二羧酸生产工艺的制作方法

专利名称：：二羧酸生产工艺的制作方法二羧酸生产工艺本发明涉及用于发酵生产二羧酸的工艺。二羧酸(比如苹果酸、延胡索酸和琥珀酸)是重要的化合物,其在食品工业中用于食物制备和保存，在医药工业中用于配制药物制品，以及用于其他工业用途，例如(生物)聚合物的单体。可通过石油化学工艺或基于发酵的工艺，由细菌或真菌细胞生产二羧酸。已研究的用于二羧酸(比如琥拍酸)生产的细菌例如有E.col1、Mannheimiasp.、Actinobacillussp.或Corynebacteria0生产二羧酸的合适的真菌细胞有例如酵母，比如Saccharomyces或Yarrowia种，或丝状真菌比如pergillus或Rhizopus种。开发了用于生产二羧酸的若干工艺。W02009/081012公开了在厌氧条件和高二氧化碳浓度下通过发酵Escherichiacoli菌株生产琥珀酸的工艺。W02008/14462公开了在不同的二氧化碳浓度下通过发酵酵母生产苹果酸和琥珀酸的工艺。本发明的目的是以十分高的产率生产二羧酸的一种替代工艺。
发明内容本发明涉及用于生产二羧酸的工艺，其包括在合适的发酵培养基中发酵微生物，其中将在大气压下测量的包含30%至100%v/v的氧的气流添加至发酵培养基；以及生产二羧酸。本公开还涉及包含30%至100%v/v氧的气流用于在合适的发酵培养基中通过微生物生产二羧酸的用途。术语“二羧酸”和“二羧酸盐/酯”，比如“琥珀酸”和“琥珀酸盐/酯”在本文中具有相同的含义并互换使用，前者是后者的氢化形式。本文中使用的术语发酵(fermenting)或发酵(fermentation)是指由碳水化合物微生物生产诸如醇类或酸类的化合物。根据本公开的遗传修饰的或重组的微生物，或遗传修饰的或重组的微生物细胞在本文中被定义为下述细胞，其含有基因破坏(disruption)或含有微生物细胞中不天然存在的核苷酸序列或所述细胞用微生物细胞中不天然存在的核苷酸序列转化过或遗传修饰过，或所述细胞含有内源核酸序列的额外的拷贝或多个拷贝。野生型微生物细胞在本文中被定义为重组细胞的亲本细胞。基因破坏、或缺失或敲除表示基因的一部分或全部基因已从细胞中去除，或基因已被修饰使得基因不被转录为原始的编码的蛋白。当用来表示给定(重组)核酸(DNA或RNA)、基因或多肽分子和给定宿主生物或宿主细胞之间的关系时，术语“同源的”被理解为表示天然情况下所述核酸或多肽分子由相同物种的宿主细胞或生物生产，优选由相同品种或菌株的宿主细胞或生物生产。当用于核酸(DNA或RNA)或蛋白时，术语“异源的”是指下述核酸、基因或蛋白质，所述核酸、基因或蛋白质不作为其出现的生物、细胞、基因组或DNA或RNA序列的一部分天然存在，或者存在于与其天然存在不同的细胞或基因组或DNA或RNA序列中的一个或多个位置中。异源核酸或蛋白质对引入它的细胞而言不是内源的，而是得自另一细胞或合成生产或重组生产的。可过表达在本文中公开的重组微生物中的基因。本领域中有已知的方法用于过表达编码酶的基因。可以通过提高细胞中编码酶的基因的拷贝数，例如通过在细胞的基因组中整合额外的基因拷贝，通过表达来自着丝粒载体、来自附加体多拷贝表达载体的基因，或者通过引入包含多拷贝基因的(附加体)表达载体，来过量表达编码酶的基因。用(强)组成型启动子实现编码根据本发明的酶的基因的过表达。用于微生物细胞，比如细菌和真菌的启动子对本领域技术人员而言是公知的。用于真菌细胞的合适的启动子可以是但不限于，TDHUTDH3、GAL7、GALlO,GALUCYCUHIS3、ADH1、PH05、ADCl、ACTl、TRPl、URA3、LEU2、ENOl、TPI1、A0X1、PGL、GPDA和GAPDH0其他合适的启动子包括roCl、GPDl、PGKl和TEF1。可将编码酶的基因连接进核酸构建体，例如质粒，比如低拷贝质粒或高拷贝质粒中。根据本发明的微生物细胞可包含单个拷贝，但是优选地包含多个拷贝的基因，这例如通过多拷贝的核苷酸构建体来实现。核酸构建体可以保持为附加体，并因此包含用于自主复制的序列，比如自主复制序列和着丝粒(SikorskiandHieter，1989，Geneticsl22，19-27)。在本发明的工艺中的微生物细胞是真菌细胞的情况下，合适的附加体核酸构建体可例如基于酵母2μ或pKDl质粒(Gleeretal.，1991,Biotechnology9:968-975)或AMA质粒(Fierroetal.,1995,Curr.Genet.29:482-489)。或者，可以将每种核酸构建体以一个或多个拷贝整合进真核细胞的基因组中。进入细胞基因组的整合可以通过非同源重组随机发生，可以如本领域所公知的,通过同源重组将核酸构建体整合进细胞的基因组中。发明详沭本发明涉及用于生产二羧酸的工艺，其包括在合适的发酵培养基中发酵微生物，其中将在大气压下测量的包含30%至100%v/v的氧的气流添加至发酵培养基；以及生产二羧酸。在一种实施方式中，当在大气压下测量时，添加至发酵培养基的气流包含例如40%至100%v/v,或50%至100%v/v，例如70%至100%v/v或80%至100%v/v或90%至100%v/v氧或95%至100%v/v氧或约100%v/v氧。技术人员知道发酵罐中的局部气压可改变。发酵罐中的局部气压通常是静水压力和发酵罐的顶部空间中压力的结果。顶部空间中的压力可以是大气压。通常将轻微的超压应用在顶部空间中，所述超压例如在0.1和0.5bar超压之间。本文中使用的超压是高于大气压的任何压力。我们令人吃惊地发现，将30%至100%v/v氧(O2)的气流添加发酵培养基，导致二羧酸，比如琥珀酸的高产率(每底物的产物量)，所述产率与当使用包含过量二氧化碳(CO2)的气流时的产率相当。本文中使用的高产率被定义为二羧酸/底物的量为至少0.3，例如至少0.35、例如至少0.4,0.5,0.6,0.7或0.8且通常低于I的产率。发现根据本发明的工艺对于其中在发酵期间掺入一种或多种二氧化碳分子的二羧酸生产而言是有优势的。令人吃惊地，发现，本文中公开的微生物能在高氧压下吸入足够的氧，将氧转化为二氧化碳，所述二氧化碳被转化为二羧酸。发现根据本发明的工艺对于不能从二羧酸的发酵生产中得到足够的能量(ATP)的微生物而言是尤其有优势的。根据本公开的工艺的另一优势在于不需要额外的二氧化碳气流而以十分高的产率生产二羧酸。该发现对于以工业规模生产二羧酸的工艺而言是尤其有优势的。在一种实施方式中，以范围在0%和10%之间，例如在0.1%和8%之间、例如在0.5%和5%之间或在1%和2%之间的氧的分压(p02)进行根据本发明的工艺。发现，通过将氧分压保持在10%以下，可防止氧累积以及导致的微生物毒性状况的发生。可例如通过搅拌发酵培养基和/或通过喷出气流穿过发酵培养基，来保持范围在10%和0%之间的氧分压(O2)。用于以10%以下的氧分压生产二羧酸进行工艺的另一优势在于:较之以高于10%的氧分压进行的工艺，可获得更高的二羧酸产率。可通过在本文中公开的工艺生产的二羧酸可以是例如琥珀酸、延胡索酸(富马酸)、苹果酸或己二酸，例如琥珀酸。将包含30%至100%v/v氧的气流添加至本公开的工艺中的发酵培养基，可以以任何合适的方式进行，例如通过将气流添加至发酵罐中的液相或气相，这对本领域技术人员而言是已知的。添加包含30%至100%v/v氧的气流优选地以连续方式进行。以连续方式添加包含氧的气流表示氧可以不断添加，即没有间断地添加至发酵培养基。或者，氧可以在Isec和5min之间，例如在5sec和2min之间，例如在IOsec和Imin之间的短的时间间隔下连续添加至发酵培养基。根据本公开的工艺包括发酵能生产二羧酸的任何合适的微生物，例如细菌或真菌细胞。合适的细菌细胞可例如属于Mannheimia,比如M.succiniciproducens、Actinobacillus,比如A.succinogenes、Anaerobiospirillum、Bacteroides、Succinimonas、Escherichia,比如E.coli。合适的真菌细胞例如属于Saccharomyces、Aspergillus、Penicillium、Pichia、Kluyveromyces、Yarrowia、Candida、Hansenula、Humicola、Issatchenkia、Torulaspora、Trichosporon、Brettanomyces、Rhizopus、Zygosaccharomyces>Pachysolen或Yamadazyma属。真菌细胞可例如属于Saccharomycescerevisiae、Saccharomycesuvarum、Saccharomycesbayanus、Aspergillusniger、Penicilliumchrysogenum、Pichiastipidis、Kluyveromycesmarxianus、K.lactis、K.thermotolerans、Yarrowialipolytica、Candidasonorensis、C.glabrata、Hansenulapolymorpha、Issatchenkiaorientalis、Torulasporadelbruecki1、Brettanomycesbruxellensis、Rhizopusoryzae或Zygosaccharomycesbailii种。在一种实施方式中，本发明工艺中的真菌细胞是酵母，例如属于Saccharomycessp.,比如Saccharomycescerevisiae的酵母。在一种实施方式中，在本文中公开的工艺包括发酵经遗传修饰的微生物，即重组微生物。重组微生物可例如是重组酵母，例如重组Saccharomyces,比如S.cerevisiae。本文中使用的重组微生物可表达，例如可过表达编码磷酸烯醇式丙酮酸酯(PEP)羧激酶的基因。催化从磷酸烯醇式丙酮酸酯到草酰乙酸酯的反应的任何PEP-羧激酶(4.1.1.49)可适于在微生物细胞中过表达。微生物可表达异源的PEP羧激酶，比如得自Escherichiacol1、Mannheimiasp.、Actinobacillussp.或Anaerobiospirillumsp.,更优选地Mannheimiasucciniciproducens、Actinobacillussuccinogenes或Anaerobiospirillumsucciniciproducens的PEP羧激酶。在本文中公开的工艺中的微生物可表达，例如可过表达编码丙酮酸羧化酶(PYC)的核苷酸序列，例如可过表达内源的或同源的丙酮酸羧化酶。本文中使用的微生物可进一步表达，例如可过表达编码苹果酸酯脱氢酶(MDH)的基因。MDH可以是催化从草酰乙酸酯到苹果酸酯的反应的任何合适的同源的或异源的苹果酸酯脱氢酶(EC1.1.1.37)ο在微生物是酵母比如S.cerevisiae的情况下，MDH可以来自S.cerevisiae的MDH3。本文中使用的微生物细胞可表达，例如可过表达编码延胡索酸酶(EC4.2.1.2)的基因，所述延胡索酸酶催化从苹果酸到延胡索酸的反应。编码延胡索酸酶的基因可以是得自任何合适的来源，例如来自微生物来源，例如来自酵母比如Saccharomyces或丝状真菌，比如Rhizopusoryzae的基因。本文中使用的微生物可表达，例如可过表达编码NAD(H)-依赖型延胡索酸酯还原酶(EC1.3.1.6)的任何合适的异源的或同源的基因，所述NAD(H)-依赖型延胡索酸酯还原酶催化从延胡索酸酯到琥珀酸酯的反应。NADH-依赖型延胡索酸酯还原酶可以是异源酶，其可得自任何合适的来源，例如细菌、真菌、原生动物或植物。本文中使用的微生物可包含异源NAD(H)-依赖型延胡索酸酯还原酶，所述NAD(H)-依赖型延胡索酸酯还原酶例如得自Trypanosomasp,例如Trypanosomabrucei。微生物可表达，例如可过表达编码二羧酸转运蛋白的基因。二羧酸转运蛋白可以是同源的或异源的蛋白。二羧酸转运蛋白可以是例如来自Schizosaccharomycespombe的苹果酸转运蛋白(MAE)。本文中公开的用于生产二羧酸的工艺中的重组微生物可包含编码乙醇发酵途径的酶的基因破坏。编码乙醇发酵途径的酶的基因可以是催化从丙酮酸酯到乙醛的反应的丙酮酸脱羧酶(EC4.1.1.1)，或催化从乙醛到乙醇的反应的醇类脱氢酶(EC1.1.1.1)。在本文中公开的工艺中的微生物可包含编码醇类脱氢酶的一个、两个或多个的基因的破坏。在微生物是酵母，例如Saccharomycescerevisiae的情况下，S.cerevisiae可包含醇类脱氧酶基因ADHl和/或ADH2的破坏。在本文中公开的用于生产二羧酸的工艺可包括发酵重组微生物，所述微生物过表达编码从磷酸烯醇式丙酮酸酯羧激酶、苹果酸酯脱氢酶、延胡索酸酶、NAD(H)-依赖型延胡索酸酯还原酶、丙酮酸羧化酶和二羧酸转运蛋白的组中选择的酶的基因。优选地，重组微生物是真菌细胞，比如酵母，例如Saccharomyces,例如S.cerevisiae。所述基因可例如被整合进细胞的基因组中。在本公开的工艺中的微生物是真菌细胞，比如酵母的情况下，本文中描述的基因优选地在细胞溶质中表达。例如，在线粒体或过氧化物酶体靶向信号存在于编码用于根据本发明生产二羧酸的合适的酶的基因中的情况下，可通过去除线粒体或过氧化物酶体靶向信号，来获得细胞溶质的表达。本发明工艺中的发酵培养基可包含允许通过发酵微生物生产二羧酸的任何合适的营养物，比如碳源、氮源和痕量元素。合适的碳源可以是例如葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、棉子糖或甘油。合适的氮源可以是例如铵或尿素。用于生产本公开的二羧酸的工艺可以在I和8之间的任何合适的pH下进行。合适的PH取决于本发明工艺中的微生物，这通常被本领域技术人员所已知。在微生物是真菌细胞的情况下，根据本发明的工艺可以在例如2和7之间，例如3和5之间的pH下进行。用于根据本公开生产二羧酸的工艺可以在取决于微生物的任何合适的温度下进行。本公开的工艺可以在5°C和60°C之间，或在10°C和50V之间，例如在15°C和45°C之间，或在20°C和40°C之间进行。本领域技术人员知道用于发酵特定微生物的最适温度。在另一实施方式中，本公开的工艺还包括通过本领域中已知的合适的方法，例如通过结晶、铵沉淀或离子交换技术从发酵培养基中回收二羧酸。在另一实施方式中，根据本公开的工艺还包括在药物、化妆品、食品或饲料产物中使用制备的二羧酸。在根据本发明的工艺中产生的二羧酸可例如被转化为聚酯聚合物。琥珀酸可被例如进一步转化为聚琥珀酸丁二酯(PBS)。在另一实施方式中，以工业规模进行根据本发明的工艺。工业规模在本文中被定义为在至少10升、优选地至少100升、优选地至少I立方米(m3)、更优选地至少10、100或1000或2000立方米(m3)，通常10，000立方米(m3)以下的体积中进行的发酵工艺。在另一实施方式中，本发明涉及包含30%至100%v/v氧的气流用于在合适的发酵培养基中通过微生物生产二羧酸的用途。附1.质粒pPWT006的物理图谱。图2.质粒pPSUC044的物理图谱。图3.质粒pPWT007的物理图谱。图4.质粒pSUC047的物理图谱。图5.pB0L034的物理图谱。图6.pSUC091的物理图谱。图7.Southern印迹放射自显影。用PspOMI/Afel(泳道I)和BmgBI/Aflll(泳道2)消化野生型菌株SUC-347的染色体DNA。将印迹与特异性MDH3-探针杂交。标记物(M)表示标记的IkB加的梯度(Invitrogen)。图8.Southern印迹放射自显影。用Not1、SpeI和XhoI(泳道I)和ApaI(泳道2)消化的野生型菌株SUC-347的染色体DNA。将印迹与特异性FRDg-探针杂交。标记物(M)表示标记的IkB加的梯度(Invitrogen)。图9.野生型SIT4-基因座的物理图谱(A组)，和通过整合质粒pSUC047引入MDH3、FUMR和SpMAEl合成构建体，随后通过分子内重组导致载体和选择性标记物序列丢失之后的物理图谱(B组)。示出了用于Southern印迹的探针和用于诊断PCR的引物的杂交。图10.野生型SIT2-基因座的物理图谱(A组)，和通过整合质粒pSUC044引入PCKa和FRDg合成构建体，随后分子内重组导致载体和选择性标记物序列丢失之后的物理图谱(B组)。示出了用于Southern印迹的探针和用于诊断PCR的引物的杂交。图11.野生型ADHl-基因座的物理图谱和周围的基因座(A组)的物理图谱，和通过将质粒PSUC091整合进菌株SUC-347而引入URA3PCR片段和PYC2合成构建体，导致菌株SUC-401的物理图谱(B组)。示出了用于诊断PCR的引物结合位点(B组)。正确整合给出了具有引物SEQIDN0:19和SEQIDNO:20的1356bp条带(泳道I)和具有引物SEQIDNO:21和SEQIDNO:22的1252bp条带(泳道2)。如果没有发生整合，预期没有PCR产物。实施例实施例1菌株SUC-401的构律:将某闵PCKa.MDH3、FUMR、FRDg.SpMAEl和PYC2引入S.cerevisiae的基因组1.1构建用于生产琥珀酸的含有还原性TCA循环的基因的表达载体如下构建如图2所展示的质粒pSUC044:将下述质粒pPWT006(图1)用限制性酶MluI和ApaI消化，所述质粒pPWT006由YGR059w(SPR3)或SIT2-基因座(Gottlin-NinfaandKaback(1986)MolecularandCellBiologyvol.6，n0.6，2185-2197)和允许选择在抗生素G418上的以及能在乙酰胺上生长的转化体的标记物构成。赋予G418抗性的kanMX-标记物分离自p427TEF(DualsystemsBiotech),含有amdS-标记物的片段已在文献中描述(Swinkels,B.ff.,Noordermeer,A.C.M.andRenniers,A.C.Η.M(1995).TheuseoftheamdScDNAofAspergillusnidulansasadominant,bidirectionalselectablemarkerforyeasttransformation.YeastVolumell,Issuel995A,pageS579;和US6051431)。通过Sloning(Puchheim,德国)合成了如在专利申请W02009/065778中公开的来自Trypanosomabrucei的编码延胡索酸酯还原酶(FRDg)的基因和如在专利申请W02009/065780中公开的来自Actinobacillussuccinogenes的编码憐酸烯醇式丙酮酸酯羧激酶(PCKa)的基因。合成了包含适当的限制性位点的特异性启动子；基因(终止子)序列。如在专利申请W02008/000632中所公开的，对基因序列进行密码子对优化用于在Saccharomycescerevisiae中表`达。合成基因处于来自S.cerevisiae的强启动子，即控制FRDg-基因表达的TDH3-启动子和控制PCKa-基因的TPI1-启动子的控制下(或合成基因可操作地与上述启动子连接)。通过来自S.cerevisiae的终止子序列，即控制FRDg-基因的TDH3-终止子和控制PCKa-基因的在质粒pPWT006上存在的PMAl-终止子来控制合适的终止。TDH3-启动子；FRDg-基因；TDH3-终止子序列周围有独特的限制性酶位点MluI和ApaI。TPIl-启动子、PCKa-基因序列周围有独特的限制性酶位点ApaI和BsiWI。将FRDg合成构建体克隆进用MluI和ApaI消化的pPWT006，这导致中间质粒pPWT006_FRDg。将PCKa合成构建体克隆进用ApaI和BsiWI消化的pPWT006_FRDg，这导致质粒pSUC044(SEQIDNO:25，图2)。如下构建如图4所展示的质粒pSUC047:将下述质粒pPWT007(图3)用限制性酶MluI和ApaI消化，所述质粒pPWT007由YEL023c或SIT4-基因座(Gottlin-NinfaandKaback(1986)MolecularandCellBiologyvol.6,n0.6,2185-2197)以及允许选择在抗生素G418上的以及能在乙酰胺上生长的转化体的标记物构成。通过Sloning(Puchheim,德国)合成了如在专利申请W02009/065778中公开的来自Saccharomycescerevisiae的编码苹果酸酯脱氢酶(MDH3)的基因、如在专利申请W02009/065779中公开的来自Rhizopusoryzae的编码延胡索酸酶(FUMR)的基因和如在专利申请W02009/065778中公开的来自Schizosaccharomycespombe的编码苹果酸转运蛋白(SpMAEl)的基因。合成了包含适当的限制性位点的特异性启动子；基因；终止子序列。如在专利申请W02008/000632中公开的，对基因序列进行密码子对优化用于在Saccharomycescerevisiae中表达。合成基因处于(或可操作地连接至)来自S.cerevisiae的强启动子，即控制MDH3-基因表达的TDH3-启动子、控制FUMR-基因的TPI1-启动子和控制SpMAEl基因的ENOl-启动子的控制下(或合成基因可操作地与上述启动子连接)。通过来自S.cerevisiae的终止子序列，即控制MDH3-基因的TDH3-终止子、在质粒pPWT006上存在的控制PCKa-基因的PMAl-终止子和控制SpMAEl-基因的ENOl-终止子来控制合适的终止。TDH3-启动子；MDH3-基因；TDH3_终止子序列周围有独特的限制性酶位点MluI和ApaI。TPI1-启动子、FUMR-基因序列周围有独特的限制性酶位点——处于5’末端的Apa1、AscI和NotI和处于3，末端的Bsiff10ENOl-启动子；SpMAEl_基因；EN01-终止子序列周围有独特的限制性酶位点MluI和ApaI。将MDH3合成构建体克隆进用MluI和ApaI消化的PPWT007，这导致中间质粒pPWT007-MDH3。将FUMR合成构建体克隆进用ApaI和BsiWI消化的pPWT007-MDH3，这导致质粒pSUC046。将SpMAEl合成构建体克隆进用AscI和NotI消化的pSUC046，这导致质粒pSUC047(SEQIDNO:26，图4)。含有IOOObpY0L086C(ADHl)启动子序列(紧邻Y0L086C的起始密码子的IOOObp)、500bpY0L086C(ADHl)终止子序列(紧邻终止密码子下游500bp)和插入的基因序列的质粒pB0L034(图5)用作构建pSUC091(图6)的宿主载体。使用质粒pRS416(SikorskiandHieter,1989)作为模板，获得URA3-启动子；URA3-基因；URA3-终止子PCR片段(正向引物SEQIDNO:1，反向引物SEQIDN0:2)。引物含有适当的限制性酶位点——正向引物的MluI和反向引物的BsrGI，用于对PCR片段进行进一步的亚克隆。通过Geneart(Regensburg,德国)合成如在专利申请W02009/065780中所公开的来自Saccharomycescerevisiae的编码丙酮酸羧化酶(PYC2)的基因序列。合成包含适当的限制性位点的特异性启动子；基因；终止子序列。如在专利申请W02008/000632中公开的，对基因序列进行密码子对优化用于在Saccharomycescerevisiae中表达。合成基因处于来自S.cerevisiae的强启动子，即控制PYC2-基因表达的PGKl-启动子的控制下(或合成基因与上述启动子可操作地连接)。通过来自S.cerevisiae的终止子序列，即控制PYC2-基因的PGKl-终止子来控制合适的终止。PGKl-启动子；PYC2-基因；PGK1_终止子序列周围有独特的限制性酶位点StuI和MluI。用BsrG1、PsiI和SnaBI限制pB0L034,用MluI和BsrGI限制URA3PCR片段以及用StuI和MluI限制PGKl-启动子、PYC2-基因、PGKl-终止子序列之后，通过3-点连接将三个DNA片段连接起来，以产生质粒pSUC091(SEQIDNO:27:图6)。1.2酵母转化根据供应商的指导，使用预先用SfiI(NewEnglandBiolabs)线性化的质粒PSUC047转化CEN.PK113-5D(MATaura3,52HIS3LEU2TRP1MAL2-8SUC2)。在存在于质粒PPWT007上的SIT4-基因(命名为SIT4A，见图3)的序列中设计合成SfΠ-位点。将转化混合物在每ml含有ΙΟΟμgG418(SigmaAldrich)的YPD-琼脂(每升:10克酵母提取物、每升20克蛋白胨、每升20克右旋糖、20克琼脂)上铺平板。两到四天之后，平板上出现菌落，而阴性对照(即在转化实验中不添加DNA)导致空白的YPD/G418-平板。或者，在含有乙酰胺的琼脂平板上选择阳性转化体，由于在DNA构建体整合之后乙酰胺酶(amdS)标记物的存在，所述乙酰胺用作唯一氮源。为此，将转化混合物在琼脂乙酰胺琼脂平板(每升:20克琼脂、每升20克磷酸二氢钾、每升0.5克的七水硫酸镁、70晕升32%半乳糖、I毫升50%右旋糖、12.5毫升400mM乙酰胺(Sigma)、lml维生素和Iml痕量元素)(维生素和痕量元素的组成在文献(VerduynC,PostmaE,ScheffersWA,VanDijkenJP.Yeast,1992Jul;8(7):501-517)中描述)上铺平板。两到四天之后，平板上出现菌落，而阴性对照(即在转化实验中不添加DNA)导致空白的乙酰胺琼脂-平板。将整合质粒PSUC047导向SIT4-基因座。使用PCR技术，表征在SIT4-基因座处整合有MDH3、FUMR和SpMAEl基因的正确转化体。使用SEQIDN0:3和4以及SEQIDN0:5和6表示的引物，进行指示在SIT4-基因座处正确整合的PCR反应。用SEQIDNO:4和5引物对，检查整合一个拷贝的质粒PSUC047。如果质粒pSUC047以多个拷贝整合(头尾相接整合)，SEQIDN0:4和5引物对将给出PCR-产物。如果没有后者的PCR产物，这表示pSUC047的一个拷贝整合。对于MDH3而言使用SEQIDNO:7和8表示的引物、对FUMR而言使用SEQIDNO:9和10表示的引物和对SpMAEl而言使用SEQIDNO:11和12表示的引物，通过PCR证实合成基因序列的引入。其中在SIT4-基因座中整合一个拷贝的质粒pSUC047的菌株(命名为CEN.PK113-5D-pSUC047)用于标记物补救(见1.3部分)。得到的无标记物的菌株被命名为SUC-270(MATaura3,52HIS3LEU2TRPlsit4::TDH3p-MDH3-TDH3t;ENOlp-SpMAEl-ENOlt;TPIIp-FUMR-PMAltMAL2-8SUC2)。根据供应商的指导，使用预先用线性化的SfiI(NewEnglandBiolabs)的质粒PSUC044转化菌株SUC-270。在质粒pPWT006(命名为SIT2A，见图1)上的SIT2-基因序列中设计合成Sfi1-位点。如上所述的将转化混合物铺平板。两到四天之后，平板上出现菌落，而阴性对照(即在转化实验中不添加DNA)导致空白的YPD/G418-平板。整合质粒pSUC044导向SIT2-基因座。使用PCR技术表征在SIT2基因座处有PCKa和FRDg基因整合的正确转化体。用SEQIDNO:13和4以及SEQIDNO:5和14表示的引物进行表示在SIT2-基因座处正确整合的PCR反应。用SEQIDN0:4和5引物对，检查质粒pSUC044的一个拷贝的整合。如果质粒PSUC044以多个拷贝整合(头尾相接整合)，SEQIDN0:4和5引物对会给出PCR-产物。如果没有后者的PCR产物，这表示pSUC044的一个拷贝整合。对PCKa而言使用SEQIDNO:15和16表示的引物，对FRDg而言使用SEQIDNO:17和18表示的引物，通过PCR证实合成基因序列的引入。将得到的单拷贝整合菌株命名为SUC-304，其随后用于标记物-补救(见1.3部分)，产生无标记物的菌株SUC-347(MATaura3,52HIS3LEU2TRPlsit2::TPIIp-PCKa-PMAlt;TDH3p-FRDg-TDH3tsit4::TDH3p-MDH3_TDH3t;ENOlp-SpMAEl-ENOIt;TPIIp-FUMR-PMAltMAL2-8SUC2)。通过Southern印迹分析进一步分析菌株SUC-347(见1.4部分)。使用预先用限制性酶Swal、Sail和ClaI(图6)线性化的6.4kB质粒pSUC091片段转化菌株SUC-347。将转化混合物在酵母氮基(YNB)w/oAA(Difco)+2%葡萄糖上铺平板。最初选择尿嘧啶原养型的正确转化体，因为亲本菌株具有尿嘧啶营养缺陷(ura3，52)，所述尿嘧啶营养缺陷通过功能性的URA3基因拷贝来补足。使用SEQIDNO:19和20以及SEQIDNO:21和22表示的引物，通过PCR对转化体进一步分析，来证实URA3PCR产物和PYC2合成构建体正确靶向进adhl基因座，使用SEQIDNO:23和24表示的引物，来证实PYC2合成构建体的存在(图11)。得到的菌株被命名为SUC-401(MATaura3,52HIS3LEU2TRPlsit2::TPIIp-PCKa-PMAlt;TDH3p-FRDg-TDH3tsit4::TDH3p-MDH3-TDH3t;EN01p-SpMAEl-EN0It;TPIIp-FUMR-PMAltadhl::PGKlp-PYC2-PGKlt;URA3p-URA3-URA3tMAL2-8SUC2)。1.3标记物补救为了能使用相同的选择标记物用其他构建体转化酵母菌株，去除选择性标记物是必要地。这样设计质粒PSUC044和pSUC047:使得当pSUC044和pSUC047整合进染色体时，同源的序列彼此密切接近。这种设计允许选择性标记物通过这些同源区域的自发的分子内重组而被丢失。当无性生长时，尽管以低的频率发生，但是会发生分子内重组。该重组频率取决于同源长度和基因组中的基因座(未公布的结果)。当将培养物的亚组分连续转移至新鲜培养基时，分子内重组将随着时间累积。为此，将起始自单菌落隔离群的菌株CEN.PK113-5D-pSUC047和SUC-304在YPD-培养基(每升:10克酵母提取物、每升20克蛋白胨、每升20克右旋糖)中培养。将25μI的过夜培养物用来接种新鲜YI3D培养基。至少五次这种连续转移之后，测量培养物的光密度并将细胞稀释至约5000/ml的浓度。将ΙΟΟμI的细胞悬浮液在含有30mMKPi(pH6.8)、0.1%(NH4)2S04、40mM氟-乙酰胺(Amersham)和1.8%琼脂(Difco)的酵母碳基培养基(Difco)上铺平板。与菌株CEN.PK113-5D-pSUC047和SUC-304的细胞相同的细胞(没有细胞内重组的细胞)仍含有amdS-基因。对于这些细胞，氟-乙酰胺是有毒性的。这些细胞将不能在含有氟-乙酰胺的培养基上生长并且不形成菌落。但是如果已发生了分子内重组，已丢失选择性标记物的CEN.PK113-5D-pSUC047和SUC-304将能在氟-乙酰胺培养基上生长，因为它们不能将氟-乙酰胺转化为生长抑制性化合物。这些细胞将在该琼脂培养基上形成菌落。使用SEQIDN0:3和4以及SEQIDNO:5和6引物，使获得的CEN.PK113-5D-pSUC047的氟-乙酰胺抗性菌落经受PCR分析。如果选择性标记物的重组已如期望的发生，SEQIDN0:5和6引物会给出条带。结果，处于强酵母启动子控制下的带有基因MDH3、FUMR和SpMAEl的表达盒已被整合进宿主菌株的基因组的SIT4-基因座中。在该种情况下，使用SEQIDN0:3和4引物的PCR反应不产生PCR产物，因为这些引物结合在由于重组而应被丢失的区域中。如果用后者的引物获得了条带，这表示在基因组中存在完整的质粒PSUC047，所以没有发生重组。如果SEQIDNO:5和6引物不产生PCR产物，已发生了重组，但所述重组是以完整的质粒PSUC047已被重组出基因组的方式发生。不仅仅丢失了选择性标记物，还丢失了引入的基因。事实上，恢复了野生型酵母。使用SEQIDNO:13和4以及SEQIDNO:5和14引物，使获得的氟-乙酰胺抗性SUC-304菌落经受PCR分析。如果已如所期望的发生了选择性标记物的重组，SEQIDNO:5和14引物将得到条带。结果，处于强酵母启动子控制下的有基因PCKa和FRDg的表达盒已被整合进宿主菌株的基因组的SIT2-基因座中。在该种情况下，使用SEQIDN0:13和4引物的PCR反应不会产生PCR产物，因为这些引物结合在由于重组而被丢失的区域中。如果用后者的引物获得了条带，这表示在基因组中存在完整的质粒PSUC044，因为没有发生重组。如果SEQIDN0:5和14引物不产生PCR产物，已发生了重组，但所述重组是以完整的质粒PSUC044已被重组出基因组的方式发生。不仅仅丢失了选择性标记物，还丢失了引入的基因。事实上，恢复了野生型酵母。1.4Southern印迹对菌株SUC-347进行Southern印迹分析。对每个整合基因座，使用不同的酶进行双重检验(doublecheck)以限制分离自SUC-347的基因组DNA。为了证实MDH3、FUMR和SpMAEl是否在SIT4基因座处正确整合以及标记物序列是否被重组出，将来自菌株SUC-347的基因组DNA纯化并用Notl/Spel/Xhol或ApaI限制。使用质粒(如在专利申请W02009/065778中所公开的)pGBS415FUM_3作为模板，用SEQIDNO:78引物制备MDH3探针。为了证实PCKa和FRDg是否在SIT2基因座处正确整合以及标记物序列是否被重组出，将来自菌株SUC-347的基因组DNA纯化并用PspOMI/Afel或BmgBI/AfIII限制。使用质粒pGBS414PPK-3(如在专利申请W02009/065778中所公开的)作为模板，SEQIDNO:17和18引物，制备FRDg探针。杂交试验的结果在图7和8中示出。期望的杂交模式可以自如图9和10(B组)所示的物理图谱推导出。表I提供了在进行杂交反应后期望的条带和观察到的条带的总览。如所期望的，观察到所有的条带，这表示获得了在SIT4-基因座处有MDH3、FUMR和SpMAEl整合和在SIT2-基因座处有FRDg整合的无标记的菌株。表1.菌株SUC-347的Southern印迹结果的总览权利要求1.用于生产二羧酸的工艺，其包括在合适的发酵培养基中发酵微生物，其中将在大气压下测量的包含30%至100%v/v氧的气流添加至发酵培养基；以及生产二羧酸。2.根据权利要求1的工艺，其中以连续方式将包含30%至100%v/v氧的气流添加至发酵培养基。3.根据权利要求2的工艺，其中在0%至10%v/v之间范围的氧分压(O2)下进行所述工艺。4.根据权利要求1至3的任一项的工艺，其中所述微生物是酵母，优选地是Saccharomyces05.根据权利要求1至4的任一项的工艺，其中所述微生物是重组微生物。6.根据权利要求1至5的任一项的工艺，其中所述重组微生物过表达编码选自由下述酶组成的组的酶的基因:磷酸烯醇式丙酮酸酯羧激酶、苹果酸酯脱氢酶、延胡索酸酶、(NAD(H)-依赖型延胡索酸酯还原酶、丙酮酸羧化酶和二羧酸转运蛋白。7.根据权利要求1至6的任一项的工艺，其中所述二羧酸是苹果酸、延胡索酸、琥珀酸或己二酸。8.根据权利要求1至7的任一项的工艺，其中所述发酵在2和7之间的pH下进行。9.根据权利要求1至8的任一项的工艺，还包括从发酵培养基回收所述二羧酸。10.根据权利要求9的工艺，还包括在药物、化妆品、食品或饲料产物中使用所述二羧酸。11.根据权利要求9的工艺，其中所述二羧酸被进一步转化为聚酯聚合物。12.根据权利要求1至11的任一项的工艺，其中所述工艺在工业规模上进行。13.包含30%至100%v/v氧的气流用于通过在合适的发酵培养基中发酵微生物生产二羧酸的用途。全文摘要用于生产二羧酸的工艺，其包括在合适的发酵培养基中发酵微生物，其中将在大气压下测量的包含30%至100%v/v的氧的气流添加至发酵培养基；以及生产二羧酸。文档编号C12P7/46GK103228791SQ201180056715公开日2013年7月31日申请日期2011年9月20日优先权日2010年9月24日发明者米克尔·莱纳德斯·奥古斯特·詹森,劳伦特·西格艾哈,瑞内·维尔瓦尔,麦兰尼·洛查尔特申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司,法国罗盖特公司