相比,强度大大减少。由高度脱酰胺化的α-乳清蛋白在钙存在下的光谱强度(图2B的D61)和没有脱酰胺化的α-乳清蛋白在乙二胺四乙酸存在下的光谱强度(图2A的天然)是大致相同的水平,表明脱酰胺化造成的3级结构的变化非常大,即使在钙的存在下也不能稳定化。
其次,对相同的样品,进行远紫外区域CD分析的结果示于图3中。分析在含有2mM乙二胺四乙酸(图3A)或者2mM CaCl2(图3B)的20mMTris-HCl缓冲液(pH7.0)中进行。这样,无论在哪种溶液中,脱酰胺化的α-乳清蛋白都显示出和作为对照的没有脱酰胺化的α-乳清蛋白(天然)大致类似的光谱。该事实表明,脱酰胺化的α-乳清蛋白在2级结构方面没有受到改变。
如此认为,通过用蛋白质脱酰胺酶进行脱酰胺化,可以使蛋白质变性。另外,与3级结构遭到破坏相对,该变性状态是2级结构得以保持的温和的变性状态,对蛋白质的功能性来说,是比较好的状态。
实施了蛋白质脱酰胺酶处理的α-乳清蛋白的胰蛋白酶分解用超滤膜将实施例2中得到的脱酰胺化α-乳清蛋白(脱酰胺化率46.5%)脱盐后,以10mg/ml的浓度,溶解在含有2mM CaCl2的20mMTris-HCl缓冲液(pH7.0)中,以基质蛋白质计,加入重量比1/100量的胰蛋白酶,在37℃反应。作为对照,对没有进行脱酰胺化处理的α-乳清蛋白进行同样的处理。在0.5、1、2、4、24小时后取样,在SDS电泳用的缓冲液中加热,停止反应,供给20%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果示于图4中。如图所示,对对照的没有进行脱酰胺化处理的α-乳清蛋白进行胰蛋白酶处理时,直至第4小时,完整的α-乳清蛋白的谱带几乎没有改变,虽然在24小时有些变薄,但没有观察到分解为低分子片段的肽(图4A)。另一方面,在脱酰胺化的α-乳清蛋白的场合,胰蛋白酶处理0.5小时,生成已经片段化的肽,同时,完整的α-乳清蛋白的谱带开始减少。反应后1小时,相当完整的α-乳清蛋白消失,2小时完全消失。片段化的肽也大部分在24小时消失,表明进行了分解(图4B)。
这样,通过用蛋白质脱酰胺酶进行脱酰胺化,使蛋白质变性,可以促进目的蛋白质的通过蛋白质分解酶进行的分解。
工业实用性如上所述,使用具有直接作用于蛋白质中的酰氨基进行脱酰胺化而没有肽键的断裂和蛋白质的交联的作用的酶,进行蛋白质的脱酰胺反应时,通过使用变性蛋白质作为脱酰胺化的蛋白质,可以显著改善脱酰胺化速度和脱酰胺化率。另外,通过使用具有直接作用于蛋白质中的酰氨基进行脱酰胺化而没有肽键的断裂和蛋白质的交联的作用的酶,进行蛋白质的脱酰胺反应,可以变性为对蛋白质分解酶的敏感性高的状态。该变性方法由于是以往不知的酶性蛋白质变性方法,所以可以避免以往的物理或者化学的蛋白质变性方法中是难题的、副反应的产生。另外,由本发明的变性方法得到的蛋白质由于蛋白质分解酶敏感性高,所以将其作为原料可以更有效地制造蛋白质分解物。另外,在本发明的方法中,通过温和的条件可以将蛋白质变性,所以具有可以得到乳化特性、泡沫特性、凝胶化特性等功能提高了的蛋白质的优点。
权利要求
1.一种乳蛋白的脱酰胺化方法,其特征在于,使酶作用于变性乳蛋白,其中该酶具有直接作用于蛋白质的酰氨基进行脱酰胺化而不伴有肽键的断裂和蛋白质的交联的作用。
2.权利要求1所述的方法,其特征在于,前述酶是对于分子量5000以上的蛋白质具有前述作用的酶。
3.权利要求1所述的方法,其特征在于,前述酶是对于分子量10000以上的蛋白质具有前述作用的酶。
4.权利要求1~3任一项所述的方法,其特征在于,前述酶来源于微生物。
5.权利要求4所述的方法,其特征在于,前述微生物属于金黄杆菌(Chryseobacterium)属、黄杆菌(Flavobacterium)属、稳杆菌(Empedobacter)属、鞘氨醇杆菌(Sphingobacterum)属、金杆菌(Aureobacterium)属或Myroides)属。
6.权利要求4所述的方法,其特征在于,前述微生物是属于金黄杆菌(Chryseobacterium)属的金黄杆菌菌种(Chryseobacteriumsp.)No.9670(FERM BP-7351)。
7.权利要求1~6任一项所述的方法,其特征在于,前述变性乳蛋白是用选自热、压力、酸、碱、变性剂、氧化剂、还原剂和螯合剂中的1种或2种以上进行变性处理得到的变性乳蛋白。
8.一种脱酰胺化乳蛋白的制造方法,其特征在于,包括使乳蛋白变性的步骤,以及使酶作用于前述步骤中得到的变性乳蛋白,将前述变性乳蛋白脱酰胺化的步骤,所述酶具有直接作用于蛋白质的酰氨基进行脱酰胺化而不伴有肽键的断裂和蛋白质的交联的作用。
9.权利要求8所述的方法,其特征在于,前述酶是对于分子量5000以上的蛋白质具有前述作用的酶。
10.权利要求8所述的方法,其特征在于,前述酶是对于分子量10000以上的蛋白质具有前述作用的酶。
11.权利要求8~10任一项所述的方法,其特征在于,前述酶来源于微生物。
12.权利要求11所述的方法,其特征在于,前述微生物属于金黄杆菌(Chryseobacterium)属、黄杆菌(Flavobacterium)属、稳杆菌(Empedobacter)属、鞘氨醇杆菌(Sphingobacterum)属、金杆菌(Aureobacterium)属或Myroides属。
13.权利要求11所述的方法,其特征在于,前述微生物是属于金黄杆菌(Chryseobacterium)属的金黄杆菌菌种(Chryseobacteriumsp.)No.9670(FERM BP-7351)。
14.权利要求11~13任一项所述的方法,其特征在于,前述变性步骤包括选自热、压力、酸、碱、变性剂、氧化剂、还原剂和螯合剂中的1种或2种以上的处理。
15.一种乳蛋白的变性方法,其特征在于,使酶作用于乳蛋白,所述酶具有直接作用于蛋白质的酰氨基进行脱酰胺化而不伴有肽键的断裂和蛋白质的交联的作用。
16.权利要求15所述的方法,其特征在于,前述酶是对于分子量5000以上的蛋白质具有前述作用的酶。
17.权利要求15所述的方法,其特征在于,前述酶是对于分子量10000以上的蛋白质具有前述作用的酶。
18.权利要求15~17任一项所述的方法,其特征在于,前述酶来源于微生物。
19.权利要求18所述的方法,其特征在于,前述微生物属于金黄杆菌(Chryseobacterium)属、黄杆菌(Flavobacterium)属、稳杆菌(Empedobacter)属、鞘氨醇杆菌(Sphingobacterum)属、金杆菌(Aureobacterium)属或Myroides属。
20.权利要求18所述的方法,其特征在于,前述微生物是属于金黄杆菌(Chryseobacterium)属的金黄杆菌菌种(Chryseobacteriumsp.)No.9670(FERM BP-7351)。
21.一种蛋白质分解物的制造方法,其特征在于,包括用权利要求15~20任一项所述的方法使蛋白质变性的步骤,以及使蛋白质分解酶作用于前述步骤中得到的变性蛋白质的步骤。
全文摘要
本发明提供一种在用具有直接作用于蛋白质中的酰氨基进行脱酰胺化而没有肽键的断裂和蛋白质的交联的作用的酶将乳蛋白脱酰胺时,改善其脱酰胺化率和脱酰胺化速度的方法。另外还提供乳蛋白的酶变性方法。使具有直接作用于分子量5000以上的蛋白质中的酰氨基进行脱酰胺化而没有肽键的断裂和蛋白质的交联的作用的蛋白质脱酰胺酶作用于预先变性的乳蛋白,进行脱酰胺化。另外,使用该酶进行乳蛋白的变性。
文档编号A23J3/18GK1543507SQ0280895
公开日2004年11月3日 申请日期2002年2月26日 优先权日2001年2月27日
发明者松村康生, 森友彦 申请人:天野酶株式会社

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