基于荧光共振能量转移的原理的单分子型fret生物传感器接头的制作方法

xiaoxiao2020-6-24  9

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专利名称:基于荧光共振能量转移的原理的单分子型fret生物传感器接头的制作方法
技术领域
本发明涉及用于将基于荧光共振能量转移原理的单分子型FRET生物传感器最适化的接头(linker)、包括该接头的生物传感器、编码该接头或单分子型FRET生物传感器的基因、包含该接头或单分子型FRET生物传感器的表达载体、具有该表达载体的转化细胞和转基因非人动物、使用上述生物传感器的测定方法。
背景技术
在生命科学领域中,利用突光共振能量转移(Fluorescene resonance energytransfer,以下称为FRET)的原理和荧光蛋白的生物传感器正在快速地扩展(例如参照非专利文献I 4)。FRET是指从处于激发状态的荧光分子(供体:能量供给体)向非常近的荧光分子(受体:能量接受体)转移激发能量的现象。利用FRET的生物传感器的普及大大促进绿色荧光蛋白(GFP)的颜色突变体的出现及其改良。现在,很多情况下,作为GFP突变体的CFP(青色荧光蛋白)和YFP (黄色荧光蛋白)作为供体和受体荧光蛋白而被利用。使用荧光蛋白的FRET生物传感器系统分为双分子型FRET生物传感器(图1)和单分子型FRET生物传感器(图2)。双分子型FRET生物传感器检测分子间相互作用,单分子型FRET生物传感器检测分子的结构变化(例如,参照非专利文献I 4)。其中,单分子型生物传感器(单分子型FRET生物传感器)开发了离子、糖、脂质等低分子的定量、低分子量GTP结合蛋白、激酶等的活性测定中使用的传感器(例如,参照非专利文献4)。

但是,为了制作该生物传感器,需要结合至少3个,很多情况下4个以上的蛋白质结构域,仅仅将它们简单接合,通常无法制作具有充分的灵敏度的单分子型FRET生物传感器。即,为了制作这样的单分子型FRET生物传感器,必须考虑以下3个因子:i)受体荧光蛋白的发光光谱与受体荧光蛋白的吸光光谱的重叠;ii)受体荧光蛋白与受体荧光蛋白之间的距离;iii)受体荧光蛋白的发光瞬间和受体荧光蛋白的吸光瞬间的取向。此外,在荧光蛋白与其他蛋白质融合的情况下,与其他蛋白质融合成为负荷,从而产生荧光蛋白的错误折叠,其结果,发色团形成的效率降低,还必须考虑到有可能成为无荧光。这样,利用受体荧光蛋白和受体荧光蛋白在两者之间产生FRET的良好的表达存在严格的条件,两者间的配置等也没有发现一定的规则,因此,每个制作的单分子型FRET生物传感器都需要将各种蛋白质结构域的长度、结构域之间的接头序列等进行各种各样的变更,制作最适宜的传感器,但是这需要多次试行错误或复杂高度的试验等,具有充分灵敏度的单分子型FRET生物传感器的开发非常的困难。作为连接各结构域的接头,报告有9个氨基酸的甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸构成的接头(例如参照非专利文献5)、72个氨基酸的甘氨酸接头(例如参照非专利文献6),但是不能够说充分最适化。此外,这些接头中,没有在多种单分子型FRET生物传感器中共通的最适化的接头。现有技术文献非专利文献非专利文献1:Aoki, K.and M.Matsuda.2009.Visualization of small GTPaseactivity with fluorescence resonance energy transfer-based biosensors.NatureProtocol4:1623-1631非专利文献2:Giepmans, B.N., S.R.Adams, M.H.Ellisman, and R.Y.Tsien.2006.The fluorescent toolbox for assessing protein location and function.Science312:217-224非专利文献3:Jares-Erijman, E.A.and T.M.Jovin.1maging molecularinteractions in living cells by FRET microscopy.2006.Curr.0pin.Chem.Biol.10:409-416.
非专利文献4:Kiyokawa, E.,S.Hara, T.Nakamura, and M.Matsuda.2006.Fluorescence (Forster)resonance energy transfer imaging of oncogene activity inliving cells.Cancer Sc1.97:8-15.
非专利文献5:1toh, R.E., K.Kurokawa, Y.0hba, H.Yoshizaki, N.Mochizuki,and M.Matsuda.2002.Activation of Rac and Cdc42video-1maged byFRET—based single-molecule probes in the membrane of living cells.Mol.Cell.Biol.22:6582-6591.
非专利文献6:Harvey, C.D., A.G.Ehrhardt, C.Cellurale.H.Zhong, R.Yasuda, R.J.Davis, and K.Svoboda.2008.A genetically encoded fluorescent sensor of ERKactivity.Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A

发明内容
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发明要解决的课题本发明就是为了解决上述现有的问题,以达成以下的目的为课题的。即,本发明的目的在于提供一种用于将基于荧光共振能量转移原理的单分子型FRET生物传感器最适化,得到高灵敏度的单分子型FRET生物传感器而能够广泛使用的接头(以下,本说明书中,本发明的接头称为EV (Enhanced visualization)接头)、包含该接头的生物传感器、编码该接头或生物传感器的基因、包含该接头或生物传感器的表达载体、具有该表达载体的转化细胞和转基因非人动物、和使用包含上述接头的生物传感器的测定丝氨酸-苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性、低分子量GTP结合蛋白的活性而使用适宜的上述单分子型FRET生物传感器的测定方法。用于解决课题的方法为了解决上述课题进行了潜心研究,发现具有一定以上长度的接头可以解决上述问题,该接头将基于荧光共振能量转移原理的单分子型FRET生物传感器最适化,为了获得高灵敏度的单分子型FRET生物传感器而能够广泛应用。并且发现,通过包含一定比例或一定序列的特定氨基酸的重复,能够提高最适化的效果。S卩,本发明基于下述见解:使用具有一定以上长度的接头,能够显著降低作为降低单分子型FRET生物传感器的增益的主要原因的基础状态的FRET,本发明能够广泛应用在单分子型FRET生物传感器制作中。本发明的接头是为了增大上述单分子型FRET生物传感器的增益而开发得到的接头,其技术价值非常大。 g卩,用于解决上述课题的方法如下。(I) 一种接头,其为基于荧光共振能量转移原理的单分子型FRET生物传感器的接头,所述接头的特征在于,其为包括52个氨基酸残基以上、400个氨基酸残基以下的多肽,总氨基酸残基数的至少45%为甘氨酸和丙氨酸的至少任一个,丙氨酸在总氨基酸残基数中含有至少10%。(2)如上述(I)所述的接头,其为包括84个氨基酸残基以上的多肽。(3)如上述(I)或(2)所述的接头,丝氨酸和苏氨酸的至少任一个在总氨基酸残基数中含有至少10%。(4)如上述(3)所述的接头,总氨基酸残基数的至少95%由甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸和丙氨酸构成,甘氨酸含有35 65%,丝氨酸和苏氨酸的至少任一个含有10 40%,丙氨酸含有10 40%o(5)上述(4)所述的接头,总氨基酸序列的至少95%为由SAGG和GGAS的任一个的氨基酸序列的重复构成,SAGG和GGAS的任一个的氨基酸序列的重复单元含有13个以上、100个以下。(6)如上述(I)或(2)所述的接头,精氨酸和谷氨酸的至少任一个在总氨基酸残基数中含有至少10%。(7)如上述(6)所述的接头,总氨基酸残基数的至少95%由甘氨酸、精氨酸、谷氨酸和丙氨酸构成,甘氨酸含有 4 30%,精氨酸含有5 30%,谷氨酸含有5 30%,丙氨酸含有30 60%0(8) —种基因,其特征在于,编码上述(I) (7)中任一项所述的接头。(9) 一种表达载体,其特征在于,包含编码上述(I) (7)中任一项所述的接头的基因。(10)—种转化细胞,其特征在于,保持上述(9)所述的表达载体。(11) 一种转基因非人动物,其特征在于,保持上述(9)所述的表达载体。(12) 一种单分子型FRET生物传感器,其为基于荧光共振能量转移原理的单分子型FRET生物传感器,其特征在于,其为具有传感器区域、配体区域、受体荧光蛋白区域、供体荧光蛋白区域和连接该传感器区域与该配体区域的接头区域的融合蛋白,该接头区域上述(I) (7)中任一项所述的接头构成。(13)如上述(12)所述的单分子型FRET生物传感器,该供体荧光蛋白为YPet。(14)一种基因,其特征在于,编码上述(12)或(13)中任一个所述的单分子型FRET生物传感器。(15)—种表达载体,其特征在于,包含编码上述(14)所述的单分子型FRET生物传感器的基因。(16)—种转化细胞,其特征在于,保持上述(15)所述的表达载体。(17)—种转基因非人动物,其特征在于,保持上述(15)所述的表达载体。(18)—种测定方法,其特征在于,包括使用上述(12)所述的单分子型FRET生物传感器检测FRET的工序,测定丝氨酸一苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性和低分子量GTP结合蛋白活性的任一个。(19) 一种测定方法,其特征在于,包括使用上述(16)所述的转化细胞或上述(13)所述的转基因非人动物检测FRET的工序,测定丝氨酸一苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性和低分子量GTP结合蛋白活性的任一个。(20) 一种丝氨酸一苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性和低分子量GTP结合蛋白活性的任一个的调节物质的筛选方法,包括:(a)使上述(16)所述的转化细胞与被检物质接触的工序;和(b)通过检测FRET,检测丝氨酸一苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性和低分子量GTP结合蛋白活性的任一个的变化的工序。发明的效果根据本发明的接头,能够将基于荧光共振能量转移原理的单分子型FRET生物传感器最适化,得到高灵敏度单分子型FRET生物传感器。根据本发明的单分子型FRET生物传感器,能够测定丝氨酸一苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性和低分子量GTP结合蛋白活性。


图1表示双分子型FRET生物传感器的基本结构和工作原理。为了检测A和B的分子间相互作用,A融合FRET受体荧光蛋白(示例CFP),B融合FRET受体荧光蛋白(示例YFP )。若A和B结合,则FRET供体荧光蛋白接近FRET受体荧光蛋白,利用FRET检测来自FRET受体荧光蛋白的荧 光。带有箭头的波浪线是表示激发光和荧光。图2表示单分子FRET生物传感器的基本结构和工作原理。已知A分子发生结构变化的情况下,在两个位置融合FRET供体荧光蛋白(示例CFP)和FRET受体荧光蛋白(示例YFP)。A分子的结构变化带来FRET的效率变化。附有箭头的波浪线表示激发光和荧光。图3表示利用包括传感器区域和配体区域的FRET的单分子型FRET生物传感器的原理。在FRET供体荧光蛋白(示例CFP)和FRET受体荧光蛋白(示例YFP)之间,通过接头序列结合传感器区域与配体区域。传感器区域包括与激酶的活化、GTP交换因子的活化等各种细胞内环境的变化相对应而发生结构变化的部分。配体区域为与该传感器区域的结构变化相对应而结合的结构域。若传感器区域的结构变化,则配体区域结合。与之相伴,FRET供体荧光蛋白接近FRET受体荧光蛋白,利用FRET检测来自FRET受体荧光蛋白的荧光。图4为以针对PKA的生物传感器Eevee-PKA为例,例示利用包括传感器区域和配体区域的FRET的单分子型FRET生物传感器中的接头区域的作用。传感器区域包括由PKA特异性磷酸化的底物序列。配体区域为已知抑制与该磷酸化肽接合的Radl蛋白的FHAl结构域。若传感器区域的底物序列被PKA磷酸化,则与配体区域接合。与之相伴,FRET供体荧光蛋白(CFP)接近FRET受体荧光蛋白(YFP),利用FRET检测来自FRET受体荧光蛋白的荧光。图5表示EV接头的长度与增益的关系,在HeLa细胞中表达具有各种长度的EV接头的Eevee-PKA,在24小时后,通过ImM的联丁酰基cAMP将PKA活化。测定刺激前和刺激后30分钟的FRET/CFP荧光比,将相对于刺激前的增加的比例作为增益。图6表示YFP受体蛋白为YPet突变株时,EV接头的效果更显著。制作具有YPet和各种长度的EV接头的Eevee-PKA。接着,在HeLa细胞中表达这些Eevee-PKA,24小时后,通过ImM的联丁酰基cAMP将PKA活化。测定刺激前和刺激后30分钟的FRET/CFP荧光比,将相对于刺激前的增加的比例作为增益。图7表示EV接头的效果是通过降低基础状态的FRET来获得的。图7A为在HeLa细胞中表达Eevee-PKA-52,通过激光共聚焦显微镜FV1000以438nm的激光激发,测定各波长的荧光强度的结果。图7B为采用Eevee-PKA-84,与图7A同样测定的结果。图7C为采用Eevee-PKA-116,与图7A同样测定的结果。表示基础状态下的FRET的530nm荧光通过增长EV接头而显著降低。图8A表示由EV接头导致的基础状态的FRET效率降低来自磷酸化的降低。与图7同样,在HeLa细胞中表达Eevee-PKA。刺激前样品分为ImM联丁酰基cAMP进行15分钟处理的物质和ImM联丁酰基cAPM和50nM花萼海绵诱癌素进行15分钟处理的物质,通过含有50iiM PhosTag的6%SDS聚丙烯酸酰胺凝胶进行分离。之后,以抗GFP抗体小鼠单克隆抗体进行免疫印迹。得知随着EV接头缩短,基础状态的磷酸化降低。图8B为用图表表示图8A的磷酸化比例的图。图9A表示具有PIP3结合结构域的Akt生物传感器(Eevee_Akt_84)的结构。记载为84a.a.的为EV84接头。AktPH表示Akt蛋白的PH结构域,NES为核输出信号。图9B是与图9A同样表示具有PIP3结合结构域的Akt生物传感器(Eevee-Akt-116)的结构。记载为116a.a.的为EV116接头。图10表示在Akt的生物传感器中也观察到由EV接头导致的基础状态的FRET降低。在C0S7细胞中表达Eevee-Akt,测定FRET/CFP荧光比。对5个以上的细胞进行测定,显示平均值。EV接头为116的比72Gly接头具有更低的基础状态的FRET。图1lA为由Eevee-ERK进行的ERK活性测定与具有甘氨酸接头的情况下进行比较的图。图1lA为在HeLa细胞中表达包含EV116接头的Eevee-ERK (3560NES),以10ng/ml的EGF刺激,将实测值的FRET/CFP荧光比记录于Y轴的图。图1lB表示将上述FRET/CFP荧光比以刺激前状态标准化后的图。图1lC为与图1lA同样表示具有甘氨酸接头的EKAR-1667nes (72Gly接头)(1667NES)的结果的图。图1lD为表示将上述FRET/CFP荧光比以刺激前状态标准化后的图。实测值的FRET/CFP的上限为2.2左右,因此显示,相比于具有甘氨酸接头的EKAR_1667nes,包括EV116接头的Eevee-ERK(参照图1lA和B)具有很广的增益,这是由于低的基础状态的FRET效率所导致的。图12表示具有EV接头的EGFR/Abl的生物传感器Picchu_734的反应性。在HeLa细胞中表达Picchu-734,用10ng/ml的EGF刺激。可知与没有EV接头的Picchu-730相比,
具有更广的增益。图13A表示由具有EV接头的Raichu-Racl (2246X)进行的Racl活性测定。为在HeLa细胞中转染没有EV接头的pRaichu-Racl (2241X)和具有EV接头的pRaichu-Racl(2246X),在48小时后,用实施例2记载的方法进行显像。在激光共聚焦显微镜FVlOOO下,用438nm的激光激发, 测定各波长的荧光强度的图。可知表示基础状态的FRET的530nm的荧光由于增长EV接头而显著降低。图13B为在图13A的显像中,在显像开始10分钟后投与表皮生长因子(EGF),使其达到25ng/ml,继续显像。将标准化后的FRET/CFP作为图表显示。具有EV接头的Raichu-Racl (2246X)具有更高的反应性。图14A表示稳定表达Raichu_2246X的大鼠C6细胞经过24小时定时成像,测定FRET/CFP效率(记载为Racl活性)的数据。箭头表示细胞分裂。显示在表达EV接头的细胞中,FRET长时间能够稳定测定。图14B为在与上述相同的条件下摄影的其他细胞的结果。图14C为在与上述相同的条件下摄影的其他细胞的结果。图14D为在与上述相同的条件下摄影的其他细胞的结果。图15A为在C0S7细胞中表达具有EV接头的Raichu-Cdc42。比较基础状态的FRET效率,显示EV接头显著降低基础状态的FRET。图15B为对具有EV接头的Raichu_Cdc42在显像开始10分钟后投与表皮生长因子(EGF),使其达到25ng/ml,将继续显像时的标准化后的FRET/CFP作为图表表示的图。图15C为没有EV接头的Raichu_Cdu42,与图15B同样,将标准化后的FRET/CFP作为图表表示。可知与没有EV接头的Raichu-Cdc42相比,具有EV接头的Raichu_Cdu42具有更高的反应性。图16A为在HeLa细胞中表达具有EV接头的Raichu-Ras (3705X),用10ng/ml的EGF刺激,每隔I分钟获取的定时摄影的图。可知与没有EV接头的Raichu-HRas (图16B)相比较,具有EV接头 的Raichu-HRas能够早期检测出很强的活化。图16B为没有EV接头的Raichu-HRas与图16A同样获取图像的图。图17为用荧光显微镜拍摄表达Eevee-ERK的转基因小鼠的胎儿的矢状切面,获取FRET图像的图。基础状态前后40%用伪彩色表示(暖色表示高的FRET)。能够观察到个体内的ERK活性分布。图18为在HeLa细胞中稳定表达Eevee-ERK的细胞在96孔培养皿中培养,加入梯度稀释的抑制剂之后,用25ng/ml的EGF刺激得到的结果。对30个以上的细胞自动测定ERK活性,将平均值图表化。图18A表示DMSO的对照。图18B表示使用EGF受体抑制剂(AG1478)作为抑制剂的情况。图18C表示使用MEK抑制剂(PD15035)作为抑制剂的情况。图18D表示使用BRAF的抑制剂(PLX4720)作为抑制剂的情况。图18E表示使用MEK抑制剂(PD184351)作为抑制剂的情况。图18F表示使用磷脂酰肌醇3-磷酸激酶的抑制剂(LY294002)作为抑制剂的情况。图18G表示使用RSK的抑制剂(B1-D1870)作为抑制剂的情况。图18H表示使用JNK抑制剂(JNK inhibitor VIII)作为抑制剂的情况。显示EGK依赖性ERK活化在HeLa细胞中通过EGF受体和MEK的抑制剂而被有效抑制。图19表示在表达Eevee-PKA (3536NES)的转基因小鼠中,分别静脉注射磷酸二酯酶的抑制剂茶碱和环腺苷三磷酸的类似物布拉地新,测定PKA活性得到的结果。分别在肌间神经细胞、肠道平滑肌、血管平滑肌中能够实时可视化PKA的活性变化。图20为将图19的图像图表化的图。
图21为显示使用减少甘氨酸含量的EV3X8和EV6X4接头的生物传感器也具有与使用EV116接头的生物传感器几乎相同的效果的图。与图7同样,在HeLa细胞中表达 Eevee-PKA_3X8、Eevee-PKA_4X6、Eevee-PKA-116,在激光共聚焦显微镜 FV1000 下,用438nm的激光激发,测定各波长的荧光强度的图。可知EV3X8和EV4X6接头具有与EVl 16接头相匹敌的效能。
具体实施例方式以下,说明本发明的实施方式。本发明的接头(EV接头)为基于荧光共振能量转移(FRET)原理的单分子型FRET生物传感器的接头,为包括52个氨基酸残基以上、400个氨基酸残基以下的多肽,总氨基酸残基数的至少45%为甘氨酸和丙氨酸的任一个,丙氨酸在总氨基酸残基数中至少包含10%。本发明的接头,作为基于荧光共振能量转移(FRET)原理的单分子型FRET生物传感器,即单分子型FRET生物传感器中的构成要素之一而连结使用。本发明中,所谓FRET,是指从处于激发状态的荧光分子(供体:能量供给体)向非常近的荧光分子(受体:能量接受体)转移激发能量的现象。 单分子型FRET生物传感器通常具有供体荧光蛋白、受体荧光蛋白、传感器结构域、配体结构域这四个区域,接头连接这些的2个区域之间。图3为单分子型FRET生物传感器中使用的本发明的接头的示例。将CFP作为供体荧光蛋白的一例,YFP作为受体荧光蛋白的一例,对本发明进行具体说明,但是如后所述,供体荧光蛋白和受体荧光蛋白不限于此。传感器结构域和配体结构域在基础状态下处于空间上离开的位置,在该状态下,供体荧光蛋白和受体荧光蛋白也处于空间上离开的位置,基础状态的FRET效率低。在活化状态中,由结构识别结构域构成的配体区域(B)识别因磷酸化、GTP结合等各种信号诱导的传感器区域(A)的结构变化并与之结合,由此使供体接近受体,从而使FRET效率提高。在此,FRET效率是指激发供体荧光蛋白所得到的荧光强度的在受体荧光蛋白存在下的减少比例,但是在本说明书中,为了方便起见,使用在供体荧光蛋白的激发波长照射单分子型FRET生物传感器的情况下的供体荧光蛋白的荧光强度与受体荧光蛋白的荧光强度的比(荧光强度比)(参照非专利文献I和3)。以下,本说明书中记载的参考文献通过参照而将其全部教导弓I入本说明书中。本说明书中的EV接头是至少具有52个氨基酸以上、400个氨基酸以下的长度,没有获得稳定的三级结构的多肽。如果不足52个氨基酸,则基础状态下的FRET效率增高,不会获得很大的增益;如果超过400个氨基酸,则FRET生物传感器的分子量增大,表达量降低。从增大上述增益的观点出发,更优选84个氨基酸以上,特别优选116个氨基酸以上。从抑制上述分子量的观点出发,更优选244个氨基酸以下。从上述观点出发,接头的长度特别优选84氨基酸以上、244氨基酸以下。本发明的EV接头是没有取得稳定的三级结构的多肽,总氨基酸残基数的至少45%为甘氨酸和丙氨酸的至少任一个(即,意为甘氨酸残基和丙氨酸残基的合计占总氨基酸残基数的至少45%),丙氨酸在总氨基酸残基数中至少包含10%。总氨基酸残基数的至少45%为甘氨酸和丙氨酸的至少任一个构成,从制作可动性大的多肽的观点出发是非常重要的,通过使丙氨酸在总氨基酸残基数中至少包含10%,能够比仅由甘氨酸构成的接头增大增益。作为甘氨酸和丙氨酸以外的氨基残基,只要注意不能取得稳定的三级结构,则也可以包含其他氨基酸。从制作不能取得稳定的三级结构的多肽的观点出发,特别适宜包含丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、谷氨酸等。例如,优选除了甘氨酸和丙氨酸,丝氨酸和苏氨酸的至少任一个在总氨基酸残基数中含有至少10%的多肽。作为这样的多肽,可以举出总氨基酸残基数的至少95%由Gly, Ser, Thr和Ala构成,Gly含有35 65%、Ser和Thr的至少任一个含有10 40%、Ala含有10 40%的多肽。这些氨基酸残基优选均勻分布于全长中,其中,优选重复包含Ser-Ala-Gly-Gly、其反向序列 Gly-Gly-Ala-Ser 或 Gly-Ala-Gly-Ser 的序列。作为这样的序列,例如,优选 Ser-Ala-Gly-Gly、Gly-Gly-Ala-Ser 或 Gly-Ala-Gly-Ser 的重复单元在总氨基酸残基数中包含95%以上,在上述基本序列之外,也优选以总体不足5%的范围在序列中插入Gly、Ser、Ala、Thr等的序列。上述序列中,优选以与Ser性质非常接近的氨基酸Thr取代Ser的序列。上述氨基酸序列的重复单元优选包含13个以上、100个以下。这样的接头的具体例子可以例举如下。EV52接头(序列号:12)SAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGEV84接头(序列号:15)SAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGEV116 接头(序列号:18)SAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGG EV180 接头(序列号:23) SAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGS TSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGEV244 接头(序列号:26 )SAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGG此外,优选除了丙氨酸和甘氨酸,精氨酸和谷氨酸的至少任一个在总氨基酸残基数中含有至少10%的多肽。作为这样的多肽,可以举出总氨基酸残基数的至少95%由甘氨酸、精氨酸、谷氨酸和丙氨酸构成,甘氨酸含有4 30%,精氨酸含有5 30%,谷氨酸含有5 30%、丙氨酸含有30 60%的多肽。这样的氨基酸残基优选均勻分布于全长中,例如,可以例举下述序列。EV3X8 接头(序列号:45)EAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREMARGGEAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAAREV6X4 接头(序列号:46)EAAAREAAAREAAAREAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAAREAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAAREAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAARAAREAAAREAAAREV3X8接头为3次重复EAAAR序列得到的15个氨基酸残基的序列单元以GG序列连接8个而得到的134个氨基酸残基的多肽。总氨基酸残基数134个中,丙氨酸为72个(53.7%),甘氨酸为14个(10.4%),谷氨酸为24个(17.9%),精氨酸为24个(17.9%)。丙氨酸和甘氨酸合计为64.1%。此外,EV6X4接头为124个氨基酸残基的多肽,总氨基酸残基数124个中,丙氨酸为71个(57.3%),甘氨酸6个(4.8%),谷氨酸23个(18.5%),精氨酸24个(19.4%),丙氨酸和甘氨酸合计为62.1%。本发明的EV接头增大了单分子型FRET生物传感器的增益,该单分子型FRET生物传感器中的插入部位考虑到基础状态和活化状态的FRET效率之差,即,增益的增大而适宜选择。即,能够连接选自单分子型FRET生物传感器的供体荧光蛋白、受体荧光蛋白、传感器结构域和配体结构域的任2个区域之间而使用,对于用在哪个区域间没有特别限定。例如,如图3所示,能够用在传感器结构域和配体结构域之间的连接。本发明的单分子型FRET生物传感器是基于荧光共振能量转移原理的单分子型FRET生物传感器,其为具有传感器区域、配体区域、受体荧光蛋白区域、供体荧光蛋白区域和连接该传感器区域和配体区域的接头区域的融合蛋白,该接头区域由上述本发明的接头构成。本发明的单分子型FRET生物传感器的优选方式为:至少包含供体荧光蛋白、受体荧光蛋白、传感器结构域、配体结构域、接头的5个区域的至少每一个,并且,从氨基末端侧包含供体(或受体)荧光 蛋白、传感器(或配体)结构域、EV接头、配体(或传感器)结构域、受体(或供体)荧光蛋白的方式(I);至少包含供体荧光蛋白、受体荧光蛋白、传感器结构域、配体结构域、接头的5个区域的至少每一个,并且,从氨基末端侧包含传感器(或配体)结构域、供体(或受体)荧光蛋白、EV接头、受体(或供体)荧光蛋白、配体(或传感器)结构域的方式
(2);至少包含供体荧光蛋白、受体荧光蛋白、传感器结构域、配体结构域、接头的5个区域的至少每一个,并且,从氨基末端侧包含供体(或受体)荧光蛋白、传感器(或配体)结构域、EV接头、受体(或供体)荧光蛋白、配体(或传感器)结构域的方式(3);至少包含供体荧光蛋白、受体荧光蛋白、传感器结构域、配体结构域、接头的5个区域的至少每一个,并且,从氨基末端侧包含传感器(或配体)结构域、供体(或受体)荧光蛋白、EV接头、受体(或供体)荧光蛋白、配体(或传感器)结构域的方式(4)。传感器区域包括磷酸化的肽或者低分子量GTP结合蛋白的情况下优选方式(I )。因此,该EV接头在单分子型FRET生物传感器中优选存在于配体区域和传感器区域之间。此夕卜,在单分子型FRET生物传感器中不一定必须存在各一个受体荧光蛋白、受体荧光蛋白、传感器区域、配体区域、EV接头,也可以存在多个。作为构成供体荧光蛋白区域的供体荧光蛋白,只要保持形成FRET对的功能,就没有特别限定,但是从功能性的观点出发,优选CFP或TFP (Teal Fluorescence Protein)。构成另一方面的受体荧光蛋白区域的受体荧光蛋白也同样,只要保持形成FRET对的功能,就没有特别限定,但是从功能性的观点出发,优选YFP。在此,所谓的FRET对的功能,是指从激发状态的供体荧光蛋白向附近的受体荧光蛋白转移激发能量,并能够检测该激发能量的转移。供体荧光蛋白和/或受体荧光蛋白只要能够保持形成FRET对的功能,则也可以为这些蛋白质的一部分,而不一定为全长。通过屡屡缩短这些氨基酸序列的羧基末端,产生FRET效率之差的增大。例如,作为受体荧光蛋白和/或供体荧光蛋白的一部分,可以例举在这些氨基酸序列的羧基末端区域优选具有至少I个、更优选I 11个缺失的蛋白。其中,该区域中的氨基酸缺失部位没有特别限定。例如,在YFP的情况下,其氨基酸序列的羧酸末端区域优选具有至少I个、更优选I 11个、更优选11个氨基酸缺失。在CFP的情况下,其氨基酸序列的羧酸末端区域中优选具有至少I个、更优选I 11个、更优选11个氨基酸缺失。这里,羧酸末端区域是指在本发明中使用的GFP关联蛋白质的氨基酸序列中,从其羧酸末端直到氨基酸的个数优选I 20个、更优选11个的区域。此外,是否保持形成FRET对的功能,例如能够通过以下方法评价,S卩,依照公知的方法在大肠杆菌中共同产生假想形成FRET对的一对蛋白质分子,在含有该一对蛋白质的细胞提取液中,观察该蛋白质在各自的假定激发波长下的荧光强度。而且,受体荧光蛋白和/或受体荧光蛋白是否具有突变都可以。只要是能够保持形成FRET对的功能,则突变的导入可以对受体荧光蛋白和/或受体荧光蛋白的氨基酸序列中的任意部位进行。例如,作为突变的方式,可以举出多个氨基酸的取代,作为这样的氨基酸取代的具体方式,例如可以举出GFP的突变体Leu65Phe、Phe47Leu、Thr66Ser等。通过导入这样的突变,能够获得使得发色团形成效率上升、FRET效率上升等效果,因此优选。突变的导入能够通过公知的使用PCR (聚合酶链式反应)的方法进行。作为YFP的突变体,例如,可以举出 Ypet [Nguyen A.ff., and P.S.Daugherty.Evolutionary optimization offluorescent proteins for intracellular FRET.2005.Nat.Biotechnol.23:355-360]>EYFP (Clontech 公司)、Venus [Nagai, T., K.1bata, E.S.Park, M.Kubota, K.Mikoshiba, andA.Miyawak1.A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficientmaturation for cell-biological applications.2002.Nat.Biotechnol.20:87-90.]等,作为 CFP 的突变体,例如能够举出 CyPet [Nguyen A.ff., and P.S.Daugherty.Evolutionaryoptimization of fluorescent proteins for intracellular FRET.2005.Nat.Biotechnol.23:355-360]、ECFP (Clontech 公司)、SECFP (非专利文献 5)、Turquoise(Goedhart, J., L.an ffeeren, M.A.Hink, N.0.Vischer, K.Jalink, and T.ff.Gadella, Jr.Bright cyan fluorescent protein variants` identified by fluorescence lifetimescreening.2010.Nat.Methods7:137-139.)等。作为受体荧光蛋白和供体荧光蛋白的组合,适宜使用 Venus 和 ECFP、YPet 和 ECFP、Venus 和 Turquoise、YPet 和 Turquoise。作为构成传感器区域的传感器蛋白和构成配体区域的配体的组合,没有特别限定,可以适宜举出能够测定丝氨酸-苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性、低分子量GTP结合蛋白的任一个的组合。作为测定丝氨酸-苏氨酸激酶活性的组合,可以适宜地举出包含叉头关联(Forkhead-associated,以下记载为FHA1)区域、Wff (Trp-Trp)区域、或者BRCT(BRCA1-C末端)区域和丝氨酸或苏氨酸的肽序列;作为测定酪氨酸激酶活性的组合,可以适宜地举出包含SH2 (Src同源-2)结构域或PTB (Phsophotyrosine-binding:磷酸酪氨酸结合)结构域和酪氨酸的肽序列;作为测定低分子量GTP结合蛋白活性的组合,可以适宜地举出包含Ras家族低分子量GTP结合蛋白、Rho家族低分子量GTP结合蛋白、Rab家族低分子量GTP结合蛋白、Arf家族低分子量GTP结合蛋白、或者Ran家族低分子量GTP结合蛋白和各自的标的蛋白。
作为本发明的单分子型FRET生物传感器的构成要素和分别特别优选的组合,从有效性、特异性、灵敏度的观点出发,传感器区域为低分子量GTP结合蛋白Ras,配体区域为Ras的标的蛋白Raf,供体荧光蛋白为CFP,受体荧光蛋白为YFP ;或者,传感器区域为低分子量GTP结合蛋白Racl,配体区域为Racl的标的蛋白Pak,供体荧光蛋白为CFP,受体荧光蛋白为YFP ;或者,传感器区域为低分子量GTP结合蛋白Cdc42,配体区域为Cdc42的标的蛋白Pak,供体荧光蛋白为CFP,受体荧光蛋白为YFP ;或者,传感器区域为由蛋白激酶A (A激酶,以下记为PKA)磷酸化的肽,配体区域为FHAl结构域,供体荧光蛋白为CFP,受体荧光蛋白为YFP ;或者,传感器区域为由细胞外信号调节激酶(Extracellular Signal-regulatedKinase,以下记载为ERK)磷酸化的肽,配体区域为Wff结构域,供体荧光蛋白为CFP,受体荧光蛋白为YFP ;或者,传感器区域为由酪氨酸激酶磷酸化的肽,配体区域为Crk蛋白的SH2结构域,供体荧光蛋白为CFP,受体荧光蛋白为YFP。受体(供体)荧光蛋白、配体(或传感器)结构域、低分子量GTP结合蛋白、标的蛋白的结合顺序,从增大增益的观点出发,在包含本发明的EV接头的单分子型FRET生物传感器中,优选可以例举从氨基酸末端侧为YFP-FHA1-EV接头-PKA底物肽-CFP、YFP-FHA1-EV接头-ERK 底物肽-CFP、YFP-Raf-EV 接头-Ras-CFP、YFP-Racl-EV 接头-Pak-CFP、YFP-Cdc42-EV接头-Pak-CFP、或者YFP-CRK SH2结构域-EV接头-酪氨酸激酶底物肽-CFP。这些中,能够适宜地使用YFP和CFP的位置相互交换的,或者也能够适宜地使用YFP和CFP的各种突变体,例如 Ypet、CyPet> EYFP (Clontech 公司)、ECFP (Clontech 公司)、SECFP>Venus 等。本发明的单分子型FRET生物传感器只要是具有上述5个区域的即可,为了根据目的改变细胞内分布,或者为了容易进行单分子型FRET生物传感器的精制,适宜使用在其N末端、C末端或者单分子型FRET生物传感器内部含有肽标签、其他荧光蛋白或者细胞内定位信号、调节蛋白质-蛋白质之间相互作用的结构域等。对于上述本发明的EV接头是否实现本发明所期望的效果的评价,例如,基于后述的实施例1记载的方法进行评价。本发明还提供编码本发明的上述EV接头的基因(DNA)和编码本发明的上述单分子型FRET生物传感器的基因(DNAXEV接头的基因能够化学合成,此外,上述单分子型FRET生物传感器的基因,对于EV接头以外的上述各构成蛋白质而言,能够从GenBank等获得基因信息,通过公知的使用PCR的方法和使用限制性内切酶和连接酶的方法依照通常的方法制作。本发明还提供包含上述基因的表达载体。这样的载体能够通过下述方法获得,即,依照公知的方法将编码本发明的EV接头或者单分子型FRET生物传感器的基因插入公知的原核细胞表达载体,例如PGEX-2T (GE Healthcare公司制造)、真核细胞表达载体,例如 pCAGGS[Niwa, H., K.Yamamura, and J.Miyazak1.1991.Efficientselection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.Genel08:193-200.]、或者病毒载体,例如 pCX4 [Iwahara, T., T.Akagi, Y.Fujitsuka, andH.Hanafusa.2004.CrkII regulates focal adhesion kinase activation by makinga complex with Crk—associated substrate,pl30Cas.Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.AlOl:17693-17698.]而得到。
本发明还提供保持上述表达载体的转化细胞和转基因非人动物。该转化细胞通过将上述表达载体导入作为对象的细胞而获得。作为导入细胞中的方法,能够使用公知的转染法或病毒感染法,没有特别限定,例如磷酸钙法、脂质转染法、电穿孔法或者使用转座子的方法等。作为该细胞,能够使用真核细胞或者原核细胞,没有特别限定。例如,作为真核细胞能够使用来自人癌的HeLa细胞、来自人胎儿肾脏的HEK293细胞、来自狗肾脏的MDCK细胞、来自猴肾脏的C0S7细胞、大鼠C6神经胶质瘤细胞、酵母等,作为原核细胞能够使用大肠杆菌等及其他的各种细胞。另一方面,通过公知的方法,例如,在小鼠受精卵的核内显微注射质粒DNA的方法或者利用 Tol2 转座酶的方法[Sumiyama, K., K.Kawakami, and K.Yagita.2010.A simpleand highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2transposon systemand cytoplasmic microinjection.Genomics95:306-311.]等将上述表达载体直接导入小鼠等的个体中,能够获得转基因非人动物。作为转基因非人动物,只要是人以外的则没有特别限定,能够举出小鼠、大鼠、猪、斑马鱼、线虫等。从应用于医药产业的观点出发,优选小鼠。本发明还提供测定丝氨酸-苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性、低分子量GTP结合蛋白活性的任一个的测定方法,该测定方法包括使用本发明的单分子型FRET生物传感器检测FRET的工序。作 为使用本发明的单分子型FRET生物传感器检测FRET的工序,可以举出在荧光显微镜下观察表达单分子型FRET生物传感器的细胞株、进行定时摄影的方法;使用流式细胞仪分析表达单分子型FRET生物传感器的细胞株的方法等。通过这些方法就检测本发明的单分子型FRET生物传感器中的FRET,从而能够测定丝氨酸_苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性、低分子量GTP结合蛋白活性。此外,本发明提供测定丝氨酸-苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性以及低分子量GTP结合蛋白活性的任一个的测定方法,该测定方法包括使用本发明的转化细胞或者转基因非人动物检测FRET的工序。丝氨酸-苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性以及低分子量GTP结合蛋白活性能够通过使用上述的能够测定丝氨酸-苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性、低分子量GTP结合蛋白活性的任一个的具有传感器区域和配体区域的单分子型FRET生物传感器来测定。作为检测FRET的工序,只要能够检测FRET激发能量的转移,就没有特别限定,例如,可以举出使用显微镜的测定方法、使用流式细胞仪的测定方法、使用分光光度计的测定方法、使用荧光ELISA检测仪的方法等。该测定方法中,检测FRET,能够直接测定该细胞或动物中的丝氨酸-苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性、低分子量GTP结合蛋白活性。在这样的情况下,能够另外使用磷酸化特异性抗体,计算磷酸化的比例,测定对应的FRET效率,制作标准曲线;或者测定GTP结合的低分子量GTP结合蛋白和由GTP的无机磷酸游离产生的⑶P结合的低分子量GTP结合蛋白,计算GTP/⑶P比[或者GTP/ (⑶P+DTP)比](均为摩尔比),测定对应的FRET效率,制作标准曲线。使用这样的标准曲线,根据该细胞或者动物的FRET效率,计算磷酸化、GTP/⑶P比。例如,示例如下的具体方法。在荧光显微镜下观察表达本发明的单分子型FRET生物传感器的本发明的转化细胞或者转基因非人动物,直接检测传感器区域的结构变化前后产生的FRET效率的变化。该测定方法基于(非专利文献I)进行。在转基因非人动物的情况下,观察对象优选例如外耳等容易固定的部位。使用的荧光显微镜没有特别限定,优选具有公知的氙光源的倒置荧光显微镜(1X81,奥林巴斯公司生产)上具备旋转式突光激发滤色片和旋转式突光发光滤色片、具备高灵敏度冷却CXD照相机的显微镜。滤色片和照相机图像优选能够通过MolecularDevices公司生产的MetaMorph图像分析软件控制和分析的系统。对上述细胞或者动物照射供体荧光蛋白的激发光,供体荧光蛋白的荧光波长下的图像通过CCD照相机拍摄,然后,拍摄受体荧光蛋白的荧光波长下的图像。测定两图像的荧光强度的比,由此能够计算各测定点的FRET效率。根据本发明,能够提供包含本发明的EV接头的、可以非侵袭性地测定丝氨酸-苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性、低分子量GTP结合蛋白活性的单分子型FRET生物传感器、其基因等。能够进行非侵袭性活性测定是由于使用的激发光为可见光区域的缘故。还提供表达这样的单分子型FRET生物传感器、保持在非侵袭性测定丝氨酸-苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性、低分子量GTP结合蛋白活性中有用的上述表达载体的转化细胞和转基因非人动物、以及使用包含上述EV接头的单分子型FRET生物传感器测定丝氨酸-苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性、低分子量GTP结合蛋白活性的方法。因此,在细胞内或者个体内非侵袭性地获知丝氨酸-苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性、低分子量GTP结合蛋白活性成为可能,不仅能够理解生命现象,还能够在药剂开发(例如,癌、自身免疫疾病、过敏性疾病等的治疗剂或者预防剂)方面带来利益。作为本发明的其他方式,提供丝氨酸-苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性、低分子量GTP结合蛋白活性调节物质的筛选方法。即,该筛选方法为丝氨酸-苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性、低分子量GTP结合蛋白活性的任一个的调节物质的筛选方法,包括:(a)使本发明的转化细胞与被检物质接触 的工序、和(b)通过检测FRET而检测丝氨酸-苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性、低分子量GTP结合蛋白活性的任一个的变化的工序。本发明的转化细胞是表达本发明的单分子型FRET生物传感器、保持包含具有EV接头的单分子型FRET生物传感器基因的表达载体的转化细胞。根据本发明的筛选方法,构建表达包含本发明的EV接头的单分子型FRET生物传感器的细胞,使用生物检测体系,由此能够有效筛选使得丝氨酸-苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性、低分子量GTP结合蛋白活性变化的物质或其盐(即,丝氨酸-苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性、低分子量GTP结合蛋白的活性调节物质)。作为该方法中的被检物质没有特别限定,例如能够举出肽、蛋白质、非肽性物质、合成物质、发酵产物等。实施例以下,根据实施例说明本发明,但是本发明的范围不限于这些实施例。(实施例1)由Eevee-PKA进行的丝氨酸-苏氨酸激酶A激酶(PKA)的酶活性测定(I)编码用于测定PKA的酶活性的包含EV接头的单分子型FRET生物传感器的基因的制作(i)用于插入EV接头基因的平台Eevee-PKA-G72 (3520NES)基因的制作单分子型FRET生物传感器Eevee-PKA-G72 (3520NES)基因使用PCR等公知的方法制造(图3)。S卩,单分子型FRET生物传感器从氨基末端依次具有YFP、接头、配体结构域(本例中是与磷酸化苏氨酸特异性结合的FHAl结构域)、接头、由PKA磷酸化的底物序列、接头、CFP供体荧光蛋白。说明该碱基序列(序列号:I)和预测的氨基酸序列(序列号:2):ntl_714:水母(Aequorea)的 YFP (YPet)nt715_720:接头(Leu-Glu)nt721-1143:酵母的Rad53基因的FHAl结构域ntll44_1149:接头(Gly-Thr)ntll50_1392:甘氨酸接头ntl393-1437:PKA 的底物序列ntl438_1446:接头(Gly-Gly-Arg)ntl447-2163:水母的 CFP (ECFP)nt2164_2169:接头(Ser-Arg)nt2170-2205:核输出信号(NES)nt2206-2208:终止密码子(ii) EV20 接头的合成和 Eevee-PKA-20 基因(3532NES)的制作将正义引物F_20a.a_linker (序列号:3)和反义引物R_20a.a_linker (序列号:4)退火,插入3520NE S的Asp7181和Aor3HI的限制性内切酶的切断部位。该插入的核苷酸所编码的20个氨基酸的接头称为EV20接头(序列号:5)。此外,将YPet取代为Venus。所制作的单分子型FRET生物传感器命名为Eevee-PKA-20(3532NES)。说明该碱基序列(序列号:6)和预测的氨基酸序列(序列号:7):ntl-714:水母(Aequorea)的 YFP (Venus)nt715_720:接头(Leu-Glu)nt721-1143:酵母的Rad53基因的FHAl结构域ntll44_1149:接头(Gly-Thr)ntll50-1209:EV20 接头(序列号:5)ntl210_1215:接头(Ser-Gly)ntl216_1239:PKA 的底物序列ntl239-1248:接头(Gly-Gly-Arg)ntl249-1965:水母的 CFP (ECFP)ntl966_1971:接头(Ser-Arg)ntl972_2007:核输出信号(NES)nt2008_2010:终止密码子(iii) Eevee-PKA-52 (3535NES)的制作用限制性内切酶EcoRI和Asp718I切断Eevee-PKA-20的哺乳细胞表达载体pEevee-PKA-20,将尺寸大的片段调整为载体。将该pEevee-PKA-20片段与用EcoRI和Aor3HI切断得到的包含接头的部分以及将正义引物F_10a.a_linker (序列号:8)和反义引物R_10a.a_linker (序列号:9)进行退火得到的DNA这3者进行连接,制作了pEevee-PKA-52。说明该碱基序列(序列号:10)和预测的氨基酸序列(序列号:11):ntl_714:水母(Aequorea)的 YFP (Venus)nt715_720:接头(Leu-Glu)
nt721-1143:酵母的Rad53基因的FHAl结构域ntll44_1149:接头(Gly-Thr)ntll50-1305:EV52 接头(序列号:12)ntl306_1311:接头(Ser-Gly)ntl312_1335:PKA 的底物序列ntl336_1344:接头(Gly-Gly-Arg)ntl345_2061:水母的 CFP (ECFP)nt2062_2067:接头(Ser-Arg)nt2068_2103:核输出信号(NES)nt2104_2106:终止密码子(iv)pEevee-PKA-84 (3537NES)的制作用限制性内切酶EcoRI和Asp718I切断Eevee-PKA-20的哺乳细胞表达载体pEevee-PKA-20,将尺寸大的片段调整为载体。将该pEevee-PKA-20片段与用EcoRI和Aor3HI切断的含有接头的部分以及将正义引物F_10a.a_linker (序列号:8)和反义引物R_10a.a_linker (序列号:9)进行退火得到的DNA这3者进行连接,制作了 Eevee_PKA_84。说明该碱基序列(序列号:13)和预测的氨基酸序列(序列号:14):
ntl_714:水母(Aequorea)的 YFP (Venus)nt715_720:接头(Leu-Glu)nt721-1143:酵母的Rad53基因的FHAl结构域ntll44_1149:接头(Gly-Thr)ntll50-1401:EV84 接头(序列号:15)ntl402_1407:接头(Ser-Gly)nt 1408-1431:PKA 的底物序列ntl432_1440:接头(Gly-Gly-Arg)ntl441-2157:水母的 CFP (ECFP)nt2158-2163:接头(Ser-Arg)nt2164_2199:核输出信号(NES)nt2200_2202:终止密码子(v)pEevee-PKA-116 (3536NES)的制作用限制性内切酶EcoRI和Asp718I切断Eevee-PKA-52的哺乳细胞表达载体pEevee-PKA-20,将尺寸大的片段调整为载体。将该pEevee-PKA-52片段与用EcoRI和Aorl3HI切断的包含接头的部分以及将正义引物F_10a.a_linker (序列号:8)和反义引物R_10a.a_linker(序列号:9)进行退火得到的DNA这3者进行连接,制作了 Eevee-PKA-116。说明该碱基序列(序列号:16)和预测的氨基酸序列(序列号:17):ntl_714:水母(Aequorea)的 YFP (YPet)nt715_720:接头(Leu-Glu)nt721-1143:酵母的Rad53基因的FHAl结构域ntll44_1149:接头(Gly-Thr)ntll50-1497:EV116 接头(序列号:18)
ntl498_1503:接头(Ser-Gly)ntl504-1527:PKA 的底物序列ntl528-1536:接头(Gly-Gly-Arg)nt 1537-2247:水母的 CFP (ECFP)nt2248-2253:接头(Ser-Arg)nt2254_2289:核输出信号(NES)nt2290-2292:终止密码子(vi)pEevee-PKA-5 (3522NES)的制作单分子型FRET生物传感器pEevee-PKA-5使用PCR等公知的方法制作,说明该碱基序列(序列号:19)和预测的氨基酸序列(序列号:20):ntl-714:水母(Aequorea)的 YFP (Venus)nt715_720:接头(Leu-Glu)nt721-1143:酵母的Rad53基因的FHAl结构域ntl 144-170:接头(Gly-Thr-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly)ntll71_1194:PKA 的底物序列ntll95_1203:接头(Gly-Gly-Arg)ntl204_1920:水母的 CFP (ECFP)ntl921_1926:接头(Ser-Arg)ntl927_1962:核输出信号(NES)ntl963_1965:终止密码子(vii) pEevee-PKA-lSO (3597NES)的制作用限制性内切酶EcoRI和Asp718I切断pEevee-PKA-116,将尺寸大的片段调整为载体。将该pEevee-PKA-116片段与用EcoRI和Aor3HI切断的包含接头的部分以及将正义弓丨物F_10a.a_linker (序列号:8)和反义引物R_10a.a_linker (序列号:9)进行退火得到的DNA这3者进行连接,制作了 Eevee-PKA-180。并将Venus取代为YPet。说明该碱基序列(序列号:21)和预测的氨基酸序列 (序列号:22):ntl-714:水母(Aequorea)的 YFP (YPet)nt715_720:接头(Leu-Glu)nt721-1143:酵母的Rad53基因的FHAl结构域ntll44_1149:接头(Gly-Thr)ntll50-1689:EV180 接头(序列号:23)ntl690_1695:接头(Ser-Gly)ntl696-1719:PKA 的底物序列ntl720-1728:接头(Gly-Gly-Arg)ntl729-2439:水母的 CFP (ECFP)nt2440_2445:接头(Ser-Arg)nt2446_2481:核输出信号(NES)nt2482-2484:终止密码子(vii)pEevee-PKA-244 (3598NES 的制作)
用限制性内切酶EcoRI和Asp718I切断pEevee-PKA-116,将尺寸大的片段调整为载体。将该pEevee-PKA-116片段与用EcoRI和Aor3HI切断的包含接头的部分以及将正义弓丨物F_10a.a_linker (序列号:8)和反义引物R_10a.a_linker (序列号:9)进行退火得到的DNA这3者进行连接,制作了 Eevee-PKA-244。说明该碱基序列(序列号:24)和预测的氨基酸序列(序列号:25):ntl-714:水母(Aequorea)的 YFP (YPet)nt715_720:接头(Leu-Glu)nt721-1143:酵母的Rad53基因的FHAl结构域ntll44_1149:接头(Gly-Thr)ntll50-1881:EV244 接头(序列号:26)ntl882_1887:接头(Ser-Gly)nt 1888-1911:PKA 的底物序列ntl912-1920:接头(Gly-Gly-Arg)ntl921-2631:水母的 CFP (ECFP)nt2632_2637:接头(Ser-Arg)nt2638_2673:核输出信号(NES)nt2674-267 6:终止密码子(2)包含EV接头的单分子型FRET生物传感器(Eevee-PKA)在哺乳类细胞中的表达和由定时荧光显微镜进行的分析在此,将具有各种长度的EV接头的PKA的生物传感器总称为Eevee-PKA,将其哺乳细胞表达载体总称为pEevee-PKA。作为哺乳细胞表达载体使用pCAGGS[Niwa,H.,K.Yamamura, and J.Miyazak1.1991.Efficient selection for high—expressiontransfectants with a novel eukaryotic vector.Genel08:193-200.]。来自宫颈癌的HeLa细胞在含有10%胎牛血清的DMEM培养基(INVITR0GEN公司生产)中培养。使用293fectin (INVITR0GEN公司生产),根据该试剂附加的操作方法将上述(I)中得到的pEevee-PKA转染HeLa细胞。将转染后的HeLa细胞在含有10%胎牛血清的DMEM培养基(INVITR0GEN公司生产)中培养,使Eevee-PKA蛋白表达。转染24小时后,通过定时荧光显微镜观察培养细胞。该显微镜是具备旋转式荧光激发滤色装置和旋转式荧光发光滤色装置(LUDLelectronic公司生产)、还具备高灵敏度冷却C⑶照相机(NIPPON ROPER公司生产CooISNAP-HQ)的、具有氙光源的倒置荧光显微镜(奥林巴斯公司生产,1X81),观察时,该显微镜的控制和观察结果的分析使用由日本Molecular Devices公司生产的MetaMorph图像分析软件进行的系统。荧光激发滤色片、荧光发光滤色片、分色镜从Omega公司购入。 对上述培养细胞照射440nm的激发光,由CXD照相机拍摄在480nm的CFP供体的荧光波长下的图像,接着,照射在530nm的YFP受体的荧光波长下的图像。根据两图像数据求出两者的荧光强度比,作为各测定点的FRET效率的指标。通过添加作为PKA活化剂的ImM的联丁酰基cAMP并与刺激前的FRET效率比较,就能够知道Eevee-PKA的增益。如图4所示,由PKA的活化而变化的增益,通过使用52个氨基酸以上的长度的EV接头而显著增加。
此外,将YFP供体蛋白设为最适于FRET的物质,例如为YPet,效果更显著(图6)。但是,该效果在116个氨基酸时几乎饱和,即使比其更长也没有显著的效果。为了研究该增益增大的原因,测定了基础状态的荧光曲线(图7A、B和C)。可知随着EV接头变长,基础状态的YFP供体蛋白质的荧光减少。即,可知EV接头通过减少基础状态的FRET而得到高的增益。该效果一直持续直至达到244个氨基酸。(3)由免疫印迹法分析Eevee-PKA的磷酸化水平与上述同样在HeLa细胞中表达Eevee-PKA,24小时后,用ImM的联丁酰基cAMP和50nM花萼海绵诱癌素处理之后,用公知的方法将细胞可溶化,通过SDS-PAGE进行分离。其中,在蛋白质分离中使用含有50μΜ PhosTag (PhosTag企业集团)的6%聚丙烯酸酰胺凝胶。转印到PVDF膜(Millipore公司生产)之后,与ant1-GFP抗体(自家制)反应,接着,用IRDye800CW标记抗兔抗体(L1-C0R公司制造)检测Eevee-PKA蛋白质。结合的荧光标记抗体通过Odyssey荧光分析仪(L1-C0R公司生产)定量。如图8A和图8B所示,EV接头显著减少基础状态的磷酸化水平。即,配体结构域通常因与传感器结构域结合而具有阻碍活化状态的传感器区域返回基础状态的效果,但是EV接头使得该效果降低,由此使基础状态的FRET降低,这就导致增益的增大。(实施例2)由Eevee-Akt进行的丝氨酸-苏氨酸激酶Akt的酶活性测定(I)编码用于测定丝氨酸-苏氨酸激酶Akt的酶活性的包含EV接头的单分子型FRET生物传感器的基因的制作利用合成引物等制作了将Eevee-Akt-84 (3547NES)和 Eevee-Akt-116 (3548NES)的PKA底物序列部位取代为适宜Akt的磷酸化的氨基酸序列的基因。将该序列插入上述Eevee-PKA中,并且在氨 基末端插入Akt的PH结构域,表示由此制作得到的基因Eevee-Akt-84和Eevee-Akt-116的碱基序列(序列号:27,29)和预测的氨基酸序列(序列号:28,30)。此外,其结构如图9A和B所示。Eevee-Akt-84 (3547NES)nt 1-453:Akt 蛋白的 AH 结构域nt454_462:接头(Glu-Phe-Gly)nt463_l 176:水母(Aequorea)的 YFP (YPet)ntll77_1182:接头(Leu-Glu)ntl 183-1605:酵母的Rad53基因的FHAl结构域ntl606_1611:接头(Gly-Thr)ntl612_1863:EV84 接头ntl864_l869:接头(Ser-Gly)ntl870-1902:PKA 的底物序列ntl903_1911:接头(Gly-Gly-Arg)ntl912-2622:水母的 CFP (ECFP)nt2623_2628:接头(Ser-Arg)nt2629_2664:核输出信号(NES)nt2665-2667:终止密码子
Eevee-Akt-116 (3548NES)nt 1-453:Akt 蛋白的 AH 结构域nt454_462:接头(Glu-Phe-Gly)nt463_l 176:水母(Aequorea)的 YFP (YPet)ntll77_1182:接头(Leu-Glu)ntl 183-1605:酵母的Rad53基因的FHAl结构域ntl606_1611:接头(Gly-Thr)ntl612-1959:EV116 接头ntl864_l965:接头(Ser-Gly)nt 1870-1998:PKA 的底物序列ntl903-2007:接头(Gly-Gly-Arg)ntl912-2718:水母的 CFP (ECFP)nt2623_2724:接头(Ser-Arg)nt2629_2760:核输出信号(NES)
nt2665-2763:终止密码子(2)包含EV接头的单分子型FRET生物传感器(Eevee-Akt)在哺乳类细胞中的表达和由定时荧光显微镜进行的分析采用实施例1-(2)记载的方法进行分析,但是细胞使用C0S7细胞。如图10所示,116个氨基酸的EV接头能够显著降低基础状态。(实施例3)由Eevee-ERK进行的ERK的酶活性测定(I)编码用于ERK的酶活性测定的包含EV接头的单分子型FRET生物传感器Eevee-ERK (3550NES)的基因的制作(i)利用PCR和合成引物制作了将Eevee-PKA-116的底物序列部位和磷酸化蛋白质识别序列取代为ERK的底物序列的质粒。制作得到的质粒命名为Eevee-ERK,说明该碱基序列(序列号:31)和预测的氨基酸序列(序列号:32):ntl-714:水母(Aequorea)的 YFP (YPet)nt715_720:接头(Leu-Glu)nt721_882:Pinl 基因的 Wff 区域ntl 144-888:接头(Gly-Thr)ntll50-1236:EV116 接头ntl498_1242:接头(Ser-Gly)ntl504-1272:ERK 的底物序列ntl528-1281:接头(Gly-Gly-Arg)ntl537-1992:水母的 CFP (ECFP)nt2248_2004:接头(Gly-Arg-Ser-Arg)nt2254_2040:核输出信号(NES)nt2290-2043:终止密码子(ii)也同样制作了在ERK底物中添加特有的锚定序列的载体,命名为Eevee-ERK-DS (3560NES)。说明该碱基序列(序列号:33)和预测的氨基酸序列(序列号:34):ntl-714:水母(Aequorea)的 YFP (YPet)nt715_720:接头(Leu-Glu)nt721_882:Pinl 基因的 Wff 结构域nt883_888:接头(Gly-Thr)nt889-1236:EV116 接头ntl237_1242:接头(Ser-Gly)nt l243_1272:ERK 的底物序列ntl273_1284:接头(Ala-Lys-Leu-Ser)ntl285_1296:铺定序列(Phe-Gln-Phe-Pro)ntl297-1305:接头(Gly-Gly-Arg)ntl306-2016:水母的 CFP (ECFP)nt2017_2028:接头(Gly-Arg-Ser-Arg)nt2029_2064:核输出信号(NES)nt2065-2067:终止密码子(2)包含EV接头的单分子型FRET生物传感器(Eevee-ERK)在哺乳类细胞中的表达和由定时荧光显微镜进行的分析采用实施例1- (2)记载的方法进行分析。S卩,在HeLa细胞中表达Eevee-ERK,用EGF刺激。如图11A、B、C和D所示,具有EV接头的生物传感器(3560NES)比包含Gly接头的生物传感器(EKAR-1667nes)具有更大的增益。该效果的原因之一是起因于基础状态的FRET降低。(实施例4)由包含EV接头的单分子型FRET生物传感器Picchu-734进行的酪氨酸激酶活性测定(I)用于测定酪氨酸激酶活性用的包含EV接头的单分子型FRET生物传感器Picchu-734 的制作(i)将包含CrkII蛋白的SH2结构域的区域由PCR扩增并插入由XhoI和Asp718I切断Eevee-PKA-116 (3536NES)得到片段中。并取代底物序列部位,制作了 Picchu-734的基因。说明该碱基序列(序列号:35)和预测的氨基酸序列(序列号:36):ntl-714:水母(Aequorea)的 YFP (YPet)nt715_720:接头(Leu-Glu)nt721-1332 =CRKII 基因的 SH2 结构域nt883_1338:接头(Gly-Thr)nt889-1686:EV116 接头ntl237_1692:接头(Ser-Gly)ntl243-1719 =CRKII的酪氨酸磷酸化底物序列ntl273-1728:接头(Ala-Lys-Leu-Ser)ntl306-2439:水母的 CFP (ECFP)
nt2017-2451:接头(Gly-Arg-Ser-Arg)nt2029_2487:核输出信号(NES)nt2065_2490:终止密码子(2)用于测定酪氨酸激酶活性的包含EV接头的单分子型FRET生物传感器Picchu-734在哺乳类细胞中的表达和由定时荧光显微镜进行的分析采用实施例3- (2)记载的方法进行分析。如图12所示,可知包含EV接头的Picchu生物传感器(Picchu-734)与不含该接头的Picchu生物传感器(Picchu_730)[Kurokawa, K., N.Mochizuki, Y.0hba, H.Mizuno, A.Miyawaki, and M.Matsuda.2001.A pairof FRET—based probes for tyrosine phosphorylation of the CrkII adaptor proteinin viv0.J.Biol.Chem.276:31305-31310.]相比具有更大的增益。(实施例5)由Raichu-Racl进行的Racl活性测定(I)用于测定Racl活性的含有EV接头的单分子型FRET生物传感器Raichu-Racl(2246X)的制作(i)使用PCR等,以已知的Raichu-Racl (IOllX)(非专利文献5)为基础制作了测定Racl活性的单分子型FRET生物传感器Raichu-Racl(2241X)。说明该碱基序列(序列号:37)和预测的氨基酸序列(序列号:38):ntl-714:水 母(Aequorea)的 YFP (YPet)nt715_720:接头(Leu-Glu)nt721-969:Pak 蛋白的 CRIB 结构域nt883_996:甘氨酸接头ntl237-1527 =Raclntl273_1536:接头(Arg-Gly-Arg)ntl306_2247:水母的 CFP (Turquoise)ntl273-2253:接头(Ser-Arg)nt2017-231 3:KRas蛋白的C末端结构域nt2065-2316:终止密码子(ii)以Raichu-Racl (2241X)为基础,通过替换接头而制作了测定Racl活性的包含EV接头的单分子型FRET生物传感器Raichu-Racl (2246X)。说明该碱基序列(序列号:39)和预测的氨基酸序列(序列号:40):ntl-714:水母(Aequorea)的 YFP (YPet)nt715_720:接头(Leu-Glu)nt721-969:Pak 蛋白的 CRIB 结构域nt970-1332:EV116 接头ntl333-1860:Raclntl861_1869:接头(Arg-Gly-Arg)ntl870_2580:水母的 CFP (Turquoise)nt2581_2586:接头(Ser-Arg)nt2587-2646:KRas蛋白的C末端结构域
nt2647-2649:终止密码子(2)用于测定Racl活性的包含EV接头的单分子型FRET生物传感器Raichu-Racl在哺乳类细胞中的表达和由定时荧光显微镜进行的分析采用实施例3- (2)记载的方法进行分析。如图13A和图13B所示,具有EV接头的Raichu生物传感器(Raichu_2246X)比具有通常的接头的Raichu生物传感器(Raichu-2241X)在基础状态下的FRET降低,EGF刺激下观察到的上升,即灵敏度大幅上升。(3)稳定表达Raichu-Racl (2246X)的细胞株的建立将Raichu-Racl (2246X)的基因插入pPB质粒中。将该质粒和转座酶表达载体(pCMV-mPBase) [Yusa, K.,R.Rad, J.Takeda, and A.Bradley.2009.Generation oftransgene-free induced pluripotent mouse stem cells by the piggyBac transposon.Nat.Methods6:363-369.]同时转染 C6 细胞,2 天后,添加 10 μ g/ml 浓度的 Blasticidine(杀稻瘟菌素),继续培养2周。之后,在96孔培养皿中进行克隆。其结果,成功建立了稳定表达生物传感器的培养细胞株。使用该细胞株能够长时间监控Racl活性。(图14A、B、C和D)。(实施例6)由Raichu_Cdc42 (2253X)进行的 Cdc42 活性测定(I)用于测定Cdc42活性的包含EV接头的单分子型FRET生物传感器Raichu-Cdc42 (2253X)的制作(i)使用PCR等,以已知的Raichu_Cdc42 (1054X)为基础制作了测定Cdc42活性的单分子型FRET生物传感器Ra ichu-Cdc42 (2253X)。说明该碱基序列(序列号:41)和预测的氨基酸序列(序列号:42):ntl-714:水母(Aequorea)的 YFP (YPet)nt715_720:接头(Leu-Glu)nt721-969:Pak 蛋白的 CRIB 结构域nt970-1332:EV116 接头ntl333-1857:Cdc42ntl858_1866:接头(Arg-Gly-Arg)ntl867-2577:水母的 CFP (Turquoise)nt2578_2583:接头(Ser-Arg)nt2584-2643:KRas蛋白的C末端结构域nt2644-2646:终止密码子(2)用于测定Cdc42活性的包含EV接头的单分子型FRET生物传感器Raichu-Cdc42在哺乳类细胞中的表达和由定时荧光显微镜进行的分析采用实施例3- (2)记载的方法进行分析。如图15A到图15C所示,该生物传感器也观察到基础状态下低的FRET,迄今为止难以检测的EGF刺激依赖性Cdc42的活化能够以高灵敏度检测出来。(实施例8)由Raichu-HRas (3705X)进行的 HRas 活性测定(I)用于测定HRas活性的含有EV接头的单分子型FRET生物传感器Raichu-HRas(3705X)的制作(i)使用 PCR 等,以已知的 Raichu-HRas [Mochizuki, N., S.Yamashita, K.Kurokawa, Y.0hba, T.Nagai, A.Miyawaki, and M.Matsuda.2001.Spacio-temporal imagesof growth factor-1nduced activation of Ras and Rapl.Nature411:1065-1068.]为基础制作了测定HRas活性的单分子型FRET生物传感器Raichu-HRas (3705X)。说明制作的基因Raichu-HRas (3705X)的碱基序列(序列号:43)和预测的氨基酸序列(序列号:44):ntl-714:水母(Aequorea)的 YFP (YPet)nt715_720:接头(Leu-Glu)nt721_1236:HRas 蛋白质ntl237-1602:EV116 接头ntl603-1845:Raf 蛋白的 RBD 结构域ntl846_1854:接头(Gly-Gly-Arg)ntl855-2565:水母的 CFP (Turquoise)nt2566_2571:接头(Ser-Arg)nt2584-2631:KRas蛋白的C末端结构域n t2632-2634:终止密码子(2)用于测定HRas活性的包含EV接头的单分子型FRET生物传感器Raichu-HRas在哺乳类细胞中的表达和由定时荧光显微镜进行的分析通过实施例3- (2)记载的方法进行分析。图16A和B表示定时FRET成像的数据。可知相比于原型的 HRas [Mochizuki, N., S.Yamashita, K.Kurokawa, Y.0hba, T.Nagai, A.Miyawaki, and M.Matsuda.2001.Spacio-temporal images of growth factor-1nducedactivation of Ras and Rapl.Nature411:1065-1068.],能够在更期检测出更强的活性。(实施例10)表达Eevee-ERK (3560NES)和 Eevee-PKA (3536NES)的转基因小鼠的制作(I)编码用于测定ERK和PKA的酶活性的包含EV接头的单分子型FRET生物传感器Eevee-ERK (3560NES)和Eevee-PKA (3536NES)的基因向受精卵的显微注射将包含实施例1记载的Eevee-PKA (3536NES)或者实施例3记载的Eevee-ERK(3560NES)基因的哺乳细胞表达质粒插入具有转座子识别序列的质粒pT2A中。将该质粒和Tol2转座子如已经报道的那样进行显微注射[Sumiyama, K., K.Kawakami, andK.Yagita.2010.A simple and highly efficient transgenesis method in mice withthe Tol2transposon system and cytoplasmic microinjection.Genomics95:306-311.]。(2)表达生物传感器的转基因小鼠的筛选出生的小鼠用420nm的LED照射,使用470nm短波长截止滤色片,用彩色数码照相机拍摄,通过确认绿色荧光能够容易地鉴定出发生了重组的小鼠。此外,通过以实施例1记载的荧光显微镜对胎儿的矢状切面的FRET图像进行拍摄,能够研究ERK或者PKA活性的空间分布(图17)。(实施例11)使用表达Eevee-ERK (3560NES)的细胞株的药剂感受性试验(I)稳定表达编码用于测定ERK的酶活性的包含EV接头的单分子型FRET生物传感器Eevee-ERK (3560NES)的基因的细胞株的建立将实施例3记载的包含Eevee-ERK (3560NES)基因的哺乳细胞表达质粒插入具有转座子识别序列的质粒中。将该质粒与转座子表达载体如已报告的那样进行转基因,以杀稻痕菌素(blasticidin)选择生物传感器表达细胞株[Yusa, K., R.Rad, J.Takeda, andA.Bradley.2009.Generation of transgene-free induced pluripotent mouse stemcells by the piggyBac transposon.Nat.Methods6(5):363-369]。(2)用稳定表达生物传感器的细胞株进行FRET测定在96孔培养皿中接种培养细胞株,加入梯度稀释的抑制剂,之后用25ng/ml的EGF刺激。30分钟后,如实施例3所记载的那样测定ERK活性(图18A 图18H)。对30个以上的细胞测定ERK活性,将平均值制成图表。使用的抑制剂是EGF受体抑制剂(AG1478)、MEK抑制剂(PD15035、PD184351), BRAF抑制剂(PLX4720)、磷脂酰肌醇3-磷酸激酶的抑制剂(LY294002)、RSK 的抑制剂(B1-D1870)、JNK 的抑制剂(JNK inhibitor VIII )。结果,在HeLa细胞中,EGF依赖性的ERK活性被EGE受体(AG1478)和MEK抑制剂(PD153035、PD184352)有效抑制。使用活细胞能够非常容易地测定EGF依赖性的ERK活性被这些抑制剂浓度依赖性地抑制。(实施例12)使用表达Eevee-PKA (3536NES)的转基因小鼠的药剂感受性试验(I)表达Eevee-PKA (3536NES)的转基因小鼠的小肠成像用异氟醚麻醉实施例10制作的表达Eevee-PKA (3536NES)的转基因小鼠,用奥林巴斯公司制造的倒置双光子显微镜IX81/FV1000对小肠进行定时摄影。使用SpectraPhysics公司制造的钛宝石脉冲激光系统Mai Tai DeepSee HP,以840nm激发细胞,通过BA460-500 (奥林巴斯)荧光过滤器取得CFP的荧光,通过BA520-560 (奥林巴斯)荧光滤色片获取YFP的荧光,如实施例3所记载的那样制作了 FRET图像。(2)在活小鼠中的药剂效果的可视化对小鼠分别静脉注射磷酸二酯酶的抑制剂茶碱和环腺苷三磷酸的类似物布拉地新,测定PKA活性。如图19和20所示,分别在肌间神经细胞、肠道平滑肌、血管平滑肌中的PKA的活性变化能够实时可视化。(实施例13)如果增长接头的长度,则有可能容易引起蛋白酶的分解。因此,制作了从接头中减少甘氨酸、增加容易获取α -螺旋的丙氨酸的接头EV3X8和EV6X4,研究增益。(I) (i) Eevee-PKA-3X8 (3676NES)的制作与实施例1 (I) (iii)同样,用限制性内切酶Asp718I和Aorl3HI切断Eevee-PKA-20的哺乳细胞表达载体pEevee-PKA-20,将尺寸大的片段调整为载体。合成在对应于EV3 X 8接头(序列号:45)的DNA的两端添加有限制性内切酶Asp718I和Aorl3HI的酶切位点的DNA。用Asp718I和Aorl3HI切断该DNA,将其作为插入序列使用。将插入序列与载体连接,制作了 pEeVee-PKA-3X8。说明该碱基序列(序列号:47)和预测的氨基酸序列(序列号:48):ntl-714:水母(Aequorea)的 YFP (YPet)nt715_720: 接头(Leu-Glu)
nt721-1143:酵母的Rad53基因的FHAl结构域ntll44_1149:接头(Gly-Thr)ntll50-1551:EV3X8 接头(序列号:45)ntl552_1557:接头(Ser-Gly)ntl558-1581:PKA 的底物序列ntl582-1590:接头(Gly-Gly-Arg)ntl591-2307:水母的 ECFPnt2308_2313:接头(Ser-Arg)nt2314_2349:核输出信号(NES)nt2350-2352:终止密码子
`
(I) (ii) Eevee-PKA-6X4 (3677NES)的制作用限制性内切酶Asp718I和Aorl3HI切断Eevee-PKA-20的哺乳细胞表达载体pEevee-PKA-20,将尺寸大的片段调整为载体。合成在对应于EV6X4接头(序列号:46)的DNA的两端添加有限制性内切酶Asp718I和Aorl3HI的酶切位点的DNA。用Asp718I和Aorl3HI切断该DNA,将其作为插入序列使用。将插入序列与载体连接,制作了pEevee-PKA-6X40说明该碱基序列(序列号:49)和预测的氨基酸序列(序列号:50):ntl-714:水母(Aequorea)的 YFP (YPet)nt715_720:接头(Leu-Glu)nt721-1143:酵母的Rad53基因的FHAl结构域ntll44_1149:接头(Gly-Thr)ntll50-1521:EV6X4 接头(序列号:46)ntl522_1527:接头(Ser-Gly)ntl528-1551:PKA 的底物序列ntl552-1560:接头(Gly-Gly-Arg)ntl561-2277:水母的 ECFPnt2278-2283:接头(Ser-Arg)nt2284_2319:核输出信号(NES)nt2320-2322:终止密码子(2)与实施例1同样研究增益,可知EV3X8和EV6X4具有与116个氨基酸相匹敌的增益(图21)。工业实用性根据本发明,提供能够非侵袭性地测定丝氨酸-苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性、低分子量GTP结合蛋白的活性等的EV接头和包含该EV接头的单分子型FRET生物传感器;编码该EV接头和生物传感器进行的基因;包含该基因的表达载体;表达上述生物传感器、保持对非侵袭性测定丝氨酸-苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性、低分子量GTP结合蛋白的活性有用的上述表达载体的转化细胞和转基因非人动物;使用上述生物传感器的丝氨酸-苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性、低分子量GTP结合蛋白的活性的测定方法;以及丝氨酸-苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性、低分子量GTP结合蛋白的活性调节物质的筛选方法。
权利要求
1.一种接头,其为基于荧光共振能量转移原理的单分子型FRET生物传感器的接头,所述接头的特征在于: 其为包括52个氨基酸残基以上、400个氨基酸残基以下的多肽,总氨基酸残基数的至少45%为甘氨酸和丙氨酸的至少任一个,丙氨酸在总氨基酸残基数中含有至少10%。
2.如权利要求1所述的接头,其特征在于: 其为包括84个氨基酸残基以上的多肽。
3.如权利要求1或2所述的接头,其特征在于: 丝氨酸和苏氨酸的至少任一个在总氨基酸残基数中含有至少10%。
4.如权利要求3所述的接头,其特征在于: 总氨基酸残基数的至少95%由甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸和丙氨酸构成,甘氨酸含有35 65%,丝氨酸和苏氨酸的至少任一个含有10 40%,丙氨酸含有10 40%。
5.如权利要求4所述的接头,其特征在于: 总氨基酸序列的至少95%为由SAGG和GGAS的任一个的氨基酸序列的重复构成,SAGG和GGAS的任一个的氨基酸序列的重复单元含有13个以上、100个以下。
6.如权利要求1或2所述的接头,其特征在于: 精氨酸和谷氨酸的至少任一个在总氨基酸残基数中含有至少10%。
7.如权利要求6所述的接头,其特征在于: 总氨基酸残基数的至少95%由甘氨酸、精氨酸、谷氨酸和丙氨酸构成,甘氨酸含有4 30%,精氨酸含有5 30%,谷氨酸含有5 30%,丙氨酸含有30 60%。
8.一种基因,其特征在于: 编码权利要求1 7中任一项所述的接头。
9.一种表达载体,其特征在于: 包含编码权利要求1 7中任一项所述的接头的基因。
10.一种转化细胞,其特征在于: 保持权利要求9所述的表达载体。
11.一种转基因非人动物,其特征在于: 保持权利要求9所述的表达载体。
12.—种单分子型FRET生物传感器,其为基于荧光共振能量转移原理的单分子型FRET生物传感器,其特征在于: 其为具有传感器区域、配体区域、受体荧光蛋白区域、供体荧光蛋白区域和连接该传感器区域与该配体区域的接头区域的融合蛋白,该接头区域由权利要求1 7中任一项所述的接头构成。
13.如权利要求12所述的单分子型FRET生物传感器,其特征在于:该供体荧光蛋白为YPet。
14.一种基因,其特征在于: 编码权利要求12或13中任一项所述的单分子型FRET生物传感器。
15.—种表达载体,其特征在于: 包含编码权利要求14所述的单分子型FRET生物传感器的基因。
16.一种转化细胞,其特征在于:保持权利要求15所述的表达载体。
17.一种转基因非人动物,其特征在于: 保持权利要求15所述的表达载体。
18.—种测定方法,其特征在于: 包括使用权利要求12所述的单分子型FRET生物传感器检测FRET的工序,测定丝氨酸一苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性和低分子量GTP结合蛋白活性的任一个。
19.一种测定方法,其特征在于: 包括使用权利要求16所述的转化细胞或权利要求17所述的转基因非人动物检测FRET的工序,测定丝氨酸一苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性和低分子量GTP结合蛋白活性的任一个。
20.一种丝氨酸一苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性和低分子量GTP结合蛋白活性的任一个的调节物质的筛选方法,包括: Ca)使权利要求16所述的转化细胞与被检物质接触的工序;和(b)通过检测FRET,检测丝氨酸一苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性和低分子量GTP结合蛋白活性的任一个的变化的工序 。
全文摘要
本发明提供一种基于荧光共振能量转移原理的单分子型FRET生物传感器的接头以及包含该接头的单分子型FRET生物传感器等,其能够非侵袭性地测定丝氨酸-苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性和低分子量GTP结合蛋白活性等。一种接头,其为包括52个氨基酸残基以上、400个氨基酸残基以下的多肽,总氨基酸残基数的至少95%由甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸和丙氨酸构成,甘氨酸为35~65%,丝氨酸和苏氨酸的至少任一个为10~40%,丙氨酸为10~40%;包含该接头的单分子型FRET生物传感器;保持包含编码该生物传感器的基因的表达载体的转化细胞和转基因非人动物。
文档编号C12N1/19GK103228669SQ20118005700
公开日2013年7月31日 申请日期2011年9月26日 优先权日2010年9月27日
发明者松田道行, 小松直贵, 青木一洋, 上冈裕治, 幸长弘子, 稻冈芳惠, 樱井敦朗, 清川悦子, 隅山健太 申请人:国立大学法人京都大学

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