人参皂苷Rd在制备治疗结肠炎药物的新用途的制作方法

专利名称：：人参皂苷Rd在制备治疗结肠炎药物的新用途的制作方法
技术领域：
：本发明主要涉及一种人参皂苷Rd在制备治疗结肠炎药物的用途。尤其涉及人参皂苷Rd在制备治疗溃疡性结肠炎药物的用途。
背景技术：
：溃疡性结肠炎(UlcerativeColitis,UC)是一种病因及发病机制均不明确的慢性结肠炎症，腹痛、腹泻、黏液便和血便是其主要临床症状。UC急性暴发型病死率高，慢性持续型癌变率高、易反复发作，目前无特效药物，故被世界卫生组织列为现代难治病之一。本病在欧美国家发病率较高，患病率为0.4%。1%。，在国内未见精确的统计报告数据，但近年来呈明显增加的趋势。由于众多医疗和科研工作者对UC的关注，治疗UC的新药不断出现。目前，柳氮磺吡啶(SASP)作为临床上普遍应用的治疗溃疡性结肠炎的常用药，疗效较明显，并且它及其代谢产物5-氨基水杨酸(5-ASA)被发现具有较强的清除氧应激反应代谢产物的作用，但SASP可能在一些患者治疗过程中产生与剂量相关的厌食、恶心、皮疹及血液毒性(主要包括中性粒细胞减少、粒细胞缺乏症、溶血性贫血、血小板减少症、两种血细胞减少、各类血细胞减少或再生障碍性贫血)等不良反应，部分男性患者可能会出现精子活动能力下降而致不育症。上述不良反应使得SASP用药具有一定局限性。因此发现新的、副作用低的治疗溃疡性结肠炎的新药，仍是目前国内外新药研究的一个重点。三七(Panaxnotoginseng)属五加科人参属植物，其主要活性成分为达玛烷型四环三萜皂苷，与人参成分相似，入药部位多为根块。传统中医学理论证实三七具有强壮补虚和止血的作用，多用于治疗一些心血管疾病、炎症和各种身体疼痛、外伤及有外伤导致的体内体外出血症状。大量的植物化学和药理学研究证实达玛烷型四环三鹏皂苷为其主要的药理活性成分，其中人参皂苷Rd占总皂苷的4.07%，是其中主要具有显著药理活性成分的四种皂苷之一(Rgl、Rbl、Rl、Rd)。人参皂苷Rd是二醇型人参皂苷在人体肠道内的主要代谢产物之一，具有广泛的生物活性，对心脑血管、神经系统、免疫系统等作用独特，在镇痛、神经保护作用方面作用显著。人参皂苷Rd对脑缺血的保护作用的临床III期研究业已完成，正在申请新药生产批文。我们的前期工作还表明，Rd抑制有丝分裂原ConA诱导的人T细胞增殖、抑制迟发性超敏反应，抑制胶叉菜胶诱导的大鼠关节炎，有极强的抗炎作用(该项研究结果已由本发明人申请Rd治疗关节炎等的发明专利，专利初审通过，见《人参皂苷-Rd丙二醇水溶液制备及其抗炎、免疫抑制与抗器官移植排斥的新用途》，受理号200810208119.2)。但具有抗炎作用的药物(如乙酰水杨酸类)并不一定具有治疗溃疡性结肠炎的作用，而关于人参皂苷Rd治疗大鼠溃疡性结肠炎的研究国内外未见报道，尚需实验证实。人参皂苷-Rd，是从中药五加科植物三七中经多步分离而得的一种单体化合物，属原人参二醇型皂苷。它的中文化学名为20-(S)-原人参二醇-3-20-0-l3-D-吡喃葡萄糖苷，英文化学名为20(S)—Protopanaxadiol3_0_[P_D_glucopyranosyl(1—2)_P_D_glucopyranosyl]_20-O-P-glucopyranoside，化学结构如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>C48H820183H20;1001.20关于从三七药材中提取人参皂苷Rd的方法，首先提取粗总皂苷，然后通过大孔吸附树脂乙醇梯度洗脱分离去大多数其它组分，获得杂质较少的Rd组分，再经硅胶柱以"氯仿2甲醇2水"溶剂梯度洗脱，一次性得到纯度达93.16%的Rd单体。最终纯度可达95%以上。(中药材第29巻第3期2006年3月，《从三七药材中快速批量分离提取人参皂苷Rd的方法》刘德育，曾飒中山大学药学院，广东广州510080)
发明内容本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种人参皂苷Rd在制备治疗结肠炎药物的应用。本发明的目的通过试验说明人参皂苷Rd在制备治疗结肠炎药物的应用。所述的人参皂苷Rd在制备治疗溃疡性结肠炎药物的应用，是人参皂苷Rd在制备治疗溃疡性结肠炎药物的应用。所述的人参皂苷Rd在制备治疗结肠炎药物的应用，是人参皂苷Rd在制备治疗非细菌性慢性结肠炎药物的应用。所述的人参皂苷Rd在制备治疗结肠炎药物的应用，是人参皂苷Rd口服制剂在制备治疗溃疡性结肠炎药物的应用。所述的人参皂苷Rd在制备治疗结肠炎药物的应用，其特征是所述的口服制剂为为胶囊、微囊、脂质体、颗粒剂、片剂、口服液。所述的人参皂苷Rd在制备治疗结肠炎药物的应用，人参皂苷Rd为从三七中提取的人参皂苷Rd单体化合物，其中人参皂苷Rd单体为95%以上；还包括从五加科人参属植物人参、西洋参的根、茎、叶、花、果实中提取分离得到的人参皂苷Rd单体化合物。本发明的有益效果(1)通过实验首次证实了人参皂苷Rd对实验性结肠炎的治疗作用。(2)人参皂苷及其活性代谢物在大鼠口服给药后生物利用低、吸收少，但具有大量聚集在结肠部位的特点，结合其具有的强大的抗炎作用，充分展示了人参皂苷Rd对结肠炎的治疗作用，揭示了具有抗氧化作用的钙池操纵的钙离子通道阻滞剂对结肠炎的治疗价值，立意新奇。(3)采用形态与生化测定(MP0活性测定)相结合，定性、定量观察药物对溃疡性结肠炎愈合的影响，使对药物疗效的评价更为可靠。机理研究指标紧密结合结肠炎的已知有关病理生理机制和人参皂苷Rd抗氧化特性，如炎细胞浸润(MP0)、氧化损伤与抗氧化能力变化(SOD、GSH-Px)、脂质过氧化物(MDA)生成，深入、系统、全方位地揭示人参皂苷Rd抗氧化治疗与促进溃疡性结肠炎愈合的关系，进而阐明人参皂苷Rd在肠粘膜抗损伤及修复过程中的调节作用，思路独特，构思新颖。(4)目前UC的免疫学发病机制特别是细胞因子发病机制越来越受到人们的重视。而促炎性细胞因子与抑炎性细胞因子之间的平衡失调所致的免疫异常被视为UC的重要发病机制，本实验也证实了人参皂苷Rd能显著抑制促炎细胞因IL-113、TNF-a的生成，以及促进抗炎细胞因子IL-10的表达，从免疫学角度阐述了人参皂苷Rd治疗结肠炎与其能抑制结肠组织致炎因子的表达，促进抑炎因子生成及调节免疫平衡密切相关，其观点新颖。(5)最新研究资料表明，人参皂苷Rd是一种新型的电位非依赖型膜受体钙激活通道(ROCC)和f丐池操纵的f丐离子通道(SOC)阻滞剂，可以通过ROCC和SOC途径显著地抑制受体操纵性Ca"内流。现有的抗炎药如乙酰水杨酸类、糖皮质激素类与及抗UC药柳氮磺吡啶也均不具钙拮抗作用。用特异性的SOC阻滞剂来调节炎症反应必将为炎症的防治提供一个新的靶点，结合本课题研究结果，我们预测人参皂苷Rd这一新型的非电位依赖性钙离子通道阻滞剂可能会成为治疗溃疡性结肠炎及其它炎症的新型的治疗药物，为结肠炎这一被世界卫生组织列为现代难治疾病的治疗提供了一种新的思路。(6)通过系统、全面研究人参皂苷Rd对实验性结肠炎的治疗作用机理，全方位的揭示了人参皂苷Rd对结肠炎的治疗作用机理，为溃疡性结肠炎的药物治疗提供了新的论据及观点。具体实施例方式以下结合最佳实施例作进一步详述实施例1:人参皂苷Rd治疗大鼠急性溃疡性结肠炎的量效关系及作用机理1.材料与方法1.1药物和动物Wistar大白鼠，体重180200g，c^，购自兰州大学实验动物中心，动物合格证号医动字第SCXK(甘)2009-0004。人参皂苷Rd(纯度>95%，制备方法参照已公开专利《化合物(1)，其提取方法及包含所述化合物的药物组合物》，授权公告号CN1176101C):广东泰禾生物药业有限公司批号080312;柳氮磺吡啶上海信谊嘉华有限公司产品，批号081013。1.2主要试齐U2，4，6-三石肖基苯磺酸(2，4，6_Trinitrobenzenesulfonicacidsolution，TNBS)购于Sigma公司，5%(W/V)水溶液，货号P2297-10ML，批号20070315);无水乙醇(天津市博迪化工有限公司天津光复研究所，20080327分析纯)；冰醋酸(北京化工厂，批号000108，分析纯)；GSH-PX试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，批号20080416;髓过氧化物酶(MP0)、超氧化物歧化酶(SOD)、氧化型谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)及考马斯亮蓝试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，试剂批号20090730。1.3主要仪器TGL-16型低温高速离心机，上海安亭科学仪器厂制造；DY_2型电动玻璃匀浆机，宁波新芝生物科技股份有限公司制造；722S型紫外分光光度仪，上海精密科学仪器有限公司制造KA-1000型台式离心机上海安亭科学仪器厂制造。2方法2.1分组大鼠70只，按体重随机分为6组，分别为正常对照组(8只)、模型对照组(14只)、阳性对照组(12只)和人参皂苷Rd低剂量组(12只)、中剂量组(12只)、高剂量组(12只)。2.2急性溃疡性结肠炎模型的制备各组大鼠禁食不禁水48h，记录体重，腹腔注射(i.P)戊巴比妥钠40mg/kg麻醉。麻醉后，大鼠头部朝下、肛门朝上倒置，用灌胃针(16号)缓慢插入大鼠结肠部(深度为距肛门8cm处)，缓慢注入TNBS/50%乙醇溶液(0.4ml/100g大鼠体重，TNBS100mg/kg大鼠体重)。推注耗时约lmin(推注期间防止大鼠腹部被挤压)。致炎剂推注完毕后缓慢抽出灌胃针，用木夹夹住大鼠肛门，悬挂大鼠尾巴，使整个鼠身倾斜大约60。，保持约30min，取下夹子，把大鼠放归笼中，保持大鼠体位为头低臀高状态，待自然清醒。正常对照组大鼠分别缓慢注入等体积的生理盐水，其余操作同前。2.3给药致炎24h后，正常对照组、模型对照组用注射用水灌胃(lml/100g)，阳性对照组大鼠给予SASP(30mg/kg，lml/100g大鼠体重)溶液灌胃，Rd低、中、高剂量组大鼠分别按人参皂苷Rd20、40、80mg/kg，lml/100g灌胃。连续给药7d，每天给药1次。2.4结肠炎症的评价，标本的采集及处理2.4.1每日测体重，观察腹泻及粪便性状，精神活动，食量等。2.4.2大鼠在给药7d后，腹腔注射戊巴比妥钠30mg/kg麻醉，腹主动脉取血，取出肛门至结肠末端(回盲瓣水平，不含盲肠和阑尾)的整个结肠和直肠段，沿肠系膜缘剪开肠腔，用冷生理盐水冲净肠内容物，用滤纸拭干净后平铺于塑胶板上(肠粘膜面朝上)，按表1所列评分标准进行大体评分后称结肠湿重、量所取肠段长度。取一小块病变部位结肠组织，平铺于纸板上后用4%甲醛固定，石蜡包埋，HE染色，按表2所列评分标准(参考Dieleman等提出的评分标准，并稍作修改)进行组织学评分。再取部分病变部位结肠组织准确称重，用眼科剪剪碎，加入冷生理盐水，低温下制成10%组织匀浆，取部分未离心的匀浆组织用以测MPO，余下的以3000r/min离心10min，取上清液，-20°〇冰箱保存，待测MDA、SOD、GSH-PX等各项生化指标。取出的血液4t:放置2h后，以3000r/min离心10min，分离血清，-2(TC冰箱保存，待测生化指标。表1结肠大体与组织学损伤评分标准组织学评分标准CN101791316A大体评分标准0无损伤01充血水肿，但无溃疡12有溃疡但无明显的炎症23有溃疡，仅有一处出现炎症34有两处或以上溃疡和炎症，溃疡大小4<lcm5有两处或以上溃疡或炎症，至少一处溃5疡或炎症部位"cm_正常结肠组织炎症或溃疡病灶限于粘膜层炎症或溃疡病灶限于粘膜与粘膜下层炎症或溃疡病灶深入固有肌层透壁性炎症或溃疡病灶深入浆膜层透壁性炎症或大面积溃疡深入浆膜层并穿IL_2.4.3检测指标的测定1)组织中髓过氧化物酶(MPO)活力测定用分光光度法测定。该酶为髓性过氧化物酶，该酶具有使过氧化氢还原的能力，利用这一特点可以分析酶的活力，并定量测定中性白细胞的数目。取未离心的10%结肠组织匀浆901，按试剂盒说明书进行操作，通过供氢体邻连茴香胺供氢后生成黄色化合物，在460nm处通过比色测定吸光度，从而推算出MPO酶活力单位。组织中酶活力单位定义为每克组织湿片在37t:的反应体系中H202被分解lymol为一个酶活力单位。血清中MPO活力测定测定原理同上，取血清90iU，按试剂盒说明书进行操作，在460nm处通过比色测定吸光度，从而推算出MP0酶活力单位。血清中酶活力单位定义为每升血清在37。C的反应体系中H202被分解1mol为1个酶活力单位。2)Rd对UC大鼠结肠组织氧化损伤及抗氧化能力的影响组织中丙二醛(MDA)含量测定MDA为脂质过氧化物，用硫代巴比妥酸(TBA)比色法测定。过氧化脂质降解产物丙二醛可与硫代巴比妥酸縮合，形成红色产物，在532nm处有最大吸收峰。取10%结肠组织匀浆上清200测定，以每毫克组织蛋白纳摩尔数(nmol/mgprot)表不。组织中超氧化物岐化酶(SOD)活力测定用黄嘌呤_黄嘌呤氧化酶法检测。通过黄嘌呤_黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见分光光度计在550nm处测定其吸光度。当被测样品中含SOD时，则对超氧阴离子有转移性抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于对照管的吸光度值，通过公式计算可求出被测样品中的SOD活力。取1%结肠组织上清70按试剂盒说明书进行操作。组织匀浆中总SOD活力单位(U)定义为每毫克组织蛋白在1ml反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位。组织中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)含量测定GSH-Px可以促进过氧化氢(H202)与还原型GSH反应生成H202及氧化型谷胱甘肽(GSSG)，谷胱甘肽过氧化物酶的活力可用其酶促反应的速度来表示，测定此酶促反应中还原型谷胱甘肽的消耗，则可求出酶的活力。GSH-Px的活力以催化GSH的反应速度来表示，由于这两个底物在没有酶的条件下，也能进行氧化还原反应(称非酶促反应)，所以最后计算此酶活力时必须扣除非酶促反应所引起的GSH减少的部分。取10X结肠组织匀浆上清60ia，按试剂盒说明书操作。3)Rd对UC大鼠结肠组织中致炎细胞因子释放的影响组织中TNF-a测定采用双抗体夹心ELISA法检测。操作步骤1.标准品的稀释将标准品(360ng/L)分别稀释成240ng/L，160ng/L，80ng/L，740ng/L，20ng/L5个浓度。2.加样分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品空中先加样品稀释液40iU，然后再加待测样品10iU(样品最终稀释浓度为5倍)。加样时将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。3.温育用封板膜封板后置37t:温育30分钟。4.配液将30倍浓縮洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。5.洗涤小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。6.加酶每孔加入酶标试剂50ii1，空白孔除外。7.温育操作同3。8.洗涤操作同5。9.显色每孔先加入显色剂A50iil，再加入显色剂B50ia，轻轻震荡混匀，37t:避光显色15分钟。10.终止每孔加终止液50ii1，终止反应(此时蓝色立转黄色)。11.测定以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。组织中IL-113的测定采用双抗体夹心ELISA法检测。操作步骤1.标准品的稀释将标准品(45ng/L)分别稀释成30ng/L，20ng/L，10ng/L，5ng/L，2.5ng/L5个浓度。2.加样分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品空中先加样品稀释液40iU，然后再加待测样品10iU(样品最终稀释浓度为5倍)。加样时将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。3.温育用封板膜封板后置37t:温育30分钟。4.配液将30倍浓縮洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。5.洗涤小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。6.加酶每孔加入酶标试剂50ii1，空白孔除外。7.温育操作同3。8.洗涤操作同5。9.显色每孔先加入显色剂A50iil，再加入显色剂B50ia，轻轻震荡混匀，37t:避光显色15分钟。10.终止每孔加终止液50ii1，终止反应(此时蓝色立转黄色)。11.测定以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。3)Rd对UC大鼠结肠组织中抑炎细胞因子IL-10释放的影响采用双抗体夹心ELISA法检测。8操作步骤1.标准品的稀释将标准品(72ng/L)分别稀释成48ng/L，32ng/L，16ng/L，8ng/L，4ng/L5个浓度。2.加样分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品空中先加样品稀释液40iU，然后再加待测样品10iU(样品最终稀释浓度为5倍)。加样时将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。3.温育用封板膜封板后置37t:温育30分钟。4.配液将30倍浓縮洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。5.洗涤小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。6.加酶每孔加入酶标试剂50iU，空白孔除外。7.温育操作同3。8.洗涤操作同5。9.显色每孔先加入显色剂A50iil，再加入显色剂B50ia，轻轻震荡混匀，37t:避光显色15分钟。10.终止每孔加终止液50ii1，终止反应(此时蓝色立转黄色)。11.测定以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。2.5统计学处理参数检验用Student'st检验，均以均数±标准差(；±s)表示P<0.01，P<0.05为差异具有统计学意义，非参数检验用Mann-WhitneyU检验。3.结果3.1大鼠外观体征一般观察用TNBS-50%乙醇建立大鼠溃疡性结肠炎，动物于造模第2d出现稀便、消瘦、食欲减退、蜷縮、毛发不光泽、活动减少等。各给药组动物外观症状均轻于模型对照组。3.2人参皂苷Rd对大鼠体重变化的影响在实验期间，正常对照组体重呈增加趋势，平均增加18.4%;模型对照组体重先减后增，但增长缓慢，平均增加9.4%;SASP组、GSPE低、中、高剂量组体重先减后增，但增加速度较模型对照组快，分别平均增加14.7%、12.2%、13.8%和12.3%。对各组大鼠处死前体重作统计分析，结果显示，模型对照组大鼠体重明显低于正常对照组及各给药组，差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)，结果见表2表2人参皂苷Rd对UC大鼠体重变化的影响G士s，n=8_14)组别造模前体重(g)处死前体重(g)正常对照组172±10.86203±14.44模型对照组171±6.91187±5.78**阳性对照组172±9.76198±11.78#Rd低剂量组174±8.56195±8.67#Rd中剂量组174±11.94193±19.57#Rd高剂量组177±11.89196±14.88#模型对照组与正常对照组比较rp<0.01;给药组与模型对照组比较<0.05，##p<0.013.3人参皂苷Rd对大鼠结肠湿重变化的影响与正常对照组相比，各给药组大鼠结肠湿重指数都有所增加，其中模型对照组结肠湿重指数(结肠重量/结肠长度，mg/mm)增加最大，与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.01);各给药组与模型对照组比较结肠湿重指数降低，差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)，见表3。表3人参皂苷Rd对UC大鼠结肠湿重指数变化的影响G±s，n=8_14)组别重量(g)长度(mm)结肠湿重指数(mg/mm)正常对照组1.33±0.22109.94±10.0612.13±1.50模型对照组2.03±0.54109.25±10.7020.00±4.94**阳性对照组1.62±0.41103.55±10.0513.48±5.19##Rd低剂量组1.68±0.41105.56±12.515.29±2.29#Rd中剂量组1.678±0.24107.00±5.12315.72±2.36#Rd高剂量组1.59±0.37105.56±6.5713.95±1.75"模型对照组与正常对照组比较**p<0.01;各给药组与模型对照组比较#p<0.05，##p<0.013.4大体观察评分结果与正常对照组比较，模型对照组结肠组织损伤明显加重，差异有统计学意义(P<0.01)，与模型对照组比较，各给药组结肠组织损伤明显减轻，差异有统计学意义(P<0.01)。结果显示见表4。表4人参皂苷Rd治疗后UC大鼠结肠大体损伤评分结果(n=8_12)10评分/只数组别012345正常对照组8模型对照组"12423阳性对照组##72Rd低剂量组"2321Rd中剂量组^1Rd高剂量组"2513模型对照组与正常对照组比较,p<0.01;各给药组与模型对照组比较，p<0.013.5病理组织学评分结果光镜下观察，模型对照组结肠粘膜组织内可见大量炎性渗出物和组织坏死；人参皂苷Rd各剂量组溃疡面可见大量再生上皮组织和新生腺体；与正常对照组比较，模型对照组结肠组织损伤明显，差异有统计学意义(P〈0.01)，与模型对照组比较，各给药组大鼠结肠组织损伤程度减轻，差异有统计学意义(P<0.01)。结果见表5。表5人参皂苷Rd治疗后UC大鼠结肠组织学损伤评分结果(n=8_12)评分/只数组别012345正常对照组8模型对照组"121阳性对照组##72Rd低剂量组"63Rd中剂量组"41Rd高剂量组^46模型对照组与正常对照组比较,p<0.01;各给药组与模型对照组比较，p<0.013.6Rd对白细胞浸润程度的影响3.6.1Rd对大鼠血清中MPO活性的影响实验各组大鼠血清中MPO含量值见表6，由表可见与正常对照组比较，模型对照组MPO活力明显增加，差异具有统计学意义(P11<0.01);SASP给药组，Rd低、中、高各剂量中MPO与模型对照组比较活力明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。3.6.2Rd对大鼠结肠组织中MPO活性的影响实验各组大鼠结肠组织中MPO含量值见表6，由表可见与正常对照组比较，模型对照组MPO活力明显增加，差异具有统计学意义(P<0.01);SASP给药组，Rd低、中、高各剂量中MPO活力与模型对照组比较明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。表6人参皂苷Rd对TNBS诱导的UC大鼠结肠组织及血清中MPO活力的影响(；±s，n=8-12)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>模型对照组与正常对照组比较**p<0.01，*p<0.05;各给药组与模型对照组比<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>3.7Rd对UC大鼠结肠组织氧化损伤及抗氧化能力的影响3.7.lRd对大鼠结肠组织中MDA含量的影响实验各组大鼠结肠组织中MDA含量测定值见表7，由表可见与正常对照组比较，模型对照组MDA含量明显增加，差异具有统计学意义(P<0.01);与模型对照组比较，各给药组结肠组织中MDA含量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01)。3.7.2Rd对大鼠结肠组织GSH-PX活性的影响实验各组大鼠结肠组织中GSH-PX活性测定值见表7，由表可见与正常对照组比较，模型对照组GSH-PX活性明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01);SASP给药组，Rd低、中、高剂量中GSH-PX活性较模型对照组明显增加，差异具有统计学意义(P<0.01)。3.7.3Rd对大鼠结肠组织SOD活性的影响实验各组大鼠结肠组织中SOD活性测定值见表7，由表可见与正常对照组比较，模型对照组SOD活性明显降低差异具有统计学意义(P<0.05);SASP给药组，Rd低、中、高剂量中GSH-PX活性较模型对照组明显增加，差异具有统计学意义(P<0.01)。表7人参皂苷Rd对TNBS诱导的大鼠UC结肠组织MDA含量、GSH-Px与SOD活力的影响(；士s，n=8-12)组别结肠组织GSH-PX活力(U/mgprot)结肠组织MDA含量(nmol/mgprot)结肠组织SOD活力(U/mgprot)正常对照组80.74±31.021.06±0.48106.71±21.64模型对照组55.01±23.04**1.94±0.76**89.90±9.66*阳性对照组48.40±10.81##1.03±0.48##130.16±18.59##Rd低剂量组75.41±14.75##0.97±0.33##129.50±20.92##Rd中剂量组74.88士8.05##0.85±0.53##142.99±18.68##Rd高剂量组78.39±26.48##0.82±0.32##144.39±41.34##3.8Rd对UC大鼠结肠组织中致炎细胞因子表达水平的影响3.8.1Rd对大鼠结肠组织TNF-a表达水平的影响实验各组大鼠结肠组织中TNF-a表达水平测定值见表8，由表可见与正常对照组比较，模型对照组TNF-a表达水平显著增加(P<0.01);SASP给药组，Rd低剂量、中、高剂量中TNF-a表达水平较模型对照组明显降低(P<0.01)。3.8.2Rd对大鼠结肠组织IL-IP表达水平的影响实验各组大鼠结肠组织中IL-IP水平测定值见表8，由表可见与正常对照组比较，模型对照组IL-113表达水平明显增高，差异具有统计学意义(P<0.01);SASP给药组，Rd低、中、高剂量中IL-IP表达水平较模型对照组明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01)。3.9Rd对UC大鼠结肠组织中抑炎细胞因子IL-10水平的影响实验各组大鼠结肠组织中IL-10水平测定值见表8，由表可见与正常对照组比较，模型对照组IL-10表达水平显著降低(P<0.01);SASP给药组，Rd低剂量组与高剂量中IL-10表达水平较模型对照组明显增加(P<0.05)。Rd中剂量组IL-10表达水平值与模型对照组相比较有增加的趋势但差异不具有统计学意义。表8人参皂苷Rd对TNBS诱导的大鼠UC结肠组织IL_1P、TNF_a、IL-10表达水平的影响(；±s，n=6-12)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>模型对照组与正常对照组比较**p<0.01，*p<0.05;各给药组与模型对照组比较抑p<0.01，#p<0.054.结论近来国内外学者对于人参皂苷进行了大量研究，研究发现这些皂苷类活性成分具有血液系统、心血管系统、神经系统、免疫系统，物质代谢系统，以及抗炎、抗衰老、抗肿瘤等多方面的药理活性。本课题研究的对象是其主要活性成分之一人参皂苷Rd，研究了其对于TNBS-50X乙醇诱导的大鼠急性溃疡性结肠炎的治疗作用，并对其抗炎机理进行了初步研究。大鼠结肠湿重指数(结肠重量/长度)被认为是可以指示TNBS-50X诱导的实验性大鼠溃疡性结肠炎严重程度的较为稳定和可靠的指标之一，本研究结果表明不同剂量人参皂苷Rd给药组大鼠结肠湿重指数与模型对照组相比较显著降低。人参皂苷Rd还能防止TNBS-50%诱导的UC大鼠体重下降；从大体和病理学评分也可以看到人参皂苷Rd能够减轻大体形态学及病理学病变，显著减少了组织坏死和溃疡的形成、减轻炎性细胞浸润，促进上皮细胞和溃疡面的修复。国内外研究结果已证实炎性介质和活性氧的代谢产物与炎症性肠病的产生和发展有关。大量的动物实验也证实活性氧的代谢产物可能与炎症的发生密不可分，同时研究结果显示炎性肠炎患者粘膜中过量、大量的活性氧的代谢产物可能与此类疾病的发病有关。这些代谢产物可能是导致溃疡性结肠炎患者粘膜损伤的诱因之一。吞噬细胞是其主要来源，在炎症发病期间这些细胞大量的渗入肠粘膜，发生应激反应释放大量的活性氧，而导致肠粘膜的氧化损伤。尽管肠粘膜具有很好的抗氧化损伤的防御机制，但与机体的其它器官如肝和肺相比能力比较低。氧应激产物的过度释放可能破坏肠道系统本身的粘膜防御机制。目前，肠粘膜中由于吞噬细胞应激产生的过量活性氧和脂质过氧化物的增加已作为描述炎性肠炎患者活检标本(IBD)的指标。个别研究者还发现人参皂苷Rd具有免疫佐剂活性，并且能够通过调节细胞因子的产生和表达来激发和平衡Thl和Th2免疫应答反应。由于细胞因子在免疫系统调控有着重要地位，目前UC的免疫学发病机制特别是细胞因子发病机制越来越受到人们的重视。而促炎性细胞因子与抑炎性细胞因子之间的平衡失调所致的免疫异常被视为UC的重要发病机制。本发明也证实了人参皂苷Rd在清除氧自由基、抗氧化，免疫调剂的作用，其对于大鼠溃疡性结肠炎的作用机制我们可从以下几个方面进行进一步的探讨和总结。—、Rd对白细胞浸润程度的影响①髓性过氧化物酶(MPO):是中性粒细胞中含量较高的一种酶，其含量的增高可以反映中性粒细胞在某一组织中浸润，间接反映炎症在组织中的存在，而炎症组中MPO水平可反映中性粒细胞的浸润数目和活性，MPO已被作为评价肠道炎症严重程度的指标之一^'^。本实验中正常对照组大鼠结肠及血清样本中MPO活力在各组中最低，模型对照组MPO活性在各组中最高，这也说明了模型对照组中性粒细胞浸润及肠道炎症损伤最严重。与模型对照组相比较，SASP组，人参皂苷Rd低、中、高剂量组UC大鼠结肠组织中的MPO活性明显降低(呈剂量依赖关系)，[18]MP0检测结果与病理学组织检测结果相符。说明Rd能减轻中性粒细胞浸润程度，缓解炎症。二、Rd对UC大鼠结肠组织氧化损伤及抗氧化能力的影响①丙二醛(MDA)与超氧化物岐化酶(SOD):机体通过酶系统与非酶系统产生氧自由基，后者能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸(PUFA)，引发脂质过氧化作用，并因此形成脂质过氧化物，如丙二醛(MDA)、羟基、羰基、酮基、氢过氧基或内过氧基，以及新的氧自由基等。氧自由基不但通过生物膜中多不饱和脂肪酸的过氧化引起细胞损伤，而且还能通过脂氢过氧化物的分解产物引起细胞损伤。因而测试MDA的量可反映机体内脂质过氧化的程度，间接的反应出细胞的损伤程度；并且MDA与SOD有着密切联系，SOD活力的高低间接反应了机体清除氧自由基的能力，而MDA得高低又间接反应了机体细胞受自由基攻击的严重程度。本实验中，模型对照组大鼠结肠组织MDA含量较正常对照组明显升高，而SOD活力明显降低，各用药组与模型对照组相比较结肠组织中的MDA含量明显降低，而SOD活力显著升高且呈剂量依赖关系。这一结果表明Rd在治疗溃疡性结肠炎损伤中有较强的抗氧化作用，且其抗炎作用可能与减轻脂质过氧化反应有关。②谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px):是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶，它的生理功能主要是催化GSH参与过氧化反应，清除在细胞呼吸代谢过程中产生的过氧化物和羟自由基，从而减轻细胞膜多不饱和脂肪酸的过氧化作用。从而保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害。因此GSH-Px活性的变化也可反映机体抗氧化能力的变化。本实验中，模型对照组大鼠结肠组织GSH-PX活力较正常对照组显著降低，而SASP组及人参皂苷Rd低、中、高剂量与模型对照组相比较GSH-PX活力明显升高，差异具有统计学意义，此结果进一步证实了人参皂苷Rd较强的抗氧化能力。三、人参皂苷Rd对细胞因子平衡的影响①抑制促炎因子的表达IL-113是一种前炎症因子，它和TNF-a、IL_6、IL_8等细胞因子在诱导结肠粘膜炎症中有重要作用，并参与炎症的持续和放大。它通过激活免疫细胞级联反应使炎症反应加重。腹泻是肠道炎症的主要症状，而IL-ie似乎是腹泻的主要剌激物。高剂量IL-IP引起上皮细胞坏死、水肿、中性粒细胞浸润和杯状细胞缺失。目前认为其在UC中发病作用有4个方面(1)UC粘膜固有层中活化的巨噬细胞可释放IL-113，激活树突样细胞，吞噬、消化外来抗原，释放抗原片段并呈递至T淋巴细胞发生免疫反应；(2)IL-1P能增加由巨噬细胞所产生的细胞因子如IL-6、TNF-a和IL_8，使得中性粒细胞向炎症部位聚集，进入肠道病变部位，从而引起一系列的肠道病变，如结肠上皮的损伤、小血管炎、隐窝脓肿等，最终造成UC的发病；(3)IL-1P与IL-1受体的失衡是UC发生的重要环节；(4)IL-113可以通过诱导释放H202，影响的Ca2+释放和NK-A的信号转导途径的开关，从而导致UC患者的结肠平滑肌收縮功能紊乱。本实验中模型对照组大鼠结肠组织中IL-IP表达水平较正常对照组显著升高，而人参皂苷Rd各剂量组能够显著降低溃疡性结肠炎大鼠结肠组织中IL-IP表达水平，说明人参皂苷Rd减轻UC组织损伤的主要机制之一是降低病变部位的IL-113表达水平。肿瘤坏死因子(TNF-a)是一种重要的促炎症因子和免疫调节因子，由活化的巨噬细胞和T淋巴细胞分泌的一种参与UC发病的细胞因子，TNF-a引起肠道粘膜损伤的机制包括释放血小板活化因子、生成白三烯和氧自由基，诱导细胞内诱生型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA表达及细胞内四氢生物蝶呤(一种NO促生因子)的生成，使NO生成增加而引起细胞的损伤；TNF-a可调节中性粒细胞和巨噬细胞的增生、成熟和活化，并促进其粘附、游走和脱颗粒，增强它们的吞噬杀伤功能，促进它们释放炎症蛋白和炎症介质，直接参与肠粘膜的损伤；TNF-a上调的血管内皮细胞粘附分子和趋化性细胞因子IL_8的表达而增加炎症细胞的聚集；TNF-a也能诱生IL-1P的生成而致肠粘膜的损伤；TNF-a过多还可通过激活半胱天冬蛋白酶(Caspases)导致肠道内淋巴细胞凋亡，降低肠粘膜的免疫功能。TNF-a在TNBS诱导的结肠炎发病机制中发挥着重要作用，TNF_a是一个具有显著趋化活性细胞因子，在IL-113的协同作用下，使相关的酶激活(包括一氧化氮合酶，磷脂酶A、环氧化酶和蛋白酶等)，从而诱导粘附分子和其他炎性细胞因子表达，直接或间接导致粘膜损伤，这些细胞因子是调节和控制炎症反应重要的生物活性蛋白，与溃疡性结肠炎(UC)的发病机制密切相关。本实验中模型对照组大鼠结肠组织TNF-a含量较正常对照组显著升高，而人参皂苷Rd各给药组能够显著降低溃疡性结肠炎大鼠结肠组织中TNF-a表达水平。这一结果表明人参皂苷Rd治疗TNBS诱导的大鼠急性溃疡性结肠炎有显著的治疗效果与其能降低组织内致炎因子TNF-a表达及调节免疫平衡密切相关。②对抑炎因子的调控作用白介素10(IL-10)是1989年Fiorentino等发现具有多重功效的炎症抑制性细胞因子，参与多种免疫反应，其主要的生物学活性是免疫抑制作用，能抑制单核细胞、中性粒细胞、嗜酸粒细胞等产生促炎性因子和趋化因子抑制IL-113、L-6、L-8、TNF-a，粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子(GM-CSF)等的产生；阻止抗原特异T细胞的增殖，抑制抗原递呈细胞(APC)表面的组织相容性复合物(MHC)-II类分子和某些剌激因子如B7的表达，降低APC的抗原递呈能力，下调效应细胞的IL-2mRNA的表达，抑制IL_2的产生，抑制炎性介质一氧化氮、氧自由基、前列腺素等的合成；抑制巨噬细胞的炎症相关酶iNOS(诱导型一氧化氮合酶)和C0X-2(环氧合酶)的表达；通过抑制IFN-Y的产生抑制自然杀伤NK细胞的活性，抑制ThO细胞向Thl细胞的转化，抑制炎症细胞的迁移。还能抑制由LPS诱导的组织因子的表达，从而抑制凝血系统的活性。另外IL-10还具有免疫剌激作用，可促进B细胞的增殖和分化，产生大量IgG、IgA、IgM，还可增加静止B细胞的存活率，在组织特异性自身免疫性损伤的启动和发展中起着关键性调节作用。1993年，Kuhn，Lohler，Rennick，Rajewsky，和Muller等研究者发现IL-10基因敲除的小鼠会诱发肠道炎症，并且IL-10的变化与溃疡性结肠炎病情变化程度一致，也与治疗效果一致。本实验中模型对照组大鼠结肠组织IL-10含量较正常对照组显著降低，人参皂苷Rd低剂量组、高剂量与模型对照组相比较结肠组织中的IL-10含量显著增加，这一结果表明Rd能够显著的促进抑炎因子IL-10的表达。由上述结果可知，人参皂苷Rd治疗TNBS/50X诱导的大鼠急性溃疡性结肠炎有明显疗效其主要机理之一是能显著的抑制促炎细胞因子IL-113、TNF-a的生成，以及促进抗炎细胞因子IL-10的表达。四、与钙离子通道的关系最新研究结果证实人参皂苷Rd为一新型的非电位依赖性钙离子通道阻滞剂，而电位非依赖性钙通道是通过剌激细胞膜受体(膜受体钙激活通道，ROCC)或者是肌质网钙离子贮存池衰减(钙池操纵的钙离子通道，SOC)而完成细胞内钙离子的调控功能，并且对于多种细胞例如上皮细胞，T淋巴细胞的功能起到非常重要的调控作用。炎症细胞属非兴奋细胞，SOC是这些细胞胞外钙内流的主要通道。细胞质内钙浓度的升高可使炎性细胞，包括中性粒细胞激活或发挥作用，可使相关酶和炎症介质激活、释放。调节中性粒细胞胞质16内Ca"浓度可调节炎症反应的强度。钙拮抗剂有稳定肥大细胞膜和阻止脱颗粒、抑制淋巴细胞转化及IL-2的产生，降低表皮郎格罕细胞数的作用，钙通道阻滞剂如硝苯地平、维拉帕米能阻断钙通道，减少胞内Ca2+浓度，抑制肥大细胞脱颗粒，抑制炎性细胞因子的产生和释放。但此类药如硝苯地平阻滞电压依赖性f丐通道(PDC)，而不影响SOC。由于炎症细胞属非兴奋细胞，S0C抑制剂对炎细胞上的钙离子通道较PDC阻滞药更特异，应能更有效地阻碍炎细胞内钙浓度的上升而对炎症产生抑制作用。已发现的S0C阻滞剂有阳离子、细胞色素P-450抑制剂、花生四烯酸代谢酶抑制剂等，但它们大多缺乏理想的特异性，或仅是工具药。如前所述，现有的抗炎药如乙酰水杨酸类、糖皮质激素类与及抗UC药柳氮磺吡啶也均不具钙拮抗作用。用特异性的S0C阻滞剂来调节炎症反应必将为炎症的防治提供一个新的靶点，寻找能治疗UC炎症的特异性的S0C阻滞剂的研究有重要的理论价值和应用价值。实施例2:人参皂苷Rd治疗大鼠急性溃疡性结肠炎最佳给药途径方法用炎症诱导剂三硝基苯磺酸(TNBS)/50%乙醇溶液诱导法建立大鼠急性溃疡性结肠炎模型。将大鼠随机分为模型对照组、Rd灌胃给药组、Rd肌肉注射组。Rd给药剂量为30mg/kg，每天给药1次，连续给药7天。各项指标具体检测方法见实施实例1。结果①与模型对照组比，Rd灌胃给药组及Rd肌肉注射组大鼠结肠湿重指数均明显减轻，差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)，其中灌胃给药组大鼠结肠湿重指数最低。②与模型对照组相比，Rd灌胃给药及Rd肌肉注射能够明显降低UC大鼠结肠大体观察评分及病理组织学评分，减轻大鼠结肠的病理学损伤(P<0.01)差异具有统计学意义。结论人参皂苷Rd对TNBS诱导的大鼠溃疡性结肠炎有明显的治疗作用，且灌胃给药方式为治疗溃疡性结肠炎最佳的给药途径。权利要求人参皂苷Rd在制备治疗结肠炎药物的应用。2.如权利要求l所述的人参皂苷Rd在制备治疗结肠炎药物的应用，其特征是人参皂苷Rd在制备治疗溃疡性结肠炎药物的应用。3.如权利要求l所述的人参皂苷Rd在制备治疗结肠炎药物的应用，其特征是人参皂苷Rd在制备治疗非细菌性慢性结肠炎药物的应用。4.如权利要求1或2或3所述的人参皂苷Rd在制备治疗结肠炎药物的应用，其特征是人参皂苷Rd口服制剂在制备治疗溃疡性结肠炎药物的应用。5.如权利要求4所述的人参皂苷Rd在制备治疗结肠炎药物的应用，其特征是所述的口服制剂为胶囊、微囊、脂质体、颗粒剂、片剂、口服液。6.如权利要求l-3、5任意之一所述的人参皂苷Rd在制备治疗结肠炎药物的应用，其特征是人参皂苷Rd为从三七中提取的人参皂苷Rd单体化合物，其中人参皂苷Rd单体为95%以上；还包括从五加科人参属植物人参、西洋参的根、茎、叶、花、果实中提取分离得到的人参皂苷Rd单体化合物。7.如权利要求4所述的人参皂苷Rd在制备治疗结肠炎药物的应用，其特征是人参皂苷Rd从三七中提取的人参皂苷Rd单体化合物，其中人参皂苷Rd单体为95%以上；还包括从五加科人参属植物人参、西洋参的根、茎、叶、花、果实中提取分离得到的人参皂苷Rd单体化合物。全文摘要本发明主要涉及一种人参皂苷Rd在制备治疗结肠炎药物的用途。尤其涉及人参皂苷Rd在制备治疗溃疡性结肠炎药物的用途。本发明通过试验说明人参皂苷Rd在制备治疗结肠炎药物的应用。人参皂苷Rd在制备治疗结肠炎药物的应用是人参皂苷Rd在制备治疗溃疡性结肠炎药物的应用。人参皂苷Rd在制备治疗结肠炎药物的应用是人参皂苷Rd在制备治疗非细菌性慢性结肠炎药物的应用。人参皂苷Rd在制备治疗结肠炎药物的应用是人参皂苷Rd口服制剂在制备治疗溃疡性结肠炎药物的应用。本发明利用人参皂苷Rd口服难吸收、主要进入结肠内这一特性，结合其具有的强大的抗炎作用，充分展示了人参皂苷Rd对结肠炎的治疗作用，揭示了抗氧化剂对结肠炎的治疗价值，立意新奇。文档编号A61P1/00GK101791316SQ20101012940公开日2010年8月4日申请日期2010年2月16日优先权日2010年2月16日发明者吴勇杰,范福林,黄艳辉申请人:兰州大学;广东泰禾医药科技有限公司