环烯醚萜类化合物在制备抗卵巢癌药物中的应用的制作方法

专利名称：：环烯醚萜类化合物在制备抗卵巢癌药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及药物，具体涉及环烯醚萜类化合物在制备抗卵巢癌药物中的应用。
背景技术：
：卵巢癌是女性生殖器官常见的肿瘤之一。因卵巢癌致死者占各类妇科肿瘤的首位，对妇女生命造成严重威胁，其五年生存率仅25%30%。据流行病学资料统计，卵巢癌好发于卵巢功能不全的妇女，如月经初潮推迟、绝经期提前、痛经、独身、不育、人工流产频繁和有家族史的人群。由于卵巢位于盆腔深部，发病的早期可无或有较轻的症状。因卵巢癌临床早期无症状，鉴别其组织类型及良恶性相当困难，卵巢癌行剖腹探查术中发现肿瘤局限于卵巢的仅占30%，大多数已扩散到子宫双侧附件，大网膜及盆腔各器官，所以卵巢癌无论在诊断和治疗上确是一大难题。药物治疗是肿瘤患者主要治疗手段之一，常用的药物有顺钼、博来霉素、长春新碱、丝裂霉素、氟尿嘧啶、紫杉醇等，这些药物有效地延长了患者的生命或者提高了患者的生活质量。但是，抗肿瘤药物的副作用明显，限制了其疗效的发挥。当今医学对于肿瘤的防治依然处于初级阶段。中药有几千年的人体毒性实验基础，从天然产物中，寻找高效低毒的抗肿瘤活性的先导化合物，一直是新药研究的热点。蜘蛛香，又名马蹄香、老虎七、印度缬草，系败酱科缬草属植物。《本草纲目》记载“蜘蛛香出蜀西茂松藩山中。草根也，黑色有粗须，状如蜘蛛及藁本，气味芳香”。中国药典1977年版曾予以收载，贵州民间用其治疗心腹疼痛、风湿麻木及筋肉酸痛，并可镇静、顺气，消食，治发痧、止水泄，用菜油调敷治蜘蛛疮等。昆明等地区每年端午节前后，民间喜爱用蜘蛛香做烟熏剂，用于驱除害虫。化学成分研究表明，蜘蛛香含有挥发油、环烯醚萜以及黄酮类成分。药理研究结果表明，蜘蛛香水提液具有镇静催眠作用、抗菌及抗病毒作用，同时对犬、兔等有降血压作用。尽管对蜘蛛香的研究已经具有一定的规模，但对其化学成分等的研究仍然不够，尤其对其中环烯醚萜类成分研究不够透彻。本发明人对蜘蛛香进行了系统深入的化学成分研究，从中分离得到100多个环烯醚萜类成分，其中一些具有良好的细胞毒活性，已经申请中国专利，专利申请号200810207745.X(环烯醚萜类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用)。专利申请号=200810207746.4(母核共轭的环烯醚萜类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用)。本发明人又对环烯醚萜化合物进行了更深入的药理活性研究筛选研究，结果发现其中的化合物具有治疗卵巢癌的作用。
发明内容本发明所要解决的技术问题在于研究设计环烯醚萜化合物的新用途。本发明提供了环烯醚萜化合物在制备抗卵巢癌药物中的应用。本发明所述环烯醚萜化合物为异戊酸基二氢缬草素或缬草三酯J，它们的结构式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>氢缬草素为无色油状物，易溶于氯仿、丙酮、甲醇、乙醇中，分子量为540.26，分子式为C27H400llt缬草三酯J为无色油状物，分子量为576.23，分子式为C^I^OnCl,上述两个化合物的屮NMR和13CNMR数据分别见表1和表2.表1异戊酸基二氢缬草素和缬草三酯J的屯NMR数据<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2异戊酸基二氢缬草素和缬草三酯J的13CNMR数据<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>异戊酸基二氢缬草素和缬草三酯J可以从蜘蛛香或者败酱科缬草属等植物中分离得到，也可以通过化学合成的方式获得。本发明人通过异戊酸基二氢缬草素和缬草三酯J对卵巢癌细胞A2780(p53野生型)，0VCAR-3(p53突变型)和卵巢正常细胞I0SE144的毒性杀伤作用进行了比较。研究结果发现，异戊酸基二氢缬草素和缬草三酯J对卵巢癌细胞A2780，0VCAR-3细胞株具有较强的毒性杀伤作用，异戊酸基二氢缬草素的IC5(I分别为2.6和2.3yM,缬草三酯J的IC5Q分别为3.1和2.8yM；而对卵巢正常细胞I0SE144的毒性杀伤作用小于对卵巢癌癌细胞株的毒性杀伤作用，IC5(I分别为为n.gyMdl.eyM，是其对癌细胞的近7倍。上述结果说明异戊酸基二氢缬草素和缬草三酯J具有选择性的卵巢癌细胞毒性杀伤作用。从探讨异戊酸基二氢缬草素和缬草三酯J化合物对卵巢癌细胞株A2780，0VCAR_3以及正常卵巢细胞株I0SE144增殖的影响，结果表明异戊酸基二氢缬草素和缬草三酯J能显著地、选择性地抑制卵巢癌细胞的增殖，而相同条件下对卵巢正常细胞株的增殖没有显著的影响。经细胞周期分析结果表明，异戊酸基二氢缬草素和缬草三酯J能显著阻滞卵巢癌细胞A2780，0VCAR-3细胞于细胞分裂的G2/M期，而选择性地抑制卵巢癌细胞的增殖，导致癌细胞的死亡。因此，通过上述实验表明，本发明所述环烯醚萜化合物异戊酸基二氢缬草素和缬草三酯J，能作为活性成分用于制备抗卵巢癌药物。本发明为临床提供了新的治疗卵巢癌药物，给患者带来福音，有较大的应用价值。具体实施例方式下面的实施例可以使本专业技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例1异戊酸基二氢缬草素和缬草三酯J的制备干燥的蜘蛛香全草8.5Kg，粉碎后用95%乙醇渗漉提取4天，得到提取液100L。提取液减压浓缩成浸膏后将其混悬于水中，用乙酸乙酯萃取5次，每次3L，减压回收溶剂后乙酸乙酯部位420g，水相部位315g。乙酸乙酯部位进行正相硅胶(1500g)柱色谱分离，用石油醚-丙酮(1000-0100)进行梯度洗脱，洗脱液经薄层色谱检测，合并相似组成的洗脱液，回收溶剂得I-X10(洗脱液根据薄层检测斑点的不同分成10个洗脱部分)。取其中第4洗脱部分，上反相中压色谱仪，以20%-100%甲醇梯度洗脱，合并相似组成的洗脱液，回收溶剂得到8个流分。取其中第5个流分，经过2次上S^hadexLH-20凝胶柱色谱，以石油醚-氯仿-甲醇551洗脱，先后得到化合物缬草三酯J2.8g，异戊酸基二氢缬草素4.5g(以溥层色谱跟踪分离)。(此方法得到的化合物异戊酸基二氢缬草素，缬草三酯J用于实施例2-5的实验)异戊酸基二氢缬草素为无色油状物，易溶于氯仿、丙酮、甲醇、乙醇中，分子量为540.26，分子式为C27H4tlO11。缬草三酯J为无色油状物，分子量为576.23，分子式为C27H4tlO11CL两个化合物的1HNMR和13CNMR数据分别见表1和表2.表1异戊酸基二氢缬草素和缬草三酯J的1HNMR数据<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表2异戊酸基二氢缬草素和缬草三酯J的13CNMR数据<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>实施例2异戊酸基二氢缬草素和缬草三酯J对卵巢癌细胞的细胞毒作用异戊酸基二氢缬草素和缬草三酯J对卵巢癌细胞A2780(p53野生型)，0VCAR-3(p53突变型)和卵巢正常细胞I0SE144的毒性杀伤作用进行了比较。异戊酸基二氢缬草素和缬草三酯J实验药物处理时间为48h；药物分别浓度设置为0，1，5，10，50，100μM；药物溶解于DMSO(1000Χ)；药物处理时DMSO的含量低于0.1%0研究结果见表3。异戊酸基二氢缬草素和缬草三酯J卵巢正常细胞I0SE144的毒性杀伤作用小于对卵巢癌癌细胞株的毒性杀伤作用，说明异戊酸基二氢缬草素和缬草三酯J具有选择性的卵巢癌细胞毒性杀伤作用。表3异戊酸基二氢缬草素和缬草三酯对卵巢细胞的IC50值卵巢癌细胞卵巢正常细胞A2780OVCAR-3IOSElii异戊酸基二氢缬草素Γ6VL9缬草三酯3Λ~2^82Γ6实施例3异戊酸基二氢缬草素和缬草三酯J对卵巢癌细胞株A2780，0VCAR_3和正常卵巢细胞株I0SE144增殖的影响异戊酸基二氢缬草素和缬草三酯J对卵巢癌细胞具有选择性的毒性杀伤作用(相对正常卵巢细胞株)，研究探讨了这2个化合物对卵巢癌细胞株A2780，0VCAR-3以及正常卵巢细胞株I0SE144增殖的影响。实验时间梯度0，24，48，72小时；异戊酸基二氢缬草素和缬草三酯J实验药物分别浓度梯度设置:0，1,5,10，25，50，100μM；药物溶解于DMSO(1000Χ)；药物处理时DMSO的含量低于0.1%。实验方法ΜΤΤ实验；每24小时检测细胞活力。研究结果表明，异戊酸基二氢缬草素和缬草三酯J能显著抑制卵巢癌细胞株Α2780、0VCAR-3的增殖，在5μM的时候就能收到显著的抑制效果，而对正常卵巢细胞株I0SE144细胞株而言，在10μM和25μM的时候才出现比较明显的增殖抑制作用。因此，本实验说明异戊酸基二氢缬草素和缬草三酯J能显著地、选择性地抑制卵巢癌细胞的增殖，而相同条件下对卵巢正常细胞株的增殖没有显著的影响。实施例4异戊酸基二氢缬草素和缬草三酯J对卵巢癌细胞的细胞周期抑制作用研究异戊酸基二氢缬草素和缬草三酯J实验药物分别浓度梯度设置0，1，5μM；药物溶解于DMSO(1000Χ)；药物处理时DMSO的含量低于0.1%，处理12小时后分析细胞的周期；实验步骤细胞以不同浓度梯度处理12小时后，吸去细胞上清，胰酶消化后离心收集细胞，之后以70%的乙醇4°C固定过夜，加入50μg/mLPI溶液，15min后上流式细胞仪检测。细胞周期分析结果表明，异戊酸基二氢缬草素和缬草三酯J都能显著阻滞卵巢癌细胞A2780，0VCAR-3细胞于细胞分裂的G2/M期，该结果与这两个化合物能显著地、选择性地抑制卵巢癌细胞的增殖相一致，因此推测异戊酸基二氢缬草素和缬草三酯J可能通过显著阻滞卵巢癌细胞A2780，0VCAR-3于细胞分裂的G2/M期而选择性地抑制卵巢癌细胞的增殖，导致癌细胞的死亡。实施例5异戊酸基二氢缬草素促进卵巢癌细胞的凋亡的研究检测异戊酸基二氢缬草素能否促进卵巢癌细胞的凋亡。实验方法=ArmexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒；实验步骤，以不同药物浓度(设置为0，5，10，25μΜ)；药物溶解于DMSO(IOOOX)，药物处理时DMSO的含量低于0.1%；处理后，离心收集细胞和细胞上清，之后按试剂盒protocol加入一定量的BindingBuffer；然后加入一定量的AnnexinV-FITC和PI，15min之后上流式细胞仪检测。实验结果表明，异戊酸基二氢缬草素能显著促进卵巢癌细胞的凋亡，与0μM异戊酸基二氢缬草素的处理浓度(control)比较，5μM时异戊酸基二氢缬草素能导致A2780细胞近4倍的凋亡率增加，能导致0VCAR-3近8倍的凋亡率增加；而在10μM时能导致Α2780细胞近10倍的凋亡率增加，导致0VCAR-3近20倍的凋亡率增加。相比之下，0VCAR-3对异戊酸基二氢缬草素更为敏感。由此可见，异戊酸基二氢缬草素对卵巢癌细胞株的选择性毒性杀伤作用有可能是经由导致细胞凋亡实现的。权利要求环烯醚萜类化合物在制备抗卵巢癌药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述环烯醚萜化合物为异戊酸基二氢缬草素或缬草三酯J，它们的结构式分别如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>异戊酸基二氢缬草素为无色油状物，易溶于氯仿、丙酮、甲醇、乙醇中，分子量为540.26，分子式为C27H4。0n；缬草三酯J为无色油状物，分子量为576.23，分子式为C27H4(l0nCl；所述化合物异戊酸基二氢缬草素和缬草三酯J的^NMR数据为<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>所述化合物异戊酸基二氢缬草素和缬草三mIJ的13C<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>3.根据权利要求2的应用，其特征在于所述环烯醚萜化合物为异戊酸基二氢缬草素4.根据权利要求2的应用，其特征在于所述环烯醚萜化合物为缬草三酯J全文摘要本发明提供了环烯醚萜化合物在制备抗卵巢癌药物中的应用。所述环烯醚萜化合物为异戊酸基二氢缬草素或缬草三酯J，它们的结构式分别如下。通过异戊酸基二氢缬草素和缬草三酯J对卵巢癌细胞A2780(p53野生型)，OVCAR-3(p53突变型)和卵巢正常细胞IOSE144的毒性杀伤作用实验，结果说明它们具有选择性的卵巢癌细胞毒性杀伤作用，能抑制卵巢癌细胞的增殖，导致癌细胞的死亡。可以作为活性成分用于制备抗卵巢癌药物。本发明为临床提供新的治疗卵巢癌药物，给患者带来福音，有较大的应用价值。文档编号A61P35/00GK101829080SQ20101012658公开日2010年9月15日申请日期2010年3月17日优先权日2010年3月17日发明者单磊,张卫东,徐希科,李慧梁,林生,柳润辉,苏娟申请人:中国人民解放军第二军医大学