胚胎干细胞来源的心肌细胞以及包含所述心肌细胞作为活性成分的细胞治疗剂的制作方法
专利名称：胚胎干细胞来源的心肌细胞以及包含所述心肌细胞作为活性成分的细胞治疗剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及胚胎干细胞来源的心肌细胞和包含所述心肌细胞作为活性成分的细胞治疗剂。更具体地，本发明涉及产生胚胎干细胞来源的心肌细胞的方法、由所述方法产生的心肌细胞、由所述心肌细胞产生心肌细胞体的方法、由所述方法产生的心肌细胞体、包含所述心肌细胞体作为活性成分用于治疗心脏病的细胞治疗剂以及使用所述细胞治疗剂治疗心脏病的方法。
背景技术：
胚胎干细胞(ESC)来源的心肌细胞(CM)可以用于心血管疾病的再生疗法，因此许多研究人员已经开发出了多种使CM分化并分离CM的技术。但是，这些方法在其实际应用中遇到了由于CM产率低所带来的困难。已通过显微切割从收缩性人胚状体(hEB)中分离出CM。已知hEB的形成会诱导未分化的hESC形成收缩性CM，但是通过这种方法形成CM还有一些缺点。首先，在三维培养中，hEB不会表现出三个胚层所特有的分裂模式。第二，分化的细胞与不同细胞谱系的细胞相混。第三，难以分离出高浓度的CM。因此，许多研究人员已经尝试着通过机械分离、Percoll密度梯度分离并通过使用KDR、⑶15和⑶16来分离大量的CM。但是，通过这些方法不能完全地分离出纯的CM细胞，因此在其临床应用中依然有缺陷。由于缺乏CM特异的表面标志物，也难以将常规培养方法应用于CM分离中。为了克服这些问题，使用重组慢病毒载体系统通过转导产生了 MLC-2V诱导的表达GFP的hESC，并通过FACS分离将hESC用于从hEB分离CM。但是，由于病毒DNA能够整合至hEB的DNA中，hESC的这一临床应用大受局限。另外，通过显微切割从收缩性hEB分离CM具有这样一个问题，即由于其与内胚层细胞 而非外胚层细胞可以共存的这一特征，CM与其他内胚层谱系细胞相混，目前正在积极地进行多项研究来解决这一问题。另一方面，同样重要的一个因素是获得足量的CM来用作心血管疾病的治疗剂，因为成熟的CM具有有限的增殖活力。对于这一研究，已经开发出了使用生长因子或者END-2共培养体系(其中内胚层细胞系提供CM增殖和分化)的多种分化方法。但是，由于要使用生长因子，这一方法花费昂贵，并且还有从与其共培养的END-2细胞进一步分离CM的不便。因此，需要能够为针对心脏病的基于细胞的疗法提供高效高产率的产生和分离CM的方法。
发明内容
技术问题在这一背景下，本发明人经过诸多努力，开发出了高效高产率纯化ESC分化的心肌细胞的方法。因此，他们开发出了使用无血清培养基纯化ESC分化的心肌细胞的方法，并发现拟用于治疗心脏病的心肌细胞体(CB)可以通过在无血清培养基中悬浮培养经纯化的CM来产生，由此完成了本发明。
技术方案本发明的一个目的是提供由胚胎干细胞产生心肌细胞的方法，包括:Ca)培养胚胎干细胞，以获得培养物；并6)在无血清培养基中培养所述培养物，以纯化心肌细胞。本发明的另一个目的是提供通过所述方法产生的心肌细胞。本发明的又一个目的是提供产生心肌细胞体的方法，包括:(a)培养胚胎干细胞，以获得培养物；(b)在无血清培养基中培养所述培养物，以纯化成心肌细胞；并((3)在无血清培养基中培养所述经纯化的成心肌细胞。本发明的另一个目的是提供通过所述方法产生的心肌细胞体。本发明的另一个目的是提供用于治疗心脏病的细胞治疗剂，其包含作为活性成分的所述心肌细胞体。本发明的另一个目的是提供治疗心脏病的方法，其包括将所述细胞治疗剂给予个体的步骤。有益效果本发明的产生心肌 细胞的方法可用于容易地纯化胚胎干细胞分化的心肌细胞，无需另外的设备。另外，经纯化的心肌细胞可用于产生心肌细胞体，其可用作用于治疗心脏病的细胞治疗剂。因此，可以将心肌细胞体广泛地应用于开发针对心脏病的预防剂或治疗剂。
图1至4:对来源于人胚胎干细胞的收缩性EB的细胞组分分析。(图1，左图)当在含有20%FBS的DMEM培养基中悬浮培养15天时，出现了来源于人胚胎干细胞的分化的收缩性EB。(图1，中图)表达CM特异的标志物cTnT的细胞以团块形式(clump)部分地位于收缩性EB中。(图1，右图)第二幅图中的白色方框的放大图。(图2，左图)在0.1%明胶包被的平板上分离收缩性和非收缩性区域，之后将收缩性EB铺板。(图2，中图和右图)收缩性细胞簇区域中的细胞表达CM特异的标志物cTnT和sMHC。(图3)EB收缩性区域(Ib)和非收缩性区域中心脏谱系相关基因的表达模式。与非收缩性区域相比，收缩性区域中心脏转录相关基因(NKX2.5和MEF-2c)和CM相关基因(Myh6、Myh7、MLC-2v和TnT)的表达升高。误差棒表示三次实验的平均值。(图4)图1b的收缩性细胞簇由0.05%胰蛋白酶-ETDA处理机械地切割，然后将该细胞重新铺板于0.1%明胶包被的平板上。(图4，左图)在重新铺板的细胞群中，收缩性细胞与非收缩性细胞共存。(图4，中图和右图)免疫细胞化学分析表明，收缩性细胞为CM标志物sMHC或cTnT阳性，相反，非收缩性细胞不表达CM标志物，但是表达内胚层谱系特异的标志物Foxa2或 AFP。图5至11:从重新铺板于含有N2的无血清培养基上的非收缩性细胞群中有效地纯化收缩性细胞，以及对心室型CM的浓缩。
(图5，左图)含有N2的无血清培养基中的大部分细胞均表现出收缩性，并且强烈地表达cTnT(图5，中图)或sMHC(图5，右图)。(图6，左图)当从在含血清(2%FBS)培养基中培养的收缩性细胞簇中分离细胞时，本发明人发现非收缩性细胞和收缩性细胞共存。(图6，中图和右图)含血清培养基中的收缩性细胞和非收缩性细胞分别表达cTnT 和 sMHC。(图7)在含血清培养基或无血清培养基中培养分离的细胞后第14天，表达CM标志物的细胞相对表达DAPI的细胞的百分比。误差棒表示五次实验的平均值。(图8)含血清和无血清条件下培养的细胞中心脏相关基因和内胚层谱系相关基因的表达模式。使用样本的cDNA进行定量RT-PCR，并相对GAPDH将每个值标准化。(图8a和8b)无血清条件下，CM相关基因(Myh6、Myh7、MLC_2v和TnT)表达升高，内胚层谱系相关基因(Foxa2和AFP)表达下降。无血清组的数据被表示为通过血清组标准化的比值。误差棒表示三次实验的平均值。(图9)来源于人胚胎干细胞的CM的电生理特征。从血清组和无血清组记录到了三大类动作电位(结节型(Nodal-type)、心房型和心室型)。从标记区域(*)采集单个动作电位，并在扩展的时间标尺上示出。图9中,虚线表示OmV。(图10和11)含血清或无血清培养条件下三大类动作电位的比例。图中示出含血清组或无血清组中H9-和CHA15-人胚胎干细胞来源的心肌细胞的三大类动作电位。有趣的是，在被记录的细胞中，无血清条件下有80%的细胞表现出心室特征。图12至16:高度纯化的CM在高密度培养体系中增强的增殖能力。(图12，左图)纯化的 CM在含N2的无血清培养基中培养期间，观察到低密度的单细胞和(图12，右图，▲)高密度的形成集落的CM的收缩性。(图13)单CM和形成集落的CM之间在一段时间里的收缩性比较。(图14，左图)周围具有CM的非收缩性的单CM表达CM特异的标志物sMHC(红色)，但不表达增殖标志物K1-67 (绿色)。(图14，右图)一些形成集落的CM表达K1-67和sMHC。(图15)对表达DAPI的细胞中Ki_67表达细胞的定量表明，形成集落的CM比单CM具有更高比例的K1-67表达细胞。误差棒表示三次实验的标准偏差。(图16)对低密度条件和高密度条件下CM的六周增殖率的测量。图17至23:纯化的人胚胎干细胞来源的CM的集落形成。(图17)悬浮条件下单CM的收缩。(图18)当5xl03个收缩性单CM在20μ I中过夜聚集，随后在悬浮培养条件下使用含Ν2的无血清培养基在超低贴壁培养皿上培养7天，形成了 CM体。(图19)同步跳动的细胞簇中全部细胞均为cTnT阳性。(图20)在细胞簇所有细胞的细胞核中发现心脏特异的转录因子Nkx2.5(绿色)和DAPI (红色)的共表达。心脏特异的间隙连接标志物Con43 (红色)也在细胞簇内细胞间相互作用区的细胞膜中表达。(图21)通过sMHC染色在同步的细胞簇中清楚地观察到肌节结构。(图22)在大鼠心脏心肌梗死后，使用10μ I微量移液管将心肌细胞体移植至两个缺血性心脏区域中。(图23)通过超声心动图显像对LV的功能研究(FS)。图24至34:在对心肌梗死进行手术后七周对移植物的组织学研究。(图24)苏木精-伊红染色。(图24，一)心肌细胞体移植中注射的细胞的放大图，这在单细胞移植中没有检测到(图 24，Λ )。(图25)麦森三色染色表明，对心肌梗死进行手术致使左心房纤维化。(图25，一)梗死区中由移植的心肌细胞体对纤维化抑制的放大图，这在单细胞移植中没有检测到(图25，Λ)。(图26)cTnT 染色。(图26，▲)未检测到注射的DiI标记的细胞簇。(图26，一)DiI标记的移植物在移植区域的梗死区中强烈表达，这表明移植的心肌细胞体存活。(图27)对边界区的外部(一)和内部(▲)区域中移植的心肌细胞体的分析。(图28至30)对缺血性心脏的外部区域(图27，一)中的移植物的免疫组织化学分析。(图28)DiI标记的移植物共表达cTnT。(图29)通过三维成像的DiI和cTnT共表达区域的结构。(图30)Con43在DiI标记的移植物中特异地表达，但是不在宿主区中表达。(图31至32)对缺血性心脏的内部区域(图27，▲)中的移植物的免疫组织化学分析。(图31)在缺血性心脏的内部区域观察到的至宿主区的表达DiI的移植物。(图32)图31的白色方框的放大图。(图33)缺血性心脏的内部区域中由Con43抗体染色的移植物，以及自宿主移行的区域中的DiI表达细胞。(图34)图33的放大图。图35:单CM移植的组织学评估。在连续切片组织的内部区域中移植的CM的间隙连接表达。在缺血性心脏的内部区域，大部分DiI标记的共表达间隙连接特异的标志物Con43(绿色)的细胞，但是与宿主并无接触，这不同于心肌细胞体移植。图36至42:由来源于人胚胎干细胞的CM移植的梗死左心室的超声心动图显像。(图36)非梗死大鼠心脏的M模式超声心动图。(图37至39)每组在第2天(左图)和第51天(右图)的M模式超声心动图。(图40至42)对第2天和51天的左心室舒张期内径(LVIDd)、左心室收缩期内径(LVIDs)和缩短分数(FS)的分析。
最佳实施方式 一方面，为了实现上述目标，本发明提供了使用无血清培养基由胚胎干细胞产生心肌细胞的方法。特别地，产生心肌细胞的方法包括以下步骤:(a)培养胚胎干细胞，以获得培养物；并6)在无血清培养基中培养所述培养物，以纯化心肌细胞。本文所使用的术语“心肌细胞(CM)”通常指构成作为心壁中间层的心肌的细胞，就本发明的目的而言，所述心肌细胞包含任何分化期的任何细胞，对其没有限制，例如由胚胎干细胞分化以形成肌节的成心肌细胞、具有成为功能性心肌细胞的潜能的心肌细胞祖细胞，所述功能性心肌细胞如由成心肌细胞分化的心肌细胞、胎儿心肌细胞和成人心肌细胞，并且心肌细胞是指可通过下文列出方法中的至少一种、优选通过多种方法中的至少一种、并且更优选通过多个标志物或标准鉴定的细胞。多种心肌细胞特异的标志物的表达可通过已知的生物化学方法或免疫化学方法检测，并且这些方法可以无限制地使用。在所述方法中，可以使用能结合心肌细胞祖细胞或心肌细胞的标志物特异的多克隆抗体或单克隆抗体。靶向每一种特异的标志物的抗体可以商购，或者通过已知方法制备，对其没有限制。对心肌细胞祖细胞或心肌细胞特异的标志物可以包括，但不限于，α-辅肌动蛋白、肌钙蛋白KcTn I)、ANP、GATA4、Nkx2.5、MEF-2c、MYH6、MYH7、Con43、肌球蛋白重链(a -MHC或sMHC)、肌球蛋白轻链(MLC-2 α或MLC_2v)、心肌肌动蛋白、cTnT、cTn I，并优选cTnT和sMHC。另外，标志物的表达可以通过用于扩增、检测、翻译编码任何标志物蛋白的mRNA的常规分子生物学方法来检测，所述方法例如反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)或杂交测试，但是不限于具体的方法。编码标志物的核酸序列是已知的，因此可从公共数据库如GenBank获得。需要被用作引物或探针的标志物特异的序列可以容易地确定。另外，还可以使用生理标准来检测多潜能细胞至心肌细胞的分化。也就是说，自发性脉搏跳动、或者各种离子通道的表达以及对电刺激的反应也可以用作检测多潜能细胞分化成心肌细胞的指标。本文使用的术语“胚胎干细胞”指这样的细胞:其恰好在植入到母体子宫内之前的时期从胚泡的内细胞团提取，并离体(ex vivo)培养，具有多潜能，能够分化成为人体的任何细胞类型。本发明中使用的胚胎干细胞优选为人胚胎干细胞或小鼠胚胎干细胞，其产生方法和特征已被确立，但对所述胚胎干细胞并没有特别的限制。通过培养人胚胎干细胞获得的培养物可以包括由胚胎干细胞分化的包含全部外胚层细胞、中胚层细胞和内胚层细胞的胚状体，优选内胚层细胞和中胚层细胞，并且更优选内胚层细胞和CM，但对其没有特别的限制。
胚状体可以包含由胚胎干细胞分化的CM，并且由于包含CM而表现出收缩性。胚状体中CM的含量可以为约10至15%，但是对其没有特别的限制。胚胎干细胞可以是使用干细胞用含血清培养基在无有丝分裂活性的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)滋养层上预培养的那些胚胎干细胞，并且在经随后的悬浮培养之后，可以使用从滋养层分离的胚胎干细胞。干细胞用含血清培养基可以优选为补充有血清或者血清替代物的hESC培养基(含有L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、β -巯基乙醇和bFGF)，但对其没有特别的限制，并且血清或者血清替代物的含量优选为10至20% (v/v)，但是对其并没有特别的限制。本文使用的术语“悬浮培养”，也称为漂浮培养，是指细胞悬浮或漂浮在培养容器的液体培养基中，并且为了使细胞维持在悬浮或漂浮状态，在培养期间应该搅拌培养基。可以进行悬浮培养，目的是纯化CM并形成培养物，优选从胚胎干细胞形成收缩性胚状体。用于产生培养物的悬浮培养可以通过以下方式进行:在除去bFGF的基础hESC培养基中对胚胎干细胞进行原代培养，并在含血清或血清替代物的培养基中进行继代培养。如所述，基础hESC培养基是含有L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、β -巯基乙醇和bFGF的培养基，并且含血清或血清替代物的培养基可以优选为含有血清例如FBS的基础hESC培养基，但对其没有特别的限制，并且培养基中血清或血清替代物的含量优选为10至20%(v/v)，但对其没有特别的限制。同时，可以进行用于纯化CM的悬浮培养，这样培养物，优选收缩性胚状体，在无血清培养基中被培养，以杀死除CM之外的细胞，使得仅允许CM存活，由此实现纯化CM的效
果O本文使用的术语“无血清培养基”是指不含异源或同源血清的任何细胞培养基，并且本领域已知的任何细胞培养基均可使用，只要它不含血清。通常需要含血清培养基来培养已分化的成熟细胞。但是，本发明发现，在无血清培养基中，CM存活，但是其他细胞死亡。另外，通过使用无血清培养基，可以消除可能出现在临床应用中的由于污染物质所致的污染风险，所述污染物质包括来自血清培养基中存在的牛来源物质例如胎牛血清(FBS)或牛血清(FCS)的疯牛病病毒。另外，通过使用无血清培养基，可以消除由血清中的蛋白质所诱导的抗体形成所引起的移植细胞的移植排斥风险，这样可以将本发明方法所产生的心肌细胞应用于针对心脏相关疾病的细胞疗法，而无临床风险。无血清培养基可以优选为不含其它生长因子、血清或血清替代物，但含有胰岛素、人转铁蛋白、孕酮、腐胺(putrascine)和亚硒酸盐的培养基,更优选含有N2补充物的培养基，最优选含有N2补充物的DMEM培养基，但是对其没有特别的限制。无血清培养基，优选含有胰岛素、人转铁蛋白、孕酮、腐胺和亚硒酸盐的培养基，更优选含有N2补充物的培养基， 更加优选含有N2补充物的培养基，不含来源于胚胎干细胞的细胞生长、分化和增殖必需的组分，从而在细胞培养期间提供苛刻的环境，这样需要生长、分化和增殖的细胞不能在该培养基中存活。相反，结束分化的CM由于其本性不需要经历细胞生长、分化、增殖，因此能够在该培养基所提供的苛刻环境下充分存活。因此，该培养基显示出对非CM的多种类型的分化细胞的存活的抑制效应，最终，能够将CM从培养物中纯化出来。为了提高从培养物中纯化CM的效率，如果必要的话，可以在悬浮培养前进一步进行细胞水平的分离步骤。优选使用蛋白水解酶、更优选使用胰蛋白酶，可以进行细胞水平的分离，但是不特别限于上述方法。在进行细胞水平的分离时，从培养物中分离的全部的单细胞均受无血清培养基的直接影响，由此更快更有效地纯化CM。根据本发明的一个实施方案，本发明人已发现，三维聚集物——胚状体(EB)——由人胚胎干细胞(hESC)在体外形成(图1)，并且其中包含的收缩性心肌细胞(CM)通过免疫细胞化学分析鉴定(图1)。发现EB具有显示出收缩性和表达CM特异的标志物cTnT和sMHC的区域和不显示收缩性和CM特异的标志物表达的区域(图2)。在显示出收缩性和表达CM特异的标志物cTnT和sMHC的EB区域观察到心脏相关的转录因子(NKX2.5和MEF_2c)和心脏特异的肌节蛋白编码基因(MLC-2v、MYH6、MYH7和TnT)的表达(图3)。另外，在不显示收缩性和CM特异的标志物表达的区域观察到内胚层标志物FoxA2和AFP的表达(图4)。这些结果表明，为了由hESC制备CM，必须要从EB纯化成心肌细胞。因此，本发明人意图通过从胚状体纯化CM来由胚胎干细胞产生心肌细胞。为了实现这一意图，本发明人通过下述方式由胚胎干细胞产生了心肌细胞:培养胚胎干细胞，以获得培养物；并随后在无血清培养基中培养所述培养物，以纯化心肌细胞。具体地，本发明人使用含有N2补充物的DMEM培养基培养了胚状体(实验组)，并使用含有血清和N2补充物的DMEM培养基培养了胚状体，作为对照组。结果，实验组中培养的细胞数目与对照组的细胞数目相当，并且在实验组和对照组两组中均观察到了收缩性细胞，但是没有在实验组中、而是在对照组中观察到了非收缩性细胞(图5和6)。使用CM特异的标志物cTnT和sMHC进行的免疫细胞化学分析的结果表明，CM特异的标志物cTnT和sMHC在实验组的大部分细胞(80%或更多)中表达，但是CM特异的标志物cTnT和sMHC在50%或更少的对照组中表达(图7)。并且，通过qRT-PCR确定了实验组和对照组的细胞中心脏特异的标志物CTnT、Myh6、Myh7和MLC-2v以及内胚层标志物FOXA2和AFP的基因表达水平，并将之相互比较。结果是，实验组细胞表现出高表达水平的心脏特异的标志物，但低表达水平的内胚层谱系标志物(图8)。最后，为了提供初步的对hESC来源的CM的功能评估，对收缩性细胞进行了全细胞膜片钳记录。结果表明，与对照组相比，实验组细胞中的心室型动作电位显著升高(图9和10)。在另一方面，本发明提供了由上述方法产生的心肌细胞。该心肌细胞具有以下特征:(i)表达选自以下的标志物:α-辅肌动蛋白、肌钙蛋白I(cTn I)、ANP、GATA4、Nkx2.5、MEF-2c、MYH6、MYH7、Con43、肌球蛋白重链(a -MHC 或 sMHC)、肌球蛋白轻链(MLC-2 α 或 MLC-2v)、心肌肌动蛋白、cTnT 和 cTnl ；(ii)具有囊样形状、混合的形状、漂浮或肌肉样形状；和
(iii)表现出脉搏跳动。在又另一方面，本发明提供了由心肌细胞产生心肌细胞体(CB)的方法。具体地，本发明的产生心肌细胞体的方法包括以下步骤:(a)培养胚胎干细胞，以获得培养物；(b)在无血清培养基中培养所述培养物，以纯化成心肌细胞；并(C)在无血清培养基中培养所述成心肌细胞。在这一点上，可以以与CM纯化过程中的悬浮培养的方法相同的方法进行培养，但是并不特别地限于以上方法，并且如上所述，培养用无血清培养基可以是不含其它生长因子、血清或血清替代物，但含有胰岛素、人转铁蛋白、孕酮、腐胺和亚硒酸盐的培养基，更优选含有N2补充物的培养基，最优选含有N2补充物的DMEM培养基。在另一方面，本发明提供了由上述方法产生的心肌细胞体(CB)。由上述方法产生的CB可以表现出同步的跳动，直径为200至500 μ m。本文使用的术语“心肌细胞体(CB)”是指通过将纯化的由hESC分化的CM在不含细胞生长、分化和增殖所必需的组分的条件下悬浮培养较长一段时间而形成的CM聚集体。优选地，本发明的CB可以表现出同步的跳动，其大小可以优选为直径200至500 μ m,但对其没有特别的限制。CB是由CM高密度聚集以适应苛刻培养条件的组织类型。由于CB表现出同步的跳动，就其收缩性和密度而言，其可针对心脏病被移植。根据本发明的一个实施方案，本发明人产生了 CM体(心肌细胞体，CB)，并且他们通过将其移植至心肌梗死心脏证实了其效应。详细地，将纯化的hESC来源的CM通过悬滴法悬浮培养7天，从而产生直径为200至500μπι的CB(图17)。所产生的CB显示出同步的跳动(图18)。为了表征所产生的CB，使用心脏特异的标志物cTnT、Nkx2.5、Con43和sMHC进行了免疫细胞化学分析，结果显示了心脏特异的标志物的表达(图19至21)。同时，将CB形式的CM移植到心肌梗死引起的动物模型的心脏病灶中，并且在一段时间后对移植区域进行组织化学分析。结果显示，在移植组织中没有检测到畸胎瘤形成，这表明细胞没有分化能力，因为在移植具有分化能力的干细胞后会形成畸胎瘤。另外，在移植CB形式而非单细胞的CM时，观察到更广泛的组织再生(图24)，观察到更少的纤维组织(图25)，检测到成块的心肌组织(图26)，并且CB移植到梗死区引起了心肌再生(图27至34)。具体地，与移植单CM细胞相比，移植CB显示出广泛存在的Di I阳性细胞(图28和29)，并且Con43阳性细胞位于检测到DiI阳性细胞的区域(图30)。在移植CB和单细胞之间的边界区观察到几个零散的移植物(图31至34)。但是，在移植单CM细胞的对照组中没有观察到DiI阳性细胞或Con43的移入(图35)。因此，检查了 CB移植对左心室(LV)功能的影响。结果是，在移植单CM细胞的大鼠中观察到显著升高的LVIDs值，而在移植CB的大鼠中观察到下降的LVIDs值(图40)。在移植后第51天，与第2天测量的值相比，LVIDd值基本都升高。与非移植大鼠或移植单CM细胞的大鼠相比，移植CB的大鼠表现出最低的LVIDd升高水平，并且与非移植大鼠或单细胞移植的大鼠相比，移植CB的大鼠表现出显著升高的缩短分数值(fractional shortening value)(图 42)。在另一方面，本发明提供了用于治疗心脏病的细胞治疗剂，其包含本发明的心肌细胞体作为活性成分。如上所述，表现出同步跳动的CB在植入心脏病患者的心脏时能够展现出正常的心脏功能，因此能够用作心脏病细胞治疗剂的活性成分。表现出同步跳动的CB可以容易地通过本发明的产生方法获得。本文使用的术语“细胞治疗剂”是指用于进行治疗、诊断和预防的药物，其包含通过自人分离、培养以及特别的操作(如由US FDA提供)制备的细胞或组织。具体地，其是指用于通过一系列以下行为而进行治疗、诊断和预防的药物:在体外扩增和分选活的自体细胞、同种异体细胞和异种细胞，或者通过恢复细胞或组织功能的其他方式改变细胞生物学特征。就本发明的目的而言，表现出同步跳动的CB可用于多种通过植入、移植或注射至心脏组织内来增强、治疗或替换 的治疗方案中，并且它们替代或者强化心脏组织，使之成为新的或者改变的组织，或者与生物组织或结构结合。在另一方面，本发明提供了使用本发明的细胞治疗剂治疗心脏病的方法。具体地，本发明的用于治疗心脏病的方法包括以下步骤:将所述CB或所述细胞治疗剂给予需要治疗心脏病的个体的心脏中。本文使用的术语“个体”是指患有心脏病或具有患心脏病可能性的包括人在内的动物。细胞治疗剂可以经由任何常规途径给药，只要它能够达到目标组织。另外，细胞治疗剂可以通过任何能能够将活性成分递送至靶细胞的设备给药。本发明的细胞治疗剂可以以治疗有效量给药，本文使用的短语“治疗有效量”是指足以以适用于任何医学治疗的合理利益/风险比治疗疾病的量。有效剂量水平可能因多种因素而异，所述多种因素包括个体的类型、严重程度、年纪和性别，药物活性、药物敏感度、给药时间、给药途径、排放系数(discharge ratio)、治疗周期和共给药的药物以及医学领域周知的其他因素。本发明的细胞治疗剂可以单独给予或与其他疗法联合给予。本发明的治疗剂与其他疗法的共给予可以同时地或者相继地进行。单个或者多个剂量均是可以的。重要的是，使用足以获得最大疗效而无副作用的最小可能量，在考虑所有因素的情况下。典型地，当有关疾病用包含未分化的干细胞或者干细胞分化的细胞作为活性成分的细胞治疗剂进行治疗时，所述细胞治疗剂依据细胞类型被分离，然后经由注射器被给予个体损伤部位。根据细胞类型分离细胞治疗剂的理由是防止细胞治疗剂效果下降，所述下降是由共给予细胞以及经由注射器的常规注射所致。与使用细胞治疗剂的典型方法不一样，本发明的细胞治疗剂可通过将活性成分心肌细胞体直接地移植到需要治疗的个体的心脏损伤部位来使用。如上所述，由于本发明的心肌细胞体表现出同步的跳动，通过使用心肌细胞体而非使用单个收缩性心肌细胞可以更为有效地治疗心脏病。本发明人首次证实，通过使用表现出同步跳动的心肌细胞体，可以更有效地治疗心脏病。表现出同步跳动的心肌细胞体可以通过本发明的产生心肌细胞体的方法容易地获得，无需额外的装置。人胚胎干细胞是富有前景的用于治疗心脏病的心肌细胞源。以前的研究表明，移植人胚胎干细胞会再生心脏组织，并改善梗死心脏的收缩。但是，将未分化的人胚胎干细胞和来源于未分化的人胚胎干细胞的非靶细胞注射到心肌内，会导致在个体内形成不想要的畸胎瘤或非靶组织。另外，移植完全分化的心肌细胞会导致不利的存活和移入。为了克服这些问题，本发明人开发出了从人胚胎干细胞产生纯的CM的纯化方法以及改善梗死心脏中的细胞存活和移入的移植方法。在本发明中，本发明人使用无血清培养基选择分化的CM，并将其他谱系细胞排除在收缩性EB之外。成分确知的无血清培养基仅允许收缩性CM存活，并保持其功能。这一方法产生了相当纯的来源于收缩性EB的CM，其保留了收缩性，并在成分确知的无血清培养基中表达CM相关的标志物。
有许多纯化hESC来源的CM的方法:作为从人胚胎干细胞纯化CM的典型方法的选择在EB形成后通过机械切割获得的自发收缩的CM、物理分离如Percoll密度梯度离心或者选择细胞表面标志物如荧光激活的细胞分选。这些纯化方法需要大量的财力和人力。因此，这些方法的效率取决于专门的仪器和技能。但是，本发明的纯化心肌细胞的方法提供了更为简单的方案，无需任何专门的仪器和技能。而且，这一方法不需要对细胞的遗传修饰。使用非病毒或病毒系统进行遗传修饰具有以下缺点:外源基因的表达、难以控制基因表达以及可能产生肿瘤。另外，含有许多在细胞生长和分化中起到未知功能的非特化因子的血清不用于本发明中。在临床应用中，使用无血清培养基可以降低潜在的病原体污染风险。另一方面，药物开发旨在开发直接应用于人的药物，因此优选通过将药物施用于具有与人相似特征的人源细胞来测试药物的活性。为此，在开发用于药物测试的细胞中，胚胎干细胞或诱导型多潜能干细胞有望成为最有用的药物开发工具。理论上，这些细胞都能够分化成为许多不同类型的构成身体的细胞，因此这些细胞有望成为需要用于药物开发的化合物所靶向的细胞来源，并且由于其无限增殖性，它们也有望成为大规模生产的来源。对于这一研究，将干细胞应用于药物开发的技术已经被积极地研究，由这些研究所得到的干细胞已经应用于药物开发的所有阶段，从最初的阶段到临床前阶段，包括疾病病因学研究、发现新药物IE标、次要药效学、安全药效学、代谢轮廓分析(metabolic profiling)和毒性评估。由于在药物开发阶段中的低失败率和高收益，应该使用正常人细胞进行体外评估。但是，由于人正常细胞的体外培养会导致人细胞固有能力的丧失，因此主要使用原代培养细胞或肿瘤细胞系。心脏毒性在体外评估中最为重要。心脏毒性由复杂的反应所致，因此评估的准确性应尽可能高，所述复杂的反应例如多离子通道和细胞内离子浓度的改变。为此，必需通过体外评估测试心脏毒性，但是难以获得待用于测试中的人原代培养细胞形式的心脏细胞。最近，已报道可商购药物如糖尿病药物或普通麻醉剂可能引起心律失常，对药物引起的心脏毒性的兴趣也在与日俱增。因此，迫切地需要开发出用于药物开发的心脏细胞模型。在体外条件下，本发明提供的胚胎干细胞来源的心肌细胞能够形成表现出与心脏组织相似的密度和同步跳动的心肌细胞体，因此它们可以用于开发药物开发的心脏细胞模型。本发明的实施方式在下文中，将参照实施例更详细地对本发明进行描述。但是，这些实施例仅为示例性目的，本发明不应被这些实施例所限制。实施例1:从人杯胎干细朐(hESC)产牛心肌细朐(CM)在体外从人胚胎干细胞(hESC)形成了分化的三维聚集体一胚状体(EB)，并鉴定了其中包含的收缩性心肌细胞(CM)。 实施例1-1: hESC培养和hEB形成使用通过将20% (v/v)血清替代物(Gibco)加至基础hESC培养基(ImM L-谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、IOOmM β -巯基乙醇和4ng/mL bFGF)制备的DMEM/F12 (50:50%; GibcoBRL, Gaithersburg, MD)，在无有丝分裂活性的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)滋养层上培养未分化的hESC (CHA15-hE·SC和H9_hESC系)。此时，将DMEM/F12培养基每24小时换一次，然后使用切割移液管每5-7天将hESC转移到新鲜的无有丝分裂活性的滋养层。随后，使用分散酶(Gibco)从无有丝分裂活性的滋养层分离出hESC，并将其转移至超低贴壁的培养皿中，然后向其加入无bFGF的基础hESC培养基，接着悬浮培养2天。之后，将培养基替换为补充有20%FBS的DMEM，并将细胞培养15-20天，收缩性分化的三维聚集物——人胚状体(hEB)从hESC形成(图1，左图)。如图1的左图所示，形成的EB中的10-15%是收缩的。实施例1-2:对hEB的免疫细胞化学分析为确认EB是否含有收缩性CM，使用CM特异的标志物进行了免疫细胞化学分析。详细地，在载玻片上将EB于4%多聚甲醛中固定20分钟，并用含有0.l%TritonX-100的PBS处理五分钟。随后，将细胞用5%正常山羊血清处理30分钟，再用CM特异的标志物cTnT所特异的一抗(MiIlipore, Billerica, MA)处理,接着在4°C孵育12小时进行第一反应。在终止第一反应后，将细胞用PBS洗涤三次，并用罗丹明或FITC标记的二抗(Molecular Probes Inc.，Eugene, OR)处理,接着孵育I小时进行第二反应。在终止第二反应后，将细胞用PBS洗涤三次，并染色。将染色的玻片固定于含有2.5%聚乙烯醇和1，4二氮杂二环(2.2.2)辛烷和4，6- 二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)的甘油基固定溶液(Sigma)中。在 LSM510META 共聚焦显微镜(Carl Zeiss Inc.，Oberkochen, Germany)下对固定的玻片照相，并对其进行分析(图1的中图和右图)。如图1的中图和右图所不，观察到对EB的部分染色，这表明含有收缩性CM。
实施例1-3:对hEB的表征将EB固定于明胶包被的平板上，以进行hEB表征(图2)。如图2的左图所示，尽管被固定在明胶包被的平板上，一部分EB也收缩了。接下来，如图2的中图和右图所示，使用CM特异的标志物cTnT和sMHC对hEB进行免疫细胞化学分析的结果显示，hEB的收缩区域被染上色，但是hEB的非收缩区域未被染上色。这些结果表明，hEB含有收缩性CM和非收缩性细胞。实施例1-4:对hEB基因表达水平的分析通过显微切割分离了 hEB的收缩区域和非收缩区域，并将分离的区域用0.25%胰蛋白酶-EDTA处理，以在细胞水平对其进行分离。将每一分离的细胞转移至明胶包被的平板。使用分离的细胞进行qRT-PCR，以确定心脏相关转录因子(NKX2.5和MEF-2c)和心脏特异的肌节蛋白编码基因(MLC-2v、MYH6、MYH7和TnT)的基因表达水平。详细地,使用TRIzol试剂(Molecular Research Center, OH)自每一分离的细胞获得总RNA，并使用2 μ g的总RNA和反转录酶(SuperScript II反转录酶)进行RT-PCR，以合成cDNA。通过将合成的cDNA和能够扩增心脏相关转录因子(NKX2.5和MEF_2c)和心脏特异的肌节蛋白编码基因(MLC-2v、MYH6、MYH7和TnT)的下表I的每一引物应用至ABI7300qRT_PCR 系统(Applied Biosystems)来进行 qRT-PCR。此时，将 GAPDH 用作 PCR 内部对照组，并通过比较Λ Λ Ct法(图3)来计算基因表达水平。[表I]
权利要求
1.由胚胎干细胞产生心肌细胞的方法，包括: (a)培养胚胎干细胞，以获得培养物；并 (b)在无血清培养基中培养所述培养物，以纯化心肌细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述胚胎干细胞是人胚胎干细胞或小鼠胚胎干细胞。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述无血清培养基包含胰岛素、转铁蛋白、孕酮、腐胺和亚硒酸盐。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述无血清培养基包含N2补充物。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述无血清培养基是包含N2补充物的DMEM培养基。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述培养物包含胚状体。
7.如权利要求1所述的方法，还包括在步骤(a)后在细胞水平分离所述培养物。
8.由权利要求1至7中任一项所述的方法产生的心肌细胞，具有如下特征: ⑴表达选自以下的标志物:α-辅肌动蛋白、肌钙蛋白I (cTn I)、ANP、GATA4、Nkx2.5、MEF-2c、MYH6、MYH7、Con43、肌球蛋白重链(a -MHC或sMHC)、肌球蛋白轻链(MLC-2 α或MLC-2v)、心肌肌动蛋白、cTnT和cTnl ； ( )具有囊样形状、混合的形状、漂浮或肌肉样形状；和 (iii)表现出脉搏跳动。
9.产生心肌细胞体的方法，包括: Ca)培养胚胎干细胞，以获得培养物； (b)在无血清培养基中培养所述培养物，以纯化成心肌细胞；并 (C)在无血清培养基中培养纯化的成心肌细胞。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述无血清培养基包含胰岛素、转铁蛋白、孕酮、腐胺和亚硒酸盐。
11.如权利要求9所述的方法，其中所述无血清培养基包含N2补充物。
12.如权利要求9所述的方法，其中所述无血清培养基是包含N2补充物的DMEM培养基。
13.如权利要求9所述的方法，其中所述心肌细胞体表现出同步的跳动。
14.如权利要求9所述的方法，其中所述心肌细胞体的直径为200至500μ m。
15.由权利要求9-14中任一项所述的方法产生的心肌细胞体。
16.用于治疗心脏病的细胞治疗剂，其包含作为活性成分的心肌细胞体。
17.如权利要求16所述的细胞治疗剂，其中所述心肌细胞体表现出同步的跳动。
18.治疗心脏病的方法，包括将治疗有效量的权利要求16所述的细胞治疗剂给予个体。
全文摘要
本发明涉及产生胚胎干细胞来源的心肌细胞的方法和由所述方法产生的心肌细胞、由心肌细胞产生心肌细胞聚集体的方法和由所述方法产生的心肌细胞聚集体、用于治疗心脏病的包含所述心肌细胞聚集体作为活性成分的细胞治疗产品、使用所述细胞治疗产品治疗心脏病的方法、以及心肌细胞和心肌细胞聚集体用于产生细胞治疗产品的用途。通过使用本发明的产生心肌细胞的方法，可以容易地纯化胚胎干细胞来源的心肌细胞，并且心肌细胞聚集体可以由纯化的心肌细胞产生，因此可用作可以用于治疗心脏病的细胞治疗产品。因此，本发明可以广泛用于开发用于预防或治疗多种心脏病的制剂。
文档编号C12N5/02GK103237887SQ201180058293
公开日2013年8月7日 申请日期2011年10月6日 优先权日2010年10月6日
发明者郑炯敏, 文盛焕 申请人:车比奥及戴奥斯泰有限公司
技术领域：
本发明涉及胚胎干细胞来源的心肌细胞和包含所述心肌细胞作为活性成分的细胞治疗剂。更具体地，本发明涉及产生胚胎干细胞来源的心肌细胞的方法、由所述方法产生的心肌细胞、由所述心肌细胞产生心肌细胞体的方法、由所述方法产生的心肌细胞体、包含所述心肌细胞体作为活性成分用于治疗心脏病的细胞治疗剂以及使用所述细胞治疗剂治疗心脏病的方法。
背景技术：
胚胎干细胞(ESC)来源的心肌细胞(CM)可以用于心血管疾病的再生疗法，因此许多研究人员已经开发出了多种使CM分化并分离CM的技术。但是，这些方法在其实际应用中遇到了由于CM产率低所带来的困难。已通过显微切割从收缩性人胚状体(hEB)中分离出CM。已知hEB的形成会诱导未分化的hESC形成收缩性CM，但是通过这种方法形成CM还有一些缺点。首先，在三维培养中，hEB不会表现出三个胚层所特有的分裂模式。第二，分化的细胞与不同细胞谱系的细胞相混。第三，难以分离出高浓度的CM。因此，许多研究人员已经尝试着通过机械分离、Percoll密度梯度分离并通过使用KDR、⑶15和⑶16来分离大量的CM。但是，通过这些方法不能完全地分离出纯的CM细胞，因此在其临床应用中依然有缺陷。由于缺乏CM特异的表面标志物，也难以将常规培养方法应用于CM分离中。为了克服这些问题，使用重组慢病毒载体系统通过转导产生了 MLC-2V诱导的表达GFP的hESC，并通过FACS分离将hESC用于从hEB分离CM。但是，由于病毒DNA能够整合至hEB的DNA中，hESC的这一临床应用大受局限。另外，通过显微切割从收缩性hEB分离CM具有这样一个问题，即由于其与内胚层细胞 而非外胚层细胞可以共存的这一特征，CM与其他内胚层谱系细胞相混，目前正在积极地进行多项研究来解决这一问题。另一方面，同样重要的一个因素是获得足量的CM来用作心血管疾病的治疗剂，因为成熟的CM具有有限的增殖活力。对于这一研究，已经开发出了使用生长因子或者END-2共培养体系(其中内胚层细胞系提供CM增殖和分化)的多种分化方法。但是，由于要使用生长因子，这一方法花费昂贵，并且还有从与其共培养的END-2细胞进一步分离CM的不便。因此，需要能够为针对心脏病的基于细胞的疗法提供高效高产率的产生和分离CM的方法。
发明内容
技术问题在这一背景下，本发明人经过诸多努力，开发出了高效高产率纯化ESC分化的心肌细胞的方法。因此，他们开发出了使用无血清培养基纯化ESC分化的心肌细胞的方法，并发现拟用于治疗心脏病的心肌细胞体(CB)可以通过在无血清培养基中悬浮培养经纯化的CM来产生，由此完成了本发明。
技术方案本发明的一个目的是提供由胚胎干细胞产生心肌细胞的方法，包括:Ca)培养胚胎干细胞，以获得培养物；并6)在无血清培养基中培养所述培养物，以纯化心肌细胞。本发明的另一个目的是提供通过所述方法产生的心肌细胞。本发明的又一个目的是提供产生心肌细胞体的方法，包括:(a)培养胚胎干细胞，以获得培养物；(b)在无血清培养基中培养所述培养物，以纯化成心肌细胞；并((3)在无血清培养基中培养所述经纯化的成心肌细胞。本发明的另一个目的是提供通过所述方法产生的心肌细胞体。本发明的另一个目的是提供用于治疗心脏病的细胞治疗剂，其包含作为活性成分的所述心肌细胞体。本发明的另一个目的是提供治疗心脏病的方法，其包括将所述细胞治疗剂给予个体的步骤。有益效果本发明的产生心肌 细胞的方法可用于容易地纯化胚胎干细胞分化的心肌细胞，无需另外的设备。另外，经纯化的心肌细胞可用于产生心肌细胞体，其可用作用于治疗心脏病的细胞治疗剂。因此，可以将心肌细胞体广泛地应用于开发针对心脏病的预防剂或治疗剂。
图1至4:对来源于人胚胎干细胞的收缩性EB的细胞组分分析。(图1，左图)当在含有20%FBS的DMEM培养基中悬浮培养15天时，出现了来源于人胚胎干细胞的分化的收缩性EB。(图1，中图)表达CM特异的标志物cTnT的细胞以团块形式(clump)部分地位于收缩性EB中。(图1，右图)第二幅图中的白色方框的放大图。(图2，左图)在0.1%明胶包被的平板上分离收缩性和非收缩性区域，之后将收缩性EB铺板。(图2，中图和右图)收缩性细胞簇区域中的细胞表达CM特异的标志物cTnT和sMHC。(图3)EB收缩性区域(Ib)和非收缩性区域中心脏谱系相关基因的表达模式。与非收缩性区域相比，收缩性区域中心脏转录相关基因(NKX2.5和MEF-2c)和CM相关基因(Myh6、Myh7、MLC-2v和TnT)的表达升高。误差棒表示三次实验的平均值。(图4)图1b的收缩性细胞簇由0.05%胰蛋白酶-ETDA处理机械地切割，然后将该细胞重新铺板于0.1%明胶包被的平板上。(图4，左图)在重新铺板的细胞群中，收缩性细胞与非收缩性细胞共存。(图4，中图和右图)免疫细胞化学分析表明，收缩性细胞为CM标志物sMHC或cTnT阳性，相反，非收缩性细胞不表达CM标志物，但是表达内胚层谱系特异的标志物Foxa2或 AFP。图5至11:从重新铺板于含有N2的无血清培养基上的非收缩性细胞群中有效地纯化收缩性细胞，以及对心室型CM的浓缩。
(图5，左图)含有N2的无血清培养基中的大部分细胞均表现出收缩性，并且强烈地表达cTnT(图5，中图)或sMHC(图5，右图)。(图6，左图)当从在含血清(2%FBS)培养基中培养的收缩性细胞簇中分离细胞时，本发明人发现非收缩性细胞和收缩性细胞共存。(图6，中图和右图)含血清培养基中的收缩性细胞和非收缩性细胞分别表达cTnT 和 sMHC。(图7)在含血清培养基或无血清培养基中培养分离的细胞后第14天，表达CM标志物的细胞相对表达DAPI的细胞的百分比。误差棒表示五次实验的平均值。(图8)含血清和无血清条件下培养的细胞中心脏相关基因和内胚层谱系相关基因的表达模式。使用样本的cDNA进行定量RT-PCR，并相对GAPDH将每个值标准化。(图8a和8b)无血清条件下，CM相关基因(Myh6、Myh7、MLC_2v和TnT)表达升高，内胚层谱系相关基因(Foxa2和AFP)表达下降。无血清组的数据被表示为通过血清组标准化的比值。误差棒表示三次实验的平均值。(图9)来源于人胚胎干细胞的CM的电生理特征。从血清组和无血清组记录到了三大类动作电位(结节型(Nodal-type)、心房型和心室型)。从标记区域(*)采集单个动作电位，并在扩展的时间标尺上示出。图9中,虚线表示OmV。(图10和11)含血清或无血清培养条件下三大类动作电位的比例。图中示出含血清组或无血清组中H9-和CHA15-人胚胎干细胞来源的心肌细胞的三大类动作电位。有趣的是，在被记录的细胞中，无血清条件下有80%的细胞表现出心室特征。图12至16:高度纯化的CM在高密度培养体系中增强的增殖能力。(图12，左图)纯化的 CM在含N2的无血清培养基中培养期间，观察到低密度的单细胞和(图12，右图，▲)高密度的形成集落的CM的收缩性。(图13)单CM和形成集落的CM之间在一段时间里的收缩性比较。(图14，左图)周围具有CM的非收缩性的单CM表达CM特异的标志物sMHC(红色)，但不表达增殖标志物K1-67 (绿色)。(图14，右图)一些形成集落的CM表达K1-67和sMHC。(图15)对表达DAPI的细胞中Ki_67表达细胞的定量表明，形成集落的CM比单CM具有更高比例的K1-67表达细胞。误差棒表示三次实验的标准偏差。(图16)对低密度条件和高密度条件下CM的六周增殖率的测量。图17至23:纯化的人胚胎干细胞来源的CM的集落形成。(图17)悬浮条件下单CM的收缩。(图18)当5xl03个收缩性单CM在20μ I中过夜聚集，随后在悬浮培养条件下使用含Ν2的无血清培养基在超低贴壁培养皿上培养7天，形成了 CM体。(图19)同步跳动的细胞簇中全部细胞均为cTnT阳性。(图20)在细胞簇所有细胞的细胞核中发现心脏特异的转录因子Nkx2.5(绿色)和DAPI (红色)的共表达。心脏特异的间隙连接标志物Con43 (红色)也在细胞簇内细胞间相互作用区的细胞膜中表达。(图21)通过sMHC染色在同步的细胞簇中清楚地观察到肌节结构。(图22)在大鼠心脏心肌梗死后，使用10μ I微量移液管将心肌细胞体移植至两个缺血性心脏区域中。(图23)通过超声心动图显像对LV的功能研究(FS)。图24至34:在对心肌梗死进行手术后七周对移植物的组织学研究。(图24)苏木精-伊红染色。(图24，一)心肌细胞体移植中注射的细胞的放大图，这在单细胞移植中没有检测到(图 24，Λ )。(图25)麦森三色染色表明，对心肌梗死进行手术致使左心房纤维化。(图25，一)梗死区中由移植的心肌细胞体对纤维化抑制的放大图，这在单细胞移植中没有检测到(图25，Λ)。(图26)cTnT 染色。(图26，▲)未检测到注射的DiI标记的细胞簇。(图26，一)DiI标记的移植物在移植区域的梗死区中强烈表达，这表明移植的心肌细胞体存活。(图27)对边界区的外部(一)和内部(▲)区域中移植的心肌细胞体的分析。(图28至30)对缺血性心脏的外部区域(图27，一)中的移植物的免疫组织化学分析。(图28)DiI标记的移植物共表达cTnT。(图29)通过三维成像的DiI和cTnT共表达区域的结构。(图30)Con43在DiI标记的移植物中特异地表达，但是不在宿主区中表达。(图31至32)对缺血性心脏的内部区域(图27，▲)中的移植物的免疫组织化学分析。(图31)在缺血性心脏的内部区域观察到的至宿主区的表达DiI的移植物。(图32)图31的白色方框的放大图。(图33)缺血性心脏的内部区域中由Con43抗体染色的移植物，以及自宿主移行的区域中的DiI表达细胞。(图34)图33的放大图。图35:单CM移植的组织学评估。在连续切片组织的内部区域中移植的CM的间隙连接表达。在缺血性心脏的内部区域，大部分DiI标记的共表达间隙连接特异的标志物Con43(绿色)的细胞，但是与宿主并无接触，这不同于心肌细胞体移植。图36至42:由来源于人胚胎干细胞的CM移植的梗死左心室的超声心动图显像。(图36)非梗死大鼠心脏的M模式超声心动图。(图37至39)每组在第2天(左图)和第51天(右图)的M模式超声心动图。(图40至42)对第2天和51天的左心室舒张期内径(LVIDd)、左心室收缩期内径(LVIDs)和缩短分数(FS)的分析。
最佳实施方式 一方面，为了实现上述目标，本发明提供了使用无血清培养基由胚胎干细胞产生心肌细胞的方法。特别地，产生心肌细胞的方法包括以下步骤:(a)培养胚胎干细胞，以获得培养物；并6)在无血清培养基中培养所述培养物，以纯化心肌细胞。本文所使用的术语“心肌细胞(CM)”通常指构成作为心壁中间层的心肌的细胞，就本发明的目的而言，所述心肌细胞包含任何分化期的任何细胞，对其没有限制，例如由胚胎干细胞分化以形成肌节的成心肌细胞、具有成为功能性心肌细胞的潜能的心肌细胞祖细胞，所述功能性心肌细胞如由成心肌细胞分化的心肌细胞、胎儿心肌细胞和成人心肌细胞，并且心肌细胞是指可通过下文列出方法中的至少一种、优选通过多种方法中的至少一种、并且更优选通过多个标志物或标准鉴定的细胞。多种心肌细胞特异的标志物的表达可通过已知的生物化学方法或免疫化学方法检测，并且这些方法可以无限制地使用。在所述方法中，可以使用能结合心肌细胞祖细胞或心肌细胞的标志物特异的多克隆抗体或单克隆抗体。靶向每一种特异的标志物的抗体可以商购，或者通过已知方法制备，对其没有限制。对心肌细胞祖细胞或心肌细胞特异的标志物可以包括，但不限于，α-辅肌动蛋白、肌钙蛋白KcTn I)、ANP、GATA4、Nkx2.5、MEF-2c、MYH6、MYH7、Con43、肌球蛋白重链(a -MHC或sMHC)、肌球蛋白轻链(MLC-2 α或MLC_2v)、心肌肌动蛋白、cTnT、cTn I，并优选cTnT和sMHC。另外，标志物的表达可以通过用于扩增、检测、翻译编码任何标志物蛋白的mRNA的常规分子生物学方法来检测，所述方法例如反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)或杂交测试，但是不限于具体的方法。编码标志物的核酸序列是已知的，因此可从公共数据库如GenBank获得。需要被用作引物或探针的标志物特异的序列可以容易地确定。另外，还可以使用生理标准来检测多潜能细胞至心肌细胞的分化。也就是说，自发性脉搏跳动、或者各种离子通道的表达以及对电刺激的反应也可以用作检测多潜能细胞分化成心肌细胞的指标。本文使用的术语“胚胎干细胞”指这样的细胞:其恰好在植入到母体子宫内之前的时期从胚泡的内细胞团提取，并离体(ex vivo)培养，具有多潜能，能够分化成为人体的任何细胞类型。本发明中使用的胚胎干细胞优选为人胚胎干细胞或小鼠胚胎干细胞，其产生方法和特征已被确立，但对所述胚胎干细胞并没有特别的限制。通过培养人胚胎干细胞获得的培养物可以包括由胚胎干细胞分化的包含全部外胚层细胞、中胚层细胞和内胚层细胞的胚状体，优选内胚层细胞和中胚层细胞，并且更优选内胚层细胞和CM，但对其没有特别的限制。
胚状体可以包含由胚胎干细胞分化的CM，并且由于包含CM而表现出收缩性。胚状体中CM的含量可以为约10至15%，但是对其没有特别的限制。胚胎干细胞可以是使用干细胞用含血清培养基在无有丝分裂活性的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)滋养层上预培养的那些胚胎干细胞，并且在经随后的悬浮培养之后，可以使用从滋养层分离的胚胎干细胞。干细胞用含血清培养基可以优选为补充有血清或者血清替代物的hESC培养基(含有L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、β -巯基乙醇和bFGF)，但对其没有特别的限制，并且血清或者血清替代物的含量优选为10至20% (v/v)，但是对其并没有特别的限制。本文使用的术语“悬浮培养”，也称为漂浮培养，是指细胞悬浮或漂浮在培养容器的液体培养基中，并且为了使细胞维持在悬浮或漂浮状态，在培养期间应该搅拌培养基。可以进行悬浮培养，目的是纯化CM并形成培养物，优选从胚胎干细胞形成收缩性胚状体。用于产生培养物的悬浮培养可以通过以下方式进行:在除去bFGF的基础hESC培养基中对胚胎干细胞进行原代培养，并在含血清或血清替代物的培养基中进行继代培养。如所述，基础hESC培养基是含有L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、β -巯基乙醇和bFGF的培养基，并且含血清或血清替代物的培养基可以优选为含有血清例如FBS的基础hESC培养基，但对其没有特别的限制，并且培养基中血清或血清替代物的含量优选为10至20%(v/v)，但对其没有特别的限制。同时，可以进行用于纯化CM的悬浮培养，这样培养物，优选收缩性胚状体，在无血清培养基中被培养，以杀死除CM之外的细胞，使得仅允许CM存活，由此实现纯化CM的效
果O本文使用的术语“无血清培养基”是指不含异源或同源血清的任何细胞培养基，并且本领域已知的任何细胞培养基均可使用，只要它不含血清。通常需要含血清培养基来培养已分化的成熟细胞。但是，本发明发现，在无血清培养基中，CM存活，但是其他细胞死亡。另外，通过使用无血清培养基，可以消除可能出现在临床应用中的由于污染物质所致的污染风险，所述污染物质包括来自血清培养基中存在的牛来源物质例如胎牛血清(FBS)或牛血清(FCS)的疯牛病病毒。另外，通过使用无血清培养基，可以消除由血清中的蛋白质所诱导的抗体形成所引起的移植细胞的移植排斥风险，这样可以将本发明方法所产生的心肌细胞应用于针对心脏相关疾病的细胞疗法，而无临床风险。无血清培养基可以优选为不含其它生长因子、血清或血清替代物，但含有胰岛素、人转铁蛋白、孕酮、腐胺(putrascine)和亚硒酸盐的培养基,更优选含有N2补充物的培养基，最优选含有N2补充物的DMEM培养基，但是对其没有特别的限制。无血清培养基，优选含有胰岛素、人转铁蛋白、孕酮、腐胺和亚硒酸盐的培养基，更优选含有N2补充物的培养基， 更加优选含有N2补充物的培养基，不含来源于胚胎干细胞的细胞生长、分化和增殖必需的组分，从而在细胞培养期间提供苛刻的环境，这样需要生长、分化和增殖的细胞不能在该培养基中存活。相反，结束分化的CM由于其本性不需要经历细胞生长、分化、增殖，因此能够在该培养基所提供的苛刻环境下充分存活。因此，该培养基显示出对非CM的多种类型的分化细胞的存活的抑制效应，最终，能够将CM从培养物中纯化出来。为了提高从培养物中纯化CM的效率，如果必要的话，可以在悬浮培养前进一步进行细胞水平的分离步骤。优选使用蛋白水解酶、更优选使用胰蛋白酶，可以进行细胞水平的分离，但是不特别限于上述方法。在进行细胞水平的分离时，从培养物中分离的全部的单细胞均受无血清培养基的直接影响，由此更快更有效地纯化CM。根据本发明的一个实施方案，本发明人已发现，三维聚集物——胚状体(EB)——由人胚胎干细胞(hESC)在体外形成(图1)，并且其中包含的收缩性心肌细胞(CM)通过免疫细胞化学分析鉴定(图1)。发现EB具有显示出收缩性和表达CM特异的标志物cTnT和sMHC的区域和不显示收缩性和CM特异的标志物表达的区域(图2)。在显示出收缩性和表达CM特异的标志物cTnT和sMHC的EB区域观察到心脏相关的转录因子(NKX2.5和MEF_2c)和心脏特异的肌节蛋白编码基因(MLC-2v、MYH6、MYH7和TnT)的表达(图3)。另外，在不显示收缩性和CM特异的标志物表达的区域观察到内胚层标志物FoxA2和AFP的表达(图4)。这些结果表明，为了由hESC制备CM，必须要从EB纯化成心肌细胞。因此，本发明人意图通过从胚状体纯化CM来由胚胎干细胞产生心肌细胞。为了实现这一意图，本发明人通过下述方式由胚胎干细胞产生了心肌细胞:培养胚胎干细胞，以获得培养物；并随后在无血清培养基中培养所述培养物，以纯化心肌细胞。具体地，本发明人使用含有N2补充物的DMEM培养基培养了胚状体(实验组)，并使用含有血清和N2补充物的DMEM培养基培养了胚状体，作为对照组。结果，实验组中培养的细胞数目与对照组的细胞数目相当，并且在实验组和对照组两组中均观察到了收缩性细胞，但是没有在实验组中、而是在对照组中观察到了非收缩性细胞(图5和6)。使用CM特异的标志物cTnT和sMHC进行的免疫细胞化学分析的结果表明，CM特异的标志物cTnT和sMHC在实验组的大部分细胞(80%或更多)中表达，但是CM特异的标志物cTnT和sMHC在50%或更少的对照组中表达(图7)。并且，通过qRT-PCR确定了实验组和对照组的细胞中心脏特异的标志物CTnT、Myh6、Myh7和MLC-2v以及内胚层标志物FOXA2和AFP的基因表达水平，并将之相互比较。结果是，实验组细胞表现出高表达水平的心脏特异的标志物，但低表达水平的内胚层谱系标志物(图8)。最后，为了提供初步的对hESC来源的CM的功能评估，对收缩性细胞进行了全细胞膜片钳记录。结果表明，与对照组相比，实验组细胞中的心室型动作电位显著升高(图9和10)。在另一方面，本发明提供了由上述方法产生的心肌细胞。该心肌细胞具有以下特征:(i)表达选自以下的标志物:α-辅肌动蛋白、肌钙蛋白I(cTn I)、ANP、GATA4、Nkx2.5、MEF-2c、MYH6、MYH7、Con43、肌球蛋白重链(a -MHC 或 sMHC)、肌球蛋白轻链(MLC-2 α 或 MLC-2v)、心肌肌动蛋白、cTnT 和 cTnl ；(ii)具有囊样形状、混合的形状、漂浮或肌肉样形状；和
(iii)表现出脉搏跳动。在又另一方面，本发明提供了由心肌细胞产生心肌细胞体(CB)的方法。具体地，本发明的产生心肌细胞体的方法包括以下步骤:(a)培养胚胎干细胞，以获得培养物；(b)在无血清培养基中培养所述培养物，以纯化成心肌细胞；并(C)在无血清培养基中培养所述成心肌细胞。在这一点上，可以以与CM纯化过程中的悬浮培养的方法相同的方法进行培养，但是并不特别地限于以上方法，并且如上所述，培养用无血清培养基可以是不含其它生长因子、血清或血清替代物，但含有胰岛素、人转铁蛋白、孕酮、腐胺和亚硒酸盐的培养基，更优选含有N2补充物的培养基，最优选含有N2补充物的DMEM培养基。在另一方面，本发明提供了由上述方法产生的心肌细胞体(CB)。由上述方法产生的CB可以表现出同步的跳动，直径为200至500 μ m。本文使用的术语“心肌细胞体(CB)”是指通过将纯化的由hESC分化的CM在不含细胞生长、分化和增殖所必需的组分的条件下悬浮培养较长一段时间而形成的CM聚集体。优选地，本发明的CB可以表现出同步的跳动，其大小可以优选为直径200至500 μ m,但对其没有特别的限制。CB是由CM高密度聚集以适应苛刻培养条件的组织类型。由于CB表现出同步的跳动，就其收缩性和密度而言，其可针对心脏病被移植。根据本发明的一个实施方案，本发明人产生了 CM体(心肌细胞体，CB)，并且他们通过将其移植至心肌梗死心脏证实了其效应。详细地，将纯化的hESC来源的CM通过悬滴法悬浮培养7天，从而产生直径为200至500μπι的CB(图17)。所产生的CB显示出同步的跳动(图18)。为了表征所产生的CB，使用心脏特异的标志物cTnT、Nkx2.5、Con43和sMHC进行了免疫细胞化学分析，结果显示了心脏特异的标志物的表达(图19至21)。同时，将CB形式的CM移植到心肌梗死引起的动物模型的心脏病灶中，并且在一段时间后对移植区域进行组织化学分析。结果显示，在移植组织中没有检测到畸胎瘤形成，这表明细胞没有分化能力，因为在移植具有分化能力的干细胞后会形成畸胎瘤。另外，在移植CB形式而非单细胞的CM时，观察到更广泛的组织再生(图24)，观察到更少的纤维组织(图25)，检测到成块的心肌组织(图26)，并且CB移植到梗死区引起了心肌再生(图27至34)。具体地，与移植单CM细胞相比，移植CB显示出广泛存在的Di I阳性细胞(图28和29)，并且Con43阳性细胞位于检测到DiI阳性细胞的区域(图30)。在移植CB和单细胞之间的边界区观察到几个零散的移植物(图31至34)。但是，在移植单CM细胞的对照组中没有观察到DiI阳性细胞或Con43的移入(图35)。因此，检查了 CB移植对左心室(LV)功能的影响。结果是，在移植单CM细胞的大鼠中观察到显著升高的LVIDs值，而在移植CB的大鼠中观察到下降的LVIDs值(图40)。在移植后第51天，与第2天测量的值相比，LVIDd值基本都升高。与非移植大鼠或移植单CM细胞的大鼠相比，移植CB的大鼠表现出最低的LVIDd升高水平，并且与非移植大鼠或单细胞移植的大鼠相比，移植CB的大鼠表现出显著升高的缩短分数值(fractional shortening value)(图 42)。在另一方面，本发明提供了用于治疗心脏病的细胞治疗剂，其包含本发明的心肌细胞体作为活性成分。如上所述，表现出同步跳动的CB在植入心脏病患者的心脏时能够展现出正常的心脏功能，因此能够用作心脏病细胞治疗剂的活性成分。表现出同步跳动的CB可以容易地通过本发明的产生方法获得。本文使用的术语“细胞治疗剂”是指用于进行治疗、诊断和预防的药物，其包含通过自人分离、培养以及特别的操作(如由US FDA提供)制备的细胞或组织。具体地，其是指用于通过一系列以下行为而进行治疗、诊断和预防的药物:在体外扩增和分选活的自体细胞、同种异体细胞和异种细胞，或者通过恢复细胞或组织功能的其他方式改变细胞生物学特征。就本发明的目的而言，表现出同步跳动的CB可用于多种通过植入、移植或注射至心脏组织内来增强、治疗或替换 的治疗方案中，并且它们替代或者强化心脏组织，使之成为新的或者改变的组织，或者与生物组织或结构结合。在另一方面，本发明提供了使用本发明的细胞治疗剂治疗心脏病的方法。具体地，本发明的用于治疗心脏病的方法包括以下步骤:将所述CB或所述细胞治疗剂给予需要治疗心脏病的个体的心脏中。本文使用的术语“个体”是指患有心脏病或具有患心脏病可能性的包括人在内的动物。细胞治疗剂可以经由任何常规途径给药，只要它能够达到目标组织。另外，细胞治疗剂可以通过任何能能够将活性成分递送至靶细胞的设备给药。本发明的细胞治疗剂可以以治疗有效量给药，本文使用的短语“治疗有效量”是指足以以适用于任何医学治疗的合理利益/风险比治疗疾病的量。有效剂量水平可能因多种因素而异，所述多种因素包括个体的类型、严重程度、年纪和性别，药物活性、药物敏感度、给药时间、给药途径、排放系数(discharge ratio)、治疗周期和共给药的药物以及医学领域周知的其他因素。本发明的细胞治疗剂可以单独给予或与其他疗法联合给予。本发明的治疗剂与其他疗法的共给予可以同时地或者相继地进行。单个或者多个剂量均是可以的。重要的是，使用足以获得最大疗效而无副作用的最小可能量，在考虑所有因素的情况下。典型地，当有关疾病用包含未分化的干细胞或者干细胞分化的细胞作为活性成分的细胞治疗剂进行治疗时，所述细胞治疗剂依据细胞类型被分离，然后经由注射器被给予个体损伤部位。根据细胞类型分离细胞治疗剂的理由是防止细胞治疗剂效果下降，所述下降是由共给予细胞以及经由注射器的常规注射所致。与使用细胞治疗剂的典型方法不一样，本发明的细胞治疗剂可通过将活性成分心肌细胞体直接地移植到需要治疗的个体的心脏损伤部位来使用。如上所述，由于本发明的心肌细胞体表现出同步的跳动，通过使用心肌细胞体而非使用单个收缩性心肌细胞可以更为有效地治疗心脏病。本发明人首次证实，通过使用表现出同步跳动的心肌细胞体，可以更有效地治疗心脏病。表现出同步跳动的心肌细胞体可以通过本发明的产生心肌细胞体的方法容易地获得，无需额外的装置。人胚胎干细胞是富有前景的用于治疗心脏病的心肌细胞源。以前的研究表明，移植人胚胎干细胞会再生心脏组织，并改善梗死心脏的收缩。但是，将未分化的人胚胎干细胞和来源于未分化的人胚胎干细胞的非靶细胞注射到心肌内，会导致在个体内形成不想要的畸胎瘤或非靶组织。另外，移植完全分化的心肌细胞会导致不利的存活和移入。为了克服这些问题，本发明人开发出了从人胚胎干细胞产生纯的CM的纯化方法以及改善梗死心脏中的细胞存活和移入的移植方法。在本发明中，本发明人使用无血清培养基选择分化的CM，并将其他谱系细胞排除在收缩性EB之外。成分确知的无血清培养基仅允许收缩性CM存活，并保持其功能。这一方法产生了相当纯的来源于收缩性EB的CM，其保留了收缩性，并在成分确知的无血清培养基中表达CM相关的标志物。
有许多纯化hESC来源的CM的方法:作为从人胚胎干细胞纯化CM的典型方法的选择在EB形成后通过机械切割获得的自发收缩的CM、物理分离如Percoll密度梯度离心或者选择细胞表面标志物如荧光激活的细胞分选。这些纯化方法需要大量的财力和人力。因此，这些方法的效率取决于专门的仪器和技能。但是，本发明的纯化心肌细胞的方法提供了更为简单的方案，无需任何专门的仪器和技能。而且，这一方法不需要对细胞的遗传修饰。使用非病毒或病毒系统进行遗传修饰具有以下缺点:外源基因的表达、难以控制基因表达以及可能产生肿瘤。另外，含有许多在细胞生长和分化中起到未知功能的非特化因子的血清不用于本发明中。在临床应用中，使用无血清培养基可以降低潜在的病原体污染风险。另一方面，药物开发旨在开发直接应用于人的药物，因此优选通过将药物施用于具有与人相似特征的人源细胞来测试药物的活性。为此，在开发用于药物测试的细胞中，胚胎干细胞或诱导型多潜能干细胞有望成为最有用的药物开发工具。理论上，这些细胞都能够分化成为许多不同类型的构成身体的细胞，因此这些细胞有望成为需要用于药物开发的化合物所靶向的细胞来源，并且由于其无限增殖性，它们也有望成为大规模生产的来源。对于这一研究，将干细胞应用于药物开发的技术已经被积极地研究，由这些研究所得到的干细胞已经应用于药物开发的所有阶段，从最初的阶段到临床前阶段，包括疾病病因学研究、发现新药物IE标、次要药效学、安全药效学、代谢轮廓分析(metabolic profiling)和毒性评估。由于在药物开发阶段中的低失败率和高收益，应该使用正常人细胞进行体外评估。但是，由于人正常细胞的体外培养会导致人细胞固有能力的丧失，因此主要使用原代培养细胞或肿瘤细胞系。心脏毒性在体外评估中最为重要。心脏毒性由复杂的反应所致，因此评估的准确性应尽可能高，所述复杂的反应例如多离子通道和细胞内离子浓度的改变。为此，必需通过体外评估测试心脏毒性，但是难以获得待用于测试中的人原代培养细胞形式的心脏细胞。最近，已报道可商购药物如糖尿病药物或普通麻醉剂可能引起心律失常，对药物引起的心脏毒性的兴趣也在与日俱增。因此，迫切地需要开发出用于药物开发的心脏细胞模型。在体外条件下，本发明提供的胚胎干细胞来源的心肌细胞能够形成表现出与心脏组织相似的密度和同步跳动的心肌细胞体，因此它们可以用于开发药物开发的心脏细胞模型。本发明的实施方式在下文中，将参照实施例更详细地对本发明进行描述。但是，这些实施例仅为示例性目的，本发明不应被这些实施例所限制。实施例1:从人杯胎干细朐(hESC)产牛心肌细朐(CM)在体外从人胚胎干细胞(hESC)形成了分化的三维聚集体一胚状体(EB)，并鉴定了其中包含的收缩性心肌细胞(CM)。 实施例1-1: hESC培养和hEB形成使用通过将20% (v/v)血清替代物(Gibco)加至基础hESC培养基(ImM L-谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、IOOmM β -巯基乙醇和4ng/mL bFGF)制备的DMEM/F12 (50:50%; GibcoBRL, Gaithersburg, MD)，在无有丝分裂活性的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)滋养层上培养未分化的hESC (CHA15-hE·SC和H9_hESC系)。此时，将DMEM/F12培养基每24小时换一次，然后使用切割移液管每5-7天将hESC转移到新鲜的无有丝分裂活性的滋养层。随后，使用分散酶(Gibco)从无有丝分裂活性的滋养层分离出hESC，并将其转移至超低贴壁的培养皿中，然后向其加入无bFGF的基础hESC培养基，接着悬浮培养2天。之后，将培养基替换为补充有20%FBS的DMEM，并将细胞培养15-20天，收缩性分化的三维聚集物——人胚状体(hEB)从hESC形成(图1，左图)。如图1的左图所示，形成的EB中的10-15%是收缩的。实施例1-2:对hEB的免疫细胞化学分析为确认EB是否含有收缩性CM，使用CM特异的标志物进行了免疫细胞化学分析。详细地，在载玻片上将EB于4%多聚甲醛中固定20分钟，并用含有0.l%TritonX-100的PBS处理五分钟。随后，将细胞用5%正常山羊血清处理30分钟，再用CM特异的标志物cTnT所特异的一抗(MiIlipore, Billerica, MA)处理,接着在4°C孵育12小时进行第一反应。在终止第一反应后，将细胞用PBS洗涤三次，并用罗丹明或FITC标记的二抗(Molecular Probes Inc.，Eugene, OR)处理,接着孵育I小时进行第二反应。在终止第二反应后，将细胞用PBS洗涤三次，并染色。将染色的玻片固定于含有2.5%聚乙烯醇和1，4二氮杂二环(2.2.2)辛烷和4，6- 二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)的甘油基固定溶液(Sigma)中。在 LSM510META 共聚焦显微镜(Carl Zeiss Inc.，Oberkochen, Germany)下对固定的玻片照相，并对其进行分析(图1的中图和右图)。如图1的中图和右图所不，观察到对EB的部分染色，这表明含有收缩性CM。
实施例1-3:对hEB的表征将EB固定于明胶包被的平板上，以进行hEB表征(图2)。如图2的左图所示，尽管被固定在明胶包被的平板上，一部分EB也收缩了。接下来，如图2的中图和右图所示，使用CM特异的标志物cTnT和sMHC对hEB进行免疫细胞化学分析的结果显示，hEB的收缩区域被染上色，但是hEB的非收缩区域未被染上色。这些结果表明，hEB含有收缩性CM和非收缩性细胞。实施例1-4:对hEB基因表达水平的分析通过显微切割分离了 hEB的收缩区域和非收缩区域，并将分离的区域用0.25%胰蛋白酶-EDTA处理，以在细胞水平对其进行分离。将每一分离的细胞转移至明胶包被的平板。使用分离的细胞进行qRT-PCR，以确定心脏相关转录因子(NKX2.5和MEF-2c)和心脏特异的肌节蛋白编码基因(MLC-2v、MYH6、MYH7和TnT)的基因表达水平。详细地,使用TRIzol试剂(Molecular Research Center, OH)自每一分离的细胞获得总RNA，并使用2 μ g的总RNA和反转录酶(SuperScript II反转录酶)进行RT-PCR，以合成cDNA。通过将合成的cDNA和能够扩增心脏相关转录因子(NKX2.5和MEF_2c)和心脏特异的肌节蛋白编码基因(MLC-2v、MYH6、MYH7和TnT)的下表I的每一引物应用至ABI7300qRT_PCR 系统(Applied Biosystems)来进行 qRT-PCR。此时，将 GAPDH 用作 PCR 内部对照组，并通过比较Λ Λ Ct法(图3)来计算基因表达水平。[表I]
权利要求
1.由胚胎干细胞产生心肌细胞的方法，包括: (a)培养胚胎干细胞，以获得培养物；并 (b)在无血清培养基中培养所述培养物，以纯化心肌细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述胚胎干细胞是人胚胎干细胞或小鼠胚胎干细胞。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述无血清培养基包含胰岛素、转铁蛋白、孕酮、腐胺和亚硒酸盐。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述无血清培养基包含N2补充物。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述无血清培养基是包含N2补充物的DMEM培养基。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述培养物包含胚状体。
7.如权利要求1所述的方法，还包括在步骤(a)后在细胞水平分离所述培养物。
8.由权利要求1至7中任一项所述的方法产生的心肌细胞，具有如下特征: ⑴表达选自以下的标志物:α-辅肌动蛋白、肌钙蛋白I (cTn I)、ANP、GATA4、Nkx2.5、MEF-2c、MYH6、MYH7、Con43、肌球蛋白重链(a -MHC或sMHC)、肌球蛋白轻链(MLC-2 α或MLC-2v)、心肌肌动蛋白、cTnT和cTnl ； ( )具有囊样形状、混合的形状、漂浮或肌肉样形状；和 (iii)表现出脉搏跳动。
9.产生心肌细胞体的方法，包括: Ca)培养胚胎干细胞，以获得培养物； (b)在无血清培养基中培养所述培养物，以纯化成心肌细胞；并 (C)在无血清培养基中培养纯化的成心肌细胞。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述无血清培养基包含胰岛素、转铁蛋白、孕酮、腐胺和亚硒酸盐。
11.如权利要求9所述的方法，其中所述无血清培养基包含N2补充物。
12.如权利要求9所述的方法，其中所述无血清培养基是包含N2补充物的DMEM培养基。
13.如权利要求9所述的方法，其中所述心肌细胞体表现出同步的跳动。
14.如权利要求9所述的方法，其中所述心肌细胞体的直径为200至500μ m。
15.由权利要求9-14中任一项所述的方法产生的心肌细胞体。
16.用于治疗心脏病的细胞治疗剂，其包含作为活性成分的心肌细胞体。
17.如权利要求16所述的细胞治疗剂，其中所述心肌细胞体表现出同步的跳动。
18.治疗心脏病的方法，包括将治疗有效量的权利要求16所述的细胞治疗剂给予个体。
全文摘要
本发明涉及产生胚胎干细胞来源的心肌细胞的方法和由所述方法产生的心肌细胞、由心肌细胞产生心肌细胞聚集体的方法和由所述方法产生的心肌细胞聚集体、用于治疗心脏病的包含所述心肌细胞聚集体作为活性成分的细胞治疗产品、使用所述细胞治疗产品治疗心脏病的方法、以及心肌细胞和心肌细胞聚集体用于产生细胞治疗产品的用途。通过使用本发明的产生心肌细胞的方法，可以容易地纯化胚胎干细胞来源的心肌细胞，并且心肌细胞聚集体可以由纯化的心肌细胞产生，因此可用作可以用于治疗心脏病的细胞治疗产品。因此，本发明可以广泛用于开发用于预防或治疗多种心脏病的制剂。
文档编号C12N5/02GK103237887SQ201180058293
公开日2013年8月7日 申请日期2011年10月6日 优先权日2010年10月6日
发明者郑炯敏, 文盛焕 申请人:车比奥及戴奥斯泰有限公司
最新回复(0)