抗phiX174噬菌体裂解蛋白E的单克隆抗体、产生该抗体的杂交瘤细胞株及其表位的制作方法
专利名称：抗phiX174噬菌体裂解蛋白E的单克隆抗体、产生该抗体的杂交瘤细胞株及其表位的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种phiX174噬菌体裂解蛋白E的单克隆抗体、产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株及与单克隆抗体特异性结合的裂解蛋白E的一个表位多肽。本发明属于生物技术领域。
背景技术：
菌蜕(bacterial ghost, BG)是一种具有佐剂性质且能携带外源物质的新型疫苗递送体系。其实质是菌体空壳，其胞浆及核酸等内容物在内外渗透压的作用下通过WiiX174 噬菌体的裂解蛋白E在细菌细胞壁上形成的损伤流出胞外，这也是菌蜕与常规疫苗相比的一个突出优势。首先，表面抗原结构没有被破坏，本身就具有的佐剂性质可以使其加强免疫反应。其次，菌蜕可以将特异性抗原成分有效地递呈给抗原递呈细胞，激活Thl型免疫应答。特别适合作为黏膜免疫的疫苗。另外，菌蜕又是完美的载体，可以接收大量的外源物质。重组蛋白可通过特定的膜锚定结构插入细胞膜，或填充于胞周间隙和细胞空腔中，以获得重组菌蜕多价苗和多联苗。而且由于菌蜕保留有菌毛、纤毛，具有生物亲和性，能够进行特异的细胞和组织定位，可用作核酸和药物的亲和性载体，在疾病的预防和治疗方面具有广阔前景。菌蜕生产简单，发酵后可用离心重悬的方法进行收集，并可以冻干的形式保存于室温，无需像蛋白疫苗那样复杂的纯化工作。理想的菌蜕不含胞浆、核酸等内容物，因此不存在毒力增强的问题，使用安全，对环境无污染。作为一种新型的疫苗及佐剂形式，菌蜕系统已经受到国内外研究者的广泛关注。 自phiX174的E基因被鉴定为裂解基因以来已有40多年，但其介导的溶菌机制研究进展缓慢，争论不断。由于E蛋白为大肠杆菌噬菌体蛋白，所制备的多克隆抗体与环境中大肠杆菌存在严重的交叉反应，导致长期以来始终缺乏有效工具用于E蛋白的研究。本发明能应用于E蛋白在细菌裂解过程中的表达定位研究，为寻找与确证E蛋白的互作蛋白提供有力手段，为从根本上阐明E蛋白的溶菌机制奠定基础。E蛋白介导的裂解与抗生素盘尼西林引起的裂解较为相似，其靶分子MraY也是衣霉素、胞质霉素A和脂赛霉素B的作用位点，所以， 鉴于E蛋白的独特性，制备其单抗进而阐明溶菌的分子机制对“蛋白抗生素”的开发利用亦具有重大意义。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种抗phiX174噬菌体裂解蛋白E的单克隆抗体。本发明的一种抗phiX174噬菌体裂解蛋白E的单克隆抗体，其特征在于所述单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No. 5430的杂交瘤细胞株分泌产生。其中，所述的单克隆抗体为IgG2b型，轻链属于κ型。其中，所述的单克隆抗体能够特异性结合phiX174噬菌体裂解蛋白E的B细胞抗原表位多肽，所述的表位多肽的氨基酸序列为VRLKPLNCSR。本发明的目的之二是提供一种产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本发明的一种杂交瘤细胞株，为小鼠的脾细胞与SP2/0细胞经过细胞融合产生的杂交瘤细胞株，命名为E-A5，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为CGMCC No. 5430，保藏日期为2011年11月16日。本发明的目的之三是提供一种与抗phiX174噬菌体裂解蛋白E的单克隆抗体特异性结合的E蛋白的一个表位多肽。本发明的一种phiX174噬菌体裂解蛋白E的B细胞抗原表位多肽，其特征在于所述的表位多肽与以上任一项所述的单克隆抗体特异性结合，所述的表位多肽(Epep)的氨基酸序列为VRLKPLNCSR。本发明还提供了编码所述的B细胞抗原表位多肽的核苷酸序列。在本发明的具体实施例中，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。进一步的，本发明还提供了所述的单克隆抗体在制备检测phiX174噬菌体裂解蛋白E的试剂中的应用。所述的检测，包括对phiX174噬菌体裂解蛋白E表达水平的检测，也可包括对phiX174噬菌体裂解蛋白E的定位检测。将所述单克隆抗体应用于E蛋白在细菌裂解过程中的定位研究，为寻找与确证E蛋白的互作蛋白提供了有力手段，也为揭示E蛋白的溶菌机制奠定了基础。更进一步的，本发明还提供了所述的杂交瘤细胞株在制备抗phiX174噬菌体裂解蛋白E的单克隆抗体中的应用。本发明还提供了所述的表位多肽在制备检测抗phiX174噬菌体裂解蛋白E的抗体的试剂中的应用。所述多肽Epep能竞争抑制单抗E-A5与E蛋白分子结合，也能用于E蛋白功能的研究。及所述的核苷酸序列在制备检测抗phiX174噬菌体裂解蛋白E的抗体的试剂中的应用。为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案本发明关键在于通过噬菌体随机十二肽库技术筛选到单克隆抗体所识别phiX174 噬菌体裂解蛋白E的特异性多肽，其多肽氨基酸序列为Ep印VRLKPLNCSR。本发明通过杂交瘤细胞技术筛选得到了一株能够稳定分泌所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其制备方法包括用His-ΔΕ融合蛋白免疫小鼠，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，用GST-E、GST-△ E融合蛋白筛选出能够稳定分泌所述单克隆抗体的杂交瘤细胞，从杂交瘤细胞上清液中或从注射杂交瘤细胞的动物腹水中，获得所述单克隆抗体。其中GST-E融合蛋白中，E蛋白的氨基酸序列及核苷酸序列如SEQID NO. 2所示，His-ΔΕ及 GST-ΔE融合蛋白中，ΔE蛋白的氨基酸序列及核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。本发明单克隆抗体特识别phiX174噬菌体裂解蛋白E特异性多肽的鉴定方法，利用噬菌体随机十二肽库鉴定所述单克隆抗体特异性结合phiX174噬菌体裂解蛋白E的表位多肽，通过三轮淘洗，进行滴度测定，选取阳性噬菌体克隆，进行测序分析，结果显示所述单克隆抗体对SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列的第160-189位核苷酸编码的多肽具有特异性， 其多肽是Ep印VRLKPLNCSR。所述融合蛋白由以下方法获得将含有phiX174噬菌体裂解基因E相关核苷酸序列的将pETj8a- Δ E、pGEX-6p- Δ E和pGEX_6p-E质粒载体转化大肠杆菌，IPTG诱导下获得包涵体，对包涵体进行纯化，得到所述的His- Δ Ε、GST- Δ E和GST-E融合蛋白，本发明所指的 IPTG (Isopropyl-β -D-thiogalactopyranoside，异丙基-β _D硫代半乳糖苷)可以诱导蛋白表达，能对乳糖操纵子产生极强的诱导效应，是强诱导物。具体的，所述单克隆抗体由如下方法制备得到(1)免疫原的准备将pETj8a-AE、pGEX_6p-AE和pGEX_6p-E重组载体转化 BL21 (DE3)大肠杆菌，在IPTG诱导下，分子量分别约14ku、34ku和36ku的His- Δ Ε,GST- Δ E 和GST-E均以包涵体形式存在。在本发明的一个优选实验方案中，以简便的方法对上述包涵体进行了纯化，并以纯化过的蛋白作为抗原免疫小鼠。(2)动物免疫用上述纯化过的His-ΔΕ融合蛋白免疫BALB/c小鼠，以期产生针对E蛋白的特异性单克隆抗体。每只小鼠以IOOyg的量进行背部皮下注射，每两周一次共三次，第四次加强免疫一次，3天后待融合，获得免疫小鼠。(3)杂交瘤细胞系的建立取免疫小鼠的脾脏细胞作为能够产生抗体的浆细胞， 与同系动物的骨髓瘤细胞(SP2/0)以聚乙二醇(PEG3500)介导进行融合。融合后细胞经HAT 培养基选择性培养，以GST-ΔΕ和GST-E为包被抗原，采用间接酶联免疫吸附试验(ELISA) 筛选阳性克隆。用有限稀释法对阳性孔的杂交瘤细胞进行克隆化培养直至克隆化细胞抗体阳性率为100%。将杂交瘤细胞经体外连续传代和反复冻存、复苏，直到细胞系能稳定分泌单克隆抗体。(4)单克隆抗体的制备与纯化将建系的杂交瘤细胞注射到经石蜡油预处理的小鼠腹腔，诱生腹水。诱生的腹水用亲和层析法获得纯化的单克隆抗体。本发明还涉及所述的单克隆抗体所针对phiX174噬菌体裂解蛋白E的特异性肽段的筛选。利用随机十二肽库的噬菌体展示技术，利用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)对单克隆抗体的表位进行3轮淘选，滴度测定，阳性噬菌体克隆测序和竞争抑制试验，证明 Epep :VRLKPLNCSR是针对所述的单克隆抗体的特异性肽段。本发明的有益效果主要体现在本发明提供了抗phiX174噬菌体裂解蛋白E单克隆抗体，以及产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并对其表位进行了鉴定，为进一步明确 phiX174噬菌体裂解蛋白E在菌影形成中的作用提供了基础，为菌影疫苗的深入研究奠定基础，对“蛋白抗生素”的开发利用亦具有重大意义。
图1为融合蛋白诱导表达的SDS-PAGE图； 1为诱导pGEX-6p-l裂解菌体对照；2为纯化GST对照；3为诱导pGEX_6p-E裂解菌体；4为纯化GST-E ；5为诱导pGEX-6p- Δ E裂解菌体；6为纯化GST- Δ E ;7为诱导pET_28a 裂解菌体对照；8为诱导pET48a- Δ E裂解菌体；9为纯化His- Δ E图2为抗phiX174噬菌体裂解蛋白E单抗E-A5纯化后SDS-PAGE ；图3为E-A5单克隆抗体亚型鉴定；图4为免疫印迹杂交检测E-A5单克隆抗体特异性的结果；1 为 GST- Δ E ;2 为 GST-E ；3 为 GST ；图5为噬菌体阳性克隆测序分析；
图6为合成肽Ep印与单抗结合的ELISA检测；图7为合成肽Ep印的竞争抑制试验。
具体实施例方式下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。实施例1 :E蛋白原核表达载体的构建以phiX174噬菌体基因组DNA (购自i^rmentas公司)为模板，采用PCR方法扩增出276bp的E基因(SEQ ID NO. 2所示)及201bp的Δ E片段(SEQ ID NO. 3所示)，经限制性内切酶酶(Bam H I和Sal I)切后，分别与pGEX_6P_l (购自Amersham公司)和pET_28a 载体(购自Merck公司)连接，转化到大肠杆菌BL21 (DE3)(购自Merck公司)中，并经酶切和PCR鉴定后获得重组质粒pGEX-6P-E、pGEX_6p-ΔE和pET48a-ΔΕ。实施例2融合蛋白的表达与纯化(1)重组蛋白的诱导挑取含有质粒的单克隆菌落，分别接种于5ml含有相应抗生素的LB培养基(pGEX-6P-E和pGEX-6p- ΔΕ为氨苄青霉素抗性；pET-28a- △ E为卡那霉素抗性)， 37°C 220rpm振荡过夜。次日，以1 100稀释到含有相应抗生素的500ml LB培养基中， 37°C培养至OD6tltl约为0. 6，加入IPTG使其浓度为lmM，37°C诱导4小时，离心收集沉淀。(2)尿素变形提取包涵体1)按％il/100ml菌液(该菌液体积为IPTG诱导时的菌液体积)比例用12mL重悬液QOmM Tis 150mM NaCl)将沉淀悬起；2)超声30分钟，每超声5秒，间隔15秒，振幅30 %，冰上操作；3) 4°C 12000 Xg 离心 20 分钟，收集沉淀用 12mL 洗涤液 QOmM Tris 150mMNaCl 2M 尿素0. 5% NP40)洗涤沉淀；4)重复步骤3)，收集沉淀用12ml 8M尿素溶解并超声至溶液清亮；5)40C 12000Xg离心20分钟，收集上清蛋白样品，_80°C冻存。(3) Hi S-Δ E融合蛋白纯化1)将 anl Ni-NTA HIS-Binding Resin (Novagen 公司)与 IOml 蛋白样品混合，4°C 振荡2小时使之充分混合；2)将上述混合液装入层析柱(Bio-RAD公司)；3)用5个柱体积缓冲液1平衡镍柱；4)用5个柱体积50mM咪唑洗涤液洗脱杂蛋白；5)用5个柱体积400mM咪唑洗脱液洗脱目的蛋白，收集流出液500 μ 1/管；6)用10个柱体积超纯水清洗层析柱；7)用20%乙醇过柱清洗，并于4°C保存。SDS-PAGE鉴定蛋白纯度，并用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。(4)GST- AE与GST-E融合蛋白纯化1)配制SDS-PAGE浓缩胶和分离胶，不插样品梳上样，按常规方法电泳；2)电泳结束后将胶放4mol/L NaAc溶液中在脱色摇床上摇1小时，目的蛋白可呈现一条白色的条带；3)将目的蛋白切割下来放在蒸馏水中在脱色摇床上摇20分钟脱去NaAc ；4)然后将切下来的胶放在密封的透析袋内(透析袋内也装满电泳液)；5)再将透析袋放在水平电泳槽内，在120V的电压下作用30分钟可使目的蛋白游离出来；6)将透析袋直接放入盛有PBS溶液的烧杯中，4°C透析过夜；7)用PEG20000将透析袋包埋，浓缩至合适体积，吸出蛋白液。SDS-PAGE鉴定蛋白纯度，并用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。实施例3抗血清的制备将纯化的His-ΔΕ融合蛋白与等体积的弗氏完全佐剂(购自Sigma公司)混合并乳化后，皮下多点免疫6-8周龄雌性BALB/c小鼠(购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心)，注射剂量为IOOyg/只；共免疫三次，后两次用等体积的弗氏不完全佐剂 (购自Sigma公司)，免疫剂量也为100 μ g/只。第三次免疫后7天，尾部静脉采血，分离血清作为阳性血清。以间接ELISA法测定效价，当达到10_4后准备融合。融合前三天用不加佐剂的蛋白腹腔注射进行加强免疫，剂量也为IOOyg/只。实施例4单克隆抗体的制备(1)饲养细胞铺板在融合前一天，取一只无免疫的BALB/c小鼠，脱颈处死，并将其完全浸泡于75% 的酒精中约5分钟。用剪刀小心剪开腹部皮肤，但不要剪开腹膜。酒精棉球对腹膜进行消毒，20ml的注射器吸取5ml HAT筛选培养基，小心推入小鼠腹腔，取饲养细胞，然后注入到培养皿中。再加入约36ml完全培养基混勻，用排枪加入四块96孔培养板中，100 μ 1/孔。 观察生长，防止污染。(2)免疫后的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合无菌条件下取出加强免疫的BALB/c小鼠脾脏，在基础培养液中洗掉结缔组织。再将脾脏移入另一盛有基础培养基中进行二次清洗，然后过100目钢丝网，将其捣碎，将悬液转入离心管中，IOOOXg离心10分钟，用基础培养液悬起脾细胞，进行计数。收集将生长状态良好并处于对数生长期的SP2/0细胞(购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所技术服务中心)，进行计数。按比例为1 10的脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合，IOOOXg离心7分钟，弃尽上清。轻轻震动离心管，使细胞轻微的悬浮起来，便于融合剂渗入细胞之间。将离心管放入37°C水中，缓慢加入Iml PEG3350，并边滴边摇晃离心管。静置1分钟，然后按Iml/ 分钟、3mL/分钟，6ml/分钟速度分步滴加培养基，最后再慢慢滴加到45ml，起到彻底终止作用。IOOOXg离心10分钟，吸尽上清，用37°C预热准备好的含有20%胎牛血清的HAT选择培养基，轻轻悬起沉淀细胞，并定容到40ml，然后转移到灭菌平皿中，按每孔100 μ 1的量加入96孔细胞培养板中，放入细胞培养箱进行培养。HT培养基的配制方法将100倍浓缩的HT液体(Iml)放入含有20%胎牛血清的 DMEM 99ml液体培养基中。HAT培养基的配制方法将100倍浓缩的HAT液体(Iml)放入含有20%胎牛血清的DMEM99ml液体培养基中。(3)杂交瘤细胞的筛选
用显微镜观察融合后细胞的生长情况，及时用固体NaOH颗粒清除污染的细胞。每 3天更换培养基一次，所用培养基根据换液时间而有所不同，在融合后的第3、6天用HAT培养基进行半换液，第9天改用HT培养基进行半换液，第12天用HT培养基进行全换液。当在15天时融合的细胞形成小集落，大约达到板底面积的1/4时，可取上清100 μ 1，利用间接 ELISA方法，对细胞分泌抗体的水平进行检测。用移液器小心吹打阳性孔，使细胞混勻悬浮。 然后取100 μ 1放入2ml的DMEM的基础培养液中，充分混勻，进行计数。取约100个细胞的混合液，放入IOml HT培养液中，并用100 μ 1的排枪吸到铺有饲养层细胞的96孔板中。经常观察细胞生长状态，培养液变黄进行换液。以GST-ΔΕ和GST-E为包被抗原(包被浓度 5 μ g/ml，每孔50 μ 1)，进行间接ELISA，测OD45tl值，筛选阳性单一杂交瘤细胞群。再用相同方法进行阳性杂交瘤细胞的克隆，直至所得到细胞株能稳定分泌单克隆抗体。最终获得一株杂交瘤细胞株，命名为Ε-Α5，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为=CGMCC No. Μ30，保藏日期为2011年11月16日。实施例5单克隆抗体的腹水的制备及纯化取8-10周龄的BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡0. 5ml/只，一周后接种生长状态良好的单克隆杂交瘤细胞E-A5，大约0. 5 X IO6个细胞，待一周左右小鼠腹部膨大，抽取腹水，3000 Xg离心10分钟，取上清，分装入1. 5ml离心管，_20°C备用。用饱和硫酸铵沉淀法将腹水进行初步提纯，之后用ftOteinA亲和层析法将其进一步纯化，单克隆抗体纯化后的 SDS-PAGE见图2。该图显示了单克隆抗体的轻链和重链聚合体，证明单抗的纯度很高。实施例6抗phiX174噬菌体裂解蛋白E单克隆抗体E_A5效价及亚型鉴定用间接ELISA方法，检测纯化后单抗E-A5的效价为10万以上，见表1。采用 Southern Biotech抗体亚类试剂盒对获得的单抗E-A5进行抗体亚类进行鉴定，结果单抗 E-A5重链为IgG^，轻链是κ链，见图3。表1为纯化后的E-A5单克隆抗体ELISA方法检测效价结果
权利要求
1.一种抗phiX174噬菌体裂解蛋白E的单克隆抗体，其特征在于所述单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No. 5430的杂交瘤细胞株分泌产生。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体为IgG2b型，轻链属于κ型。
3.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体特异性结合 phiX174噬菌体裂解蛋白E的B细胞抗原表位多肽，所述的表位多肽的氨基酸序列为 VRLKPLNCSR。
4.一种产生权利要求1-3任一项所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为E-A5，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为CGMCC No. M30。
5.一种phiX174噬菌体裂解蛋白E的B细胞抗原表位多肽，其特征在于所述的表位多肽与权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体特异性结合，所述的表位多肽的氨基酸序列为 VRLKPLNCSR。
6.编码权利要求5所述的B细胞抗原表位多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。
7.权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体在制备检测phiX174噬菌体裂解蛋白E的试剂中的应用。
8.权利要求4所述的杂交瘤细胞株在制备抗phiX174噬菌体裂解蛋白E的单克隆抗体中的应用。
9.权利要求5所述的表位多肽在制备检测抗phiX174噬菌体裂解蛋白E的抗体试剂中的应用。
10.权利要求6所述的核苷酸序列在制备检测抗phiX174噬菌体裂解蛋白E的抗体试剂中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种抗phiX174噬菌体裂解蛋白E的单克隆抗体和产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，以及与该单克隆抗体特异性结合的E蛋白的表位多肽。所述单克隆抗体是由命名为E-A5的杂交瘤细胞产生，并对SEQ ID No.1所示核苷酸序列的第160-189位核苷酸编码的多肽具有特异性，多肽为VRLKPLNCSR。本发明的有益效果主要体现在本发明提供了抗phiX174噬菌体裂解蛋白E单克隆抗体，以及产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并对其表位进行了鉴定，为进一步明确phiX174噬菌体裂解蛋白E在菌影形成中的作用提供了基础，为菌影疫苗的深入研究奠定基础，对“蛋白抗生素”的开发利用亦具有重大意义。
文档编号C12R1/91GK102558346SQ201210001050
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月4日 优先权日2012年1月4日
发明者于申业, 刘思国 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所
技术领域：
本发明涉及一种phiX174噬菌体裂解蛋白E的单克隆抗体、产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株及与单克隆抗体特异性结合的裂解蛋白E的一个表位多肽。本发明属于生物技术领域。
背景技术：
菌蜕(bacterial ghost, BG)是一种具有佐剂性质且能携带外源物质的新型疫苗递送体系。其实质是菌体空壳，其胞浆及核酸等内容物在内外渗透压的作用下通过WiiX174 噬菌体的裂解蛋白E在细菌细胞壁上形成的损伤流出胞外，这也是菌蜕与常规疫苗相比的一个突出优势。首先，表面抗原结构没有被破坏，本身就具有的佐剂性质可以使其加强免疫反应。其次，菌蜕可以将特异性抗原成分有效地递呈给抗原递呈细胞，激活Thl型免疫应答。特别适合作为黏膜免疫的疫苗。另外，菌蜕又是完美的载体，可以接收大量的外源物质。重组蛋白可通过特定的膜锚定结构插入细胞膜，或填充于胞周间隙和细胞空腔中，以获得重组菌蜕多价苗和多联苗。而且由于菌蜕保留有菌毛、纤毛，具有生物亲和性，能够进行特异的细胞和组织定位，可用作核酸和药物的亲和性载体，在疾病的预防和治疗方面具有广阔前景。菌蜕生产简单，发酵后可用离心重悬的方法进行收集，并可以冻干的形式保存于室温，无需像蛋白疫苗那样复杂的纯化工作。理想的菌蜕不含胞浆、核酸等内容物，因此不存在毒力增强的问题，使用安全，对环境无污染。作为一种新型的疫苗及佐剂形式，菌蜕系统已经受到国内外研究者的广泛关注。 自phiX174的E基因被鉴定为裂解基因以来已有40多年，但其介导的溶菌机制研究进展缓慢，争论不断。由于E蛋白为大肠杆菌噬菌体蛋白，所制备的多克隆抗体与环境中大肠杆菌存在严重的交叉反应，导致长期以来始终缺乏有效工具用于E蛋白的研究。本发明能应用于E蛋白在细菌裂解过程中的表达定位研究，为寻找与确证E蛋白的互作蛋白提供有力手段，为从根本上阐明E蛋白的溶菌机制奠定基础。E蛋白介导的裂解与抗生素盘尼西林引起的裂解较为相似，其靶分子MraY也是衣霉素、胞质霉素A和脂赛霉素B的作用位点，所以， 鉴于E蛋白的独特性，制备其单抗进而阐明溶菌的分子机制对“蛋白抗生素”的开发利用亦具有重大意义。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种抗phiX174噬菌体裂解蛋白E的单克隆抗体。本发明的一种抗phiX174噬菌体裂解蛋白E的单克隆抗体，其特征在于所述单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No. 5430的杂交瘤细胞株分泌产生。其中，所述的单克隆抗体为IgG2b型，轻链属于κ型。其中，所述的单克隆抗体能够特异性结合phiX174噬菌体裂解蛋白E的B细胞抗原表位多肽，所述的表位多肽的氨基酸序列为VRLKPLNCSR。本发明的目的之二是提供一种产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本发明的一种杂交瘤细胞株，为小鼠的脾细胞与SP2/0细胞经过细胞融合产生的杂交瘤细胞株，命名为E-A5，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为CGMCC No. 5430，保藏日期为2011年11月16日。本发明的目的之三是提供一种与抗phiX174噬菌体裂解蛋白E的单克隆抗体特异性结合的E蛋白的一个表位多肽。本发明的一种phiX174噬菌体裂解蛋白E的B细胞抗原表位多肽，其特征在于所述的表位多肽与以上任一项所述的单克隆抗体特异性结合，所述的表位多肽(Epep)的氨基酸序列为VRLKPLNCSR。本发明还提供了编码所述的B细胞抗原表位多肽的核苷酸序列。在本发明的具体实施例中，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。进一步的，本发明还提供了所述的单克隆抗体在制备检测phiX174噬菌体裂解蛋白E的试剂中的应用。所述的检测，包括对phiX174噬菌体裂解蛋白E表达水平的检测，也可包括对phiX174噬菌体裂解蛋白E的定位检测。将所述单克隆抗体应用于E蛋白在细菌裂解过程中的定位研究，为寻找与确证E蛋白的互作蛋白提供了有力手段，也为揭示E蛋白的溶菌机制奠定了基础。更进一步的，本发明还提供了所述的杂交瘤细胞株在制备抗phiX174噬菌体裂解蛋白E的单克隆抗体中的应用。本发明还提供了所述的表位多肽在制备检测抗phiX174噬菌体裂解蛋白E的抗体的试剂中的应用。所述多肽Epep能竞争抑制单抗E-A5与E蛋白分子结合，也能用于E蛋白功能的研究。及所述的核苷酸序列在制备检测抗phiX174噬菌体裂解蛋白E的抗体的试剂中的应用。为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案本发明关键在于通过噬菌体随机十二肽库技术筛选到单克隆抗体所识别phiX174 噬菌体裂解蛋白E的特异性多肽，其多肽氨基酸序列为Ep印VRLKPLNCSR。本发明通过杂交瘤细胞技术筛选得到了一株能够稳定分泌所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其制备方法包括用His-ΔΕ融合蛋白免疫小鼠，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，用GST-E、GST-△ E融合蛋白筛选出能够稳定分泌所述单克隆抗体的杂交瘤细胞，从杂交瘤细胞上清液中或从注射杂交瘤细胞的动物腹水中，获得所述单克隆抗体。其中GST-E融合蛋白中，E蛋白的氨基酸序列及核苷酸序列如SEQID NO. 2所示，His-ΔΕ及 GST-ΔE融合蛋白中，ΔE蛋白的氨基酸序列及核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。本发明单克隆抗体特识别phiX174噬菌体裂解蛋白E特异性多肽的鉴定方法，利用噬菌体随机十二肽库鉴定所述单克隆抗体特异性结合phiX174噬菌体裂解蛋白E的表位多肽，通过三轮淘洗，进行滴度测定，选取阳性噬菌体克隆，进行测序分析，结果显示所述单克隆抗体对SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列的第160-189位核苷酸编码的多肽具有特异性， 其多肽是Ep印VRLKPLNCSR。所述融合蛋白由以下方法获得将含有phiX174噬菌体裂解基因E相关核苷酸序列的将pETj8a- Δ E、pGEX-6p- Δ E和pGEX_6p-E质粒载体转化大肠杆菌，IPTG诱导下获得包涵体，对包涵体进行纯化，得到所述的His- Δ Ε、GST- Δ E和GST-E融合蛋白，本发明所指的 IPTG (Isopropyl-β -D-thiogalactopyranoside，异丙基-β _D硫代半乳糖苷)可以诱导蛋白表达，能对乳糖操纵子产生极强的诱导效应，是强诱导物。具体的，所述单克隆抗体由如下方法制备得到(1)免疫原的准备将pETj8a-AE、pGEX_6p-AE和pGEX_6p-E重组载体转化 BL21 (DE3)大肠杆菌，在IPTG诱导下，分子量分别约14ku、34ku和36ku的His- Δ Ε,GST- Δ E 和GST-E均以包涵体形式存在。在本发明的一个优选实验方案中，以简便的方法对上述包涵体进行了纯化，并以纯化过的蛋白作为抗原免疫小鼠。(2)动物免疫用上述纯化过的His-ΔΕ融合蛋白免疫BALB/c小鼠，以期产生针对E蛋白的特异性单克隆抗体。每只小鼠以IOOyg的量进行背部皮下注射，每两周一次共三次，第四次加强免疫一次，3天后待融合，获得免疫小鼠。(3)杂交瘤细胞系的建立取免疫小鼠的脾脏细胞作为能够产生抗体的浆细胞， 与同系动物的骨髓瘤细胞(SP2/0)以聚乙二醇(PEG3500)介导进行融合。融合后细胞经HAT 培养基选择性培养，以GST-ΔΕ和GST-E为包被抗原，采用间接酶联免疫吸附试验(ELISA) 筛选阳性克隆。用有限稀释法对阳性孔的杂交瘤细胞进行克隆化培养直至克隆化细胞抗体阳性率为100%。将杂交瘤细胞经体外连续传代和反复冻存、复苏，直到细胞系能稳定分泌单克隆抗体。(4)单克隆抗体的制备与纯化将建系的杂交瘤细胞注射到经石蜡油预处理的小鼠腹腔，诱生腹水。诱生的腹水用亲和层析法获得纯化的单克隆抗体。本发明还涉及所述的单克隆抗体所针对phiX174噬菌体裂解蛋白E的特异性肽段的筛选。利用随机十二肽库的噬菌体展示技术，利用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)对单克隆抗体的表位进行3轮淘选，滴度测定，阳性噬菌体克隆测序和竞争抑制试验，证明 Epep :VRLKPLNCSR是针对所述的单克隆抗体的特异性肽段。本发明的有益效果主要体现在本发明提供了抗phiX174噬菌体裂解蛋白E单克隆抗体，以及产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并对其表位进行了鉴定，为进一步明确 phiX174噬菌体裂解蛋白E在菌影形成中的作用提供了基础，为菌影疫苗的深入研究奠定基础，对“蛋白抗生素”的开发利用亦具有重大意义。
图1为融合蛋白诱导表达的SDS-PAGE图； 1为诱导pGEX-6p-l裂解菌体对照；2为纯化GST对照；3为诱导pGEX_6p-E裂解菌体；4为纯化GST-E ；5为诱导pGEX-6p- Δ E裂解菌体；6为纯化GST- Δ E ;7为诱导pET_28a 裂解菌体对照；8为诱导pET48a- Δ E裂解菌体；9为纯化His- Δ E图2为抗phiX174噬菌体裂解蛋白E单抗E-A5纯化后SDS-PAGE ；图3为E-A5单克隆抗体亚型鉴定；图4为免疫印迹杂交检测E-A5单克隆抗体特异性的结果；1 为 GST- Δ E ;2 为 GST-E ；3 为 GST ；图5为噬菌体阳性克隆测序分析；
图6为合成肽Ep印与单抗结合的ELISA检测；图7为合成肽Ep印的竞争抑制试验。
具体实施例方式下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。实施例1 :E蛋白原核表达载体的构建以phiX174噬菌体基因组DNA (购自i^rmentas公司)为模板，采用PCR方法扩增出276bp的E基因(SEQ ID NO. 2所示)及201bp的Δ E片段(SEQ ID NO. 3所示)，经限制性内切酶酶(Bam H I和Sal I)切后，分别与pGEX_6P_l (购自Amersham公司)和pET_28a 载体(购自Merck公司)连接，转化到大肠杆菌BL21 (DE3)(购自Merck公司)中，并经酶切和PCR鉴定后获得重组质粒pGEX-6P-E、pGEX_6p-ΔE和pET48a-ΔΕ。实施例2融合蛋白的表达与纯化(1)重组蛋白的诱导挑取含有质粒的单克隆菌落，分别接种于5ml含有相应抗生素的LB培养基(pGEX-6P-E和pGEX-6p- ΔΕ为氨苄青霉素抗性；pET-28a- △ E为卡那霉素抗性)， 37°C 220rpm振荡过夜。次日，以1 100稀释到含有相应抗生素的500ml LB培养基中， 37°C培养至OD6tltl约为0. 6，加入IPTG使其浓度为lmM，37°C诱导4小时，离心收集沉淀。(2)尿素变形提取包涵体1)按％il/100ml菌液(该菌液体积为IPTG诱导时的菌液体积)比例用12mL重悬液QOmM Tis 150mM NaCl)将沉淀悬起；2)超声30分钟，每超声5秒，间隔15秒，振幅30 %，冰上操作；3) 4°C 12000 Xg 离心 20 分钟，收集沉淀用 12mL 洗涤液 QOmM Tris 150mMNaCl 2M 尿素0. 5% NP40)洗涤沉淀；4)重复步骤3)，收集沉淀用12ml 8M尿素溶解并超声至溶液清亮；5)40C 12000Xg离心20分钟，收集上清蛋白样品，_80°C冻存。(3) Hi S-Δ E融合蛋白纯化1)将 anl Ni-NTA HIS-Binding Resin (Novagen 公司)与 IOml 蛋白样品混合，4°C 振荡2小时使之充分混合；2)将上述混合液装入层析柱(Bio-RAD公司)；3)用5个柱体积缓冲液1平衡镍柱；4)用5个柱体积50mM咪唑洗涤液洗脱杂蛋白；5)用5个柱体积400mM咪唑洗脱液洗脱目的蛋白，收集流出液500 μ 1/管；6)用10个柱体积超纯水清洗层析柱；7)用20%乙醇过柱清洗，并于4°C保存。SDS-PAGE鉴定蛋白纯度，并用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。(4)GST- AE与GST-E融合蛋白纯化1)配制SDS-PAGE浓缩胶和分离胶，不插样品梳上样，按常规方法电泳；2)电泳结束后将胶放4mol/L NaAc溶液中在脱色摇床上摇1小时，目的蛋白可呈现一条白色的条带；3)将目的蛋白切割下来放在蒸馏水中在脱色摇床上摇20分钟脱去NaAc ；4)然后将切下来的胶放在密封的透析袋内(透析袋内也装满电泳液)；5)再将透析袋放在水平电泳槽内，在120V的电压下作用30分钟可使目的蛋白游离出来；6)将透析袋直接放入盛有PBS溶液的烧杯中，4°C透析过夜；7)用PEG20000将透析袋包埋，浓缩至合适体积，吸出蛋白液。SDS-PAGE鉴定蛋白纯度，并用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。实施例3抗血清的制备将纯化的His-ΔΕ融合蛋白与等体积的弗氏完全佐剂(购自Sigma公司)混合并乳化后，皮下多点免疫6-8周龄雌性BALB/c小鼠(购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心)，注射剂量为IOOyg/只；共免疫三次，后两次用等体积的弗氏不完全佐剂 (购自Sigma公司)，免疫剂量也为100 μ g/只。第三次免疫后7天，尾部静脉采血，分离血清作为阳性血清。以间接ELISA法测定效价，当达到10_4后准备融合。融合前三天用不加佐剂的蛋白腹腔注射进行加强免疫，剂量也为IOOyg/只。实施例4单克隆抗体的制备(1)饲养细胞铺板在融合前一天，取一只无免疫的BALB/c小鼠，脱颈处死，并将其完全浸泡于75% 的酒精中约5分钟。用剪刀小心剪开腹部皮肤，但不要剪开腹膜。酒精棉球对腹膜进行消毒，20ml的注射器吸取5ml HAT筛选培养基，小心推入小鼠腹腔，取饲养细胞，然后注入到培养皿中。再加入约36ml完全培养基混勻，用排枪加入四块96孔培养板中，100 μ 1/孔。 观察生长，防止污染。(2)免疫后的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合无菌条件下取出加强免疫的BALB/c小鼠脾脏，在基础培养液中洗掉结缔组织。再将脾脏移入另一盛有基础培养基中进行二次清洗，然后过100目钢丝网，将其捣碎，将悬液转入离心管中，IOOOXg离心10分钟，用基础培养液悬起脾细胞，进行计数。收集将生长状态良好并处于对数生长期的SP2/0细胞(购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所技术服务中心)，进行计数。按比例为1 10的脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合，IOOOXg离心7分钟，弃尽上清。轻轻震动离心管，使细胞轻微的悬浮起来，便于融合剂渗入细胞之间。将离心管放入37°C水中，缓慢加入Iml PEG3350，并边滴边摇晃离心管。静置1分钟，然后按Iml/ 分钟、3mL/分钟，6ml/分钟速度分步滴加培养基，最后再慢慢滴加到45ml，起到彻底终止作用。IOOOXg离心10分钟，吸尽上清，用37°C预热准备好的含有20%胎牛血清的HAT选择培养基，轻轻悬起沉淀细胞，并定容到40ml，然后转移到灭菌平皿中，按每孔100 μ 1的量加入96孔细胞培养板中，放入细胞培养箱进行培养。HT培养基的配制方法将100倍浓缩的HT液体(Iml)放入含有20%胎牛血清的 DMEM 99ml液体培养基中。HAT培养基的配制方法将100倍浓缩的HAT液体(Iml)放入含有20%胎牛血清的DMEM99ml液体培养基中。(3)杂交瘤细胞的筛选
用显微镜观察融合后细胞的生长情况，及时用固体NaOH颗粒清除污染的细胞。每 3天更换培养基一次，所用培养基根据换液时间而有所不同，在融合后的第3、6天用HAT培养基进行半换液，第9天改用HT培养基进行半换液，第12天用HT培养基进行全换液。当在15天时融合的细胞形成小集落，大约达到板底面积的1/4时，可取上清100 μ 1，利用间接 ELISA方法，对细胞分泌抗体的水平进行检测。用移液器小心吹打阳性孔，使细胞混勻悬浮。 然后取100 μ 1放入2ml的DMEM的基础培养液中，充分混勻，进行计数。取约100个细胞的混合液，放入IOml HT培养液中，并用100 μ 1的排枪吸到铺有饲养层细胞的96孔板中。经常观察细胞生长状态，培养液变黄进行换液。以GST-ΔΕ和GST-E为包被抗原(包被浓度 5 μ g/ml，每孔50 μ 1)，进行间接ELISA，测OD45tl值，筛选阳性单一杂交瘤细胞群。再用相同方法进行阳性杂交瘤细胞的克隆，直至所得到细胞株能稳定分泌单克隆抗体。最终获得一株杂交瘤细胞株，命名为Ε-Α5，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为=CGMCC No. Μ30，保藏日期为2011年11月16日。实施例5单克隆抗体的腹水的制备及纯化取8-10周龄的BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡0. 5ml/只，一周后接种生长状态良好的单克隆杂交瘤细胞E-A5，大约0. 5 X IO6个细胞，待一周左右小鼠腹部膨大，抽取腹水，3000 Xg离心10分钟，取上清，分装入1. 5ml离心管，_20°C备用。用饱和硫酸铵沉淀法将腹水进行初步提纯，之后用ftOteinA亲和层析法将其进一步纯化，单克隆抗体纯化后的 SDS-PAGE见图2。该图显示了单克隆抗体的轻链和重链聚合体，证明单抗的纯度很高。实施例6抗phiX174噬菌体裂解蛋白E单克隆抗体E_A5效价及亚型鉴定用间接ELISA方法，检测纯化后单抗E-A5的效价为10万以上，见表1。采用 Southern Biotech抗体亚类试剂盒对获得的单抗E-A5进行抗体亚类进行鉴定，结果单抗 E-A5重链为IgG^，轻链是κ链，见图3。表1为纯化后的E-A5单克隆抗体ELISA方法检测效价结果
权利要求
1.一种抗phiX174噬菌体裂解蛋白E的单克隆抗体，其特征在于所述单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No. 5430的杂交瘤细胞株分泌产生。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体为IgG2b型，轻链属于κ型。
3.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体特异性结合 phiX174噬菌体裂解蛋白E的B细胞抗原表位多肽，所述的表位多肽的氨基酸序列为 VRLKPLNCSR。
4.一种产生权利要求1-3任一项所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为E-A5，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为CGMCC No. M30。
5.一种phiX174噬菌体裂解蛋白E的B细胞抗原表位多肽，其特征在于所述的表位多肽与权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体特异性结合，所述的表位多肽的氨基酸序列为 VRLKPLNCSR。
6.编码权利要求5所述的B细胞抗原表位多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。
7.权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体在制备检测phiX174噬菌体裂解蛋白E的试剂中的应用。
8.权利要求4所述的杂交瘤细胞株在制备抗phiX174噬菌体裂解蛋白E的单克隆抗体中的应用。
9.权利要求5所述的表位多肽在制备检测抗phiX174噬菌体裂解蛋白E的抗体试剂中的应用。
10.权利要求6所述的核苷酸序列在制备检测抗phiX174噬菌体裂解蛋白E的抗体试剂中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种抗phiX174噬菌体裂解蛋白E的单克隆抗体和产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，以及与该单克隆抗体特异性结合的E蛋白的表位多肽。所述单克隆抗体是由命名为E-A5的杂交瘤细胞产生，并对SEQ ID No.1所示核苷酸序列的第160-189位核苷酸编码的多肽具有特异性，多肽为VRLKPLNCSR。本发明的有益效果主要体现在本发明提供了抗phiX174噬菌体裂解蛋白E单克隆抗体，以及产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并对其表位进行了鉴定，为进一步明确phiX174噬菌体裂解蛋白E在菌影形成中的作用提供了基础，为菌影疫苗的深入研究奠定基础，对“蛋白抗生素”的开发利用亦具有重大意义。
文档编号C12R1/91GK102558346SQ201210001050
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月4日 优先权日2012年1月4日
发明者于申业, 刘思国 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所
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