用于检测和定量微生物的方法
专利名称：用于检测和定量微生物的方法
技术领域：
本发明涉及用于检测和定量样品中微生物的方法。
背景技术：
某些样品中活微生物的检测特别重要，特别是在医疗领域和食品加工业。检测的标准方法仍然是微生物培养，通常需要数日才能获得足够数量的微生物以鉴定待测试的微生物。在使用源自患者的样品进行检测的情况下，这种获得结果前的延迟常常意味着必须对患者施用广谱的预防性抗菌素。因此，在致病菌的情况下，这种不靶向具体细菌而是靶向大量其他菌种的给药方案增加了抗菌素抗性菌株的数量的可能性。细菌学诊断通常分两步进行:-第一步:培养细菌，通常在固体培养基上，从而使其具有足够的数量并分离疑似的细菌；在此步骤中，在固体培养基上研究菌落的形状可初步鉴定细菌；此外，此步骤通常与细菌的非特异性检测结合，通过液体培养基中的培养，基于培养基的酸化或(例如通过光散射检测)培养基光学性质的变化，给出关于样品中可能存在的细菌的判断；-第二步:通过在选择培养基中鉴定所述细菌，随后根据涉及从最广特征至最精细特征的分叉式检索表研究生化和免疫特征，从而确定具体的菌种。在医疗应用中，在治疗处理前，通常需要额外的步骤；其包括进行抗菌谱测试，从而检测所述细菌对药典中的各种抗菌素的抗性水平。
在目测鉴定前，此方法需要至少培养24小时，对于某些菌种甚至需要数日的培养。在任何情况下，分析所需的时间长度都是关键的，且富集和分析步骤都很漫长(一至数日)。为了缩短这种延迟，已开发了用于检测细菌生长的更快的体外方法。然而，所有这些方法均基于多步系统，包括:首先的培养步骤以提高样品中存在的细菌数量，和随后的至少一个鉴定和表征步骤。用于监测细菌生长的自动化仪器现已上市，例如来自Becton-Dickinso的Bactec9000和来自BioM6rieux的BacT/Alter。这些自动化仪器的工作原理为基于细菌增殖期间的CO2排放的分析。这些自动化仪器在血培养中的应用可提高特别是在血培养期间的测试敏感性，由此缩短反应时间(Lamy et al.(2005)Biotribunel6:37-39 ；Croizet etal.(2007) Spectra Biologie160:45-51)。然而，这些自动化仪器不能特异性地鉴定细菌的种属。最近以来，AccelrS公司投产了微流浓缩器，将细菌非特异性地吸附到化学官能化的聚合物表面。在这种情况下，在鉴定微生物前，检测微生物的生长。实际上，首先在支持物上增殖细菌，随后借助于免疫荧光法和后续的显微镜分析鉴定细菌。应注意，由于连续进行培养和检测的两个步骤，此方法仍相对费力。Zourob等人开发了相当类似的方法，包括用于富集枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)孢子的电脉冲系统，从而使用相联的光学系统对其进行检测(Zourob etal.(2005)Lab Chip5:1350-1365)。此方法不包括任何培养，且直接检测存在于样品中的孢子。然而，其需要使用相当复杂的微系统。现已提出使用电化学检测法的技术，其中最有效的是基于阻抗滴定原理(Yang etal.(2004)Anal.Chem.76:1107-13 ；Huang et al.(2010)Biosensors&Bioelectronics25:1204-11)。这些方法通常包括使用作为探针的氧化还原媒介物(redox mediator)。在这种情况下，必须在分析介质中补充所述媒介物，通常为亚铁氰化物(hexacyanoferrate),使用浓度为约I至10mM。由于尚不彻底理解相对高浓度(mM)的此类化合物对微生物的影响，且相对高浓度的此类化合物可能是生物介质的干扰源，这仍是其主要的缺陷。无示踪物的光学技术能够基本摒弃外源化合物的添加，因此更为直接。Taylor等人已经将表面等离子体共振(SPR)技术应用于细菌裂解物的检测(Taylor et al.(2006)Biosensors and Bioelectronics22:752-758)。在这种情况下，在检测前进行细菌裂解，随后通过与特异性二级抗体结合放大信号，达到了 IO4至IO6细菌/ml之间的检测限。因此，此方法需要高污染样品(highly contaminated samples)或预先培养以达到这些阈值。此夕卜，由于使用细菌裂解物进行检测，此方法不适合用于鉴定活细菌。最后，已报道了可使用微悬臂梁(micro-cantilevers)检测黑曲霉(Aspergillus nige)和白色念珠菌(Candida albicans)抱子萌发的其他研究(Nugaevaet al.(2007)Microsc.Microanal.13:13-17 ；Nugaeva et al.(2005)Biosensors andBioelectronics21:849-856)。此类检测可在湿试验箱空气中进行，但缺点在于其不能在液体介质中进行。此外，其仅可应用于检测预先捕获的真菌孢子的萌发。
发明内容
本发明基于本发 明人的以下发现:将微生物的培养与检测通过配体特异性结合所述微生物产生的不同信号结合，即同时进行培养和不同信号的检测，可降低微生物检测的阈值，且与现有技术相比，显著缩短了分析时间。因此，本发明涉及用于检测存在于样品中的至少一种微生物的方法，其包括:-在存在至少一种微生物特异性配体和至少一个对所述微生物的亲和性低于所述配体的传感分子(sensor)的液体培养基中培养所述样品，化合物与配体的结合产生第一可测量信号，且化合物与传感分子的结合产生第二可测量信号；-在至少一个培养时间测量所述第一信号和第二信号的数值；其中，所述第一信号和所述第二信号在相同培养时间下的数值不同时，推断所述样品包含所述微生物。在本发明方法的具体实施方式
中，当所述样品包含微生物时，还通过作为培养时间的函数的第一信号数值的变化测定培养开始时存在于样品中的微生物的量。在本发明方法的另一个实施方式中，当所述样品包含微生物时，在培养物中引入抗菌剂后，通过作为培养时间函数的第一信号数值的变化测定所述微生物对至少一种抗菌剂的敏感性。本发明还涉及适合用于实施上述方法的装置，其包括至少一个适合用于在液体培养基中培养微生物的箱室，所述箱室包含至少一种所述微生物特异性配体和对所述微生物无亲和性的传感分子，化合物与所述配体的结合产生第一可测量信号，且化合物与所述传感分子的结合产生第二可测量信号；所述配体和所述传感分子固定到支持物上，从而接触待研究的液体培养基。发明详沭如本文理解，微生物优选为单细胞或多细胞的原核或真核生物。然而，所述微生物是多细胞时，构成所述多细胞微生物的细胞优选在分化方面是同类的，即所述微生物不包含具有不同特化作用的细胞。优选地，本发明的微生物是活微生物，即其能够增殖。此外，本发明的微生物优选为单细胞微生物。在此方面，根据其发育或繁殖阶段，本发明的微生物可以是多细胞生物的单核形式(single-cell form)。此外，本发明的微生物还可以由多细胞动物(metazoan)的分离细胞或分离组织的碎片组成。因此，本发明的微生物还可以是哺乳动物细胞，特别是人细胞，例如肿瘤细胞或血细胞，例如淋巴细胞或外周血单核细胞。因此，本发明的微生物优选为选自细菌、真菌、酵母、藻、原生动物和多细胞动物的分离细胞组成的组的微生物，特别是单细胞微生物。特别优选地，本发明的微生物是细菌，特别是链球菌属(Streptococcus)或埃希氏菌属(Escherichia)的细菌。本发明的样品可以是任何类型，只要其能包含微生物。优选地，本发明的样品选自生物样品、食物样品、水样品(特别是废水、淡水或海水样品)、土壤样品、淤泥样品或空气样品组成的组。本发明的生物样品可源自活体生物或曾经活过的生物，特别是动物或植物。源自动物，特别是哺乳动物的样品，可以是液体或固体，且具体包括血液、血浆、血清、脑脊髓液、尿液、粪、滑液、精液、阴道分泌物、口腔分泌物、呼吸道样本，特别是源自肺、鼻或喉部的样本，脓、腹水，或皮肤或结膜衆膜(conjunctival serosites)的样本。优选地,本发明的食物样品尤其为源自可生食、烹饪或调制的食物，食物配料、调料或预先调制的膳食。还优选，本发明的样品在进行本发明的培养之前未经纯化或浓缩。对本领域技术人员显而易见的是，进行本发明所述在液体培养基中的培养目的在于使可能存在于进行培养的样品中的待检测微生物获得扩增。用于在液体培养基中培养微生物的技术和条件是本领域技术人员熟知的，本领域的普通技术人员熟知具体如何确定对每种微生物的适合的营养培养基，最佳生长温度，例如对于很多哺乳动物致病菌为37° C，以及繁殖微生物所需的气氛。此外，可优先使用弱选择性培养基，即允许不同种类的大量微生物生长的那些培养基。还可根据其生长速率及其世代时间，即微生物分裂成两个子代微生物所需的时间，调整每种微生物的培养时间。优选地，本发明的培养时间大于或等于产生至少两个连续世代的子代微生物所需的时间，由此能够使待检测微生物的数量至少四倍化，即4倍增殖。本领域技术人员容易地理解，由于待检测的微生物可能不存在于本发明的样品中，因此，实际上没有必要观察到培养物中微生物数量的四倍化，但所述培养时间至少对应于确实包含所述微生物的培养物在与本发明方法相同的条件下进行培养时中微生物数量四倍化所需的时间。因此，还优选本发明的培养时间至少等于2倍的待检测微生物世代时间，或待检测微生物的加倍时间。本领域技术人员可以理解，本发明所述的世代时间或加倍时间是可以在本发明培养条件下获得的。通常，所述培养时间可小于72小时、48小时或24小时。此外,可在已能够获得所需信息，即检测结果、测定量，或对抗菌剂敏感性时，即停止培养。有利地，本发明的方法是敏感的， 且可检测包含低浓度微生物的样品中所述微生物的存在，例如等于I个微生物/ml或小于10、IO2或IO3个微生物/ml，其通常无法直接检测，特别是在使用生物传感分子的情况下。因此，本发明的方法优选适用于疑似包含浓度低于或等于106、105、104、103、102或10个微生物/ml，或等于I个微生物/ml的待检测微生物
的样品。本发明的配体可以是使其可以特异性地结合微生物或多种相关微生物的任何类型。具体地，其可以是:-微生物的天然受体，例如多糖或复合脂类，即包含至少一个非脂质基团，特别是蛋白质、碳水化合物、含磷或含氮型基团的脂质；蛋白或糖蛋白，例如结合多种链球菌属细菌的纤维蛋白溶酶原(plasminogen);任选为灭活的全曬菌体或病毒,曬菌体或病毒片段，或噬菌体或病毒蛋白；-免疫球蛋白，例如抗体及其片段，其包含特异性靶向抗原的可变部分，或能够结合包含蛋白A的葡萄球菌属(Staphylococcus)细菌的恒定部分,或特别包含可变部分的T细胞受体(TCR)片段；-合成化合物，特别是:.包含特别是I至100碳原子的有机小分子，.肽类的化合物，例如scFv (单链可变片段)， 多核苷酸类的化合物 ，例如适体，或.多糖类的化合物；-经研磨的材料、活体生物或组织的裂解物或提取物；-具有微生物吸附表面的合成材料；或-包含两种或多种上述配体的混合物。因此，本发明的配体优选选自抗体、抗体片段、scFv、适体、蛋白或糖蛋白、任选灭活的全噬菌体、噬菌体片段和噬菌体蛋白组成的组。本发明的传感分子发挥阴性对照的作用。因此，优选具有类似于所述配体的性质。此外，本发明的传感分子对待检测微生物的亲和性低于所述配体，即根据本发明，优选所述传感分子对所述微生物的亲和性比所述配体对所述微生物的亲和性低至少10倍，特别是至少100倍、1000倍、10，000倍、100，000倍或I, 000，000倍。特别地，可通过Scatchard法在相同的实验条件下测定所述配体和所述传感分子对所述微生物的亲和性。更优选地，本发明的传感分子对所述微生物没有亲和性。优选地，根据本发明，当所述第一信号和所述第二信号之间的数值差异大于或等于所测量背景噪音信号的两倍时，认为所述第一信号和所述第二信号在同一培养时间的数值是不同的。所测量的背景噪音信号对应于在没有微生物时测量的第一信号。如本文理解，本发明的可测量信号是通过化合物，特别是微生物与所述配体或所述传感分子连接或结合而直接 产生的。具体地，优选除了本发明所述的配体和传感分子外，本发明的可测量信号不来自媒介物，例如氧化还原探针，或不来自存在于培养基中或添加到培养基中的标记物。因此，优选地，本发明的可测量信号不是来自于已结合所述配体或传感分子的微生物与所述微生物特异性标记物的附加连接。所述信号可通过适合同时测量至少两个信号的任何技术测量，特别是直接测量，尤其是通过显微镜、表面等离子体共振(surface Plasmon resonance)、共振反射镜(resonant mirrors)、阻抗测量(impedance measurement)、微机电系统(micro-electromechanical system, MEMS)，例如石英微量天平(quartz microbalance)或柔性梁(flexible beams)，光(特别是紫外光或可见光)吸收测量、或荧光测量，特别是在所述微生物本身具有荧光的情况下，这些是本领技术人员所熟知的。在此方面，对本领域技术人员显而易见的是，上述标记物不代表本发明的微生物；因此，本发明信号可来自与所述配体或传感分子结合时的微生物。根据本发明，特别优选表面等离子体共振。优选地，所述配体和传感分子连接到支持物上。更优选地，所述支持物能够转导通过化合物与所述配体和/或所述传感分子结合而产生的信号，特别地，可通过上述技术测量的信号。此类支持物是本领域技术人员熟知的，且具体包含适合用于通过表面等离子体共振测量的，由连续或不连续金属表面覆盖的透明基底。因此，在本发明的优选实施方式中，所述配体和所述传感分子连接到其本身是生物芯片组成部分的、相同或不同的支持物。此外，本发明的所述配体和传感分子，或所述支持物，或所述装置可包含在容器中，所述的容器用于收集可包含微生物的液体，或用于培养微生物，例如血培养瓶或如Stomacher袋。还优选对所述信号进行实时测量，特别是不必提取培养物样品以测量信号。优选记录测量的信号，例如以显示作为时间函数的测量信号强度的曲线的形式。还可记录与本发明所述配体和传感分子连接的支持物的图片，以测定所述配体和所述传感分子被所述微生物占据的程度或水平。在本发明的具体实施方式
中，本发明的方法可检测多种不同微生物的存在，测定存在于所述样品中的多种微生物的量，或测定多种微生物对一种或多种抗菌剂的敏感性，随后可使用分别对所述多种微生物具有特异性的多种配体。此类方法被称作多元方法。如本文理解，术语“抗菌剂”是指抑制微生物生长或降低其增殖的任何杀微生物化合物，特别是指任何抗菌、杀菌或抑菌性化合物，例如红霉素(erythromycin)。此外,术语“抗菌剂”还涉及用于破坏微生物或降低其增殖的任何抗癌(特别是化疗)化合物，特别是在本发明所述微生物为癌细胞的情况下。
优选地，在根据本发明测定微生物对至少一种抗菌剂的敏感性时，作为培养时间函数的第一信号的数值的变化部分或完全源自于微生物分裂所需的时间，即世代时间(generation time),因此,源自于与所述第一配体结合的微生物的数量随时间的变化。本领域技术人员完全可以理解，如果微生物的世代时间显著增加，则微生物数量的变化将小于没有抗菌剂时产生的变化。因此，优选地，所述第一信号数值的变化不是由于所述抗菌剂破坏了与本发明所述第一配体连接的微生物而产生的。
图 1、2 和 3图1至图3来自3个独立实验，且体现了使用(i)抗肺炎链球菌的抗-CbpE抗体(大星，一式三份纤维蛋白溶酶原(Plg)(大圈，一式三份非肺炎链球菌特异性IgG(大三角，一式三份)和(iv)仅吡咯(大方块)官能化的生物芯片，在存在初始浓度为IO2个细菌/ml (图1)、103个细菌/ml (图2)和IO4个细菌/ml (图3)的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae) R6株培养物的500 μ I样品体积中(即，分别为50、500和5000个细菌)，通过表面等离子体共振成像测定的,作为培养时间(X轴，以分钟计的时间)函数的反射率(dR，y_轴，以％计)的变化。此外，还显示了使用相同生物芯片在无接种培养基中获得的曲线，作为对照，标记为(C)。图 4图4显示了使用抗肺炎链球菌的抗-CbpE抗体(阳性曲线)和仅使用吡咯(阴性曲线)官能化的生物芯片，在存在肺炎链球菌的培养基中，通过表面等离子成像测量的作为培养时间(X轴，以分钟计的时间)函数的反射率变化(Λ Rspe, y_轴，以％计)，以及使用抗CbpE抗体官能化点的反射率的模型曲线(计算曲线)。图5图5显示了使用抗肺炎链球菌的抗-CbpE抗体、纤维蛋白溶酶原(Plg)、非肺炎链球菌特异性IgG和仅吡咯官能化的生物芯片，在存在初始浓度为IO4个细菌/ml的肺炎链球菌R6株培养物的两个平行试管中测量的反射率(dR，y-轴，以％计)的变化，其中在t=250分钟时，分别向所述两个试管添加(i)在0.08%终浓度的乙醇中稀释的红霉素至40mg/ml终浓度(+ATB)，(ii)乙醇(EtOH)至0.08%的终浓度。
实施例实施例1:样品中微生物的检测牛物芯片的构律如Grosjean等人所述，在游离吡咯的存在下，使用蛋白-吡咯偶联物，通过在包金棱柱(用作工作电极)上电聚合蛋白质的方法制备蛋白生物芯片(Grosjean etal.(2005) Analytical Biochemistry347:193-200)。简要而言，使用包含充当对电极(counterelectrode)的钼棒的吸液管枪头进行游离卩比咯和卩比咯-NHS偶联蛋白的电聚合；如Gu6don等人所述，通过工作电极和对电极之间100ms (2.4V)的快速电脉冲的方式进行聚合(Gu6don et al.(2000) Anal.Chem.72:6003-6009)。将每种蛋白实体一式三份地放置在棱柱的包金表面上，从而评估此方法的可重复性。所使用的配体如下:-识别肺炎链球菌的配体(i)根据 Attali 等人制备的抗 CbpE 抗体(Attali et al.(2008) Infect.Tmmun0.76:466-76)(ii)人纤维蛋白溶酶原(Sigma Aldrich)。-用于阴性对照的传感分子:(iii)纯化的兔IgG(Sigma Aldrich),或抗-肉毒杆菌毒素单克隆IgG ；(iv)批咯(Tokyo kasei, TCI)。所有这些产物都与吡咯偶联，随后，根据适合微生物培养容器形状的放置方案，以斑点的形式放置到包金棱柱上。每个容器配有2个独立的隔间，其可包含两个不同的样品，其中之一为对照。
_9] 细菌培养物的制备R6肺炎双球菌菌株培养在Todd Hewitt培养基(TH,得自Mast Diagnostic)。在细菌的最佳生长期 期间停止培养，即在600nm测量的光密度为0.4时，其对应于约IO8个细菌/ml的细菌浓度。在TH培养基中进行连续稀释，以获得IO2至IO4个细菌/ml的浓度。
通过表面等离子体共振成像(SPRi)的测暈使用来自Genoptics (Orsay, France)的SPR1-Lab系统进行SPR成像的测量。使用包含1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS缓冲剂预阻断生物芯片15分钟。将可能包含细菌的0.5毫升样品放入“样品”隔间，并将不含肺炎双球菌的培养基放入“对照”隔间。将此系统放入加热至37° C的SPRi设备的箱室中。将此容器密封以防止培养基在进行无振荡培养期间蒸发。平行地进行生长对照。制备多个包含ImllO3个细菌/ml的培养物的试管，并在37° C恒温箱中孵育。每小时测量0D_，从而监测作为时间函数的细菌生长变化，并与SPRi生长曲线进行比较。细菌培养16小时。表1:通讨600nm光密度处测量监测牛长
权利要求
1.用于检测存在于样品中的至少一种微生物的方法，其包括: -在存在至少一种微生物特异性配体和至少一种对所述微生物的亲和性低于所述配体的传感分子的液体培养基中培养所述样品，化合物与配体的结合产生第一可测量信号，且化合物与传感分子的结合产生第二可测量信号； -在至少一个培养时间测量所述第一信号和第二信号的数值； 其中，所述第一信号和所述第二信号在相同培养时间下的数值不同时，推断所述样品包含所述微生物。
2.如权利要求1所述的检测方法，其中，所述培养时间是所述微生物世代时间的至少两倍。
3.如权利要求1或2所述的检测方法，其中，所述微生物选自细菌、真菌、藻、原生动物和多细胞动物的分离细胞。
4.如权利要求1-3 中任一项所述的方法，其中，所述配体选自抗体、抗体片段、scFv、适体(DNA、RNA)，蛋白或糖蛋白，任选灭活的全噬菌体或病毒，噬菌体或病毒片段和噬菌体或病毒蛋白。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述样品选自生物样品、食物样品、水样品、土壤样品和空气样品。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述配体和/或所述传感分子连接到支持物，所述支持物用于转导化合物与所述配体和/或所述传感分子结合而产生的信号。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法,其中，对所述第一信号和第二信号进行实时检测。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述信号通过显微镜、表面等离子体共振、共振反射镜、阻抗测量、石英微量天平、柔性梁，光吸收测量、或荧光微生物的荧光测量来测定。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，通过表面等离子体共振实时测量所述信号。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中，除了本发明所述的配体和传感分子夕卜，本发明的可测量信号不来自媒介物，或不来自存在于培养基中或添加到培养基中的标记物。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，当所述样品包含微生物时，还通过作为培养时间函数的第一信号数值的变化测定培养开始时存在于样品中的微生物的量。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中，当所述样品包含微生物时，在培养物中引入抗菌剂后，通过作为培养时间函数的第一信号数值的变化测定所述微生物对至少一种抗菌剂的敏感性。
13.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中，测定样品中多种不同微生物的存在或量。
14.适合用于实施权利要求1-13中任一项所述方法的装置，其包括至少一个适合用于在液体培养基中培养微生物的箱室，所述箱室包含至少一种所述微生物特异性配体和至少一种对所述微生物的亲和性低于所述配体的传感分子，化合物与所述配体的结合产生第一可测量信号，且化合物与所述传感分子的结合产生第二可测量信号；所述配体和所述传感分子连接到支持物上，从而接触所述液体培养基。
15.如权利要求14所述的装置 ，其包含在用于收集能够包含微生物的液体和/或用于培养微生物的容器中。
全文摘要
本发明涉及用于检测存在于样品中的至少一种微生物的方法，其包括在存在至少一种微生物特异性配体和至少一个对所述微生物的亲和性低于所述配体的传感分子的液体培养基中培养所述样品，化合物与配体的结合产生第一可测量信号，且化合物与传感分子的结合产生第二可测量信号；在至少一个培养时间测量所述第一信号和第二信号的数值；其中，所述第一信号和所述第二信号在相同培养时间下的数值不同时，推断所述样品包含所述微生物。
文档编号C12Q1/06GK103237900SQ201180058187
公开日2013年8月7日 申请日期2011年11月30日 优先权日2010年12月1日
发明者约安尼·鲁皮奥斯, 罗伯托·卡朗丘克, 蒂埃里·韦尔内, 蒂埃里·利瓦什, 西赫姆·布盖利亚, 克莱雷·迪尔莫尔 申请人:原子能与替代能源署
技术领域：
本发明涉及用于检测和定量样品中微生物的方法。
背景技术：
某些样品中活微生物的检测特别重要，特别是在医疗领域和食品加工业。检测的标准方法仍然是微生物培养，通常需要数日才能获得足够数量的微生物以鉴定待测试的微生物。在使用源自患者的样品进行检测的情况下，这种获得结果前的延迟常常意味着必须对患者施用广谱的预防性抗菌素。因此，在致病菌的情况下，这种不靶向具体细菌而是靶向大量其他菌种的给药方案增加了抗菌素抗性菌株的数量的可能性。细菌学诊断通常分两步进行:-第一步:培养细菌，通常在固体培养基上，从而使其具有足够的数量并分离疑似的细菌；在此步骤中，在固体培养基上研究菌落的形状可初步鉴定细菌；此外，此步骤通常与细菌的非特异性检测结合，通过液体培养基中的培养，基于培养基的酸化或(例如通过光散射检测)培养基光学性质的变化，给出关于样品中可能存在的细菌的判断；-第二步:通过在选择培养基中鉴定所述细菌，随后根据涉及从最广特征至最精细特征的分叉式检索表研究生化和免疫特征，从而确定具体的菌种。在医疗应用中，在治疗处理前，通常需要额外的步骤；其包括进行抗菌谱测试，从而检测所述细菌对药典中的各种抗菌素的抗性水平。
在目测鉴定前，此方法需要至少培养24小时，对于某些菌种甚至需要数日的培养。在任何情况下，分析所需的时间长度都是关键的，且富集和分析步骤都很漫长(一至数日)。为了缩短这种延迟，已开发了用于检测细菌生长的更快的体外方法。然而，所有这些方法均基于多步系统，包括:首先的培养步骤以提高样品中存在的细菌数量，和随后的至少一个鉴定和表征步骤。用于监测细菌生长的自动化仪器现已上市，例如来自Becton-Dickinso的Bactec9000和来自BioM6rieux的BacT/Alter。这些自动化仪器的工作原理为基于细菌增殖期间的CO2排放的分析。这些自动化仪器在血培养中的应用可提高特别是在血培养期间的测试敏感性，由此缩短反应时间(Lamy et al.(2005)Biotribunel6:37-39 ；Croizet etal.(2007) Spectra Biologie160:45-51)。然而，这些自动化仪器不能特异性地鉴定细菌的种属。最近以来，AccelrS公司投产了微流浓缩器，将细菌非特异性地吸附到化学官能化的聚合物表面。在这种情况下，在鉴定微生物前，检测微生物的生长。实际上，首先在支持物上增殖细菌，随后借助于免疫荧光法和后续的显微镜分析鉴定细菌。应注意，由于连续进行培养和检测的两个步骤，此方法仍相对费力。Zourob等人开发了相当类似的方法，包括用于富集枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)孢子的电脉冲系统，从而使用相联的光学系统对其进行检测(Zourob etal.(2005)Lab Chip5:1350-1365)。此方法不包括任何培养，且直接检测存在于样品中的孢子。然而，其需要使用相当复杂的微系统。现已提出使用电化学检测法的技术，其中最有效的是基于阻抗滴定原理(Yang etal.(2004)Anal.Chem.76:1107-13 ；Huang et al.(2010)Biosensors&Bioelectronics25:1204-11)。这些方法通常包括使用作为探针的氧化还原媒介物(redox mediator)。在这种情况下，必须在分析介质中补充所述媒介物，通常为亚铁氰化物(hexacyanoferrate),使用浓度为约I至10mM。由于尚不彻底理解相对高浓度(mM)的此类化合物对微生物的影响，且相对高浓度的此类化合物可能是生物介质的干扰源，这仍是其主要的缺陷。无示踪物的光学技术能够基本摒弃外源化合物的添加，因此更为直接。Taylor等人已经将表面等离子体共振(SPR)技术应用于细菌裂解物的检测(Taylor et al.(2006)Biosensors and Bioelectronics22:752-758)。在这种情况下，在检测前进行细菌裂解，随后通过与特异性二级抗体结合放大信号，达到了 IO4至IO6细菌/ml之间的检测限。因此，此方法需要高污染样品(highly contaminated samples)或预先培养以达到这些阈值。此夕卜，由于使用细菌裂解物进行检测，此方法不适合用于鉴定活细菌。最后，已报道了可使用微悬臂梁(micro-cantilevers)检测黑曲霉(Aspergillus nige)和白色念珠菌(Candida albicans)抱子萌发的其他研究(Nugaevaet al.(2007)Microsc.Microanal.13:13-17 ；Nugaeva et al.(2005)Biosensors andBioelectronics21:849-856)。此类检测可在湿试验箱空气中进行，但缺点在于其不能在液体介质中进行。此外，其仅可应用于检测预先捕获的真菌孢子的萌发。
发明内容
本发明基于本发 明人的以下发现:将微生物的培养与检测通过配体特异性结合所述微生物产生的不同信号结合，即同时进行培养和不同信号的检测，可降低微生物检测的阈值，且与现有技术相比，显著缩短了分析时间。因此，本发明涉及用于检测存在于样品中的至少一种微生物的方法，其包括:-在存在至少一种微生物特异性配体和至少一个对所述微生物的亲和性低于所述配体的传感分子(sensor)的液体培养基中培养所述样品，化合物与配体的结合产生第一可测量信号，且化合物与传感分子的结合产生第二可测量信号；-在至少一个培养时间测量所述第一信号和第二信号的数值；其中，所述第一信号和所述第二信号在相同培养时间下的数值不同时，推断所述样品包含所述微生物。在本发明方法的具体实施方式
中，当所述样品包含微生物时，还通过作为培养时间的函数的第一信号数值的变化测定培养开始时存在于样品中的微生物的量。在本发明方法的另一个实施方式中，当所述样品包含微生物时，在培养物中引入抗菌剂后，通过作为培养时间函数的第一信号数值的变化测定所述微生物对至少一种抗菌剂的敏感性。本发明还涉及适合用于实施上述方法的装置，其包括至少一个适合用于在液体培养基中培养微生物的箱室，所述箱室包含至少一种所述微生物特异性配体和对所述微生物无亲和性的传感分子，化合物与所述配体的结合产生第一可测量信号，且化合物与所述传感分子的结合产生第二可测量信号；所述配体和所述传感分子固定到支持物上，从而接触待研究的液体培养基。发明详沭如本文理解，微生物优选为单细胞或多细胞的原核或真核生物。然而，所述微生物是多细胞时，构成所述多细胞微生物的细胞优选在分化方面是同类的，即所述微生物不包含具有不同特化作用的细胞。优选地，本发明的微生物是活微生物，即其能够增殖。此外，本发明的微生物优选为单细胞微生物。在此方面，根据其发育或繁殖阶段，本发明的微生物可以是多细胞生物的单核形式(single-cell form)。此外，本发明的微生物还可以由多细胞动物(metazoan)的分离细胞或分离组织的碎片组成。因此，本发明的微生物还可以是哺乳动物细胞，特别是人细胞，例如肿瘤细胞或血细胞，例如淋巴细胞或外周血单核细胞。因此，本发明的微生物优选为选自细菌、真菌、酵母、藻、原生动物和多细胞动物的分离细胞组成的组的微生物，特别是单细胞微生物。特别优选地，本发明的微生物是细菌，特别是链球菌属(Streptococcus)或埃希氏菌属(Escherichia)的细菌。本发明的样品可以是任何类型，只要其能包含微生物。优选地，本发明的样品选自生物样品、食物样品、水样品(特别是废水、淡水或海水样品)、土壤样品、淤泥样品或空气样品组成的组。本发明的生物样品可源自活体生物或曾经活过的生物，特别是动物或植物。源自动物，特别是哺乳动物的样品，可以是液体或固体，且具体包括血液、血浆、血清、脑脊髓液、尿液、粪、滑液、精液、阴道分泌物、口腔分泌物、呼吸道样本，特别是源自肺、鼻或喉部的样本，脓、腹水，或皮肤或结膜衆膜(conjunctival serosites)的样本。优选地,本发明的食物样品尤其为源自可生食、烹饪或调制的食物，食物配料、调料或预先调制的膳食。还优选，本发明的样品在进行本发明的培养之前未经纯化或浓缩。对本领域技术人员显而易见的是，进行本发明所述在液体培养基中的培养目的在于使可能存在于进行培养的样品中的待检测微生物获得扩增。用于在液体培养基中培养微生物的技术和条件是本领域技术人员熟知的，本领域的普通技术人员熟知具体如何确定对每种微生物的适合的营养培养基，最佳生长温度，例如对于很多哺乳动物致病菌为37° C，以及繁殖微生物所需的气氛。此外，可优先使用弱选择性培养基，即允许不同种类的大量微生物生长的那些培养基。还可根据其生长速率及其世代时间，即微生物分裂成两个子代微生物所需的时间，调整每种微生物的培养时间。优选地，本发明的培养时间大于或等于产生至少两个连续世代的子代微生物所需的时间，由此能够使待检测微生物的数量至少四倍化，即4倍增殖。本领域技术人员容易地理解，由于待检测的微生物可能不存在于本发明的样品中，因此，实际上没有必要观察到培养物中微生物数量的四倍化，但所述培养时间至少对应于确实包含所述微生物的培养物在与本发明方法相同的条件下进行培养时中微生物数量四倍化所需的时间。因此，还优选本发明的培养时间至少等于2倍的待检测微生物世代时间，或待检测微生物的加倍时间。本领域技术人员可以理解，本发明所述的世代时间或加倍时间是可以在本发明培养条件下获得的。通常，所述培养时间可小于72小时、48小时或24小时。此外,可在已能够获得所需信息，即检测结果、测定量，或对抗菌剂敏感性时，即停止培养。有利地，本发明的方法是敏感的， 且可检测包含低浓度微生物的样品中所述微生物的存在，例如等于I个微生物/ml或小于10、IO2或IO3个微生物/ml，其通常无法直接检测，特别是在使用生物传感分子的情况下。因此，本发明的方法优选适用于疑似包含浓度低于或等于106、105、104、103、102或10个微生物/ml，或等于I个微生物/ml的待检测微生物
的样品。本发明的配体可以是使其可以特异性地结合微生物或多种相关微生物的任何类型。具体地，其可以是:-微生物的天然受体，例如多糖或复合脂类，即包含至少一个非脂质基团，特别是蛋白质、碳水化合物、含磷或含氮型基团的脂质；蛋白或糖蛋白，例如结合多种链球菌属细菌的纤维蛋白溶酶原(plasminogen);任选为灭活的全曬菌体或病毒,曬菌体或病毒片段，或噬菌体或病毒蛋白；-免疫球蛋白，例如抗体及其片段，其包含特异性靶向抗原的可变部分，或能够结合包含蛋白A的葡萄球菌属(Staphylococcus)细菌的恒定部分,或特别包含可变部分的T细胞受体(TCR)片段；-合成化合物，特别是:.包含特别是I至100碳原子的有机小分子，.肽类的化合物，例如scFv (单链可变片段)， 多核苷酸类的化合物 ，例如适体，或.多糖类的化合物；-经研磨的材料、活体生物或组织的裂解物或提取物；-具有微生物吸附表面的合成材料；或-包含两种或多种上述配体的混合物。因此，本发明的配体优选选自抗体、抗体片段、scFv、适体、蛋白或糖蛋白、任选灭活的全噬菌体、噬菌体片段和噬菌体蛋白组成的组。本发明的传感分子发挥阴性对照的作用。因此，优选具有类似于所述配体的性质。此外，本发明的传感分子对待检测微生物的亲和性低于所述配体，即根据本发明，优选所述传感分子对所述微生物的亲和性比所述配体对所述微生物的亲和性低至少10倍，特别是至少100倍、1000倍、10，000倍、100，000倍或I, 000，000倍。特别地，可通过Scatchard法在相同的实验条件下测定所述配体和所述传感分子对所述微生物的亲和性。更优选地，本发明的传感分子对所述微生物没有亲和性。优选地，根据本发明，当所述第一信号和所述第二信号之间的数值差异大于或等于所测量背景噪音信号的两倍时，认为所述第一信号和所述第二信号在同一培养时间的数值是不同的。所测量的背景噪音信号对应于在没有微生物时测量的第一信号。如本文理解，本发明的可测量信号是通过化合物，特别是微生物与所述配体或所述传感分子连接或结合而直接 产生的。具体地，优选除了本发明所述的配体和传感分子外，本发明的可测量信号不来自媒介物，例如氧化还原探针，或不来自存在于培养基中或添加到培养基中的标记物。因此，优选地，本发明的可测量信号不是来自于已结合所述配体或传感分子的微生物与所述微生物特异性标记物的附加连接。所述信号可通过适合同时测量至少两个信号的任何技术测量，特别是直接测量，尤其是通过显微镜、表面等离子体共振(surface Plasmon resonance)、共振反射镜(resonant mirrors)、阻抗测量(impedance measurement)、微机电系统(micro-electromechanical system, MEMS)，例如石英微量天平(quartz microbalance)或柔性梁(flexible beams)，光(特别是紫外光或可见光)吸收测量、或荧光测量，特别是在所述微生物本身具有荧光的情况下，这些是本领技术人员所熟知的。在此方面，对本领域技术人员显而易见的是，上述标记物不代表本发明的微生物；因此，本发明信号可来自与所述配体或传感分子结合时的微生物。根据本发明，特别优选表面等离子体共振。优选地，所述配体和传感分子连接到支持物上。更优选地，所述支持物能够转导通过化合物与所述配体和/或所述传感分子结合而产生的信号，特别地，可通过上述技术测量的信号。此类支持物是本领域技术人员熟知的，且具体包含适合用于通过表面等离子体共振测量的，由连续或不连续金属表面覆盖的透明基底。因此，在本发明的优选实施方式中，所述配体和所述传感分子连接到其本身是生物芯片组成部分的、相同或不同的支持物。此外，本发明的所述配体和传感分子，或所述支持物，或所述装置可包含在容器中，所述的容器用于收集可包含微生物的液体，或用于培养微生物，例如血培养瓶或如Stomacher袋。还优选对所述信号进行实时测量，特别是不必提取培养物样品以测量信号。优选记录测量的信号，例如以显示作为时间函数的测量信号强度的曲线的形式。还可记录与本发明所述配体和传感分子连接的支持物的图片，以测定所述配体和所述传感分子被所述微生物占据的程度或水平。在本发明的具体实施方式
中，本发明的方法可检测多种不同微生物的存在，测定存在于所述样品中的多种微生物的量，或测定多种微生物对一种或多种抗菌剂的敏感性，随后可使用分别对所述多种微生物具有特异性的多种配体。此类方法被称作多元方法。如本文理解，术语“抗菌剂”是指抑制微生物生长或降低其增殖的任何杀微生物化合物，特别是指任何抗菌、杀菌或抑菌性化合物，例如红霉素(erythromycin)。此外,术语“抗菌剂”还涉及用于破坏微生物或降低其增殖的任何抗癌(特别是化疗)化合物，特别是在本发明所述微生物为癌细胞的情况下。
优选地，在根据本发明测定微生物对至少一种抗菌剂的敏感性时，作为培养时间函数的第一信号的数值的变化部分或完全源自于微生物分裂所需的时间，即世代时间(generation time),因此,源自于与所述第一配体结合的微生物的数量随时间的变化。本领域技术人员完全可以理解，如果微生物的世代时间显著增加，则微生物数量的变化将小于没有抗菌剂时产生的变化。因此，优选地，所述第一信号数值的变化不是由于所述抗菌剂破坏了与本发明所述第一配体连接的微生物而产生的。
图 1、2 和 3图1至图3来自3个独立实验，且体现了使用(i)抗肺炎链球菌的抗-CbpE抗体(大星，一式三份纤维蛋白溶酶原(Plg)(大圈，一式三份非肺炎链球菌特异性IgG(大三角，一式三份)和(iv)仅吡咯(大方块)官能化的生物芯片，在存在初始浓度为IO2个细菌/ml (图1)、103个细菌/ml (图2)和IO4个细菌/ml (图3)的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae) R6株培养物的500 μ I样品体积中(即，分别为50、500和5000个细菌)，通过表面等离子体共振成像测定的,作为培养时间(X轴，以分钟计的时间)函数的反射率(dR，y_轴，以％计)的变化。此外，还显示了使用相同生物芯片在无接种培养基中获得的曲线，作为对照，标记为(C)。图 4图4显示了使用抗肺炎链球菌的抗-CbpE抗体(阳性曲线)和仅使用吡咯(阴性曲线)官能化的生物芯片，在存在肺炎链球菌的培养基中，通过表面等离子成像测量的作为培养时间(X轴，以分钟计的时间)函数的反射率变化(Λ Rspe, y_轴，以％计)，以及使用抗CbpE抗体官能化点的反射率的模型曲线(计算曲线)。图5图5显示了使用抗肺炎链球菌的抗-CbpE抗体、纤维蛋白溶酶原(Plg)、非肺炎链球菌特异性IgG和仅吡咯官能化的生物芯片，在存在初始浓度为IO4个细菌/ml的肺炎链球菌R6株培养物的两个平行试管中测量的反射率(dR，y-轴，以％计)的变化，其中在t=250分钟时，分别向所述两个试管添加(i)在0.08%终浓度的乙醇中稀释的红霉素至40mg/ml终浓度(+ATB)，(ii)乙醇(EtOH)至0.08%的终浓度。
实施例实施例1:样品中微生物的检测牛物芯片的构律如Grosjean等人所述，在游离吡咯的存在下，使用蛋白-吡咯偶联物，通过在包金棱柱(用作工作电极)上电聚合蛋白质的方法制备蛋白生物芯片(Grosjean etal.(2005) Analytical Biochemistry347:193-200)。简要而言，使用包含充当对电极(counterelectrode)的钼棒的吸液管枪头进行游离卩比咯和卩比咯-NHS偶联蛋白的电聚合；如Gu6don等人所述，通过工作电极和对电极之间100ms (2.4V)的快速电脉冲的方式进行聚合(Gu6don et al.(2000) Anal.Chem.72:6003-6009)。将每种蛋白实体一式三份地放置在棱柱的包金表面上，从而评估此方法的可重复性。所使用的配体如下:-识别肺炎链球菌的配体(i)根据 Attali 等人制备的抗 CbpE 抗体(Attali et al.(2008) Infect.Tmmun0.76:466-76)(ii)人纤维蛋白溶酶原(Sigma Aldrich)。-用于阴性对照的传感分子:(iii)纯化的兔IgG(Sigma Aldrich),或抗-肉毒杆菌毒素单克隆IgG ；(iv)批咯(Tokyo kasei, TCI)。所有这些产物都与吡咯偶联，随后，根据适合微生物培养容器形状的放置方案，以斑点的形式放置到包金棱柱上。每个容器配有2个独立的隔间，其可包含两个不同的样品，其中之一为对照。
_9] 细菌培养物的制备R6肺炎双球菌菌株培养在Todd Hewitt培养基(TH,得自Mast Diagnostic)。在细菌的最佳生长期 期间停止培养，即在600nm测量的光密度为0.4时，其对应于约IO8个细菌/ml的细菌浓度。在TH培养基中进行连续稀释，以获得IO2至IO4个细菌/ml的浓度。
通过表面等离子体共振成像(SPRi)的测暈使用来自Genoptics (Orsay, France)的SPR1-Lab系统进行SPR成像的测量。使用包含1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS缓冲剂预阻断生物芯片15分钟。将可能包含细菌的0.5毫升样品放入“样品”隔间，并将不含肺炎双球菌的培养基放入“对照”隔间。将此系统放入加热至37° C的SPRi设备的箱室中。将此容器密封以防止培养基在进行无振荡培养期间蒸发。平行地进行生长对照。制备多个包含ImllO3个细菌/ml的培养物的试管，并在37° C恒温箱中孵育。每小时测量0D_，从而监测作为时间函数的细菌生长变化，并与SPRi生长曲线进行比较。细菌培养16小时。表1:通讨600nm光密度处测量监测牛长
权利要求
1.用于检测存在于样品中的至少一种微生物的方法，其包括: -在存在至少一种微生物特异性配体和至少一种对所述微生物的亲和性低于所述配体的传感分子的液体培养基中培养所述样品，化合物与配体的结合产生第一可测量信号，且化合物与传感分子的结合产生第二可测量信号； -在至少一个培养时间测量所述第一信号和第二信号的数值； 其中，所述第一信号和所述第二信号在相同培养时间下的数值不同时，推断所述样品包含所述微生物。
2.如权利要求1所述的检测方法，其中，所述培养时间是所述微生物世代时间的至少两倍。
3.如权利要求1或2所述的检测方法，其中，所述微生物选自细菌、真菌、藻、原生动物和多细胞动物的分离细胞。
4.如权利要求1-3 中任一项所述的方法，其中，所述配体选自抗体、抗体片段、scFv、适体(DNA、RNA)，蛋白或糖蛋白，任选灭活的全噬菌体或病毒，噬菌体或病毒片段和噬菌体或病毒蛋白。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述样品选自生物样品、食物样品、水样品、土壤样品和空气样品。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述配体和/或所述传感分子连接到支持物，所述支持物用于转导化合物与所述配体和/或所述传感分子结合而产生的信号。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法,其中，对所述第一信号和第二信号进行实时检测。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述信号通过显微镜、表面等离子体共振、共振反射镜、阻抗测量、石英微量天平、柔性梁，光吸收测量、或荧光微生物的荧光测量来测定。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，通过表面等离子体共振实时测量所述信号。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中，除了本发明所述的配体和传感分子夕卜，本发明的可测量信号不来自媒介物，或不来自存在于培养基中或添加到培养基中的标记物。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，当所述样品包含微生物时，还通过作为培养时间函数的第一信号数值的变化测定培养开始时存在于样品中的微生物的量。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中，当所述样品包含微生物时，在培养物中引入抗菌剂后，通过作为培养时间函数的第一信号数值的变化测定所述微生物对至少一种抗菌剂的敏感性。
13.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中，测定样品中多种不同微生物的存在或量。
14.适合用于实施权利要求1-13中任一项所述方法的装置，其包括至少一个适合用于在液体培养基中培养微生物的箱室，所述箱室包含至少一种所述微生物特异性配体和至少一种对所述微生物的亲和性低于所述配体的传感分子，化合物与所述配体的结合产生第一可测量信号，且化合物与所述传感分子的结合产生第二可测量信号；所述配体和所述传感分子连接到支持物上，从而接触所述液体培养基。
15.如权利要求14所述的装置 ，其包含在用于收集能够包含微生物的液体和/或用于培养微生物的容器中。
全文摘要
本发明涉及用于检测存在于样品中的至少一种微生物的方法，其包括在存在至少一种微生物特异性配体和至少一个对所述微生物的亲和性低于所述配体的传感分子的液体培养基中培养所述样品，化合物与配体的结合产生第一可测量信号，且化合物与传感分子的结合产生第二可测量信号；在至少一个培养时间测量所述第一信号和第二信号的数值；其中，所述第一信号和所述第二信号在相同培养时间下的数值不同时，推断所述样品包含所述微生物。
文档编号C12Q1/06GK103237900SQ201180058187
公开日2013年8月7日 申请日期2011年11月30日 优先权日2010年12月1日
发明者约安尼·鲁皮奥斯, 罗伯托·卡朗丘克, 蒂埃里·韦尔内, 蒂埃里·利瓦什, 西赫姆·布盖利亚, 克莱雷·迪尔莫尔 申请人:原子能与替代能源署
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