白细胞或单核细胞的分离方法、分离材的制作方法
专利名称：白细胞或单核细胞的分离方法、分离材的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于从含有各血细胞成分的体液选择性地回收白细胞或单核细胞的分离材、分离方法。
背景技术：
近年来，伴随着血液学、科学技术的迅速进步，如下治疗方式得到广泛普及，S卩，通过从以全血、骨髓、脐带血、组织提取物为代表的体液仅分离需要的血液组分并供患者使用来提高治疗效果，进而，通过不给予治疗所不需要的部分来抑制副作用。例如，血液输血也是其中之一。红细胞制剂是在出血和红细胞不足的情况下、或在由于红细胞的功能降低而导致氧缺乏的情况下得到使用的血液制剂。红细胞制剂中不需要会诱导异常的免疫反应、移植物抗宿主病(GVHD)等副作用的白细胞，需要用过滤器除去白细胞。根据情况，有时除白细胞之外，也要除去血小板。另一方面，血小板制剂是由存在血液凝固因子的缺乏而导致的出血或有出血趋势的患者所使用的血液制剂。为了制造血小板制剂，通过离心分离来除去血小板以外的不需要的细胞、成分，仅采集需要的血小板成分。而且，近年来，开始积极进行面向白血病、实体癌治疗的造血干细胞移植，可采取将治疗所需要的含有造血干细胞的白细胞群分离并给予的方法。作为该造血干细胞的来源，从供体的负担少、增殖能力优异等优点出发，除骨髓、外周血之外，脐带血也备受关注。另外，近年来，启示了在月经血中也存在丰富的干细胞，存在此前被废弃的月经血也可作为珍贵的干细胞来源而被利用的可能性。对于骨髓、外周血 ，期望除去不需要的细胞，将白细胞分离、纯化后给予，另一方面，对于脐带血，用于血缘者的血液银行开始盛行，需要冷冻保存至使用时，所以出于防止由冷冻保存而导致的红细胞溶血的目的，也要将白细胞分离、纯化。作为白细胞的分离方法，提出了利用使用了聚蔗糖(Ficoll)的比重液进行的离心分离法、使用了作为红细胞沉降剂的羟乙基淀粉的离心分离法，但存在无法进行封闭体系内的处理而混入异物、菌，处理需要长时间等问题。作为不使用离心分离法的细胞分离方法，最近还报告了使用不捕集红细胞和血小板而仅捕集白细胞的过滤材料来回收白细胞的方法(专利文献1、专利文献2)。然而，以往，报告了为了将白细胞捕集到过滤器，纤维直径需要小于3 μ m(非专利文献I )，在各文献的报告中使用的分离材的纤维直径也小于2.5 μ m (专利文献1、专利文献2、专利文献3)。这是由于以往的白细胞除去过滤器以最大限度地除去白细胞为目的，白细胞的捕集率高，另一方面，存在进行体液处理时容易堵塞，回收操作时引起压力上升而诱发细胞回收率的降低、工艺问题等问题。因此，作为用于回收白细胞的过滤器，即使转用以往的白细胞除去过滤器，也无法实现充分的功能。专利文献1:日本特表2001-518792号公报
专利文献2:国际公开第98/32840号公报专利文献3:日本特开平10-313855号公报非专利文献1:纤维学会志 Vol.61，N0.8ρ.Ρ215-216 (2005)
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于从含有各血细胞成分的体液在避免压力上升的同时，以高效率回收白细胞或单核细胞的分离材，以及使用了该分离材的细胞分离方法。本发明人等对能够有效率地从体液分离白细胞或单核细胞且不易引起压力上升的分离材、细胞分离方法进行了深入研究。其结果发现通过使用特定的分离材，能够有效率地分离白细胞或单核细胞，从而完成了本发明。即，本发明涉及一种用于从体液分离白细胞或单核细胞的分离材，其特征在于，由平均纤维直径为2.Ομπι 6.Ομπι且透气性系数M为6.2 35的无纺布构成。无纺布优选由选自聚烯烃、聚酰胺以及聚酯中的至少I种构成。体液优选为选自外周血、脐带血、骨髓、月经血以及组织提取物中的至少I种。另外，本发明涉及一种细胞分离用容器，其是由将上述分离材填充于具有体液的入口和体液的出口的容器而得到的。在细胞分离用容器中，优选将分离材在体液的流动方向上填充有I片分离材或者以层叠的方式填充有多片分离材，并优选在体液的流动方向上以被压缩的状态进行填充。细胞分离用容器优选为柱型。另外，本发明涉及一种细胞分离方法，其包括使体液与上述分离材接触而分离白细胞或单核细胞的工序。另外，本发明涉及白细胞或单核细胞的细胞分离方法，其包括使体液与上述细胞分离用容器接触而将白细胞或单 核细胞捕集到分离材的第一工序；和使用剥离溶液从分离材回收白细胞或单核细胞的第二工序。在该细胞分离方法中，优选第一工序为从上述细胞分离用容器的入口导入体液并从出口排出的工序，优选第二工序为从细胞分离用容器的出口导入剥离溶液并从入口回收白细胞或单核细胞的工序。进一步优选在第一工序之后并在第二工序之前，包括通过从入口导入生理盐水或缓冲液来除去细胞分离用容器内的夹杂成分的工序。进一步优选在第一工序之前，包括使分离材与生理盐水或缓冲液接触的工序。进一步优选在第一工序之前，包括将细胞分离容器的体液的入口固定在低于细胞分离容器的体液的出口的高度的工序。优选白细胞和血小板实质上被分离材捕集而红细胞实质上不被捕集。优选被分离的白细胞或单核细胞包含造血干细胞和/或间充质干细胞。另外，本发明涉及一种冷冻保存方法，其特征在于，将利用上述细胞分离方法得到的细胞置于液氮环境下。液氮环境下优选为_196°C -30°C。在该冷冻保存方法中，优选使用选自二甲基亚砜、右旋糖酐、白蛋白以及羟乙基淀粉中的至少I种冷冻保护剂。优选冷冻保存过的干细胞的成活率为80%以上。另外，本发明涉及白细胞、单核细胞或干细胞，它们是利用上述细胞分离方法得到的。干细胞优选包含选自⑶34阳性细胞、⑶133阳性细胞、⑶34阴性且⑶133阳性细胞、⑶34阳性且⑶133阳性细胞、⑶34阳性且⑶133阴性细胞、⑶45阴性且⑶44阳性且⑶73阳性且⑶90阳性细胞、⑶45阴性且⑶235a阴性且⑶33阴性且⑶7阴性细胞、⑶45阳性且⑶133阳性且CDl 17阳性细胞、CD45阳性且CD 133阴性且CDl 17阳性细胞、CD45阳性且CD 133阳性且CD 164阳性细胞、CD45阳性且CD 133阴性且CD 164阳性细胞、以及CD45阴性且⑶309阳性细胞中的任一细胞。白细胞优选包含⑶45阳性且⑶164阳性细胞、或⑶45阳性且⑶117阳性细胞。根据本发明，能够从以全血、骨髓、脐带血、月经血、组织提取物为代表的体液，简便且迅速地在不易引起堵塞、压力上升的情况下有效率地分离白细胞或单核细胞。如果使用本发明的分离材和细胞分离方法，则与以往报告的方案相比，具有不易引起堵塞，而且白细胞、单核细胞的回收率高的多方面的优点。进而，该技术也可以在形成白细胞层(buffy coat)等前处理后使用，但在基本上不进行这样的前处理的情况下也能够从外周血、脐带血、骨髓、月经血、组织提取物分离白细胞或单核细胞。将本发明的分离材填充于容器而得到的过滤器也能够在用无菌封闭体系进行的处理中使用。被回收的含白细胞的液体或含单核细胞的液体是含有丰富的造血干细胞、间充质干细胞的细胞群，能够作为用于白血病治疗、心肌再生、血管再生等再生医疗的治疗细胞制备用过滤器而提供。就使用本发明的分离材而得到的白细胞而言，红细胞的混入率极低，即使冷冻保存至使用时，由溶血等引起的影响也非常少。另外，白细胞被无菌分离，所以也能够直接扩增来制备细胞。因此，本发·明的分离材除输血用制剂制备用途之外，作为用于制备再生医疗用的细胞来源的过滤器也非常有用。通过使用本发明的分离材，能够制备副作用少、安全性高的治疗用细胞。
图1是新鲜牛外周血的白细胞回收率的结果。图2是新鲜人外周血的白细胞回收率的结果。图3是新鲜猪骨髓的白细胞回收率的结果。图4是新鲜牛外周血的白细胞回收率的结果。图5是新鲜人外周血的白细胞回收率的结果。图6是新鲜猪骨髓的白细胞回收率的结果。图7是柱的示意图。图8是由造血系干细胞构成的集落照片。图9是血细胞成分分离系统的一个例子。图10是血细胞成分分离系统的一个例子(入口比出口低的情况)。
具体实施例方式以下对本发明进行详细说明，但本发明不限于以下的说明。本发明涉及一种用于从体液分离白细胞或单核细胞的分离材，其特征在于，由平均纤维直径为2.Ομ 6.Ομ 且透气性系数M为6.2 35以下的无纺布构成。从材料与体液的接触时间的观点出发，分离材由为纤维状且容易制作、得到的无纺布构成。作为无纺布的制造方法，大体分为湿式和干式，进一步可举出树脂结合、热结合、水刺、针刺、缝编、纺粘、熔喷等，但不限于这些制法。对于具有10 μ m以下的纤维直径的无纺布而言，优选熔喷法、水刺法。也可以对无纺布实施压延加工、等离子体处理。
作为无纺布纤维，也可以优选使用将复合单丝分割为多个的所谓分割纤维。这是因为纤维复杂地相互缠绕而使血细胞分离效率良好。分离材可以不放入容器中而使用，也可以将分离材放入具备体液的入口和出口的容器中而使用。其中，如果考虑实用性，则优选放入容器中而使用的后者的方式。构成无纺布的纤维的平均纤维直径优选为2.0 μ m 6.0 μ m,更优选为2.5 μ m
5.7 μ m，进一步优选为3.5 μ m 5.0 μ m。如果平均纤维直径小于2.0 μ m，则容易引起堵塞，回收率有降低的趋势。如果平均纤维直径大于6.0 μ m，则将白细胞捕集到分离材的能力有降低的趋势。应予说明，平均纤维直径是指相对于纤维轴呈直角方向的纤维的宽度。就纤维直径的测定而言，用扫描式电子显微镜拍摄由无纺布构成的分离材，将由照片中记载的比例求出的纤维直径的计算值进行平均，从而求出。换言之，是指测定的纤维直径的平均值，为50个以上的平均值，优选为100个以上的平均值。但是，多个纤维重叠时、因其它纤维妨碍而无法测定其宽度时、或者直径显著不同的纤维混杂等时，排除该数据而算出纤维直径。分离材的透气性系数M优选为6.2 35，更优选为7.0 14.2，进一步优选为
9.2 10.0。如果透气性系数小于6.2，则细胞被分离材密集地捕集，所以回收性能有降低的趋势。如果透气性系数大于35，则有细胞难以被分离材捕集的趋势。应予说明，透气性系数M是由分离材的透气性(cc/cm2.sec)与厚度(mm)之积定义的值，是消除了分离材的厚度的影响的本质的参数。即，透气性是取决于分离材的孔径大小的参数，但即使是相同的透气性，分离材的厚度越小，本质的透气性也越小，如果换算成相当于相同的厚度，则透气性变小。因此，通过将透气性乘以厚度，从而成为表示分离材的本质的孔径的参数。 透气性例如按照JIS L1096-1999所记载的一般织物试验方法(弗雷泽型法)、或以其为基准能够容易地测定。另外，对于厚度，也可以利用以数显卡尺为代表的各种设备测定。但是，透气性的测定方法并不限于这些测定方法。如果分离材的平均纤维直径为2.0 μ m 6.0 μ m，并且，分离材的透气性系数M为
6.2 35，则能够效率良好地分离白细胞或单核细胞。作为分离材所使用的材料，从灭菌耐性、对细胞的安全性的观点出发，优选聚烯烃、聚酰胺、聚酯等。作为聚烯烃，可举出聚丙烯、聚乙烯、高密度聚乙烯、低密度聚乙烯等，作为聚酰胺，可举出尼龙等，作为聚酯，可举出聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯等。进而，也可使用聚乙烯醇、偏二氯乙烯、人造丝、维尼纶、丙烯酸类(聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚丙烯腈、聚丙烯酸、聚丙烯酸酯)、尼龙、聚酰亚胺、芳族聚酰胺(芳香族聚酰胺)、聚酰胺、铜氨纤维、炭黑、酚类、聚酯、纸浆、麻、聚氨酯、聚苯乙烯、聚碳酸酯等合成高分子，琼脂糖、纤维素、乙酸纤维素、壳聚糖、甲壳质等天然高分子，玻璃等无机材料，金属等，但其中优选聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯、聚丙烯、丙烯酸类、尼龙、聚氨酯、玻璃。另外，这些材料不限于单独I种，也可以根据需要将材料复合、混合、融合而使用。进而，如果需要，则也可以将蛋白质、肽、氨基酸、糖类等对特定的细胞具有亲和性的分子固定于材料。体液是指全血、外周血、骨髓、脐带血、月经血、组织提取物以及它们的组合，也可以是经粗分离的体液。另外，作为成为体液的采集源的动物种类，例如可举出人、牛、小鼠、大鼠、猪、猿、狗、猫等哺乳动物。体液可以预先用抗凝剂处理。作为抗凝剂，可举出AOXacid-citrate-dextrose)液、CPD (citrate-phosphate-dextrose)液、CPDA (citrate-phosphate-dextrose-adenine)液等柠檬酸抗凝剂，肝素、低分子肝素、FUTHAN (甲磺酸萘莫司他)、EDTA等抗凝剂。只要不对各组分的使用目的造成影响，体液的保存条件就没有特别限制。作为能够利用上述分离材分离的白细胞或单核细胞，具体而言，可举出淋巴细胞、单核细胞、⑶3阳性细胞、⑶14阳性细胞、⑶19阳性细胞、造血干细胞、间充质干细胞。本发明还涉及将上述的分离材填充于具有体液的入口和出口的容器而得的细胞分离用容器。填充分离材的容器的形态、大小、材质没有特别限定。容器的形态可以是球、箱、盒、袋、管、柱等任意形态。作为优选的具体例，例如可举出容量约0.1mL 400mL左右、直径约0.1cm 15cm左右的半透明的筒状容器。另外，可举出一边的长度0.1cm 20cm左右的长方形或正方形且厚度为0.1cm 5cm左右的四棱柱容器等，但不限于这些。作为容器的类型，可举出横流型、柱型等。横流型或柱型均可使用，容器的类型没有特别限定，但从能够均匀地导入回收液这样的观点出发，更优选柱型。在以往的捕集有核细胞的细胞分离容器中，从能够效率良好地回收细胞这样的观点出发，可使用横流型，但存在只能使用高粘度的剥离溶液这样的限制。但是，如果将本发明的分离材与柱型的容器组合，则即使用低粘度的剥离溶液，细胞回收率也不降低，可得到高的分离性能。柱型是指例如相对于过滤器表面，在面的中心附近带有液体的入口和出口的容器、或入口部和出口部垂直地位于过滤器表面的容器、或以液体在与过滤器表面垂直的方向上流动为特征的容器、或以液体与分离材的压缩方向平行地流动为特征的容器。图7表示柱型的一个例子。另一方面，横流型是指如由白细胞除去过滤器(Asahi Kasei Medical株式会社制“SEPACELL”、Poul公司制“PURECELL RC”)代表的那样，相对于过滤器表面，液的入口和出口的位置偏离于表面的中心，入口部和出口部相对于过滤器表面平行地设置的容器。此处，入口部和出口部垂直地位于过滤器表面是指入口和出口与表面所成的角度(锐角)为45度以上且小于90度，入口部和出口部相对于过滤器表面平行地设置是指入口与出口与表面所成的角度(锐角)为O度以上且小于45度。容器可以使用任意的结构材料制作。作为结构材料，具体而言，可举出非反应性聚合物、生物亲和性金属、合金、玻璃等。作为非反应性聚合物，可举出丙烯腈丁二烯苯乙烯三元共聚物等丙烯腈聚合物；聚四氟乙烯、聚氯三氟乙烯、四氟乙烯与六氟丙烯的共聚物、聚氯乙烯等卤化聚合物；聚酰胺、聚酰亚胺、聚砜、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯丙烯酸共聚物、聚碳酸酯丙烯腈丁二烯苯乙烯、聚苯乙烯、聚甲基戊烯等。对于作为容器的材料而有用的金属材料(生物亲和性金属、合金)，可举出不锈钢、钛、钼、钽、金、及它们的合金、以及镀金合金铁、镀钼合金铁、钴铬合金、氮化钛被覆不锈钢等。其中，优选具有灭菌耐性的结构材料，具体而言，可举出聚丙烯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚酰亚胺、聚碳酸酯、聚砜、聚甲基戊烯等。就分离材而言，优选将由无纺布构成的分离材切割成适当的大小，沿体液的流动方向I片或多片层叠至厚度Imm 200mm左右而使用。从各组分的分离效率的角度出发，层叠的厚度更优选为1.5mm 150mm,进一步优选为2mm 100mm。将分离材填充于容器时，可以在沿体液的流动方向I片或多片层叠的状态下使用，厚度优选为Imm 50mm左右。从各部分的分离效率的角度出发，更优选为1.5mm 40mm,进一步优选为2mm 35_。另外，也可以将分离材卷成辊状而填充于容器。以辊状使用时，可以通过从该辊的内侧朝向外侧处理体液来分离血细胞，或者也可以与其相反地从该辊的外侧朝向内侧处理体液。将分离材填充于容器时，可以沿体液的流动方向压缩地填充于容器，也可以不压缩地进行容器填充。压缩的有无可根据分离材的材质等适当地选择。在细胞分离容器中，可以将分离材以切割成适当大小的平板状来填充，也可以以卷成辊状的形状来填充。进而，可以并用2种以上，也可以并用上述分离材以外的分离材，只要能够构成实质上捕集并回收白细胞这样的分离系统即可。实质上捕集白细胞是指，在与分离材接触的体液所含有的白细胞中，60%以上被分离材捕集。进而，在被细胞分离用容器整体捕集的白细胞中，本发明的分离材捕集的白细胞优选占60%以上的比例。细胞分离容器具有实质上不捕集红细胞而实质上捕集白细胞的特征。此处不捕集红细胞是指，具有在与分离材接触的体液所含有的红细胞中，60%以上通过分离材的性质。进而，本发明的分离材也可以是实质上捕集血小板的材料，但不限于此。实质上捕集血小板是指，在与分离材接触的体液所含有的血小板中，50%以上被分离材捕集。更优选60%以上被分离材捕集。另外，本发明涉及一种细胞分尚方法，其包括使体液与上述分尚材接触而分尚白细胞或单核细胞的工序。进而，本发明涉及一种细胞分离方法，其包括使体液与上述细胞分离容器接触而在分离材捕集白细胞或单核细胞的第一工序；和使用剥离溶液，从分离材回收捕集的白细胞或单核细胞的第二工序。具体而言，作为第一工序，从入口侧向填充有分离材的容器注入体液，捕集白细胞或单核细胞而使红细胞通过。接着，作为第二工序，通过从容器的出口方向，即，与体液、清洗液的通入方向相反的方向流过剥离溶液，从而能够以高收率分离回收被分离材捕集的白细胞或单核细胞。另外，虽然不是必要的，但在使体液与分离材接触而在分离材上捕集白细胞的工序之后，通过从相同方向通入清洗液，从而能够有效率地回收、分离滞留于容器内的红细胞。在具有体液的入口和出口的细胞分离容器中流过体液时，可以以比体液的出口高的方式设置体液的入口，沿与重力相同的方向流过体液，也可以以比体液的出口低的方式设置体液的入口，沿与重力相反的方向流过体液。通过沿与重力相反的方向流过体液，从而体液在容器内均匀地流动，所以能够进一步提高分离效率。可以使用上述细胞分离容器来构成血细胞成分分离系统。就血细胞成分分离系统而言，除了细胞分离容器之外，同时具备清洗溶液、剥离溶液的入口、出口，红细胞回收袋、白细胞回收袋等时，是实用的而优选的。此时，细胞分离容器具有体液流入的入口和流出的出口，进而与体液的入口 、体液的入口独立地具有冲洗滞留于容器内的红细胞的清洗溶液的流入部，进而与体液的出口、体液的出口独立地具有清洗液的流出部，而且，优选除了上述体液和清洗液的流出部或者流出部以外，还独立地具备用于导入剥离溶液的入口。附属于容器的清洗液的入口、出口可以作为体液的入口、出口发挥功能，也可以在入口侧的线路中介由三路活塞等而连接血液袋和清洗溶液袋。分离溶液的导入口也可以作为体液的出口发挥功能。另外，剥离溶液的回收侧也可以作为体液的入口发挥功能，同样地也可以介由三路活塞连接各袋、注射器等。图9、图10表示血细胞成分分离系统的一个例子。在血细胞成分分离系统中优选进一步配备体液的保存袋、用于回收被分离白细胞的剥离溶液回收袋、红细胞回收袋等。通过将这些袋与上述记载的各溶液的入口、出口连接，从而能够在无菌的封闭体系内分离体液。另外，优选各袋可以在使用后分开使用，可以形成像通常使用的血液袋这样的形状，也可以是平板状的盒方式等。作为各袋的方式，也可以根据需要，选择能够进行细胞培养的袋、具有冷冻保存耐性的袋等。对本发明的分离方法进行具体说明。I)体液送液工序从填充有分离材的容器的体液入口侧通入体液时，可以从装有体液的容器通过送液线路以自由下落进行送液，也可以利用泵进行送液。另外，将装有体液的注射器直接连接于容器，并用手推注射器。利用泵进行通液时，如果送液速度过快，则分离效率降低，如果过慢，则有花费处理时间的趋势。作为送液速度，例如可举出0.lmL/min 100mL/min的速度，但并不限于此。另外，作为体液送液工序的前处理，可以实施用生理盐水、缓冲液浸溃分离材的工序。该操作不是必要的，但考虑到分离材在上述溶液中的浸溃会影响分离效率的提高和血液流路的确保，所以可以根据情况来实施。该前处理溶液不必与以下的清洗工序中使用的溶液相同，但如果相同，则可以共用溶液袋，所以从线路系统的简单化和操作性的观点出发，优选为相同。作为前处理的液体量，是填充有分离材的容器的I倍 100倍左右时，是实用而优选的。作为可以使用的缓冲液，没有特别限定，但优选林格液、细胞培养所使用的培养液、磷酸缓冲液等通常的缓冲液。2)清洗工序 本工序不是必要的，但可以在提高夹杂物的除去效率的情况下实施。作为能够利用该工序除去的夹杂物，可举出红细胞、血浆等非血细胞成分。将清洗液从清洗液的流入侧沿与体液送液工序相同方向通入时，清洗液可以通过线路以自由下落进行送液，也可以利用泵进行送液。利用泵进行送液时的流速为与体液送液工序相同程度，可举出0.1mL/min 100mL/min的速度，但并不限于此。清洗量根据容器的容量而异,如果清洗量过少,则容器中残留的红细胞成分变多，如果清洗量过多，则分离效率降低，并且需要大量的时间，所以优选以容器的0.5倍 100倍左右的液量进行清洗。作为可以使用的清洗液，只要能够只冲洗红细胞并抑制被回收的白细胞中的其它血细胞的混入，能够保持血细胞的捕集状态，无论使用何种溶液均可，但优选生理盐水、林格液、细胞培养所使用的培养液、磷酸缓冲液等通常的缓冲液。3)白细胞或单核细胞的剥离从与体液的通入相反的方向(体液流出侧)向填充有分离材的容器注入剥离溶液，使白细胞剥离。注入剥离溶液时，可以通过预先将剥离溶液加入注射器等中，并使用手、设备用力挤压注射器的柱塞来实行。回收液量、流速根据容器的容量、处理量而异，优选容器的I倍 100倍左右的液量、流速0.5mL/sec 20mL/sec的流速,但并不限于此。
剥离溶液只要是低渗溶液就没有特别限定，可举出生理盐水、林格液、右旋糖酐葡萄糖注射液^卜’ >糖注)、羟乙基淀粉等作为注射用剂而具有实际使用效果的溶液、缓冲液、细胞培养用培养液等。另外，为了提高被捕集的细胞的回收率，可以提高回收液的粘稠度。因此，可以在上述分离溶液中添加白蛋白、纤维蛋白原、球蛋白、右旋糖酐、羟乙基淀粉、羟乙基纤维素、胶原蛋白、透明质酸、明胶等，但并不限于这些。剥离溶液的粘度没有特别限定，但如果粘度过高，则有难以进行回收操作的趋势，所以更优选为20mPa*s以下。如果是柱型的容器，则即使使用低粘度的剥离溶液分离性能也不降低，所以即使在IOmPa *s以下也可以使用。进而，即使是5mPa.s以下的剥离溶液也可以使用。在利用上述细胞分离方法而被回收的白细胞中，优选含有造血干细胞、间充质干细胞、⑶34阳性细胞。另外，本发明涉及一种冷冻保存方法，其特征在于，将利用上述细胞分离方法得到的细胞置于液氮环境下。上述细胞分离方法与以往的离心分离法相比，赋予细胞的应力非常低，所以利用该细胞分离方法得到的细胞的冷冻保存后的活性非常高。将细胞冷冻保存时，出于保护冷冻时的细胞的目的，可添加冷冻保护剂。添加的冷冻保护剂的种类没有特别限制，可以使用二甲基亚砜、右旋糖酐、白蛋白、羟乙基淀粉等。上述冷冻保护剂可以单独使用，也可以组合多种使用。对于冷冻保存方法而言，细胞只要在液氮环境下保存即可，可以在浸溃于液氮的状态下保存，也可以在液氮的气体下保存。保存时的温度没有特别限定，但为了防止细胞的活性降低，优选为-196 °C -30°C。更优选为_196°C -50°C，进一步优选为-196 °C -70 °C。本发明还涉及利用上述冷冻保存方法得到的白细胞、单核细胞、干细胞。作为利用上述冷冻保存方法得到 的干细胞，只要是体液中含有的具有自我复制能力且具有分化能力的细胞，无论是何种干细胞均可。具体而言，可举出造血干细胞、间充质干细胞、胚胎样干细胞(Embryonic-like Stem Cell)、血管内皮前体细胞等。作为造血干细胞的例子，可举出⑶34阳性细胞、⑶133阳性细胞、⑶34阴性且CD 133阳性细胞、CD34阳性且CD 133阳性细胞、CD34阳性且CD 133阴性细胞、CD45阳性且CD 133阳性且⑶117阳性细胞、CD45阳性且CD 133阴性且⑶117阳性细胞、CD45阳性且⑶133阳性且⑶164阳性细胞、⑶45阳性且⑶133阴性且⑶164阳性细胞。作为通常的造血干细胞，可举出⑶34阳性细胞或⑶133阳性细胞，但在脐带血中，认为造血干细胞会分化成⑶34阴性且⑶133阳性细胞、⑶34阳性且⑶133阳性细胞、⑶34阳性且⑶133阴性细胞。如果使用本发明的分离材，则能够也分离这些造血干细胞，并且，分离后的细胞即使进行冷冻，活性的降低也少。另外，对于造血干细胞中，特别是可以说与移植时的植入相关的作为造血生长因子(Stem Cell Factor)受体的⑶117阳性细胞、与细胞粘附相关的CD164阳性细胞而言，用本发明的分离材分离后，即使进行冷冻，活性的降低也少。另外，利用本发明的分离材将被认为是脐带血中间充质干细胞的CD45阴性且⑶44阳性且⑶73阳性且⑶90阳性细胞分离后，即使进行冷冻，活性的降低也少。脐带血中仅存在少数间充质干细胞，用离心分离时，存在损失大且不易分离的问题，但用本发明的分离材时，能够有效率地进行分离。脐带血中存在谱系阴性造血干细胞(Lineage Negative Stem Cell)这样的具有多分化能力的有趣的干细胞，被称为胚胎样干细胞(Embryonic-like Stem Cell)。用本发明的分离材时，能够有效率地分离该⑶45阴性且⑶235a阴性且⑶33阴性且⑶7阴性细胞，即使进行冷冻，活性的降低也少。对于血管内皮前体细胞的⑶45阴性且⑶309阳性细胞，用本发明的分离材分离后，即使进行冷冻，活性的降低也少。另外，对于白细胞中的⑶45阳性且⑶164阳性细胞、⑶45阳性且⑶117阳性细胞而言，用本发明的分离材分离后，即使进行冷冻，活性的降低也少。冷冻保存后的细胞的成活率优选为80%以上，更优选为85%以上。实施例以下，在实施例中对本发明进行详细叙述，但本发明不限于以下的实施例的方式。以下的实施例和比较例所示的无纺布以非压缩时的厚度均为恒定的范围的方式调整片数，进行填充。另外实施例和比较例中的填充有分离材的容器为如图7所示的柱型，液的入口和出口相对于过滤器的面位于中心，液的入口和出口位于与过滤器表面垂直的位置。(实施例1)将28片聚对苯二甲酸丁二醇酯制无纺布(平均纤维直径2.Ομπι、透气性系数Μ=7.0)在层叠状态下以图7所示的方式填充厚度6mm且直径18mm的由聚碳酸酯形成的柱状容器中。首先，从入口侧使用注射器用手按压而通入45mL的生理盐水。接着，以2.5mL/min的速度通入20mL的CPD抗凝 固的新鲜牛血液(以CPD:血液=200:28混合而成的含有12%CPD的牛外周血)，接着，从相同方向通入IOmL的生理盐水。其后，通过使用注射器用手按压而从相反方向通入30mL的添加10%FBS的a MEM培养液(粘度2.9mPa.s)，由此回收白细胞。剥离溶液能够顺利地导入。利用血细胞计数器(Sysmex公司制，K-4500)测定处理前血液的血细胞计数、回收的溶液的血细胞计数，算出白细胞的回收率。结果示于表1、图1以及图4。(实施例2)将28片聚丙烯制无纺布(平均纤维直径3.5 μ m、透气性系数Μ=9.6)以层叠状态填充，除此之外，实施与实施例1相同的操作。结果示于表1、图1以及图4。(实施例3)将28片聚对苯二甲酸丁二醇酯制无纺布(平均纤维直径2.9 μ m、透气性系数M=I0.0)以层叠状态填充，除此之外，实施与实施例1相同的操作。结果示于表1、图1以及图4。(实施例4)将32片尼龙制无纺布(平均纤维直径5.Ομπι、透气性系数M=9.2)以层叠状态填充，除此之外，实施与实施例1相同的操作。结果示于表1、图1以及图4。(比较例I)将84片聚对苯二甲酸丁二醇酯制无纺布(平均纤维直径1.7 μ m、透气性系数M=5.9)以层叠状态填充，除此之外，实施与实施例1相同的操作。回收操作时受到少许阻力，所以柱内压闻而堵塞。结果不于表1、图1以及图4。
(比较例2)将30片聚丙烯制无纺布(平均纤维直径2.1 μ m、透气性系数Μ=6.0)以层叠状态填充，除此之外，实施与实施例1相同的操作。结果示于表1、图1以及图4。(比较例3)将24片聚丙烯制无纺布(平均纤维直径4.9 μ m、透气性系数Μ=39.6)以层叠状态填充，除此之外，实施与实施例1相同的操作。结果示于表1、图1以及图4。表I表I
权利要求
1.一种用于从体液分离白细胞或单核细胞的分离材，其特征在于，由平均纤维直径为
2.Ομπι 6.Ομπι且透气性系数M为6.2 35的无纺布构成。
2.根据权利要求1所述的分离材，其中，无纺布由选自聚烯烃、聚酰胺以及聚酯中的至少I种构成。
3.根据权利要求1或2所述的分离材，其中，体液为选自外周血、脐带血、骨髓、月经血以及组织提取物中的至少I种。
4.一种细胞分离用容器，是将权利要求1 3中任一项所述的分离材填充于具有体液入口和体液出口的容器而得到的。
5.根据权利要求4所述的细胞分离用容器，其特征在于，在体液的流动方向上填充有I片分离材或者以层叠的方式填充有多片分离材。
6.根据权利要求4或5所述的细胞分离用容器，其特征在于，在体液的流动方向上以被压缩的状态填充有分尚材。
7.根据权利要求4 6中任一项所述的细胞分离用容器，其特征在于，所述细胞分离用容器为柱型。
8.一种细胞分离方法，包括使体液与权利要求1 3中任一项所述的分离材接触而分离白细胞或单核细胞的工序。
9.一种细胞分离方法，包括: 第一工序，使体液与权利要求4 7中任一项所述的细胞分离用容器接触而将白细胞或单核细胞捕集到分离材；和 第二工序，使用剥离溶液 ，从分离材回收捕集的白细胞或单核细胞。
10.根据权利要求9所述的细胞分离方法，其中，第二工序是从细胞分离用容器的出口导入剥离溶液且从入口回收白细胞或单核细胞的工序。
11.根据权利要求9或10所述的细胞分离方法，其中，在第一工序之后并在第二工序之前，进一步包括通过从入口导入生理盐水或缓冲液来除去细胞分离用容器内的夹杂成分的工序。
12.根据权利要求9 11中任一项所述的细胞分离方法，其中，在第一工序之前，进一步包括使分离材与生理盐水或缓冲液接触的工序。
13.根据权利要求9 12中任一项所述的细胞分离方法，其中，在第一工序之前，进一步包括将细胞分离容器的体液入口固定在低于细胞分离容器的体液出口的高度的工序。
14.根据权利要求8 13中任一项所述的细胞分离方法，其特征在于，白细胞和血小板实质上被分离材捕集，而红细胞实质上不被捕集。
15.根据权利要求8 14中任一项所述的细胞分离方法，其特征在于，被分离的白细胞或单核细胞包含造血干细胞和/或间充质干细胞。
16.—种细胞的冷冻保存方法,其特征在于,在权利要求8 15中任一项所述的细胞分离方法中，进一步包括置于液氮环境下的工序。
17.根据权利要求16所述的冷冻保存方法，其中，液氮环境下为-196°C -30°C。
18.根据权利要求16或17所述的冷冻保存方法，其特征在于，使用选自二甲基亚砜、右旋糖酐、白蛋白以及羟乙基淀粉中的至少I种冷冻保护剂。
19.根据权利要求16 18中任一项所述的冷冻保存方法，其特征在于，冷冻保存过的干细胞的成活率为80%以上。
20.利用权利要求8 15中任一项所述的细胞分离方法而得到的白细胞、单核细胞或干细胞。
21.根据权利要求20所述的干细胞，其中，包含选自如下细胞中的任一细胞: CD34阳性细胞， CD133阳性细胞， ⑶34阴性且⑶133阳性细胞， CD34阳性且CD133阳性细胞， ⑶34阳性且⑶133阴性细胞， ⑶45阴性且⑶44阳性且⑶73阳性且⑶90阳性细胞， ⑶45阴性且⑶235a阴性且⑶33阴性且⑶7阴性细胞， CD45阳性且CD133阳性且CD117阳性细胞， CD45阳性且CD133阴性且CD117阳性细胞， ⑶45阳性且⑶133阳性且⑶164阳性细胞， ⑶45阳性且⑶133阴性且⑶164阳性细胞，以及⑶45阴性且⑶309阳性细胞。
22.根据权利要求20所述的白细胞，其中，包含: ⑶45阳性且⑶164阳性细胞，或 ⑶45阳性且⑶117阳性细胞。
全文摘要
本发明的课题是提供从含有各血细胞成分的体液有效率地分离白细胞或单核细胞的分离系统和分离材。通过使含有各血细胞成分的体液与平均纤维直径为2.0μm～6.0μm且透气性系数M为6.2～35以下的分离材接触而将白细胞捕集到分离材，使用剥离溶液回收被捕集的白细胞或单核细胞，从而能够更有效率地分离白细胞或单核细胞。
文档编号C12N1/02GK103228780SQ201180056749
公开日2013年7月31日 申请日期2011年11月24日 优先权日2010年11月25日
发明者佐藤伸彦, 塚本彩子 申请人:株式会社钟化
技术领域：
本发明涉及用于从含有各血细胞成分的体液选择性地回收白细胞或单核细胞的分离材、分离方法。
背景技术：
近年来，伴随着血液学、科学技术的迅速进步，如下治疗方式得到广泛普及，S卩，通过从以全血、骨髓、脐带血、组织提取物为代表的体液仅分离需要的血液组分并供患者使用来提高治疗效果，进而，通过不给予治疗所不需要的部分来抑制副作用。例如，血液输血也是其中之一。红细胞制剂是在出血和红细胞不足的情况下、或在由于红细胞的功能降低而导致氧缺乏的情况下得到使用的血液制剂。红细胞制剂中不需要会诱导异常的免疫反应、移植物抗宿主病(GVHD)等副作用的白细胞，需要用过滤器除去白细胞。根据情况，有时除白细胞之外，也要除去血小板。另一方面，血小板制剂是由存在血液凝固因子的缺乏而导致的出血或有出血趋势的患者所使用的血液制剂。为了制造血小板制剂，通过离心分离来除去血小板以外的不需要的细胞、成分，仅采集需要的血小板成分。而且，近年来，开始积极进行面向白血病、实体癌治疗的造血干细胞移植，可采取将治疗所需要的含有造血干细胞的白细胞群分离并给予的方法。作为该造血干细胞的来源，从供体的负担少、增殖能力优异等优点出发，除骨髓、外周血之外，脐带血也备受关注。另外，近年来，启示了在月经血中也存在丰富的干细胞，存在此前被废弃的月经血也可作为珍贵的干细胞来源而被利用的可能性。对于骨髓、外周血 ，期望除去不需要的细胞，将白细胞分离、纯化后给予，另一方面，对于脐带血，用于血缘者的血液银行开始盛行，需要冷冻保存至使用时，所以出于防止由冷冻保存而导致的红细胞溶血的目的，也要将白细胞分离、纯化。作为白细胞的分离方法，提出了利用使用了聚蔗糖(Ficoll)的比重液进行的离心分离法、使用了作为红细胞沉降剂的羟乙基淀粉的离心分离法，但存在无法进行封闭体系内的处理而混入异物、菌，处理需要长时间等问题。作为不使用离心分离法的细胞分离方法，最近还报告了使用不捕集红细胞和血小板而仅捕集白细胞的过滤材料来回收白细胞的方法(专利文献1、专利文献2)。然而，以往，报告了为了将白细胞捕集到过滤器，纤维直径需要小于3 μ m(非专利文献I )，在各文献的报告中使用的分离材的纤维直径也小于2.5 μ m (专利文献1、专利文献2、专利文献3)。这是由于以往的白细胞除去过滤器以最大限度地除去白细胞为目的，白细胞的捕集率高，另一方面，存在进行体液处理时容易堵塞，回收操作时引起压力上升而诱发细胞回收率的降低、工艺问题等问题。因此，作为用于回收白细胞的过滤器，即使转用以往的白细胞除去过滤器，也无法实现充分的功能。专利文献1:日本特表2001-518792号公报
专利文献2:国际公开第98/32840号公报专利文献3:日本特开平10-313855号公报非专利文献1:纤维学会志 Vol.61，N0.8ρ.Ρ215-216 (2005)
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于从含有各血细胞成分的体液在避免压力上升的同时，以高效率回收白细胞或单核细胞的分离材，以及使用了该分离材的细胞分离方法。本发明人等对能够有效率地从体液分离白细胞或单核细胞且不易引起压力上升的分离材、细胞分离方法进行了深入研究。其结果发现通过使用特定的分离材，能够有效率地分离白细胞或单核细胞，从而完成了本发明。即，本发明涉及一种用于从体液分离白细胞或单核细胞的分离材，其特征在于，由平均纤维直径为2.Ομπι 6.Ομπι且透气性系数M为6.2 35的无纺布构成。无纺布优选由选自聚烯烃、聚酰胺以及聚酯中的至少I种构成。体液优选为选自外周血、脐带血、骨髓、月经血以及组织提取物中的至少I种。另外，本发明涉及一种细胞分离用容器，其是由将上述分离材填充于具有体液的入口和体液的出口的容器而得到的。在细胞分离用容器中，优选将分离材在体液的流动方向上填充有I片分离材或者以层叠的方式填充有多片分离材，并优选在体液的流动方向上以被压缩的状态进行填充。细胞分离用容器优选为柱型。另外，本发明涉及一种细胞分离方法，其包括使体液与上述分离材接触而分离白细胞或单核细胞的工序。另外，本发明涉及白细胞或单核细胞的细胞分离方法，其包括使体液与上述细胞分离用容器接触而将白细胞或单 核细胞捕集到分离材的第一工序；和使用剥离溶液从分离材回收白细胞或单核细胞的第二工序。在该细胞分离方法中，优选第一工序为从上述细胞分离用容器的入口导入体液并从出口排出的工序，优选第二工序为从细胞分离用容器的出口导入剥离溶液并从入口回收白细胞或单核细胞的工序。进一步优选在第一工序之后并在第二工序之前，包括通过从入口导入生理盐水或缓冲液来除去细胞分离用容器内的夹杂成分的工序。进一步优选在第一工序之前，包括使分离材与生理盐水或缓冲液接触的工序。进一步优选在第一工序之前，包括将细胞分离容器的体液的入口固定在低于细胞分离容器的体液的出口的高度的工序。优选白细胞和血小板实质上被分离材捕集而红细胞实质上不被捕集。优选被分离的白细胞或单核细胞包含造血干细胞和/或间充质干细胞。另外，本发明涉及一种冷冻保存方法，其特征在于，将利用上述细胞分离方法得到的细胞置于液氮环境下。液氮环境下优选为_196°C -30°C。在该冷冻保存方法中，优选使用选自二甲基亚砜、右旋糖酐、白蛋白以及羟乙基淀粉中的至少I种冷冻保护剂。优选冷冻保存过的干细胞的成活率为80%以上。另外，本发明涉及白细胞、单核细胞或干细胞，它们是利用上述细胞分离方法得到的。干细胞优选包含选自⑶34阳性细胞、⑶133阳性细胞、⑶34阴性且⑶133阳性细胞、⑶34阳性且⑶133阳性细胞、⑶34阳性且⑶133阴性细胞、⑶45阴性且⑶44阳性且⑶73阳性且⑶90阳性细胞、⑶45阴性且⑶235a阴性且⑶33阴性且⑶7阴性细胞、⑶45阳性且⑶133阳性且CDl 17阳性细胞、CD45阳性且CD 133阴性且CDl 17阳性细胞、CD45阳性且CD 133阳性且CD 164阳性细胞、CD45阳性且CD 133阴性且CD 164阳性细胞、以及CD45阴性且⑶309阳性细胞中的任一细胞。白细胞优选包含⑶45阳性且⑶164阳性细胞、或⑶45阳性且⑶117阳性细胞。根据本发明，能够从以全血、骨髓、脐带血、月经血、组织提取物为代表的体液，简便且迅速地在不易引起堵塞、压力上升的情况下有效率地分离白细胞或单核细胞。如果使用本发明的分离材和细胞分离方法，则与以往报告的方案相比，具有不易引起堵塞，而且白细胞、单核细胞的回收率高的多方面的优点。进而，该技术也可以在形成白细胞层(buffy coat)等前处理后使用，但在基本上不进行这样的前处理的情况下也能够从外周血、脐带血、骨髓、月经血、组织提取物分离白细胞或单核细胞。将本发明的分离材填充于容器而得到的过滤器也能够在用无菌封闭体系进行的处理中使用。被回收的含白细胞的液体或含单核细胞的液体是含有丰富的造血干细胞、间充质干细胞的细胞群，能够作为用于白血病治疗、心肌再生、血管再生等再生医疗的治疗细胞制备用过滤器而提供。就使用本发明的分离材而得到的白细胞而言，红细胞的混入率极低，即使冷冻保存至使用时，由溶血等引起的影响也非常少。另外，白细胞被无菌分离，所以也能够直接扩增来制备细胞。因此，本发·明的分离材除输血用制剂制备用途之外，作为用于制备再生医疗用的细胞来源的过滤器也非常有用。通过使用本发明的分离材，能够制备副作用少、安全性高的治疗用细胞。
图1是新鲜牛外周血的白细胞回收率的结果。图2是新鲜人外周血的白细胞回收率的结果。图3是新鲜猪骨髓的白细胞回收率的结果。图4是新鲜牛外周血的白细胞回收率的结果。图5是新鲜人外周血的白细胞回收率的结果。图6是新鲜猪骨髓的白细胞回收率的结果。图7是柱的示意图。图8是由造血系干细胞构成的集落照片。图9是血细胞成分分离系统的一个例子。图10是血细胞成分分离系统的一个例子(入口比出口低的情况)。
具体实施例方式以下对本发明进行详细说明，但本发明不限于以下的说明。本发明涉及一种用于从体液分离白细胞或单核细胞的分离材，其特征在于，由平均纤维直径为2.Ομ 6.Ομ 且透气性系数M为6.2 35以下的无纺布构成。从材料与体液的接触时间的观点出发，分离材由为纤维状且容易制作、得到的无纺布构成。作为无纺布的制造方法，大体分为湿式和干式，进一步可举出树脂结合、热结合、水刺、针刺、缝编、纺粘、熔喷等，但不限于这些制法。对于具有10 μ m以下的纤维直径的无纺布而言，优选熔喷法、水刺法。也可以对无纺布实施压延加工、等离子体处理。
作为无纺布纤维，也可以优选使用将复合单丝分割为多个的所谓分割纤维。这是因为纤维复杂地相互缠绕而使血细胞分离效率良好。分离材可以不放入容器中而使用，也可以将分离材放入具备体液的入口和出口的容器中而使用。其中，如果考虑实用性，则优选放入容器中而使用的后者的方式。构成无纺布的纤维的平均纤维直径优选为2.0 μ m 6.0 μ m,更优选为2.5 μ m
5.7 μ m，进一步优选为3.5 μ m 5.0 μ m。如果平均纤维直径小于2.0 μ m，则容易引起堵塞，回收率有降低的趋势。如果平均纤维直径大于6.0 μ m，则将白细胞捕集到分离材的能力有降低的趋势。应予说明，平均纤维直径是指相对于纤维轴呈直角方向的纤维的宽度。就纤维直径的测定而言，用扫描式电子显微镜拍摄由无纺布构成的分离材，将由照片中记载的比例求出的纤维直径的计算值进行平均，从而求出。换言之，是指测定的纤维直径的平均值，为50个以上的平均值，优选为100个以上的平均值。但是，多个纤维重叠时、因其它纤维妨碍而无法测定其宽度时、或者直径显著不同的纤维混杂等时，排除该数据而算出纤维直径。分离材的透气性系数M优选为6.2 35，更优选为7.0 14.2，进一步优选为
9.2 10.0。如果透气性系数小于6.2，则细胞被分离材密集地捕集，所以回收性能有降低的趋势。如果透气性系数大于35，则有细胞难以被分离材捕集的趋势。应予说明，透气性系数M是由分离材的透气性(cc/cm2.sec)与厚度(mm)之积定义的值，是消除了分离材的厚度的影响的本质的参数。即，透气性是取决于分离材的孔径大小的参数，但即使是相同的透气性，分离材的厚度越小，本质的透气性也越小，如果换算成相当于相同的厚度，则透气性变小。因此，通过将透气性乘以厚度，从而成为表示分离材的本质的孔径的参数。 透气性例如按照JIS L1096-1999所记载的一般织物试验方法(弗雷泽型法)、或以其为基准能够容易地测定。另外，对于厚度，也可以利用以数显卡尺为代表的各种设备测定。但是，透气性的测定方法并不限于这些测定方法。如果分离材的平均纤维直径为2.0 μ m 6.0 μ m，并且，分离材的透气性系数M为
6.2 35，则能够效率良好地分离白细胞或单核细胞。作为分离材所使用的材料，从灭菌耐性、对细胞的安全性的观点出发，优选聚烯烃、聚酰胺、聚酯等。作为聚烯烃，可举出聚丙烯、聚乙烯、高密度聚乙烯、低密度聚乙烯等，作为聚酰胺，可举出尼龙等，作为聚酯，可举出聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯等。进而，也可使用聚乙烯醇、偏二氯乙烯、人造丝、维尼纶、丙烯酸类(聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚丙烯腈、聚丙烯酸、聚丙烯酸酯)、尼龙、聚酰亚胺、芳族聚酰胺(芳香族聚酰胺)、聚酰胺、铜氨纤维、炭黑、酚类、聚酯、纸浆、麻、聚氨酯、聚苯乙烯、聚碳酸酯等合成高分子，琼脂糖、纤维素、乙酸纤维素、壳聚糖、甲壳质等天然高分子，玻璃等无机材料，金属等，但其中优选聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯、聚丙烯、丙烯酸类、尼龙、聚氨酯、玻璃。另外，这些材料不限于单独I种，也可以根据需要将材料复合、混合、融合而使用。进而，如果需要，则也可以将蛋白质、肽、氨基酸、糖类等对特定的细胞具有亲和性的分子固定于材料。体液是指全血、外周血、骨髓、脐带血、月经血、组织提取物以及它们的组合，也可以是经粗分离的体液。另外，作为成为体液的采集源的动物种类，例如可举出人、牛、小鼠、大鼠、猪、猿、狗、猫等哺乳动物。体液可以预先用抗凝剂处理。作为抗凝剂，可举出AOXacid-citrate-dextrose)液、CPD (citrate-phosphate-dextrose)液、CPDA (citrate-phosphate-dextrose-adenine)液等柠檬酸抗凝剂，肝素、低分子肝素、FUTHAN (甲磺酸萘莫司他)、EDTA等抗凝剂。只要不对各组分的使用目的造成影响，体液的保存条件就没有特别限制。作为能够利用上述分离材分离的白细胞或单核细胞，具体而言，可举出淋巴细胞、单核细胞、⑶3阳性细胞、⑶14阳性细胞、⑶19阳性细胞、造血干细胞、间充质干细胞。本发明还涉及将上述的分离材填充于具有体液的入口和出口的容器而得的细胞分离用容器。填充分离材的容器的形态、大小、材质没有特别限定。容器的形态可以是球、箱、盒、袋、管、柱等任意形态。作为优选的具体例，例如可举出容量约0.1mL 400mL左右、直径约0.1cm 15cm左右的半透明的筒状容器。另外，可举出一边的长度0.1cm 20cm左右的长方形或正方形且厚度为0.1cm 5cm左右的四棱柱容器等，但不限于这些。作为容器的类型，可举出横流型、柱型等。横流型或柱型均可使用，容器的类型没有特别限定，但从能够均匀地导入回收液这样的观点出发，更优选柱型。在以往的捕集有核细胞的细胞分离容器中，从能够效率良好地回收细胞这样的观点出发，可使用横流型，但存在只能使用高粘度的剥离溶液这样的限制。但是，如果将本发明的分离材与柱型的容器组合，则即使用低粘度的剥离溶液，细胞回收率也不降低，可得到高的分离性能。柱型是指例如相对于过滤器表面，在面的中心附近带有液体的入口和出口的容器、或入口部和出口部垂直地位于过滤器表面的容器、或以液体在与过滤器表面垂直的方向上流动为特征的容器、或以液体与分离材的压缩方向平行地流动为特征的容器。图7表示柱型的一个例子。另一方面，横流型是指如由白细胞除去过滤器(Asahi Kasei Medical株式会社制“SEPACELL”、Poul公司制“PURECELL RC”)代表的那样，相对于过滤器表面，液的入口和出口的位置偏离于表面的中心，入口部和出口部相对于过滤器表面平行地设置的容器。此处，入口部和出口部垂直地位于过滤器表面是指入口和出口与表面所成的角度(锐角)为45度以上且小于90度，入口部和出口部相对于过滤器表面平行地设置是指入口与出口与表面所成的角度(锐角)为O度以上且小于45度。容器可以使用任意的结构材料制作。作为结构材料，具体而言，可举出非反应性聚合物、生物亲和性金属、合金、玻璃等。作为非反应性聚合物，可举出丙烯腈丁二烯苯乙烯三元共聚物等丙烯腈聚合物；聚四氟乙烯、聚氯三氟乙烯、四氟乙烯与六氟丙烯的共聚物、聚氯乙烯等卤化聚合物；聚酰胺、聚酰亚胺、聚砜、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯丙烯酸共聚物、聚碳酸酯丙烯腈丁二烯苯乙烯、聚苯乙烯、聚甲基戊烯等。对于作为容器的材料而有用的金属材料(生物亲和性金属、合金)，可举出不锈钢、钛、钼、钽、金、及它们的合金、以及镀金合金铁、镀钼合金铁、钴铬合金、氮化钛被覆不锈钢等。其中，优选具有灭菌耐性的结构材料，具体而言，可举出聚丙烯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚酰亚胺、聚碳酸酯、聚砜、聚甲基戊烯等。就分离材而言，优选将由无纺布构成的分离材切割成适当的大小，沿体液的流动方向I片或多片层叠至厚度Imm 200mm左右而使用。从各组分的分离效率的角度出发，层叠的厚度更优选为1.5mm 150mm,进一步优选为2mm 100mm。将分离材填充于容器时，可以在沿体液的流动方向I片或多片层叠的状态下使用，厚度优选为Imm 50mm左右。从各部分的分离效率的角度出发，更优选为1.5mm 40mm,进一步优选为2mm 35_。另外，也可以将分离材卷成辊状而填充于容器。以辊状使用时，可以通过从该辊的内侧朝向外侧处理体液来分离血细胞，或者也可以与其相反地从该辊的外侧朝向内侧处理体液。将分离材填充于容器时，可以沿体液的流动方向压缩地填充于容器，也可以不压缩地进行容器填充。压缩的有无可根据分离材的材质等适当地选择。在细胞分离容器中，可以将分离材以切割成适当大小的平板状来填充，也可以以卷成辊状的形状来填充。进而，可以并用2种以上，也可以并用上述分离材以外的分离材，只要能够构成实质上捕集并回收白细胞这样的分离系统即可。实质上捕集白细胞是指，在与分离材接触的体液所含有的白细胞中，60%以上被分离材捕集。进而，在被细胞分离用容器整体捕集的白细胞中，本发明的分离材捕集的白细胞优选占60%以上的比例。细胞分离容器具有实质上不捕集红细胞而实质上捕集白细胞的特征。此处不捕集红细胞是指，具有在与分离材接触的体液所含有的红细胞中，60%以上通过分离材的性质。进而，本发明的分离材也可以是实质上捕集血小板的材料，但不限于此。实质上捕集血小板是指，在与分离材接触的体液所含有的血小板中，50%以上被分离材捕集。更优选60%以上被分离材捕集。另外，本发明涉及一种细胞分尚方法，其包括使体液与上述分尚材接触而分尚白细胞或单核细胞的工序。进而，本发明涉及一种细胞分离方法，其包括使体液与上述细胞分离容器接触而在分离材捕集白细胞或单核细胞的第一工序；和使用剥离溶液，从分离材回收捕集的白细胞或单核细胞的第二工序。具体而言，作为第一工序，从入口侧向填充有分离材的容器注入体液，捕集白细胞或单核细胞而使红细胞通过。接着，作为第二工序，通过从容器的出口方向，即，与体液、清洗液的通入方向相反的方向流过剥离溶液，从而能够以高收率分离回收被分离材捕集的白细胞或单核细胞。另外，虽然不是必要的，但在使体液与分离材接触而在分离材上捕集白细胞的工序之后，通过从相同方向通入清洗液，从而能够有效率地回收、分离滞留于容器内的红细胞。在具有体液的入口和出口的细胞分离容器中流过体液时，可以以比体液的出口高的方式设置体液的入口，沿与重力相同的方向流过体液，也可以以比体液的出口低的方式设置体液的入口，沿与重力相反的方向流过体液。通过沿与重力相反的方向流过体液，从而体液在容器内均匀地流动，所以能够进一步提高分离效率。可以使用上述细胞分离容器来构成血细胞成分分离系统。就血细胞成分分离系统而言，除了细胞分离容器之外，同时具备清洗溶液、剥离溶液的入口、出口，红细胞回收袋、白细胞回收袋等时，是实用的而优选的。此时，细胞分离容器具有体液流入的入口和流出的出口，进而与体液的入口 、体液的入口独立地具有冲洗滞留于容器内的红细胞的清洗溶液的流入部，进而与体液的出口、体液的出口独立地具有清洗液的流出部，而且，优选除了上述体液和清洗液的流出部或者流出部以外，还独立地具备用于导入剥离溶液的入口。附属于容器的清洗液的入口、出口可以作为体液的入口、出口发挥功能，也可以在入口侧的线路中介由三路活塞等而连接血液袋和清洗溶液袋。分离溶液的导入口也可以作为体液的出口发挥功能。另外，剥离溶液的回收侧也可以作为体液的入口发挥功能，同样地也可以介由三路活塞连接各袋、注射器等。图9、图10表示血细胞成分分离系统的一个例子。在血细胞成分分离系统中优选进一步配备体液的保存袋、用于回收被分离白细胞的剥离溶液回收袋、红细胞回收袋等。通过将这些袋与上述记载的各溶液的入口、出口连接，从而能够在无菌的封闭体系内分离体液。另外，优选各袋可以在使用后分开使用，可以形成像通常使用的血液袋这样的形状，也可以是平板状的盒方式等。作为各袋的方式，也可以根据需要，选择能够进行细胞培养的袋、具有冷冻保存耐性的袋等。对本发明的分离方法进行具体说明。I)体液送液工序从填充有分离材的容器的体液入口侧通入体液时，可以从装有体液的容器通过送液线路以自由下落进行送液，也可以利用泵进行送液。另外，将装有体液的注射器直接连接于容器，并用手推注射器。利用泵进行通液时，如果送液速度过快，则分离效率降低，如果过慢，则有花费处理时间的趋势。作为送液速度，例如可举出0.lmL/min 100mL/min的速度，但并不限于此。另外，作为体液送液工序的前处理，可以实施用生理盐水、缓冲液浸溃分离材的工序。该操作不是必要的，但考虑到分离材在上述溶液中的浸溃会影响分离效率的提高和血液流路的确保，所以可以根据情况来实施。该前处理溶液不必与以下的清洗工序中使用的溶液相同，但如果相同，则可以共用溶液袋，所以从线路系统的简单化和操作性的观点出发，优选为相同。作为前处理的液体量，是填充有分离材的容器的I倍 100倍左右时，是实用而优选的。作为可以使用的缓冲液，没有特别限定，但优选林格液、细胞培养所使用的培养液、磷酸缓冲液等通常的缓冲液。2)清洗工序 本工序不是必要的，但可以在提高夹杂物的除去效率的情况下实施。作为能够利用该工序除去的夹杂物，可举出红细胞、血浆等非血细胞成分。将清洗液从清洗液的流入侧沿与体液送液工序相同方向通入时，清洗液可以通过线路以自由下落进行送液，也可以利用泵进行送液。利用泵进行送液时的流速为与体液送液工序相同程度，可举出0.1mL/min 100mL/min的速度，但并不限于此。清洗量根据容器的容量而异,如果清洗量过少,则容器中残留的红细胞成分变多，如果清洗量过多，则分离效率降低，并且需要大量的时间，所以优选以容器的0.5倍 100倍左右的液量进行清洗。作为可以使用的清洗液，只要能够只冲洗红细胞并抑制被回收的白细胞中的其它血细胞的混入，能够保持血细胞的捕集状态，无论使用何种溶液均可，但优选生理盐水、林格液、细胞培养所使用的培养液、磷酸缓冲液等通常的缓冲液。3)白细胞或单核细胞的剥离从与体液的通入相反的方向(体液流出侧)向填充有分离材的容器注入剥离溶液，使白细胞剥离。注入剥离溶液时，可以通过预先将剥离溶液加入注射器等中，并使用手、设备用力挤压注射器的柱塞来实行。回收液量、流速根据容器的容量、处理量而异，优选容器的I倍 100倍左右的液量、流速0.5mL/sec 20mL/sec的流速,但并不限于此。
剥离溶液只要是低渗溶液就没有特别限定，可举出生理盐水、林格液、右旋糖酐葡萄糖注射液^卜’ >糖注)、羟乙基淀粉等作为注射用剂而具有实际使用效果的溶液、缓冲液、细胞培养用培养液等。另外，为了提高被捕集的细胞的回收率，可以提高回收液的粘稠度。因此，可以在上述分离溶液中添加白蛋白、纤维蛋白原、球蛋白、右旋糖酐、羟乙基淀粉、羟乙基纤维素、胶原蛋白、透明质酸、明胶等，但并不限于这些。剥离溶液的粘度没有特别限定，但如果粘度过高，则有难以进行回收操作的趋势，所以更优选为20mPa*s以下。如果是柱型的容器，则即使使用低粘度的剥离溶液分离性能也不降低，所以即使在IOmPa *s以下也可以使用。进而，即使是5mPa.s以下的剥离溶液也可以使用。在利用上述细胞分离方法而被回收的白细胞中，优选含有造血干细胞、间充质干细胞、⑶34阳性细胞。另外，本发明涉及一种冷冻保存方法，其特征在于，将利用上述细胞分离方法得到的细胞置于液氮环境下。上述细胞分离方法与以往的离心分离法相比，赋予细胞的应力非常低，所以利用该细胞分离方法得到的细胞的冷冻保存后的活性非常高。将细胞冷冻保存时，出于保护冷冻时的细胞的目的，可添加冷冻保护剂。添加的冷冻保护剂的种类没有特别限制，可以使用二甲基亚砜、右旋糖酐、白蛋白、羟乙基淀粉等。上述冷冻保护剂可以单独使用，也可以组合多种使用。对于冷冻保存方法而言，细胞只要在液氮环境下保存即可，可以在浸溃于液氮的状态下保存，也可以在液氮的气体下保存。保存时的温度没有特别限定，但为了防止细胞的活性降低，优选为-196 °C -30°C。更优选为_196°C -50°C，进一步优选为-196 °C -70 °C。本发明还涉及利用上述冷冻保存方法得到的白细胞、单核细胞、干细胞。作为利用上述冷冻保存方法得到 的干细胞，只要是体液中含有的具有自我复制能力且具有分化能力的细胞，无论是何种干细胞均可。具体而言，可举出造血干细胞、间充质干细胞、胚胎样干细胞(Embryonic-like Stem Cell)、血管内皮前体细胞等。作为造血干细胞的例子，可举出⑶34阳性细胞、⑶133阳性细胞、⑶34阴性且CD 133阳性细胞、CD34阳性且CD 133阳性细胞、CD34阳性且CD 133阴性细胞、CD45阳性且CD 133阳性且⑶117阳性细胞、CD45阳性且CD 133阴性且⑶117阳性细胞、CD45阳性且⑶133阳性且⑶164阳性细胞、⑶45阳性且⑶133阴性且⑶164阳性细胞。作为通常的造血干细胞，可举出⑶34阳性细胞或⑶133阳性细胞，但在脐带血中，认为造血干细胞会分化成⑶34阴性且⑶133阳性细胞、⑶34阳性且⑶133阳性细胞、⑶34阳性且⑶133阴性细胞。如果使用本发明的分离材，则能够也分离这些造血干细胞，并且，分离后的细胞即使进行冷冻，活性的降低也少。另外，对于造血干细胞中，特别是可以说与移植时的植入相关的作为造血生长因子(Stem Cell Factor)受体的⑶117阳性细胞、与细胞粘附相关的CD164阳性细胞而言，用本发明的分离材分离后，即使进行冷冻，活性的降低也少。另外，利用本发明的分离材将被认为是脐带血中间充质干细胞的CD45阴性且⑶44阳性且⑶73阳性且⑶90阳性细胞分离后，即使进行冷冻，活性的降低也少。脐带血中仅存在少数间充质干细胞，用离心分离时，存在损失大且不易分离的问题，但用本发明的分离材时，能够有效率地进行分离。脐带血中存在谱系阴性造血干细胞(Lineage Negative Stem Cell)这样的具有多分化能力的有趣的干细胞，被称为胚胎样干细胞(Embryonic-like Stem Cell)。用本发明的分离材时，能够有效率地分离该⑶45阴性且⑶235a阴性且⑶33阴性且⑶7阴性细胞，即使进行冷冻，活性的降低也少。对于血管内皮前体细胞的⑶45阴性且⑶309阳性细胞，用本发明的分离材分离后，即使进行冷冻，活性的降低也少。另外，对于白细胞中的⑶45阳性且⑶164阳性细胞、⑶45阳性且⑶117阳性细胞而言，用本发明的分离材分离后，即使进行冷冻，活性的降低也少。冷冻保存后的细胞的成活率优选为80%以上，更优选为85%以上。实施例以下，在实施例中对本发明进行详细叙述，但本发明不限于以下的实施例的方式。以下的实施例和比较例所示的无纺布以非压缩时的厚度均为恒定的范围的方式调整片数，进行填充。另外实施例和比较例中的填充有分离材的容器为如图7所示的柱型，液的入口和出口相对于过滤器的面位于中心，液的入口和出口位于与过滤器表面垂直的位置。(实施例1)将28片聚对苯二甲酸丁二醇酯制无纺布(平均纤维直径2.Ομπι、透气性系数Μ=7.0)在层叠状态下以图7所示的方式填充厚度6mm且直径18mm的由聚碳酸酯形成的柱状容器中。首先，从入口侧使用注射器用手按压而通入45mL的生理盐水。接着，以2.5mL/min的速度通入20mL的CPD抗凝 固的新鲜牛血液(以CPD:血液=200:28混合而成的含有12%CPD的牛外周血)，接着，从相同方向通入IOmL的生理盐水。其后，通过使用注射器用手按压而从相反方向通入30mL的添加10%FBS的a MEM培养液(粘度2.9mPa.s)，由此回收白细胞。剥离溶液能够顺利地导入。利用血细胞计数器(Sysmex公司制，K-4500)测定处理前血液的血细胞计数、回收的溶液的血细胞计数，算出白细胞的回收率。结果示于表1、图1以及图4。(实施例2)将28片聚丙烯制无纺布(平均纤维直径3.5 μ m、透气性系数Μ=9.6)以层叠状态填充，除此之外，实施与实施例1相同的操作。结果示于表1、图1以及图4。(实施例3)将28片聚对苯二甲酸丁二醇酯制无纺布(平均纤维直径2.9 μ m、透气性系数M=I0.0)以层叠状态填充，除此之外，实施与实施例1相同的操作。结果示于表1、图1以及图4。(实施例4)将32片尼龙制无纺布(平均纤维直径5.Ομπι、透气性系数M=9.2)以层叠状态填充，除此之外，实施与实施例1相同的操作。结果示于表1、图1以及图4。(比较例I)将84片聚对苯二甲酸丁二醇酯制无纺布(平均纤维直径1.7 μ m、透气性系数M=5.9)以层叠状态填充，除此之外，实施与实施例1相同的操作。回收操作时受到少许阻力，所以柱内压闻而堵塞。结果不于表1、图1以及图4。
(比较例2)将30片聚丙烯制无纺布(平均纤维直径2.1 μ m、透气性系数Μ=6.0)以层叠状态填充，除此之外，实施与实施例1相同的操作。结果示于表1、图1以及图4。(比较例3)将24片聚丙烯制无纺布(平均纤维直径4.9 μ m、透气性系数Μ=39.6)以层叠状态填充，除此之外，实施与实施例1相同的操作。结果示于表1、图1以及图4。表I表I
权利要求
1.一种用于从体液分离白细胞或单核细胞的分离材，其特征在于，由平均纤维直径为
2.Ομπι 6.Ομπι且透气性系数M为6.2 35的无纺布构成。
2.根据权利要求1所述的分离材，其中，无纺布由选自聚烯烃、聚酰胺以及聚酯中的至少I种构成。
3.根据权利要求1或2所述的分离材，其中，体液为选自外周血、脐带血、骨髓、月经血以及组织提取物中的至少I种。
4.一种细胞分离用容器，是将权利要求1 3中任一项所述的分离材填充于具有体液入口和体液出口的容器而得到的。
5.根据权利要求4所述的细胞分离用容器，其特征在于，在体液的流动方向上填充有I片分离材或者以层叠的方式填充有多片分离材。
6.根据权利要求4或5所述的细胞分离用容器，其特征在于，在体液的流动方向上以被压缩的状态填充有分尚材。
7.根据权利要求4 6中任一项所述的细胞分离用容器，其特征在于，所述细胞分离用容器为柱型。
8.一种细胞分离方法，包括使体液与权利要求1 3中任一项所述的分离材接触而分离白细胞或单核细胞的工序。
9.一种细胞分离方法，包括: 第一工序，使体液与权利要求4 7中任一项所述的细胞分离用容器接触而将白细胞或单核细胞捕集到分离材；和 第二工序，使用剥离溶液 ，从分离材回收捕集的白细胞或单核细胞。
10.根据权利要求9所述的细胞分离方法，其中，第二工序是从细胞分离用容器的出口导入剥离溶液且从入口回收白细胞或单核细胞的工序。
11.根据权利要求9或10所述的细胞分离方法，其中，在第一工序之后并在第二工序之前，进一步包括通过从入口导入生理盐水或缓冲液来除去细胞分离用容器内的夹杂成分的工序。
12.根据权利要求9 11中任一项所述的细胞分离方法，其中，在第一工序之前，进一步包括使分离材与生理盐水或缓冲液接触的工序。
13.根据权利要求9 12中任一项所述的细胞分离方法，其中，在第一工序之前，进一步包括将细胞分离容器的体液入口固定在低于细胞分离容器的体液出口的高度的工序。
14.根据权利要求8 13中任一项所述的细胞分离方法，其特征在于，白细胞和血小板实质上被分离材捕集，而红细胞实质上不被捕集。
15.根据权利要求8 14中任一项所述的细胞分离方法，其特征在于，被分离的白细胞或单核细胞包含造血干细胞和/或间充质干细胞。
16.—种细胞的冷冻保存方法,其特征在于,在权利要求8 15中任一项所述的细胞分离方法中，进一步包括置于液氮环境下的工序。
17.根据权利要求16所述的冷冻保存方法，其中，液氮环境下为-196°C -30°C。
18.根据权利要求16或17所述的冷冻保存方法，其特征在于，使用选自二甲基亚砜、右旋糖酐、白蛋白以及羟乙基淀粉中的至少I种冷冻保护剂。
19.根据权利要求16 18中任一项所述的冷冻保存方法，其特征在于，冷冻保存过的干细胞的成活率为80%以上。
20.利用权利要求8 15中任一项所述的细胞分离方法而得到的白细胞、单核细胞或干细胞。
21.根据权利要求20所述的干细胞，其中，包含选自如下细胞中的任一细胞: CD34阳性细胞， CD133阳性细胞， ⑶34阴性且⑶133阳性细胞， CD34阳性且CD133阳性细胞， ⑶34阳性且⑶133阴性细胞， ⑶45阴性且⑶44阳性且⑶73阳性且⑶90阳性细胞， ⑶45阴性且⑶235a阴性且⑶33阴性且⑶7阴性细胞， CD45阳性且CD133阳性且CD117阳性细胞， CD45阳性且CD133阴性且CD117阳性细胞， ⑶45阳性且⑶133阳性且⑶164阳性细胞， ⑶45阳性且⑶133阴性且⑶164阳性细胞，以及⑶45阴性且⑶309阳性细胞。
22.根据权利要求20所述的白细胞，其中，包含: ⑶45阳性且⑶164阳性细胞，或 ⑶45阳性且⑶117阳性细胞。
全文摘要
本发明的课题是提供从含有各血细胞成分的体液有效率地分离白细胞或单核细胞的分离系统和分离材。通过使含有各血细胞成分的体液与平均纤维直径为2.0μm～6.0μm且透气性系数M为6.2～35以下的分离材接触而将白细胞捕集到分离材，使用剥离溶液回收被捕集的白细胞或单核细胞，从而能够更有效率地分离白细胞或单核细胞。
文档编号C12N1/02GK103228780SQ201180056749
公开日2013年7月31日 申请日期2011年11月24日 优先权日2010年11月25日
发明者佐藤伸彦, 塚本彩子 申请人:株式会社钟化
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