目标核酸多标靶定量鉴定的制作方法
专利名称：目标核酸多标靶定量鉴定的制作方法
目标核酸多标朝定量鉴定
相关申请的交叉参考本申请要求美国临时专利申请编号为61/393.253的优先权，题为“多标靶定量”，于2010年10月14日提交，所有内容纳入本参考中。
背景技术：
1.发明适用领域本发明涉及分子检测，更具体地来说，是关于一个或众多目标分子多标靶定量检测的方法和系统。
2.
背景技术：
生化分析一般用于研究、临床、环境和工业设置，以检测和量化某些基因序列、抗原、疾病或病原体。生化分析通常用来识别生物体，比如宿主生物体或样品中的寄生虫、真菌、细菌或病毒。在特定条件下，生化分析可以提供定量检测，其可以用来计算感染或疾病的程度，并且监测疾病随着时间的推移而产生的状态。一般情况下，生化分析通常检测从研究、临床、环境或工业来源样品中所提取的抗原(采用免疫测定法)或核酸(基于核酸或分子的生化分析)。对生化分析而言，定量识别横跨国土安全、食品安全以及医疗诊断等众多学科的多种病原体需求是不断增长的。虽然现有技术可以进行多种定量分析，但是这些技术无法对多种病原体提供足够的定量识别。例如，微阵列提供满意的DNA多靶标鉴定，但是很少或根本没有提供量化信息。另一方面，实时PCR提供高品质的量化信息，但是多靶标鉴定则有限。实时聚合酶链反应(PCR)，在 其它应用中也被称作定量实时聚合酶链反应(qrt-PCR)，它是一个分子生物学工具，采用众所周知的PCR工艺来同时扩增目标DNA分子，同时量化目标DNA ;与另一个输入相比，可以作为一个绝对量或者一个相对量。采用标准的PCR，可以在反应完成后对产品进行检测。与此相反，为进行定量实时聚合酶链反应，用户采用大致相同的方式来放大目标DNA分子，但是在聚合酶链反应进展的同时来检测目标DNA分子。用来实时检测qrt-PCR产品的一些最常用方法，就是利用结合到双链DNA产品中的非特异性荧光染料；或者使用标有荧光报告基团的特定序列探针，只有当探针与目标序列产生交叉时，荧光报告基团才会发出荧光。如果采用这些方法，则需要提供附加设备比如荧光检测器。特定序列探针法要求使用的探针具有核苷酸碱基序列，它与目标序列基本上互补，或者与其扩增物交替互补。在选择性生化分析条件下，为了检测样品中目标序列是否存在，探针被用来杂交目标序列或其扩增物。有效的探针可以防止与任何核酸序列进行非特异性杂交，这些核酸序列会干扰检测是否存在目标序列。探针或扩增物可包括标记物，能够检测标记所在位置，比如放射性标记、荧光染料、生物素、酶、电化学或化学发光化合物等。为量化qrt-PCR产品，将所检测到的荧光强度绘制在对应于PCR循环数的对数刻度图上。可以通过比较试验结果和采用已知量产品获得标准结果来决定待反应中的目标量。然而,这只是可以量化qrt-PCR产品的方式之一。
定量实时PCR应用很多，特别是在分子生物学方面更是如此。qrt-PCR的一个特别用处在于获取样品中有关病原体的定量信息。为了定量分析，实时测量荧光强度，或者实时测量扩增反应期间扩增物浓度增加的另外一个参数都是必要的。为区分众多靶标，必须为每个靶标设计带有特定探针的特殊引物。或者在一个要求不高的情况下，只需要设计引物以及将诸如SYBR绿色荧光报告物应用于该反应，以监测扩增物的浓度在增加。例如，如果有10个潜在靶标，那么通常情况下需要10个不同的探针。当前最先进的探测器/探针组合允许多靶标同时检测最多4或5个目标。但是，大多数实时PCR系统只配备两个探测器，用于多靶标检测。使用该系统，对于区分6个丙型肝炎C病毒(HCV)基因而言则需要进行6次单独的PCR反应。DNA微阵列是一种工具，通过样品中目标核酸与微阵列上互补的DNA序列相杂交，以检测样品中是否存在目标核酸序列。微阵列本身含有多达数千个的DNA斑点-被称作探针(或报告物)_其连接到表面上(例如微阵列自身表面或者次表面，比如小珠)。通常在显微镜玻片或其他相对较小的表面上形成微阵列，可以通过微阵列读取器来轻松读取。DNA探针的读取范围可以从很短或很长的DNA片断，并且常常包括一个短的寡核苷酸、基因、基因段、或非编码DNA片段，其中包括许多其它类型的序列。要使用微阵列，就需要获取、纯化、扩增、以及标记感兴趣的核酸，通常情况下要么采用荧光方式，要么采用放射性标记。而后在DNA斑点上洗涤标记过的核酸，并且如果感兴趣的核酸实际上存在，其会与微阵列上的互补探针相杂交。未绑定或非特异性绑定的核酸被冲走，只留下绑定目标。做过标记的绑定目标从而在各绑定的DNA斑点处产生了一个信号，微阵列读取器可以检测到荧光信号，同时根据微阵列上的已知位置来确定探针和目标的身份。DNA微阵列技术的优点之一就是该阵列的多靶标能力。因为单一阵列最多可能包括数千个的不同探针，单一微阵列试验可以同时执行数以千计的基因检测。微阵列通常用于以下方面:(i)分析基因表达；(ii)识别生物体；(iii)检测单核苷酸多态性(简写为SNP) ;(iv)对密切相关的生物之 间进行基因组比较，其中包括许多其它广为人知的用处。因此，微阵列技术常用于DNA的多靶标识别。然而，微阵列提供与被识别DNA有关的非常少或者不准确的定量信息。因此，在该技术领域中需要继续改进方法和系统，以便定量与多靶标检测相结合。
本发明小结因此，本发明的一个主要目的和优点就是向一个或众多目标定量检测提供一种方法。本发明的另一个目的和优点就是将定量与一个或众多目标多标靶检测相结合。本发明还有一个目的和优点就是将实时核酸扩增系统的定量能力与杂交系统的多标靶功能相结合。本发明的其它目的和优点部分是显而易见的，部分将在下文介绍。根据上述目的和优点，本发明为样品中至少一个目标核酸分子提供检测方法。该方法包括以下步骤:(i)识别每个众多目标核酸分子的第一区域，即在众多目标核酸分子中，该第一区域是保守的；(ii)在样品中生成各目标核酸分子第一区域的第一扩增物；(iii)在扩增期间实时检测第一扩增物的生成；(iv)识别每个众多目标核酸分子的第二区域，即在众多目标核酸分子中，第二区域并不是保守的；(V)在样品中生成各目标核酸分子第二区域的第二扩增物；(V)检测第二扩增物，以表示样品中是否存在各目标核酸分子。从另外一方面来说，第一扩增产物产生于存在能与第一区域杂交的第一核酸探针时，并且扩增产物的实时检测步骤包括检测第一核酸探针与第一区域的杂交情况。从另外一方面来说，检测第二扩增物的步骤包括将第二扩增产物与互补探针杂交，此处将探针固定在基片上，比如DNA微阵列。该方法还可以包括以下步骤:(i)识别第二众多目标核酸分子的第三区域，即在第二众多目标核酸分子中，第三区域是保守的。(ii)通过扩增样品中每个第二众多目标核酸分子的第三区域来生成第三扩增物。(iii)实时检测第三扩增物的生成。在同一反应中可以生成第一扩增物和上述第三扩增物。第二方面就是上述方法，还包括通过分析样品中目标核酸分子的定量以及样品中是否检测各目标核酸分子来进行样品中各众多目标核酸分子的多标靶定量检测步骤。第三方面，样品中存在一个或更多目标核酸分子表不该样品中存在病原体。该方法可以用来检测、定量或者识别至少两个目标，比如样品中的病原体、基因、单核苷酸多态性、特定核酸序列等。第四方面，识别每个众多目标核酸分子的第一区域的步骤包括如下:(i)对每个众多目标核酸分子的至少一个核酸序列片段进行序列比对；(ii)在序列比对基础上识别第一区域；(iii)设计第一引物和第二引物，其将在PCR扩增期间扩增第一区域；(iv)设计一个探针，在第 一区域PCR扩增期间用来与该区域杂交。该探针的熔解温度至少要比第一弓I物的熔解温度和第二弓I物的熔解温度高6 V。第五方面，识别每个众多目标核酸分子的第二区域的步骤包括如下:(i)对每个众多目标核酸分子的核酸序列至少一个片段进行序列比对；(ii)基于序列比对来识别第二区域；(iii)设计第一引物和第二引物，在PCR扩增期间将扩增第二区域。该方法还包括设计互补探针的步骤，即与每个众多目标核酸分子的第二区域进行杂交。第六方面，提供一个系统，用来检测众多目标核酸分子的至少一个分子。该系统包括如下:(i)包括众多靶核酸分子至少一个分子的样品；(ii)第一引物对:第一引物对可以扩增每个众多目标核酸分子的第一区域，以生成第一扩增物。其中，众多目标核酸分子中，第一区域是保守的。(iii)实时聚合酶链反应(PCR)仪器，其中，PCR仪器可以用第一引物对来生成第一扩增物，并且还可以实时检测第一扩增物。(iv)第二引物对:第二引物对可以扩增每个众多目标核酸分子的第二区域，以生成第二扩增物，其中在众多目标核酸分子中，第二区域并不是保守的。(V)检测装置用来检测第二扩增物。根据一个实施例子，该系统还包括以下一个或多个方面:与第一区域杂交的第一核酸探针；与第二区域杂交的第二核酸探针，其中可以将第二核酸探针固定在基板上，比如微阵列。第七方面:该系统还包括以下一个或多个方面:(i)第三引物对:第三引物对可以扩增每个众多靶核酸分子的第三区域，以生成第三扩增物。其中在第二众多靶核酸分子中，第三区域是保守的。(ii)从样品中纯化核酸的方法。第八方面，该系统是一试剂盒，用来检测样品中众多目标核酸分子的至少一个分子。第九方面，提供一试剂盒，用来检测众多靶核酸分子的至少一个分子。该试剂盒包括如下:(i)第一引物对:第一引物对可以扩增每个众多靶核酸分子的第一区域，以生成第一扩增物。其中，在众多目标核酸分子中，第一区域是保守的。(ii)与第一区域杂交的第一核酸探针。(iii)第二引物对:第二引物对可以扩增每个众多靶核酸分子的第二区域，以生成第二扩增物。其中，在所述众多靶核酸分子中，第二区域是不保守的。(iv)与第二区域杂交的第二核酸探针。第十方面:该试剂盒还包括以下一个或多个方面:(i)微阵列；(ii)从样品中纯化核酸的方法。第^^一方面，该试剂盒还包括第三引物对，其中第三引物对可以扩增每个第二众多靶核酸分子的第三区域，以生成第三扩增物。在第二众多靶核酸分子中，第三区域是保守的。
附图若干意见的简要说明通过阅读以下详细说明连同附图，可以更好地理解本发明，其中:
图1为根据本发明的一方面对方法进行高级别的示意图示。图2为对以下细菌进行23S核糖体RNA (rRNA)序列比对。肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌、奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌显示TQR引物序列，箭头位于对齐序列的左上侧和右下侧；并且显示TQR探针序列，箭头位于对齐序列的右上侧。图3为相同五种细菌的16S rRNA序列比对，表示TDR引物序列，箭头位于对准序列的左上侧和右下侧；并且表示TDR探针，箭头通过对准序列而分布于对准序列之间变异所处的独特位置上。图4为六变体丙型肝炎病毒(HCV)的基因序列比对，用箭头来识别上游引物和下游引物以及潜在的qrt-PCR探针区域框。图5为六变体丙型·肝炎病毒(HCV)的基因序列比对，用箭头来识别上游引物和下游引物以及潜在的微阵列探针位置框。图6为本发明一个方面的qrt-PCR反应结果扩增曲线。图7A是一张表，根据本发明的一个方面来代表微阵列的组织。图7B表示微阵列分析的结果，采用图7A所组织的微阵列来进行分析，其中斑点表示杂交。
本发明的详细说明本发明的一个方面是方法和系统，以便将实时核酸扩增系统的定量能力和杂交系统的多标靶功能相结合。例如，本文所述为方法和系统，对样品中的目标核酸序列、物种或者菌株进行定量分析，样品包括两个或两个以上的基因、物种或菌株。即使那些核酸序列、物种或者菌株存在或远或近的关系，都可以进行定量分析。本文中所用到的术语“核酸”是指核苷酸链(即含有链接到可交换有机碱的糖的分子)。术语“核酸”还可以指寡核糖核苷酸和寡脱氧核苷酸、以及多核苷酸和其它含核酸的有机碱，包括但不限于腺嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘌呤、胞嘧啶和肌苷。核酸可以是单链或双链的、可以从天然来源获取或者通过合成方法获取。请参阅附图，其中相同的标号表示相同的部件。在图1中，根据本发明的一个实施例，可以看到定量识别样品中核酸方法的高级别图示表示。作为本方法的初始步骤，获得样品来进行分析。样品可以是上述方法中所用的任何样品。例如:可以获得的样品包含一个或多个核酸序列、物种或菌株等等。作为具体实施例，样品可以是从食物获得，从动物或人类获得，或从环境获得的任何样品，以及获得的任何其他样品，比如用于识别致病性或非致病性微生物的微生物样品。因此在本方法的许多用途中，本文所述的装置和系统用来识别致病性或非致病性微生物潜在复杂混合物中所发现的一种或多种微生物。例如，潜在性复杂混合物可能是人或动物的血液样本或血培养，可能包含众多类型以及来自不同领域、门、分类、目纲、科的致病性或非致病性微生物菌株，以及众多的属包括埃希氏杆菌细菌属、葡萄球菌属、假单胞菌属、肠球菌属、克雷博菌属、肠杆菌属、变形杆菌属、立克次体、李斯特菌、分支杆菌属、沙门菌属、芽孢杆菌属、梭状芽孢杆菌等等；还有病毒科比如腺病毒、小核糖核酸病毒、疱疹病毒、嗜肝DNA病毒、黄病毒科、逆转录病毒、正粘病毒科、副粘病毒、多瘤病毒、弹状病毒科、乳多空病毒、披膜病毒科等等。潜在的复杂混合物也可以是从任何其他微生物菌落获得的样品，包括土壤样品，空气样品，水样品和表面样品等。一旦获得样品，就可以从样品中提取出核酸来。在一个实施例中，样品中诸如细胞或组织样品等生物材料在样品制备过程中发生裂解。在另一个实施例中，可以从生物材料中提取。可以采用本发明的方法来采用本领域中已知的任何生物提取准则，包括但不限于化学、机械、电、声、热等。可以采用本领域中已知的任何核酸提取和纯化介质，来分离感兴
趣的核酸，包括QIAGEN ^3、InvitiOgen1^g、Promega 公司等供应商制造或销售
的核酸纯化商用试剂盒。 除了从样品中序列特异性或生物特异性提取核酸以外，还可以对该过程进行设计，以便从样品中获取所有或几乎全部的核酸。后者特别有用，例如在样品中潜在生物身份未知的情况则很适用。根据一个实施例，采用一种方法来获取核酸，从而在本文所述该过程的下一步操作中即时使用核酸。目标定量区域在本实施例中的第110步中，为各目标定位好一个第一独特区域。在目标中，这个第一区域为保守区域，并且可以被称作目标定量区域(TQR)。在一个实施例中，TQR被确定用于已知一组相关的微生物，比如各种细菌群体。在另外一个实例中，TQR被确定用于已知一组更密切相关的微生物，比如包括致病性和非致病性菌株的一组大肠杆菌菌株。图2中显示的是五种不同细菌基因部分的序列比对，以便识别目标之间的TQR:肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌。图2所显示的比对将编码23S核糖体RNA (rRNA)各生物体的DNA序列进行对齐。在许多微生物包含一份以上23SrRNA基因序列的同时，这些有机体内部序列往往保守性非常高。例如，肺炎克雷伯菌有8份23S rRNA、大肠杆菌有7份、奇异变形杆菌有7份、金黄色葡萄球菌有5份、粪肠球菌有4份。23SrRNA是大原核50S亚基的组成部分，通常情况下执行这个特定rRNA的核糖体肽酰转移酶活性。由于23S rRNA基因序列结构方面的这种或许其它功能性限制，该序列包含生物体之间高度保守的特定区域。由于图2显示了序列比对，在五个细菌中间23S rRNA区域保持了高度保守。在图1所示方法的第120步中，引物和荧光探针专用于TQR。由于图2所示的五种细菌具有高度保守的区域，该TQR在qrt-PCR步骤期间可以被扩增，对于所有五种细菌而言采用一组正向和反向引物(如图2所示，请参阅正向引物“UT1-23S-S For”和反向引物“UT1-23S-2reV”)。因此，相同的引物将扩增从所有五种描述细菌获取DNA的区域。在另一实施例中，可以用一组特殊的引物来扩增各目标的TQR，或者在一个或多个组内来扩增众多目标。还应当指出的是，除了 PCR扩增以外，可以采用该领域内已知扩增的其它方法和技术，对按照此文所述方法扩增的这些核酸序列或任何其它核酸序列进行扩增和分析。可以包括但不限于其它方法中基于扩增的核酸序列(NASBA)。Qrt-PCR的具体设计也是本发明的一方面。如图2所示，采用正向引物“UT1-23S-2for” (ATCGCTCAACGGATAAAAG)和反向引物“UT1-23S_2rev”(CCGAACTGTCTCACGAC)从五种细菌开始对TQR区域进行扩增。但是，qrt-PCR探针包含序列AGCCGACATCGAGTG，并且对图2所示“UT1-23S-2探针”所处位置进行退火处理。为方便TQR扩增和探针的结合，探针的融解温度或Tm最好要比正向和反向引物的Tm高6 8 °C。因此，虽然其它配置文件是可能的，但是引物、探针和扩增子都具有表I所述的特征。表I引物、探针和扩增子的特征
权利要求
1.一种用于检测样品中至少一个众多目标核酸分子的方法，该方法包括的步骤内容如下: 识别每个所述众多目标核酸分子的第一区域；其中，在所述众多目标核酸分子中，第一区域是保守的； 在所述样品中生成各目标核酸分子第一区域的第一扩增产物； 实时检测上述第一扩增产物的生成； 识别每个所述众多目标核酸分子的第二区域；其中，在所述众多目标核酸分子中，第二区域不是保守的； 在所述样品中生成各目标核酸分子第二区域的第二扩增产物； 检测所述第二扩增产物，以表明所述样品中存在各目标核酸分子。
2.权利要求1的方法，其中所述的第一扩增产物产生于存在能与所述第一区域杂交的第一核酸探针时。
3.权利要求2的方法，其中所述扩增产物的实时检测步骤包括检测所述第一核酸探针与所述第一区域的杂交情况。
4.权利要求1的方法，其中检测所述第一扩增产物的步骤还包括量化所述样品中目标核酸分子的步骤。
5.权利要求1的方法，其中检测所述第二扩增产物的步骤包括所述第二扩增产物与互补探针的杂交。
6.权利要求5的方法，其中将所述的互补探针固定在基板上。
7.权利要求6的方法，其中所述基板为微阵列。
8.权利要求1的方法还包括以下步骤: 识别第二众多目标核酸分子的第三区域；其中，在所述第二众多目标核酸分子中，第三区域是保守的； 在所述样品中生成每个所述第二众多目标核酸分子的第三区域的第三扩增产物； 实时检测所述第三扩增产物的生成。
9.权利要求8的方法，其中在同一反应中生成所述第一扩增产物和所述第三扩增产物。
10.权利要求4的方法还包括以下步骤: 通过分析所述样品中目标核酸分子的定量以及所述样品中是否检测各目标核酸分子，对所述样品中所述各众多目标核酸分子进行多标靶定量检测。
11.权利要求1的方法，其中在所述样品中存在一个或更多目标核酸分子，则表示在所述样品中存在病原体。
12.权利要求1的方法，其中该方法可以检测所述样品中至少两种病原体。
13.权利要求1的方法，其中在所述样品中存在一个或更多目标核酸分子，则表示在所述样品中存在特定核酸序列。
14.权利要求1的方法，还包括从所述样品中纯化核酸的步骤。
15.权利要求1的方法，其中识别每个所述众多目标核酸分子的第一区域的步骤包括如下: 对每个所述众多目标核酸分子的至少一个核酸序列片段进行序列比对；基于所述序列比对来识别所述第一区域； 设计第一引物和第二引物，将在扩增期间扩增所述第一区域； 设计一个探针，在所述区域扩增期间与所述第一区域杂交。
16.权利要求15的方法，其中对所述探针进行设计，使其熔解温度至少要比所述第一引物熔解温度和所述第二引物熔解温度高6°C。
17.权利要求1的方法，其中识别每个所述众多目标核酸分子的所述第二区域的步骤包括如下: 对每个所述众多目标核酸分子的至少一个核酸序列片段进行序列比对； 基于所述序列比对来识别所述第二区域； 设计第一引物和第二引物，在扩增期间扩增所述第二区域。
18.权利要求17的方法，还包括设计互补探针的步骤，即与每个所述众多目标核酸分子的第二区域杂交。
19.权利要求1的方法，其中同时生成所述第一扩增产物和所述第二扩增产物。
20.权利要求1的方法，其中先后生成所述第一扩增产物和所述第二扩增产物。
21.权利要求1的方法，其中通过聚合酶链反应(PCR)扩增来生成各扩增产物。
22.用来检测至少一个众多目标核酸分子的系统，系统包括如下: 包括至少一个所述众多目标核酸分子的一个样品； 第一引物对，所述第一引物对可以扩增每个所述众多核酸分子的第一区域，以生成第一扩增产物，其中在所述众多目标核酸分子中，第一区域是保守的； 实时核酸扩增仪器，其中所述仪器可用所述第一引物对来生成所述第一扩增物，并且还可以实时检测所述第一扩增物； 第二引物对，所述第二引物对可以扩增每个所述众多核酸分子的第二区域，以生成第二扩增产物，其中在所述众多目标核酸分子中，第二区域不是保守的； 用来检测所述第二扩增物的装置。
23.权利要求22的系统，还包括与所述第一区域杂交的第一核酸探针。
24.权利要求22的系统，还包括与所述第二区域杂交的第二核酸探针。
25.权利要求24的系统，其中将所述第二核酸探针固定在基板上。
26.权利要求25的系统:其中所述基板为微阵列。
27.权利要求22的系统，还包括以下方面: 第三引物对，所述第三引物对可以扩增每个所述众多核酸分子的第三区域，以生成第三扩增产物，其中在所述第二众多目标核酸分子中，第三区域是保守的。
28.权利要求22的系统，其中检测所述第二扩增产物则表示在所述样品中存在病原体。
29.权利要求22的系统，其中该系统可以检测所述样品中至少两种病原体。
30.权利要求22的系统，其中检测所述第二扩增产物则表示在所述样品中存在特定核酸序列。
31.权利要求22的系统，还包括从所述样品中纯化核酸的方法。
32.权利要求23的系统，其中所述第一核酸探针的熔解温度至少要比所述第一引物对各引物的熔解温度高6°C。
33.权利要求22的系统，其中所述系统是一个试剂盒，用来检测样品中至少一个众多目标核酸分子。
34.权利要求22的系统，其中所述实时核酸扩增仪为聚合酶链反应(PCR)仪。
35.用来检测至少一个众多目标核酸分子的试剂盒，该试剂盒包括如下: 第一引物对，所述第一引物对可以扩增每个所述众多核酸分子的第一区域，以生成第一扩增产物，其中在所述众多目标核酸分子中，第一区域是保守的； 与所述第一区域杂交的第一核酸探针； 第二引物对，所述第二引物对可以扩增每个所述众多核酸分子的第二区域，以生成第二扩增产物，其中在所述众多目标核酸分子中，第二区域不是保守的； 与所述第二区域杂交的第二核酸探针。
36.权利要求35的试剂盒，还包括微阵列。
37.权利要求35的试剂盒，还包括第三引物对，所述第三引物对可以扩增每个所述众多核酸分子的第三区域，以生成第三扩增产物，其中在所述第二众多目标核酸分子中，第三区域是保守的。
38.权利要求35的试剂盒，还包括从所述样品中纯化核酸的方法。
39.权利要求35的试剂盒，其中所述第一核酸探针的熔解温度至少要比所述第一引物对各引物的熔解温度高6°C。
全文摘要
采用实时核酸扩增系统的定量能力和杂交系统的多标靶功能来检测目标核酸的方法和系统，包括如下识别各个目标核酸序列中保守序列和独特序列；同时扩增保守区域和独特区域；实时监测保守区域的扩增情况；通过多标靶识别来识别独特区域；通过将实时监控信息与目标核酸多标靶识别相结合来进行多标靶定量分析。
文档编号C12Q1/68GK103249844SQ201180058629
公开日2013年8月14日 申请日期2011年10月14日 优先权日2010年10月14日
发明者格温多琳·斯碧茨, 周朋 申请人:瑞昂尼克公司
目标核酸多标朝定量鉴定
相关申请的交叉参考本申请要求美国临时专利申请编号为61/393.253的优先权，题为“多标靶定量”，于2010年10月14日提交，所有内容纳入本参考中。
背景技术：
1.发明适用领域本发明涉及分子检测，更具体地来说，是关于一个或众多目标分子多标靶定量检测的方法和系统。
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背景技术：
生化分析一般用于研究、临床、环境和工业设置，以检测和量化某些基因序列、抗原、疾病或病原体。生化分析通常用来识别生物体，比如宿主生物体或样品中的寄生虫、真菌、细菌或病毒。在特定条件下，生化分析可以提供定量检测，其可以用来计算感染或疾病的程度，并且监测疾病随着时间的推移而产生的状态。一般情况下，生化分析通常检测从研究、临床、环境或工业来源样品中所提取的抗原(采用免疫测定法)或核酸(基于核酸或分子的生化分析)。对生化分析而言，定量识别横跨国土安全、食品安全以及医疗诊断等众多学科的多种病原体需求是不断增长的。虽然现有技术可以进行多种定量分析，但是这些技术无法对多种病原体提供足够的定量识别。例如，微阵列提供满意的DNA多靶标鉴定，但是很少或根本没有提供量化信息。另一方面，实时PCR提供高品质的量化信息，但是多靶标鉴定则有限。实时聚合酶链反应(PCR)，在 其它应用中也被称作定量实时聚合酶链反应(qrt-PCR)，它是一个分子生物学工具，采用众所周知的PCR工艺来同时扩增目标DNA分子，同时量化目标DNA ;与另一个输入相比，可以作为一个绝对量或者一个相对量。采用标准的PCR，可以在反应完成后对产品进行检测。与此相反，为进行定量实时聚合酶链反应，用户采用大致相同的方式来放大目标DNA分子，但是在聚合酶链反应进展的同时来检测目标DNA分子。用来实时检测qrt-PCR产品的一些最常用方法，就是利用结合到双链DNA产品中的非特异性荧光染料；或者使用标有荧光报告基团的特定序列探针，只有当探针与目标序列产生交叉时，荧光报告基团才会发出荧光。如果采用这些方法，则需要提供附加设备比如荧光检测器。特定序列探针法要求使用的探针具有核苷酸碱基序列，它与目标序列基本上互补，或者与其扩增物交替互补。在选择性生化分析条件下，为了检测样品中目标序列是否存在，探针被用来杂交目标序列或其扩增物。有效的探针可以防止与任何核酸序列进行非特异性杂交，这些核酸序列会干扰检测是否存在目标序列。探针或扩增物可包括标记物，能够检测标记所在位置，比如放射性标记、荧光染料、生物素、酶、电化学或化学发光化合物等。为量化qrt-PCR产品，将所检测到的荧光强度绘制在对应于PCR循环数的对数刻度图上。可以通过比较试验结果和采用已知量产品获得标准结果来决定待反应中的目标量。然而,这只是可以量化qrt-PCR产品的方式之一。
定量实时PCR应用很多，特别是在分子生物学方面更是如此。qrt-PCR的一个特别用处在于获取样品中有关病原体的定量信息。为了定量分析，实时测量荧光强度，或者实时测量扩增反应期间扩增物浓度增加的另外一个参数都是必要的。为区分众多靶标，必须为每个靶标设计带有特定探针的特殊引物。或者在一个要求不高的情况下，只需要设计引物以及将诸如SYBR绿色荧光报告物应用于该反应，以监测扩增物的浓度在增加。例如，如果有10个潜在靶标，那么通常情况下需要10个不同的探针。当前最先进的探测器/探针组合允许多靶标同时检测最多4或5个目标。但是，大多数实时PCR系统只配备两个探测器，用于多靶标检测。使用该系统，对于区分6个丙型肝炎C病毒(HCV)基因而言则需要进行6次单独的PCR反应。DNA微阵列是一种工具，通过样品中目标核酸与微阵列上互补的DNA序列相杂交，以检测样品中是否存在目标核酸序列。微阵列本身含有多达数千个的DNA斑点-被称作探针(或报告物)_其连接到表面上(例如微阵列自身表面或者次表面，比如小珠)。通常在显微镜玻片或其他相对较小的表面上形成微阵列，可以通过微阵列读取器来轻松读取。DNA探针的读取范围可以从很短或很长的DNA片断，并且常常包括一个短的寡核苷酸、基因、基因段、或非编码DNA片段，其中包括许多其它类型的序列。要使用微阵列，就需要获取、纯化、扩增、以及标记感兴趣的核酸，通常情况下要么采用荧光方式，要么采用放射性标记。而后在DNA斑点上洗涤标记过的核酸，并且如果感兴趣的核酸实际上存在，其会与微阵列上的互补探针相杂交。未绑定或非特异性绑定的核酸被冲走，只留下绑定目标。做过标记的绑定目标从而在各绑定的DNA斑点处产生了一个信号，微阵列读取器可以检测到荧光信号，同时根据微阵列上的已知位置来确定探针和目标的身份。DNA微阵列技术的优点之一就是该阵列的多靶标能力。因为单一阵列最多可能包括数千个的不同探针，单一微阵列试验可以同时执行数以千计的基因检测。微阵列通常用于以下方面:(i)分析基因表达；(ii)识别生物体；(iii)检测单核苷酸多态性(简写为SNP) ;(iv)对密切相关的生物之 间进行基因组比较，其中包括许多其它广为人知的用处。因此，微阵列技术常用于DNA的多靶标识别。然而，微阵列提供与被识别DNA有关的非常少或者不准确的定量信息。因此，在该技术领域中需要继续改进方法和系统，以便定量与多靶标检测相结合。
本发明小结因此，本发明的一个主要目的和优点就是向一个或众多目标定量检测提供一种方法。本发明的另一个目的和优点就是将定量与一个或众多目标多标靶检测相结合。本发明还有一个目的和优点就是将实时核酸扩增系统的定量能力与杂交系统的多标靶功能相结合。本发明的其它目的和优点部分是显而易见的，部分将在下文介绍。根据上述目的和优点，本发明为样品中至少一个目标核酸分子提供检测方法。该方法包括以下步骤:(i)识别每个众多目标核酸分子的第一区域，即在众多目标核酸分子中，该第一区域是保守的；(ii)在样品中生成各目标核酸分子第一区域的第一扩增物；(iii)在扩增期间实时检测第一扩增物的生成；(iv)识别每个众多目标核酸分子的第二区域，即在众多目标核酸分子中，第二区域并不是保守的；(V)在样品中生成各目标核酸分子第二区域的第二扩增物；(V)检测第二扩增物，以表示样品中是否存在各目标核酸分子。从另外一方面来说，第一扩增产物产生于存在能与第一区域杂交的第一核酸探针时，并且扩增产物的实时检测步骤包括检测第一核酸探针与第一区域的杂交情况。从另外一方面来说，检测第二扩增物的步骤包括将第二扩增产物与互补探针杂交，此处将探针固定在基片上，比如DNA微阵列。该方法还可以包括以下步骤:(i)识别第二众多目标核酸分子的第三区域，即在第二众多目标核酸分子中，第三区域是保守的。(ii)通过扩增样品中每个第二众多目标核酸分子的第三区域来生成第三扩增物。(iii)实时检测第三扩增物的生成。在同一反应中可以生成第一扩增物和上述第三扩增物。第二方面就是上述方法，还包括通过分析样品中目标核酸分子的定量以及样品中是否检测各目标核酸分子来进行样品中各众多目标核酸分子的多标靶定量检测步骤。第三方面，样品中存在一个或更多目标核酸分子表不该样品中存在病原体。该方法可以用来检测、定量或者识别至少两个目标，比如样品中的病原体、基因、单核苷酸多态性、特定核酸序列等。第四方面，识别每个众多目标核酸分子的第一区域的步骤包括如下:(i)对每个众多目标核酸分子的至少一个核酸序列片段进行序列比对；(ii)在序列比对基础上识别第一区域；(iii)设计第一引物和第二引物，其将在PCR扩增期间扩增第一区域；(iv)设计一个探针，在第 一区域PCR扩增期间用来与该区域杂交。该探针的熔解温度至少要比第一弓I物的熔解温度和第二弓I物的熔解温度高6 V。第五方面，识别每个众多目标核酸分子的第二区域的步骤包括如下:(i)对每个众多目标核酸分子的核酸序列至少一个片段进行序列比对；(ii)基于序列比对来识别第二区域；(iii)设计第一引物和第二引物，在PCR扩增期间将扩增第二区域。该方法还包括设计互补探针的步骤，即与每个众多目标核酸分子的第二区域进行杂交。第六方面，提供一个系统，用来检测众多目标核酸分子的至少一个分子。该系统包括如下:(i)包括众多靶核酸分子至少一个分子的样品；(ii)第一引物对:第一引物对可以扩增每个众多目标核酸分子的第一区域，以生成第一扩增物。其中，众多目标核酸分子中，第一区域是保守的。(iii)实时聚合酶链反应(PCR)仪器，其中，PCR仪器可以用第一引物对来生成第一扩增物，并且还可以实时检测第一扩增物。(iv)第二引物对:第二引物对可以扩增每个众多目标核酸分子的第二区域，以生成第二扩增物，其中在众多目标核酸分子中，第二区域并不是保守的。(V)检测装置用来检测第二扩增物。根据一个实施例子，该系统还包括以下一个或多个方面:与第一区域杂交的第一核酸探针；与第二区域杂交的第二核酸探针，其中可以将第二核酸探针固定在基板上，比如微阵列。第七方面:该系统还包括以下一个或多个方面:(i)第三引物对:第三引物对可以扩增每个众多靶核酸分子的第三区域，以生成第三扩增物。其中在第二众多靶核酸分子中，第三区域是保守的。(ii)从样品中纯化核酸的方法。第八方面，该系统是一试剂盒，用来检测样品中众多目标核酸分子的至少一个分子。第九方面，提供一试剂盒，用来检测众多靶核酸分子的至少一个分子。该试剂盒包括如下:(i)第一引物对:第一引物对可以扩增每个众多靶核酸分子的第一区域，以生成第一扩增物。其中，在众多目标核酸分子中，第一区域是保守的。(ii)与第一区域杂交的第一核酸探针。(iii)第二引物对:第二引物对可以扩增每个众多靶核酸分子的第二区域，以生成第二扩增物。其中，在所述众多靶核酸分子中，第二区域是不保守的。(iv)与第二区域杂交的第二核酸探针。第十方面:该试剂盒还包括以下一个或多个方面:(i)微阵列；(ii)从样品中纯化核酸的方法。第^^一方面，该试剂盒还包括第三引物对，其中第三引物对可以扩增每个第二众多靶核酸分子的第三区域，以生成第三扩增物。在第二众多靶核酸分子中，第三区域是保守的。
附图若干意见的简要说明通过阅读以下详细说明连同附图，可以更好地理解本发明，其中:
图1为根据本发明的一方面对方法进行高级别的示意图示。图2为对以下细菌进行23S核糖体RNA (rRNA)序列比对。肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌、奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌显示TQR引物序列，箭头位于对齐序列的左上侧和右下侧；并且显示TQR探针序列，箭头位于对齐序列的右上侧。图3为相同五种细菌的16S rRNA序列比对，表示TDR引物序列，箭头位于对准序列的左上侧和右下侧；并且表示TDR探针，箭头通过对准序列而分布于对准序列之间变异所处的独特位置上。图4为六变体丙型肝炎病毒(HCV)的基因序列比对，用箭头来识别上游引物和下游引物以及潜在的qrt-PCR探针区域框。图5为六变体丙型·肝炎病毒(HCV)的基因序列比对，用箭头来识别上游引物和下游引物以及潜在的微阵列探针位置框。图6为本发明一个方面的qrt-PCR反应结果扩增曲线。图7A是一张表，根据本发明的一个方面来代表微阵列的组织。图7B表示微阵列分析的结果，采用图7A所组织的微阵列来进行分析，其中斑点表示杂交。
本发明的详细说明本发明的一个方面是方法和系统，以便将实时核酸扩增系统的定量能力和杂交系统的多标靶功能相结合。例如，本文所述为方法和系统，对样品中的目标核酸序列、物种或者菌株进行定量分析，样品包括两个或两个以上的基因、物种或菌株。即使那些核酸序列、物种或者菌株存在或远或近的关系，都可以进行定量分析。本文中所用到的术语“核酸”是指核苷酸链(即含有链接到可交换有机碱的糖的分子)。术语“核酸”还可以指寡核糖核苷酸和寡脱氧核苷酸、以及多核苷酸和其它含核酸的有机碱，包括但不限于腺嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘌呤、胞嘧啶和肌苷。核酸可以是单链或双链的、可以从天然来源获取或者通过合成方法获取。请参阅附图，其中相同的标号表示相同的部件。在图1中，根据本发明的一个实施例，可以看到定量识别样品中核酸方法的高级别图示表示。作为本方法的初始步骤，获得样品来进行分析。样品可以是上述方法中所用的任何样品。例如:可以获得的样品包含一个或多个核酸序列、物种或菌株等等。作为具体实施例，样品可以是从食物获得，从动物或人类获得，或从环境获得的任何样品，以及获得的任何其他样品，比如用于识别致病性或非致病性微生物的微生物样品。因此在本方法的许多用途中，本文所述的装置和系统用来识别致病性或非致病性微生物潜在复杂混合物中所发现的一种或多种微生物。例如，潜在性复杂混合物可能是人或动物的血液样本或血培养，可能包含众多类型以及来自不同领域、门、分类、目纲、科的致病性或非致病性微生物菌株，以及众多的属包括埃希氏杆菌细菌属、葡萄球菌属、假单胞菌属、肠球菌属、克雷博菌属、肠杆菌属、变形杆菌属、立克次体、李斯特菌、分支杆菌属、沙门菌属、芽孢杆菌属、梭状芽孢杆菌等等；还有病毒科比如腺病毒、小核糖核酸病毒、疱疹病毒、嗜肝DNA病毒、黄病毒科、逆转录病毒、正粘病毒科、副粘病毒、多瘤病毒、弹状病毒科、乳多空病毒、披膜病毒科等等。潜在的复杂混合物也可以是从任何其他微生物菌落获得的样品，包括土壤样品，空气样品，水样品和表面样品等。一旦获得样品，就可以从样品中提取出核酸来。在一个实施例中，样品中诸如细胞或组织样品等生物材料在样品制备过程中发生裂解。在另一个实施例中，可以从生物材料中提取。可以采用本发明的方法来采用本领域中已知的任何生物提取准则，包括但不限于化学、机械、电、声、热等。可以采用本领域中已知的任何核酸提取和纯化介质，来分离感兴
趣的核酸，包括QIAGEN ^3、InvitiOgen1^g、Promega 公司等供应商制造或销售
的核酸纯化商用试剂盒。 除了从样品中序列特异性或生物特异性提取核酸以外，还可以对该过程进行设计，以便从样品中获取所有或几乎全部的核酸。后者特别有用，例如在样品中潜在生物身份未知的情况则很适用。根据一个实施例，采用一种方法来获取核酸，从而在本文所述该过程的下一步操作中即时使用核酸。目标定量区域在本实施例中的第110步中，为各目标定位好一个第一独特区域。在目标中，这个第一区域为保守区域，并且可以被称作目标定量区域(TQR)。在一个实施例中，TQR被确定用于已知一组相关的微生物，比如各种细菌群体。在另外一个实例中，TQR被确定用于已知一组更密切相关的微生物，比如包括致病性和非致病性菌株的一组大肠杆菌菌株。图2中显示的是五种不同细菌基因部分的序列比对，以便识别目标之间的TQR:肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌。图2所显示的比对将编码23S核糖体RNA (rRNA)各生物体的DNA序列进行对齐。在许多微生物包含一份以上23SrRNA基因序列的同时，这些有机体内部序列往往保守性非常高。例如，肺炎克雷伯菌有8份23S rRNA、大肠杆菌有7份、奇异变形杆菌有7份、金黄色葡萄球菌有5份、粪肠球菌有4份。23SrRNA是大原核50S亚基的组成部分，通常情况下执行这个特定rRNA的核糖体肽酰转移酶活性。由于23S rRNA基因序列结构方面的这种或许其它功能性限制，该序列包含生物体之间高度保守的特定区域。由于图2显示了序列比对，在五个细菌中间23S rRNA区域保持了高度保守。在图1所示方法的第120步中，引物和荧光探针专用于TQR。由于图2所示的五种细菌具有高度保守的区域，该TQR在qrt-PCR步骤期间可以被扩增，对于所有五种细菌而言采用一组正向和反向引物(如图2所示，请参阅正向引物“UT1-23S-S For”和反向引物“UT1-23S-2reV”)。因此，相同的引物将扩增从所有五种描述细菌获取DNA的区域。在另一实施例中，可以用一组特殊的引物来扩增各目标的TQR，或者在一个或多个组内来扩增众多目标。还应当指出的是，除了 PCR扩增以外，可以采用该领域内已知扩增的其它方法和技术，对按照此文所述方法扩增的这些核酸序列或任何其它核酸序列进行扩增和分析。可以包括但不限于其它方法中基于扩增的核酸序列(NASBA)。Qrt-PCR的具体设计也是本发明的一方面。如图2所示，采用正向引物“UT1-23S-2for” (ATCGCTCAACGGATAAAAG)和反向引物“UT1-23S_2rev”(CCGAACTGTCTCACGAC)从五种细菌开始对TQR区域进行扩增。但是，qrt-PCR探针包含序列AGCCGACATCGAGTG，并且对图2所示“UT1-23S-2探针”所处位置进行退火处理。为方便TQR扩增和探针的结合，探针的融解温度或Tm最好要比正向和反向引物的Tm高6 8 °C。因此，虽然其它配置文件是可能的，但是引物、探针和扩增子都具有表I所述的特征。表I引物、探针和扩增子的特征
权利要求
1.一种用于检测样品中至少一个众多目标核酸分子的方法，该方法包括的步骤内容如下: 识别每个所述众多目标核酸分子的第一区域；其中，在所述众多目标核酸分子中，第一区域是保守的； 在所述样品中生成各目标核酸分子第一区域的第一扩增产物； 实时检测上述第一扩增产物的生成； 识别每个所述众多目标核酸分子的第二区域；其中，在所述众多目标核酸分子中，第二区域不是保守的； 在所述样品中生成各目标核酸分子第二区域的第二扩增产物； 检测所述第二扩增产物，以表明所述样品中存在各目标核酸分子。
2.权利要求1的方法，其中所述的第一扩增产物产生于存在能与所述第一区域杂交的第一核酸探针时。
3.权利要求2的方法，其中所述扩增产物的实时检测步骤包括检测所述第一核酸探针与所述第一区域的杂交情况。
4.权利要求1的方法，其中检测所述第一扩增产物的步骤还包括量化所述样品中目标核酸分子的步骤。
5.权利要求1的方法，其中检测所述第二扩增产物的步骤包括所述第二扩增产物与互补探针的杂交。
6.权利要求5的方法，其中将所述的互补探针固定在基板上。
7.权利要求6的方法，其中所述基板为微阵列。
8.权利要求1的方法还包括以下步骤: 识别第二众多目标核酸分子的第三区域；其中，在所述第二众多目标核酸分子中，第三区域是保守的； 在所述样品中生成每个所述第二众多目标核酸分子的第三区域的第三扩增产物； 实时检测所述第三扩增产物的生成。
9.权利要求8的方法，其中在同一反应中生成所述第一扩增产物和所述第三扩增产物。
10.权利要求4的方法还包括以下步骤: 通过分析所述样品中目标核酸分子的定量以及所述样品中是否检测各目标核酸分子，对所述样品中所述各众多目标核酸分子进行多标靶定量检测。
11.权利要求1的方法，其中在所述样品中存在一个或更多目标核酸分子，则表示在所述样品中存在病原体。
12.权利要求1的方法，其中该方法可以检测所述样品中至少两种病原体。
13.权利要求1的方法，其中在所述样品中存在一个或更多目标核酸分子，则表示在所述样品中存在特定核酸序列。
14.权利要求1的方法，还包括从所述样品中纯化核酸的步骤。
15.权利要求1的方法，其中识别每个所述众多目标核酸分子的第一区域的步骤包括如下: 对每个所述众多目标核酸分子的至少一个核酸序列片段进行序列比对；基于所述序列比对来识别所述第一区域； 设计第一引物和第二引物，将在扩增期间扩增所述第一区域； 设计一个探针，在所述区域扩增期间与所述第一区域杂交。
16.权利要求15的方法，其中对所述探针进行设计，使其熔解温度至少要比所述第一引物熔解温度和所述第二引物熔解温度高6°C。
17.权利要求1的方法，其中识别每个所述众多目标核酸分子的所述第二区域的步骤包括如下: 对每个所述众多目标核酸分子的至少一个核酸序列片段进行序列比对； 基于所述序列比对来识别所述第二区域； 设计第一引物和第二引物，在扩增期间扩增所述第二区域。
18.权利要求17的方法，还包括设计互补探针的步骤，即与每个所述众多目标核酸分子的第二区域杂交。
19.权利要求1的方法，其中同时生成所述第一扩增产物和所述第二扩增产物。
20.权利要求1的方法，其中先后生成所述第一扩增产物和所述第二扩增产物。
21.权利要求1的方法，其中通过聚合酶链反应(PCR)扩增来生成各扩增产物。
22.用来检测至少一个众多目标核酸分子的系统，系统包括如下: 包括至少一个所述众多目标核酸分子的一个样品； 第一引物对，所述第一引物对可以扩增每个所述众多核酸分子的第一区域，以生成第一扩增产物，其中在所述众多目标核酸分子中，第一区域是保守的； 实时核酸扩增仪器，其中所述仪器可用所述第一引物对来生成所述第一扩增物，并且还可以实时检测所述第一扩增物； 第二引物对，所述第二引物对可以扩增每个所述众多核酸分子的第二区域，以生成第二扩增产物，其中在所述众多目标核酸分子中，第二区域不是保守的； 用来检测所述第二扩增物的装置。
23.权利要求22的系统，还包括与所述第一区域杂交的第一核酸探针。
24.权利要求22的系统，还包括与所述第二区域杂交的第二核酸探针。
25.权利要求24的系统，其中将所述第二核酸探针固定在基板上。
26.权利要求25的系统:其中所述基板为微阵列。
27.权利要求22的系统，还包括以下方面: 第三引物对，所述第三引物对可以扩增每个所述众多核酸分子的第三区域，以生成第三扩增产物，其中在所述第二众多目标核酸分子中，第三区域是保守的。
28.权利要求22的系统，其中检测所述第二扩增产物则表示在所述样品中存在病原体。
29.权利要求22的系统，其中该系统可以检测所述样品中至少两种病原体。
30.权利要求22的系统，其中检测所述第二扩增产物则表示在所述样品中存在特定核酸序列。
31.权利要求22的系统，还包括从所述样品中纯化核酸的方法。
32.权利要求23的系统，其中所述第一核酸探针的熔解温度至少要比所述第一引物对各引物的熔解温度高6°C。
33.权利要求22的系统，其中所述系统是一个试剂盒，用来检测样品中至少一个众多目标核酸分子。
34.权利要求22的系统，其中所述实时核酸扩增仪为聚合酶链反应(PCR)仪。
35.用来检测至少一个众多目标核酸分子的试剂盒，该试剂盒包括如下: 第一引物对，所述第一引物对可以扩增每个所述众多核酸分子的第一区域，以生成第一扩增产物，其中在所述众多目标核酸分子中，第一区域是保守的； 与所述第一区域杂交的第一核酸探针； 第二引物对，所述第二引物对可以扩增每个所述众多核酸分子的第二区域，以生成第二扩增产物，其中在所述众多目标核酸分子中，第二区域不是保守的； 与所述第二区域杂交的第二核酸探针。
36.权利要求35的试剂盒，还包括微阵列。
37.权利要求35的试剂盒，还包括第三引物对，所述第三引物对可以扩增每个所述众多核酸分子的第三区域，以生成第三扩增产物，其中在所述第二众多目标核酸分子中，第三区域是保守的。
38.权利要求35的试剂盒，还包括从所述样品中纯化核酸的方法。
39.权利要求35的试剂盒，其中所述第一核酸探针的熔解温度至少要比所述第一引物对各引物的熔解温度高6°C。
全文摘要
采用实时核酸扩增系统的定量能力和杂交系统的多标靶功能来检测目标核酸的方法和系统，包括如下识别各个目标核酸序列中保守序列和独特序列；同时扩增保守区域和独特区域；实时监测保守区域的扩增情况；通过多标靶识别来识别独特区域；通过将实时监控信息与目标核酸多标靶识别相结合来进行多标靶定量分析。
文档编号C12Q1/68GK103249844SQ201180058629
公开日2013年8月14日 申请日期2011年10月14日 优先权日2010年10月14日
发明者格温多琳·斯碧茨, 周朋 申请人:瑞昂尼克公司
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