从植物细胞培养物产生和提取原花青素的制作方法
专利名称：从植物细胞培养物产生和提取原花青素的制作方法
从植物细胞培养物产生和提取原花青素相关申请的交叉引用本申请要求于2010年10月4日提交的美国临时专利申请N0.61/389，629的权益和优先权，将该专利以引用的方式全文并入本文。
背景技术：
多酚广泛分布于植物、水果和蔬菜中，并因其在人和动物健康中的生理功能(包括抗氧化活性、抗诱变活性和癌症预防活性)受到了相当多的重视(Salvia等人，J.Agric.Food Chem.(《农业和食品化学杂志》)39:1549-1552,1991 ;Bomser 等人，CancerLett.(《癌症快讯》)，135:151-157,1999 ；Zhao 等人，Carcmogenesis (《致癌作用》)，20:1737-1745，1999)。流行病学研究已暗示多酚中的黄酮可能会降低心脏疾病的风险(Hertog等人，Lancet(《柳叶刀》):342:1007-1011,1993) 0另外，已显示膳食黄烷_3_醇和/或原花色式(proanthocyanidin)在实验动物中降低了动脉粥样硬化症和冠心病的发病率(Tijburg 等人，Atherosclorosis (《动脉粥样硬化》)，135:37-47,1997 ；Yamakoshi 等人，Atherosclerosis (《动脉粥样硬化》),142:139-149,1999)。负责这些效果的机制之一涉及它们对于低密度脂蛋白(LDL)氧化的抑制(Steinberg, Circulation (《循环》)，85:2337-2344，1992)。已知可可植物(可可树(Theobroma cacao L.),梧桐科(Sterculiaceae))的种子富含多酌.(Porter等人,Phytochemistry (《植物化学》)，30:1657-1663,1991)。从发酵和烘焙可可豆制备的可可浆液(可可产品和巧克力产品的主要成分)的某些抗氧化组分已鉴定为黄烧-3-醇和原花青素 (procyanidin)低聚物(Sanbongi等人,J.Agric.Food Chem.(《农业和食品化学杂志》)，46:454-457,1998 ;Adamson等人,J.Agric.Food Chem.(《农业和食品化学杂志》)，47 =4184-4188,1999)。可可属(Theobroma)和其他属如Herrania属也是已知的可可原花青素来源。已描述了可可属的二十种不同物种，但通常仅12种被接受。其中，九种原产于亚马逊流域，因而遗传分布的中心看起来是在该地区的西半部(Giacometti, 1994,载于:“NeglectedCrops:1492 from a different perspective (J.E.Hernando Berme jo 和 J.Leon 编辑)Plant Production and Protection Series N0.26, FA0, Rome, Italy (联合国粮农署植物生产和保护系列第26号，意大利罗马)，第205-209页)。可可属通常在新热带区，并且分布西半球北纬18°至南纬15°之间的热带雨林中。具有最多物种的区域是在哥斯达黎加和哥伦比亚东北部之间。公认了五个组(section)和20个种。大花可可树(Theobroma grandif1rum)属于由11个种构成的组Glossopetalum ;可可是可可组的唯一物种。已将可可属的四个物种描述为可食用果肉的生产者:大花可可树、Theobromacanumanense Pires&Froes、Theobroma subincanum Martius (巴西的 Cupui,哥伦 t:匕亚的 Cacau de monte)以及 Theobroma tricolorHumb.&Βοηρ1.,其为一种分布在西亚马逊流域至墨西哥南部的小树。巧克力也由这些物种的种子制成(Giacometti, 1994,载于:“Neglected Crops:1492from a different perspective (J.E.Hernando Bermejo 和J.Leon 编辑)Plant Production and Protection Series N0.26, FAO, Rome, Italy (联合国粮农署植物生产和保护系列第26号，意大利罗马)，第205-209页)。已显示，可可属和Herrania属的数个物种的豆产生类似的原花青素并且可从这些豆提取这些化合物(Romanczyk 等人，W097/36497)。可可豆中的多酚储藏在子叶的色素细胞中。根据那些色素细胞(也称为多酚储藏细胞)中的花青素的量，它们是白色到深紫色的。在这些细胞中可区分三组多酚:儿茶素或黄烷-3-醇(约37%)、花青素(约4%)和原花色甙(约58%)。主要的儿茶素是(-)-表儿茶素，其构成高达总多酚含量的35%。原花青素(通常称为原花色甙)主要是黄烷_3，4- 二醇，其4 — 8或4 — 6键合成缩合二聚体、三聚体或低聚物，以表儿茶素作为主要的延伸亚单兀(Romanczyk 等人，W097/36497)。在新鲜可可豆的不含脂肪的干物质中可溶性多酚的总量为15%至20% (相当于含有54%脂肪和6%水分的风干可可豆中的约6% )，而在发酵豆中为约5%。因而，使用可可豆作为多酚来源的一个主要缺点是在豆的加工过程中损失了大部分多酚。其他步骤如烘焙和脱脂也导致损失。因而，可可粉中含有少于10%的存在于新鲜豆中的总多酚。使用可可豆的另一个问题是可可树的有限生长范围。它仅生长于赤道北纬和南纬约20°区域中的温暖潮湿气候中。这使得难以在储存和运输至可进行加工和提取多酚的区域的过程中保持豆的多酚含量。植物细胞培养物是克服这些问题的有吸引力的供替代的选择。最近植物细胞培养物已用于分离黄酮。就原花青素而言，若干团体已能够从培养物中分离特定的化合物。例如，已从玫瑰属(Rosa)培养物分离出4 — 8连接的(-)-表儿茶素-(+)-儿茶素和没食子酸(Muhitch 和 Fletcher, Plant Physiol.(《植物生理学》)，75:592-595,1984)。已发现日本柳杉(Cryptomeria japonica)的悬浮培养物和愈伤组织可产生多至干重26%的原花青素(Teramoto 和 Ishikura, Bot.Mag.Tokyo (《东京植物学杂志》)98:171-179,1985 ；Ishikura 和 Teramoto, Agric.Biol.Chem.(《农业与生物化学》)47:421-423,1983),而花旗松(Pseudotsuga mensiesii) 悬浮培养物产生多至其干重40%的原花青素(Stafford和Cheng,Phytochemistry (《植物化学》)19:131-135,1980)。还有报道显示了在葡萄(Vitisvinifera)的细胞悬浮培养物中产生原花青素(Decendit和Merillon, Plant Cell Rep.(《植物细胞报道》)15 =762-765,1996 ；ffaffo-Teguo等人，Phytochem.(《植物化学》)42:1591-1593，1996)。可可树的组织培养研究已集中于体细胞胚胎发生，在数个实验室中已发展了该技术用于植物的无性繁殖。Esan在1977年首先报道了可可树体细胞胚胎发生(Pioc.5thInt.Cacao Res.Conf.1975.1badan: Cacao Res.1nst.Nigeria, 1977:116-125,1977),其描述了使用未成熟合子胚组织外植体的方法。后来其他人也报道了类似方法(Pence等人，J.Am.Soc.Hort.Sc1.(《美国园艺学协会杂志》)104:145_148，1979 ;Villalobos 和Aguilar, Abstr.VII Int.Congr.Plant Tissue and Cell Cult., Amsterdam, Int.Assoc,for Plant Tissue Culture,第140页，1990)。后来的研究集中于从包括叶(Litz, InDimick, P.S.(编辑)Cacao biotechnology symposium.(《可可生物技术专题论文集》)，宾夕法尼亚州大学园的宾夕法尼亚州立大学出版社(The Pennsylvania State UniversityPress, University Park, PA),第 111-120 页，1986)、珠心(Chatelet 等人，C.R.Acad.Sc1.，Paris 315:55-62,1992 ；Figueira 和 Janick，Acta Hort.336:231-238,1993 ；Sondhal 等人，Acta Hort.336 =245-248,1993)在内的体组织以及包括花瓣和退化雄蕊在内的花外植体(Lopez-Baez 等人，C.R.Acad.Sc1., Paris 316:579-584,1993 ；Alemanno 等人，PlantCell Tiss.0rgan Cult.(《植物细胞组合和器官培养》)46:187_194，1996 ;Alemanno 和Michaux-Ferriere, In Vitro Cell Dev.Biol.Plant (《体外细胞与发育生物学-植物》)33:163-172，1997)开发组织培养方法。这些早期方法，尽管是成功的，但并不适用于所有基因型，并且再生植物的频率低。还发展了能够繁殖广泛基因型的更有效方法(Li等人，In Vitro Cell Dev.Biol.Plant (体外细胞与发育生物学-植物)34:293_299，1998 ;Maximova等人，In Vitro Cell Dev.Biol.Plant (《体外细胞与发育生物学-植物》)38:252-259,2002)。然而，当使用组织培养方法来产生体细胞胚时，所有已描述的方法均未教导培养悬浮细胞的方法。已公布的关于发展可可树的细胞培养的工作数量有限。该工作的绝大多数是在二十世纪七十年代和八十年代(Hall和Collin, Annals of Bot.(《植物学年鉴》)39:555,1975 Jalal 和 Collin, Phytochem.(《植物化学》)16:1377-1380，1977 Jalal 和 Collin,New Phytol.(《新 植物学家》)83 =343-349,1979 ；Tsai等人，J.Food Sc1.(《食品科学杂志》)47:768-773,1982 ;Wen等人，J.Am.0il Chemist，s Soc.(《美国石油化学家协会杂志》)16:1720-1724，1984)。其中，仅少数研究了可可树细胞培养物中的黄酮。例如，Jalal和Collin(1979)报道愈伤组织和细胞悬浮液中的黄酮组成类似并且与初始的完整子叶的黄酮组成相比变化性少得多。两种组织培养物均含有(-)_表儿茶素、无色花青素、咖啡酸和香豆酸。在组织培养物中未能检测到甲基化嘌呤、可可碱和咖啡因。然而，Gurney等人(J.Expt.Bot.(《实验生物学杂志》)43:769-775，1992)报道，可可树的愈伤组织和悬浮培养物产生咖啡因、可可碱和茶碱，浓度约为体内存在的浓度的10%。尚未有现有技术报道低聚原花青素的形成，近年来已显示低聚原花青素具有最大的生物效力。Jalal和Col I in (New Phytol.(《新植物学家》)83:343_349，1979)报道在可可树的细胞培养物中检测到无色花青素。然而，基于用于检测该化合物的方法，不可能表征无色花青素的性质或大小。另外，对于可可属或Herrania属的其他物种还未描述组织培养方法。植物细胞培养是克服这些问题的有吸引力的替代方法。因而，拥有用于获得多酚以及特别是原花青素的改善的植物细胞培养方案以及提取方案将会是有利的。
发明内容
本发明涉及分离的可可细胞系、从这类分离的细胞系制备的提取物和用于开发适于在液体培养物中培养的可可细胞系的方法。该公开还涉及用于选择可在细胞培养物中产生高水平的原花青素的细胞系的方法以及用于从这类细胞培养物提取原花青素来制备食品成分、食品添加剂、治疗组合物或化妆品组合物的方法。此外，选择用于产生高水平的原花青素的这类分离的细胞系也可被选择为基本上没有咖啡因和可可碱。咖啡因和可可碱通常在可可制备物中相当丰富，其为可可中主要造成可可苦味的化合物。这类化合物也主要造成可可产品对狗和其他动物的毒性。本发明还涉及用于培养可可细胞的细胞悬浮培养物的新的培养条件和/或培养基(例如液体培养基)以及用于增强这类悬浮细胞产生原花青素的液体培养基组合物。在一个实施例中，本发明包括选择为实质上不含咖啡因和可可碱的分离的可可细胞系。也就是说，由分离的可可细胞系产生的产物实质上不含咖啡因和可可碱。因此，源于分离的可可细胞系的制备物(例如裂解物、提取物等)在天然实质上不含咖啡因和可可碱。在一个实施例中，分离的可可细胞系可适于在悬浮细胞培养物中培养。分离的可可细胞系可衍生自基本上可可植物的任何部分。例如，分离的可可细胞系可衍生自花组织或非花营养组织中的至少一者。花组织的实例包括但不限于花瓣、花萼、退化雄蕊以及它们的组合。非花营养组织的实例包括但不限于节、节间、幼叶、成熟叶、茎、根以及它们的组合。在 一个实施例中，分离的可可细胞系产生大于100mg/L细胞压积(“PCV”)、大于200mg/L PCV的原花青素、大于300mg/L PCV、大于400mg/L PCV或大于500mg/L PCV的原花青素。在一个实施例中，分离的可可细胞系每升细胞培养物产生大于lOOmg、大于200mg或至少250mg的原花青素。在一个实施例中，描述了从可可细胞培养物制备可可低聚原花青素的方法。在一个实施例中，制备可可低聚原花青素的方法可包括:(I)以足以导致以第一速率产生可可低聚原花青素的时间和条件培养细胞，以及(2)将单糖以足以诱导所述细胞以高于第一速率的第二速率产生可可低聚原花青素的量引入所述细胞。在一个方面，该单糖可以是葡萄糖、蔗糖、果糖等。单糖可在指数生长状态的最后阶段期间或之后引入。任选地，单糖可以培养基重量或体积的约0.5%至约20%的量引入。可添加单糖用于稳定细胞系维持、诱导过度产生或防止细胞聚集。在另一个实施例中，制备可可低聚原花青素的方法可包括:(I)以足以导致以第一速率产生可可低聚原花青素的时间和条件培养细胞，以及(2)在无激素培养基中以及在足以诱导所述细胞以高于第一速率的第二速率产生可可低聚原花青素的条件下培养所述细胞。在一个实施例中，该方法可包括将单糖以足以诱导所述细胞以高于第二速率的第三速率产生可可低聚原花青素的量引入无激素培养基。根据本文所述方法的一个实施例，该方法可还包括从所述细胞提取可可低聚原花青素。在一个实施例中，细胞的提取物基本上没有黄嘌呤生物碱。黄嘌呤生物碱的实例包括但不限于咖啡因、可可碱和茶碱。因此，在另一个实施例中，制备可可低聚原花青素的方法可包括:(1)以足以导致产生可可低聚原花青素的时间和条件培养细胞，以及(2)用提取溶液从所述细胞提取可可低聚原花青素。在一个实施例中，提取溶液可以是乙醇基的。在一个方面，乙醇基提取溶液可以是含水的。在另一个方面，乙醇基提取溶液可没有除乙醇外的任何有机溶剂。在一个实施例中，提取溶液可以是酸性提取溶液。该酸性提取溶液的PH为约3至约6。该酸性提取溶液可包括乙酸、柠檬酸或抗坏血酸。在一个实施例中，该方法可用包含抗氧化剂的酸性提取溶液进行。在某些情况下，该酸性提取溶液中的酸也是抗氧化剂。在某些情况下，在提取溶液中使用单独的酸和抗氧化剂。本文所述的方法可还包括在引入所述单糖后I天至21天(例如约I天至约10天)从所述细胞提取可可低聚原花青素。任选地，该单糖可以培养基重量或体积的约0.5%至约20 %的量引入。在一个方面，可在无激素培养基中培养所述培养物。在一个实施例中，该方法可没有脱脂步骤。也就是说，可在不必采用脱脂步骤的情况下从所培养的细胞制备提取物(原花青素、多酚等)。在一个实施例中，该方法可包括如下步骤中的一者或多者:收获细胞；在适于提取多酚富集级分的溶剂中均质化细胞生物质；使用溶剂-溶剂提取和/或色谱分离原花青素富集级分；或者干燥或浓缩该原花青素素级分。在一个实施例中，该方法可包括如下步骤中的一者或多者:在固体生长培养基中培养可可属物种(Theotooma sp.)愈伤组织细胞；从可可树愈伤组织培养物选择快速生长的细胞系；以及通过将该快速生长的细胞系接种进液体培养基中引发可可属物种细胞悬浮
培养；在一个实施例中，该方法可包括在溶解气体(包括氧气)的存在下在发酵罐或生物反应器容器中培养该可可细胞培养物，从而所述细胞在该液体培养基中经受升高水平的溶解氧。可在生长阶段和诱导阶段(elicitation stage)期间(例如，在引入单糖后或在将细胞引入无激素培养基后)经由分布器(sparger)向发酵罐或生物反应器提供氧气(单独的或作为空气与纯气态氧的共混物)以有利于生长和产量提高。递送至细胞的溶解氧的浓度可取决于细胞的初级或次级代谢需要。在一个实施例中，在生长阶段期间培养可可细胞的步骤是在溶解氧浓度为空气饱和度的I %至400% (例如，约1%至约200% )时进行。在另一个实施例中，在诱导阶段期间培养可可细胞的步骤是在溶解氧浓度为空气饱和度的I %至400% (例如，约I %至约200% )时进行。根据下面的说明，上述的以及其他的目标、特征和优势将变得更显而易见，下面的说明参考附图进行。
`图1包括快速生长的细胞系的照片。图2A-2E包括一系列图，示出了可可树细胞培养物中的原花青素生产率和收率以及碳水化物消耗。图2A和图2B展示了非花组织和花组织的悬浮培养物的原花青素生产率(图2B)和生产收率(图2A)。图2C示出了对原花青素生产率改善的细胞选择效果。图2D示出了对原花青素生产收率改善的细胞选择效果。图2E示出了培养基XXVI中的可可树细胞培养物的碳水化物分析(表I)。图3包括示出了多种接种密度的培养物中生物量密度的典型时间进程的图。图4包括示出了衍生自营养组织的细胞由于细胞选择过程而随时间推移原花青
素产量改善的图。图5A包括示出了原花青素产量响应以葡萄糖温育而增加的图。图5B包括示出了使用多种浓度的葡萄糖时原花青素产量增加的图。图6包括示出了细胞系MX1440-3496中由于补加葡萄糖,原花青素产量在2个诱导事件中增强的图。图7A包括示出了在移除激素连续2周后每升培养物的原花青素产量增加的图。图7B包括示出了两种处理的累加效果的图:移除激素I周，然后用6%葡萄糖诱导细胞I周进行第二次处理，其中该诱导是在从培养基移除激素后7天。
图8A-8C —起示出了用于测量原花青素的丁醇-HCl水解测定法。原花青素的酸水解导致其分解为两种单体形式，(-)_表儿茶素和颜色为粉红色的花青素。每份样品中粉红颜色的强度代表不同细胞系中获得的原花青素的量(图8A)。该方法被优化为96孔板形式用于快速筛选样品(图8B)。花青素吸收是在520nm处，表儿茶素吸收是在280nm(图SC);根据花青素吸收值来计算定量。图9A-9F包括来自可可树细胞培养物的原花青素和生物碱的一系列色谱。图9A-9C示出了对多种确证标准化合物的HPLC LC-MS分析。图9D-9F示出了对可可树悬浮细胞的HPLC LC-MS分析，显示出表儿茶素和儿茶素的信号但没有任何咖啡因或可可碱。图10A-10B包括示出了悬浮细胞提取物的一系列HPLC色谱图的图:荧光检测器模式(图10);或280nm下的PDA检测器模式(图10B)。标签I至12分别指原花青素的聚合度:1，单体；2，二聚体；3，三聚体；4，四聚体；5，五聚体；6，六聚体；7，七聚体；8，八聚体；9，九聚体；10，十聚体；ll，i^一聚体；12，十二聚体。图11包括比较悬浮细胞提取物和未发酵的可可豆提取物中的可可碱和咖啡因浓度的色谱图，表明与可可豆提取物形成对比的是，在悬浮细胞提取物中这两种代谢物的量为痕量。图12A包括示出了多种含水溶剂中的总原花青素收率的比较的图(当日内，n =
3)。·图12Β包括示出了提取程序的低聚原花青素(单体至十聚体)的总提取率的比较的图(η = 2)。图12C包括示出了 60%乙醇与70%丙酮之间提取物中的原花青素谱的比较的图。图13包括示出了多种接种密度的培养物中生物量密度的典型时间进程的图。图14Α-14Β包括示出了室温下23小时内酸性与非酸性提取溶剂系统中二聚体原花青素的稳定性比较的图。
具体实施例方式本发明涉及分离的可可细胞系、从这类分离的细胞系制备的提取物和用于开发适于在液体培养物中培养的可可细胞系的方法。该公开还涉及用于选择可在细胞培养物中产生高水平的原花青素的细胞系的方法以及用于从这类细胞培养物提取原花青素来制备食品成分、食品添加剂、治疗组合物或化妆品组合物的方法。此外，选择用于产生高水平的原花青素的这类分离的细胞系也可被选择为基本上没有咖啡因和可可碱。咖啡因和可可碱通常在可可制备物中相当丰富，其为可可中主要造成可可苦味的化合物。这类化合物也主要造成可可产品对狗和其他动物的毒性。本发明还涉及用于培养可可细胞的细胞悬浮培养物的新的培养条件和/或培养基(例如液体培养基)以及用于增强这类悬浮细胞产生原花青素的液体培养基组合物。1.缩写2,4-D2，4-二氯苯氧基乙酸
2iP6-(γ，γ-二甲基烯丙基胺)嘌呤
Β5Gamborg's B5
BA苄基腺嘌呤
CPChcc and Poolc
DKWDriver and KuniMiki VValnul
FAB/MS快速原子轰击/灰谱
HCl盐酸
HPLC高效液相色谱
H2SO4碗酸
IAA吲咮乙酸
IBA吲咮丁酸
LC液相色谱
LSIMS液相二次离子质谱
MS质谱
MS 培养基iVlurashigc and Skoog 培养基
MS 维生索Murasliigc and Skoog 维生素
MS itMiirashigc and Skoog it
NAA]-杀'乙
NMR核磁共振
NNNitsch and Nitsch
PCV细胞压积
PDA光电二极管阵列
QL,Quiorin and Lcpoivrc
RI折射率
rpm每分钟转数
SHSclicnk and Hildcbrandt
TDZ^Wir(Ihisdiazuron)
TLC薄层色谱
wm每分钟每体积培养物的气体体积
WPMMcCown's木本植物培养基I1.术语除非另有说明，否则技术术语根据常规用法使用。为方便综述本发明的多个实施例，提供了下列特定术语的解释:抗氧化剂是降低氧化损伤(由氧造成的损伤)如自由基造成的损伤的物质。愈伤组织是薄壁、未分化的植物细胞的团块，由创伤或在营养介质中培养发育而来。儿茶素是在植物中天然产生的多酚类化合物。它们也称为黄烷-3-醇。可可是(梧桐科的)可可树的种子，主要由两个品种构成=Criollo和Forestero,分为若干亚种。称为Trinitario的第三组是Criollo和Forestero的杂种。这里包括的其他物种有例如大花可可树、Theobroma obovatum、Theobroma speciosum、Theobromasubincanum 和 Theobroma sylvestris。黄酮是含有特征性芳族三聚体杂环核的一组化合物中的任一者，通常以糖苷形式出现并在植物中广泛分布，经常作为色素。
多酚是水溶性植物色素，也被称为生物类黄酮，其涵盖超过4，000种化学独特的黄酮，可根据它们的化学结构进行分类。多酚单体包括儿茶素、表儿茶素、无色花青素。多酚低聚体包括原花青素。原花青素是由两个到多于五十个单元的偶联儿茶素单元构成的多聚体化合物。原花青素还常被称为原花色甙或缩合单宁。悬浮培养是通过其原核或者真核细胞在可控条件下于液体营养介质中生长的过程。组织培养是保持组织在培养基中存活和生长的技术或过程。黄嘌呤类、黄嘌呤(3，7- 二氢-嘌呤-2，6- 二酮)衍生物是一组生物碱，通常因为其作为温和兴奋剂和作为支气管扩张剂的效用而使用。甲基化黄嘌呤衍生物包括咖啡因、副黄嘌呤、茶碱和可可碱(主要存在于巧克力中)。这些化合物抑制磷酸二酯酶和拮抗腺嘌呤核苷。除非另作解释，否则本文使用的所有技术和科技术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。除非上下文另外明确指明，否则单数术语“一种”、“一个”和“所述”包括多个指代物。类似地，除非上下文另外明确指明，否则单词“或”旨在包括“和”。因此“包含A或B”意指包括A或B，或者A和B。尽管类似于或等同于本文所述那些的方法和材料可 被用于实践或测试本发明，但下文描述了适当的方法和材料。在此提及的所有文献、专利申请、专利及其他参考文献以引入的方式全文并入本文。在冲突的情况下，将采用本说明书，包括术语的解释。此外，材料、方法和实例仅作说明而无意限制本发明。II1.本发明的实施例开发分离的可可细胞系、由这类分离的细胞系制备的提取物、用于开发适于在液体培养物中生长的可可细胞系的方法、用于生成可产生高收率的原花青素的细胞培养物的方法以及用于从该培养物有效提取这些化合物的方法可显著增加这些有价值的化合物的产量。使用细胞培养物来产生原花青素不需要开发用于处理可可豆以减少原花青素损失的新方法的繁重任务。另外，细胞培养物不受可破坏作物生产的环境条件影响。本发明描述这类细胞培养物和方法。本文提供选择为实质上不含咖啡因和可可碱的分离的可可细胞系。也就是说，由分离的可可细胞系产生的产物实质上不含咖啡因和可可碱。因此，源于分离的可可细胞系的制备物(例如裂解物、提取物等)天然实质上不含咖啡因和可可碱。这与通常的可可细胞制备物相反，通常的可可细胞制备物中必须使用溶剂提取将咖啡因和可可碱从该可可细胞制备物移除。这种溶剂提取代价高且耗时。另外，这些溶剂提取通常采用可能在处理过的可可细胞提取物中留下潜在毒性的残余物的苛性溶剂(例如己烷)。在一个实施例中，分离的可可细胞系可适于在悬浮细胞培养物中培养。分离的可可细胞系可衍生自基本上可可植物的任何部分。例如，分离的可可细胞系可衍生自花组织或非花营养组织中的至少一者。花组织的实例包括但不限于花瓣、花萼、退化雄蕊以及它们的组合。非花营养组织的实例包括但不限于节、节间、幼叶、成熟叶、茎、根以及它们的组合。在一个实施例中，分离的可可细胞系产生大于100mg/L细胞压积(“PCV”)、大于200mg/L PCV的原花青素、大于300mg/L PCV、大于400mg/L PCV或大于500mg/L PCV的原花青素。在一个实施例中，分离的可可细胞系每升细胞培养物产生大于lOOmg、大于200mg或至少250mg的原花青素。本发明提供制备实质上不含黄嘌呤生物碱的可可多酚制备物的方法，该方法包括以足以导致可可多酚产生的时间和条件使可可属或Herrania属细胞在悬浮培养物中生长，以及从该细胞悬浮培养物收获可可多酚。在特定的实施例中，以足以导致可可原花青素(例如低聚原花青素)产生的时间和条件(例如I至3周)在悬浮培养物中培养可可属或Herrania属细胞，并从该细胞悬浮培养物收获可可原花青素。在这些方法的实例中，所得的可可多酚(或原花青素)制备物实质上(或在某些情况下完全)不含可检测的咖啡因和/或可可碱。
本发明还提供了制备可可细胞的细胞悬浮培养物的方法。这些方法的实例涉及在固体培养基上从非成熟的可可属物种花外植体或从可可属物种营养材料培养愈伤组织；从该可可属物种愈伤组织培养物选择快速生长的细胞系；以及通过将该快速生长的细胞系接种进液体细胞培养基中弓I发该细胞悬浮培养。举个例子，该未成熟的可可树花外植体在一些情形中选自退化雄蕊、花萼和花瓣基部外植体。在其他特定的非限制性实例中，可可属物种营养材料选自幼小的或成熟的叶、茎、分生组织、节或节间。在一些情况中，营养细胞培养物可能是优选的，因为能够产生比花细胞培养物更多的原花青素。可对可可细胞的这种细胞悬浮培养物进行选择使得可由其产生的细胞和提取物实质上不含咖啡因和可可碱。还提供使用本文所述方法中的任一者制备的实质上不含黄嘌呤生物碱的可可多酚(例如原花青素)制备物。在特定实施例中，可可多酚(例如原花青素)制备物缺少可检测水平的黄嘌呤生物碱(该制备物不含黄嘌呤生物碱)。在具体的非限制性的实例中，可可多酚制备物包含原花青素(例如，低聚体原花青素)并且实质上不含咖啡因和/或生物碱。在特定的非限制性实施例中，本文所述的可可多酚可用于膳食组合物、化妆品组合物、治疗组合物或兽用组合物。举个例子，如果以提取物的重量或体积计可可多酚制备物含有少于2%的可可碱和少于0.5%的咖啡因，则可认为其实质上不含黄嘌呤生物碱(例如实质上不含咖啡因和可可碱)。在具体的非限制性实例中，如果可可多酚制备物含有少于1.5%、少于1%、少于0.5%或0%的可可碱和/或含有少于0.25%、少于0.2%、少于0.1%或0%的咖啡因，则可认为其实质上不含黄嘌呤生物碱。在另一个实例中，如果可可原花青素制备物含有少于2%的可可碱和少于0.5%的咖啡因，即可认为其实质上不含黄嘌呤生物碱。在具体的非限制性实例中，如果可可多酚制备物含有少于1.5 %、少于I %、少于0.5%或O %的可可碱和/或含有少于0.25 %、少于0.2 %、少于0.1 %或O %的咖啡因，可认为其实质上不含黄嘌呤生物碱。最理想的实质上不含黄嘌呤生物碱的水平是0%可可碱和0%咖啡因(制备物是不含黄嘌呤生物碱的)。还可以设想，本文所述的和/或用本文所述方法制备的代表性制备物含有可可多酚，所述可可多酚包含儿茶素、表儿茶素和原花青素低聚体。在具体的实例中，低聚体是二聚体至十二聚体。例如，在某些制备物中，低聚体包括二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体或它们任意两种或更多种的混合物。还设想的是其中可可多酚是可可原花青素的制备物。本文提供的可可多酚制备物可以液体形式、干燥形式或冻干形式提供。可可多酚可在不进行提取的情况下以干燥的或冻干的细胞形式提供。在一个实施例中，可将添加补充的葡萄糖至悬浮培养物用于增加原花青素的产量。已经发现的是在指数生长阶段结束时添加葡萄糖至细胞培养物可增加原花青素产量。因此，葡萄糖可用作增加原花青素的产量的诱导剂。可用另一种糖代替葡萄糖。葡萄糖可以培养基重量或体积的约0.5%至约至约20%，更优选约1%至约10%，更优选约2%至约8%,更优选约3%至约6%,并且最优选培养基重量和体积的约5或6%的量添加。可任选地是，可用另一种单糖如蔗糖或果糖代替葡萄糖。可在细胞培养期间的任何时间添加葡萄糖或另外的单糖以增加原花青素的产量。单糖可在接种I至21天后引入，并且可在提取原花青素之前引入一次或多次。在一个实例中，单糖添加可在接种后I至7天进行，然后在接种后7至21天再次进行，更具体地讲可在接种后5至8天添加然后在第12至18天再次添力口，并且更具体地讲可在约第7天添加并在约第14天再次添加。在另一个实例中，单糖的添加可在指数生长阶段末期之前、期间和/或之后，优选在指数生长阶段末期时或之后。可在添加葡萄糖后I至21天，更具体地讲7至18天，或更具体地讲是葡萄糖添加后约10天提取细胞的原花青素。本发明还提供使用本文所述方法中的任一者制备的实质上无激素的可可多酚(如原花青素)制备物。在特定的实施例中，可可多酚(例如原花青素)制备物缺少可检测水平的激素。制备这种无激素组合物的相关方法可包括在无激素细胞培养基中将细胞培养I天至3周。惊人且出乎意料的是，在无激素培养基中培养的细胞产生足够量的原花青素用于提取。使用无激素培养基可有益于降低细胞培养物提取物中的激素水平。已经发现的是，细胞培养物在可接受范围内是活的，使得无激素培养基可用于制备在细胞培养物提取物中具有降低的激素含量的原花青素。惊人且出乎意料的是，据发现使用无激素培养基还导致原花青素产量增加。因此，可在提取之前使用无激素细胞培养物来降低激素含量水平以及增加原花青素产量。细胞培养基中缺少激素在未分化的细胞中可以是有用的。该细胞培养方法可包括在接种时或此后某个时间从细胞培养基中移除激素。移除激素的方法可包括从细胞移除细胞培养基和/或给细胞引入无激素培养基使得细胞基本上没有激素。在一个方面，可在接种后I至14天，更具体地讲是接种后I至7天或接种后7至14天从细胞移除激素。在提取之前可将细胞在不存在激素的情况下培养I至3周，更优选I至2周，最优选在不存在激素的情况下培养后I周。可在无激素培养基之前以25%接种。
在一个实施例中，可将产原花青素的细胞在不存在激素的情况下培养，同时补充葡萄糖。虽然无激素培养基和补充的葡萄糖独立显示了原花青素产量增加，令人惊奇且出乎意料的是，较于单独的无激素培养基或补充的葡萄糖，使用补充有葡萄糖的无激素培养基进一步增加了原花青素产量。原花青素产量增加的结果是令人惊奇和出乎意料的，因为调节细胞培养中的多个变量通常会导致令人不满意的结果。然而，在此情况下无激素培养基与补充葡萄糖的组合具有实质的累加效应，其中因为单独的无激素培养基或补充的葡萄糖引起的增加现在组合而进一步增加原花青素产量。从细胞培养物移除激素、引入葡萄糖以及提取原花青素的步骤可通过将如上所述的引入葡萄糖和在无激素培养基中培养的特征组合来进行。另外，在无激素培养基中培养和在葡萄糖存在的情况下培养的组合可以是一前一后的，其中首先在无激素培养基中培养细胞，然后给予葡萄糖。培养技术可包括以下中的至少一者:从细胞移除激素I周，添加葡萄糖，然后等候I至21天的一段时间，之后提取原花青素；从细胞移除激素2周，添加葡萄糖，然后等候I至21天的一段时间，之后提取原花青素；从细胞移除激素3周，添加葡萄糖，然后等候I至21天的一段时间，之后提取原花青素；从细胞移除激素I周或更多周，以两次或更多次剂量隔I至14天添加葡萄糖，然后等候I至21天的一段时间，之后提取原花青素；接种后O至14天从细胞移除激素，如本文所述添加葡萄糖，然后等候I至21天的一段时间，之后提取原花青素；或其他相似的培养技术。在一个实施例中，用于获得原花青素的提取工艺可使用乙醇作为提取溶剂以增加从细胞培养物提取单体-十聚体原花青素的效率。现在，可使用乙醇，其为更环境友好的，因为丙酮已知为环境污染的。另外，乙醇提取剂可循环和再利用。另一方面，丙酮难以循环。在一个实施例中，用于获得原花青素的提取工艺可在酸的存在下进行，该酸还可以是抗氧化剂，如抗坏血酸或柠檬酸。具有抗氧化剂性质的酸性提取溶液可改善原花青素的提取，因为氧化降解减少。另外，在某种程度上由于该提取溶剂对细胞的渗透性以及原花青素释放增加，提取效率增加。或者，可以使用酸和单独的抗氧化剂。可用通过所述方法中的任一者制备的可可属和Herrania属细胞悬浮培养物进行细胞培养，以及如本文所述的这些细胞悬浮培养物用于产生可可多酚(如原花青素)的用途。在一个实施例中，制备实质上不含黄嘌呤生物碱的可可多酚制备物的方法包括以足以导致可可多酚产生的时间和条件在悬浮培养物中培养可可属或Herrania属细胞，以及从该细胞悬浮培养物收获可可多酚。在该方法的实例中，所得的可可多酚制备物实质上(或在某些情形中，完全)不含可检测的咖啡因和/或可可碱。在其他特定实例中，制备物含有少于50%的由发酵过的豆所制备的可可多酚制备物中将会存在的咖啡因和/或可可碱水平。在优选实施例中，细胞培养物所生成的制备物含有少于30%、少于20%、少于15%、少于10%或少于5%的由发酵过的豆制备的可可多酚制备物中将会存在的咖啡因和/或可可碱水平。在本发明方法的具体实施例中，以足以导致产生可可原花青素(例如，低聚原花青素)的时间和条件在悬浮培养物中培养可可属或He rrania属细胞，以及从该细胞悬浮培养物收获可可原花青素。在本文提供的代表性方法中，可可属或Herrania属细胞悬浮培养物通过在固体生长培养基上从不成熟的可可属或Herrania属花外植体或从可可属或Herrania属营养材料培养愈伤组织，从该可可属或Herrania属愈伤组织培养物选择快速生长的细胞系，并通过将快速生长的细胞系接种进液体培养基中来引发细胞悬浮培养而制备。在某些所提供的方法中，制备可可多酚(包括原花青素)包括收获细胞；在用于提取多酚富集级分的合适溶剂(例如乙醇提取剂)中均质化细胞生物质；分离原花青素富集级分(例如使用溶剂-溶剂提取和/或色谱)；以及任选干燥、冻干或浓缩原花青素级分。在某些情形中，收获细胞包括离心、过滤或它们的组合。另一个实施例是制备可可细胞的细胞悬浮培养物的方法。该方法的实例包括在固体生长培养基从不成熟的可可属或Herrania属花外植体或从可可属或Herrania属营养材料培养愈伤组织；从可可属或Herrania属愈伤组织培养物选择快速生长的细胞系；以及通过将该快速生长的细胞系接种进液体培养基中引发该细胞悬浮培养。举个例子，不成熟的可可树或Herrania属花外植体在一些情形中选自退化雄蕊外植体、花萼外植体和花瓣基部外植体。在其他特定的非限制性实例中，可可树或Herrania属营养材料选自幼叶或成熟叶、茎、分生组织、节或节间。可任选地，制备可可细胞的细胞悬浮培养物的方法还包括在烧瓶、任何合适的培养容器或生物反应器中培养细胞悬浮培养物。例如，在某些情形中，该培养在容器或生物反应器中以及以分批、分批补料或连续模式实现。本文还设想的是通过所述方法中任一者制备的可可属或Herrania属细胞悬浮培养物以及这些细胞悬浮培养物制备可可多酚或更具体地讲原花青素的用途。本公开提供的另一个实施例是包含可可多酚混合物且天然实质上不含咖啡因和可可碱的可可多酚制备物，该制备物提取自可可属或Herrania属细胞悬浮培养物。关于“天然实质上不含咖啡因和可可碱”的术语“天然”表明咖啡因和可可碱的相对不存在不是通过纯化程序(如LH-20尺寸排阻色谱法)产生。因此，通过本文描述的工艺获得初级细胞培养物提取物可在不进行额外纯化的情况下实质上不含咖啡因和/或可可碱。然而，如果从初级提取物获得高于所需水平的某些咖啡因和/或可可碱，则可进行进一步的纯化。另外的实施例是在不使用己烷或另一有机溶剂进行脱脂步骤的情况下进行的可可多酚提取物制备方法。对于这些目的，乙醇不认为是有机溶剂。因此，本文设想的是在不使用己烷的情况下制备的可可多酚(例如原花青素)制备物。可可多酚提取物可实质上或完全没有任何有机溶剂，例如己烷或丙酮等等。设想本文提供的可 可多酚制备物可用于膳食组合物和/或用于治疗组合物和/或用于兽用组合物和/或用于化妆品组合物。IV.可可组织培养本文描述的是从可可属或Herrania属的细胞培养物有效分离原花青素的方法。具体地讲，已建立了允许常规分离与提取自可可豆的花青素类似的原花青素的可可属或Herrania属细胞悬浮培养物。此外，本文提供的方法已导致制备了这些原花青素的多产细胞培养物来源。这些方法的代表性优势包括:由于控制气候条件而导致生物质来源可靠且连续；快速而有效的分离程序，其使在提取过程期间原花青素的降解最少；从细胞培养物分离的原花青素在组成上类似于从可可豆分离的原花青素；和/或可用于操纵和优化细胞培养物原花青素生产率的技术。一般而言，本文描述的是从可可属或Herrania属植物的多种组织建立愈伤组织培养物。建立的愈伤组织被用于使用多种类型的细胞培养基培养浮培养物。当稳定的悬浮细胞培养物建立时，对细胞进行提取并通过公认的分光光度法分析原花青素含量，而使用HPLC-MS方法来鉴定各原花青素。根据这样的分析，选择能产生所需原花青素的悬浮培养物来进一步优化生产率。可可培养物的生成这里大致概述生成可可培养物的方法，并在实例中描述详细的示例方案。简而言之，尽管本领域技术人员可以根据已知变化变动具体细节，通过从源自多个植物部分，例如花组织如花瓣、花萼、退化雄蕊等，或非花营养组织如节、节间、幼叶、成熟叶的外植体建立愈伤组织和悬浮培养物来实现产原花青素细胞培养物的引发，如对于体细胞胚胎发生所描述的。通过定期转移所培养细胞的一部分至新鲜培养基中，在新鲜悬浮培养基中维持悬浮培养物。通过细胞生长性能和培养基的糖消耗来确定转移安排和接种密度。—个实施例提供改变原花青素含量的方法，该方法涉及在足以引发产原花青素培养物的条件下引发这样的培养物，以及建立足以用于建立生产性细胞培养物的生产培养基，随后按比例放大生产性细胞培养物适当量的时间以分离原花青素。相应地，改变引发培养物或建立生产性培养物所需的条件能导致在这种培养物中原花青素含量(量)改变。可改变植物细胞培养物微环境的物理方面(例如光辐照)和/或化学方面(例如培养基组成或化学诱导剂)以实现所需的改变的含量。例如，可最初或者在诱导期间增加悬浮培养基中的碳水化合物(例如蔗糖或葡萄糖)浓度以便增加培养物中原花青素的量。此外，可为了在植物细胞培养物中产生次级代谢物而操纵氮源(例如硝酸铵)(参见Neera等人,Phytochemistry.(《植物化学》)31 (12):4143-4149，1992)。因此，降低可可属或Herrania属细胞培养基中氮源的浓度可用于增加培养物中的原花青素产量。此外，输入某些氨基酸(如谷氨酸、甘氨酸和丝氨酸)也可显著影响次级代谢物的产量。因此，可增加这些氨基酸在可可属或Herrania属悬浮培养基中的浓度以便增强原花青素的产量。还可将另外的氨基酸包括在培养基中并测试其增加可可属或Herrania属悬浮培养物的原花青素产量的能力。此外，可从培养基移除激素以增强可可属或Herrania属悬浮培养物的原花青素产量。还可变动光照条件以便实现可可属或Herrania属细胞培养物中的原花青素含量改变。例如，通过增加辐照或曝光长度来改变光照，从而增加原花青素产量。还可以改变光辐照的波长以实现原花青素产量增加。例如，已知紫外光可诱导原花青素在植物细胞培养物中产生(Meyer, J.Biotechnology (《生物技术杂志》)93 =45-57,2002) 本领域已知的用于操纵植物细胞培养微环境的其他改变方法也设想为处于本说明书的范围内，并且本领域内任何技术人员均可执行。另外，可如本文所述培养可可细胞。例如，可在提取原花青素前的某个点给培养物施予葡萄糖。可用其他糖如蔗糖、果糖等替代葡萄糖。可在如下时间点将葡萄糖引入细胞培养物:接种时；接种后1-7天；接种后7-14天；接种后14-21天；或它们的组合。在另一个实例中，可在提取原花青素之前将培养物在无激素培养基中培养。可在如下时间点将无激素培养基引入培养中的所述细胞:接种时；接种后1-7天；接种后7-14天；接种后14-21天；或它们的组合。从培养物中收获可可细胞如本文所述培养一批产原花青素可可属或Herrania属细胞，并收获细胞以提取原花青素。可以多种方式进行悬浮细胞的收获，本文描述了这些方式的实例。一旦细胞培养物到达稳定期并达到所需的原花青素生产率，就让培养物在容器中沉降为紧密的团块并可轻轻倒出培养基，留下大部分固体细胞生物质。然后洗涤细胞生物质以移除残留的培养基并类似滗出。或者，可离心细胞悬浮并弃去上清液(培养基)，然后洗涤细胞团块并再次离心以弃去液体。第三个选择是过滤细胞培养物悬浮液以移除培养基。这些方法的任一者可使用几毫升到数千升培养物的生产规模体积的细胞培养物体积。提取稈序粉碎、研磨或磨碎收获的细胞团块以均质化细胞团块，并破碎细胞以增强提取溶剂与样品的接触面积，以及确保提取的部分代表整个样品。原花青素是不稳定的化合物。因而，如果在提取前需要保存细胞生物质，优选冷冻保存，例如通过用液 氮冷冻。
除了几个主要差异外，从可可属或Herrania属的细胞培养物提取总多酚类似于用从可可豆提取总多酚的程序。在可可豆的情形中，磨碎豆之后的起始步骤是使磨碎的碎片(碎粒)脱脂。该过程导致多酚损失。因为细胞培养物没有可可豆那么多的脂肪，因而不需要该步骤。去除该步骤可减少细胞培养物的提取工艺过程中的多酚损失。此外，脱脂需要诸如己烷之类的溶剂，在最终的提取物中存在痕量的该溶剂。这导致由可可豆制备的提取物中有不良气味，并且该溶剂可能是有毒的或对于某些用途(如食品配料成分)是不期望的。因为本文所述的用于从细胞培养物生物质提取的方法排除了使用溶剂(如己烷)，在所得的提取物中没有溶剂污染或不良溶剂气味。在代表性方法中，用70% -80%含水甲醇或70%含水丙酮或它们的组合来从磨碎、均质化的细胞提取多酚。也能使用水和乙醇，尽管使用这些溶剂只能部分提取低聚体原花青素，而根本不能提取高分子量聚合物(Grayer,载于:J.B.Harborne, PlantPhenolics (《植物酚类物质》)(第I卷)，第283-323页，1989.圣地亚哥(San Diego)，美国学术出版公司(Academic Press, Inc.) ;Lee 和 Widmer,载于:L.M.L.Nollet，Handbookof Food Analysis (《食品分析手册》)(第 I 卷)，第 821-894 页，1996, Basel, New York,Hong Kong, Marcel Dekker, Inc.)。在一个实施例 中，提取溶剂可包括乙醇。乙醇可以是包括约25体积或重量％至约100体积或重量％、更优选超过约50%，更优选超过75%，甚至更优选超过90%的乙醇的含水组合物。具体的实例包括50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇和80%乙醇，其中图12示出了最优的60%乙醇。在该实施例中，乙醇提取溶剂没有其他醇或酮。在一个实施例中，提取溶剂可包括与水和/或乙醇一起的其他醇或酮，如含水有机溶剂。实例包括异丙醇、乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯或它们的组合。该含水有机溶剂可包括约25 %至约99 %，更优选约30 %至约90 %的水，或甚至更优选超过50 %的水。在一个实施例中，取决于细胞团块的量，将提取溶剂与处理过的或未经处理的细胞以多种量组合。提取溶剂的量可以是细胞团块质量或体积的50%或更多，更优选超过或约75 %，甚至更优选超过或约100 %，并且甚至更优选超过细胞团块质量或体积的200 %。当然，可使用更大体积的提取溶剂。在一个实施例中，提取溶剂可包括酸，例如抗氧化剂酸。酸的实例包括乙酸、柠檬酸或抗坏血酸。以提取组合物的体积计或以提取溶剂的体积计，该酸可以约0.05%至10%存在，更优选约0.75%至约5%，更优选提取溶剂的约0.1体积％至约I体积％或至约2体积％。在彻底提取次要组分之后，各原花青素可能以释的水平存在于提取物中。浓缩在低温(低于40°C)和减压下实现以使原花青素的降解最少(Lee和Widmer，载于:L.M.L.Nollet, Handbook of Food Analysis (《食品分析手册》)(第 I 卷)，第 821-894 页,1996, Basel, New York, Hong Kong, Marcel Dekker, Inc.)。在该阶段可可属或Herrania属的细胞培养物的多酚提取物相对纯净，可立刻对其进行分析。本文所述方法的一个好处在于，与可可豆的多酚提取物相比，源于细胞培养物的可可属或Herrania属多酚提取物一开始就具有不可检测水平的杂质(例如，咖啡因和可可碱)。然而，做进一步的净化以移除微量杂质(如咖啡因和可可碱)是有益的。净化提取物以移除甚至痕量的这些杂质是可能的。这种净化步骤可包括以非互溶溶剂进行的液-液分配和在S印hadex LH-20、聚酰胺、Amberlite XAD-2、制备型HPLC上的柱色谱，以及使用可商购获得的一次性柱的固相提取(SPE) (Grayer,载于:J.B.Harborne, Plant Phenolics (《植物酚类物质》)(第I卷)，第283-323页，1989.圣地亚哥，美国学术出版公司；Markham和Bloor,载于:C.A.Rice-Evans 和 L.Packer, Flavonoids in Health and Disease (《健康与疾病中的黄丽》)，第 1-33 页，1998, Basel, New York, Hong Kong, Marcel Dekker, Inc.)。通常可通过用氯仿或二氯甲烷提取来实现可可碱和咖啡因的移除，因为多数黄酮在这些溶剂中溶解度有限。分析程序用于检测和鉴定来自可可属或Herrania属细胞培养物的原花青素的分析技术与用于来自可可豆的提取物的那些类似。主要使用多种色谱技术来分离低聚体然后使用独立的方法进行结构鉴定来实现可可原花青素的鉴定。Quesnel (Phytochemistry (《植物化学》)7:1583-1592，1968)以及 Jalal 和 Collin(Phytochem.(《植物化学》)16:1377_1380，1977)分别使用纸色谱分析方法和TLC方法鉴定了可可中的原花青素。然而，尽管这些出版物确认原花青素存在于可可中，但未阐明原花青素的立体专一性结构。Porter等人(Phytochemistry (《植物化学》)30:1657-1663,1991)用柱色谱、TLC、HPLC 和阴离子 FAB/MS对可可中的原花青素进行了严格的调查研究，从而确立了原花青素低聚体至七聚体的存在。此外他们使用NMR证实了原花青素至四聚体的结构，并发现它们主要由(-)_表儿茶素构成。Clapperton等人报道了 可可原花青素低聚体至八聚体的证据(Proceedings,16th International Conference of Groupe Polyphenols, Lisbon, Portugal ；GroupePolyphenols:Norbonne, France,第 II 卷，第 112-115 页，1992)，他们使用柱色谱、反相HPLC和阳离LSMS的组合来鉴定原花青素低聚体。该工作证明了阳离子LSMS的实用性以及钠加合物作为鉴定较大原花青素低聚体的手段的用途。可惜的是，所有这些方法都很费力，需要漫长的制备时间来获得结构信息，而不适合大量细胞培养物样品的高通量分析和筛选。而且，这些方法不适用于小样本。对于本发明，我们开发了用于从可可属或Herrania属细胞培养物提取原花青素的高通量微量方法、用于原花青素单体和低聚体的快速分离的反相HPLC方法，以及用于基于原花青素低聚体的分子特征对它们进行同步鉴定的质谱(MS)方法。可可属或Herrania属细胞培养物的大规模工艺优化在开发工业化生产工艺时大规模植物细胞培养是重要的技术。这可在类似于微生物发酵中所用的那些的大罐中进行。通过基于大规模工艺中的细胞生长和生产特征确定生物分子因素以及通过优化可增强原花青素生产率的大规模生物工艺变量，可以实现这些罐中生产率的增长。生物分子因素包括培养基组分、诱导剂和生物合成途径中的前体。在大规模工艺之前，应该在烧瓶规模的工艺中测试这些因素，因为放大过程的目的在于大规模重现在较小规模下观察为最适的那些条件。然而，大规模生物反应器培养中的条件与烧瓶规模培养可可属或Herrania属悬浮细胞不同。由输送限制导致的影响悬浮细胞的环境条件改变会影响培养物的宏观动力学。例如，虽然生长动力学参数是规模不依赖的，但细胞培养物在容器中的总体生长是规模依赖性的，因为气体营养物质和溶解的营养物质以及代谢产物的输送具有规模依赖性(Dicosmo和Misawa, Plant Cell Culture SecondaryMetabolism(《植物细胞培养物次级代谢》)，第11_44页，1996年。佛罗里达博卡拉顿(BocaRaton，Florida)，CRC出版社(CRC Press LLC))。因此，在放大可可原花青素生产的生物反应器工艺时，要进行许多基础实验以获得生长速率、产物形成速率、营养物质吸收速率和呼吸率的基本数据。一般而言，通过增加细胞浓度和单位生产率，可实现植物细胞培养物中的高生产率。最大细胞浓度取决于营养供给、每底物的生物质收率和水含量。基于基础数据，可以逐一变动另外的环境因素或同时变动多个因素以增加生物量。生物工艺变量如曝气率、悬浮培养的流变性能可影响生物反应器中的传质和混合，继而不仅影响细胞生长而且还影响植物次级代谢物的产量。因此，可能要考虑两步培养，因为多数多酚通常是非生长相关的化合物。因为单阶段工艺理想地将培养限制为单一生长速率并且大概限制为单一发育阶段，当几个发育阶段是产生非生长相关的化合物的前提条件时，该操作将不适合。对于生长阶段和生产阶段，分开优化曝气率变量、搅拌速度、其他混合相关变量以及甚至培养基组成。然而，在保持所有条件最适的同时放大工艺是不可能的。关于被认为是最重要的变量必须做出选择。因为碳源和氮源的相对量在增强次级代谢物生物合成和细胞生长中起重要作用，还基于碳和氮消耗的基础工程数据研究了补充碳源和氮源对于生长和产量的影响(Basaria, Current Biology (《当代生物学》)，2:370-374,1990)。然后,可研究氧和二氧化碳的供应。除氧以外，已有报道二氧化碳可改善植物细胞培养中的所述细胞生长和次级代谢物产量(Thanh 等，Biologia Plantarum(《植物生物学》)，50:752-754,2006 ;Tate 和Payne, Plant Cell Reports (《植物细胞报道》)，10:22_25，1991)。在细胞生长阶段植物细胞的氧需求相 对较低，但是在代谢物合成期间可能显著增高。对这些气体的水平进行控制以使它们在可可属或Herrania属细胞的反应器培养中的利用最佳。在大规模发酵中，弓丨入与实验室规模所引入的相同量的气体(空气、氧等)是不可能的。因此，应维持传质系数恒定以使在生物反应器过程期间表观气速恒定。氧在碳源代谢中起关键作用并且可通过分布器将其引入生物反应器的生长培养基和诱导培养基，引入的速率取决于生物体的生长或产物形成动力学(Shuler和Kargi，Bioprocess Engineering:Basic Concepts (《生物工艺工程:基本概念》)，第二版，2002。美国新泽西州上鞍河(Upper Saddle River,NJ,USA),普伦蒂斯霍尔出版社(Prentice-Hall,Inc.))。此前已演示在升高的溶解氧水平下在生物反应器中培育植物细胞以进行紫杉烷生产(常见例如美国专利N0.7，264，951)。在多种类型和尺寸的生物反应器中研究了升高的溶解氧气水平对可可细胞培养物的生长和产量的效果，包括7.5L和30L机械搅拌反应器以及IOL和20L气升式生物反应器。本发明人已发现，具有升高的溶解氧的气体状况是大规模可可细胞生长以及升高的多酚产量所需的。在供给生物反应器的空气与纯氧的共混物中，进气气体状况的氧气部分可为1%至100%，最适条件取决于培育的生长阶段或诱导阶段期间可可细胞悬浮液的需求。生长阶段或诱导阶段期间可可细胞培养基中的溶解氧浓度可为空气饱和度的I %至空气饱和度的400%。在生长阶段期间经由分布器作为空气/氧气混合物提供进生物反应器中的氧气部分在该气体混合物的1%至100%的范围内。在诱导阶段期间以空气/氧气混合物提供进生物反应器中的氧气部分在该气体混合物的1%至100%的范围内，优选在25%至100%的范围内。使用诱导剂来刺激代谢物形成和分泌是重要的工艺策略。其曾对降低达到高产物浓度(如体积生产率所需用的工艺时间十分有用。而且，诱导可导致新化合物形成(Payne等，Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems (《液体系统中的植物细胞和组织培养》)，第333-351页，1995,纽约约翰威立父子出版公司(New York, John ffiley&Sons,Inc))。在大规模反应器培养中测试用若干生物/非生物候选物进行的诱导优化，以优化应用诱导剂处理的时间、最佳的剂量、细胞暴露于诱导剂的时长以及应收获细胞的时间。因为每种诱导剂可诱导生物合成途径中的不同类型的酶，还测试使用多重诱导剂处理的协同增强效应以增强生产率。反应器操作方法取决于细胞生长动态、产量以及它们的关系。如先前所述的，在该研究中的靶标化合物是非生长相关的，这意味着必须考虑两阶段培养工艺。因此，当生产时间大大长于生长生物量所需的时间时，分批补料培养是特别有吸引力的选择，并且在该情形中，后续生物反应器体积增幅较大是有可能的，这导致该生物质序列(biomass train)中的生物反应器数量较少。V.原花青素的用途和施用可为了治疗、膳食或化妆品目的将通过本文所公开的方法生成的原花青素施用给受试者。受试者可以是人或兽类哺乳动物，如猴、马、奶牛、猪、狗、猫、小鼠或大鼠。关于治疗用途，可将原花青素用于治疗或预防若干障碍或疾病，如动脉粥样硬化症、心血管疾病、癌症、血压调节和/或高血压。例如，可将原花青素预防性地施用给有发展肿瘤风险的受试者、施用给患有肿瘤的受试者或施用给之前治疗过肿瘤的受试者。肿瘤的治疗包括但不限于手术移除肿瘤、化疗、免疫疗法或放疗。在其他实施例中，将通过本文所公开的方法生成的原花青素与至少一种另外的作用剂组合，在肿瘤治疗之前、与之同时或之后施用给受试者。另外的作用剂也可以是本文所述的抑制或降低肿瘤生长的另一作用齐U。或者，另外的作用剂可以是在肿瘤疗程期间改善受试者抑制肿瘤生长的能力的作用剂或帮助受试者对抗感染的作用剂(如抗生素)。例如，另外的作用剂可以是刺激免疫系统的作用剂，如细胞因子。可将通过本文提供的方法生成的原花青素施用给有发展任何类型肿瘤的风险的受试者，或施用给患有任何类型肿瘤的受试者。肿瘤可以是良性肿瘤或恶性肿瘤。肿瘤可包括癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤或神经系统肿瘤。在几个特定的非限制性实施例中，肿瘤包括乳腺肿瘤、肝肿瘤、胰腺肿瘤、胃肠道肿瘤、结肠肿瘤、子宫肿瘤、卵巢肿瘤、宫颈肿瘤、睾丸肿瘤、前列腺肿瘤、脑肿瘤、皮肤肿瘤、黑素瘤、视网膜肿瘤、肺肿瘤、肾肿瘤、骨肿瘤、骨肉瘤、鼻咽肿瘤、甲状腺肿瘤、白血病或淋巴瘤。一般而言,可将通过本文提供的方法生成的原花青素以足以预防或抑制肿瘤生长的量施用给受试者。在其他实施例中，可以预防性地施用原花青素给有发展动脉粥样硬化症、心血管疾病或高血压风险的受试者。或者，可施用原花青素给受试者以治疗已有的病症(如动脉粥样硬化症、心血管疾病或高血压)。组合物可以与其他作用剂(如抗肿瘤剂、抗氧化剂或缓解与动脉粥样硬化症、心血管疾病、血压调节和/或高血压相关的症状或病征的作用剂)一起施用或依次施用。此外，本发明方法生成的原花青素可用于膳食组合物中。当以液体形式经口施用时，液体可以是基于水的、 基于奶的、基于茶的、基于果汁的或它们的某种组合。用于内部施用的固体和液体制剂还包含增稠剂、甜味剂。
通过本文所公开的方法生成的原花青素还可用于化妆品组合物中以改善受试者皮肤的质量或外观。通过外用、内用或它们的某种组合施用原花青素组合物可实现皮肤外观、纹理和水分的改善。可接受的载体可在多个方面充当用于组合物成分的溶剂、载体、稀释剂或分散剂，并使得各成分能以适当的稀释度均匀地施用于皮肤表面。可接受的载体也可有利于组合物渗透进皮肤。含有通过所公开的方法生成的原花青素的组合物可用于很多的成品(包括医药产品、食品和饮料组合物)中，并可按照医药领域的技术人员所熟知的标准技术制备。取决于所选的特定施用模式，包含活性剂的药物组合物可用适当的固体或液体载体配制。可用于本公开的可药用载体和赋形剂是常规的。例如，肠胃外用制剂通常包含注射用流体，该流体是在药学上以及生理学上可接受的流体溶媒(如水、生理盐水、其他平衡盐溶液、葡萄糖水、甘油等)。可包括的赋形剂是例如其他蛋白质，如人血清白蛋白或血浆制备物。如需要，待施用的原花青素组合物也可含有微量的无毒辅助物质，如润湿剂或乳化剂、防腐剂以及PH缓冲剂等，例如醋酸钠或脱水山梨醇单月桂酸酯。除注射用流体外，还可使用局部用制剂和口服制剂。口服制剂可以是液体(例如，糖浆剂、饮料、溶液剂或混悬剂)，或固体(例如，散剂、丸剂、片剂或胶囊剂)。对于固体组合物，常规的无毒固体载体可包括药物级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。局部用制剂可包括滴眼剂、软膏齐 、霜齐 、喷雾剂等。优选地，将适于局部施用的本发明制剂与组合物成分的溶剂、载体、稀释剂或分散剂相混合，并使各成分能以适当的稀释度均匀施于皮肤表面。可接受的载体也可有利于组合物渗透进皮肤。原花青素组合物的剂型将由所选施用模式确定。制备这种剂型的实际方法对于本领域技术人员而言是已知或将是显而易见的。可将通过本公开的方法生成的原花青素组合物以多种方式(如局部、经口、静脉内、肌内、腹腔内、鼻内、皮内、鞘内和皮下)施用给人或兽类哺乳动物，原花青素组合物对它们的细胞发挥效应。本领域技术人员考虑到案例的具体情况(例如受试者、疾病、所涉及的疾病状态以及治疗是否是预防性的)来选择具体的施用模式和给药方案。治疗可涉及在几天到数月或甚至数年的时期内每日或每几天一次剂量的化合物。可考虑诸如具体受试者的年龄、性别、体重和状况及施用途径之类的因素，将这样的组合物以一定剂量并通过医药、营养或兽医领域技术人员熟知的技术施用给需要这种施用的受试者。用于治疗、膳食、化妆品和兽用用途的组合物的制备、剂量和施用是本领域众所周知的(参见例如，美国专利 N0.5，554，645、N0.5，853，728、N0.6，194，020、N0.6，312，753、N0.6，998，417、N0.7，122，574、N0.7，314，634、N0.7，320，797 和美国专利申请公布N0.2007/0148107，将这些以引用的方式并入本文)。提供如下实例以阐明某些特定的特征和/或实施例。这些实例不应理解为将本发明限于所述的特定特征或实施例。实魁实例1:从花组织诱导和增殖可可树愈伤组织使用补加有生长素(2mg/L2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D))、细胞分裂素(0.005mg/L噻苯隆(TDZ))和其他 补充剂(250mg/L L-谷氨酰胺、100mg/L肌醇)的全强度Driver andKuniyuki walnut (DKff)培养基，并使用[D+]-葡萄糖作为碳源(表I中的培养基I)，在控制条件下，建立致密愈伤组织聚集体(aggregate)。将培养基pH调整至5.8后，对培养基进行高压灭菌。从多个栽植植株收获可可不成熟花材料的样品。为防止培养物的污染，将材料先进行表面灭菌再将它们引入到培养基。首先将材料浸在1% ( /V)次氯酸钠中20分钟，并每隔5分钟轻轻搅动。在无菌条件下，轻轻倒出材料，用无菌去离子水清洗三次，每次清洗过程中轻轻搅动。轻轻倒出最终清洗液，只将花芽转移到无菌平板。使用无菌解剖刀，在距基部1/3花长度的位置处将花芽横切。通过切端开口提取退化雄蕊、萼片和花瓣基部外植体。将提取的材料接种在固体愈伤组织诱导培养基上。在每个平板的整个表面上分布大约50个外植体。用封口膜(parafilm)封住平板并在暗处25°C下维持14天。10天后观察到大量的愈伤组织形成。在将花部分放在愈伤组织诱导培养基上14天内，从外植体分离愈伤组织并将其放在愈伤组织增殖培养基上(表I所列的培养基Ι、Π和III)。在四个星期时间间隔，从愈伤组织的表面分离快速生长的细胞并分培到新鲜培养基。选择呈现发白至浅黄颜色的快速生长的 细胞系进行分培(图1)。实例2:从营养组织诱导和增殖可可树愈伤组织在补加有生长素(2mg/L IAA和4mg/L IBA)、细胞分裂素(0.005mg/LTDZ)和L-谷氨酰胺(250mg/L)并以葡萄糖(20g/L)为碳源的Murashige and Skoog(MS)培养基(表I的培养基XXVII)上建立愈伤组织。将培养基pH调整至5.8后，对培养基进行高压灭菌。从多个温室生长的植株收集可可营养组织材料(幼叶和成熟叶，节和节间)的样品。为防止培养物的污染，将材料先进行表面灭菌再将它们引入到培养基。首先将材料浸在70%乙醇中I分钟，然后浸在25%漂白剂中10分钟，并每隔5分钟轻轻搅动。在无菌条件下，轻轻倒出材料，用无菌去离子水清洗三次，每次清洗过程中轻轻搅动。将叶子切成5mm正方形和将节和节间切成l_2mm圆柱体，并移植到含有固体培养基的平板上。将平板维持在暗处25V下。每天对它们观察污染迹象并弃去受污染的材料。4个星期后观察到愈伤组织形成。6个星期后，从外植体分离愈伤组织并将其放在如上所述和如培养基XXVII (表I)所示的愈伤组织增殖培养基上。但是，在引发后，愈伤组织非常快速地增殖和建立。在两个星期时间间隔，从愈伤组织的表面分离新形成的细胞并分培到新鲜培养基。选择呈现浅黄至浅棕颜色的快速生长的细胞系进行分培。在建立了可可愈伤组织后，有必要测试较低含量的生长素对愈伤组织的持续性的效应，因为培养基XXVII中的高生物素含量延迟细胞生长并在后续各代中形成非常棕色的愈伤组织，这表明细胞经历着应激。测试各种培养基维持可可愈伤组织的能力以及维持培养基对细胞悬浮物的产生的下游效应。培养基XXVII为MS培养基补加6mg/L的生长素(2mg/LIAA和4mg/L IBA)、2X MS维生素和250mg/L的谷氨酰胺并含20g/L的葡萄糖和7g/L的琼脂。为进行维持，将培养基中的生长素减少到4mg/L(2mg/L IAA和2mg/L IBA，表I中的培养基XXVIII)和IBA形式的2mg/L生长素(表I中的培养基XXIX)。将生长素减少至4mg/L改善了愈伤组织的颜色，从深棕色变成浅棕色至黄色。愈伤组织细胞生长回复到旺盛水平。细胞悬浮培养物建立起来与从在培养基XXVII上分培的健康愈伤组织建立细胞悬浮培养物一样容易。在含有2mg/L生长素的培养基中，愈伤组织的颜色改变，并且细胞生长回复到旺盛水平。但是，当将这些愈伤组织分培到相同培养基上时，愈伤组织的细胞生长较之培养基XXVIII上的愈伤组织减少了。在将生长素减少到2mg/L后，还记录了额外MS维生素的去除(表I中的培养基XXX)结合谷氨酰胺的去除(表I中的培养基XXXI)对生长的效应。来自这两个培养基的愈伤组织在生长特征方面与培养基XXIX上的愈伤组织看起来没有不同。但是，注意到培养基中额外维生素的存在对于原花青素的产生而言是有利的。维持可可营养愈伤组织的最佳培养基是培养基XXVIII，因为这使得愈伤组织持续性时间长，并且使得容易建立细胞悬浮物和维持原花青素生产率。实侈Il 3:大花可可木对矛口 Theobroma obovatum愈伤组织诱导SlJ:曾殖使用诸如实例I和2中对可可树所描述的方法，建立大花可可树和Theobromaobovatum的愈伤组织培养物。实例4:悬浮物引发通过将从实例I中描述的花外植体产生的白色新鲜愈伤组织接种到含有25ml的20个不同种类的液体培养基(培养基IV-XXIII ;表1)的125ml三角烧瓶中，建立细胞悬浮培养物。将烧瓶用有机硅泡沫盖盖住，在完全黑暗、24±1°C下的恒温控制室中以120rpm旋摇进行振荡54天。每个星期或者每两个星期按需转移分培物。保留作为细胞的颗粒悬浮物或者细小悬浮物形成的培养物，而弃去不形成悬浮培养物的培养物。在14天的细胞生长后，将10% (v/v)的细胞转移到含有25ml新鲜培养基的新的125ml烧瓶中，之后每两个星期进行分培。培养基VIII在悬浮细胞引发中表现出最佳的细胞增殖性能(在第14天45%PCV)。为产生非花组织(营养组织，即节、节间、幼叶、成熟叶)的悬浮物，将实例2中产生的愈伤组织以与上文对花外植体所述的方式相似的方式转移到液体培养基。所用的培养基为培养基XXIV，其与常规维持培养基VIII差别在于盐的类型(MS盐而不是DKW盐，MS盐含有更多的铵和氮源及更少 的硫酸盐)，其包含2mg/L IAA和4mg/L IBA代替2，4-D作为生长素，并且含有两倍浓度的MS维生素(表I)。这个培养基与其中引发营养组织的固体培养基即培养基XXVIII相似，但不含胶凝剂琼脂。在这个培养基中，悬浮培养物建立得较快，愈伤组织在七天时间里消耗掉培养基中的所有糖，而在培养基VIII中引发的愈伤组织通常要花2-3个星期才能消耗掉全部碳水化合物源。非花组织的这些建立的悬浮物的原花青素生产率也高于从花组织产生的悬浮物(1.1g总原花青素/L培养物)(图2A-2B)。实例5:花组织衍生的悬浮细胞培养物的细胞生长、细胞选择和培养物优化本实例描述用于增加悬浮物的细胞生长的方法。细胞培养物生产率随细胞生长的速率和细胞生长停止时的密度而增加。为确定最佳接种密度，将可可树细胞的悬浮培养物以10、15和20% (v/v)的起始细胞密度进行引发并让其生长14天。图3显示生物量密度与接种物密度的变化关系的典型时间进程。以10%的细胞密度引发的培养物表现出生长显著迟滞，在14天内没有达到最大密度。以培养基VIII中15%和20%的细胞密度引发的培养物在13天内密度翻倍，在14天内达到40-43%的最大平均细胞密度。但是，在该细胞选择过程后第14天一些培养物表现出超过50-60%细胞密实体积(PCV)。除培养基VIII不含Phytagel之外，培养基VIII和培养基I是相同的配方。这两个培养基都是基于使用几种储备溶液制备的DKW盐和维生素，这可能会导致培养基组分存在批次差异。因此，使用预混合的DKW基础盐(植物技术实验室(PhytotechnologyLaboratories, LLC),目录号D190)制备培养基XXXII，并在培养基VIII和XXXII之间比较悬浮细胞生长。在任一培养基中都不存在细胞生长的显著差异。因此，将培养基XXXII日常用于维持来自花组织的悬浮培养物。在培养中每隔七天测量生物量增加量、糖消耗量和原花青素生产率。这些数据对于合乎需要的细胞选择过程是非常重要的。优先基于PCV和糖消耗量测量结果选择生长良好的细胞，然后基于原花青素生产收率从生长良好的细胞系当中挑选产量良好的细胞系。较高的生物量和较高的原花青素生产收率可提高一个批次循环的生产率。该细胞选择过程之前的平均原花青素生产率为52mg原花青素/L培养物，在一年的该细胞选择过程后提升到251mg/L的水平，达到的最高水平为1.6mg原花青素/L培养物。最高生产收率也提高到超过 5.0g/L PCV。使用B5主要盐和MS次要盐开发培养基XXV，从而与培养基VIII的平常维持培养基相比降低铵离子在培养基中的浓度。碳水化合物源为60g/L蔗糖，激素为0.lmg/LNAA和0.2mg/L激动素，相比于2mg/L 2，4-D和0.005mg/L TDZ0在2个星期的时间里，在培养基XXV中测试的悬浮物没有显示生长，但原花青素在悬浮物中的积累水平达对照培养基VIII的4倍(培养基乂乂￥超过9511^/1，相比之下培养基￥111为2211^/1)。这可能是因为这个培养基中硝酸盐/铵离子的比例较高，并且细胞分裂素与生长素相比过量。用MS盐、30g/L蔗糖和1.5mg/L 2，4_D开发了培养基XXVI。转移在这个培养基中的悬浮培养物显示出较高的原花青素积累，在第13天为培养基VIII的4倍(培养基XXVI为87mg/L，相比之下培养基VIII为22mg/L)。尽管两种培养基之间细胞生长相对而言近似(培养基VIII中61% PCV自(from) 22% PCV，相比之下培养基XXVI中60% PCV至(to) 25%PCV)，但糖的消耗不同，表明细胞会偏好葡萄糖作为碳水化合物源。用大花可可树和Theobroma obovatum进行了类似的研究。细胞培养物生产率随细胞生长的速率和细胞生长停止时的密度而增加。为确定最佳接种密度，将大花可可树和Theobroma obovatum细胞的悬浮培养物以10、15和20% (v/v)的起始细胞密度进行引发并让其生长14天。`一般而言，以较高的密度引发的细胞具有较短的生长周期或者较早地达到最大细胞密度。以10%的细胞密度引发的培养物表现出生长显著迟滞，在14天内没有达到最大密度。以15%和20%的细胞密度引发的培养物在13天内密度翻倍，在14天内达到40-43%的最大细胞密度。这个生长速率比之前对其他植物细胞悬浮培养物(如红豆杉属(Taxussp.))所报道的生长速率慢。但是，可通过进一步优化生长培养基和严格选择细胞(如以下实例6中所描述)来提高可可属细胞培养物的细胞生长。实例6:营养组织衍生的悬浮细胞培养物的细胞生长、细胞选择和培养基优化在培养中每隔七天测量生物量增加量、糖消耗量和原花青素生产率。这些数据对于合乎需要的细胞选择过程是非常重要的。优先基于PCV和糖消耗量测量结果选择生长良好的细胞，然后基于原花青素生产收率从生长良好的细胞系当中挑选产量良好的细胞系。较高的生物量和较高的原花青素生产收率可提高一个批次循环的生产率。新产生的细胞悬浮培养物通常是细胞的不均匀混合物。这个不均匀性在大规模悬浮培养物中导致不平衡的细胞生长和所需代谢产物的不稳定生产模式。可通过分培和选择具有所需特征的培养物，从这些不均匀混合物衍生出适于大规模生产的均匀细胞培养物。开发了选择性且快速的筛选法来检测多酚和细胞生长以协助这个过程。使用实例8中描述的丁醇-HCl水解方法监测多酚积累，并采用细胞密实体积(PCV(% )=细胞体积100/总细胞体积)作为生物量的度量。碳水化合物消耗速率通过折射指数(BriX% )作为细胞代谢的度量来进行测量。营养组织(节)衍生的悬浮培养物如实例2和4中所描述衍自愈伤组织。选择一个生长良好的细胞系(MX1440-3496)并在三种不同的培养基中生长，所述三种不同的培养基在基础培养基的类型(DKW盐对比MS培养基)以及激素的类型和数量方面改变(表I中的培养基ΧΧΧΠ、ΧΧΧΙΙΙ和XXXIV)。培养基XXXII和XXXIV中的细胞密实体积(PCV)在第7天仅仅为33.7±4.7%和25.7±4.0%，显示出生长比培养基XXXIII (47.6±6.6% )要慢。细胞生长速率对于使细胞培养过程中的体积生产率最大化是非常重要的。培养基XXXIII在碳水化合物消耗速率方面也较优，该速率是通过废培养基的折射指数(RI)来测量。将培养基XXXIII中的初始葡萄糖浓度(2% )调整为3%，因为ΜΧ1440-3496细胞系的葡萄糖消耗速率在指数生长期后期放慢。因此，选择培养基XXXV作为ΜΧ1440-3496细胞系的进一步细胞选择过程的维持培养基。
优选在每个分培时间选择生长良好、不成块或者形成聚集体的细小细胞以提高体积生产率和消除聚集的细胞，因为选择大的或者成块的细胞聚集体会导致培养性能不良。因此，选定的细胞具有主要黄颜色的细小细胞形态，并且细小的悬浮培养物导致了更好的生长和均匀悬浮培养物的产生。ΜΧ1440-3496细胞系最初以超过15天的倍增时间生长，而在执行了该细胞选择过程后倍增时间显示出降低到10天。在该细胞选择过程之前总原花青素产生水平最初为0.5g/L PCV，但经过该细胞选择过程提高20.4倍(10.2g/L PCV)(图4)。实例7:从可可属愈伤组织培养物和悬浮培养物提取多酷本实例描述被开发用于从实例1-4中开发的可可属培养物的愈伤组织和悬浮细胞提取多酚的方法。本实例的实验中具体使用可可树的培养物。用1.5ml包含0.1%H2S04的50% (v/v)乙醇从大约0.25±0.04g鲜重的愈伤组织提取多酚，并用1.5ml包含0.1 %H2S04的80% (v/v)甲醇从0.l±0.003g干重的悬浮细胞(无培养基上清液)提取多酚。将细胞放在微量离心管(2.0ml)中并用珠磨匀浆机均质I分钟。将均浆在3500rpm下离心20分钟，仅将上清液转移到另一微量离心管。当需要筛选大量的悬浮细胞培养物时，如下使用更为强大的高通量方法:从待分析的细胞培养物的每个烧瓶取Iml等分试样到96深孔板中。在转移到96深孔板之前还记录样品的细胞密实体积(PCV)。通过将板在台式离心机中在6000rpm下离心4分钟使每个孔中的细胞沉淀。用塑料转移吸管将每个孔的上清液移除并弃去。接着，向每个孔加入0.5ml的提取溶剂(80: 20甲醇:水)和碳化钨小珠，将板放在混合型研磨仪(Mixer Mill)上将细胞在15Hz下研磨2分钟。然后将板转移到离心管，通过在6000rpm下离心4分钟使细胞碎片沉淀。实例8:培养物中的多酚产暈的初步分析用于进行原花青素分析反应的方法被设计成非常近似地模拟原始的Swain和HillisCJ.SC1.Food Agric.(《食品和农业科学杂志》)10:63，1959)方法和Porter等人(Phytochemistry (《植物化学》)，25⑴:223，1986)方法。使用丁醇-HCl提取测定法来测量可可树悬浮细胞的提取物中的多酚。通过将0.1ml的含水甲醇提取物和1.0ml的丁醇-HCl试剂(95: 5v/v)进行组合并将该溶液在Qiagen深孔块(deep well block)(美国加州巴伦西亚)中于75°C下加热60分钟，使多酚水解成(-)_表儿茶素和花青素单体。通过粉红色颜色的形成观察到花青素在水解样品中的存在。测定280和520nm处的吸光度,并使用校准曲线基于所形成的花青素的量计算原花青素含量，所述校准曲线是使用不同浓度的原花青素B2(购自美国加州欧文市Chromadex, Inc.公司)产生。更亮的粉红色表示悬浮培养物中更高浓度的原花青素(图5A)。基于这个方法，几个悬浮培养物的原花青素含量在250mg/L 至 1000mg/L 的范围内。实例9:花衍生的细胞悬浮物的细胞选择和培养基优化过程在培养中每隔七天测量生物质增加量、糖消耗量和原花青素生产率。这些数据对于合乎需要的细胞选择过程是非常重要的。优先基于PCV和糖消耗量测量结果选择生长良好的细胞，然后基于原花青素生产收率从生长良好的细胞系当中挑选产量良好的细胞系。较高的生物质和较高的原花青素生产收率可提高一个批次循环的生产率。该细胞选择过程之前的平均原花青素生产率为52mg原花青素/L培养物，在一年的该细胞选择过程后提升到251mg/L的水平，达到的最高水平为1600mg原花青素/L培养物(图2C)。最高生产收率也提高到超过5000mg/L PCV (图2D)。使用B5主要盐和MS次要盐开发培养基XXV，从而与培养基VIII的平常维持培养基相比降低铵离子在培养基中的浓度。碳水化合物源为60g/L蔗糖，激素为0.lmg/LNAA和0.2mg/L激动素，相·比于2mg/L 2，4-D和0.005mg/L TDZ0在2个星期的时间里，在培养基XXV中测试的悬浮物没有显示生长，但原花青素在悬浮物中的积累水平达对照培养基VIII的4倍(培养基乂乂￥超过9511^/1，相比之下培养基￥111为2211^/1)。这可能是因为这个培养基中硝酸盐/铵离子的比例较高，并且细胞分裂素与生长素相比过量。用MS盐、30g/L蔗糖和1.5mg/L 2，4_D开发了培养基XXVI。转移在这个培养基中的悬浮培养物显示出较高的原花青素积累，在第13天为培养基VIII的4倍(培养基XXVI为87mg/L，相比之下培养基VIII为22mg/L)。尽管两种培养基之间细胞生长相对而言近似(培养基VIII中61% PCV自22% PCV，相比之下培养基XXVI中60% PCV至25% PCV)，但糖的消耗不同，表明细胞会偏好葡萄糖作为碳水化合物源(图2E)。实例10:添加葡萄糖以提升生产率本实例描述用于通过补加葡萄糖提高可可悬浮培养物的原花青素生产率的方案的开发。通过将培养基从生长培养基改变成生产培养基诱导了植物次级代谢产物产生。对于生产培养基的优化，碳水化合物源或者氮源都可认为是关键因素。在指数生长期结束时使用葡萄糖形式的额外碳水化合物，以提高来自花组织和营养组织衍生的悬浮培养物的原
花青素产量。通过添加葡萄糖，从花组织衍生的悬浮细胞系(MX1241-58)获得了原花青素生产率的显著提升。将培养物在培养基XXXII中在实例5描述的正常培养条件下正常维持7天。在第7天在添加葡萄糖之前获取MX1241-58细胞培养物样品，其PCV和RI平均为49.5±3.5%和0.2。平均原花青素生产水平为189.5±17.7mg/L PCV。在第7天，将5ml的50%葡萄糖储备溶液添加到悬浮培养物以调整RI至超过3%，并且随后在培养基中葡萄糖浓度低于0.5%时重复操作。添加葡萄糖后，用手剧烈摇动烧瓶中的培养物大约10秒钟以使悬浮物中的浓缩葡萄糖分散，并再次测量RI，平均值为3。在不同的培养日(在第
7、11、16和21日)添加葡萄糖3-4次并添加新鲜培养基一次(第25天)后，原花青素生产水平提高到最高达4.4g/L PCV，这比其初始值高24倍，并且PCV从49.5 ±3.5%提高到
69.0±1.4%。对细胞系MX1440_3496(实例6中描述)实施了类似的处理以改进其生产水平。这个实验被设计用来测试该细胞系对添加葡萄糖的响应。如实例6中所述，将MX1440-4496细胞系维持在培养基XXXIII中。在第6天，随机挑选MX1440-3496细胞系的6个烧瓶并分成两组，每组三个烧瓶。一组三个烧瓶用50%葡萄糖储备溶液处理，另一组3个烧瓶不进行处理。在第6天所有六个烧瓶添加葡萄糖之前的测量值平均为:PCV45%，R10.3±0.1，原花青素产量2.41±0.19g/L PCV。将5ml的50%葡萄糖储备溶液添加到三个处理的烧瓶。在添加葡萄糖后，处理的烧瓶的平均RI增加至IJ 6.0 ± 1.1，平均PCV为39.7 ± 0.6 %。在添加葡萄糖后第1、3、4、5和6天对所有烧瓶取样并测量它们的PCV、RI和原花青素产量。未处理的烧瓶显示出RI无显著变化，PCV从45%稍微增加到53±3.6%。在处理后第6天，它们的产量保持在2.83± 1.17g/L PCV。相反，处理的烧瓶显示出在第6天PCV增加到53 ±2.7 %，稳定地提高。RI每天以0.6-0.8个RI单位的速率显著下跌，从第O天的6±1.1跌至第6天的2.0± 1.3。同时，它们的产量也从添加葡萄糖之前的2.42± 1.93g/LPCV提高到第5天的12.93±2.24g/L PCV。葡萄糖处理导致了原花青素产量提高，这些生产特征代表了原花青素生产的细胞培养过程的显著改进，如图5A中所示。同时，通过添加3%、5%和6 %的葡萄糖，从MX1440-3496细胞系获得了原花青素生产率的改进。这个实验被设计用来测试该细胞系对添加葡萄糖的响应。如实例6中所述，将MX1440-4496细胞系维持在培养基XXXV中。在第4天，随机挑选MX1440-3496细胞系的12个烧瓶并分成四组，每组三个烧瓶。三个组用不同浓度(培养基的体积的3%、5%和6% )的葡萄糖处理，第四组不进行处理。使用折射计检查每个烧瓶中的葡萄糖浓度以核实RI是否分别为3、5和6。在第4天所有六个烧瓶添加葡萄糖之前的测量值平均为:PCV45%，RI0.7±0.1，原花青素产量13.5± 1.0g/L PCV。在添加葡萄糖后第3、6、8和9天对所有烧瓶取样并测量它们的PCV、RI和原花青素产量。未处理的烧瓶显示出RI无显著变化，PCV稍微增加。在处理后第9天，它们的产量保持在12.8±3.lg/L PCV。相反，处理的烧瓶显示出RI每天以
0.7个RI单位的速率显著下跌，在第9天跌至0.07± 1.3。同时，它们的产量也稳定地提高，尤其是6%处理组显示出猛烈的提高，从添加葡萄糖之前的13.5±1.0g/L PCV提高到处理后第9天的40.6±4.12g/L PCV。葡萄糖处理导致了原花青素产量提高，这些生产特征代表了原花青素生产的细胞培养过程的显著改进，如图5B中所示。另一个提升悬浮培养物中的原花青素产量的方法是反复诱导。在第7和第13天，向培养基添加葡萄糖，它们的RI增加到最高达6% Brix。该反复诱导使悬浮细胞稳定地产生原花青素化合物。在第一次诱导之前，原花青素产量为3.2±0.lg/L PCV，但在第13天被提高到12.6±1.3g/L PCV，在第20天到29.5±2.8g/L PCV。葡萄糖的反复添加提供了提高可可悬 浮细胞培养物的原花青素产量的简单有效的方法，如图6中显示，其中箭头显示给予葡萄糖。
在每个分培时间进行的反复细胞选择收集了生长良好和产量良好的细胞，然后从第4 5天培养基XXXV中的初始3%葡萄糖浓度变得有限。这对细胞提供非常严酷的应激，它们在悬浮培养物中开始变得更加聚集。通常，聚集会成为工艺放大到大规模生产系统的障碍。因此，将3%的初始葡萄糖浓度增加到4% (培养基XXXVII)以不产生任何来自碳水化合物限制的应激。这个4%葡萄糖浓度使细胞系的维持更加稳定，在烧瓶悬浮培养物以及生物反应器培养物中没有聚集现象。
_7] 实例11:在无激素培养基中培养细胞并对这些细胞进行i秀导本实例描述连续2个星期在无激素的培养基中生长细胞并产生原花青素。将通过实例2和4中的方法产生的细胞在培养基XXXVI (表I)中连续培养2个星期。这个培养基无激素添加到基础培养基即培养基XXXV (表I)。初始接种物设定为25%。让细胞在无激素培养基中生长7天，然后在无激素培养基中第二次分培又是7天时间。在转移到新鲜培养基中的第6天记录生长和生产数据。发现细胞的生长从45-50% %降低到35-40%，降低了 10-15%。但是，每升PCV的产量与对照细胞相比增加了 2.5-3倍。总体积生产率为对照细胞的约2-2.5倍。这表明了从培养物移除激素后维持生产率的能力，如图7A中所示。这在加工方面是一个重要成就，因为从监管的观点看，从最终数个星期的生产中移除激素是一个重大优势。测试了生长中的细胞在无激素培养基中在葡萄糖诱导下的协同作用的可行性。使细胞在无激素培养基TC3015中生长I个星期。在培养的第7天，对照细胞和经处理的细胞的RI均从初始值3.0变成在0-0.6之间。在这个时间，给予细胞6%葡萄糖并让其再生长7天。在诱导的第O天和第7天取样。发现激素的移除和葡萄糖的诱导存在累加作用。在仅进行诱导处理的对照细胞中每升PCV的产量增加约2.5倍，而在同时用无激素培养基和添加诱导剂(如葡萄糖)处理的细胞中该变化倍数为约4倍。激素的移除增加了产量近2倍，然后在对这些细胞进行诱导后发现又增加2倍，因此这两种处理一起存在明显的累加作用(图7B)。
实例12:从新鲜的可可细胞或者经研磨的冻干细胞小规模提取多酷取无培养基的可可细胞样品(0.5ml)或者50mg经研磨的可可细胞样品，放在96孔板(凯杰公司(Qiagen，Inc))中的2.0ml微管或者1.2ml管中。向每种可可细胞加入适当体积的酸性(0-2%的柠檬酸、乙酸或者抗坏血酸)含水提取溶剂(30-80%的丙酮、乙醇、甲醇)，然后放入超声发生器或者BeadMill中以提取原花青素。将样品在6000rpm(RCF5996)下离心4分钟。使上清液滤过0.45um膜过滤器，并在分析前用相同的含水提取溶剂稀释10倍(如需要)。剩余的提取物保藏于-20度的冷冻机中以供进一步分析。图12示出得自各个溶剂系统的结果。
_2] 实例13:来自可可树愈伤组织和悬浮细胞的多酚的分析。用于进行原花青素分析反应的方法被设计成模拟原始的Swain和HillisCJ.SC1.Food Agric.(《食品和农业科学杂志》)，10:63，1959)方法和Porter等人(Phytochemistry (《植物化学》)，25 (I) =223,1986)方法。使用丁醇-HCl水解测定法来测量可可树细胞的提取物中的原花青素。通过将0.1ml的含水乙醇、甲醇或者丙酮提取物和
1.0ml的丁醇-盐酸试剂(95: 5v/v)进行组合并将该溶液在Qiagen深孔块(美国加州巴伦西亚)中于75 °C下加热60分钟，使原花青素水解成(-)_表儿茶素和花青素单体。通过红色颜色的形成观察到花青素在水解样品中的存在。以分光光度法测定280和520nm处的吸光度，并使用校准曲线基于所形成的花青素的量计算原花青素含量，所述校准曲线是使用不同浓度的原花青素B2(购自美国加州欧文市Chromadex, Inc.公司)产生。更深的红色颜色表示愈伤组织或者悬浮培养物中更高浓度的原花青素(图8A-8C)。使用Waters(美国马萨诸塞州米尔福德市)Alliance HPLC系统对可可树细胞提取物进行LC分析,该系统装配有CTC Analytics PAL自动进样器(Leap Technologies公司，美国北卡罗来纳州卡勃罗市(Carrboro))、带600S控制器的Waters 626泵和从190-780nm扫描的Waters 2996光电二极管阵列检测器(PDA)。用水-0.1%甲酸(溶剂A)和乙腈-0.1%甲酸(溶剂B)以0.3ml/分钟的恒定流速进行梯度洗脱。以溶剂B的以下比例(vlv)施加线性梯度(t (min)，％ B): (0，7)、(5，15)、(20，75)、(25，100)、(35，100)、(35.1,7) (45，7)。柱子为 UltraAqueous C18 柱(100X2.1mm 内径，3.5 μ m) (Restek 公司，美国宾夕法尼亚州贝尔丰特(Bellefonte))。于280nm处监测原花青素单体(+)-儿茶素、(-)_表儿茶素和低聚原花青素(二聚体至六聚体)。使用Waters Quattro Micro三重四级杆质量检测器(美国马萨诸塞州米尔福德市)获取MS数据，并通过MassLynx 软件进行分析。从m/z 150到1800扫描，进行全扫描数据采集。儿茶素、表儿茶素的真实标准品购自西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich, Inc.)(美国密苏里州圣路易斯)，制备稀释液来产生校准曲线以检测和定量代谢物。(图9A至9C)。使用 Folin- Ciocalteau 测定法(waterhouse.ucdavis.edu/phenol/folinmicro网站；以及 Slinkard, K.；Singleton, V.L.Total Phenol Analysis !Automation andComparison with Manual Methods (总酌.分析:用手工方法进行自动化和比较).AmericanJournal of Enology and Viticulture (《美国葡萄酒酿造学和葡萄栽培杂志》)，1977, 28:49-55)，测量细胞提取物的总多酚含量。如下对实例9中所描述的细胞培养物提取物进行总多酚含量分析:取20 μ I提取物，将其加到1.58ml的水和100 μ I的Folin-Ciocalteau试剂。然后通过加入300 μ I碳酸钠溶液终止反应。所得的溶液在765nm处测量，并与通过相同测定法测量的没食子酸溶液的多个稀释液的校准曲线进行比较，以测定细胞提取物中的总多酚的浓度。通过正相HPLC系统进行可定量的原花青素的分析，该系统由Waters 2795分离模块、Waters 996 PDA检测器和Waters 474扫描荧光检测器组成。使用DevelosilDiol (250X4.6mm内径,5 μ粒度),按改编自Kelm等人,“用于分析、分离和离析极性质子单体和/或低聚体的改进方法”(美国专利第0075020号)的方法，获得可可细胞提取物中原花青素的表征和分离条件。二元流动相由溶剂(A)乙腈:乙酸(98: 2，v/v)和溶剂(B)甲醇:水:乙酸(95: 3: 2，v/v/v)组成。用0.8ml/min流速在30°C下如下进行线性梯度洗脱:0-35min, 100-60% A ；35-40min, 60 % A ；40-45min, 60-100 % A。通过荧光检测(276nm激发波长，316nm发射波长)、280nm紫外检测，监测原花青素低聚体的分离(图1OA) ο (Lazarus 等人，J.Agric.Food Chem (《农业和食品化学杂志》).47 (1999), 3693)和PDA (图 10B)。该分析方法的目的是定量新鲜可可细胞或者冻干细胞中的十种不同的单独原花青素的量。可定量的原花青素有单体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体和十聚体。
通过在Empower 2上执行内部HPLC方法，对从新鲜可可细胞、冻干可可细胞和可可细胞提取物制备的样品进行原花青素定量分析。使用公司内的标准储备溶液来制备低聚原花青素的校准曲线。使用公司内的纯化的标准化合物，以20、40、80和100ug/ml的系列稀释度制备一组标准品。这些标准品校准曲线是对10种目标化合物(单体到十聚体)进行定量的基础。实例14:可可碱和咖啡闵的分析使用LC/MS分析方法，分别测定出可可碱和咖啡因(各粒脱脂可可树种子中的主要生物碱)的含量为25.2mg/g干重和4.6mg/g干重。相反，可可悬浮细胞不产生可测量的咖啡因(图9C和9F)或者可可碱(图9B和9E)，而它们产生的儿茶素和表儿茶素含量与种子相当(图9A和9D)。可可碱和咖啡因的真实标准品购自西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich, Inc.)(美国密苏里州圣路易斯)，制备稀释液来产生校准曲线以检测和定量这些代谢物。这些结果证明植物细胞培养物可产生高浓度的目的化合物，而不需要的化合物的污染极少。可可碱和咖啡因的定量也是在由Waters 996 PDA检测器组成的Waters2795分离模块(美国马萨诸塞州米尔福德市)上进行。按改编自Kelm等人(J.Agric.Food Chem.(《农业和食品化学杂志》)，2006，54，1571)的方法，在Develosil Diol (250 X 4.6mm内径，5 μ粒度，菲罗门公司(Phenomenex),美国加州托兰斯市)上使用280nm紫外,进行可可细胞提取物中的咖啡因和可可碱的分离。二元流动相由溶剂(A)乙腈:乙酸(98: 2，v/v)和溶剂(B)甲醇:水:乙酸(95: 3: 2, v/v/v)组成。用0.8ml/min流速在3(TC下如下进行线性梯度洗脱:0-35min，100-60% A ；35-40min, 60% A ；40-45min, 60-100% A。分别采用1、10、20、50、100、200和500呢/1^的系列稀释度，制备咖啡因(西格玛奥德里奇公司，美国密苏里州圣路易斯)和可可碱(西格玛奥德里奇公司，美国密苏里州圣路易斯)的标准储备溶液。按照上文实例#对可可悬浮细胞和实例#对未发酵可可豆所描述，一式两份制备样品。所有样品经0.45um膜过滤器过滤后注射到HPLC模块中。表3显示样品中的咖啡因和可可碱的测定值。可可细胞提取物中的咖啡因和可可碱分别测定出在0.27 0.49ug/mg的范围内和在0.32 0.73ug/mg的范围内，未发酵可可豆提取物中的咖啡因和可可碱分别测定出为14.lug/mg和49.3ug/mg。根据对数据的分析,可可细胞较之未发酵可可豆提取物实质上不含咖啡因和可可碱(图11)。因此，当咖啡因和可可碱分别小于约0.5ug/mg和0.75ug/mg时，提取物组成可被认为实质上是不含黄嘌呤生物碱的。实例15:可可悬浮培养物的放大使用植物细胞培养物的一个普遍问题是获得目标产物的持续产生(Kim等人，Biotechnol Prog.(《生物技术进展》)，20 (6) 1666，2004)。因此，成功的大规模植物细胞培养的一个关键是维持稳定的生产率。成功进行了将可可细胞悬浮培养从125ml烧瓶放大到500ml烧瓶的工艺，因为在放大条件下可可细胞生长和产量十分一致和稳定。选定的细胞系的平均PCV七天达45 55%，这比20%的初始PCV水平高大约2.5倍。在旋转振荡器上在维持培养基即培养基VIII中进行更大规模的培养物的生长，对于125ml和500ml三角烧瓶旋转速度为I IOrpm,对于2800ml Fernbach烧瓶旋转速度为50rpm,均在黑暗条件下进行。在培养中每隔七天，测量生物量、培养基中糖浓度和原花青素生产率。
将2.7L的可可细胞接种到6.5L生物反应器(工作体积=5.0L)中，并在0.2vvm(气体体积/体积培养物/分钟)的空气流速、IOOrpm搅拌速度和23°C容器温度下培养七天。生物量增加得十分缓慢，迟滞期持续四天。高的接种体积对于细胞而言是一个问题，因为这会限制营养物可得性，并且使得难以均匀混合细胞。理想的是，起始接种物体积应在25-40% PCV之间。影响生物量浓度和比生产率重要因素之一，是溶氧(DO)浓度和溶解气态代谢物如 C02 的气体交换(Dicosmo&Misawa, “Plant Cell Culture SecondaryMetabolism”(植物细胞培养物次级代谢)，1996，第44页)。在烧瓶培养物中，不可能控制溶氧和气态代谢物，但在反应器培养物中控制它们是可行的。在本实例中，DO水平逐渐下降，这是细胞代谢的良好指标。实例16:从悬浮细胞培养物进行大规模分离将从IL的可可悬浮细胞回收的生物量作为新鲜细胞使用或者用Labconco冷冻干燥器进行冻干以得到75.0g的干燥可可细胞。使用振荡器，在0-80°C下，将新鲜细胞或者干燥可可细胞粉用IL的含0.1% -2%抗坏血酸、乙酸、柠檬酸的H20或者IL的含水溶剂(30、40、50、60、70、80% 的丙酮、30、40、50、60、70、80% 的甲醇或者 30、40、50、60、70、80% 的乙醇，在0.1% -2%抗坏血酸、乙酸、柠檬酸存在下)提取I小时，进行两次。将提取溶液用布氏漏斗进行过滤，或者进行离心。将滤液或者上清液组合在一起，然后用旋转蒸发仪在部分真空下于40°C蒸发至300ml的最终体积。将浓缩的含水残余物在_20°C下冷冻，并使用Laboconco冷冻干燥器进行干燥以得到亮黄色的粗提取物。通过实例10中的HPLC定量方法测定来自干燥可可细胞重量的粗原花青素的产率，在10-15%之间。将从IOL的可可悬浮细胞培养物回收的冻干生物量与80%甲醇以生物量体积的I: I比例进行混合，并在室温下搅拌I小时。将此混合物在布氏漏斗中经滤纸真空过滤。反复进行提取至少三次。收集每个甲醇提取物，集中在一起并在减压下于40°C进行浓缩，以将甲醇提取物的体积减少至初始体积的30%。将浓缩的甲醇提取物加到二氯甲烷中进行液-液提取，收集二氯甲烷层提 取物，集中在一起并在减压下和室温下以25%比例浓缩。将干燥的提取物溶于甲醇中，滴入蒸馏水中，在0°C下静置两天以获得沉淀物。从干燥细胞得到的纯化前的原花青素的实际收率在10 20%之间，纯度为50 60%。为有效去除杂质，使用C18柱和二氧化硅柱通过Waters pr印-LC(美国马萨诸塞州米尔福德市)进行进一步的纯化，在该prep-LC纯化过程后纯度将提高到超过99%。为获得高纯度的原花青素目标化合物，可进行额外的结晶过程。实例17:从可可树和可可豆的细胞培养物产生的多酚和原花青素的比较。从悬浮培养物提取耜.原花色式将从IL的可可树悬浮细胞培养物回收的生物量用Labconco冷冻干燥器进行冻干以得到14.0g的干燥可可细胞。将干燥粉用250ml的混合含水丙酮(70% v/v)提取30分钟。将含水溶液在3500rpm下离心15分钟，除去上清液。固体残余物以相同的方式再提取一次。将来自两次提取的上清液组合在一起，然后用旋转蒸发仪在减压下40°C蒸发。将浓缩的含水残余物在_20°C下冷冻，并用Laboconco冷冻干燥器进行干燥以得到浓稠黄色的粗提取物。通过实例8中描述的酸丁醇水解方法测定来自干燥细胞重量的粗原花青素的收率，在10-15%之间。从非发酵的生可可豆提取粗原花色甙未发酵的生可可豆获自Raw Harmony (美国加州洛杉矶市)。从5g研磨的干燥非发酵豆或者研磨的脱脂非发酵可可豆提取原花青素。提取程序与上述的悬浮细胞培养物所用的程序相似，例外的是每个提取步骤使用50ml的含水丙酮(70% v/v)，并且重复提取三次。将提取物组合并在3500rpm下离心15分钟。轻轻倒出上清液，然后在部分真空下40°C蒸发以除去溶剂。将浓缩的含水残余物在_20°C下冷冻，并用Laboconco冷冻干燥器进行干燥以得到微红色-紫色的粗提取物。通过实例8中描述的酸丁醇水解测定法估计的粗原花青素的收率在10-13%之间。原花肓素的高效液相色谱(HPLC)分析
通过正相HPLC系统进行原花青素的HPLC分析，该系统由Waters 2795分离模块、Waters 996 PDA检测器和Waters 474扫描荧光检测器组成。使用Develosil Diol柱(250X4.6mm内径，5 μ粒度)，按改编自Kelm等人(美国专利申请N0.2007075020，描述了用于极性质子单体和/或低聚体的改进方法)的方法，获得可可树细胞提取物和生可可豆提取物中原花青素的表征和分离条件。二元流动相由溶剂(A)乙腈:乙酸(98: 2，V/ν)和溶剂⑶甲醇:水:乙酸(95: 3: 2, v/v/v)组成。用0.8ml/min流速在30°C下如下进行线性梯度洗脱:0-35分钟，100-60% A ；35-40分钟，60% A ；40-45分钟，60-100% A。通过荧光检测(276nm激发波长，316nm发射波长)、280nm紫外检测，监测原花青素的分离。(Lazarus 等人，J.Agric.Food Chem.(《农业和食品化学杂志》),47:3693,1999)。图8显示由荧光检测器得到的未发酵可可豆提取物的色谱图(图8A)和可可树细胞悬浮提取物的色谱图(图8B)。与Kelm等人(美国专利申请N0.2007075020)描述的色谱分离一致，未发酵的可可豆提取物的组成最高至十二聚体(聚合度=12)。本实例证实，来自可可树的细胞培养物的原花青素提取物也具有与对可可豆所报道的组成(profile)相同的组成。图9显示未发酵可可豆提取物的紫外吸光度色谱图(图9A)和可可树细胞培养物提取物的紫外吸光度色谱图(图9B)。这个检测模式使得可以检测咖啡因和可可碱，并且这个实验的结果证明虽然来自可可豆的提取物显示在提取物中存在这两种化合物，但它们在细胞培养物的提取物中没有检测到。因此，这个实例证实，可可树的细胞培养物能够产生与可可豆相同的原花青素，同时它们不产生不合需要的化合物即咖啡因和可可碱。此外，本文对细胞提取物所描述的提取程序不需要使用溶剂如己烷，而对可可豆进行脱脂会需要这种溶剂。因此，衍自可可树的细胞培养物的原花青素提取物不会有毒性溶剂如己烷的残留物。实例18:来自可可细胞悬浮培养物的原花青素提取物的抗氧化活性。本实例描述测试从通过以上各实例中描述的方法培养的可可细胞提取的原花青素的抗氧化活性的手段。文献中的证据提示了可可原花青素的促健康性质和这些化合物的抗氧化性质之间的关系。一般认为，这些抗氧化剂影响与心血管疾病中一些类型的肿瘤促进和LDL氧化有关联的某些氧化过程和自由基过程。因此，测量可可原花青素的抗氧化潜力，是测定这些化合物在预防人类疾病(如癌症和心脏疾病)中的有效性的合理手段，以使得这些化合物能够在具有促健康性质的组合物中使用。类似地，抗氧化剂据认为有助于使皮肤保持更年轻的外观，皱纹更少，因此可可原花青素可用于化妆品组合物中。通过多种本领域知道的程序测量多酚化合物如可可原花青素的抗氧化能力。最通用的方法是氧自由基吸收能力(ORAC)方法(Cao G, Alessio H, Cutler R(1993)。“Oxygen-radical absorbance capacity assay for antioxidants，，( “抗氧化剂的氧自由基吸收能力测定法”)，Free Radic Biol Med(《自由基生物医学》)，14 (3):303-11) 0该测定法测量荧光分子(β_藻红蛋白或者荧光素)与自由基产生剂如偶氮引发剂化合物混合后的氧化降解。偶氮引发剂据认为能通过加热产生过氧化氢自由基，后者破坏该荧光分子，导致丧失荧光。抗氧化剂能够保护该荧光分子免受氧化变性。保护的程度将使用荧光计进行定量。荧光素目前最常用作荧光探针。可自动测量和计算该能力的设备可市售获得(Biotek 公司，Roche Diagnostics 公司)。荧光强度随着氧化变性的进行而降低，并且这个强度通常在添加偶氮引发剂(自由基产生剂)后记录到35分钟。作为荧光衰减进行测量的荧光素变性(或者分解)因抗氧化剂的存在而变得不那么显著。记录衰减曲线(荧光强度对时间)并计算两条衰减曲线(有或无抗氧化剂)之间的面积。随后，使用抗氧化剂trolox (—种维生素E类似物)作为标准品定量抗氧化剂介导的保护的程度。使用不同浓度的trolox来制作标准曲线，并将试验样品与这进行比较。试验样品(食品)的结果以“trolox当量”或者TE报告。实例19:使用有机溶剂提取可可细胞中原花青素的效率在本实例中，研究了从各种含水溶剂提取原花青素的有效性。将溶剂在各种含水条件下使用(30、40、50、60、70、80%的丙酮，30、40、50、60、70、80%的甲醇或者 30、40、50、60、70、80%的乙醇，在乙酸存在下，pH在约3.0-6.0的范围)。对提取物进行分析以比较不同条件下的提取效率。提取物如实例9中所描述从研磨的可可细胞制备。将50mg或者Ig的研磨可可细胞用于使用溶剂一式三份提取低聚原花青素。通过实例14中描述的HPLC分析方法，测定提取物中各种原花青素(单体至十聚体)的量。从结果得知，80%乙醇溶剂是不如其他溶剂有效的提取系统。对于所有的低聚原花青素，50、60、70%乙醇和70%丙酮最为有效。在这个研究中，结果表明对于总体低聚原花青素来说，60%乙醇是最强效的提取溶剂(图12A)。60%乙醇比70%丙酮优先提取总体原花青素(单体至十聚体)(图12B，图12C)。与从可可细胞提取相反，已报道酸化的70%丙酮对于从脱脂可可固形物提取低聚原花青素最为有效(美国专利N0 .6627232)。实例20:二聚原花青素在酸性和中性条件下的稳定性测试对于原花青素稳定性，已报道酸化的70%丙酮为最有效的溶剂(Rohr, G.E.；Meier, B.；Sticher, 0., Analysis of procyanidins (原花青素的分析)，载于 Studiesin Natural products Chemistry (《天然产物化学研究》)，第 21 卷，Bioactive NaturalProducts (Part B)(生物活性天然产物(B 部分)),Attu-ur-Rahman ；Elsevier 出版社；荷兰阿姆斯特丹，2000 ;第497-570页)。二聚原花青素的稳定性在酸性和中性70%丙酮溶剂下进行。从纯化的二聚原花青素制备样品5ug/mL，并在室温下保持O小时至23小时。使用荧光检测器在275nm激发和316nm发射下检测二聚原花青素。使用的色谱条件与上述的条件相同。图14A-14B显示在23小时后，中性70%丙酮中的二聚原花青素(图14A)显示出显著的降解。但是，酸化的70%丙酮中的二聚原花青素(图14B)保持高度稳定。实例21:用于可可细胞悬浮物的放大的充气条件溶解的气体对于植物细胞培养物中的初级和次级产物形成起到重要作用。在本实例中，证明了充气策略的有效性，通过该充气策略将气态氧补充到入口气体混合物以提升生物反应器中生长的可可细胞中的多酚。在7.5L机械搅拌的生物反应器中接种0.875L的可可细胞(工作体积=3.5L)，并在0.1vvm(气体体积/培养物体积/分钟)的气体(仅空气)流速、IOOrpm搅拌速度和26°C容器温度下培养七天时间，然后在葡萄糖引发剂存在下培养10天时间。将平行的生物反应器如上进行处理，不过气体方案由向培养基补加氧组成，导致了每单位细胞密实体积的多酚终浓度与仅用空气处理的在生物反应器中生长的细胞相比提高3.1倍。在仅有空气的处理中最终生产收率为9.4克原花青素/PCV，而在补加氧的处理中为29.2克原花青素/PCV。表1:培养某1-XXXVI的鉬成(储备溶液的配方在表2中提供。
权利要求
1.一种制备可可低聚原花青素的方法，所述方法包括: 以足以导致以第一速率产生可可低聚原花青素的时间和条件培养细胞；以及以足以诱导所述细胞以高于所述第一速率的第二速率产生所述可可低聚原花青素的量向所述细胞引入单糖。
2.根据权利要求2所述的方法，还包括从所述细胞提取所述可可低聚原花青素。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述单糖为葡萄糖。
4.根据权利要求1所述的方法，其中在指数生长状态最后阶段期间或之后引入所述单糖。
5.根据权利要求1所述的方法，其中在无激素培养基中培养所述培养物。
6.根据权利要求2所述的方法，其中在引入所述单糖后I至21天进行所述提取。
7.根据权利要求1所述的方法，其中为了稳定细胞系维持、诱导过量产生以及防止细胞聚集，所述单糖以所述培养基的约0.5体积％至约20体积％的量引入。
8.根据权利要求1所述的方法，还包括用乙醇提取溶液从所述细胞培养物提取所述可可低聚原花青素。
9.根据权利要求8所述的方法，其中乙醇提取溶液是含水的。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述乙醇提取溶液没有有机溶剂。
11.根据权利要求1所述的方法，还包括用酸性提取溶液从所述细胞培养物提取所述可可低聚原花青素。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述酸性提取溶液的pH为约3至约6。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述酸性提取溶液包括乙酸、柠檬酸或抗坏血酸。
14.根据权利要求2所述的方法，其中所述提取物基本上没有黄嘌呤生物碱。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法没有脱脂步骤。
16.根据权利要求1所述的方法，还包括以下中的一者或多者: 收获所述细胞； 在适于提取多酚富集级分的溶剂中均质化细胞生物质； 使用溶剂-溶剂提取和/或色谱来分离原花青素富集级分；或者 干燥或浓缩所述原花青素级分。
17.根据权利要求1所述的方法，还包括以下中的一者或多者: 在固体生长培养基上培养可可属物种(Theobroma sp.)愈伤组织细胞； 从可可树(Theobroma cacao)愈伤组织培养物选择快速生长的细胞系；或者 通过将所述快速生长的细胞系接种进液体培养基中引发可可属物种细胞悬浮培养。
18.一种制备可可低聚原花青素的方法，所述方法包括: 以足以导致以第一速率产生可可低聚原花青素的时间和条件培养细胞；以及在无激素培养基中以及在足以诱导所述细胞以高于所述第一速率的第二速率产生所述可可低聚原花青素的条件下培养所述细胞。
19.根据权利要求18所述的方法，还包括从所述细胞提取所述可可低聚原花青素。
20.根据权利要求18所述的方法，还包括将单糖以足以诱导所述细胞以高于所述第二速率的第三速率产生所述可可低聚原花青素的量引入所述无激素培养基中的所述细胞。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述单糖为葡萄糖。
22.根据权利要求20所述的方法，其中在指数生长状态最后阶段期间或之后引入所述单糖。
23.根据权利要求20所述的方法，其中所述单糖以所述培养基的约0.5体积％至约20体积％的量引入。
24.根据权利要求19所述的方法，其中在所述无激素培养基中引发培养后I天至21天之间进行所述提取。
25.根据权利要求18所述的方法，还包括用乙醇提取溶液从所述细胞培养物提取所述可可低聚原花青素。
26.根据权利要求25所述的方法，其中乙醇提取溶液是含水的。
27.根据权利要求25所述的方法，其中所述乙醇提取溶液没有有机溶剂。
28.根据权利要求18所述的方法，还包括用酸性提取溶液从所述细胞培养物提取所述可可低聚原花青素。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述酸性提取溶液的pH为约3至约6。
30.根据权利要求28所述的方法，其中所述酸性提取溶液包括乙酸、柠檬酸或抗坏血酸。
31.根据权利要求19所述的方法，其中所述提取物基本上没有黄嘌呤生物碱。
32.根据权利要求18所述的方法，其中所述方法没有脱脂步骤。
33.根据权利要求18所述的方法，还包括以下中的一者或多者: 收获所述细胞； 在适于提取多酚富集级分的溶剂中均质化细胞生物质； 使用溶剂-溶剂提取和/或色谱分离原花青素富集级分；或者 干燥或浓缩所述原花青素级分。
34.根据权利要求18所述的方法，还包括以下中的一者或多者: 在固体生长培养基上培养可可属物种愈伤组织细胞； 从可可树愈伤组织培养物选择快速生长的细胞系；或者 通过将所述快速生长的细胞系接种进液体培养基中引发可可属物种细胞悬浮培养。
35.一种制备可可低聚原花青素的方法，所述方法包括: 在无激素培养基中以及 在足以诱导所述细胞以第一速率产生所述可可低聚原花青素的条件下培养细胞；以及 将单糖以足以诱导所述细胞以高于所述第一速率的第二速率产生所述可可低聚原花青素的量引入所述无激素培养基中的所述细胞。
36.根据权利要求35所述的方法，还包括从所述细胞提取所述可可低聚原花青素。
37.根据权利要求35所述的方法，其中所述单糖为葡萄糖。
38.根据权利要求35所述的方法，其中在指数生长状态最后阶段期间或之后引入所述单糖。
39.根据权利要求35所述的方法，其中单糖以所述培养基的约0.5体积％至约20体积％的量引入。
40.根据权利要求36所述的方法，其中在所述无激素培养基中引发培养后I天至21天之间进行所述提取。
41.根据权利要求35所述的方法，还包括用乙醇提取溶液从所述细胞培养物提取所述可可低聚原花青素。
42.根据权利要求41所述的方法，其中乙醇提取溶液是含水的。
43.根据权利要求41所述的方法，其中所述乙醇提取溶液没有有机溶剂。
44.根据权利要求35所述的方法，还包括用酸性提取溶液从所述细胞培养物提取所述可可低聚原花青素。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述酸性提取溶液的pH为约3至约6。
46.根据权利要求44所述的方法，其中所述酸性提取溶液包括乙酸、柠檬酸或抗坏血酸。
47.根据权利要求36所述的方法，其中所述提取物基本上没有黄嘌呤生物碱。
48.根据权利要求35所述的方法，其中所述方法没有脱脂步骤。
49.根据权利要求35所述的方法，还包括以下中的一者或多者: 收获所述细胞； 在适于提取多酚富集级分的溶剂中均质化细胞生物质； 使用溶剂-溶剂提取和/或色谱分离原花青素富集级分；或者 干燥或浓缩所述原花青素级分。
50.根据权利要求 35所述的方法，还包括以下中的一者或多者: 在固体生长培养基上培养可可属物种愈伤组织细胞； 从可可树愈伤组织培养物选择快速生长的细胞系；或者 通过将所述快速生长的细胞系接种进液体培养基中引发可可属物种细胞悬浮培养。
51.一种制备可可低聚原花青素的方法，所述方法包括: 以足以导致产生可可低聚原花青素的时间和条件培养细胞；以及 用乙醇提取溶液从所述细胞提取所述可可低聚原花青素。
52.根据权利要求51所述的方法，还包括将单糖引入培养中的所述细胞以便增加所述可可低聚原花青素的产量。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述单糖为葡萄糖。
54.根据权利要求52所述的方法，其中在指数生长状态最后阶段期间或之后引入所述单糖。
55.根据权利要求51所述的方法，其中在无激素培养基中培养所述悬浮培养物。
56.根据权利要求51所述的方法，其中在将单糖或无激素培养基引入培养中的所述细胞后I天至21天之间进行所述提取。
57.根据权利要求52所述的方法，其中所述单糖以所述培养基的约0.5体积％至约20体积％的量引入。
58.根据权利要求51所述的方法，其中乙醇提取溶液是含水的。
59.根据权利要求51所述的方法，其中所述乙醇提取溶液没有有机溶剂。
60.根据权利要求51所述的方法，其中所述乙醇提取溶液是酸性的。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述酸性提取溶液的pH为约3至约6。
62.根据权利要求60所述的方法，其中所述酸性提取溶液包括乙酸、柠檬酸或抗坏血酸。
63.根据权利要求51所述的方法，其中所述提取物基本上没有黄嘌呤生物碱。
64.根据权利要求51所述的方法，其中所述方法没有脱脂步骤。
65.根据权利要求51所述的方法，还包括以下中的一者或多者: 收获所述细胞； 在适于提取多酚富集级分的溶剂中均质化细胞生物质； 使用溶剂-溶剂提取和/或色谱分离原花青素富集级分；或者 干燥或浓缩所述原花青素级分。
66.根据权利要求51所述的方法，还包括以下中的一者或多者: 在固体生长培养基上培养可可属物种愈伤组织细胞； 从可可树愈伤组织培养物选择快速生长的细胞系；或者 通过将所述快速生长的细胞系接种进液体培养基中引发可可属物种细胞悬浮培养。
67.一种制备可可低聚原花青素的方法，所述方法包括: 以足以导致产生可可低聚原花青素的时间和条件培养细胞；以及 用酸性提取溶液从所述细胞提取所述可可低聚原花青素。
68.根据权利要求67所述的方法，还包括将单糖引入培养中的所述细胞以便增加所述可可低聚原花青素的产量。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述单糖为葡萄糖。
70.根据权利要求68所述的方法，其中在指数生长状态最后阶段期间或之后引入所述单糖。
71.根据权利要求67所述的方法，其中在无激素培养基中培养所述悬浮培养物。
72.根据权利要求67所述的方法，其中在将单糖或无激素培养基引入培养中的所述细胞后I天至21天之间进行所述提取。
73.根据权利要求68所述的方法，其中所述单糖以所述培养基的约0.5体积％至约20体积％的量引入。
74.根据权利要求67所述的方法，其中所述酸性提取溶液是含水的。
75.根据权利要求67所述的方法，其中所述酸性提取溶液没有有机溶剂。
76.根据权利要求67所述的方法，其中所述酸性提取溶液包含乙醇。
77.根据权利要求67所述的方法，其中所述酸性提取溶液的pH为约3至约6。
78.根据权利要求67所述的方法，其中所述酸性提取溶液包括乙酸、柠檬酸或抗坏血酸。
79.根据权利要求67所述的方法，其中所述提取物基本上没有黄嘌呤生物碱。
80.根据权利要求67所述的方法，其中所述方法没有脱脂步骤。
81.根据权利要求67所述的方法，还包括以下中的一者或多者: 收获所述细胞； 在适于提取多酚富集级分的溶剂中均质化细胞生物质； 使用溶剂-溶剂提取和/或色谱分离原花青素富集级分；或者 干燥或浓缩所述原花青素级分。
82.根据权利要求67所述的方法，还包括以下中的一者或多者:在固体生长培养基上培养可可属物种愈伤组织细胞； 从可可树愈伤组织培养物选择快速生长的细胞系；或者 通过将所述快速生长的细胞系接种进液体培养基中引发可可属物种细胞悬浮培养。
83.根据权利要求1所述的方法，其中在生长阶段期间培养所述可可细胞的所述步骤是在溶解氧浓度为空气饱和度的1%至400%的情况下进行。
84.根据权利要求1所述的方法，其中在引入所述单糖之后，培养所述可可细胞的所述步骤是在溶解氧浓度为空气饱和度的1%至400%的情况下进行。
85.一种分离的可可细胞系，其中所述分离的可可细胞系选择为基本上不含咖啡因和可可碱。
86.根据权利要求85所述的分离的可可细胞系，其中所述分离的可可细胞系来源于花组织或非花营养组织中的至少一者。
87.根据权利要求86所述的分离的可可细胞系，其中所述花组织选自由以下组成的组:花瓣、花萼、退化雄蕊以及它们的组合。
88.根据权利要求86所述的分离的可可细胞系，其中所述非花营养组织选自由以下组成的组:节、节间、幼叶、成熟叶、莖、根以及它们的组合。
89.根据权利要求85所述的分离的可可细胞系，其中所述分离的可可细胞系产生大于200mg/L PCV的原花青素。
90.根据权利要求85所述的分离的可可细胞系，其中所述分离的可可细胞系产生大于400mg/L PCV的原花青素 。
91.根据权利要求85所述的分离的可可细胞系，其中所述分离的可可细胞系每升细胞培养物产生大于IOOmg的原花青素。
92.根据权利要求85所述的分离的可可细胞系，其中所述分离的可可细胞系每升细胞培养物产生大于200mg的原花青素。
93.根据权利要求85所述的分离的可可细胞系，其中所述分离的可可细胞系每升细胞培养物产生至少250mg的原花青素。
全文摘要
本发明涉及从在单糖的存在下培养的可可细胞培养物制备可可低聚原花青素的方法，该方法可增加原花青素的产量，所述方法如下以足以导致以第一速率产生可可低聚原花青素的时间和条件培养细胞；以及将单糖以足以诱导所述细胞以高于所述第一速率的第二速率产生所述可可低聚原花青素的量引入给所述细胞。所述方法可还包括从所述细胞提取所述可可低聚原花青素，并且这种提取可在引入所述单糖后1天至21天之间进行。可任选地，所述单糖可以所述培养基的约0.5体积％至约20体积％的量引入。所述单糖可以是葡萄糖、蔗糖、果糖等。所述单糖可在指数生长状态的最后阶段期间或之后引入。
文档编号A23G1/04GK103237457SQ201180057910
公开日2013年8月7日 申请日期2011年10月3日 优先权日2010年10月4日
发明者尹成勇, 朴勇黜, 埃米·麦克唐纳, 卡米尔·皮埃尔·迪布瓦, 索尼娅·拉尔 申请人:戴安娜植物科学有限公司
从植物细胞培养物产生和提取原花青素相关申请的交叉引用本申请要求于2010年10月4日提交的美国临时专利申请N0.61/389，629的权益和优先权，将该专利以引用的方式全文并入本文。
背景技术：
多酚广泛分布于植物、水果和蔬菜中，并因其在人和动物健康中的生理功能(包括抗氧化活性、抗诱变活性和癌症预防活性)受到了相当多的重视(Salvia等人，J.Agric.Food Chem.(《农业和食品化学杂志》)39:1549-1552,1991 ;Bomser 等人，CancerLett.(《癌症快讯》)，135:151-157,1999 ；Zhao 等人，Carcmogenesis (《致癌作用》)，20:1737-1745，1999)。流行病学研究已暗示多酚中的黄酮可能会降低心脏疾病的风险(Hertog等人，Lancet(《柳叶刀》):342:1007-1011,1993) 0另外，已显示膳食黄烷_3_醇和/或原花色式(proanthocyanidin)在实验动物中降低了动脉粥样硬化症和冠心病的发病率(Tijburg 等人，Atherosclorosis (《动脉粥样硬化》)，135:37-47,1997 ；Yamakoshi 等人，Atherosclerosis (《动脉粥样硬化》),142:139-149,1999)。负责这些效果的机制之一涉及它们对于低密度脂蛋白(LDL)氧化的抑制(Steinberg, Circulation (《循环》)，85:2337-2344，1992)。已知可可植物(可可树(Theobroma cacao L.),梧桐科(Sterculiaceae))的种子富含多酌.(Porter等人,Phytochemistry (《植物化学》)，30:1657-1663,1991)。从发酵和烘焙可可豆制备的可可浆液(可可产品和巧克力产品的主要成分)的某些抗氧化组分已鉴定为黄烧-3-醇和原花青素 (procyanidin)低聚物(Sanbongi等人,J.Agric.Food Chem.(《农业和食品化学杂志》)，46:454-457,1998 ;Adamson等人,J.Agric.Food Chem.(《农业和食品化学杂志》)，47 =4184-4188,1999)。可可属(Theobroma)和其他属如Herrania属也是已知的可可原花青素来源。已描述了可可属的二十种不同物种，但通常仅12种被接受。其中，九种原产于亚马逊流域，因而遗传分布的中心看起来是在该地区的西半部(Giacometti, 1994,载于:“NeglectedCrops:1492 from a different perspective (J.E.Hernando Berme jo 和 J.Leon 编辑)Plant Production and Protection Series N0.26, FA0, Rome, Italy (联合国粮农署植物生产和保护系列第26号，意大利罗马)，第205-209页)。可可属通常在新热带区，并且分布西半球北纬18°至南纬15°之间的热带雨林中。具有最多物种的区域是在哥斯达黎加和哥伦比亚东北部之间。公认了五个组(section)和20个种。大花可可树(Theobroma grandif1rum)属于由11个种构成的组Glossopetalum ;可可是可可组的唯一物种。已将可可属的四个物种描述为可食用果肉的生产者:大花可可树、Theobromacanumanense Pires&Froes、Theobroma subincanum Martius (巴西的 Cupui,哥伦 t:匕亚的 Cacau de monte)以及 Theobroma tricolorHumb.&Βοηρ1.,其为一种分布在西亚马逊流域至墨西哥南部的小树。巧克力也由这些物种的种子制成(Giacometti, 1994,载于:“Neglected Crops:1492from a different perspective (J.E.Hernando Bermejo 和J.Leon 编辑)Plant Production and Protection Series N0.26, FAO, Rome, Italy (联合国粮农署植物生产和保护系列第26号，意大利罗马)，第205-209页)。已显示，可可属和Herrania属的数个物种的豆产生类似的原花青素并且可从这些豆提取这些化合物(Romanczyk 等人，W097/36497)。可可豆中的多酚储藏在子叶的色素细胞中。根据那些色素细胞(也称为多酚储藏细胞)中的花青素的量，它们是白色到深紫色的。在这些细胞中可区分三组多酚:儿茶素或黄烷-3-醇(约37%)、花青素(约4%)和原花色甙(约58%)。主要的儿茶素是(-)-表儿茶素，其构成高达总多酚含量的35%。原花青素(通常称为原花色甙)主要是黄烷_3，4- 二醇，其4 — 8或4 — 6键合成缩合二聚体、三聚体或低聚物，以表儿茶素作为主要的延伸亚单兀(Romanczyk 等人，W097/36497)。在新鲜可可豆的不含脂肪的干物质中可溶性多酚的总量为15%至20% (相当于含有54%脂肪和6%水分的风干可可豆中的约6% )，而在发酵豆中为约5%。因而，使用可可豆作为多酚来源的一个主要缺点是在豆的加工过程中损失了大部分多酚。其他步骤如烘焙和脱脂也导致损失。因而，可可粉中含有少于10%的存在于新鲜豆中的总多酚。使用可可豆的另一个问题是可可树的有限生长范围。它仅生长于赤道北纬和南纬约20°区域中的温暖潮湿气候中。这使得难以在储存和运输至可进行加工和提取多酚的区域的过程中保持豆的多酚含量。植物细胞培养物是克服这些问题的有吸引力的供替代的选择。最近植物细胞培养物已用于分离黄酮。就原花青素而言，若干团体已能够从培养物中分离特定的化合物。例如，已从玫瑰属(Rosa)培养物分离出4 — 8连接的(-)-表儿茶素-(+)-儿茶素和没食子酸(Muhitch 和 Fletcher, Plant Physiol.(《植物生理学》)，75:592-595,1984)。已发现日本柳杉(Cryptomeria japonica)的悬浮培养物和愈伤组织可产生多至干重26%的原花青素(Teramoto 和 Ishikura, Bot.Mag.Tokyo (《东京植物学杂志》)98:171-179,1985 ；Ishikura 和 Teramoto, Agric.Biol.Chem.(《农业与生物化学》)47:421-423,1983),而花旗松(Pseudotsuga mensiesii) 悬浮培养物产生多至其干重40%的原花青素(Stafford和Cheng,Phytochemistry (《植物化学》)19:131-135,1980)。还有报道显示了在葡萄(Vitisvinifera)的细胞悬浮培养物中产生原花青素(Decendit和Merillon, Plant Cell Rep.(《植物细胞报道》)15 =762-765,1996 ；ffaffo-Teguo等人，Phytochem.(《植物化学》)42:1591-1593，1996)。可可树的组织培养研究已集中于体细胞胚胎发生，在数个实验室中已发展了该技术用于植物的无性繁殖。Esan在1977年首先报道了可可树体细胞胚胎发生(Pioc.5thInt.Cacao Res.Conf.1975.1badan: Cacao Res.1nst.Nigeria, 1977:116-125,1977),其描述了使用未成熟合子胚组织外植体的方法。后来其他人也报道了类似方法(Pence等人，J.Am.Soc.Hort.Sc1.(《美国园艺学协会杂志》)104:145_148，1979 ;Villalobos 和Aguilar, Abstr.VII Int.Congr.Plant Tissue and Cell Cult., Amsterdam, Int.Assoc,for Plant Tissue Culture,第140页，1990)。后来的研究集中于从包括叶(Litz, InDimick, P.S.(编辑)Cacao biotechnology symposium.(《可可生物技术专题论文集》)，宾夕法尼亚州大学园的宾夕法尼亚州立大学出版社(The Pennsylvania State UniversityPress, University Park, PA),第 111-120 页，1986)、珠心(Chatelet 等人，C.R.Acad.Sc1.，Paris 315:55-62,1992 ；Figueira 和 Janick，Acta Hort.336:231-238,1993 ；Sondhal 等人，Acta Hort.336 =245-248,1993)在内的体组织以及包括花瓣和退化雄蕊在内的花外植体(Lopez-Baez 等人，C.R.Acad.Sc1., Paris 316:579-584,1993 ；Alemanno 等人，PlantCell Tiss.0rgan Cult.(《植物细胞组合和器官培养》)46:187_194，1996 ;Alemanno 和Michaux-Ferriere, In Vitro Cell Dev.Biol.Plant (《体外细胞与发育生物学-植物》)33:163-172，1997)开发组织培养方法。这些早期方法，尽管是成功的，但并不适用于所有基因型，并且再生植物的频率低。还发展了能够繁殖广泛基因型的更有效方法(Li等人，In Vitro Cell Dev.Biol.Plant (体外细胞与发育生物学-植物)34:293_299，1998 ;Maximova等人，In Vitro Cell Dev.Biol.Plant (《体外细胞与发育生物学-植物》)38:252-259,2002)。然而，当使用组织培养方法来产生体细胞胚时，所有已描述的方法均未教导培养悬浮细胞的方法。已公布的关于发展可可树的细胞培养的工作数量有限。该工作的绝大多数是在二十世纪七十年代和八十年代(Hall和Collin, Annals of Bot.(《植物学年鉴》)39:555,1975 Jalal 和 Collin, Phytochem.(《植物化学》)16:1377-1380，1977 Jalal 和 Collin,New Phytol.(《新 植物学家》)83 =343-349,1979 ；Tsai等人，J.Food Sc1.(《食品科学杂志》)47:768-773,1982 ;Wen等人，J.Am.0il Chemist，s Soc.(《美国石油化学家协会杂志》)16:1720-1724，1984)。其中，仅少数研究了可可树细胞培养物中的黄酮。例如，Jalal和Collin(1979)报道愈伤组织和细胞悬浮液中的黄酮组成类似并且与初始的完整子叶的黄酮组成相比变化性少得多。两种组织培养物均含有(-)_表儿茶素、无色花青素、咖啡酸和香豆酸。在组织培养物中未能检测到甲基化嘌呤、可可碱和咖啡因。然而，Gurney等人(J.Expt.Bot.(《实验生物学杂志》)43:769-775，1992)报道，可可树的愈伤组织和悬浮培养物产生咖啡因、可可碱和茶碱，浓度约为体内存在的浓度的10%。尚未有现有技术报道低聚原花青素的形成，近年来已显示低聚原花青素具有最大的生物效力。Jalal和Col I in (New Phytol.(《新植物学家》)83:343_349，1979)报道在可可树的细胞培养物中检测到无色花青素。然而，基于用于检测该化合物的方法，不可能表征无色花青素的性质或大小。另外，对于可可属或Herrania属的其他物种还未描述组织培养方法。植物细胞培养是克服这些问题的有吸引力的替代方法。因而，拥有用于获得多酚以及特别是原花青素的改善的植物细胞培养方案以及提取方案将会是有利的。
发明内容
本发明涉及分离的可可细胞系、从这类分离的细胞系制备的提取物和用于开发适于在液体培养物中培养的可可细胞系的方法。该公开还涉及用于选择可在细胞培养物中产生高水平的原花青素的细胞系的方法以及用于从这类细胞培养物提取原花青素来制备食品成分、食品添加剂、治疗组合物或化妆品组合物的方法。此外，选择用于产生高水平的原花青素的这类分离的细胞系也可被选择为基本上没有咖啡因和可可碱。咖啡因和可可碱通常在可可制备物中相当丰富，其为可可中主要造成可可苦味的化合物。这类化合物也主要造成可可产品对狗和其他动物的毒性。本发明还涉及用于培养可可细胞的细胞悬浮培养物的新的培养条件和/或培养基(例如液体培养基)以及用于增强这类悬浮细胞产生原花青素的液体培养基组合物。在一个实施例中，本发明包括选择为实质上不含咖啡因和可可碱的分离的可可细胞系。也就是说，由分离的可可细胞系产生的产物实质上不含咖啡因和可可碱。因此，源于分离的可可细胞系的制备物(例如裂解物、提取物等)在天然实质上不含咖啡因和可可碱。在一个实施例中，分离的可可细胞系可适于在悬浮细胞培养物中培养。分离的可可细胞系可衍生自基本上可可植物的任何部分。例如，分离的可可细胞系可衍生自花组织或非花营养组织中的至少一者。花组织的实例包括但不限于花瓣、花萼、退化雄蕊以及它们的组合。非花营养组织的实例包括但不限于节、节间、幼叶、成熟叶、茎、根以及它们的组合。在 一个实施例中，分离的可可细胞系产生大于100mg/L细胞压积(“PCV”)、大于200mg/L PCV的原花青素、大于300mg/L PCV、大于400mg/L PCV或大于500mg/L PCV的原花青素。在一个实施例中，分离的可可细胞系每升细胞培养物产生大于lOOmg、大于200mg或至少250mg的原花青素。在一个实施例中，描述了从可可细胞培养物制备可可低聚原花青素的方法。在一个实施例中，制备可可低聚原花青素的方法可包括:(I)以足以导致以第一速率产生可可低聚原花青素的时间和条件培养细胞，以及(2)将单糖以足以诱导所述细胞以高于第一速率的第二速率产生可可低聚原花青素的量引入所述细胞。在一个方面，该单糖可以是葡萄糖、蔗糖、果糖等。单糖可在指数生长状态的最后阶段期间或之后引入。任选地，单糖可以培养基重量或体积的约0.5%至约20%的量引入。可添加单糖用于稳定细胞系维持、诱导过度产生或防止细胞聚集。在另一个实施例中，制备可可低聚原花青素的方法可包括:(I)以足以导致以第一速率产生可可低聚原花青素的时间和条件培养细胞，以及(2)在无激素培养基中以及在足以诱导所述细胞以高于第一速率的第二速率产生可可低聚原花青素的条件下培养所述细胞。在一个实施例中，该方法可包括将单糖以足以诱导所述细胞以高于第二速率的第三速率产生可可低聚原花青素的量引入无激素培养基。根据本文所述方法的一个实施例，该方法可还包括从所述细胞提取可可低聚原花青素。在一个实施例中，细胞的提取物基本上没有黄嘌呤生物碱。黄嘌呤生物碱的实例包括但不限于咖啡因、可可碱和茶碱。因此，在另一个实施例中，制备可可低聚原花青素的方法可包括:(1)以足以导致产生可可低聚原花青素的时间和条件培养细胞，以及(2)用提取溶液从所述细胞提取可可低聚原花青素。在一个实施例中，提取溶液可以是乙醇基的。在一个方面，乙醇基提取溶液可以是含水的。在另一个方面，乙醇基提取溶液可没有除乙醇外的任何有机溶剂。在一个实施例中，提取溶液可以是酸性提取溶液。该酸性提取溶液的PH为约3至约6。该酸性提取溶液可包括乙酸、柠檬酸或抗坏血酸。在一个实施例中，该方法可用包含抗氧化剂的酸性提取溶液进行。在某些情况下，该酸性提取溶液中的酸也是抗氧化剂。在某些情况下，在提取溶液中使用单独的酸和抗氧化剂。本文所述的方法可还包括在引入所述单糖后I天至21天(例如约I天至约10天)从所述细胞提取可可低聚原花青素。任选地，该单糖可以培养基重量或体积的约0.5%至约20 %的量引入。在一个方面，可在无激素培养基中培养所述培养物。在一个实施例中，该方法可没有脱脂步骤。也就是说，可在不必采用脱脂步骤的情况下从所培养的细胞制备提取物(原花青素、多酚等)。在一个实施例中，该方法可包括如下步骤中的一者或多者:收获细胞；在适于提取多酚富集级分的溶剂中均质化细胞生物质；使用溶剂-溶剂提取和/或色谱分离原花青素富集级分；或者干燥或浓缩该原花青素素级分。在一个实施例中，该方法可包括如下步骤中的一者或多者:在固体生长培养基中培养可可属物种(Theotooma sp.)愈伤组织细胞；从可可树愈伤组织培养物选择快速生长的细胞系；以及通过将该快速生长的细胞系接种进液体培养基中引发可可属物种细胞悬浮
培养；在一个实施例中，该方法可包括在溶解气体(包括氧气)的存在下在发酵罐或生物反应器容器中培养该可可细胞培养物，从而所述细胞在该液体培养基中经受升高水平的溶解氧。可在生长阶段和诱导阶段(elicitation stage)期间(例如，在引入单糖后或在将细胞引入无激素培养基后)经由分布器(sparger)向发酵罐或生物反应器提供氧气(单独的或作为空气与纯气态氧的共混物)以有利于生长和产量提高。递送至细胞的溶解氧的浓度可取决于细胞的初级或次级代谢需要。在一个实施例中，在生长阶段期间培养可可细胞的步骤是在溶解氧浓度为空气饱和度的I %至400% (例如，约1%至约200% )时进行。在另一个实施例中，在诱导阶段期间培养可可细胞的步骤是在溶解氧浓度为空气饱和度的I %至400% (例如，约I %至约200% )时进行。根据下面的说明，上述的以及其他的目标、特征和优势将变得更显而易见，下面的说明参考附图进行。
`图1包括快速生长的细胞系的照片。图2A-2E包括一系列图，示出了可可树细胞培养物中的原花青素生产率和收率以及碳水化物消耗。图2A和图2B展示了非花组织和花组织的悬浮培养物的原花青素生产率(图2B)和生产收率(图2A)。图2C示出了对原花青素生产率改善的细胞选择效果。图2D示出了对原花青素生产收率改善的细胞选择效果。图2E示出了培养基XXVI中的可可树细胞培养物的碳水化物分析(表I)。图3包括示出了多种接种密度的培养物中生物量密度的典型时间进程的图。图4包括示出了衍生自营养组织的细胞由于细胞选择过程而随时间推移原花青
素产量改善的图。图5A包括示出了原花青素产量响应以葡萄糖温育而增加的图。图5B包括示出了使用多种浓度的葡萄糖时原花青素产量增加的图。图6包括示出了细胞系MX1440-3496中由于补加葡萄糖,原花青素产量在2个诱导事件中增强的图。图7A包括示出了在移除激素连续2周后每升培养物的原花青素产量增加的图。图7B包括示出了两种处理的累加效果的图:移除激素I周，然后用6%葡萄糖诱导细胞I周进行第二次处理，其中该诱导是在从培养基移除激素后7天。
图8A-8C —起示出了用于测量原花青素的丁醇-HCl水解测定法。原花青素的酸水解导致其分解为两种单体形式，(-)_表儿茶素和颜色为粉红色的花青素。每份样品中粉红颜色的强度代表不同细胞系中获得的原花青素的量(图8A)。该方法被优化为96孔板形式用于快速筛选样品(图8B)。花青素吸收是在520nm处，表儿茶素吸收是在280nm(图SC);根据花青素吸收值来计算定量。图9A-9F包括来自可可树细胞培养物的原花青素和生物碱的一系列色谱。图9A-9C示出了对多种确证标准化合物的HPLC LC-MS分析。图9D-9F示出了对可可树悬浮细胞的HPLC LC-MS分析，显示出表儿茶素和儿茶素的信号但没有任何咖啡因或可可碱。图10A-10B包括示出了悬浮细胞提取物的一系列HPLC色谱图的图:荧光检测器模式(图10);或280nm下的PDA检测器模式(图10B)。标签I至12分别指原花青素的聚合度:1，单体；2，二聚体；3，三聚体；4，四聚体；5，五聚体；6，六聚体；7，七聚体；8，八聚体；9，九聚体；10，十聚体；ll，i^一聚体；12，十二聚体。图11包括比较悬浮细胞提取物和未发酵的可可豆提取物中的可可碱和咖啡因浓度的色谱图，表明与可可豆提取物形成对比的是，在悬浮细胞提取物中这两种代谢物的量为痕量。图12A包括示出了多种含水溶剂中的总原花青素收率的比较的图(当日内，n =
3)。·图12Β包括示出了提取程序的低聚原花青素(单体至十聚体)的总提取率的比较的图(η = 2)。图12C包括示出了 60%乙醇与70%丙酮之间提取物中的原花青素谱的比较的图。图13包括示出了多种接种密度的培养物中生物量密度的典型时间进程的图。图14Α-14Β包括示出了室温下23小时内酸性与非酸性提取溶剂系统中二聚体原花青素的稳定性比较的图。
具体实施例方式本发明涉及分离的可可细胞系、从这类分离的细胞系制备的提取物和用于开发适于在液体培养物中培养的可可细胞系的方法。该公开还涉及用于选择可在细胞培养物中产生高水平的原花青素的细胞系的方法以及用于从这类细胞培养物提取原花青素来制备食品成分、食品添加剂、治疗组合物或化妆品组合物的方法。此外，选择用于产生高水平的原花青素的这类分离的细胞系也可被选择为基本上没有咖啡因和可可碱。咖啡因和可可碱通常在可可制备物中相当丰富，其为可可中主要造成可可苦味的化合物。这类化合物也主要造成可可产品对狗和其他动物的毒性。本发明还涉及用于培养可可细胞的细胞悬浮培养物的新的培养条件和/或培养基(例如液体培养基)以及用于增强这类悬浮细胞产生原花青素的液体培养基组合物。1.缩写2,4-D2，4-二氯苯氧基乙酸
2iP6-(γ，γ-二甲基烯丙基胺)嘌呤
Β5Gamborg's B5
BA苄基腺嘌呤
CPChcc and Poolc
DKWDriver and KuniMiki VValnul
FAB/MS快速原子轰击/灰谱
HCl盐酸
HPLC高效液相色谱
H2SO4碗酸
IAA吲咮乙酸
IBA吲咮丁酸
LC液相色谱
LSIMS液相二次离子质谱
MS质谱
MS 培养基iVlurashigc and Skoog 培养基
MS 维生索Murasliigc and Skoog 维生素
MS itMiirashigc and Skoog it
NAA]-杀'乙
NMR核磁共振
NNNitsch and Nitsch
PCV细胞压积
PDA光电二极管阵列
QL,Quiorin and Lcpoivrc
RI折射率
rpm每分钟转数
SHSclicnk and Hildcbrandt
TDZ^Wir(Ihisdiazuron)
TLC薄层色谱
wm每分钟每体积培养物的气体体积
WPMMcCown's木本植物培养基I1.术语除非另有说明，否则技术术语根据常规用法使用。为方便综述本发明的多个实施例，提供了下列特定术语的解释:抗氧化剂是降低氧化损伤(由氧造成的损伤)如自由基造成的损伤的物质。愈伤组织是薄壁、未分化的植物细胞的团块，由创伤或在营养介质中培养发育而来。儿茶素是在植物中天然产生的多酚类化合物。它们也称为黄烷-3-醇。可可是(梧桐科的)可可树的种子，主要由两个品种构成=Criollo和Forestero,分为若干亚种。称为Trinitario的第三组是Criollo和Forestero的杂种。这里包括的其他物种有例如大花可可树、Theobroma obovatum、Theobroma speciosum、Theobromasubincanum 和 Theobroma sylvestris。黄酮是含有特征性芳族三聚体杂环核的一组化合物中的任一者，通常以糖苷形式出现并在植物中广泛分布，经常作为色素。
多酚是水溶性植物色素，也被称为生物类黄酮，其涵盖超过4，000种化学独特的黄酮，可根据它们的化学结构进行分类。多酚单体包括儿茶素、表儿茶素、无色花青素。多酚低聚体包括原花青素。原花青素是由两个到多于五十个单元的偶联儿茶素单元构成的多聚体化合物。原花青素还常被称为原花色甙或缩合单宁。悬浮培养是通过其原核或者真核细胞在可控条件下于液体营养介质中生长的过程。组织培养是保持组织在培养基中存活和生长的技术或过程。黄嘌呤类、黄嘌呤(3，7- 二氢-嘌呤-2，6- 二酮)衍生物是一组生物碱，通常因为其作为温和兴奋剂和作为支气管扩张剂的效用而使用。甲基化黄嘌呤衍生物包括咖啡因、副黄嘌呤、茶碱和可可碱(主要存在于巧克力中)。这些化合物抑制磷酸二酯酶和拮抗腺嘌呤核苷。除非另作解释，否则本文使用的所有技术和科技术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。除非上下文另外明确指明，否则单数术语“一种”、“一个”和“所述”包括多个指代物。类似地，除非上下文另外明确指明，否则单词“或”旨在包括“和”。因此“包含A或B”意指包括A或B，或者A和B。尽管类似于或等同于本文所述那些的方法和材料可 被用于实践或测试本发明，但下文描述了适当的方法和材料。在此提及的所有文献、专利申请、专利及其他参考文献以引入的方式全文并入本文。在冲突的情况下，将采用本说明书，包括术语的解释。此外，材料、方法和实例仅作说明而无意限制本发明。II1.本发明的实施例开发分离的可可细胞系、由这类分离的细胞系制备的提取物、用于开发适于在液体培养物中生长的可可细胞系的方法、用于生成可产生高收率的原花青素的细胞培养物的方法以及用于从该培养物有效提取这些化合物的方法可显著增加这些有价值的化合物的产量。使用细胞培养物来产生原花青素不需要开发用于处理可可豆以减少原花青素损失的新方法的繁重任务。另外，细胞培养物不受可破坏作物生产的环境条件影响。本发明描述这类细胞培养物和方法。本文提供选择为实质上不含咖啡因和可可碱的分离的可可细胞系。也就是说，由分离的可可细胞系产生的产物实质上不含咖啡因和可可碱。因此，源于分离的可可细胞系的制备物(例如裂解物、提取物等)天然实质上不含咖啡因和可可碱。这与通常的可可细胞制备物相反，通常的可可细胞制备物中必须使用溶剂提取将咖啡因和可可碱从该可可细胞制备物移除。这种溶剂提取代价高且耗时。另外，这些溶剂提取通常采用可能在处理过的可可细胞提取物中留下潜在毒性的残余物的苛性溶剂(例如己烷)。在一个实施例中，分离的可可细胞系可适于在悬浮细胞培养物中培养。分离的可可细胞系可衍生自基本上可可植物的任何部分。例如，分离的可可细胞系可衍生自花组织或非花营养组织中的至少一者。花组织的实例包括但不限于花瓣、花萼、退化雄蕊以及它们的组合。非花营养组织的实例包括但不限于节、节间、幼叶、成熟叶、茎、根以及它们的组合。在一个实施例中，分离的可可细胞系产生大于100mg/L细胞压积(“PCV”)、大于200mg/L PCV的原花青素、大于300mg/L PCV、大于400mg/L PCV或大于500mg/L PCV的原花青素。在一个实施例中，分离的可可细胞系每升细胞培养物产生大于lOOmg、大于200mg或至少250mg的原花青素。本发明提供制备实质上不含黄嘌呤生物碱的可可多酚制备物的方法，该方法包括以足以导致可可多酚产生的时间和条件使可可属或Herrania属细胞在悬浮培养物中生长，以及从该细胞悬浮培养物收获可可多酚。在特定的实施例中，以足以导致可可原花青素(例如低聚原花青素)产生的时间和条件(例如I至3周)在悬浮培养物中培养可可属或Herrania属细胞，并从该细胞悬浮培养物收获可可原花青素。在这些方法的实例中，所得的可可多酚(或原花青素)制备物实质上(或在某些情况下完全)不含可检测的咖啡因和/或可可碱。
本发明还提供了制备可可细胞的细胞悬浮培养物的方法。这些方法的实例涉及在固体培养基上从非成熟的可可属物种花外植体或从可可属物种营养材料培养愈伤组织；从该可可属物种愈伤组织培养物选择快速生长的细胞系；以及通过将该快速生长的细胞系接种进液体细胞培养基中弓I发该细胞悬浮培养。举个例子，该未成熟的可可树花外植体在一些情形中选自退化雄蕊、花萼和花瓣基部外植体。在其他特定的非限制性实例中，可可属物种营养材料选自幼小的或成熟的叶、茎、分生组织、节或节间。在一些情况中，营养细胞培养物可能是优选的，因为能够产生比花细胞培养物更多的原花青素。可对可可细胞的这种细胞悬浮培养物进行选择使得可由其产生的细胞和提取物实质上不含咖啡因和可可碱。还提供使用本文所述方法中的任一者制备的实质上不含黄嘌呤生物碱的可可多酚(例如原花青素)制备物。在特定实施例中，可可多酚(例如原花青素)制备物缺少可检测水平的黄嘌呤生物碱(该制备物不含黄嘌呤生物碱)。在具体的非限制性的实例中，可可多酚制备物包含原花青素(例如，低聚体原花青素)并且实质上不含咖啡因和/或生物碱。在特定的非限制性实施例中，本文所述的可可多酚可用于膳食组合物、化妆品组合物、治疗组合物或兽用组合物。举个例子，如果以提取物的重量或体积计可可多酚制备物含有少于2%的可可碱和少于0.5%的咖啡因，则可认为其实质上不含黄嘌呤生物碱(例如实质上不含咖啡因和可可碱)。在具体的非限制性实例中，如果可可多酚制备物含有少于1.5%、少于1%、少于0.5%或0%的可可碱和/或含有少于0.25%、少于0.2%、少于0.1%或0%的咖啡因，则可认为其实质上不含黄嘌呤生物碱。在另一个实例中，如果可可原花青素制备物含有少于2%的可可碱和少于0.5%的咖啡因，即可认为其实质上不含黄嘌呤生物碱。在具体的非限制性实例中，如果可可多酚制备物含有少于1.5 %、少于I %、少于0.5%或O %的可可碱和/或含有少于0.25 %、少于0.2 %、少于0.1 %或O %的咖啡因，可认为其实质上不含黄嘌呤生物碱。最理想的实质上不含黄嘌呤生物碱的水平是0%可可碱和0%咖啡因(制备物是不含黄嘌呤生物碱的)。还可以设想，本文所述的和/或用本文所述方法制备的代表性制备物含有可可多酚，所述可可多酚包含儿茶素、表儿茶素和原花青素低聚体。在具体的实例中，低聚体是二聚体至十二聚体。例如，在某些制备物中，低聚体包括二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体或它们任意两种或更多种的混合物。还设想的是其中可可多酚是可可原花青素的制备物。本文提供的可可多酚制备物可以液体形式、干燥形式或冻干形式提供。可可多酚可在不进行提取的情况下以干燥的或冻干的细胞形式提供。在一个实施例中，可将添加补充的葡萄糖至悬浮培养物用于增加原花青素的产量。已经发现的是在指数生长阶段结束时添加葡萄糖至细胞培养物可增加原花青素产量。因此，葡萄糖可用作增加原花青素的产量的诱导剂。可用另一种糖代替葡萄糖。葡萄糖可以培养基重量或体积的约0.5%至约至约20%，更优选约1%至约10%，更优选约2%至约8%,更优选约3%至约6%,并且最优选培养基重量和体积的约5或6%的量添加。可任选地是，可用另一种单糖如蔗糖或果糖代替葡萄糖。可在细胞培养期间的任何时间添加葡萄糖或另外的单糖以增加原花青素的产量。单糖可在接种I至21天后引入，并且可在提取原花青素之前引入一次或多次。在一个实例中，单糖添加可在接种后I至7天进行，然后在接种后7至21天再次进行，更具体地讲可在接种后5至8天添加然后在第12至18天再次添力口，并且更具体地讲可在约第7天添加并在约第14天再次添加。在另一个实例中，单糖的添加可在指数生长阶段末期之前、期间和/或之后，优选在指数生长阶段末期时或之后。可在添加葡萄糖后I至21天，更具体地讲7至18天，或更具体地讲是葡萄糖添加后约10天提取细胞的原花青素。本发明还提供使用本文所述方法中的任一者制备的实质上无激素的可可多酚(如原花青素)制备物。在特定的实施例中，可可多酚(例如原花青素)制备物缺少可检测水平的激素。制备这种无激素组合物的相关方法可包括在无激素细胞培养基中将细胞培养I天至3周。惊人且出乎意料的是，在无激素培养基中培养的细胞产生足够量的原花青素用于提取。使用无激素培养基可有益于降低细胞培养物提取物中的激素水平。已经发现的是，细胞培养物在可接受范围内是活的，使得无激素培养基可用于制备在细胞培养物提取物中具有降低的激素含量的原花青素。惊人且出乎意料的是，据发现使用无激素培养基还导致原花青素产量增加。因此，可在提取之前使用无激素细胞培养物来降低激素含量水平以及增加原花青素产量。细胞培养基中缺少激素在未分化的细胞中可以是有用的。该细胞培养方法可包括在接种时或此后某个时间从细胞培养基中移除激素。移除激素的方法可包括从细胞移除细胞培养基和/或给细胞引入无激素培养基使得细胞基本上没有激素。在一个方面，可在接种后I至14天，更具体地讲是接种后I至7天或接种后7至14天从细胞移除激素。在提取之前可将细胞在不存在激素的情况下培养I至3周，更优选I至2周，最优选在不存在激素的情况下培养后I周。可在无激素培养基之前以25%接种。
在一个实施例中，可将产原花青素的细胞在不存在激素的情况下培养，同时补充葡萄糖。虽然无激素培养基和补充的葡萄糖独立显示了原花青素产量增加，令人惊奇且出乎意料的是，较于单独的无激素培养基或补充的葡萄糖，使用补充有葡萄糖的无激素培养基进一步增加了原花青素产量。原花青素产量增加的结果是令人惊奇和出乎意料的，因为调节细胞培养中的多个变量通常会导致令人不满意的结果。然而，在此情况下无激素培养基与补充葡萄糖的组合具有实质的累加效应，其中因为单独的无激素培养基或补充的葡萄糖引起的增加现在组合而进一步增加原花青素产量。从细胞培养物移除激素、引入葡萄糖以及提取原花青素的步骤可通过将如上所述的引入葡萄糖和在无激素培养基中培养的特征组合来进行。另外，在无激素培养基中培养和在葡萄糖存在的情况下培养的组合可以是一前一后的，其中首先在无激素培养基中培养细胞，然后给予葡萄糖。培养技术可包括以下中的至少一者:从细胞移除激素I周，添加葡萄糖，然后等候I至21天的一段时间，之后提取原花青素；从细胞移除激素2周，添加葡萄糖，然后等候I至21天的一段时间，之后提取原花青素；从细胞移除激素3周，添加葡萄糖，然后等候I至21天的一段时间，之后提取原花青素；从细胞移除激素I周或更多周，以两次或更多次剂量隔I至14天添加葡萄糖，然后等候I至21天的一段时间，之后提取原花青素；接种后O至14天从细胞移除激素，如本文所述添加葡萄糖，然后等候I至21天的一段时间，之后提取原花青素；或其他相似的培养技术。在一个实施例中，用于获得原花青素的提取工艺可使用乙醇作为提取溶剂以增加从细胞培养物提取单体-十聚体原花青素的效率。现在，可使用乙醇，其为更环境友好的，因为丙酮已知为环境污染的。另外，乙醇提取剂可循环和再利用。另一方面，丙酮难以循环。在一个实施例中，用于获得原花青素的提取工艺可在酸的存在下进行，该酸还可以是抗氧化剂，如抗坏血酸或柠檬酸。具有抗氧化剂性质的酸性提取溶液可改善原花青素的提取，因为氧化降解减少。另外，在某种程度上由于该提取溶剂对细胞的渗透性以及原花青素释放增加，提取效率增加。或者，可以使用酸和单独的抗氧化剂。可用通过所述方法中的任一者制备的可可属和Herrania属细胞悬浮培养物进行细胞培养，以及如本文所述的这些细胞悬浮培养物用于产生可可多酚(如原花青素)的用途。在一个实施例中，制备实质上不含黄嘌呤生物碱的可可多酚制备物的方法包括以足以导致可可多酚产生的时间和条件在悬浮培养物中培养可可属或Herrania属细胞，以及从该细胞悬浮培养物收获可可多酚。在该方法的实例中，所得的可可多酚制备物实质上(或在某些情形中，完全)不含可检测的咖啡因和/或可可碱。在其他特定实例中，制备物含有少于50%的由发酵过的豆所制备的可可多酚制备物中将会存在的咖啡因和/或可可碱水平。在优选实施例中，细胞培养物所生成的制备物含有少于30%、少于20%、少于15%、少于10%或少于5%的由发酵过的豆制备的可可多酚制备物中将会存在的咖啡因和/或可可碱水平。在本发明方法的具体实施例中，以足以导致产生可可原花青素(例如，低聚原花青素)的时间和条件在悬浮培养物中培养可可属或He rrania属细胞，以及从该细胞悬浮培养物收获可可原花青素。在本文提供的代表性方法中，可可属或Herrania属细胞悬浮培养物通过在固体生长培养基上从不成熟的可可属或Herrania属花外植体或从可可属或Herrania属营养材料培养愈伤组织，从该可可属或Herrania属愈伤组织培养物选择快速生长的细胞系，并通过将快速生长的细胞系接种进液体培养基中来引发细胞悬浮培养而制备。在某些所提供的方法中，制备可可多酚(包括原花青素)包括收获细胞；在用于提取多酚富集级分的合适溶剂(例如乙醇提取剂)中均质化细胞生物质；分离原花青素富集级分(例如使用溶剂-溶剂提取和/或色谱)；以及任选干燥、冻干或浓缩原花青素级分。在某些情形中，收获细胞包括离心、过滤或它们的组合。另一个实施例是制备可可细胞的细胞悬浮培养物的方法。该方法的实例包括在固体生长培养基从不成熟的可可属或Herrania属花外植体或从可可属或Herrania属营养材料培养愈伤组织；从可可属或Herrania属愈伤组织培养物选择快速生长的细胞系；以及通过将该快速生长的细胞系接种进液体培养基中引发该细胞悬浮培养。举个例子，不成熟的可可树或Herrania属花外植体在一些情形中选自退化雄蕊外植体、花萼外植体和花瓣基部外植体。在其他特定的非限制性实例中，可可树或Herrania属营养材料选自幼叶或成熟叶、茎、分生组织、节或节间。可任选地，制备可可细胞的细胞悬浮培养物的方法还包括在烧瓶、任何合适的培养容器或生物反应器中培养细胞悬浮培养物。例如，在某些情形中，该培养在容器或生物反应器中以及以分批、分批补料或连续模式实现。本文还设想的是通过所述方法中任一者制备的可可属或Herrania属细胞悬浮培养物以及这些细胞悬浮培养物制备可可多酚或更具体地讲原花青素的用途。本公开提供的另一个实施例是包含可可多酚混合物且天然实质上不含咖啡因和可可碱的可可多酚制备物，该制备物提取自可可属或Herrania属细胞悬浮培养物。关于“天然实质上不含咖啡因和可可碱”的术语“天然”表明咖啡因和可可碱的相对不存在不是通过纯化程序(如LH-20尺寸排阻色谱法)产生。因此，通过本文描述的工艺获得初级细胞培养物提取物可在不进行额外纯化的情况下实质上不含咖啡因和/或可可碱。然而，如果从初级提取物获得高于所需水平的某些咖啡因和/或可可碱，则可进行进一步的纯化。另外的实施例是在不使用己烷或另一有机溶剂进行脱脂步骤的情况下进行的可可多酚提取物制备方法。对于这些目的，乙醇不认为是有机溶剂。因此，本文设想的是在不使用己烷的情况下制备的可可多酚(例如原花青素)制备物。可可多酚提取物可实质上或完全没有任何有机溶剂，例如己烷或丙酮等等。设想本文提供的可 可多酚制备物可用于膳食组合物和/或用于治疗组合物和/或用于兽用组合物和/或用于化妆品组合物。IV.可可组织培养本文描述的是从可可属或Herrania属的细胞培养物有效分离原花青素的方法。具体地讲，已建立了允许常规分离与提取自可可豆的花青素类似的原花青素的可可属或Herrania属细胞悬浮培养物。此外，本文提供的方法已导致制备了这些原花青素的多产细胞培养物来源。这些方法的代表性优势包括:由于控制气候条件而导致生物质来源可靠且连续；快速而有效的分离程序，其使在提取过程期间原花青素的降解最少；从细胞培养物分离的原花青素在组成上类似于从可可豆分离的原花青素；和/或可用于操纵和优化细胞培养物原花青素生产率的技术。一般而言，本文描述的是从可可属或Herrania属植物的多种组织建立愈伤组织培养物。建立的愈伤组织被用于使用多种类型的细胞培养基培养浮培养物。当稳定的悬浮细胞培养物建立时，对细胞进行提取并通过公认的分光光度法分析原花青素含量，而使用HPLC-MS方法来鉴定各原花青素。根据这样的分析，选择能产生所需原花青素的悬浮培养物来进一步优化生产率。可可培养物的生成这里大致概述生成可可培养物的方法，并在实例中描述详细的示例方案。简而言之，尽管本领域技术人员可以根据已知变化变动具体细节，通过从源自多个植物部分，例如花组织如花瓣、花萼、退化雄蕊等，或非花营养组织如节、节间、幼叶、成熟叶的外植体建立愈伤组织和悬浮培养物来实现产原花青素细胞培养物的引发，如对于体细胞胚胎发生所描述的。通过定期转移所培养细胞的一部分至新鲜培养基中，在新鲜悬浮培养基中维持悬浮培养物。通过细胞生长性能和培养基的糖消耗来确定转移安排和接种密度。—个实施例提供改变原花青素含量的方法，该方法涉及在足以引发产原花青素培养物的条件下引发这样的培养物，以及建立足以用于建立生产性细胞培养物的生产培养基，随后按比例放大生产性细胞培养物适当量的时间以分离原花青素。相应地，改变引发培养物或建立生产性培养物所需的条件能导致在这种培养物中原花青素含量(量)改变。可改变植物细胞培养物微环境的物理方面(例如光辐照)和/或化学方面(例如培养基组成或化学诱导剂)以实现所需的改变的含量。例如，可最初或者在诱导期间增加悬浮培养基中的碳水化合物(例如蔗糖或葡萄糖)浓度以便增加培养物中原花青素的量。此外，可为了在植物细胞培养物中产生次级代谢物而操纵氮源(例如硝酸铵)(参见Neera等人,Phytochemistry.(《植物化学》)31 (12):4143-4149，1992)。因此，降低可可属或Herrania属细胞培养基中氮源的浓度可用于增加培养物中的原花青素产量。此外，输入某些氨基酸(如谷氨酸、甘氨酸和丝氨酸)也可显著影响次级代谢物的产量。因此，可增加这些氨基酸在可可属或Herrania属悬浮培养基中的浓度以便增强原花青素的产量。还可将另外的氨基酸包括在培养基中并测试其增加可可属或Herrania属悬浮培养物的原花青素产量的能力。此外，可从培养基移除激素以增强可可属或Herrania属悬浮培养物的原花青素产量。还可变动光照条件以便实现可可属或Herrania属细胞培养物中的原花青素含量改变。例如，通过增加辐照或曝光长度来改变光照，从而增加原花青素产量。还可以改变光辐照的波长以实现原花青素产量增加。例如，已知紫外光可诱导原花青素在植物细胞培养物中产生(Meyer, J.Biotechnology (《生物技术杂志》)93 =45-57,2002) 本领域已知的用于操纵植物细胞培养微环境的其他改变方法也设想为处于本说明书的范围内，并且本领域内任何技术人员均可执行。另外，可如本文所述培养可可细胞。例如，可在提取原花青素前的某个点给培养物施予葡萄糖。可用其他糖如蔗糖、果糖等替代葡萄糖。可在如下时间点将葡萄糖引入细胞培养物:接种时；接种后1-7天；接种后7-14天；接种后14-21天；或它们的组合。在另一个实例中，可在提取原花青素之前将培养物在无激素培养基中培养。可在如下时间点将无激素培养基引入培养中的所述细胞:接种时；接种后1-7天；接种后7-14天；接种后14-21天；或它们的组合。从培养物中收获可可细胞如本文所述培养一批产原花青素可可属或Herrania属细胞，并收获细胞以提取原花青素。可以多种方式进行悬浮细胞的收获，本文描述了这些方式的实例。一旦细胞培养物到达稳定期并达到所需的原花青素生产率，就让培养物在容器中沉降为紧密的团块并可轻轻倒出培养基，留下大部分固体细胞生物质。然后洗涤细胞生物质以移除残留的培养基并类似滗出。或者，可离心细胞悬浮并弃去上清液(培养基)，然后洗涤细胞团块并再次离心以弃去液体。第三个选择是过滤细胞培养物悬浮液以移除培养基。这些方法的任一者可使用几毫升到数千升培养物的生产规模体积的细胞培养物体积。提取稈序粉碎、研磨或磨碎收获的细胞团块以均质化细胞团块，并破碎细胞以增强提取溶剂与样品的接触面积，以及确保提取的部分代表整个样品。原花青素是不稳定的化合物。因而，如果在提取前需要保存细胞生物质，优选冷冻保存，例如通过用液 氮冷冻。
除了几个主要差异外，从可可属或Herrania属的细胞培养物提取总多酚类似于用从可可豆提取总多酚的程序。在可可豆的情形中，磨碎豆之后的起始步骤是使磨碎的碎片(碎粒)脱脂。该过程导致多酚损失。因为细胞培养物没有可可豆那么多的脂肪，因而不需要该步骤。去除该步骤可减少细胞培养物的提取工艺过程中的多酚损失。此外，脱脂需要诸如己烷之类的溶剂，在最终的提取物中存在痕量的该溶剂。这导致由可可豆制备的提取物中有不良气味，并且该溶剂可能是有毒的或对于某些用途(如食品配料成分)是不期望的。因为本文所述的用于从细胞培养物生物质提取的方法排除了使用溶剂(如己烷)，在所得的提取物中没有溶剂污染或不良溶剂气味。在代表性方法中，用70% -80%含水甲醇或70%含水丙酮或它们的组合来从磨碎、均质化的细胞提取多酚。也能使用水和乙醇，尽管使用这些溶剂只能部分提取低聚体原花青素，而根本不能提取高分子量聚合物(Grayer,载于:J.B.Harborne, PlantPhenolics (《植物酚类物质》)(第I卷)，第283-323页，1989.圣地亚哥(San Diego)，美国学术出版公司(Academic Press, Inc.) ;Lee 和 Widmer,载于:L.M.L.Nollet，Handbookof Food Analysis (《食品分析手册》)(第 I 卷)，第 821-894 页，1996, Basel, New York,Hong Kong, Marcel Dekker, Inc.)。在一个实施例 中，提取溶剂可包括乙醇。乙醇可以是包括约25体积或重量％至约100体积或重量％、更优选超过约50%，更优选超过75%，甚至更优选超过90%的乙醇的含水组合物。具体的实例包括50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇和80%乙醇，其中图12示出了最优的60%乙醇。在该实施例中，乙醇提取溶剂没有其他醇或酮。在一个实施例中，提取溶剂可包括与水和/或乙醇一起的其他醇或酮，如含水有机溶剂。实例包括异丙醇、乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯或它们的组合。该含水有机溶剂可包括约25 %至约99 %，更优选约30 %至约90 %的水，或甚至更优选超过50 %的水。在一个实施例中，取决于细胞团块的量，将提取溶剂与处理过的或未经处理的细胞以多种量组合。提取溶剂的量可以是细胞团块质量或体积的50%或更多，更优选超过或约75 %，甚至更优选超过或约100 %，并且甚至更优选超过细胞团块质量或体积的200 %。当然，可使用更大体积的提取溶剂。在一个实施例中，提取溶剂可包括酸，例如抗氧化剂酸。酸的实例包括乙酸、柠檬酸或抗坏血酸。以提取组合物的体积计或以提取溶剂的体积计，该酸可以约0.05%至10%存在，更优选约0.75%至约5%，更优选提取溶剂的约0.1体积％至约I体积％或至约2体积％。在彻底提取次要组分之后，各原花青素可能以释的水平存在于提取物中。浓缩在低温(低于40°C)和减压下实现以使原花青素的降解最少(Lee和Widmer，载于:L.M.L.Nollet, Handbook of Food Analysis (《食品分析手册》)(第 I 卷)，第 821-894 页,1996, Basel, New York, Hong Kong, Marcel Dekker, Inc.)。在该阶段可可属或Herrania属的细胞培养物的多酚提取物相对纯净，可立刻对其进行分析。本文所述方法的一个好处在于，与可可豆的多酚提取物相比，源于细胞培养物的可可属或Herrania属多酚提取物一开始就具有不可检测水平的杂质(例如，咖啡因和可可碱)。然而，做进一步的净化以移除微量杂质(如咖啡因和可可碱)是有益的。净化提取物以移除甚至痕量的这些杂质是可能的。这种净化步骤可包括以非互溶溶剂进行的液-液分配和在S印hadex LH-20、聚酰胺、Amberlite XAD-2、制备型HPLC上的柱色谱，以及使用可商购获得的一次性柱的固相提取(SPE) (Grayer,载于:J.B.Harborne, Plant Phenolics (《植物酚类物质》)(第I卷)，第283-323页，1989.圣地亚哥，美国学术出版公司；Markham和Bloor,载于:C.A.Rice-Evans 和 L.Packer, Flavonoids in Health and Disease (《健康与疾病中的黄丽》)，第 1-33 页，1998, Basel, New York, Hong Kong, Marcel Dekker, Inc.)。通常可通过用氯仿或二氯甲烷提取来实现可可碱和咖啡因的移除，因为多数黄酮在这些溶剂中溶解度有限。分析程序用于检测和鉴定来自可可属或Herrania属细胞培养物的原花青素的分析技术与用于来自可可豆的提取物的那些类似。主要使用多种色谱技术来分离低聚体然后使用独立的方法进行结构鉴定来实现可可原花青素的鉴定。Quesnel (Phytochemistry (《植物化学》)7:1583-1592，1968)以及 Jalal 和 Collin(Phytochem.(《植物化学》)16:1377_1380，1977)分别使用纸色谱分析方法和TLC方法鉴定了可可中的原花青素。然而，尽管这些出版物确认原花青素存在于可可中，但未阐明原花青素的立体专一性结构。Porter等人(Phytochemistry (《植物化学》)30:1657-1663,1991)用柱色谱、TLC、HPLC 和阴离子 FAB/MS对可可中的原花青素进行了严格的调查研究，从而确立了原花青素低聚体至七聚体的存在。此外他们使用NMR证实了原花青素至四聚体的结构，并发现它们主要由(-)_表儿茶素构成。Clapperton等人报道了 可可原花青素低聚体至八聚体的证据(Proceedings,16th International Conference of Groupe Polyphenols, Lisbon, Portugal ；GroupePolyphenols:Norbonne, France,第 II 卷，第 112-115 页，1992)，他们使用柱色谱、反相HPLC和阳离LSMS的组合来鉴定原花青素低聚体。该工作证明了阳离子LSMS的实用性以及钠加合物作为鉴定较大原花青素低聚体的手段的用途。可惜的是，所有这些方法都很费力，需要漫长的制备时间来获得结构信息，而不适合大量细胞培养物样品的高通量分析和筛选。而且，这些方法不适用于小样本。对于本发明，我们开发了用于从可可属或Herrania属细胞培养物提取原花青素的高通量微量方法、用于原花青素单体和低聚体的快速分离的反相HPLC方法，以及用于基于原花青素低聚体的分子特征对它们进行同步鉴定的质谱(MS)方法。可可属或Herrania属细胞培养物的大规模工艺优化在开发工业化生产工艺时大规模植物细胞培养是重要的技术。这可在类似于微生物发酵中所用的那些的大罐中进行。通过基于大规模工艺中的细胞生长和生产特征确定生物分子因素以及通过优化可增强原花青素生产率的大规模生物工艺变量，可以实现这些罐中生产率的增长。生物分子因素包括培养基组分、诱导剂和生物合成途径中的前体。在大规模工艺之前，应该在烧瓶规模的工艺中测试这些因素，因为放大过程的目的在于大规模重现在较小规模下观察为最适的那些条件。然而，大规模生物反应器培养中的条件与烧瓶规模培养可可属或Herrania属悬浮细胞不同。由输送限制导致的影响悬浮细胞的环境条件改变会影响培养物的宏观动力学。例如，虽然生长动力学参数是规模不依赖的，但细胞培养物在容器中的总体生长是规模依赖性的，因为气体营养物质和溶解的营养物质以及代谢产物的输送具有规模依赖性(Dicosmo和Misawa, Plant Cell Culture SecondaryMetabolism(《植物细胞培养物次级代谢》)，第11_44页，1996年。佛罗里达博卡拉顿(BocaRaton，Florida)，CRC出版社(CRC Press LLC))。因此，在放大可可原花青素生产的生物反应器工艺时，要进行许多基础实验以获得生长速率、产物形成速率、营养物质吸收速率和呼吸率的基本数据。一般而言，通过增加细胞浓度和单位生产率，可实现植物细胞培养物中的高生产率。最大细胞浓度取决于营养供给、每底物的生物质收率和水含量。基于基础数据，可以逐一变动另外的环境因素或同时变动多个因素以增加生物量。生物工艺变量如曝气率、悬浮培养的流变性能可影响生物反应器中的传质和混合，继而不仅影响细胞生长而且还影响植物次级代谢物的产量。因此，可能要考虑两步培养，因为多数多酚通常是非生长相关的化合物。因为单阶段工艺理想地将培养限制为单一生长速率并且大概限制为单一发育阶段，当几个发育阶段是产生非生长相关的化合物的前提条件时，该操作将不适合。对于生长阶段和生产阶段，分开优化曝气率变量、搅拌速度、其他混合相关变量以及甚至培养基组成。然而，在保持所有条件最适的同时放大工艺是不可能的。关于被认为是最重要的变量必须做出选择。因为碳源和氮源的相对量在增强次级代谢物生物合成和细胞生长中起重要作用，还基于碳和氮消耗的基础工程数据研究了补充碳源和氮源对于生长和产量的影响(Basaria, Current Biology (《当代生物学》)，2:370-374,1990)。然后,可研究氧和二氧化碳的供应。除氧以外，已有报道二氧化碳可改善植物细胞培养中的所述细胞生长和次级代谢物产量(Thanh 等，Biologia Plantarum(《植物生物学》)，50:752-754,2006 ;Tate 和Payne, Plant Cell Reports (《植物细胞报道》)，10:22_25，1991)。在细胞生长阶段植物细胞的氧需求相 对较低，但是在代谢物合成期间可能显著增高。对这些气体的水平进行控制以使它们在可可属或Herrania属细胞的反应器培养中的利用最佳。在大规模发酵中，弓丨入与实验室规模所引入的相同量的气体(空气、氧等)是不可能的。因此，应维持传质系数恒定以使在生物反应器过程期间表观气速恒定。氧在碳源代谢中起关键作用并且可通过分布器将其引入生物反应器的生长培养基和诱导培养基，引入的速率取决于生物体的生长或产物形成动力学(Shuler和Kargi，Bioprocess Engineering:Basic Concepts (《生物工艺工程:基本概念》)，第二版，2002。美国新泽西州上鞍河(Upper Saddle River,NJ,USA),普伦蒂斯霍尔出版社(Prentice-Hall,Inc.))。此前已演示在升高的溶解氧水平下在生物反应器中培育植物细胞以进行紫杉烷生产(常见例如美国专利N0.7，264，951)。在多种类型和尺寸的生物反应器中研究了升高的溶解氧气水平对可可细胞培养物的生长和产量的效果，包括7.5L和30L机械搅拌反应器以及IOL和20L气升式生物反应器。本发明人已发现，具有升高的溶解氧的气体状况是大规模可可细胞生长以及升高的多酚产量所需的。在供给生物反应器的空气与纯氧的共混物中，进气气体状况的氧气部分可为1%至100%，最适条件取决于培育的生长阶段或诱导阶段期间可可细胞悬浮液的需求。生长阶段或诱导阶段期间可可细胞培养基中的溶解氧浓度可为空气饱和度的I %至空气饱和度的400%。在生长阶段期间经由分布器作为空气/氧气混合物提供进生物反应器中的氧气部分在该气体混合物的1%至100%的范围内。在诱导阶段期间以空气/氧气混合物提供进生物反应器中的氧气部分在该气体混合物的1%至100%的范围内，优选在25%至100%的范围内。使用诱导剂来刺激代谢物形成和分泌是重要的工艺策略。其曾对降低达到高产物浓度(如体积生产率所需用的工艺时间十分有用。而且，诱导可导致新化合物形成(Payne等，Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems (《液体系统中的植物细胞和组织培养》)，第333-351页，1995,纽约约翰威立父子出版公司(New York, John ffiley&Sons,Inc))。在大规模反应器培养中测试用若干生物/非生物候选物进行的诱导优化，以优化应用诱导剂处理的时间、最佳的剂量、细胞暴露于诱导剂的时长以及应收获细胞的时间。因为每种诱导剂可诱导生物合成途径中的不同类型的酶，还测试使用多重诱导剂处理的协同增强效应以增强生产率。反应器操作方法取决于细胞生长动态、产量以及它们的关系。如先前所述的，在该研究中的靶标化合物是非生长相关的，这意味着必须考虑两阶段培养工艺。因此，当生产时间大大长于生长生物量所需的时间时，分批补料培养是特别有吸引力的选择，并且在该情形中，后续生物反应器体积增幅较大是有可能的，这导致该生物质序列(biomass train)中的生物反应器数量较少。V.原花青素的用途和施用可为了治疗、膳食或化妆品目的将通过本文所公开的方法生成的原花青素施用给受试者。受试者可以是人或兽类哺乳动物，如猴、马、奶牛、猪、狗、猫、小鼠或大鼠。关于治疗用途，可将原花青素用于治疗或预防若干障碍或疾病，如动脉粥样硬化症、心血管疾病、癌症、血压调节和/或高血压。例如，可将原花青素预防性地施用给有发展肿瘤风险的受试者、施用给患有肿瘤的受试者或施用给之前治疗过肿瘤的受试者。肿瘤的治疗包括但不限于手术移除肿瘤、化疗、免疫疗法或放疗。在其他实施例中，将通过本文所公开的方法生成的原花青素与至少一种另外的作用剂组合，在肿瘤治疗之前、与之同时或之后施用给受试者。另外的作用剂也可以是本文所述的抑制或降低肿瘤生长的另一作用齐U。或者，另外的作用剂可以是在肿瘤疗程期间改善受试者抑制肿瘤生长的能力的作用剂或帮助受试者对抗感染的作用剂(如抗生素)。例如，另外的作用剂可以是刺激免疫系统的作用剂，如细胞因子。可将通过本文提供的方法生成的原花青素施用给有发展任何类型肿瘤的风险的受试者，或施用给患有任何类型肿瘤的受试者。肿瘤可以是良性肿瘤或恶性肿瘤。肿瘤可包括癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤或神经系统肿瘤。在几个特定的非限制性实施例中，肿瘤包括乳腺肿瘤、肝肿瘤、胰腺肿瘤、胃肠道肿瘤、结肠肿瘤、子宫肿瘤、卵巢肿瘤、宫颈肿瘤、睾丸肿瘤、前列腺肿瘤、脑肿瘤、皮肤肿瘤、黑素瘤、视网膜肿瘤、肺肿瘤、肾肿瘤、骨肿瘤、骨肉瘤、鼻咽肿瘤、甲状腺肿瘤、白血病或淋巴瘤。一般而言,可将通过本文提供的方法生成的原花青素以足以预防或抑制肿瘤生长的量施用给受试者。在其他实施例中，可以预防性地施用原花青素给有发展动脉粥样硬化症、心血管疾病或高血压风险的受试者。或者，可施用原花青素给受试者以治疗已有的病症(如动脉粥样硬化症、心血管疾病或高血压)。组合物可以与其他作用剂(如抗肿瘤剂、抗氧化剂或缓解与动脉粥样硬化症、心血管疾病、血压调节和/或高血压相关的症状或病征的作用剂)一起施用或依次施用。此外，本发明方法生成的原花青素可用于膳食组合物中。当以液体形式经口施用时，液体可以是基于水的、 基于奶的、基于茶的、基于果汁的或它们的某种组合。用于内部施用的固体和液体制剂还包含增稠剂、甜味剂。
通过本文所公开的方法生成的原花青素还可用于化妆品组合物中以改善受试者皮肤的质量或外观。通过外用、内用或它们的某种组合施用原花青素组合物可实现皮肤外观、纹理和水分的改善。可接受的载体可在多个方面充当用于组合物成分的溶剂、载体、稀释剂或分散剂，并使得各成分能以适当的稀释度均匀地施用于皮肤表面。可接受的载体也可有利于组合物渗透进皮肤。含有通过所公开的方法生成的原花青素的组合物可用于很多的成品(包括医药产品、食品和饮料组合物)中，并可按照医药领域的技术人员所熟知的标准技术制备。取决于所选的特定施用模式，包含活性剂的药物组合物可用适当的固体或液体载体配制。可用于本公开的可药用载体和赋形剂是常规的。例如，肠胃外用制剂通常包含注射用流体，该流体是在药学上以及生理学上可接受的流体溶媒(如水、生理盐水、其他平衡盐溶液、葡萄糖水、甘油等)。可包括的赋形剂是例如其他蛋白质，如人血清白蛋白或血浆制备物。如需要，待施用的原花青素组合物也可含有微量的无毒辅助物质，如润湿剂或乳化剂、防腐剂以及PH缓冲剂等，例如醋酸钠或脱水山梨醇单月桂酸酯。除注射用流体外，还可使用局部用制剂和口服制剂。口服制剂可以是液体(例如，糖浆剂、饮料、溶液剂或混悬剂)，或固体(例如，散剂、丸剂、片剂或胶囊剂)。对于固体组合物，常规的无毒固体载体可包括药物级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。局部用制剂可包括滴眼剂、软膏齐 、霜齐 、喷雾剂等。优选地，将适于局部施用的本发明制剂与组合物成分的溶剂、载体、稀释剂或分散剂相混合，并使各成分能以适当的稀释度均匀施于皮肤表面。可接受的载体也可有利于组合物渗透进皮肤。原花青素组合物的剂型将由所选施用模式确定。制备这种剂型的实际方法对于本领域技术人员而言是已知或将是显而易见的。可将通过本公开的方法生成的原花青素组合物以多种方式(如局部、经口、静脉内、肌内、腹腔内、鼻内、皮内、鞘内和皮下)施用给人或兽类哺乳动物，原花青素组合物对它们的细胞发挥效应。本领域技术人员考虑到案例的具体情况(例如受试者、疾病、所涉及的疾病状态以及治疗是否是预防性的)来选择具体的施用模式和给药方案。治疗可涉及在几天到数月或甚至数年的时期内每日或每几天一次剂量的化合物。可考虑诸如具体受试者的年龄、性别、体重和状况及施用途径之类的因素，将这样的组合物以一定剂量并通过医药、营养或兽医领域技术人员熟知的技术施用给需要这种施用的受试者。用于治疗、膳食、化妆品和兽用用途的组合物的制备、剂量和施用是本领域众所周知的(参见例如，美国专利 N0.5，554，645、N0.5，853，728、N0.6，194，020、N0.6，312，753、N0.6，998，417、N0.7，122，574、N0.7，314，634、N0.7，320，797 和美国专利申请公布N0.2007/0148107，将这些以引用的方式并入本文)。提供如下实例以阐明某些特定的特征和/或实施例。这些实例不应理解为将本发明限于所述的特定特征或实施例。实魁实例1:从花组织诱导和增殖可可树愈伤组织使用补加有生长素(2mg/L2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D))、细胞分裂素(0.005mg/L噻苯隆(TDZ))和其他 补充剂(250mg/L L-谷氨酰胺、100mg/L肌醇)的全强度Driver andKuniyuki walnut (DKff)培养基，并使用[D+]-葡萄糖作为碳源(表I中的培养基I)，在控制条件下，建立致密愈伤组织聚集体(aggregate)。将培养基pH调整至5.8后，对培养基进行高压灭菌。从多个栽植植株收获可可不成熟花材料的样品。为防止培养物的污染，将材料先进行表面灭菌再将它们引入到培养基。首先将材料浸在1% ( /V)次氯酸钠中20分钟，并每隔5分钟轻轻搅动。在无菌条件下，轻轻倒出材料，用无菌去离子水清洗三次，每次清洗过程中轻轻搅动。轻轻倒出最终清洗液，只将花芽转移到无菌平板。使用无菌解剖刀，在距基部1/3花长度的位置处将花芽横切。通过切端开口提取退化雄蕊、萼片和花瓣基部外植体。将提取的材料接种在固体愈伤组织诱导培养基上。在每个平板的整个表面上分布大约50个外植体。用封口膜(parafilm)封住平板并在暗处25°C下维持14天。10天后观察到大量的愈伤组织形成。在将花部分放在愈伤组织诱导培养基上14天内，从外植体分离愈伤组织并将其放在愈伤组织增殖培养基上(表I所列的培养基Ι、Π和III)。在四个星期时间间隔，从愈伤组织的表面分离快速生长的细胞并分培到新鲜培养基。选择呈现发白至浅黄颜色的快速生长的 细胞系进行分培(图1)。实例2:从营养组织诱导和增殖可可树愈伤组织在补加有生长素(2mg/L IAA和4mg/L IBA)、细胞分裂素(0.005mg/LTDZ)和L-谷氨酰胺(250mg/L)并以葡萄糖(20g/L)为碳源的Murashige and Skoog(MS)培养基(表I的培养基XXVII)上建立愈伤组织。将培养基pH调整至5.8后，对培养基进行高压灭菌。从多个温室生长的植株收集可可营养组织材料(幼叶和成熟叶，节和节间)的样品。为防止培养物的污染，将材料先进行表面灭菌再将它们引入到培养基。首先将材料浸在70%乙醇中I分钟，然后浸在25%漂白剂中10分钟，并每隔5分钟轻轻搅动。在无菌条件下，轻轻倒出材料，用无菌去离子水清洗三次，每次清洗过程中轻轻搅动。将叶子切成5mm正方形和将节和节间切成l_2mm圆柱体，并移植到含有固体培养基的平板上。将平板维持在暗处25V下。每天对它们观察污染迹象并弃去受污染的材料。4个星期后观察到愈伤组织形成。6个星期后，从外植体分离愈伤组织并将其放在如上所述和如培养基XXVII (表I)所示的愈伤组织增殖培养基上。但是，在引发后，愈伤组织非常快速地增殖和建立。在两个星期时间间隔，从愈伤组织的表面分离新形成的细胞并分培到新鲜培养基。选择呈现浅黄至浅棕颜色的快速生长的细胞系进行分培。在建立了可可愈伤组织后，有必要测试较低含量的生长素对愈伤组织的持续性的效应，因为培养基XXVII中的高生物素含量延迟细胞生长并在后续各代中形成非常棕色的愈伤组织，这表明细胞经历着应激。测试各种培养基维持可可愈伤组织的能力以及维持培养基对细胞悬浮物的产生的下游效应。培养基XXVII为MS培养基补加6mg/L的生长素(2mg/LIAA和4mg/L IBA)、2X MS维生素和250mg/L的谷氨酰胺并含20g/L的葡萄糖和7g/L的琼脂。为进行维持，将培养基中的生长素减少到4mg/L(2mg/L IAA和2mg/L IBA，表I中的培养基XXVIII)和IBA形式的2mg/L生长素(表I中的培养基XXIX)。将生长素减少至4mg/L改善了愈伤组织的颜色，从深棕色变成浅棕色至黄色。愈伤组织细胞生长回复到旺盛水平。细胞悬浮培养物建立起来与从在培养基XXVII上分培的健康愈伤组织建立细胞悬浮培养物一样容易。在含有2mg/L生长素的培养基中，愈伤组织的颜色改变，并且细胞生长回复到旺盛水平。但是，当将这些愈伤组织分培到相同培养基上时，愈伤组织的细胞生长较之培养基XXVIII上的愈伤组织减少了。在将生长素减少到2mg/L后，还记录了额外MS维生素的去除(表I中的培养基XXX)结合谷氨酰胺的去除(表I中的培养基XXXI)对生长的效应。来自这两个培养基的愈伤组织在生长特征方面与培养基XXIX上的愈伤组织看起来没有不同。但是，注意到培养基中额外维生素的存在对于原花青素的产生而言是有利的。维持可可营养愈伤组织的最佳培养基是培养基XXVIII，因为这使得愈伤组织持续性时间长，并且使得容易建立细胞悬浮物和维持原花青素生产率。实侈Il 3:大花可可木对矛口 Theobroma obovatum愈伤组织诱导SlJ:曾殖使用诸如实例I和2中对可可树所描述的方法，建立大花可可树和Theobromaobovatum的愈伤组织培养物。实例4:悬浮物引发通过将从实例I中描述的花外植体产生的白色新鲜愈伤组织接种到含有25ml的20个不同种类的液体培养基(培养基IV-XXIII ;表1)的125ml三角烧瓶中，建立细胞悬浮培养物。将烧瓶用有机硅泡沫盖盖住，在完全黑暗、24±1°C下的恒温控制室中以120rpm旋摇进行振荡54天。每个星期或者每两个星期按需转移分培物。保留作为细胞的颗粒悬浮物或者细小悬浮物形成的培养物，而弃去不形成悬浮培养物的培养物。在14天的细胞生长后，将10% (v/v)的细胞转移到含有25ml新鲜培养基的新的125ml烧瓶中，之后每两个星期进行分培。培养基VIII在悬浮细胞引发中表现出最佳的细胞增殖性能(在第14天45%PCV)。为产生非花组织(营养组织，即节、节间、幼叶、成熟叶)的悬浮物，将实例2中产生的愈伤组织以与上文对花外植体所述的方式相似的方式转移到液体培养基。所用的培养基为培养基XXIV，其与常规维持培养基VIII差别在于盐的类型(MS盐而不是DKW盐，MS盐含有更多的铵和氮源及更少 的硫酸盐)，其包含2mg/L IAA和4mg/L IBA代替2，4-D作为生长素，并且含有两倍浓度的MS维生素(表I)。这个培养基与其中引发营养组织的固体培养基即培养基XXVIII相似，但不含胶凝剂琼脂。在这个培养基中，悬浮培养物建立得较快，愈伤组织在七天时间里消耗掉培养基中的所有糖，而在培养基VIII中引发的愈伤组织通常要花2-3个星期才能消耗掉全部碳水化合物源。非花组织的这些建立的悬浮物的原花青素生产率也高于从花组织产生的悬浮物(1.1g总原花青素/L培养物)(图2A-2B)。实例5:花组织衍生的悬浮细胞培养物的细胞生长、细胞选择和培养物优化本实例描述用于增加悬浮物的细胞生长的方法。细胞培养物生产率随细胞生长的速率和细胞生长停止时的密度而增加。为确定最佳接种密度，将可可树细胞的悬浮培养物以10、15和20% (v/v)的起始细胞密度进行引发并让其生长14天。图3显示生物量密度与接种物密度的变化关系的典型时间进程。以10%的细胞密度引发的培养物表现出生长显著迟滞，在14天内没有达到最大密度。以培养基VIII中15%和20%的细胞密度引发的培养物在13天内密度翻倍，在14天内达到40-43%的最大平均细胞密度。但是，在该细胞选择过程后第14天一些培养物表现出超过50-60%细胞密实体积(PCV)。除培养基VIII不含Phytagel之外，培养基VIII和培养基I是相同的配方。这两个培养基都是基于使用几种储备溶液制备的DKW盐和维生素，这可能会导致培养基组分存在批次差异。因此，使用预混合的DKW基础盐(植物技术实验室(PhytotechnologyLaboratories, LLC),目录号D190)制备培养基XXXII，并在培养基VIII和XXXII之间比较悬浮细胞生长。在任一培养基中都不存在细胞生长的显著差异。因此，将培养基XXXII日常用于维持来自花组织的悬浮培养物。在培养中每隔七天测量生物量增加量、糖消耗量和原花青素生产率。这些数据对于合乎需要的细胞选择过程是非常重要的。优先基于PCV和糖消耗量测量结果选择生长良好的细胞，然后基于原花青素生产收率从生长良好的细胞系当中挑选产量良好的细胞系。较高的生物量和较高的原花青素生产收率可提高一个批次循环的生产率。该细胞选择过程之前的平均原花青素生产率为52mg原花青素/L培养物，在一年的该细胞选择过程后提升到251mg/L的水平，达到的最高水平为1.6mg原花青素/L培养物。最高生产收率也提高到超过 5.0g/L PCV。使用B5主要盐和MS次要盐开发培养基XXV，从而与培养基VIII的平常维持培养基相比降低铵离子在培养基中的浓度。碳水化合物源为60g/L蔗糖，激素为0.lmg/LNAA和0.2mg/L激动素，相比于2mg/L 2，4-D和0.005mg/L TDZ0在2个星期的时间里，在培养基XXV中测试的悬浮物没有显示生长，但原花青素在悬浮物中的积累水平达对照培养基VIII的4倍(培养基乂乂￥超过9511^/1，相比之下培养基￥111为2211^/1)。这可能是因为这个培养基中硝酸盐/铵离子的比例较高，并且细胞分裂素与生长素相比过量。用MS盐、30g/L蔗糖和1.5mg/L 2，4_D开发了培养基XXVI。转移在这个培养基中的悬浮培养物显示出较高的原花青素积累，在第13天为培养基VIII的4倍(培养基XXVI为87mg/L，相比之下培养基VIII为22mg/L)。尽管两种培养基之间细胞生长相对而言近似(培养基VIII中61% PCV自(from) 22% PCV，相比之下培养基XXVI中60% PCV至(to) 25%PCV)，但糖的消耗不同，表明细胞会偏好葡萄糖作为碳水化合物源。用大花可可树和Theobroma obovatum进行了类似的研究。细胞培养物生产率随细胞生长的速率和细胞生长停止时的密度而增加。为确定最佳接种密度，将大花可可树和Theobroma obovatum细胞的悬浮培养物以10、15和20% (v/v)的起始细胞密度进行引发并让其生长14天。`一般而言，以较高的密度引发的细胞具有较短的生长周期或者较早地达到最大细胞密度。以10%的细胞密度引发的培养物表现出生长显著迟滞，在14天内没有达到最大密度。以15%和20%的细胞密度引发的培养物在13天内密度翻倍，在14天内达到40-43%的最大细胞密度。这个生长速率比之前对其他植物细胞悬浮培养物(如红豆杉属(Taxussp.))所报道的生长速率慢。但是，可通过进一步优化生长培养基和严格选择细胞(如以下实例6中所描述)来提高可可属细胞培养物的细胞生长。实例6:营养组织衍生的悬浮细胞培养物的细胞生长、细胞选择和培养基优化在培养中每隔七天测量生物量增加量、糖消耗量和原花青素生产率。这些数据对于合乎需要的细胞选择过程是非常重要的。优先基于PCV和糖消耗量测量结果选择生长良好的细胞，然后基于原花青素生产收率从生长良好的细胞系当中挑选产量良好的细胞系。较高的生物量和较高的原花青素生产收率可提高一个批次循环的生产率。新产生的细胞悬浮培养物通常是细胞的不均匀混合物。这个不均匀性在大规模悬浮培养物中导致不平衡的细胞生长和所需代谢产物的不稳定生产模式。可通过分培和选择具有所需特征的培养物，从这些不均匀混合物衍生出适于大规模生产的均匀细胞培养物。开发了选择性且快速的筛选法来检测多酚和细胞生长以协助这个过程。使用实例8中描述的丁醇-HCl水解方法监测多酚积累，并采用细胞密实体积(PCV(% )=细胞体积100/总细胞体积)作为生物量的度量。碳水化合物消耗速率通过折射指数(BriX% )作为细胞代谢的度量来进行测量。营养组织(节)衍生的悬浮培养物如实例2和4中所描述衍自愈伤组织。选择一个生长良好的细胞系(MX1440-3496)并在三种不同的培养基中生长，所述三种不同的培养基在基础培养基的类型(DKW盐对比MS培养基)以及激素的类型和数量方面改变(表I中的培养基ΧΧΧΠ、ΧΧΧΙΙΙ和XXXIV)。培养基XXXII和XXXIV中的细胞密实体积(PCV)在第7天仅仅为33.7±4.7%和25.7±4.0%，显示出生长比培养基XXXIII (47.6±6.6% )要慢。细胞生长速率对于使细胞培养过程中的体积生产率最大化是非常重要的。培养基XXXIII在碳水化合物消耗速率方面也较优，该速率是通过废培养基的折射指数(RI)来测量。将培养基XXXIII中的初始葡萄糖浓度(2% )调整为3%，因为ΜΧ1440-3496细胞系的葡萄糖消耗速率在指数生长期后期放慢。因此，选择培养基XXXV作为ΜΧ1440-3496细胞系的进一步细胞选择过程的维持培养基。
优选在每个分培时间选择生长良好、不成块或者形成聚集体的细小细胞以提高体积生产率和消除聚集的细胞，因为选择大的或者成块的细胞聚集体会导致培养性能不良。因此，选定的细胞具有主要黄颜色的细小细胞形态，并且细小的悬浮培养物导致了更好的生长和均匀悬浮培养物的产生。ΜΧ1440-3496细胞系最初以超过15天的倍增时间生长，而在执行了该细胞选择过程后倍增时间显示出降低到10天。在该细胞选择过程之前总原花青素产生水平最初为0.5g/L PCV，但经过该细胞选择过程提高20.4倍(10.2g/L PCV)(图4)。实例7:从可可属愈伤组织培养物和悬浮培养物提取多酷本实例描述被开发用于从实例1-4中开发的可可属培养物的愈伤组织和悬浮细胞提取多酚的方法。本实例的实验中具体使用可可树的培养物。用1.5ml包含0.1%H2S04的50% (v/v)乙醇从大约0.25±0.04g鲜重的愈伤组织提取多酚，并用1.5ml包含0.1 %H2S04的80% (v/v)甲醇从0.l±0.003g干重的悬浮细胞(无培养基上清液)提取多酚。将细胞放在微量离心管(2.0ml)中并用珠磨匀浆机均质I分钟。将均浆在3500rpm下离心20分钟，仅将上清液转移到另一微量离心管。当需要筛选大量的悬浮细胞培养物时，如下使用更为强大的高通量方法:从待分析的细胞培养物的每个烧瓶取Iml等分试样到96深孔板中。在转移到96深孔板之前还记录样品的细胞密实体积(PCV)。通过将板在台式离心机中在6000rpm下离心4分钟使每个孔中的细胞沉淀。用塑料转移吸管将每个孔的上清液移除并弃去。接着，向每个孔加入0.5ml的提取溶剂(80: 20甲醇:水)和碳化钨小珠，将板放在混合型研磨仪(Mixer Mill)上将细胞在15Hz下研磨2分钟。然后将板转移到离心管，通过在6000rpm下离心4分钟使细胞碎片沉淀。实例8:培养物中的多酚产暈的初步分析用于进行原花青素分析反应的方法被设计成非常近似地模拟原始的Swain和HillisCJ.SC1.Food Agric.(《食品和农业科学杂志》)10:63，1959)方法和Porter等人(Phytochemistry (《植物化学》)，25⑴:223，1986)方法。使用丁醇-HCl提取测定法来测量可可树悬浮细胞的提取物中的多酚。通过将0.1ml的含水甲醇提取物和1.0ml的丁醇-HCl试剂(95: 5v/v)进行组合并将该溶液在Qiagen深孔块(deep well block)(美国加州巴伦西亚)中于75°C下加热60分钟，使多酚水解成(-)_表儿茶素和花青素单体。通过粉红色颜色的形成观察到花青素在水解样品中的存在。测定280和520nm处的吸光度,并使用校准曲线基于所形成的花青素的量计算原花青素含量，所述校准曲线是使用不同浓度的原花青素B2(购自美国加州欧文市Chromadex, Inc.公司)产生。更亮的粉红色表示悬浮培养物中更高浓度的原花青素(图5A)。基于这个方法，几个悬浮培养物的原花青素含量在250mg/L 至 1000mg/L 的范围内。实例9:花衍生的细胞悬浮物的细胞选择和培养基优化过程在培养中每隔七天测量生物质增加量、糖消耗量和原花青素生产率。这些数据对于合乎需要的细胞选择过程是非常重要的。优先基于PCV和糖消耗量测量结果选择生长良好的细胞，然后基于原花青素生产收率从生长良好的细胞系当中挑选产量良好的细胞系。较高的生物质和较高的原花青素生产收率可提高一个批次循环的生产率。该细胞选择过程之前的平均原花青素生产率为52mg原花青素/L培养物，在一年的该细胞选择过程后提升到251mg/L的水平，达到的最高水平为1600mg原花青素/L培养物(图2C)。最高生产收率也提高到超过5000mg/L PCV (图2D)。使用B5主要盐和MS次要盐开发培养基XXV，从而与培养基VIII的平常维持培养基相比降低铵离子在培养基中的浓度。碳水化合物源为60g/L蔗糖，激素为0.lmg/LNAA和0.2mg/L激动素，相·比于2mg/L 2，4-D和0.005mg/L TDZ0在2个星期的时间里，在培养基XXV中测试的悬浮物没有显示生长，但原花青素在悬浮物中的积累水平达对照培养基VIII的4倍(培养基乂乂￥超过9511^/1，相比之下培养基￥111为2211^/1)。这可能是因为这个培养基中硝酸盐/铵离子的比例较高，并且细胞分裂素与生长素相比过量。用MS盐、30g/L蔗糖和1.5mg/L 2，4_D开发了培养基XXVI。转移在这个培养基中的悬浮培养物显示出较高的原花青素积累，在第13天为培养基VIII的4倍(培养基XXVI为87mg/L，相比之下培养基VIII为22mg/L)。尽管两种培养基之间细胞生长相对而言近似(培养基VIII中61% PCV自22% PCV，相比之下培养基XXVI中60% PCV至25% PCV)，但糖的消耗不同，表明细胞会偏好葡萄糖作为碳水化合物源(图2E)。实例10:添加葡萄糖以提升生产率本实例描述用于通过补加葡萄糖提高可可悬浮培养物的原花青素生产率的方案的开发。通过将培养基从生长培养基改变成生产培养基诱导了植物次级代谢产物产生。对于生产培养基的优化，碳水化合物源或者氮源都可认为是关键因素。在指数生长期结束时使用葡萄糖形式的额外碳水化合物，以提高来自花组织和营养组织衍生的悬浮培养物的原
花青素产量。通过添加葡萄糖，从花组织衍生的悬浮细胞系(MX1241-58)获得了原花青素生产率的显著提升。将培养物在培养基XXXII中在实例5描述的正常培养条件下正常维持7天。在第7天在添加葡萄糖之前获取MX1241-58细胞培养物样品，其PCV和RI平均为49.5±3.5%和0.2。平均原花青素生产水平为189.5±17.7mg/L PCV。在第7天，将5ml的50%葡萄糖储备溶液添加到悬浮培养物以调整RI至超过3%，并且随后在培养基中葡萄糖浓度低于0.5%时重复操作。添加葡萄糖后，用手剧烈摇动烧瓶中的培养物大约10秒钟以使悬浮物中的浓缩葡萄糖分散，并再次测量RI，平均值为3。在不同的培养日(在第
7、11、16和21日)添加葡萄糖3-4次并添加新鲜培养基一次(第25天)后，原花青素生产水平提高到最高达4.4g/L PCV，这比其初始值高24倍，并且PCV从49.5 ±3.5%提高到
69.0±1.4%。对细胞系MX1440_3496(实例6中描述)实施了类似的处理以改进其生产水平。这个实验被设计用来测试该细胞系对添加葡萄糖的响应。如实例6中所述，将MX1440-4496细胞系维持在培养基XXXIII中。在第6天，随机挑选MX1440-3496细胞系的6个烧瓶并分成两组，每组三个烧瓶。一组三个烧瓶用50%葡萄糖储备溶液处理，另一组3个烧瓶不进行处理。在第6天所有六个烧瓶添加葡萄糖之前的测量值平均为:PCV45%，R10.3±0.1，原花青素产量2.41±0.19g/L PCV。将5ml的50%葡萄糖储备溶液添加到三个处理的烧瓶。在添加葡萄糖后，处理的烧瓶的平均RI增加至IJ 6.0 ± 1.1，平均PCV为39.7 ± 0.6 %。在添加葡萄糖后第1、3、4、5和6天对所有烧瓶取样并测量它们的PCV、RI和原花青素产量。未处理的烧瓶显示出RI无显著变化，PCV从45%稍微增加到53±3.6%。在处理后第6天，它们的产量保持在2.83± 1.17g/L PCV。相反，处理的烧瓶显示出在第6天PCV增加到53 ±2.7 %，稳定地提高。RI每天以0.6-0.8个RI单位的速率显著下跌，从第O天的6±1.1跌至第6天的2.0± 1.3。同时，它们的产量也从添加葡萄糖之前的2.42± 1.93g/LPCV提高到第5天的12.93±2.24g/L PCV。葡萄糖处理导致了原花青素产量提高，这些生产特征代表了原花青素生产的细胞培养过程的显著改进，如图5A中所示。同时，通过添加3%、5%和6 %的葡萄糖，从MX1440-3496细胞系获得了原花青素生产率的改进。这个实验被设计用来测试该细胞系对添加葡萄糖的响应。如实例6中所述，将MX1440-4496细胞系维持在培养基XXXV中。在第4天，随机挑选MX1440-3496细胞系的12个烧瓶并分成四组，每组三个烧瓶。三个组用不同浓度(培养基的体积的3%、5%和6% )的葡萄糖处理，第四组不进行处理。使用折射计检查每个烧瓶中的葡萄糖浓度以核实RI是否分别为3、5和6。在第4天所有六个烧瓶添加葡萄糖之前的测量值平均为:PCV45%，RI0.7±0.1，原花青素产量13.5± 1.0g/L PCV。在添加葡萄糖后第3、6、8和9天对所有烧瓶取样并测量它们的PCV、RI和原花青素产量。未处理的烧瓶显示出RI无显著变化，PCV稍微增加。在处理后第9天，它们的产量保持在12.8±3.lg/L PCV。相反，处理的烧瓶显示出RI每天以
0.7个RI单位的速率显著下跌，在第9天跌至0.07± 1.3。同时，它们的产量也稳定地提高，尤其是6%处理组显示出猛烈的提高，从添加葡萄糖之前的13.5±1.0g/L PCV提高到处理后第9天的40.6±4.12g/L PCV。葡萄糖处理导致了原花青素产量提高，这些生产特征代表了原花青素生产的细胞培养过程的显著改进，如图5B中所示。另一个提升悬浮培养物中的原花青素产量的方法是反复诱导。在第7和第13天，向培养基添加葡萄糖，它们的RI增加到最高达6% Brix。该反复诱导使悬浮细胞稳定地产生原花青素化合物。在第一次诱导之前，原花青素产量为3.2±0.lg/L PCV，但在第13天被提高到12.6±1.3g/L PCV，在第20天到29.5±2.8g/L PCV。葡萄糖的反复添加提供了提高可可悬 浮细胞培养物的原花青素产量的简单有效的方法，如图6中显示，其中箭头显示给予葡萄糖。
在每个分培时间进行的反复细胞选择收集了生长良好和产量良好的细胞，然后从第4 5天培养基XXXV中的初始3%葡萄糖浓度变得有限。这对细胞提供非常严酷的应激，它们在悬浮培养物中开始变得更加聚集。通常，聚集会成为工艺放大到大规模生产系统的障碍。因此，将3%的初始葡萄糖浓度增加到4% (培养基XXXVII)以不产生任何来自碳水化合物限制的应激。这个4%葡萄糖浓度使细胞系的维持更加稳定，在烧瓶悬浮培养物以及生物反应器培养物中没有聚集现象。
_7] 实例11:在无激素培养基中培养细胞并对这些细胞进行i秀导本实例描述连续2个星期在无激素的培养基中生长细胞并产生原花青素。将通过实例2和4中的方法产生的细胞在培养基XXXVI (表I)中连续培养2个星期。这个培养基无激素添加到基础培养基即培养基XXXV (表I)。初始接种物设定为25%。让细胞在无激素培养基中生长7天，然后在无激素培养基中第二次分培又是7天时间。在转移到新鲜培养基中的第6天记录生长和生产数据。发现细胞的生长从45-50% %降低到35-40%，降低了 10-15%。但是，每升PCV的产量与对照细胞相比增加了 2.5-3倍。总体积生产率为对照细胞的约2-2.5倍。这表明了从培养物移除激素后维持生产率的能力，如图7A中所示。这在加工方面是一个重要成就，因为从监管的观点看，从最终数个星期的生产中移除激素是一个重大优势。测试了生长中的细胞在无激素培养基中在葡萄糖诱导下的协同作用的可行性。使细胞在无激素培养基TC3015中生长I个星期。在培养的第7天，对照细胞和经处理的细胞的RI均从初始值3.0变成在0-0.6之间。在这个时间，给予细胞6%葡萄糖并让其再生长7天。在诱导的第O天和第7天取样。发现激素的移除和葡萄糖的诱导存在累加作用。在仅进行诱导处理的对照细胞中每升PCV的产量增加约2.5倍，而在同时用无激素培养基和添加诱导剂(如葡萄糖)处理的细胞中该变化倍数为约4倍。激素的移除增加了产量近2倍，然后在对这些细胞进行诱导后发现又增加2倍，因此这两种处理一起存在明显的累加作用(图7B)。
实例12:从新鲜的可可细胞或者经研磨的冻干细胞小规模提取多酷取无培养基的可可细胞样品(0.5ml)或者50mg经研磨的可可细胞样品，放在96孔板(凯杰公司(Qiagen，Inc))中的2.0ml微管或者1.2ml管中。向每种可可细胞加入适当体积的酸性(0-2%的柠檬酸、乙酸或者抗坏血酸)含水提取溶剂(30-80%的丙酮、乙醇、甲醇)，然后放入超声发生器或者BeadMill中以提取原花青素。将样品在6000rpm(RCF5996)下离心4分钟。使上清液滤过0.45um膜过滤器，并在分析前用相同的含水提取溶剂稀释10倍(如需要)。剩余的提取物保藏于-20度的冷冻机中以供进一步分析。图12示出得自各个溶剂系统的结果。
_2] 实例13:来自可可树愈伤组织和悬浮细胞的多酚的分析。用于进行原花青素分析反应的方法被设计成模拟原始的Swain和HillisCJ.SC1.Food Agric.(《食品和农业科学杂志》)，10:63，1959)方法和Porter等人(Phytochemistry (《植物化学》)，25 (I) =223,1986)方法。使用丁醇-HCl水解测定法来测量可可树细胞的提取物中的原花青素。通过将0.1ml的含水乙醇、甲醇或者丙酮提取物和
1.0ml的丁醇-盐酸试剂(95: 5v/v)进行组合并将该溶液在Qiagen深孔块(美国加州巴伦西亚)中于75 °C下加热60分钟，使原花青素水解成(-)_表儿茶素和花青素单体。通过红色颜色的形成观察到花青素在水解样品中的存在。以分光光度法测定280和520nm处的吸光度，并使用校准曲线基于所形成的花青素的量计算原花青素含量，所述校准曲线是使用不同浓度的原花青素B2(购自美国加州欧文市Chromadex, Inc.公司)产生。更深的红色颜色表示愈伤组织或者悬浮培养物中更高浓度的原花青素(图8A-8C)。使用Waters(美国马萨诸塞州米尔福德市)Alliance HPLC系统对可可树细胞提取物进行LC分析,该系统装配有CTC Analytics PAL自动进样器(Leap Technologies公司，美国北卡罗来纳州卡勃罗市(Carrboro))、带600S控制器的Waters 626泵和从190-780nm扫描的Waters 2996光电二极管阵列检测器(PDA)。用水-0.1%甲酸(溶剂A)和乙腈-0.1%甲酸(溶剂B)以0.3ml/分钟的恒定流速进行梯度洗脱。以溶剂B的以下比例(vlv)施加线性梯度(t (min)，％ B): (0，7)、(5，15)、(20，75)、(25，100)、(35，100)、(35.1,7) (45，7)。柱子为 UltraAqueous C18 柱(100X2.1mm 内径，3.5 μ m) (Restek 公司，美国宾夕法尼亚州贝尔丰特(Bellefonte))。于280nm处监测原花青素单体(+)-儿茶素、(-)_表儿茶素和低聚原花青素(二聚体至六聚体)。使用Waters Quattro Micro三重四级杆质量检测器(美国马萨诸塞州米尔福德市)获取MS数据，并通过MassLynx 软件进行分析。从m/z 150到1800扫描，进行全扫描数据采集。儿茶素、表儿茶素的真实标准品购自西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich, Inc.)(美国密苏里州圣路易斯)，制备稀释液来产生校准曲线以检测和定量代谢物。(图9A至9C)。使用 Folin- Ciocalteau 测定法(waterhouse.ucdavis.edu/phenol/folinmicro网站；以及 Slinkard, K.；Singleton, V.L.Total Phenol Analysis !Automation andComparison with Manual Methods (总酌.分析:用手工方法进行自动化和比较).AmericanJournal of Enology and Viticulture (《美国葡萄酒酿造学和葡萄栽培杂志》)，1977, 28:49-55)，测量细胞提取物的总多酚含量。如下对实例9中所描述的细胞培养物提取物进行总多酚含量分析:取20 μ I提取物，将其加到1.58ml的水和100 μ I的Folin-Ciocalteau试剂。然后通过加入300 μ I碳酸钠溶液终止反应。所得的溶液在765nm处测量，并与通过相同测定法测量的没食子酸溶液的多个稀释液的校准曲线进行比较，以测定细胞提取物中的总多酚的浓度。通过正相HPLC系统进行可定量的原花青素的分析，该系统由Waters 2795分离模块、Waters 996 PDA检测器和Waters 474扫描荧光检测器组成。使用DevelosilDiol (250X4.6mm内径,5 μ粒度),按改编自Kelm等人,“用于分析、分离和离析极性质子单体和/或低聚体的改进方法”(美国专利第0075020号)的方法，获得可可细胞提取物中原花青素的表征和分离条件。二元流动相由溶剂(A)乙腈:乙酸(98: 2，v/v)和溶剂(B)甲醇:水:乙酸(95: 3: 2，v/v/v)组成。用0.8ml/min流速在30°C下如下进行线性梯度洗脱:0-35min, 100-60% A ；35-40min, 60 % A ；40-45min, 60-100 % A。通过荧光检测(276nm激发波长，316nm发射波长)、280nm紫外检测，监测原花青素低聚体的分离(图1OA) ο (Lazarus 等人，J.Agric.Food Chem (《农业和食品化学杂志》).47 (1999), 3693)和PDA (图 10B)。该分析方法的目的是定量新鲜可可细胞或者冻干细胞中的十种不同的单独原花青素的量。可定量的原花青素有单体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体和十聚体。
通过在Empower 2上执行内部HPLC方法，对从新鲜可可细胞、冻干可可细胞和可可细胞提取物制备的样品进行原花青素定量分析。使用公司内的标准储备溶液来制备低聚原花青素的校准曲线。使用公司内的纯化的标准化合物，以20、40、80和100ug/ml的系列稀释度制备一组标准品。这些标准品校准曲线是对10种目标化合物(单体到十聚体)进行定量的基础。实例14:可可碱和咖啡闵的分析使用LC/MS分析方法，分别测定出可可碱和咖啡因(各粒脱脂可可树种子中的主要生物碱)的含量为25.2mg/g干重和4.6mg/g干重。相反，可可悬浮细胞不产生可测量的咖啡因(图9C和9F)或者可可碱(图9B和9E)，而它们产生的儿茶素和表儿茶素含量与种子相当(图9A和9D)。可可碱和咖啡因的真实标准品购自西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich, Inc.)(美国密苏里州圣路易斯)，制备稀释液来产生校准曲线以检测和定量这些代谢物。这些结果证明植物细胞培养物可产生高浓度的目的化合物，而不需要的化合物的污染极少。可可碱和咖啡因的定量也是在由Waters 996 PDA检测器组成的Waters2795分离模块(美国马萨诸塞州米尔福德市)上进行。按改编自Kelm等人(J.Agric.Food Chem.(《农业和食品化学杂志》)，2006，54，1571)的方法，在Develosil Diol (250 X 4.6mm内径，5 μ粒度，菲罗门公司(Phenomenex),美国加州托兰斯市)上使用280nm紫外,进行可可细胞提取物中的咖啡因和可可碱的分离。二元流动相由溶剂(A)乙腈:乙酸(98: 2，v/v)和溶剂(B)甲醇:水:乙酸(95: 3: 2, v/v/v)组成。用0.8ml/min流速在3(TC下如下进行线性梯度洗脱:0-35min，100-60% A ；35-40min, 60% A ；40-45min, 60-100% A。分别采用1、10、20、50、100、200和500呢/1^的系列稀释度，制备咖啡因(西格玛奥德里奇公司，美国密苏里州圣路易斯)和可可碱(西格玛奥德里奇公司，美国密苏里州圣路易斯)的标准储备溶液。按照上文实例#对可可悬浮细胞和实例#对未发酵可可豆所描述，一式两份制备样品。所有样品经0.45um膜过滤器过滤后注射到HPLC模块中。表3显示样品中的咖啡因和可可碱的测定值。可可细胞提取物中的咖啡因和可可碱分别测定出在0.27 0.49ug/mg的范围内和在0.32 0.73ug/mg的范围内，未发酵可可豆提取物中的咖啡因和可可碱分别测定出为14.lug/mg和49.3ug/mg。根据对数据的分析,可可细胞较之未发酵可可豆提取物实质上不含咖啡因和可可碱(图11)。因此，当咖啡因和可可碱分别小于约0.5ug/mg和0.75ug/mg时，提取物组成可被认为实质上是不含黄嘌呤生物碱的。实例15:可可悬浮培养物的放大使用植物细胞培养物的一个普遍问题是获得目标产物的持续产生(Kim等人，Biotechnol Prog.(《生物技术进展》)，20 (6) 1666，2004)。因此，成功的大规模植物细胞培养的一个关键是维持稳定的生产率。成功进行了将可可细胞悬浮培养从125ml烧瓶放大到500ml烧瓶的工艺，因为在放大条件下可可细胞生长和产量十分一致和稳定。选定的细胞系的平均PCV七天达45 55%，这比20%的初始PCV水平高大约2.5倍。在旋转振荡器上在维持培养基即培养基VIII中进行更大规模的培养物的生长，对于125ml和500ml三角烧瓶旋转速度为I IOrpm,对于2800ml Fernbach烧瓶旋转速度为50rpm,均在黑暗条件下进行。在培养中每隔七天，测量生物量、培养基中糖浓度和原花青素生产率。
将2.7L的可可细胞接种到6.5L生物反应器(工作体积=5.0L)中，并在0.2vvm(气体体积/体积培养物/分钟)的空气流速、IOOrpm搅拌速度和23°C容器温度下培养七天。生物量增加得十分缓慢，迟滞期持续四天。高的接种体积对于细胞而言是一个问题，因为这会限制营养物可得性，并且使得难以均匀混合细胞。理想的是，起始接种物体积应在25-40% PCV之间。影响生物量浓度和比生产率重要因素之一，是溶氧(DO)浓度和溶解气态代谢物如 C02 的气体交换(Dicosmo&Misawa, “Plant Cell Culture SecondaryMetabolism”(植物细胞培养物次级代谢)，1996，第44页)。在烧瓶培养物中，不可能控制溶氧和气态代谢物，但在反应器培养物中控制它们是可行的。在本实例中，DO水平逐渐下降，这是细胞代谢的良好指标。实例16:从悬浮细胞培养物进行大规模分离将从IL的可可悬浮细胞回收的生物量作为新鲜细胞使用或者用Labconco冷冻干燥器进行冻干以得到75.0g的干燥可可细胞。使用振荡器，在0-80°C下，将新鲜细胞或者干燥可可细胞粉用IL的含0.1% -2%抗坏血酸、乙酸、柠檬酸的H20或者IL的含水溶剂(30、40、50、60、70、80% 的丙酮、30、40、50、60、70、80% 的甲醇或者 30、40、50、60、70、80% 的乙醇，在0.1% -2%抗坏血酸、乙酸、柠檬酸存在下)提取I小时，进行两次。将提取溶液用布氏漏斗进行过滤，或者进行离心。将滤液或者上清液组合在一起，然后用旋转蒸发仪在部分真空下于40°C蒸发至300ml的最终体积。将浓缩的含水残余物在_20°C下冷冻，并使用Laboconco冷冻干燥器进行干燥以得到亮黄色的粗提取物。通过实例10中的HPLC定量方法测定来自干燥可可细胞重量的粗原花青素的产率，在10-15%之间。将从IOL的可可悬浮细胞培养物回收的冻干生物量与80%甲醇以生物量体积的I: I比例进行混合，并在室温下搅拌I小时。将此混合物在布氏漏斗中经滤纸真空过滤。反复进行提取至少三次。收集每个甲醇提取物，集中在一起并在减压下于40°C进行浓缩，以将甲醇提取物的体积减少至初始体积的30%。将浓缩的甲醇提取物加到二氯甲烷中进行液-液提取，收集二氯甲烷层提 取物，集中在一起并在减压下和室温下以25%比例浓缩。将干燥的提取物溶于甲醇中，滴入蒸馏水中，在0°C下静置两天以获得沉淀物。从干燥细胞得到的纯化前的原花青素的实际收率在10 20%之间，纯度为50 60%。为有效去除杂质，使用C18柱和二氧化硅柱通过Waters pr印-LC(美国马萨诸塞州米尔福德市)进行进一步的纯化，在该prep-LC纯化过程后纯度将提高到超过99%。为获得高纯度的原花青素目标化合物，可进行额外的结晶过程。实例17:从可可树和可可豆的细胞培养物产生的多酚和原花青素的比较。从悬浮培养物提取耜.原花色式将从IL的可可树悬浮细胞培养物回收的生物量用Labconco冷冻干燥器进行冻干以得到14.0g的干燥可可细胞。将干燥粉用250ml的混合含水丙酮(70% v/v)提取30分钟。将含水溶液在3500rpm下离心15分钟，除去上清液。固体残余物以相同的方式再提取一次。将来自两次提取的上清液组合在一起，然后用旋转蒸发仪在减压下40°C蒸发。将浓缩的含水残余物在_20°C下冷冻，并用Laboconco冷冻干燥器进行干燥以得到浓稠黄色的粗提取物。通过实例8中描述的酸丁醇水解方法测定来自干燥细胞重量的粗原花青素的收率，在10-15%之间。从非发酵的生可可豆提取粗原花色甙未发酵的生可可豆获自Raw Harmony (美国加州洛杉矶市)。从5g研磨的干燥非发酵豆或者研磨的脱脂非发酵可可豆提取原花青素。提取程序与上述的悬浮细胞培养物所用的程序相似，例外的是每个提取步骤使用50ml的含水丙酮(70% v/v)，并且重复提取三次。将提取物组合并在3500rpm下离心15分钟。轻轻倒出上清液，然后在部分真空下40°C蒸发以除去溶剂。将浓缩的含水残余物在_20°C下冷冻，并用Laboconco冷冻干燥器进行干燥以得到微红色-紫色的粗提取物。通过实例8中描述的酸丁醇水解测定法估计的粗原花青素的收率在10-13%之间。原花肓素的高效液相色谱(HPLC)分析
通过正相HPLC系统进行原花青素的HPLC分析，该系统由Waters 2795分离模块、Waters 996 PDA检测器和Waters 474扫描荧光检测器组成。使用Develosil Diol柱(250X4.6mm内径，5 μ粒度)，按改编自Kelm等人(美国专利申请N0.2007075020，描述了用于极性质子单体和/或低聚体的改进方法)的方法，获得可可树细胞提取物和生可可豆提取物中原花青素的表征和分离条件。二元流动相由溶剂(A)乙腈:乙酸(98: 2，V/ν)和溶剂⑶甲醇:水:乙酸(95: 3: 2, v/v/v)组成。用0.8ml/min流速在30°C下如下进行线性梯度洗脱:0-35分钟，100-60% A ；35-40分钟，60% A ；40-45分钟，60-100% A。通过荧光检测(276nm激发波长，316nm发射波长)、280nm紫外检测，监测原花青素的分离。(Lazarus 等人，J.Agric.Food Chem.(《农业和食品化学杂志》),47:3693,1999)。图8显示由荧光检测器得到的未发酵可可豆提取物的色谱图(图8A)和可可树细胞悬浮提取物的色谱图(图8B)。与Kelm等人(美国专利申请N0.2007075020)描述的色谱分离一致，未发酵的可可豆提取物的组成最高至十二聚体(聚合度=12)。本实例证实，来自可可树的细胞培养物的原花青素提取物也具有与对可可豆所报道的组成(profile)相同的组成。图9显示未发酵可可豆提取物的紫外吸光度色谱图(图9A)和可可树细胞培养物提取物的紫外吸光度色谱图(图9B)。这个检测模式使得可以检测咖啡因和可可碱，并且这个实验的结果证明虽然来自可可豆的提取物显示在提取物中存在这两种化合物，但它们在细胞培养物的提取物中没有检测到。因此，这个实例证实，可可树的细胞培养物能够产生与可可豆相同的原花青素，同时它们不产生不合需要的化合物即咖啡因和可可碱。此外，本文对细胞提取物所描述的提取程序不需要使用溶剂如己烷，而对可可豆进行脱脂会需要这种溶剂。因此，衍自可可树的细胞培养物的原花青素提取物不会有毒性溶剂如己烷的残留物。实例18:来自可可细胞悬浮培养物的原花青素提取物的抗氧化活性。本实例描述测试从通过以上各实例中描述的方法培养的可可细胞提取的原花青素的抗氧化活性的手段。文献中的证据提示了可可原花青素的促健康性质和这些化合物的抗氧化性质之间的关系。一般认为，这些抗氧化剂影响与心血管疾病中一些类型的肿瘤促进和LDL氧化有关联的某些氧化过程和自由基过程。因此，测量可可原花青素的抗氧化潜力，是测定这些化合物在预防人类疾病(如癌症和心脏疾病)中的有效性的合理手段，以使得这些化合物能够在具有促健康性质的组合物中使用。类似地，抗氧化剂据认为有助于使皮肤保持更年轻的外观，皱纹更少，因此可可原花青素可用于化妆品组合物中。通过多种本领域知道的程序测量多酚化合物如可可原花青素的抗氧化能力。最通用的方法是氧自由基吸收能力(ORAC)方法(Cao G, Alessio H, Cutler R(1993)。“Oxygen-radical absorbance capacity assay for antioxidants，，( “抗氧化剂的氧自由基吸收能力测定法”)，Free Radic Biol Med(《自由基生物医学》)，14 (3):303-11) 0该测定法测量荧光分子(β_藻红蛋白或者荧光素)与自由基产生剂如偶氮引发剂化合物混合后的氧化降解。偶氮引发剂据认为能通过加热产生过氧化氢自由基，后者破坏该荧光分子，导致丧失荧光。抗氧化剂能够保护该荧光分子免受氧化变性。保护的程度将使用荧光计进行定量。荧光素目前最常用作荧光探针。可自动测量和计算该能力的设备可市售获得(Biotek 公司，Roche Diagnostics 公司)。荧光强度随着氧化变性的进行而降低，并且这个强度通常在添加偶氮引发剂(自由基产生剂)后记录到35分钟。作为荧光衰减进行测量的荧光素变性(或者分解)因抗氧化剂的存在而变得不那么显著。记录衰减曲线(荧光强度对时间)并计算两条衰减曲线(有或无抗氧化剂)之间的面积。随后，使用抗氧化剂trolox (—种维生素E类似物)作为标准品定量抗氧化剂介导的保护的程度。使用不同浓度的trolox来制作标准曲线，并将试验样品与这进行比较。试验样品(食品)的结果以“trolox当量”或者TE报告。实例19:使用有机溶剂提取可可细胞中原花青素的效率在本实例中，研究了从各种含水溶剂提取原花青素的有效性。将溶剂在各种含水条件下使用(30、40、50、60、70、80%的丙酮，30、40、50、60、70、80%的甲醇或者 30、40、50、60、70、80%的乙醇，在乙酸存在下，pH在约3.0-6.0的范围)。对提取物进行分析以比较不同条件下的提取效率。提取物如实例9中所描述从研磨的可可细胞制备。将50mg或者Ig的研磨可可细胞用于使用溶剂一式三份提取低聚原花青素。通过实例14中描述的HPLC分析方法，测定提取物中各种原花青素(单体至十聚体)的量。从结果得知，80%乙醇溶剂是不如其他溶剂有效的提取系统。对于所有的低聚原花青素，50、60、70%乙醇和70%丙酮最为有效。在这个研究中，结果表明对于总体低聚原花青素来说，60%乙醇是最强效的提取溶剂(图12A)。60%乙醇比70%丙酮优先提取总体原花青素(单体至十聚体)(图12B，图12C)。与从可可细胞提取相反，已报道酸化的70%丙酮对于从脱脂可可固形物提取低聚原花青素最为有效(美国专利N0 .6627232)。实例20:二聚原花青素在酸性和中性条件下的稳定性测试对于原花青素稳定性，已报道酸化的70%丙酮为最有效的溶剂(Rohr, G.E.；Meier, B.；Sticher, 0., Analysis of procyanidins (原花青素的分析)，载于 Studiesin Natural products Chemistry (《天然产物化学研究》)，第 21 卷，Bioactive NaturalProducts (Part B)(生物活性天然产物(B 部分)),Attu-ur-Rahman ；Elsevier 出版社；荷兰阿姆斯特丹，2000 ;第497-570页)。二聚原花青素的稳定性在酸性和中性70%丙酮溶剂下进行。从纯化的二聚原花青素制备样品5ug/mL，并在室温下保持O小时至23小时。使用荧光检测器在275nm激发和316nm发射下检测二聚原花青素。使用的色谱条件与上述的条件相同。图14A-14B显示在23小时后，中性70%丙酮中的二聚原花青素(图14A)显示出显著的降解。但是，酸化的70%丙酮中的二聚原花青素(图14B)保持高度稳定。实例21:用于可可细胞悬浮物的放大的充气条件溶解的气体对于植物细胞培养物中的初级和次级产物形成起到重要作用。在本实例中，证明了充气策略的有效性，通过该充气策略将气态氧补充到入口气体混合物以提升生物反应器中生长的可可细胞中的多酚。在7.5L机械搅拌的生物反应器中接种0.875L的可可细胞(工作体积=3.5L)，并在0.1vvm(气体体积/培养物体积/分钟)的气体(仅空气)流速、IOOrpm搅拌速度和26°C容器温度下培养七天时间，然后在葡萄糖引发剂存在下培养10天时间。将平行的生物反应器如上进行处理，不过气体方案由向培养基补加氧组成，导致了每单位细胞密实体积的多酚终浓度与仅用空气处理的在生物反应器中生长的细胞相比提高3.1倍。在仅有空气的处理中最终生产收率为9.4克原花青素/PCV，而在补加氧的处理中为29.2克原花青素/PCV。表1:培养某1-XXXVI的鉬成(储备溶液的配方在表2中提供。
权利要求
1.一种制备可可低聚原花青素的方法，所述方法包括: 以足以导致以第一速率产生可可低聚原花青素的时间和条件培养细胞；以及以足以诱导所述细胞以高于所述第一速率的第二速率产生所述可可低聚原花青素的量向所述细胞引入单糖。
2.根据权利要求2所述的方法，还包括从所述细胞提取所述可可低聚原花青素。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述单糖为葡萄糖。
4.根据权利要求1所述的方法，其中在指数生长状态最后阶段期间或之后引入所述单糖。
5.根据权利要求1所述的方法，其中在无激素培养基中培养所述培养物。
6.根据权利要求2所述的方法，其中在引入所述单糖后I至21天进行所述提取。
7.根据权利要求1所述的方法，其中为了稳定细胞系维持、诱导过量产生以及防止细胞聚集，所述单糖以所述培养基的约0.5体积％至约20体积％的量引入。
8.根据权利要求1所述的方法，还包括用乙醇提取溶液从所述细胞培养物提取所述可可低聚原花青素。
9.根据权利要求8所述的方法，其中乙醇提取溶液是含水的。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述乙醇提取溶液没有有机溶剂。
11.根据权利要求1所述的方法，还包括用酸性提取溶液从所述细胞培养物提取所述可可低聚原花青素。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述酸性提取溶液的pH为约3至约6。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述酸性提取溶液包括乙酸、柠檬酸或抗坏血酸。
14.根据权利要求2所述的方法，其中所述提取物基本上没有黄嘌呤生物碱。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法没有脱脂步骤。
16.根据权利要求1所述的方法，还包括以下中的一者或多者: 收获所述细胞； 在适于提取多酚富集级分的溶剂中均质化细胞生物质； 使用溶剂-溶剂提取和/或色谱来分离原花青素富集级分；或者 干燥或浓缩所述原花青素级分。
17.根据权利要求1所述的方法，还包括以下中的一者或多者: 在固体生长培养基上培养可可属物种(Theobroma sp.)愈伤组织细胞； 从可可树(Theobroma cacao)愈伤组织培养物选择快速生长的细胞系；或者 通过将所述快速生长的细胞系接种进液体培养基中引发可可属物种细胞悬浮培养。
18.一种制备可可低聚原花青素的方法，所述方法包括: 以足以导致以第一速率产生可可低聚原花青素的时间和条件培养细胞；以及在无激素培养基中以及在足以诱导所述细胞以高于所述第一速率的第二速率产生所述可可低聚原花青素的条件下培养所述细胞。
19.根据权利要求18所述的方法，还包括从所述细胞提取所述可可低聚原花青素。
20.根据权利要求18所述的方法，还包括将单糖以足以诱导所述细胞以高于所述第二速率的第三速率产生所述可可低聚原花青素的量引入所述无激素培养基中的所述细胞。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述单糖为葡萄糖。
22.根据权利要求20所述的方法，其中在指数生长状态最后阶段期间或之后引入所述单糖。
23.根据权利要求20所述的方法，其中所述单糖以所述培养基的约0.5体积％至约20体积％的量引入。
24.根据权利要求19所述的方法，其中在所述无激素培养基中引发培养后I天至21天之间进行所述提取。
25.根据权利要求18所述的方法，还包括用乙醇提取溶液从所述细胞培养物提取所述可可低聚原花青素。
26.根据权利要求25所述的方法，其中乙醇提取溶液是含水的。
27.根据权利要求25所述的方法，其中所述乙醇提取溶液没有有机溶剂。
28.根据权利要求18所述的方法，还包括用酸性提取溶液从所述细胞培养物提取所述可可低聚原花青素。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述酸性提取溶液的pH为约3至约6。
30.根据权利要求28所述的方法，其中所述酸性提取溶液包括乙酸、柠檬酸或抗坏血酸。
31.根据权利要求19所述的方法，其中所述提取物基本上没有黄嘌呤生物碱。
32.根据权利要求18所述的方法，其中所述方法没有脱脂步骤。
33.根据权利要求18所述的方法，还包括以下中的一者或多者: 收获所述细胞； 在适于提取多酚富集级分的溶剂中均质化细胞生物质； 使用溶剂-溶剂提取和/或色谱分离原花青素富集级分；或者 干燥或浓缩所述原花青素级分。
34.根据权利要求18所述的方法，还包括以下中的一者或多者: 在固体生长培养基上培养可可属物种愈伤组织细胞； 从可可树愈伤组织培养物选择快速生长的细胞系；或者 通过将所述快速生长的细胞系接种进液体培养基中引发可可属物种细胞悬浮培养。
35.一种制备可可低聚原花青素的方法，所述方法包括: 在无激素培养基中以及 在足以诱导所述细胞以第一速率产生所述可可低聚原花青素的条件下培养细胞；以及 将单糖以足以诱导所述细胞以高于所述第一速率的第二速率产生所述可可低聚原花青素的量引入所述无激素培养基中的所述细胞。
36.根据权利要求35所述的方法，还包括从所述细胞提取所述可可低聚原花青素。
37.根据权利要求35所述的方法，其中所述单糖为葡萄糖。
38.根据权利要求35所述的方法，其中在指数生长状态最后阶段期间或之后引入所述单糖。
39.根据权利要求35所述的方法，其中单糖以所述培养基的约0.5体积％至约20体积％的量引入。
40.根据权利要求36所述的方法，其中在所述无激素培养基中引发培养后I天至21天之间进行所述提取。
41.根据权利要求35所述的方法，还包括用乙醇提取溶液从所述细胞培养物提取所述可可低聚原花青素。
42.根据权利要求41所述的方法，其中乙醇提取溶液是含水的。
43.根据权利要求41所述的方法，其中所述乙醇提取溶液没有有机溶剂。
44.根据权利要求35所述的方法，还包括用酸性提取溶液从所述细胞培养物提取所述可可低聚原花青素。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述酸性提取溶液的pH为约3至约6。
46.根据权利要求44所述的方法，其中所述酸性提取溶液包括乙酸、柠檬酸或抗坏血酸。
47.根据权利要求36所述的方法，其中所述提取物基本上没有黄嘌呤生物碱。
48.根据权利要求35所述的方法，其中所述方法没有脱脂步骤。
49.根据权利要求35所述的方法，还包括以下中的一者或多者: 收获所述细胞； 在适于提取多酚富集级分的溶剂中均质化细胞生物质； 使用溶剂-溶剂提取和/或色谱分离原花青素富集级分；或者 干燥或浓缩所述原花青素级分。
50.根据权利要求 35所述的方法，还包括以下中的一者或多者: 在固体生长培养基上培养可可属物种愈伤组织细胞； 从可可树愈伤组织培养物选择快速生长的细胞系；或者 通过将所述快速生长的细胞系接种进液体培养基中引发可可属物种细胞悬浮培养。
51.一种制备可可低聚原花青素的方法，所述方法包括: 以足以导致产生可可低聚原花青素的时间和条件培养细胞；以及 用乙醇提取溶液从所述细胞提取所述可可低聚原花青素。
52.根据权利要求51所述的方法，还包括将单糖引入培养中的所述细胞以便增加所述可可低聚原花青素的产量。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述单糖为葡萄糖。
54.根据权利要求52所述的方法，其中在指数生长状态最后阶段期间或之后引入所述单糖。
55.根据权利要求51所述的方法，其中在无激素培养基中培养所述悬浮培养物。
56.根据权利要求51所述的方法，其中在将单糖或无激素培养基引入培养中的所述细胞后I天至21天之间进行所述提取。
57.根据权利要求52所述的方法，其中所述单糖以所述培养基的约0.5体积％至约20体积％的量引入。
58.根据权利要求51所述的方法，其中乙醇提取溶液是含水的。
59.根据权利要求51所述的方法，其中所述乙醇提取溶液没有有机溶剂。
60.根据权利要求51所述的方法，其中所述乙醇提取溶液是酸性的。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述酸性提取溶液的pH为约3至约6。
62.根据权利要求60所述的方法，其中所述酸性提取溶液包括乙酸、柠檬酸或抗坏血酸。
63.根据权利要求51所述的方法，其中所述提取物基本上没有黄嘌呤生物碱。
64.根据权利要求51所述的方法，其中所述方法没有脱脂步骤。
65.根据权利要求51所述的方法，还包括以下中的一者或多者: 收获所述细胞； 在适于提取多酚富集级分的溶剂中均质化细胞生物质； 使用溶剂-溶剂提取和/或色谱分离原花青素富集级分；或者 干燥或浓缩所述原花青素级分。
66.根据权利要求51所述的方法，还包括以下中的一者或多者: 在固体生长培养基上培养可可属物种愈伤组织细胞； 从可可树愈伤组织培养物选择快速生长的细胞系；或者 通过将所述快速生长的细胞系接种进液体培养基中引发可可属物种细胞悬浮培养。
67.一种制备可可低聚原花青素的方法，所述方法包括: 以足以导致产生可可低聚原花青素的时间和条件培养细胞；以及 用酸性提取溶液从所述细胞提取所述可可低聚原花青素。
68.根据权利要求67所述的方法，还包括将单糖引入培养中的所述细胞以便增加所述可可低聚原花青素的产量。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述单糖为葡萄糖。
70.根据权利要求68所述的方法，其中在指数生长状态最后阶段期间或之后引入所述单糖。
71.根据权利要求67所述的方法，其中在无激素培养基中培养所述悬浮培养物。
72.根据权利要求67所述的方法，其中在将单糖或无激素培养基引入培养中的所述细胞后I天至21天之间进行所述提取。
73.根据权利要求68所述的方法，其中所述单糖以所述培养基的约0.5体积％至约20体积％的量引入。
74.根据权利要求67所述的方法，其中所述酸性提取溶液是含水的。
75.根据权利要求67所述的方法，其中所述酸性提取溶液没有有机溶剂。
76.根据权利要求67所述的方法，其中所述酸性提取溶液包含乙醇。
77.根据权利要求67所述的方法，其中所述酸性提取溶液的pH为约3至约6。
78.根据权利要求67所述的方法，其中所述酸性提取溶液包括乙酸、柠檬酸或抗坏血酸。
79.根据权利要求67所述的方法，其中所述提取物基本上没有黄嘌呤生物碱。
80.根据权利要求67所述的方法，其中所述方法没有脱脂步骤。
81.根据权利要求67所述的方法，还包括以下中的一者或多者: 收获所述细胞； 在适于提取多酚富集级分的溶剂中均质化细胞生物质； 使用溶剂-溶剂提取和/或色谱分离原花青素富集级分；或者 干燥或浓缩所述原花青素级分。
82.根据权利要求67所述的方法，还包括以下中的一者或多者:在固体生长培养基上培养可可属物种愈伤组织细胞； 从可可树愈伤组织培养物选择快速生长的细胞系；或者 通过将所述快速生长的细胞系接种进液体培养基中引发可可属物种细胞悬浮培养。
83.根据权利要求1所述的方法，其中在生长阶段期间培养所述可可细胞的所述步骤是在溶解氧浓度为空气饱和度的1%至400%的情况下进行。
84.根据权利要求1所述的方法，其中在引入所述单糖之后，培养所述可可细胞的所述步骤是在溶解氧浓度为空气饱和度的1%至400%的情况下进行。
85.一种分离的可可细胞系，其中所述分离的可可细胞系选择为基本上不含咖啡因和可可碱。
86.根据权利要求85所述的分离的可可细胞系，其中所述分离的可可细胞系来源于花组织或非花营养组织中的至少一者。
87.根据权利要求86所述的分离的可可细胞系，其中所述花组织选自由以下组成的组:花瓣、花萼、退化雄蕊以及它们的组合。
88.根据权利要求86所述的分离的可可细胞系，其中所述非花营养组织选自由以下组成的组:节、节间、幼叶、成熟叶、莖、根以及它们的组合。
89.根据权利要求85所述的分离的可可细胞系，其中所述分离的可可细胞系产生大于200mg/L PCV的原花青素。
90.根据权利要求85所述的分离的可可细胞系，其中所述分离的可可细胞系产生大于400mg/L PCV的原花青素 。
91.根据权利要求85所述的分离的可可细胞系，其中所述分离的可可细胞系每升细胞培养物产生大于IOOmg的原花青素。
92.根据权利要求85所述的分离的可可细胞系，其中所述分离的可可细胞系每升细胞培养物产生大于200mg的原花青素。
93.根据权利要求85所述的分离的可可细胞系，其中所述分离的可可细胞系每升细胞培养物产生至少250mg的原花青素。
全文摘要
本发明涉及从在单糖的存在下培养的可可细胞培养物制备可可低聚原花青素的方法，该方法可增加原花青素的产量，所述方法如下以足以导致以第一速率产生可可低聚原花青素的时间和条件培养细胞；以及将单糖以足以诱导所述细胞以高于所述第一速率的第二速率产生所述可可低聚原花青素的量引入给所述细胞。所述方法可还包括从所述细胞提取所述可可低聚原花青素，并且这种提取可在引入所述单糖后1天至21天之间进行。可任选地，所述单糖可以所述培养基的约0.5体积％至约20体积％的量引入。所述单糖可以是葡萄糖、蔗糖、果糖等。所述单糖可在指数生长状态的最后阶段期间或之后引入。
文档编号A23G1/04GK103237457SQ201180057910
公开日2013年8月7日 申请日期2011年10月3日 优先权日2010年10月4日
发明者尹成勇, 朴勇黜, 埃米·麦克唐纳, 卡米尔·皮埃尔·迪布瓦, 索尼娅·拉尔 申请人:戴安娜植物科学有限公司
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